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REDVET. Revista electrónica de Veterinaria. ISSN: 1695-7504 2009 Vol. 10, Nº 11 REDVET Rev. electrón. vet. http://www.veterinaria.org/revistas/redvet - http://revista.veterinaria.org Vol. 10, Nº 11, Noviembre/2009 – http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109.html

SUMARIO Vol. 10, Nº 11, Noviembre/2009

Créditos SUMARIO Editorial 1109editorial

- En REDVET de noviembre…

ARTÍCULOS CIENTÍFICOS ORIGINALES Artículos de investigación 110903 - La importancia de los caracteres del vellón como definidor racial. Un casoestudio - The value of fleece traits as racial definitors. A case study 110905 - Análisis molecular de una cepa de virus de Newcastle de origen vacunal aislada a partir de un hisopado cloacal de aves sanas en Costa Rica - Molecular analysis of an isolated Newcastle disease virus strain obtained from cloacal swabs in healthy poultry farm in Costa Rica 110906 - Efecto de la aplicación de GnRH-análogo después del destete sobre el desempeño reproductivo de la cerda - Effect of GnRH-analogue application after weaning on reproductive performance of sows) 110907 - Relationships of systemic IgG antibody response and lesions caused by Oestrus ovis L. larvae (Diptera: Oestridae) in infected goats - Interacciones de la respuesta sistémica de anticuerpos IgG y las lesiones causadas por larvas de Oestrus ovis L. (Diptera: Oestridae) en cabras infectadas Artículos de revisión 110909 - Estado de conocimiento de las concentraciones de cadmio, mercurio y plomo en organismos acuáticos de Venezuela - Current state of knowledge of the concentrations of cadmium, mercury and lead from aquatic organisms of Venezuela 110904 - Respuesta inmune a la infección por Leishmania infantum en caninos - Immune response to infection by Leishmania infantum in dogs 110908 - Relationships between cow-calf sensory cues and the postpartum interval in suckler cows - Relaciones entre vínculos sensoriales vaca-ternero y duración del anestro postparto en vacas nodrizas Casos Clínicos 110901 - Piometra en una yegua: reporte de un caso – Pyometra in a mare: a case report Artículos técnicos 110902 - Algunas consideraciones sobre la deshidratación en perros beagle antes de su uso en investigaciones biomédicas - Some considerations on the dehydration in beagle dogs before their use in biomedical research Artículos de educación 110910 – Acurso online de redacción científica e infotecnología

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Diez artículos científicos originales, clasificados en investigación (4), revisión (4), caso clínico (1) y técnico (1) y educación (1) son los que se pueden leer este mes de noviembre en REDVET Revista Electrónica de Veterinaria, la mayoría por supuesto en español, nuestro idioma oficial, aunque con resúmenes en inglés, pero notareis que tres artículos están presentados en inglés, por supuesto que con resúmenes en español, ya que los idiomas en los que se puede publicar en REDVET son español, portugués, francés e inglés. Otros artículos de opinión, así como eventos y noticias sobre las Ciencias Veterinarias están disponibles desde nuestro portal, el Portal de los Veterinarios, http://www.veterinaria.org; entre ellos destacamos Se establece un acuerdo de colaboración entre Veterinaria.org y la Asociación Mundial de Veterinarios de Pequeños Animales (WSAVA), así como las dos encuestas y recepción de opiniones, que siguen abiertas, tanto ¿Qué te parece la posición que ocupa Veterinaria.org? visto el resultado del informe técnico Popularidad y calidad de Veterinaria.org según estadísticas de tráfico, posicionamiento en buscadores, rankings y comparativas que sitúa a Veterinaria.org en el 1º puesto de los sitios de Veterinaria en español, como ¿Qué te parece la presentación en flash de REDVET?, de magnífica acogida tal cómo van los votos y opiniones, simultáneamente a las presentaciones en .html y .ppt de los artículos desde la plataforma tradicional http://www.veterinaria.org/revistas/redvet y desde la plataforma en Open Journal Systems (OJS) http://revista/veterinaria.org, ambas de libre acceso (OA). Veréis igualmente la colaboración de Veterinaria.org y REDVET en las I Jornadas sobre animales salvajes en peligro de extinción de la Asociación Veterinaria para la Atención de la Fauna Exótica y Salvaje y la 11ª Conferencia de la Association of Avian Veterinarians.

