RECVET vol III nº 5 Mayo/2008 by Veterinaria Organizacion Veterinaria.org

RECVET. Vol. III, Nº 5, Mayo 2008 http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508.html RECVET- Revista Electrónica de Clínica Veterinaria http://www.veterinaria.org/revistas/recvet

Dermatitis Seborreica del Cocker Spaniel: Caso clínico (Dermatitis seborrhoea in Cocker Spaniels.Clinic case) Duvergel, Rousseaux, Almaguer, Yanara *

Jorge*:

Montejo

Cuenca,

Emilio*;

*Universidad de Granma .Granma. Cuba. Contacto: jduvergel@udg.co.cu RECVET: 2008, Vol. III, Nº 5 Recibido 20.03.08 / Referencia 050803_RECVET / Aceptado: 18.04.08 / Publicado: 01.05.08 Este artículo está disponible en http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508.html concretamente en http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508/050803.pdf Revista Electrónica de Clínica Veterinaria RECVET® está editada por Veterinaria Organización® Se autoriza la difusión y reenvío siempre que enlace con Veterinaria.org® http://www.veterinaria.org y con RECVET®-http://www.veterinaria.org/revistas/recvet

Resumen Se describe un caso clínico de Dermatitis Seborreica del Cocker Spaniels de 1,5 años de edad en el que se destacan como síntomas principales zonas de la piel con intenso tinte hiperémico,prurito progresivo y fuerte descamación epitelial en algunas regiones de la anatomía .Se observó la complicación ulterior con otitis bilateral.Se incluyen fotos de las lesiones. Palabras Claves: Dermatitis, seborreica, cocker spaniels.

Abstract A clinical case of Dermatitis Seborrhoea of the Cocker Spaniels 1,5 years old is described in the one that stand out as symptoms main areas of the skin with intense tint hyperaemic, pruritus progressive and strong desquamation epithelial in some regions of the anatomy. The ulterior complication was observed with bilateral otitis. Pictures of the lesions are included. Key Word: Dermatitis, seborrhoea, cocker Spaniels.

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Introducción: Los procesos dermatologicos: alopecia, prurito y dermatosis; constituyen un conjunto de afecciones importantes que exigen esmerada atención por el veterinario en su abordaje y tratamiento (1). Una de las razas que ha ganado gran aceptación por sus características, como son la docilidad, adaptabilidad al medio y habilidades para el desempeño de diversas tareas es el Cocker Spaniel, lo que la ha convertido en una de las preferidas para desempeñarse como animal de compañía y al mismo tiempo es una de las razas mas susceptibles a padecer algunos de estos procesos. La Seborrea Secundaria Canina o Seborrea Ideopática del Cocker Spaniel designa a una de las dermatosis mas frecuentes, de evolución crónica y caracterizada por un defecto de la queratinización y que puede ser secundaria a diversos procesos entre ellos los de base hormonal, hipotiroidismo, tendencia a complicaciones como el pioderma; y entre otros rasgos clínicos la piel seca, costrosa, olor desagradable y prurito (2). Historia del caso: Un perro de la raza Cocker Spaniel, de 1.5 años de edad de pelaje negro, presentó en algunas zonas de la piel tinte hiperemico, prurito progresivo hasta hacerse intenso, fuerte descamación epitelial en dorso cuello y orejas y piel de apariencia grasienta. Pasado algún tiempo después tuvo que ser tratado por otitis bilateral. Diagnostico clínico. Al examen físico del animal se observaron los siguientes síntomas:

Figura 1. Tinte hiperémico y zona alopécica en abdomen

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Figura 2. Intensa descamación epitelial en orejas y otras diversas áreas del cuerpo.

Figura 3. Pelo y placas epiteliales adheridas, piel con apariencia grasa y untuosa al tacto.

Discusión. Se establece la clasificación clínica de la Seborrea seca del Cocker Spaniel, con acumulación de escamas blancas-grisáceas no adherentes; la seborrea grasa u oleosa con escamas focales o difusas, con un material amarillo-marronaceo que se adhiere al pelo y piel, otitis bilateral ceruminosa; se cita su presentación en la seborrea primaria del cocker spaniel (3). Se describe en la dermatitis seborreica los perros moderadamente afectados con retención de caspas grasa alrededor de la nariz, labios y canales auriculares externos; los gravemente afectados con lesiones en cuello y tronco y los muy gravemente afectados que presentan una Dermatitis Seborreica del Cocker Spaniel: Caso clínico http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508/050803.pdf

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dermatosis mal oliente, grasa, alopécica y pruriginosa con descamación es frecuente una otitis externa (4). La Dermatitis Costrosa aparece como una complicación de otros tipos de dermatitis en la que las costras en la superficie de la piel pueden ser más o menos extensas y el color va desde pardo amarillento hasta pardo oscuro. La superficie de aspecto sucio y que se desprende con relativa facilidad dejando al descubierto El corion húmedo y enrojecido (5). Bibliografía. 1- Ford, R. B. Alopecias y pruritos. Signos clínicos y diagnóstico en pequeños animales. Edit. Médica Panamericana S. A. Buenos Aires Argentina. 1992. 503 – 544. 2- Tom, P. A. Arantic States canine Hypothyroidismo. http:///www.atlanticstatescanine.org/thyroid.htm. (2005) 3- Rejas,J.L.Seborrea secundaria canina. Manual de Dermatología de animales de compañía. Secretariado de publicaciones. León España. 1997. 116-117. 4- Harvey, R. G.; Mc Keever, R. J. Seborrea idiopática del Cocker Spaniel. Enfermedades de la piel en perros y gatos. Editores médicos S.A. Barcelona, España. 2001. 140 – 141. 5- Chamizo, E. P. Piel. Patología orgánica y enfermedades de los animales domésticos. Editorial Félix Varela. La Habana. Cuba. 2004. 135.

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Valoración de técnicas de inmunofluorescencia indirecta e inmunodifusión para la determinación de anticuerpos antinucleares en perros con leishmaniosis (Valuation techniques and indirect immunofluorescence immune to the determination of antinuclear antibodies in dogs with leishmaniasis) Ginel-Pérez, Pedro J.*; Camacho-Quesada, Soledad; BlancoNavas, Beatriz; Lucena-Solís, Rosario. Departamento de Medicina y Cirugía Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad de Córdoba, Campus de Rabanales, 14014 Córdoba, España. *Correspondencia: Dr. Pedro J. Ginel. Departamento de Medicina y Cirugía Animal. Facultad de Veterinaria de Córdoba. Campus de Rabanales 14014 Córdoba. Teléfono 34957218713; Fax 34957211093; e-mail pginel@uco.es

RECVET: 2008, Vol. III, Nº 5 Recibido 04.02.08 / Referencia 050801_RECVET / Aceptado: 24.03.08 / Publicado: 01.05.08 Este artículo está disponible en http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508.html concretamente en http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508/050801.pdf Revista Electrónica de Clínica Veterinaria RECVET® está editada por Veterinaria Organización® Se autoriza la difusión y reenvío siempre que enlace con Veterinaria.org® http://www.veterinaria.org y con RECVET®-http://www.veterinaria.org/revistas/recvet

Resumen En perros con leishmaniosis los anticuerpos antinucleares contribuyen al desarrollo de lesiones por depósito de complejos inmunes circulantes como la glomerulonefritis. Existen diversas técnicas para determinar sus niveles séricos y su especificidad antigénica. En este trabajo se comparan los resultados de las técnicas de inmunofluorescencia indirecta sobre hígado de rata, células HEP-2 y Crithidia luciliae y de la técnica de doble inmunodifusión para los antígenos nucleares extraibles de los tipos Sm y RNP. Se emplearon 60 perros con leishmaniosis adquirida de forma natural. El porcentaje de títulos positivos para la IFI sobre hígado de rata y células HEP-2 fue del 23,4% y del 55,2% respectivamente, con una Valoración de técnicas de inmunofluorescencia indirecta e inmunodifusión para la determinación de anticuerpos 1 antinucleares en perros con leishmaniosis http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508/050801.pdf

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correlación positiva de solo el 29%. Sobre Crithidia luciliae, solo un perro presentó títulos positivos para anticuerpos anti ADN de doble cadena mientras que todas las muestras fueron negativas para anticuerpos específicos de antígenos nucleares extraibles Sm y RNP. Según estos resultados, la técnica de inmunofluorescencia sobre células HEP-2 presenta una sensibilidad elevada, a la vez que permite apreciar diversos patrones de fluorescencia. Por otro lado, los anticuerpos antinucleares específicos de ADN de doble cadena y de antígenos nucleares extraibles Sm y RNP están ausentes en perros con leishmaniosis o las pruebas empleadas carecen de sensibilidad suficiente para su detección. Palabras clave: Leishmaniosis Inmunofluorescencia

ANA

ENA

HEP-2

Abstract In canine leishmaniasis, antinuclear antibodies are involved in the pathogeny of lesions associated with circulating immunocomplex deposition such as glomeruloneprhitis. There are different techniques available to determine their serum concentration and their antigenic specificity. In this article, we compare the results of immunofluorescence on rat liver cryocuts, HEP-2 cells, and Crithidia luciliae and double immunodifussion for extractable nuclear antigens Sm and RNP. Sera from 60 dogs with naturally acquired canine leishmaniasis were used. The prevalence of positive indirect immunofluorescence titers on rat liver cryocuts and HEP-2 cells was 23.4% and 55.2% respectively, and positive correlation between both techniques was only 29%. On Crithidia luciliae slides, just one dog had a positive titer for anti double-stranded DNA antibodies, whereas all the samples assayed by double immunodifussion were negative for antibodies against extractable nuclear antigens Sm and RNP. According to our results, the indirect immunofluorescence assay on HEP-2 cells achieves a higher sensitivity and allows recognition of several immunofluorescence patterns. On the other hand, antinuclear antibodies specific to double-stranded DNA and ENA are either absent in canine leishmaniasis or their serum concentrations are beyond the detection limits of the techniques used. Key words: Leishmaniosis | ANA | ENA HEP-2 | Immunofluorescence assays

Valoración de técnicas de inmunofluorescencia indirecta e inmunodifusión para la determinación de anticuerpos 2 antinucleares en perros con leishmaniosis http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508/050801.pdf