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Entre los artículos de opinión que se pueden leer en Veterinaria.org recomendamos el titulado La Ciencia en nuestro idioma y Ciencia veterinaria: Currículo con pensamiento holistico. Aprovechamos esta editorial igualmente para felicitar a quienes culminaron con éxito el curso on line de Epidemiología y Gestión de Proyectos en Salud Animal pues en breve recibirán sus diplomas, así como comunicar que de manera igualmente satisfactoria se está impartiendo en el Aula Virtual Veterinaria de Veterinaria.org, ateniéndose al programa anunciado, el curso on line Siglo XXI: Era de las Zoonosis. Y os informamos que para diciembre 2009 y enero 2010, aparte de los números normales de REDVET se están preparando varios monográficos especiales, uno de ellos, como ya es tradicional, el monográfico de Navidad y Año Nuevo con las salutaciones y felicitaciones referentes a dichas fechas, así como igualmente artículos de opinión y de carácter social y cultural: dicho número será de formato es libre por lo que no hay normas establecidas y todos podréis participar enviando cualquier tipo de contenidos, texto e imágenes, a redaccion@veterinaria.org. Desde Veterinaria.org y REDVET deseamos que un mes más disfrutéis del contenido y os animamos a que nos trasladéis vuestras impresiones, sugerencias y comentarios escribiendo a info@veterinaria.org

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La importancia de los caracteres del vellón como definidor racial. Un caso-estudio - The value of fleece traits as racial definitors. A case study Parés Casanova, Pere-Miquel Société d’Ethnozootechnie (Clermont-Ferrand, Francia) d/e: ppares@campus.uoc.es RESUMEN Se estudiaron las relaciones fenéticas entre ocho razas o tipos ovinos turcos y uno de francés a fin de evaluar las variables más discriminantes en la distinción racial. Para ello se compuso una matriz de caracteres morfológicos (7 variables) y caracteres referidos al vellón (4 variables), siendo sometidas a un análisis de agrupación de K-medias. Nuestros resultados sugieren que cuatro características del vellón -peso del vellón sucio, longitud de la mecha, diámetro de las fibras, y porcentaje de fibras meduladas- ya permiten una diferenciación clara entre grupos. Palabras clave: K-medias | ovinometría | razas | Roja del Rosselló | Turquía ABSTRACT To evaluate which are the best discriminant variables to distinguish ovine breeds, phenetic relationships among eight turkish and one french breeds or types were studied. A matrix of 7 morphological and 4 wool characters were analyzed by a K-means test. Results suggest that four fleece traits alone –total wool weight, staple length, fiber diameter and percentage of medullated fibers- permit a glimpse of differentiation among sheep breeds. Keywords: breeds | K-means | ovinometry | Roja del Rosselló | Turkey | INTRODUCCIÓN Aunque haya autores que argumentan la superioridad de los datos moleculares sobre los morfológicos, abandonar el estudio de los datos morfológicos provoca ignorar su importancia fundamental como marco de referencia, para cualquier estudio etnológico. De hecho, sin una clasificación práctica basada en morfología, los mismos estudios moleculares no podrían interpretarse adecuadamente. El valor de los análisis morfológicos cuidadosos en combinación con análisis La importancia de los caracteres del vellón como definidor racial. Un caso-estudio.http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/110903.pdf

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apropiados de datos de ADN se está volviendo pues cada vez más aceptado. Las técnicas de clustering permiten agrupar diversos elementos en un número predeterminado de grupos, o sea, que organizan los elementos estudiados en grupos en los que se junten los elementos más parecidos. Los algortimos de clustering más habitualmente utilzados son el de K-medias, el de K-medianas y el clustering jerárquico. El algoritmo de K-medias es un método de agrupación en clústeres duro, lo que significa que un punto de datos puede pertenecer a un solo clúster, y que únicamente se calcula una probabilidad de pertenencia de cada punto de datos de ese clúster. De este modo se intentan definir grupos que minimicen la distancia entre sus elementos que pertenecen a él –razas en esta investigación- y maximice la distancia respecto al resto de las razas. Aunque teóricamente los métodos clásicos de clustering no imponen restricciones para el uso de datos, frecuentemente es necesario dirigir la toma de valores a unos pocos, de fácil obtención. En este trabajo se han elegido caracteres que han sido tradicionalmente usados en los trabajos de clasificación ovina, y concretamente los correspondientes a la estructura morfológica y a los del vellón. Ya que la clasificación basada en caracteres morfológicos depende en gran medida de la selección de los caracteres, y aunque un análisis de clasificación ideal busca incorporar tantas observaciones (caracteres) como sea posible, explorando tantas líneas de evidencia como sea posible, se ha efectuado el análisis para estimar, de todas las variables utlizadas, las más discriminantes. MATERIAL Y MÉTODOS Las razas estudiadas fueron la Karaman Blanca (Akkaraman), de la que se reconocen 2 tipos locales (Kangal –WKK- y Karakaş –WKU-), Karaman Roja (RDK), Dağliç (tipo Çifteler –DCF- y tipo campero – DFI-), Awassi (AWA), Karacabey Merino (KAM) y Merino de la Anatolia Central (CAM). Los datos descriptivos fueron obtenidos de Mason (1967) y Yalçin (1986). Como grupo externo se utilizó la raza Roja del Rosselló, a partir de Parés (2008) y datos propios (2006 a 2008). La oveja Roja del Rosselló, también denominada Roja del Litoral, debe su nombre al color rojo de su pelo- Es siempre acorne. El sobrenombre se refiere la comarca del Rosselló, antiguo territorio catalán situado al norte de los Pirineos Orientales, en la vertiente francesa. A pesar de la concreción de su denominación geográfica (y aún siendo una raza que tradicionalmente no ha transhumado), la raza se extiende, en Francia -por la región del Minervés, en el tercio oriental del Languedoc (Babo, 2000), entre Perpiñá y Montpellier, y por el norte hasta Camarès y Sant Africa, en la zona de Larzac

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(Francia)-; y, en Cataluña (España), por buena parte del Pirineo Oriental, dónde se la conoce como “berberina”. En Francia hay únicamente unas 20 ganaderías en las que existe esta raza; en Cataluña, por el contrario, la raza está muy extendida en cría y recría propia, y aunque su censo en pureza supera de mucho el francés no dispone de libro genealógico propio. Las variables estudiadas fueron, por un lado, las ovinométricas clásicas: peso vivo, alzada a la cruz, longitud corporal, profundidad y anchura torácica perímetro torácico y de la caña; y por otro lado, los referidos al vellón: peso del vellón sucio, longitud de la mecha, diámetro de las fibras, y porcentaje de fibras meduladas (Tabla 1). Para el análisis cualitativo, el estudio se basó en el estudio del clustering mediante el algoritmo K-medias. Para este estudio se predeterminaron las razas en K=3 grupos. A los datos también le se aplicó un Análisis Discriminante paso a paso, a fin de determinar las variables que mejor discrimaban las razas. La generación de los diferentes cladogramas y el análisis canónico se realizaron mediante el paquete PAST – “Paleontological Statistics Software Package for Education and Data Analysis” (Hammer et al., 2001). RESULTADOS En la tabla 1 se exponen las variables estudiadas y valores por raza. Tabla 1. Variables estudiadas y valores por raza (medidas lineales en cm; pesos en kg)

Merino Dağliç de la Merino Roja del Karaman Karaman Karaman Dağliç Awassi (Karakaş) (Kangal) Roja (Çifteler) (campero) Anatolia Karacabey Rosselló Central Peso vivo (♀) Al.cruz L.corporal Pr.torácica An.torácica (P.torácico )

43,5 68,1 75,7 28,5 20,0 83,7 P.caña 8,0 Vellón sucio 1,4 (k ) L.mecha 4,0 D.fibras (µ) 24,0 FM (%) 0,5 Al.: alzada L.: longitud

42,5 64,7 63,2 30,2 16,2 81,0 7,8 1,7 10 32 4 Pr.: profundidad An.: anchura

42,5 46 37,5 37,5 68,7 66,9 61,4 61,0 69,9 67,4 60,1 67,2 31,9 31,0 29,5 27,4 18,2 18,6 16,4 16,5 92,7 92,2 84,9 78,6 8,2 8,0 7,3 7,2 1,7 1,3 2 2 10 11 14,5 14,5 32 32 29 29 4 20 8,5 8,5 P.: perímetro FM: fibras meduladas D.: diámetro

46 65,3 67,5 30,4 17,5 91,4 8,2 1,8 13,5 32,5 4,5

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55 64,9 70,9 31,2 20,1 95,5 8,3 3,7 7,8 22,4 90