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1. Introducción El término anticuerpos antinucleares (ANA) se usa de forma genérica para describir los autoanticuerpos contra diferentes componentes nucleares como ADN, ARN, histonas y sus complejos moleculares (Tan, 1982). Los ANA contribuyen al depósito de inmunocomplejos circulantes sobre el endotelio vascular y por tanto al desarrollo de reacciones de hipersensibilidad de tipo III, importantes en la patogenia de glomerulonefritis, dermatitis, uveitis y artritis (Monestier y col., 1995; Hahn, 1998). En perros, los ANA se asocian fundamentalmente con el LES, aunque pueden encontrarse en otras enfermedades inflamatorias e infecciosas como la leishmaniosis canina (Kelly y col., 1994; Lucena y col., 1996; Paul y col., 2005). La identificación de los ANA es una parte importante de la medicina e inmunología clínicas. De hecho, los tests de determinación de ANA están entre los tests serológicos más realizados a nivel mundial en todos los laboratorios de inmunología clínica (Bradwell y col., 1995). En el caso concreto del perro, la determinación precisa de los ANA caninos se ve dificultada por la capacidad del suero canino para unirse al ADN de forma inespecífica bajo ciertas condiciones. Esto se debe a una beta-globulina ácida que se une al ADN heterólogo y al dAdT (polydeoxyadenylate-deoxythymidylate) un análogo sintético del dsDNA, en el rango fisiológico del pH (Shull y col., 1983). Los ANA constituyen una población muy heterogénea de anticuerpos dirigidos contra varios antígenos nucleares y por este motivo normalmente para su detección inicial se emplea todo el núcleo de la célula como sustrato. Posteriormente se emplean técnicas que permitan establecer la especificidad de los ANA, es decir, contra qué antígenos nucleares concretos están dirigidos. Conocer la especificidad antigénica de los ANA es fundamental para establecer su asociación con enfermedades concretas e investigar su actividad patogénica (White y col., 1992). En el pasado, se ha sugerido que el estudio de la especificidad de los ANA estaba clínicamente indicado cuando las pruebas de IFI eran positivas. Sin embargo, cuando los así llamados pacientes ANA-negativos se incluían en los análisis de inmunodifusión, los sueros IFI negativos de varios de ellos eran positivos para los llamados Ag nucleares extraibles (ENA) como el SSA/Ro (Wilson y Sanders, 1992). Teniendo en cuenta las dificultades de la determinación de ANA en el perro, la importancia de su especificidad antigénica y su contribución al desarrollo de algunas lesiones clásicas de la leishmaniosis canina (Ginel y col., 2008), nuestro objetivo es valorar y correlacionar los resultados de las técnicas de IFI sobre hígado de rata, células HEP-2 y Crithidia luciliae, y de la técnica de doble inmunodifusión para ENA en perros con leishmaniosis. Valoración de técnicas de inmunofluorescencia indirecta e inmunodifusión para la determinación de anticuerpos 3 antinucleares en perros con leishmaniosis http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508/050801.pdf

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2. Material y métodos Se emplearon 60 perros con leishmaniosis adquirida de forma natural. La edad de los animales osciló entre 9 meses y 8 años, 42 machos y 18 hembras. Todos los perros eran sintomáticos y el diagnóstico se confirmó mediante observación directa del parásito en aspirados de ganglio linfático o médula ósea. 2.1. Inmunofluorescencia sobre hígado de rata La técnica se ha descrito previamente (Lucena y col., 1996). Las muestras se prepararon 1:5 en PBS para evitar la inmunofuorescencia inespecífica. Como control positivo se empleó un suero de perro ANA positivo y como control negativo la solución tamponada de PBS. Para la detección de los ANA se empleó un antisuero anti IgG canina (H+L) marcado con isotiocianato de fluoresceína a una dilución de 1:50 en PBS. La presencia de fluorescencia se establece observando las muestras en un microscopio de fluorescencia con una lámpara de 495 nm y empleando un filtro de 515 nm. 2.2. Inmunofluorescencia sobre células HEP-2. Se determinaron empleando el ANA HEP-2 screening kit (INOVA diagnostics Inc. San Diego, CA). Brevemente, se diluyen las muestras problema con una dilución inicial de 1:40 en PBS a partir de la cual se considera la positividad. Los portaobjetos con el sustrato de células epiteliales se dejan secar a temperatura ambiente durante unos minutos. Se añade una gota en cada pocillo de los controles positivo y negativo en cada uno de los portas. A continuación se colocan 50 µl de cada muestra problema. Los portaobjetos se incuban en cámara húmeda y a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después de la incubación se lavan los pocillos con buffer PBS mediante inmersión durante 5 minutos y se sacuden enérgicamente para eliminar el exceso de PBS. En el siguiente paso se añade el conjugado, un suero anti IgG canina (H+L) marcado con un fluorocromo. El conjugado se incuba en cámara húmeda y oscura durante otros 20 minutos, tras los cuales se repite el proceso de lavado. Finalmente se coloca un cubreobjetos sobre el que se han aplicado unas gotas de medio de montaje. La presencia de fluorescencia se establece observando las muestras en un microscopio de fluorescencia con una lámpara de 495 nm y empleando un filtro de 515 nm. 2.3. Determinación de ANA anti Inmunofluorescencia sobre Crithidia

ADN

doble

cadena:

Se emplearon 34 perros con leishmaniosis del total de 60 perros incluidos en el estudio. Todos los reactivos empleados, salvo el antisuero anti IgG canina corresponden a los suministrados en el kit “Crithidia luciliae doublestranded DNA (The Binding Site, Birmingham, England). Valoración de técnicas de inmunofluorescencia indirecta e inmunodifusión para la determinación de anticuerpos 4 antinucleares en perros con leishmaniosis http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508/050801.pdf

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Se diluyen las muestras problema con PBS a una dilución inicial de 1:10 a partir de la cual se considera la positividad. Los portaobjetos con el sustrato se dejan secar a temperatura ambiente durante unos 30 minutos antes de sacarlos de su embalaje. Se colocan en cámara húmeda y se añade una gota en cada pocillo de los controles positivo y negativo en cada uno de los portas. A continuación se colocan 25 µl de cada muestra problema diluida 1:10 en PBS. Los portaobjetos se incuban en cámara húmeda y a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la incubación se lavan los pocillos con buffer PBS mediante inmersión durante 10 minutos sin agitación. Después se sacuden los portaobjetos enérgicamente para eliminar el exceso de PBS. En el siguiente paso se añade el conjugado, un suero anti IgG canina (H+L) marcado con un fluorocromo (isotiocianato de fluoresceina) diluido 1:32 en PBS. Los portaobjetos no deben permanecer al aire durante más de 15 segundos. El conjugado se incuba en cámara húmeda y oscura durante otros 30 minutos, tras los cuales se repite el proceso de lavado. En este paso de lavado, se pueden añadir 2-3 gotas de azul de Evans 1% a cada 100 ml para obtener una contra tinción. La presencia de fluorescencia en el quinetoplasto se establece observando las muestras en un microscopio de fluorescencia con una lámpara de 495 nm y con un filtro de 515 nm. 2.4. ANA frente a ENA: técnica de doble inmunodifusión o de Ouchterlony Se emplearon las muestras de los animales donde se había investigado la presencia de ANA frente a ADN de doble cadena. Todos los reactivos empleados fueron suministrados por Biognost (Gräfelfing, Germany). Los extractos ENA purificados correspondieron a los autoantígenos: Sm y RNP. Brevemente, una vez que todos los reactivos se encuentran a temperatura ambiente, los sueros se emplean sin diluir. En los casos donde se observan líneas de precipitación marcadas se vuelven a ensayar diluidos 1:4 en PBS para evitar el efecto de prozona (ausencia de reacción inmune a altas concentraciones de anticuerpos). Para aplicar las muestras se pipetean 15 µl de suero y de los controles en los pocillos periféricos y 25 µl del extracto ENA en el pocillo central. Las placas se cierran y se incuban a temperatura ambiente (< 25ºC) y en cámara húmeda durante 24 horas. Hay que evitar la iluminación directa o la proximidad con radiadores o cualquier fuente de calor. La lectura de las placas se realiza a las 24 horas anotando todas las líneas de precipitación visibles.

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3. Resultados 3.1. Determinación de ANA en criocortes de hígado de rata En total, la determinación se realizó en 60 muestras de perros con leishmaniosis. Las muestras que presentaron fluorescencia a una dilución de 1:20 se consideraron positivas. No se realizaron diluciones posteriores para la titulación definitiva de las muestras positivas. La prevalencia de ANA fue del 23,3% (14 muestras positivas de 60 analizadas). Los patrones de inmunofluorescencia sobre criocortes de hígado de rata son poco específicos por lo que no se han incluido como resultado. No obstante, el patrón de inmunofluorescencia predominante fue el nuclear (Fig.1). 3.2. Determinación de ANA en células HEP-2 En total, se realizó IFA sobre células HEP-2 en un total de 67 perros con leishmaniosis. En 37 animales (55,2%) se obtuvo un título >/= 40 y por tanto se consideraron positivos. Los títulos oscilaron entre 40 (19 perros) y 640 (1 perro). En 10 perros se obtuvo un titulo final de 320. Sólo tres tipos de patrones de inmunofluorescencia pudieron ser claramente definidos; nuclear, nucleolar y citoplásmico. La mayoría de los perros presentaron sólo un tipo de patrón. El patrón nuclear fue el patrón predominante al estar presente en 15 animales, otros 12 presentaron un patrón citoplasmático y finalmente en 7 animales el patrón fue nucleolar. En 3 ocasiones, las muestras presentaron un patrón mixto que siempre fue una combinación de patrón nuclear y citoplasmático. El patrón nuclear se caracterizó por ser del tipo homogéneo (Fig. 2). La fluorescencia era de carácter difuso y uniforme sin apreciarse mayor intensidad en la región externa del núcleo. El patrón nucleolar fue también del tipo homogéneo (Fig. 3). La fluorescencia se presentó sobre todo el nucleolo y no se presentó fluorescencia en la región de cromatina condensada del núcleo. El patrón citoplasmático fue de tipo granular. Este patrón no se correspondía con otros tipos de patrones como los patrones mitocondrial, lisosomial o endoplásmico. Siguiendo la clasificación de Bradwell y col (1995), el patrón citoplasmático se correspondía con ribosómico o con el patrón específico de la proteína de reconocimiento de señal común a múltiples receptores citoplasmáticos. 3.3. Correlación entre las técnicas de Inmunofluorescencia La correlación entre ambas técnicas se estableció a partir de 24 muestras que habían obtenido un titulo positivo en al menos una de las dos técnicas empleadas. No se incluyeron las muestras negativas en ambas técnicas (correlación negativa) pues su interés clínico es menor y aumenta notablemente el grado de correlación. Valoración de técnicas de inmunofluorescencia indirecta e inmunodifusión para la determinación de anticuerpos 6 antinucleares en perros con leishmaniosis http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508/050801.pdf

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Las dos técnicas de IFI mostraron una correlación positiva, definida como muestras positivas concordantes, en 7 de las 24 (29%) muestras analizadas por ambos métodos. En 11 perros (45,8%), las muestras alcanzaron títulos positivos sólo sobre células HEP-2, mientras que 6 muestras (25%) fueron positivas sólo sobre las células de hígado de rata. 3.4. Determinación de ANA anti ADN Inmunofluorescencia sobre Crithidia luciliae

doble

cadena:

En 34 perros con leishmaniosis se estudió la presencia de ANA específicos para ADN de doble cadena mediante IFI sobre protozoos del género Crithidia. Los títulos fueron negativos en todos los animales salvo en el plasma del perro número 23 que presentó fluorescencia con un título de 80. En el animal positivo la fluorescencia se detectó específicamente a nivel del quinetoplasto y más débilmente sobre el núcleo. En las muestras negativas, la gran mayoría de ellas presentaba fluorescencia sobre el núcleo del protozoo pero no sobre el quinetoplasto, que es la estructura situada más cerca del núcleo. 3.5. Determinación extractables (ENA)

ANA

frente

antígenos

nucleares

Ninguna de las 34 muestras analizadas fue positiva. No se detectaron por tanto ANA específicos para los autoantígenos Sm y RNP. 4. Discusión Diversos trabajos han evaluado la prevalencia y la importancia patogénica de los complejos inmunes circulantes (CIC) en la leishmaniosis canina. Los hallazgos clínico-patológicos en perros con leishmaniosis demuestran que los CIC juegan un papel fundamental en la patogenia de la enfermedad y que la insuficiencia renal por depósito de CIC es la principal causa de muerte. Los CIC serían también los responsables de las poliartritis, uveitis y vasculitis cutánea (Slappendel 1988; Lucena y col., Palacio y col., 1997). Los inmunocomplejos estarían compuestos por antígenos parasitarios y anticuerpos del hospedador, pero también por antígenos endógenos como las nucleoproteinas y ANA. En el LES se ha demostrado que los ANA tienen un papel preponderante en el desarrollo de glomerulonefritis, poliartritis, etc. Una situación similar puede existir en la leishmaniosis canina, donde se ha demostrado una correlación positiva entre los niveles de ANA anti-histonas y el desarrollo de glomerulonefritis (Ginel y col., 2008). Teniendo en cuenta que las técnicas de inmunofluorescencia son las más empleadas para la determinación de ANA, nos propusimos comparar la eficacia de varias técnicas para la detección de ANA en la leishmaniosis canina. Lo más Valoración de técnicas de inmunofluorescencia indirecta e inmunodifusión para la determinación de anticuerpos 7 antinucleares en perros con leishmaniosis http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508/050801.pdf