52,5 68,4 67,7 31,5 20,1 94,4 8,6 3,2 6,7 22 90

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En la tabla 2 se exponen los resultados obtenidos del anรกlisis por Kmedias usando todos los caracteres, los de tipo morfolรณgico y los referidos al vellรณn. Vemos que es precisamente al agrupar con los caracteres referidos al vellรณn que aparecen las agrupaciones mรกs coherentes: Roja del Rossellรณ separada (grupo 2), y las merinas (Karacabey Merino y Merino de la Anatolia Central), en el grupo 3. Tabla 2. Resultados obtenidos del anรกlisis por K-medias usando todos los caracteres, los de tipo morfolรณgico y los referidos al vellรณn Raza Caracteres morfolรณgicos Todos los caracteres Caracteres referidos al vellรณn RROJ 1 1 2 CAM 3 3 3 WKU 2 2 1 WKK 2 1 1 RDK 2 1 1 DCF 2 2 1 DFI 1 2 1 AWA 2 1 1 KAM 3 3 3 En la tabla 3 se exponen los resultados obtenidos en el anรกlisis canรณnico a partir de las 3 primeras variables canรณnicas y en la figura 2, los autovalores (eigenvalues) obtenidos en el anรกlisis canรณnico. Las 2 primeras variables canรณnicas explican mรกs del 75 % de la varianza observada, siendo las variables referidas al vellรณn las mรกs discriminantes para la primera variables canรณnica; y en la segunda variable canรณnica, son las variables morfolรณgicas referidas a la conformaciรณn del tรณrax y longitud corporal las mรกs discriminantes. Tabla 3. Resultados obtenidos en el anรกlisis canรณnico a partir de las 3 primeras variables canรณnicas Variable Varianza explicada (%) Diรกmetro de las fibras Longitud de la mecha Alzada a la cruz Longitud corporal Profundidad torรกcica Perรญmetro de la caรฑa Perรญmetro torรกcico Anchura torรกcica Peso vivo Fibras meduladas

Can 1 57,52 -5,799 -3,001 -0,362 -0,342 -0,324 -0,291 -0,271 -0,226 -0,077 3,539

Can 2 19,34 -0,258 -0,289 0,274 1,394 -1,274 -0,255 -1,048 1,823 -0,325 0,078

Can 3 16,03 -0,018 0,095 -0,233 0,606 0,360 -0,613 0,796 -0,061 -2,388 0,234

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Peso del vellón sucio

7,223 -0,052 0,023

Figura. Autovalores (eigenvalues) obtenidos en el análisis canónico. Las magnitudes relativas de los diferentes autovalores muestran la importancia relativa de cada variable canónica para capturar la mayor fuente de variación que separa a las razas CONCLUSIONES Son las variables referidas al vellón las más discriminantes y, en menor medida, las referidas a la conformación torácica, suficientes para discriminar entre las razas estudiadas. El resto de las variables tienen una escasa aportación informativa. Posiblemente estos caracteres más informativos son los que muestran un menor grado de interacción con el medio, es decir, son los que muestran mayor constancia. Estos datos sugieren que el vellón constituye un sistema simple de agrupamiento útil para la clasificación de las razas ovinas. BIBLIOGRAFÍA • •

Babo, D., 2000. Races ovines et caprines françases. Eds. France Agricole. Paris Hammer, Ø.; Harper, D.A.T.; Ryan; P. D., 2001. PAST: Paleontological Statistics Software Package for Education and

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• • •

Data Analysis. Palaeontologia Electronica 4 (1) [en línea]. Disponible en Web: http://palaeoelectronica.org/2001_1/past/issue1_01.html Mason, I.L., 1967. The Sheep Breeds of the Mediterranean. Commonwealth Agricultural Bureaux, Farnham Royal, Bucks, England Parés, P.-M., 2008. Caracterització Estructural i Racial de la Raça Ovina Aranesa. Tesis Doctoral. UAB. Barcelona Yalçin, B.C., 1986. Sheep and goats in Turkey. FAO ANIMAL PRODUCTION AND PROTECTION PAPER 60. FAO. Roma

REDVET: 2009 Vol. 10, Nº 11 Recibido 21..02.09 - Ref. prov. F0928 – Revisado 18.05.09 - Aceptado 24.10.09 Ref. def. 110903_REDVET - Publicado 15.11.09 Este artículo está disponible en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109.html concretamente en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/110903.pdf REDVET® Revista Electrónica de Veterinaria está editada por Veterinaria Organización® Se autoriza la difusión y reenvío siempre que enlace con Veterinaria.org® http://www.veterinaria.org y con REDVET® - http://www.veterinaria.org/revistas/redvet - http://revista.veterinaria.org

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Análisis molecular de una cepa de virus de Newcastle de origen vacunal aislada a partir de un hisopado cloacal de aves sanas en Costa Rica - Molecular analysis of an isolated Newcastle disease virus strain obtained from cloacal swabs in healthy poultry farm in Costa Rica León-Rodríguez, Bernal 1; Vargas-Brenes Olga Marta2; GuevaraSoto, Maricruz3; Solano-Pereira, Max4 1 Laboratorio Seguridad, Departamento Servicio Nacional de Salud Animal, Ministerio de Agricultura y Ganadería. Costa Rica, Tel 50622608300, e-mail: bleon@senasa.go.cr 2 Sección Virología, Departamento Diagnóstico Veterinario, Laboratorio Nacional de Servicios Veterinarios, Servicio Nacional de Salud Animal, Ministerio de Agricultura y Ganadería. Costa Rica 3 Licenciada en Medicina Veterinaria. Patología, Escuela de Medicina y Cirugía Veterinaria San Francisco de Asís 4 Departamento Diagnóstico Veterinario, Laboratorio Nacional de Servicios Veterinarios, Servicio Nacional de Salud Animal, Ministerio de Agricultura y Ganadería. Costa Rica

Resumen El virus de Newcastle (VNC) es un paramyxovirus tipo 1 (APMV-1) que pertenece a la familia Paramyxoviridae, género Avulavirus, los cuales son virus de ARN no segmentados de una sola hebra de polaridad negativa. En Costa Rica, se vacuna con cepas de baja patogenicidad y nunca se ha detectado brotes de cepas de alta patogenicidad. En el artículo se informa sobre el aislamiento de una cepa de VNC la cual se hizo a partir de un huevo embrionado inoculado con un hisopado cloacal de una muestra de una parvada de aves que no presentó signos clínicos de la enfermedad. La cepa fue identificada por la prueba de inhibición de la hemaglutinación y confirmada por PCR. Posteriormente, se secuenció un fragmento de 310 pares de bases que incluyó el dominio de corte del gen F0 (posición 112 a 117 de la proteína), se demostró por análisis filogenéticos que la cepa aislada era de baja patogenicidad y de origen vacunal. 1 Análisis molecular de una cepa de virus de Newcastle de origen vacunal aislada a partir de un hisopado cloacal de aves sanas en Costa Rica http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/111105.pdf

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Palabras clave: Virus de Newcastle | inhibición de la hemaglutinación | PCR | secuenciación | análisis filogenéticos

Abstract A Newcastle Disease Virus was isolated from an embryonated egg inoculated with a cloacal swab specimen fluid received for testing from a poultry flock without clinical signs. The sample was identify by the Hemagglutination-Inhibition Assay and confirmed by the Polymerase Chain Reaction technique (PCR). Subsequently, a region of the fusion protein gene F0 of 310 base pairs (that included the cut site at position 112 to 117 of the protein) was sequenced and was demonstrated by phylogenetic and molecular analysis that the isolated strain was low pathogenic and vaccine origin. Key words: Newcastle Virus|hemagglutination-inhibition assay|PCR|sequencing| phylogenetic analysis

Introducción El virus de Newcastle (VNC) es un paramyxovirus tipo 1 (APMV-1) que pertenece a la familia Paramyxoviridae, género Avulavirus, los cuales son virus de ARN no segmentados de una sola hebra de polaridad negativa (1). Este tipo de virus muestra variabilidad patogénica, pudiendo presentar diferentes cuadros clínicos dependiendo del tipo de cepa, por ejemplo: Velogénica (Newcastle exótico) forma más virulenta con una alta mortalidad que puede ser velogénica viscerotrópico hemorragias gastrointestinales y o velogénica neurotrópico signos respiratorios y nerviosos, mesogénica, forma intermedia, baja mortalidad con signos respiratorios y esporádicamente nerviosos, cepas lentogénicas silvestres o vacunales (2), forma moderada, problemas respiratorios o entéricos leves, subclínicos y o asintomático (3). En el hombre este virus puede provocar conjuntivitis autolimitante que no deja secuelas (4). Cepas del VNC de alta patogenicidad producen alta morbilidad y mortalidad en aves generando pérdidas económicas cuantiosas. En Estados Unidos de América, por ejemplo el costo de las medidas de control y sacrificio de las formas velogénicas hasta el 5 de agosto del 2003 en 4 estados del suroeste, fue aproximadamente de 188 millones de dólares, lo que correspondió al sacrificio de 9.3 millones de aves 2