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destacable de nuestros resultados es sin duda la gran diferencia de sensibilidad entre unas técnicas y otras (Gráfica 1). Empleando la técnica de IFI sobre hígado de rata, 14 de los 60 perros estudiados (23,4%) presentaron un título de ANA positivo. Esta prevalencia es similar a la obtenida en trabajos previos sobre el mismo tipo de sustrato (Slappendel 1988; Lucena y col., 1996). En otro trabajo posterior, 28 de 53 perros (52%) mostraron títulos positivos de ANA (Ciaramella y col., 1997). Cuando sobre esta misma población se emplearon como sustrato las células HEP-2, el porcentaje de positividad se incrementó hasta el 55,2% y se obtuvieron títulos más elevados que con la técnica de IFI sobre criocortes de hígado de rata, alcanzando en 11 perros títulos igual o superiores a 320 que podemos considerar como clínicamente muy significativos. La correlación positiva, es decir aquellas muestras positivas en ambos sustratos, se puede considerar reducida (29% de las muestras). Esta baja correlación se debe principalmente a la menor sensibilidad de los cortes de hígado de rata, ya que un 45,8% de muestras alcanzaron un título positivo cuando se ensayaron sobre las células HEP-2 pero fueron negativas sobre los cortes de hígado de rata. La mayor sensibilidad de las células HEP-2 se debe al gran tamaño de sus núcleos, a su disposición monocelular que asegura que todos los núcleos sean visibles y a que algunos antígenos están presentes en mayor concentración en estas células tumorales poco diferenciadas que en tejidos muy diferenciados como el hígado o el riñón (Tan 1982; Fritzler 1992; Bradwell y col., 1995). A pesar de la mayor sensibilidad de las células HEP-2 como sustrato, 6 de las muestras analizadas fueron positivas sólo sobre criocortes de hígado de rata. Una primera hipótesis es que se tratara de falsos positivos. El título de 1:20 como valor de corte para los sueros positivos se estableció a partir de una población amplia de perros sanos (Lucena y col., 1996), sin embargo otros autores han demostrado que las reacciones positivas con diluciones bajas son relativamente frecuentes en perros sanos utilizando como sustrato cortes de hígado de rata. Algunos han sugerido que, con este tejido, el título mínimo para obtener una especificidad del 95% sería de 1:100. Por el contrario, los perros sanos no mostraron reactividad alguna cuando se usaron células HEP-2 como sustrato, incluso analizando las muestras a diluciones tan bajas como 1:15 (Hansson y col., 1996). Estos autores concluyeron que las células HEP-2 eran un sustrato mucho más apropiado para el perro debido a su baja reactividad con los sueros de perros normales. La falta de correlación entre sustratos también ha sido descrita previamente. Según Fritzler (1992), la expresión de ciertos antígenos nucleares presenta diferencias cualitativas y cuantitativas entre sustratos. Las pruebas de IFI para ANA pueden ser negativas en cortes de órganos y positivas en cultivos celulares o al contrario. Esto ha dado lugar a la Valoración de técnicas de inmunofluorescencia indirecta e inmunodifusión para la determinación de anticuerpos 8 antinucleares en perros con leishmaniosis http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508/050801.pdf

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opinión generalizada de que al menos deben emplearse dos substratos diferentes antes de considerar una muestra como negativa (Fritzler, 1992). En cualquier caso, nuestros resultados indican que la elección más práctica son los cultivos celulares, más sensibles y por tanto con una proporción menor de resultados falsos negativos. Además, las células HEP-2 han demostrado ser un sustrato mucho más fiable que los criocortes de hígado de rata para la investigación de ANA en el perro ya que también producen una menor proporción de falsos positivos (Hansson y col., 1996). La especificidad antigénica puede guardar relación con el origen y mecanismo de producción de cada tipo de ANA, así como con su grado de patogenicidad. Los anticuerpos anti-ADN son especialmente importantes en la patogenia de algunas enfermedades autoinmunes sistémicas como el LES. Estos anticuerpos pueden reaccionar con ADN de cadena simple o contra ADN de doble cadena (Hahn, 1998). Para estudiar la presencia de ANA específicos para ADN de doble cadena en perros con leishmaniosis, seleccionamos 34 muestras con títulos positivos sobre células HEP-2 y/o cortes de hígado de rata. La determinación se hizo mediante inmunofluorescencia sobre cultivos del protozoo hemoflagelado Crithidia luciliae. Este protozoo se ha demostrado como un sustrato útil para detectar anticuerpos específicos para ADN. Posee una gran mitocondria que contiene ADN relativamente libre de otros antígenos nucleares como las histonas (Halliwell, 1982; Fritzler, 1992). Además de su sencillez, la técnica presenta la ventaja de, a diferencia de otros ensayos de IFI para ANA, detectar tanto Ac de alta como de baja afinidad (Brinet y col., 1988). Sorprendentemente, de las 34 muestras sólo una de ellas alcanzó un título positivo de 1:80. De estos resultados se desprende que en perros con leishmaniosis el desarrollo de ANA especificos para ADN de doble cadena es excepcional. Otra conclusión sería cuestionar la validez de la prueba. En el perro, algunos autores consideran que la técnica de Crithidia carece de sensibilidad suficiente para ser empleada como técnica de rutina, además parece detectar preferentemente Ac de baja afinidad para ADN de doble cadena y recomiendan el empleo de métodos ELISA que son positivos en el 90% de perros con LES (Jones, 1993). También se ha apuntado la posibilidad de que en el suero canino existan ciertos componentes no específicos que se unen al ADN y parecen interferir con la unión de los Ac anti-ADN (Andersson y Sevelius, 1992). Sin embargo, otros autores han aplicado precisamente esta técnica con buenos resultados; Monier y col., (1988) la emplearon para detectar ADN de doble cadena en perros con LES partiendo de una dilución inicial de 1:2, mientras que el método empleado aconseja diluir las muestras al 1:10. Es posible que hubiese un mayor número de positivos si hubiésemos llevado a cabo el ensayo con una dilución menor, pero a bajas diluciones se ha visto que esta técnica, aplicada en suero de perros con LES, produce falsos positivos (Brinet y col., 1988). Más recientemente, se ha publicado la existencia de reacciones cruzadas entre este protozoo y Leishmania (Martincovic y Marinculic, Valoración de técnicas de inmunofluorescencia indirecta e inmunodifusión para la determinación de anticuerpos 9 antinucleares en perros con leishmaniosis http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508/050801.pdf

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2006). Era de esperar por tanto, una mayor proporción de resultados positivos. Sea cual sea la causa de la práctica ausencia de muestras positivas, nuestro resultados son más compatibles con aquellos autores que consideran esta prueba poco útil en el perro. Los Ag nucleares Sm y RNP forman parte del grupo denominado Ag nucleares extraibles (ENA) (Tan 1982). Los Ac frente al Ag Sm se consideran un marcador serológico de LES humano. En perros con LES, los Ac anti-Sm son los que se encuentra con más frecuencia (16% de casos) mientras que el resto de Ac frente a ENA se detectan de forma excepcional o nunca (Chabanne y col., 1995). Mediante la técnica de doble difusión, se investigó la presencia de Ac frente a los Ag Sm y RNP. Ninguna de las 34 muestras analizadas fue positiva y podemos concluir por tanto que los ANA frente a estos antígenos nucleares no son significativos en la leishmaniosis canina. En conclusión, los ANA específicos para ADN de doble cadena son excepcionales en perros con leishmaniosis o bien la técnica de IFI sobre Crithidia carece de sensibilidad suficiente para detectarlos, algo similar ocurre con los ANA específicos de Sm y RNP cuando se investigan mediante técnicas de doble inmunodifusión. Las técnicas de IFI sobre células HEP-2 obtienen una prevalencia mucho mayor de ANA en perros con leishmaniosis que puede ser atribuida a una mayor sensibilidad y sería por tanto la técnica de elección para la determinación de ANA en el perro. 5. Bibliografía 1. Andersson, M., Sevelius, E. Circulating autoantibodies in dogs with liver disease. Journal of Small Animal Practice, 1992, vol. 33, p. 389-394. 2. Bradwell, A. R., Stokes, R. P., Johnson, G.D. Atlas of HEP-2 patterns. Editado por Bradwell, A. R. Birmingham (UK):The Binding Site 1995, pp. 37-65. ISBN 0704416220. 3. Brinet, A., Fournel, C., Faure, J. R., Venet, C., Monier, J. C. Anti-histone antibodies (ELISA and immunoblot) in canine lupus erythematosus. Clinical and Experimental Immunology, 1988, vol. 74, p. 105-109. 4. Chabanne, L., Cadoré, J. L., Fournel, C. Les examens en immunorheumatologie. Le Point Veterinaire, 1995, vol. 26, p. 45-53. 5. Ciaramella, P., Oliva, G., Luna, R. D., Gradoni, L., Ambrosio, R., Cortese, L., Scalone, A., Persechino, A. A. A retrospective clinical study of canine leishmaniasis in 150 dogs naturally infected. Veterinary Record, 1997, vol. 141, p. 539-543. 6. Fritzler, M. J. Immunofluorescent antinuclear antibody test. En Rose, N. R., Conway, E., Fahey, J. L., Friedman, H., Penn, G. M., Manual of clinical laboratory immunology, 4ª ed. Washington (USA): American Society for Microbiology, 1992, pp. 724-734. ISBN 1-55581-043-8. 7. Ginel, P. J., Camacho, S., Lucena, R. Anti-histone antibodies in dogs with leishmaniasis and glomerulonephritis. Research in Veterinary Science, 2008, DOI 10.1016/j.rvsc.2008.01.007. 8. Hahn, B. H. Antibodies to DNA. New England Journal of Medicine 1988, vol. 338, p. 1359-1368. 9. Halliwell, R. E. W. Autoimmune diseases in domestic animals. Journal of the American Veterinary Medical Association, 1982, vol. 181, p. 1088-1096. Valoración de técnicas de inmunofluorescencia indirecta e inmunodifusión para la determinación de anticuerpos 10 antinucleares en perros con leishmaniosis http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508/050801.pdf

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10.Hansson, H., Trowald-Wigh, G., Karlsson-Parra, A. Detection of antinuclear antibodies by indirect immunofluorescence in dog sera: comparison of rat liver tissue and human epithelial-2 cells as antigenic substrate. Journal of Veterinary Internal Medicine, 1996, vol. 10, p. 199-203. 11.Jones, D. R. E. Canine systemic lupus erythematosus: new insights and their implications. Journal of Comparative Pathology, 1993, vol. 108, p. 215-228. 12.Kelly, P. J., Carter, S. D., Bobade, P.A., Matthewman, L. A., Bell, S. C. Absence of antinuclear antibodies in dogs with Ehrlichia canis. Veterinary Record, 1994, vol. 134, p. 382. 13.Lucena, R., Ginel, P. J., López, R., Novales, M., Martín, E., Molleda, J. M. Antinuclear antibodies in dogs with leishmaniosis. Journal of Veterinary Medicine series A, 1996, vol. 43, p. 255-259. 14.Martinkovic, F., Marinculic, A. Antibodies against Leishmania cross-react with Crithidia luciliae: indirect immunofluorescence and Dot-ELISA study in dogs. Parasitology Research, 2006, vol., 98, p. 378-380. 15.Monestier, M., Novick, K. E., Karam, E. T., Chabanne, L., Monier, J. C., Rigal, D. Autoantibodies to histone, DNA and nucleosome antigens in canine systemic lupus erythematosus. Clinical and Experimental Immunology, 1995, vol. 99, p. 37-41. 16.Monier, J. C., Fournel, C., Lapras, M., Dardenne, M., Randle, T., Fontaine, C. M. Systemic lupus erythematosus in a colony of dogs. American Journal of Veterinary Research, 1988, vol. 49, p. 46-51. 17.Palacio, J., Liste, F., Gascón, M. Enzymuria as an index of renal damage in canine leishmaniasis. Veterinary Record, 1997, vol. 140, p. 477-480. 18.Paul, S., Wilkerson, M. J., Shuman, W., Harkin, K. R. Development and evaluation of a flow cytometry microsphere assay to detect anti-histone antibody in dogs. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2005, vol. 107, p. 315-325. 19.Shull, R. M., Miller, H. A., Chilina, A. R. Investigation of the nature and specificity of antinuclear antibody in dogs. American Journal of Veterinary Research, 1983, vol. 44, p. 2004-2008. 20.Slappendel, R. J. Canine leishmaniasis. A review based on 95 cases in the Netherlands. Veterinary Quaterly, 1988, vol. 10, p. 1-16. 21.Tan, E. M. Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): their immunobiology and medicine. Advances in Immunology, 1982, vol. 33, p. 167-240. 22.White, S. D., Rosychuk, R. A. W., Schur, P. H. Investigation of antibodies to extractable nuclear antigens in dogs. American Journal of Veterinary Research, 1992, vol. 53, p. 1019-1021. 23.Wilson, M. R., Sanders, R. D. Immunodiffusion assays for antibodies to small nuclear ribonucleoproteins and other celular antigens. En Rose, N. R., Conway, E., Fahey, J. L., Friedman, H., Penn, G. M. Manual of clinical laboratory immunology, 4ª ed. Washington (USA): American Society for Microbiology, 1992, pp. 741-746. ISBN 1-55581-043-8. RECVET® Revista Electrónica de Clínica Veterinaria está editada por Veterinaria Organización®. Es una revista científica, arbitrada, online, mensual y con acceso completo a los artículos íntegros. Publica preferentemente trabajos de investigación originales referentes a la Medicina y Cirugía Veterinaria desde el aspecto Clínico en cualquier especie animal. Se puede acceder vía web a través del portal Veterinaria.org® http://www.veterinaria.org o desde RECVET® http://www.veterinaria.org/revistas/recvet Dispones de la posibilidad de recibir el Sumario de cada número por correo electrónico solicitándolo a recvet@veterinaria.org .Si deseas postular tu artículo para ser publicado en RECVET® contacta después de leer las Normas de Publicación en con recvet@veterinaria.org http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/normas.html . Se autoriza la difusión y reenvío de esta publicación electrónica siempre que se cite la fuente, enlace con Veterinaria.org®. http://www.veterinaria.org y RECVET® http://www.veterinaria.org/revistas/recvet Veterinaria Organización® (Copyright) 1996-2008 Email: info@veterinaria.org

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Diagnóstico de Ehrlichiosis en caninos en la ciudad de La Habana (Diagnosis of canine Ehrlichiosis in Havana city) León, Avelina [1]; Demedio, Jorge [2]; Márquez, Mario [2]; Castillo, Elio [2]; Perera, Anayram [3]; Zuaznaba, Oliever [3]; Caníbal, Javier [3]; Gonzalez, Barbara [1]; Reynaldo, Lázaro [4]; Vega, Natan [2]; Blanco, Diuris [1]; Ronda, Marisel [1]; Peña, Amelia [1] ; Seija, Víctor [3] [1] Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB). [2] Facultad de Medicina Veterinaria. Universidad Agraria de La Habana (UNAH). [3] Departamento Nacional de la Técnica canina (MININT). [4] Instituto de Medicina Veterinaria Contacto: avelinalg@infomed.sld.cu

RECVET: 2008, Vol. III, Nº 5 Recibido 05.03.08 / Referencia 050802_RECVET / Aceptado: 28.04.08 / Publicado: 01.05.08 Este artículo está disponible en http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508.html concretamente en http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508/050802.pdf Revista Electrónica de Clínica Veterinaria RECVET® está editada por Veterinaria Organización® Se autoriza la difusión y reenvío siempre que enlace con Veterinaria.org® http://www.veterinaria.org y con RECVET®-http://www.veterinaria.org/revistas/recvet

Resumen La ehrlichiosis canina es una enfermedad ocasionada por Ehrlichia canis que se encuentra distribuida en casi todo el mundo. La elevación sostenida del número de perros enfermos, todos con antecedentes de infestación por garrapatas y con manifestaciones hemorrágicas diversas además de una marcada trombocitopenia, hizo sospechar la presencia de la entidad, por lo que nos propusimos como objetivo establecer el diagnóstico de la enfermedad en perros de Ciudad de La Habana. Se estudiaron un total de 155 animales todos con historia anterior de infestación por garrapatas y predominio de manifestaciones hemorrágicas. A todos los animales se les tomaron muestras de sangre, se realizó

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hemocitograma y frotis de sangre. Se confrontó el suero de 109 canes con el test inmunoenzimático Inmuno-Comb® (inmunoensayo en fase sólida). Los animales enfermos se trataron con dipropionato de Imidocarb (5 mg/kg de peso) en dosis única y seguimiento con tetraciclina (25 mg/kg de peso) cada 12 horas por 30 días, y se complementó con terapia de sostén. Como resultado de las investigaciones realizadas se detectaron 90 casos seropositivos (1:160 - 1:1280), y formaciones intracitoplasmáticas monocíticas compatibles con mórulas de Ehrlichia en 13 de ellos. De los 95 animales tratados, se logró la recuperación del 92,63 %. Teniendo en cuenta los elementos epizootiológicos y clínicos, así como las determinaciones serológicas, la evidencia de mórulas monocíticas y la respuesta al tratamiento aplicado, podemos confirmar la presencia de ehrlichiosis monocítica canina (EMC) en los perros estudiados. Palabras clave: ehrlichiosis, hemoparásitos, perro, trombocitopenia.

Summary Canine monocytic ehrlichiosis is a world wide disease caused by Ehrlichia canis. The sustained raising number of sick dogs, all with tick infection antecedents and diverse bleeding manifestations, besides a marked trompocitopenia, made us suspect the illness presence. Due to this, the objective was to diagnose canine ehrlichiosis in Havana City dogs. A total of 155 animals were studied, all of them with previous history of tick infection and predominance of hemorrhagic manifestations. Blood samples were taken to all animals; hemocytogram and blood smear were done. Serums of 109 animals were tested with Inmuno-Comb® (solid phase immunoassay). The sick dogs were treated with Imidocarb (5 mg/kg) and tetracycline (25 mg/kg) every 12 hours for 30 días. Seropositive samples from 90 animals (1:160 - 1:1280) and intracitoplasmatic bodies similar to Ehrlichia morules in 13 dogs were found. The majority of animals (92.63%) were recovered with the applied treatment. According to epizootiological and clinical characteristics, as well as the serological test, the monocytic morules and treatment responses, we confirm the presence of canine ehrlichiosis in analized dogs. Keywords: dog, ehrlichiosis, hemoparasitosis, trompocitopenia.

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1. Introducción La ehrlichiosis canina, también llamada ehrlichiosis monocítica canina (EMC), pancitopenia tropical canina, tifus canino, fiebre hemorrágica, y síndrome hemorrágico idiopático, entre otras denominaciones, es una enfermedad ocasionada por Ehrlichia canis, un microorganismo perteneciente a la Tribu Ehrlichieae, situada entre las Rickettsieae y las Chlamydiales, “parásito” intracelular obligatorio de las células mononucleares del perro y otros cánidos (Hoskins, 1991; Woody y Hoskins, 1991; Ristic y Holland, 1992). Existen referencias de la presencia de la ehrlichiosis en casi todo el mundo. En Europa, Donatien y Lestoquard (1937) la reportaron en el sur de Francia; en las Antillas, Bool y Stumoller (1957) la diagnosticaron en perros de la isla de Aruba y existe comunicación de su presencia en Estados Unidos (Ewing, 1962) y en Sudamérica (Rivadeneira, 1997). Para Davoust (1993), constituye una enfermedad de actualidad por su amplia distribución y la gravedad del cuadro que provoca, requiriéndose tratamientos prolongados, sin la posibilidad actual del empleo de la vacunación. La enfermedad puede ser transmitida mediante transfusiones de sangre de un animal afectado a otro susceptible, pero la vía de transmisión más frecuente es la picadura de la garrapata parda del perro, Rhipicephalus sanguineus (Ristic y Holland, 1992). Estudios realizados en clínicas de Austin y Dallas, reportan presencia de garrapatas, fundamentalmente Rhipicephalus sanguineus aproximadamente en un 15 % de los casos que asistieron a consulta, observando que la época de mayor reproducción del ixódido comprendió el periodo mayo- agosto, meses donde se observa una elevación de la temperatura y la humedad relativa ambiental (Dykstra y col., 1997). Un examen clínico general, como el que es posible realizar en la mayoría de las clínicas asistenciales, en ocasiones no es suficiente para emitir un diagnóstico certero de la enfermedad, ya que los síntomas son con frecuencia inespecíficos y en gran medida semejantes a los presentes en otras hemoparasitosis, tales como la fiebre manchada de las montañas rocosas, la haemobartonelosis y la babesiosis, sin embargo algunos autores coinciden en afirmar que la presencia de manifestaciones hemorrágicas, unido a una disminución marcada de los recuentos plaquetarios, permiten al menos orientar el diagnóstico en áreas endémicas de la entidad. Desde el punto de vista clínico, la ehrlichiosis canina se manifiesta en forma aguda, subclínica y crónica (Kuehn y Gaunt, 1985; Codner y FarrisSmith, 1989). Los signos clínicos observados en la fase aguda no son específicos y pueden remitir sin tratamiento en una a dos semanas, para dar paso a una fase de duración variable sin signos clínicos de enfermedad. Una disminución en los mecanismos de defensa inmunológicos del animal, frecuentemente causado por situaciones de estrés, favorece el desarrollo de la forma crónica, que se caracteriza por Diagnóstico de Ehrlichiosis en caninos en la ciudad de La Habana 3 http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508/050802.pdf