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infectadas o expuestas y la cuarentena de un poco mas de 19000 granjas (5). No es de extrañar entonces, que este virus esté incluido en la lista de la Organización Mundial de Sanidad Animal, OIE (6). Análisis filogenéticos recientes, basados en el tamaño del genoma y en la secuencia del gen F y de la polimerasa, han señalado dos clases dentro del serotipo 1 del virus de Newcastle (7). La mayoría de los virus notificados pertenecen a la clase II, mientras que la clase I incluye reportes de virus de aves acuáticas y en mercados de aves vivas en los Estados Unidos(8) Estos mismos estudios filogenéticos dentro de la clase II han determinado hasta el momento 9 genotipos. El genoma del virus codifica para 6 proteínas, la ARN polimerasa dependiente de ARN (L), la proteína Hemaglutinina-Neuraminidasa (NH), una proteína de fusión (F), la proteína de la matriz (M), una fosfoproteína (P) y la nucleoproteína (N). La proteína F permite la fusión de la membrana del virus con la membrana de la célula. Durante la replicación de los viriones el precursor de esta glicoproteína (F0) es cortada para producir dos proteínas F1 y F2 las cuales son necesarias para que estas partículas sean infecciosas (9). Se ha determinado que la patogenicidad de las cepas está asociada a la secuencia de aminoácidos en el punto de corte de la proteína. La secuencia consenso en la región Carboxilo Terminal de la proteína F2 para cepas velogénicas y mesogénicas es 112R/K-R-Q-K/R-R-116 y una fenilalanina F117 en la terminación amino de la proteína F1, mientras que las cepas con baja patogenicidad , lentogénicas poseen la secuencia: 112G/E-K/R-Q-G/E-R116 y una L (leucina) en el residuo 117 (9,10,11). En Costa Rica se vacuna con cepas vivas atenuadas del tipo lentogénicas y hasta el momento no se han presentado brotes de cepas velogénicas o mesogénicas. Como parte del programa de vigilancia epidemiológica llevado a cabo por personal del Servicio Nacional de Salud Animal (SENASA), junto con las empresas avícolas del país, se realizan constantes muestreos en granjas industriales, en los puertos de entrada de huevos fértiles e hisopados traqueales y cloacales de animales importados, muestreos aleatorios en diferentes granjas del país, incluyendo aves de traspatio tanto de animales sanos como denuncia de casos clínicos, con la finalidad de realizar una detección oportuna de la presencia de estos virus en las parvadas del país. Por esta razón es fundamental tener un método eficaz y rápido para el diagnóstico y diferenciación de las 3 Análisis molecular de una cepa de virus de Newcastle de origen vacunal aislada a partir de un hisopado cloacal de aves sanas en Costa Rica http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/111105.pdf

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distintas cepas del virus de Newcastle. La prueba de Reacción en Cadena de la Polimerasa conocidas en inglés por sus siglas PCR, es una metodología rápida, sensible y altamente específica que puede ser usada para ratificar un resultado previo obtenido de otra prueba, así como una sospecha en el caso de animales que presenten signos clínicos y un grado importante de mortalidad. Sin embargo, no basta con demostrar que se ha aislado un virus de Newcastle y que ha sido confirmado por PCR sino que también hay que demostrar si el virus aislado es de alta o baja patogenicidad. En esta publicación se informa sobre el aislamiento de un virus de Newcastle, realizado por el Laboratorio Seguridad (LSE) del Departamento Diagnóstico Veterinario del Laboratorio Nacional de Servicios Veterinarios (LANASEVE). Materiales y Métodos Vigilancia epidemiológica. El 26 de octubre del 2007 ingresaron 6 hisopados los que se identificaron con el protocolo D4533-07 y las muestras con los números 0999-07 hasta 1004-07, el cual correspondía a un muestreo rutinario de aves sanas de una granja localizada en la provincia de Alajuela. Aislamiento viral a partir de huevos embrionados. Los 6 hisopados de este protocolo se identificaron una vez que ingresaron al Laboratorio de Seguridad, posteriormente fueron centrifugados a 1000 rpm (DYNAC, Clay Adans Brand. USA) por 10 minutos, a cada sobrenadante se le agregó de 1400 µl a 2800 µl de una combinación de antibióticos (12) los cuales fueron inoculados el 31 de octubre de 2007 en huevos embrionados libres de patógenos específicos de 10-11 días de edad, (SPF- obtenidos en el Bioterio del SENASA). Con cada hisopado se inocularon 3 huevos embrionados (procedimiento realizado dentro de una cámara de flujo laminar clase II A). Cada huevo fue limpiado en el área de la cámara de aire con alcohol iodado al 70%. Luego de una punción, se inocularon 300 µl del hisopado con una jeringa de 1 ml, adicionalmente, 100 µl fueron dispensados en un vial con 2 ml de caldo infusión cerebro corazón y se dejaron a 37 °C por 24 horas como control de esterilidad del hisopado. Los huevos se incubaron a 37 °C y se revisaron en el ovoscopio cada día durante 5 días. Se descartaron los embriones muertos dentro de las primeras 24 horas de haber sido inoculados. Se refrigeraron los embriones 4