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pérdida progresiva de peso, anorexia, mucosas pálidas y signos hemorrágicos en piel, mucosas y a través de orificios naturales (Beaufils, 1997). Una vez que llega al torrente sanguíneo, Ehrlichia canis se multiplica en células mononucleares circulantes, las células infectadas son transportadas vía sanguínea a otros órganos, especialmente pulmones, riñones y meninges produciendo una serie de alteraciones fundamentalmente en la red vascular y el cuadro hematológico. En las células infectadas se adhieren al endotelio, produciendo vasculitis e infección en el tejido subendotelial. Se presenta una trombocitopenia en los animales infectados debido a un mayor consumo, secuestro y destrucción de plaquetas. La anemia observada en algunos casos se debe a una supresión en la producción de eritrocitos y mayor destrucción de éstos, siendo el número de leucocitos variable (Pierce y col., 1977; Breitschwerdt y col., 1987). El diagnóstico de la enfermedad incluye, de forma general, el estudio de la situación epizoótica del área con la demostración de la presencia de garrapata, la observación del cuadro clínico-hematológico y la observación intracitoplasmática de cuerpos de inclusión o mórulas de la rickettsia (Hibler y col., 1986), así como estudios serológicos que permiten determinar la presencia de anticuerpos séricos específicos contra el agente, generalmente utilizando la técnica de Inmunofluorescencia indirecta(Ristic y col., 1972; Pierce y col., 1977). Estudios mas recientes señalan la Reacción en Cadena de la Polimerasa como un procedimiento específico para el diagnóstico de certeza (Anderson y col., 1991). A partir del año 1996, comenzaron a reportarse tanto en clínicas asistenciales adscritas al Instituto de Medicina Veterinaria (IMV) como en los canes de las diferentes escuadras del Departamento Nacional de la Técnica Canina (DNTC) del Ministerio del Interior (MININT), perros con una signología compatible con una hemoparasitosis, que en muchos casos ocasionaba la muerte sin que fuera posible precisar la causa, aunque la ehrlichiosis canina entró en la lista de agentes sospechosos, teniendo en cuenta que se presenta con cierta frecuencia en países del área del Caribe desde los cuales se habían realizado importaciones de animales. A pesar que E. canis no ha sido reportada en Cuba afectando a seres humanos, se conoce de su presencia produciendo la enfermedad en personas en el área de Centroamérica, donde se considera al perro como un reservorio natural del agente (Dawson y col., 1996; Breitschwerdt y col., 1998) y está considerada como una enfermedad de un alto potencial zoonósico, adquiriendo una gran importancia en términos de salud pública si tenemos en cuenta la alta prevalencia de garrapatas en los perros y el eventual traspaso de este parásito al hombre cuando hay contacto estrecho con los animales (Drugueri, 2004). Si conocemos que existe un grupo de enfermedades cuya similitud en su cuadro clínico, obliga a realizar una diferenciación diagnostica y que el éxito del tratamiento de esta entidad solo se logra mediante un Diagnóstico de Ehrlichiosis en caninos en la ciudad de La Habana 4 http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508/050802.pdf

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diagnostico preciso, que permita la aplicación de una terapia adecuada desde estadios iniciales de la enfermedad, cobra trascendental importancia el establecimiento de un diagnóstico de certeza de la enfermedad. Motivado por la ocurrencia de diversos casos de caninos enfermos con un síndrome que no se correspondía con ninguna de las entidades morbosas diagnosticadas hasta el presente y que frecuentemente condujeron a la muerte de los animales, este trabajo pretende reportar la presencia de Ehrlichia canis como agente causal de estos cuadros. 2. Materiales y métodos El estudio se llevó a cabo en un período de cuatro años, se evaluaron 155 canes con edades comprendidas entre uno y diez años, de ambos sexos, de diversas razas y procedentes del servicio operativo de la Técnica Canina del Misterio del Interior en Ciudad de La Habana. Las razas investigadas fueron Pastor Alemán (98), Cocker Spaniel (23), Labrador Retriever (16), mestiza (6), Beagle (3), Rottwailer (2), Boxer (2), Basset Hound (2), Stafford (1), Lebrel Afgano (1) y Pastor Checo (1). Se incluyeron aquellos con historia anterior de infestación por garrapatas y predominio de manifestaciones hemorrágicas y en ocasiones febriles, como signos más llamativos. Se excluyeron los animales con mal estado físico que mostraron síntomas de otras enfermedades sistémicas o que estaban bajo tratamiento médico. En el momento de la consulta se colectaron garrapatas de los canes afectados, un total de 47 especímenes que fueron clasificadas según la clave de Pérez Vigueras (1956) en el laboratorio de Parasitología de la Universidad Agraria de La Habana. Se realizó una encuesta a 118 personas (criadores, propietarios, profesores y estudiantes de la Universidad Agraria de La Habana) que han tenido contacto directo o trabajan con caninos, para determinar la frecuencia de picaduras por R. sanguineus en seres humanos. Se recopilaron datos de la historia de los casos que incluyeron la raza, sexo y edad de los animales y se les realizó una inspección clínica general que incluyó la observación del estado general, la medición de la temperatura corporal y la presencia o no de alteraciones hemorrágicas, como manifestaciones fundamentales. Para el estudio de las variables hematológicas, se utilizaron los Procedimientos Operacionales de Trabajo (POT) de la División de Toxicología y Experimentación Animal del CENPALAB (CENPALAB, 2003); tomándose las muestras de sangre de la vena cefálica anterior colectadas en viales con EDTA al 10 % como anticoagulante, para su examen en el micro contador automático patentado por la Roche ABX Micros, y se determinó el hematocrito (Hto), la hemoglobina (Hb), el conteo total de leucocitos (Leuc) y el conteo total de plaquetas (Plaq). Para el conteo diferencial de leucocitos se realizaron frotis con sangre venosa y donde fue posible periférica, obtenida de la vena marginal de la oreja, La Diagnóstico de Ehrlichiosis en caninos en la ciudad de La Habana http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508/050802.pdf

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búsqueda de los microorganismos en los leucocitos se realizó en los frotis de sangre completa, en 145 animales y diez con leucoconcentración, en los casos donde la población de células blancas fue muy escasa, utilizando para ello la capa flogística post centrifugación. La obtención de la capa blanca se obtuvo por centrifugación de las muestras en tubos Eppendorf (1,5 ml) por 5 minutos, a 3.500 rpm, para concentrar los leucocitos y las plaquetas. Se descartó el plasma y se tomó la capa blanca para elaborar los frotis en láminas portaobjetos limpios según los POT (CENPALAB, 2003). Los frotis fueron fijados y teñidos por el método de May Grünwald – Giemsa y se examinaron minuciosamente al microscopio óptico binocular (Axiolab) con lente de inmersión de 100x, acoplado a una cámara fotográfica digital y un sistema de micrometría (Digipad), con la cual se tomaron las imágenes de los leucocitos afectados. Se buscaron las estructuras compatibles con mórulas o cuerpos de inclusión, los cuales se describieron y fotografiaron para su posterior comparación con los referidos por la literatura internacional. Se investigó además la presencia de alteraciones de las diferentes células hemáticas. Para el estudio serológico de las muestras y a causa de la limitada disponibilidad del kit, se priorizaron aquellas con conteos hemocitológicos bajos. La sangre fue recolectada en viales de 1,5 ml y centrifugada, previa formación y retracción del coágulo a 3.500 rpm en una centrífuga Eppendorf según los POT (CENPALAB, 2003). Los sueros obtenidos fueron depositados en viales rotulados y confrontados con el test enzimático Inmuno-Comb® (inmunoensayo en fase sólida) de los laboratorios Biogal Galed Labs., de Israel (Figs. 2a anexa y 2b), para detectar títulos séricos de IgG contra Ehrlichia canis. La respuesta inmune positiva en este test se establece partir de títulos iguales o superiores a 1:160 por Inmunofluorescencia (I.F.I). Como tratamiento (95 animales) se utilizó dipropionato de Imidocarb (5 mg/kg de peso), en dosis única y seguimiento con tetraciclina (25 mg/kg), distribuida en dos tomas diarias, por 30 días, complementado con una terapia de sostén, según requiriera el animal. Para el procesamiento matemático de los resultados se codificaron las variables nominales y estas variables codificadas y las restantes se incluyeron en una base de datos y se procesaron mediante el programa Statgraphics versión 6 de 2001. Para la comparación de las variables se realizaron análisis de varianza de clasificación simple y la prueba de rangos múltiples de Duncan cuando existió diferencia significativa. En el caso de las variables discretas se llevó a cabo una comparación de porcentajes de las frecuencias (Comprop1 del Microstat). Para determinar la posible asociación entre pares de variables se empleó el coeficiente de correlación de Pearson. En todos los casos se utilizó el nivel de significación p<0,05. Se realizó análisis de correlación y regresión entre las variables hematológicas y los resultados del kit serológico, así como entre las variables clínicas y la presencia o no de estructuras parasitarias intracitoplasmáticas y entre las variables biológicas y los títulos de Diagnóstico de Ehrlichiosis en caninos en la ciudad de La Habana http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508/050802.pdf

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anticuerpos determinados en las muestras. Se determinaron los porcentajes de de animales leucopénicos frotis positivos y negativos, tomando como referencia el valor mínimo dentro del rango normal establecido para la especie, también se determinó porcentajes de positividad, considerando como valor mínimo de referencia los títulos de anticuerpos mayores o iguales a 1:160 por Inmunofluorescencia indirecta (IFI).

Fig. 2b. Test ImmunoComb. Se confrontan 12 sueros para la determinación de la presencia de anticuerpos contra Ehrlichia canis. En la parte superior se representa el control positivo conocido (IFI). A la muestra 8 corresponde el título más alto mientras las muestras 1, 7 y 10 son negativas.

3. Resultados Todos los especímenes de garrapatas estudiados, presentaron una coloración café oscura, con el capítulo terminal, piezas bucales cortas y el escudo dorsal en forma de abanico. Las espiráculas, situadas por detrás de la cuarta coxa, presentaron forma de coma, lo que permitió clasificarlos como Rhipicephalus sanguineus. En la encuesta realizada a las personas que tuvieron contacto directo con los perros, solamente una refirió conocer de un caso de picada por una garrapata que considera provenía del perro y todos aseguran haber observado animales parasitados por este vector más de una vez al año. Considerando las épocas del año, del total de 90 casos seropositivos, se presentó una mayor proporción (p<0,05) en la lluviosa (mayo – octubre) que en la poco lluviosa (noviembre - abril) (Fig. 3).

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67,78 % a

Animales seropositivos

70 60 50 32,22 % b

40 30 20 10 0 LLUVIOSA

POCO LLUVIOSA Época del año

Fig. 3. Porcentaje de casos seropositivos en las dos épocas del año. Los principales síntomas clínicos que presentaron los animales estudiados fueron: sangrado frecuente por las encías, fosas nasales y genitales, así como otras formas de sangrado, destacando las petequias, equimosis, epistaxis y metrorragias entre otras (100 %), debilidad, depresión y anorexia (100 %), palidez de mucosas y en algunos casos pérdida crónica de peso, fiebre y edema, especialmente en miembros posteriores y escroto. (Tabla I). Tabla I. Frecuencia de presentación de los diferentes tipos de hemorragias Tipo de hemorragia

Petequias Equimosis Metrorragia Epistaxis Hifema Gingivorragia Melena Dos o más tipos Total

71 31 8 6 2 1 1 35 155

45,80 a 20,00 b 5,16* 3,87 c 1,29 cd 0,64 d 0,64 d 22,58** 100,00

Letras distintas en la misma columna indican diferencia significativa (p<0,05). * => No se compara por corresponder a un solo sexo. ** => No se compara por estar comprendido en los demás tipos.

Del total de 155 animales (Tabla I), tanto en hembras como en machos la forma de manifestación hemorrágica preponderante fue la petequia, seguida por la equimosis y la epistaxis, presentándose un apreciable Diagnóstico de Ehrlichiosis en caninos en la ciudad de La Habana http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508/050802.pdf

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porcentaje de los animales con más de una forma de hemorragia al unísono. No hubo diferencia significativa (p>0,05) entre los porcentajes de animales con fiebre, seropositivos y frotis positivos, seropositivos y frotis negativos, y los frotis negativos a los que no se les realizó serología. Como se aprecia, el 100 % de los casos presentaba alguna manifestación hemorrágica (Tabla II). Tabla II. Hallazgos serológicos y su relación con la presencia de formaciones intracitoplasmáticas y los valores de indicadores hematológicos Serología

Fiebre

Hemorragia

Hto

Leuc. T

Plaq

(X) 1

(X) %

(X) 2

Serol. + Frotis +

1 1

81,82

100

83,5 a

26,22 a

8,32

76,56 a

Serol. + Frotis -

7 9

70,90

100

95,0 b

30,72 a

9,50

78,36 a

Serol. Frotis -

1 9

42,10

100

105,1 d

34,10 b

10,55

148,16 b

Serol ¿? Frotis -

4 5

71,11

100

114,4 d

37,10 c

11,02

176,72 c

Leyenda: 1 = g/l; 2 = 109/l. Letras distintas para la misma columna indican diferencia significativa (p<0,05).

Los valores de hemoglobina y hematocrito fueron significativamente menores en los grupos de animales en que se hallaron formaciones intracitoplasmáticas y/o seropositividad, correspondiendo el extremo más bajo a los grupos con positividad en los frotis. Por otra parte, las medias de los conteos leucocitarios totales no difirieron estadísticamente (p>0,05), atribuyéndose a la alta variabilidad de los valores individuales, aunque hay una diferencia próxima a 3 x 109/l a favor de los grupos con frotis negativos, debida a un mayor porcentaje (p<0,05) de animales leucopénicos (36,00 %) en los positivos, por 7,62 % de los negativos. Las medias de conteos de plaquetas fueron menores significativamente en todos los grupos en que se detectaron formaciones intracitoplasmáticas (p<0,05) que en aquellos donde no se detectaron, correspondiendo un 92,00 % de animales con valores por debajo de 150 x 109/L, valor considerado como mínimo dentro del rango normal, para los primeros y 56,19 % en los segundos. Por otra parte, del total de animales seropositivos (90), un 80,90 % no alcanzó las 150 x 109/L, mientras entre los seronegativos (19), ese porcentaje llegó a 57,80 %. Adicionalmente, se observó una tendencia decreciente de sus valores a medida que se incrementaron los títulos de anticuerpos (Fig. 4). Al realizar la caracterización de la morfología de la lámina periférica, se observó que el 33,5% de los frotis presentaron roturas de células rojas y Diagnóstico de Ehrlichiosis en caninos en la ciudad de La Habana http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508/050802.pdf

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que en general no hubo variaciones de forma y tamaño de los hematíes, pero sí hipocromías en un 10 % de las muestras analizadas. Se halló correlación positiva y significativa (p<0,05) entre: Hemoglobina hematocrito - leucocitos totales - polimorfos nucleares neutrófilos – plaquetas, y negativa (p<0,05) entre linfocitos - polimorfos nucleares neutrófilos – plaquetas. 160 140

Plaquetas (109/L)

120 100 80 60 40 20 0 1:80

1:160

1:640

1:320

1:1 280

Títulos de anticuerpos séricos

Fig. 4. Comportamiento de los valores medios de los recuentos plaquetarios en relación con los títulos séricos de anticuerpos contra E. canis. En las plaquetas se apreció aumento de tamaño, con la presencia de macroplaquetas, en tanto el conteo total y diferencial de células blancas (neutrófilos, linfocitos, monocitos y eosinófilos) alcanzó los valores que se muestran en la tabla III, con un recuento total dentro del rango normal y un predominio de los neutrófilos. En el análisis de varianza, no se encontró diferencia significativa (p>0,05) de los conteos de los tipos de células blancas entre los animales con diferentes títulos de anticuerpos. Tabla III. Valores medios del leucograma en relación con los títulos séricos de anticuerpos. Títulos anticuer-

pos séricos 1:80 (-)

Leucocitos totales (109/l)

Neutrófilos (%)

Linfocitos (%)

Monocitos (%)

Eosinófilos (%)

10,77

6,50

66,27

11,00

27,57

13,90

1,42

1,60

2,84

3,70

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1:160

10,17

4,93

62,57

15,62

32,26

14,93

1,25

1,80

2,95

4,24

1:320

8,70

6.00

65,26

12,46

31,44

13,07

1,02

1,49

1,51

2,23

1:640

9,71

5,58

67,04

10,32

31,46

15,69

1,24

1,29

2,00

2,20

1:1 280

16,66

2,30

72,00

10,58

21,00

11,26

1,66

2,88

0,33

0,57

Leyenda: X = Media; DE = Desviación estándar. Ausencia de letras indican que no hay diferencias significativas.

De los 145 frotis de sangre y diez de leucoconcentración estudiados se detectaron formaciones intracitoplasmáticas en monocitos de 13 animales (12,03%). En cada monocito se apreció solo una estructura vacuolar de forma irregularmente redondeada, teñida de color rojo, refringente y de 1/5 a 1/4 del diámetro del núcleo de la célula hospedera (Figs. 5-8). De los 155 animales que acudieron a consulta con signos de alguna manifestación hemorrágica, se muestrearon por serología 109 animales y resultaron positivos a ehrlichiosis con títulos iguales o mayores de 1:160 un total de 90, para un 82,56 %, de ellos 71 machos y 19 hembras (Tabla IV). Todas las muestras frotis positivas, resultaron seropositivas. Tabla IV. Frecuencia de presentación de formaciones intracitoplasmáticas monocíticas en relación con los títulos de anticuerpos séricos. Títulos anticuerpos contra E. canis

Total

Con formaciones intracitoplasmáticas

<1:160 (Negativo)

0,00 a

1:160

9,60 b

1:320

16,21 b

1:640

17,24 b

1:1.280

00,00 a

Totales

109

12,03

Letras distintas indican diferencia significativa (p< 0,05).

Como se aprecia, no existen diferencias significativas entre los porcentajes de hallazgos en frotis de sangre en los grupos fundamentales de animales con diferentes títulos de seropositividad, excepto con el grupo con título de 1:1.280(comprende solo tres animales) que era significativamente igual al grupo serogenativo. Por otra parte, respecto a los resultados de la terapia aplicada, de los 95 animales positivos tratados, fallecieron 7 (7,37 %) y los 88 restantes (92,63 %), se recuperaron. Diagnóstico de Ehrlichiosis en caninos en la ciudad de La Habana http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508/050802.pdf

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Figura 5. Formaciones intracitoplasmáticas en dos monocitos. Extensión de sangre periférica del caso 41, Pastor Alemán de 2,5 años. Giemsa, 1000x. (Serología positiva a E. canis 1:160). Presentaba fiebre, decaimiento, anorexia y petequias.

Fig. 6. Formación intracitoplasmática en otro monocito del mismo frotis. Extensión de sangre periférica. (Giemsa, 1000 x).

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Fig. 7. Formación intracitoplasmática en un monocito (Giemsa, 1000 x). Caso 36 (Enzo). (Serología positiva a E. canis 1:320). Presentaba fiebre, decaimiento, anorexia, petequias y equimosis testiculares y gingivales.

Fig. 8. Formación intracitoplasmática en un monocito. (Goby). May Grunwald- Giemsa (1000 x).

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De los 155 animales que acudieron a consulta con signos de alguna manifestación hemorrágica, se muestrearon por serología 109 animales y resultaron positivos a ehrlichiosis con títulos iguales o mayores de 1:160 un total de 90, para un 82,56 %, de ellos 71 machos y 19 hembras (Tabla IV). Todas las muestras frotis positivas, resultaron seropositivas. La seropositividad por sexos mostró que los machos presentaron valores porcentuales de positividad serológica significativamente mayores (p< 0,05) que las hembras (Tabla V). Tabla V. Seropositividad por sexos en los animales investigados. Animales muestreados

109

Animales positivos

Machos

Hembras

(+)

88,55 a

65,5 b

Letras distintas indican diferencia significativa (p<0,05).

La seropositividad por razas, mostró al Pastor Alemán con la mayor frecuencia de presentación, seguido por el Labrador y el Cocker Spaniel (Tabla VI), aunque sin diferencias significativas entre ellas respecto al porcentaje de casos positivos. Tabla VI. Seropositividad por razas en animales con diagnóstico presuntivo de ehrlichiosis, investigados por el test InmunoComb®. Raza

Total

Muestreados

(+)

Pastor Alemán

84,5

Labrador Retriever

81,8

Cocker Spaniel

73,3

Mestiza

50,0

Stafford

Lebrel Afgano

Beagle

100,0

Rottwailer

100,0

Basset Hound

100,0

Boxer

100,0

Pastor Checo

100,0

155

109

82,56

Totales

Entre las tres razas fundamentales no se encontró diferencia significativa (p<0,05).

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Según los registros nacionales del MINSAP y el IMV actualizados hasta 2006, la ehrlichiosis no se ha diagnosticado en humanos ni en otros animales de Cuba. 4. Discusión Un proceso infeccioso de carácter epizoótico en una población canina de razas sobre todo “puras”, en que predominaban las manifestaciones hemorrágicas, febriles, anoréxicas y el decaimiento, en las condiciones, el lugar y el momento en que se presentó, pudo inducir a un diagnóstico presuntivo inicial de alguna de las enfermedades señaladas por Mahony y Cotter (1995), Waner y Harrus (2000) y Sainz (2000), sobre todo la babesiosis, el distemper, la hepatitis viral canina o la leptospirosis, todas ellas reportadas en Cuba (Bofill, 2006). Sin embargo, un análisis más riguroso llamaría la atención sobre importantes ausencias como la hemoglobinuria, la ictericia y los cuadros nerviosos y digestivos severos. Otros patemas orgánicos, tóxicos, inmunológicos y neoplásicos a los que hacen referencia los propios autores no se ajustarían al patrón del presente proceso si se observa que este involucraba a numerosos animales de diversas procedencias. La situación epizoótica del área en que se mantenían los animales, con el hallazgo de ectoparásitos, que según la clave de Pérez Vigueras (1956) correspondían a la especie Rhipicephalus sanguineus, constituye un elemento importante al realizar el diagnóstico, ya que está comprobado que dicha garrapata es el vector biológico de Ehrlichia canis en diversas regiones del mundo (Davoust, 1993; Dykstra, 1997; Jafari, 1997; Pappalardo, 1997; Waner y Harrus, 2000). Como se observó, casi el 70% de los animales enfermos se presentaron en los meses correspondientes a la temporada lluviosa (mayo - octubre), lo cual podría atribuirse a una mayor actividad de la población de garrapatas (Espaine y col., 1980; Waner y Harrus, 2000). Si bien el conjunto de cuadros clínicos no encajan de forma clara en los esquemas de las probables hipótesis diagnósticas de enfermedades reportadas en el país, en general se observó una gran variabilidad, lo cual por una parte, se debe sin duda a que en las condiciones dadas y suponiendo se trate de una sola entidad, concurrirían casos en diferentes fases del proceso infeccioso, y por la otra, manifiesta claros signos y a la vez, esa “inconsistencia” o marcada variabilidad que se le atribuye a la ehrlichiosis canina (Jain y Gupta, 1997; Sumption y Strachan, 1997; Neer, 1998; Hylton, 2003). A pesar que la mayoría de los signos observados se presentan de forma casi constante en las hemoparasitosis, el estudio clínico no constituye una forma de arribar a un diagnóstico de certeza de la enfermedad, pero resulta un elemento de extremo valor en la aproximación diagnóstica. La totalidad de los animales mostraron trastornos hemorrágicos en alguna de Diagnóstico de Ehrlichiosis en caninos en la ciudad de La Habana http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508/050802.pdf