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muertos del día 2 al día 5, al cabo de este periodo se dejaron los embriones sobrevivientes en refrigeración toda la noche. Al siguiente día se recolectó aproximadamente 1.5 ml del líquido amnio-alantoideo (LAA) de cada uno de los huevos. Prueba de Hemaglutinación en placa (HA). Los eritrocitos utilizados en la prueba de hemaglutinación y de inhibición de la hemaglutinación fueron obtenidos de aves seronegativas a la enfermedad de Newcastle e Influenza Aviar, criadas y mantenidas en el Bioterio del SENASA. Se realizaron diluciones seriadas de 50 µl del LAA en 50 µl de PBS (un total de 4 pozos de una placa de microtítulo), posteriormente se agregó a cada pozo, 50 µl de glóbulos rojos de ave al 0.5%, la mezcla se homogenizó con movimientos de rotación durante 1 minuto. (Se dejaron 5 pozos como control positivo, uno como control negativo y dos para control de células), luego de una incubación a temperatura ambiente de 40 minutos se realizó la lectura. Los LAA que presentaban HA, se montaron nuevamente por duplicado usando todos los pozos de las placas. Prueba de Inhibición de la Hemaglutinación (IHA) en placa. Una vez que las muestras ingresaron al laboratorio, se procesaron siguiendo la metodología descrita previamente (13). Las muestras venían con una titulación hemoaglutinante de 1:2048 y se ajusta para una concentración de 16 unidades hemoaglutinantes UHA/ 50µl (8UHA/ 25 µl), en, solución bufferada fosfatos (PBS). Se montó la muestra por triplicado junto con los respectivos controles: control negativo A, una hilera con la muestra en estudio enfrentada con un Suero control normal, Control negativo B, se empleó LAA recolectado de huevos tipo SPF utilizados en su oportunidad como controles negativos sin inocular, confirmados con reacción Hemoaglutinante negativa y almacenados a -80°C. Para el control positivo se utilizó una hilera con antígeno de Newcastle de referencia (136-ADV) enfrentado con el antisuero de referencia (433-ADV). Los controles fueron comprados en el Laboratorio Nacional de Servicios Veterinarios, (NVSL), Ames, Iowa del USDA-APHIS. Se dispensaron 25 µl del LAA reaccionante (16UHA/ 50 µl) en cada uno de los pozos. Se adicionaron 25 µl del antisuero de Referencia de 5 Análisis molecular de una cepa de virus de Newcastle de origen vacunal aislada a partir de un hisopado cloacal de aves sanas en Costa Rica http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/111105.pdf

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Newcastle en el primer pocillo y se realizaron diluciones seriadas a través de siete pozos. Se incubaron por 30 minutos a temperatura ambiente, posteriormente; se adicionaron 50µl de suspensión de eritrocitos (GR) al 0.5% en cada pozo. La lectura se realizó cuando los GR control sedimentaron en el fondo del pozo, aproximadamente a los 20-30 minutos. Índice de Patogenicidad: embrionaria.

Tiempo

promedio

muerte

El líquido alantoico infectivo es diluido en solución salina estéril se a . De cada dilución, se inoculan 0.1mL en toman las diluciones la cavidad alantoica de cada uno de 5 huevos embrionados (libres de antígeno específico de 9-10 días de edad) y se incuban a 37°C. Otros 5 huevos son inoculados con 0.1mL de cada dilución (mantenidas a 4°C) 8 horas después y se dejan incubando a 37°C. Cada huevo se examina dos veces al día durante 7 días y la fecha y hora de muerte de cada embrión se apunta. La dosis letal mínima es la dilución más alta de virus que cause la muerte de todos los embriones que fueron inoculados con esa muestra. El tiempo medio de muerte (Mean Death Time -MDT) es el tiempo medio en horas para la dosis letal mínima en matar todos los embriones inoculados. El MDT ha sido utilizado para clasificar cepas de NDV en velogénicas (toman menos de 60 horas en matar); mesogénicas (toman entre 60-90 horas en matar); y lentogénicas (toman más de 90 horas en matar). Extracción de ácido nucleico. Las vacunas B1 y La Sota liofilizadas se reconstituyeron, cada una, con 5 ml de agua destilada estéril y se extrajeron junto con el antígeno de Newcastle NDV AG136 utilizado en la IHA, para ello se usó un método comercial por columnas y centrifugación (NucleoSpin® Macherey-Nagel Alemania). Prueba PCR Newcastle Comercial. Las muestras se retrotranscribieron y amplificaron utilizando un protocolo de un PCR comercial (Genekam Biotechnology AG, Alemania) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se hizo una dilución 1:100 del retrotranscripto y se realizó el PCR comercial para Newcastle. 6 Análisis molecular de una cepa de virus de Newcastle de origen vacunal aislada a partir de un hisopado cloacal de aves sanas en Costa Rica http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/111105.pdf