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sus formas, lo que explica por qué esta manifestación se tomó como criterio de selección. Por otra parte, el hecho de que entre el 70 % y el 80 % de los sangramientos correspondieron a petequias y equimosis se corresponde con ese predominio señalado por diversos autores (Woody y Hoskins, 1991; Sumption y Strachan, 1997; Jain y Gupta, 1997), pudiéndose tomar este signo como medio orientador para el examen clínico en los animales enfermos. Las frecuencias de las manifestaciones clínicas de los animales en que se detectaron títulos positivos de anticuerpos o presencia de formaciones intracitoplasmáticas mostraron en primer lugar los sangrados, seguidos por la fiebre (casi 75 %), lo cual está en correspondencia con observaciones de Woody y Hoskins (1991) y Aroch y col. (1997), aunque no fue posible lograr un registro cuantitativo confiable del resto de los síntomas, lo cual indica una clara insuficiencia de los procedimientos del examen clínico directo en los lugares de procedencia de las muestras, en aquel momento. En coincidencia con autores como Woody y Hoskins (1991), Waner y col. (1995) y Breitschwerdt (1997), los cuadros hematológicos mostraron como indicador más significativo una clara disminución de los conteos plaquetarios, al alcanzar los grupos de animales positivos apenas la mitad de los valores medios de los grupos negativos, constituyendo el desorden hematológico más común. Los resultados muestran una relación inversamente proporcional entre los recuentos plaquetarios y los títulos de anticuerpos séricos contra Ehrlichia canis, y aún cuando no se encontró antecedencia de esta relación en la literatura consultada, pudiera estar en relación con el nivel de infección. Se conoce que el primer signo de alarma de la enfermedad es la trombocitopenia, la cual puede observarse desde las fases iniciales (Kuehn y Gaunt, 1985; Breitschwerdt y col., 1987; Waner y col., 1995), lo que explica la disminución en los recuentos plaquetarios en los animales con títulos séricos de la enfermedad y hallazgos de formaciones intracitoplasmáticas. Algo similar y ya reportado por Breitschwerdt y col. (1987) se apreció en los valores de hemoglobina y hematocrito, porque aún cuando se conoce que los valores de la serie roja, de forma general, descienden durante fases tardías de la enfermedad, muy en relación con lesiones severas de la médula ósea que constituyen signos de un pronóstico desfavorable (Waner y Harrus, 2000), la disminución de estos valores, aún en la fase aguda, se explica como resultado de una disminución en la producción de células de la serie roja y un incremento de la eritrofagocitosis de causa inmunológica (Woody y Hoskins, 1991). Mientras, los conteos totales de leucocitos mostraron una alta variabilidad y no difirieron, siendo oportuno recordar que los cuadros pancitopénicos graves correspondieron con seguridad a casos en estadío crónico (Elias, 1991). A pesar de ello, como el agente parasita únicamente leucocitos mononucleares (Donatien y Lestoquard, 1937), produciendo daños que conllevan la destrucción celular y con ello su disminución en sangre periférica (Woody y Hoskins, 1991), se explica el número Diagnóstico de Ehrlichiosis en caninos en la ciudad de La Habana 16 http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508/050802.pdf

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considerablemente mayor de animales leucopénicos entre seropositivos (36 %) en comparación con los seronegativos (7,6 %).

los

Por otra parte, los casos con signos hemorrágicos, negativos al examen de frotis, a los que no se realizó la serología y presentaron fiebre en un 71,11%, no es posible descartarlos como positivos o negativos, habida cuenta de la baja sensibilidad del primero a causa de que, por una parte, la proporción de células infectadas está entre el 1 % y el 4 % (Troy y col., 1980; Hibler y col., 1986; Risctic, 1986; Cowell y col., 1988; French, 1988; Du Plessis y col., 1990), y además, que su hallazgo es poco común en monocitos circulantes, excepto durante los aproximadamente 30 días que dura la fase aguda (Hibler y col., 1986). Si se comparan las características morfológicas de las formaciones intracitoplasmáticas halladas en los monocitos y la descripción de diversos autores (Maeda, 1987; Elías, 1991; Kakoma, 1994), con seguridad se ajustan a las que estos autores califican como mórulas de Ehrlichia canis y que resultan patognomónicas, pudiendo alcanzar hasta 1/3 del diámetro nuclear. Sin embargo, Breitschwerdt y col. (1998) aclaran que el perro puede ser infectado por otras especies como E. platys, E. equi, E. ewingii y E. chaffeensis, esta última productora de la ehrlichiosis monocítica humana, aunque según Codner y Farris-Smith (1989) y Bakken y Dumler (2001), producen cuadros clínicos más benignos que E. canis, por lo que la severidad de las manifestaciones observadas no apunta precisamente hacia una de estas especies de las que los caninos no son hospederos naturales. En contradicción con lo planteado por Waner y Harrus (2000), llama la atención el más frecuente hallazgo de formaciones monocíticas en los casos seropositivos, lo cual tendría su origen en al menos tres factores: el primero es atribuible a que se trata de un agente con el cual no existía una historia anterior de contacto con esta población canina, el segundo, que en una considerable proporción de los casos la toma no al azar de las muestras favoreció los hallazgos al seleccionar casos con cuadros clínicos compatibles en un momento de probable parasitemia, y finalmente, la acuciosidad con que se buscaron las señaladas formaciones. Al analizar los resultados obtenidos en el examen serológico, el 82,56 % de los animales mostró títulos de anticuerpos considerados como positivos contra Ehrlichia canis, lo cual según Hegarty y col. (1997) constituye un elemento confirmativo del diagnostico. Más tarde Waner y col. (2001), afirman que E. canis y E. ewingii pueden coexistir en el mismo animal e incluso, en análisis serológicos con base en IFI se producen reacciones cruzadas. Sin embargo, el hecho que todos los hallazgos del agente correspondieran a formaciones monocíticas, descarta la segunda especie, ya que está bien establecido que E. ewingii se localiza en granulocitos (Anderson y col., 1991; Gobierno Vasco, 1997). Un último indicio a favor del diagnóstico realizado lo constituye, sin dudas, la respuesta a la terapia específica. La recuperación de más del 90 % de los animales a partir de un esquema con base en el uso de dipropionato Diagnóstico de Ehrlichiosis en caninos en la ciudad de La Habana 17 http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508/050802.pdf

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de Imidocarb y la tetraciclina está en línea con las prescripciones de numerosos autores (Hoskins, 1991; Ristic y Holland, 1992; Beaufils, 1997; Shaw, 2001). Trabajos realizados por Núñez (2003) en varios distritos de México con un número grande de animales, demostraron independencia de la raza, edad y sexo con la presentación de la enfermedad, pero estos resultados muestran una elevación en la frecuencia de presentación en animales machos respecto a las hembras, lo que ya observó Burke (2004), quien reporta que los machos son más afectados en proporción 4:1 que las hembras, sin que exista una explicación clara de la causa. La seropositividad por razas no mostró diferencias significativas entre los animales estudiados, y a pesar del desigual número de animales, los valores porcentuales no difirieron. Es de destacar que aún cuando no hay diferencias, se detectaron títulos séricos en un porcentaje mayor de perros de la raza Pastor Alemán, que está descrita como la más susceptible, posiblemente debido a una respuesta disminuida de su inmunidad celular, que hace que la fase crónica se desarrolle con mayor frecuencia y severidad (Woody y Hoskins, 1991; Jafary y col., 1997; Waner y Harrus, 2000) y es un factor a considerar a la hora de emitir un pronóstico, que generalmente es más desfavorable en animales de dicha raza (Nyindo y col., 1980; Jafari y col., 1997). En Cuba no existen reportes de la presencia de estos microorganismos en los seres humanos ni en animales domésticos diferentes del perro (Bofill, 2006), aunque en opinión de los propios comunicantes, esto no es indiscutible debido a que no se ha realizado una búsqueda específica de dichos agentes etiológicos. Por otra parte, si bien la garrapata Rhiphicephalus sanguineus no es considerada hasta la fecha como vector de Ehrlichia chaffeensis ni del agente de la ehrlichiosis granulocítica humana (E. ewingii), sí lo es de E. canis para el ser humano (Unver y col., 2001; López y col., 2003), por lo que a pesar de la casi nula incidencia de picaduras en los humanos encuestados en el presente estudio, constituye una amenaza, si se tienen en cuenta reportes de focos de tales ataques, principalmente en EE.UU. (Goddard, 1989; Felz y col., 1996). Recientemente, se ha reconocido que va en aumento la frecuencia de infecciones simultáneas con más de un patógeno transmitidos por garrapatas en humanos y perros. Obviamente, esto tiene implicaciones importantes para el paciente en relación con el diagnóstico, la terapéutica y el pronóstico. En condiciones naturales, el riesgo de exposición a garrapatas, pulgas, mosquitos y moscas mordedoras es mucho mayor para los perros que para los humanos y no existe certeza acerca de la influencia que puede tener la infección concurrente con múltiples patógenos transmitidos por vectores, incluyendo Ehrlichia (Breitschwerdt, 2003).

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5. Conclusiones 1. Se realizó el diagnóstico clínico de la ehrlichiosis monocítica canina, partiendo del contexto epizootiológico, las manifestaciones clínicas, la presencia de anticuerpos y la evidencia gráfica de su agente etiológico Ehrlichia canis. 2. Las manifestaciones hemorrágicas asociadas o no a la fiebre fueron los signos principales de alerta para la presunción de la enfermedad. 3. La trombocitopenia y la leucopenia fueron las alteraciones hematológicas de mayor significación en los animales clínicamente enfermos y seropositivos. 4. Se evidenció la presencia del vector biológico Rhipicephalus sanguineus, pero con escasos reportes de ataques a los seres humanos. 6. Bibliografía 1. Anderson, B., Dawson, J.E., Jones, D.C., Wilson, K.H. Ehrlichia chaffeensis, a new species associated with human ehrliquiosis. J. Clin. Microbiol. 29:283842. 1991. 2. Aroch, I., Harrus, S., Levy, E., Bark, H. Infectious canine cycle thrombocytopenia, clinical manifestation: 21st Annual Israel Veterinary Symposium. 21 May 1996. Israel Journal of Veterinary Medicine. 52(1): 23. 1997. 3. Bakken, J. S., Dumler, J.S. Proper Nomenclature for the HGE Agent. Emerging Infectious Diseases 7: 486. 2001. Disponible en: http://www.cdc.gov/ncidod/eid/vol7no3/ bakken.htm. 23/12/05,3.40 PM. 4. Beaufils, J.P. Ehrlichiosis: Clinical aspects in dogs and cats. International Forum on Ticks and Tick-Borne Disease, Compendium on Continuing Education for the Practicing Veterinarian. 19: 57-61.1997. 5. Bofill, Pedro. Com Personal. Profesor Titular de Epizootiología. Universidad Agraria de La Habana. 2006. 6. Bool, P.H., Stumoller, P. Ehrlichia case Infections in Dogs on Aruba (Netherlands Antilles). J. Am. Vet. Med. Assoc. 130: 418-420. 1957. 7. Breitschwerdt, E.B. Suplemento del Compendio Sobre Educación Continua para el Veterinario en Práctica. Vol. 24, 1-A. 155 pp. 2003. 8. Breitschwerdt, E.B., Hegarty, B.C., Hancock, S.I. Sequential evaluation of dogs naturally infected with Ehrlichia canis, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia equi, Ehrlichia ewingii or Bartonella vinsonii. J. Clin. Microbiol. 36: 2645-2651. 1998. 9. Breitschwerdt, E.B., Woody, B.J, Zerbe, C.A. Monoclonalgammopathy associated with naturally occurring canine ehrlichiosis. J. Vet. Int. Med. 1: 2-9. 1987. 10. Burke, A., Cunha, M.D. Professor of Medicine, State University of New York Stony Brook School of Medicine. Chief, Infectious Disease Division, Winthrop University Hospital, 2004. Disponible en: http://wwww.emedicine.com/cgibin/foxweb.exe/screened./em/ga? Diagnóstico de Ehrlichiosis en caninos en la ciudad de La Habana http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508/050802.pdf

RECVET. Vol. III, Nº 5, Mayo 2008 http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508.html

Consultado 27/12/05, 3:40 PM. 11. CENPALAB (Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio, Cuba). Manual de Procedimientos Operacionales de Trabajo (POT). División de toxicología y Experimentación Animal. Laboratorio Clínico. 2003. 12. Codner, E.C., Farris-Smith, l. Characterization of the subclinical phase of ehrlichiosis on dogs, Am. J. Vet. Res. 50: 1544. 1989. 13. Cowell, R.L., Tyler,R.D.., Clinkenbeard ,K.D., Meinkoth, J.H. Erlichiosis and polyarthritis in three dogs. J .Am. Vet. Med. Ass. 192: 1093-1095. 1988. 14. Davoust, B. L’ehrlichiose canine. Le Point Veterinaire 25(151): 4351. 1993. 15. Dawson, J.E., Biggie,K.L., Warner, C.K., Cookson K., Jenkins, S., Levine J.F., Olson, J.G. Polymerase Chain Reaction evidence of Ehrlichia chaffeensis, an ethiologic agent of human ehrlichiosis in dogs from southeast Virginia. Am. J. Vet. Res. 57: 1175-1179. 1996. 16. Donatien, A., Lestoquard, F. Etat actuel des connaissances sur les rickettsioses animales. Arch.Inst.Pasteurd’Algérie15:142-187.1937. 17. Drugueri, L. La garrapata parda del perro Rhipicephalus sanguineus. Med. Vet. Universidad de Bs. As. 2004. Disponible en: http://www.zootecnocampo.com/jump/ Consultado: jump.cgi?www.detectomania.com/articulos/art20-c.htm. 23/12/05. 3.40 PM. 18. Du Plessis, J. L., Fourie, N., Nel, P. W., Evezar, D.N. Concurrent babesiosis and erlichiosis in the dog’s blood smear examination supplemented by the indirect fluorescent antibody test, using Cowdria rumiantium as antigen. J. Vet. Res. 57: 151-155. 1990. 19. Dysktra, E.A., Slater, M.R., Teel, P.D., Russell, H.L. Perceptions of veterinary clinics and pest control campanies regarding lick-related problems in dogs residing in Texas cities. J. Am. Vet. Med. Ass. 210(3): 360-365. 1997. 20. Elias, E. Diagnosis of ehrlichiosis from the presence of inclusion bodies or morulae of E. canis. J. Small. Anim. Pract. 33: 540-543. 1991. 21. Espaine, L. C., Lines, R., Demedio, J. Manual de Parasitología y Enfermedades parasitarias. Edit. EMPSES, MES. Cuba. 1980. 22. Ewing, S.A. Observation on leukocytic Inclusion bodies from dogs infected with Babesia canis. J. Am .Vet .Med. Assoc. 143: 142-187. 1962. 23. Felz, M.W. Durden, J.H., Oliver, J.R. Ticks parasitizing humans in Georgia and South Carolina. J. Parasitol. 82: 505-508. 1996. 24. French, A. Canine ehrlichiosis. Veterinary Anual 28, 196- 201. 1988. 25. Gobierno Vasco. Generalidades sobre el género Ehrlichia. Informes técnicos. Departamento de Sanidad Animal. Copyraight c 1997. Gobierno Vasco. Disponible en: http://personal.redesto.es/rajuste/epha03.htm. Consultado: 20/12/05, 2:50 PM. 26. Goddard, J. Focus of human parasitism by the brown dog tick, Rhiphicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae). J. Med. Entomol 26: 5058. 1989. Diagnóstico de Ehrlichiosis en caninos en la ciudad de La Habana http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508/050802.pdf

RECVET. Vol. III, Nº 5, Mayo 2008 http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508.html

27. Hegarty, B.C., Levy,G.L., Gager, R.F.,Breitschwerdt, E.B. Immunoblot analysis of the immunoglobulin G response to Ehrlichia canis in dogs: an international survey. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 9(1): 32-38.1997. 28. Hibler S.C., Hoskins J.D., Greene, C.E. Rickettsial infections in dogs: Part 2. Ehrlichiosis and infectious cyclic trombocytopenia. Compend. Cont. Ed. Pract. Vet. 8: 106-114. 1986. 29. Hoskins, J.D. Ehrlichial diseases of dogs: diagnosis and treatment. Can. Pract. 16: 13-21.1991. 30. Hylton, B. Canine Monocytic Ehrlichiosis. DECVIM-CA School of Veterinary Medicine, Hebrew University of Jerusalem. Rehovot, Israel. 28th World Congress of the World Small Animal Veterinary Association. 2003. 31. Jafari, S., Gaur, S.N.S., Hashemi, A. Prevalence of Ehrlichia canis in dog population of Shiraz, Fars Province of Iran. J. Appl. An. Res. 11(1): 19-23. 1997. 32. Jain, V.K., Gupta, S.L. Successful treatment of canine ehrlichiosis with doxycycline - a case report. Indian Vet. J. 74(3): 252-253. 1997. 33. Kakoma, I., Hansen, R.D., Anderson, B.E., Hanley, T.A., Sims, K.G., Liu, L., Bellamy, C., Long, M.T., Baek, B.K. Cultural, molecular and immunological characterization of the etiologic agent for atypical canine ehrlichiosis. J. Clin. Microbiol. 32: 170-175. 1994. 34. Kuehn, N.F., Gaunt, S.D. Clinical and haematologic findings in canine ehrlichiosis. Jayma 186: 355-358. 1985. 35. López, J., Rivera, M. Extracto de la charla dictada en la reunión de la asamblea del 13 de mayo del 2003. Charla Ehrlichiosis. Reunión Mevepa. 2003. 36. Maeda, Kitz., Markow, N., Hawley, RC., Mistic, D., McDade, J.E. Human infection with Ehrlichia canis, a leukocytic Rickettsia. New Engl J. Med. 316 (14): 853-56. 1987. 37. Mahony, O. M., Cotter, S. M. Bleeding disorders: epistaxis and hemoptysis. En: Ettinger, S J and Feldman, EC (eds): Textbook of Veterinary Internal Medicine 4th ed. Philadelphia, PA, WB Saunders Co., pp 200-204. 1995. 38. Neer, T.M. Canine monocytic and granulocytic ehrlichiosis. In: Greene, CE (Ed.): Infectious Diseases of the Dog and Cat, 2nd ed. W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp.139-147. 1998. 39. Núñez, O.L. Estudio de la Seroprevalencia de Ehrlichia canis en México. Rev. AMMVEPE. 14(3): 83-85. 2003. 40. Nyindo, M., Huxoll, D.L., Ristic, M. Cell- mediated and humoral immune responses of German shepherd dogs and beagles to experimental infection with Ehrlichia canis. Am. J. Vet. Res. 41: 250254, 1980. 41. Pappalardo, B. L., Correa, M.T., York, C.C., Peat, C. I., Breitschwerdt, E. B. Epidemiologic evaluation of the risk factors associated with exposure and seroreactivity to Bartonella vinsonii in dogs. Am. J. Vet. Res. 58(5): 467-471.1997. 42. Pérez Vigueras, I. Ixódidos y Culícidos de Cuba. Su Historia Natural y Médica. Ed. Minerva. La Habana, Cuba. 1956. 43. Pierce, K.R., Marrs, G.E., Hightower, D. Acute canine ehrlichiosis: Diagnóstico de Ehrlichiosis en caninos en la ciudad de La Habana http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508/050802.pdf

RECVET. Vol. III, Nº 5, Mayo 2008 http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508.html

platelet survival and factor 3 assay. Am. J. Vet. Res. 38: 1821-1825. 1977. 44. Ristic, M. Pertinent characteristic of leucocytic ricktettsia of humans and animals. In: Morello J.A; Silver S.O y Wu.H. Microbiology. Eds L. Leive, Boncezentree. American Society of Microbiology. Washington. pp 182 – 187. 1986. 45. Ristic, M., Holland, C. Ehrlichiosis canina. En: Manual de las enfermedades infecciosas en pequeños animales. 1a, ed., Editorial Médica Panamericana, S.A C S. Buenos Aires, Argentina. 1992. 46. Ristic, M., Huxoll, D.L, Weisiger, R. M., Hildebrandt, P.K., Nyindo, M.B.A. Serological diagnosis of tropical canine pancytopenia by indirect immunofluorescence. Infect. Immun. 6:226-231. 1972. 47. Rivadeneira, Elías. (Comunicación personal). Presencia de ehrlichiosis canina en la región de Guayaquil, Ecuador. Universidad Agraria del Ecuador. 1997. 48. Sainz, A., Amusategui, I., Rodríguez, F. Tesouro, M. A. Las ehrlichiosis en el perro: Presente y Futuro. 2000. disponible en: htpp://www:colvet.es/Madrid/revista/may_jun 2000/pequeñosanimales.htm. Consultado.14/12/05.1.25 PM. 49. Shaw, S.E., Day, M. J, Birtles, R.J., Breitschwerdt, E. B. Tick-borne infectious diseases of dogs. Trends in Parasitology. 17: 74-80. 2001. 50. Sumption, K., Strachan, E. Canine ehrlichiosis and quarantine of dogs. Centre for Tropical Veterinary Medicine, University of Edinburgh, UK. Vet. Rec. 140(13): 347-34. 1997. 51. Troy, G.C., Vulgamott, J.C., Turnwald, G.H. Canine ehrlichiosis. A retrospective study of 30 natural occurring cases. J. Am. Anim. Hosp. Ass. 26: 181 – 187. 1980. 52. Unver, A., Ohashi, N., Tajima, T., Stich, R.W., Grover, D., Rikihisa Y. Transcriptional Analysis of p30 Major Outer Membrane Multigene Family of Ehrlichia canis in Dogs, Ticks, and Cell Culture at Different Temperatures. Infection and Immunity 69(10): 6172-6178. 2001. 53. Unver, A., Pérez, M., Orellana ,N., Huang, H., Rikihisa, Y. Molecular and antigenic comparison of Ehrlichia canis isolates from dogs, ticks, and a human in Venezuela. J. Clin. Microbiol. 39: 2788-93.2001. 54. Waner, T., Harrus, S. Ehrlichiosis monocítica canina. In: Recent Advances in Canine Infectious Diseases, international Veterinary Information Service, Ithaca NY.2000. Disponible en: http://www.ivis.org/advances/infectdis/Carmichael/toc.asp.Consultado 13-01-06. 10:20 AM. 55. Waner, T., Harrus, S., Bark, D. J., Keysary, A. Demonstration of serum antiplatelet antibodies in experimental acute canine ehrlichiosis. Vet. Inmunopathol. 48: 177-182. 1995. 56. Waner, T., Harrus, S., Jongejan, F., Bark, H., Keysary, A. Cornelissen AWCA. Significance of serological testing for ehrlichial diseases in dogs with special emphasis on the diagnosis of canine monocytic ehrlichiosis caused by Ehrlichia canis. Vet. Parasitol. 95: 1-15. 2001. 57. Woody, B.J., Hoskins, J.D. Ehrlichial Disease of Dogs. Veterinary Clinics of North America. Small Animal Practice 21(1): 75-97. 1991.

Diagnóstico de Ehrlichiosis en caninos en la ciudad de La Habana http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508/050802.pdf