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Retrotranscripción de las muestras extraídas. Se agregó 1 µl de hexámeros (300 ng/ µl), 2 µl DNtps (10 mM Sigma, USA.), 4 µl de muestra extraída, posteriormente se incubó a 70 °C por 10 min, luego se puso en hielo, después de esto se agregó 1 µl de Retrotranscriptasa RT (virus de leucemia murina Maloney, 200 unidades/ µl, Sigma USA.), 2 µl de Buffer de la RT, 0.5 µl del Inhibidor de RNAsas (40 unidades/µl Roche, USA.) y 6.5 µl de agua tratada con DEPC para un total de 20 µl de reacción. La reacción se corrió en un termociclador 2400 Eppendorff, con el siguiente esquema 42 °C por 60 min, 99 °C por 5 min. Prueba PCR Newcastle adaptado por el LSE. La metodología de este PCR se adaptó de un protocolo publicado por Pang y colaboradores 2002 (14). Las muestras se amplificaron en un termociclador GeneAmp PCR System 2400 de Perkin Elmer. La región amplificada va de la posición 148 nt a 457 nt del gen F del virus de Newcastle tomando como referencia la secuencia EU330230. Detección de productos amplificados Tanto para el PCR comercial como para el adaptado se utilizaron geles de agarosa al 2%. A cada muestra se le agregó 2 µl de buffer de corrida y se usó un marcador molecular de 100 a 1000 pb. Se cargaron 10 µl de muestra a analizar por pozo y se corrieron a 120 v por 40 min Tanto para el PCR comercial como para el PCR “adaptado” el tamaño del amplicon debe ser de 320 pb Purificación de las bandas a partir de agarosa. Las bandas positivas observadas en el PCR “adaptado” fueron seccionadas del gel de agarosa y purificadas utilizando un kit de Qiagen (EUA) siguiendo las indicaciones del fabricante. Reacción de secuenciación. Se utilizaron los mismos iniciadores de la reacción de PCR a una concentración de 1.6 µM, 2 µl de cada iniciador, 4 µl del ADN purificado, 4 µl de master mix Big Dye (Apply Biosystems, USA.), 2 µl Buffer (Apply Biosystems, USA.), 8 µl agua, las muestras se corrieron en un termociclador GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer), con el siguiente programa 96 °C por 1 min y 25 ciclos de 96 °C por 10 seg, 50 °C por 5 seg, 60 °C por 4 min, se mantuvo a 4 °C, finalmente se7 Análisis molecular de una cepa de virus de Newcastle de origen vacunal aislada a partir de un hisopado cloacal de aves sanas en Costa Rica http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/111105.pdf

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precipitó el ADN usando EDTA y acetato de sodio 3 M y se realizó la electroforesis en un secuenciador Genetic Analyzer 3130. Análisis filogenético. Una vez que se limpiaron las secuencias 1002-2 y La Sota se alinearon usando el programa Bioedit (15), junto con otras secuencias obtenidas de Genbank los números de acceso aparecen en la fig 3. El análisis filogenético se realizó usando el programa Mega (16), utilizando la prueba de Neighbor-Joining, con un boostrap de 1000 réplicas. Resultados

En el cuadro 1 se presenta la mortalidad observada en los embriones pos inoculación. Tabla I. Mortalidad de los embriones inoculados con hisopados de muestras traqueales o cloacales. Muestra Días pos inoculación

Hisopado 1 2 3 4 999 1+-1* 1001 1-3 1-2 1002 1-1 1003 1-2 1004 1-3 1-1 1005 1-2 1-3 + cantidad de embriones muertos en ese protocolo * corresponde al número que se le dió al huevo inoculado

1-1 1-3 1-3

Todos los huevos, excepto aquellos cuyos embriones murieron el día 1 de inoculación, fueron recolectados el 6 de noviembre de 2007. El 7 de noviembre se realizó la prueba de hemoaglutinación, solo en el LAA recolectado del huevo 2 del hisopado 1002 se observó una reacción de hemoaglutinación con un título preliminar 1:16. El 13 de noviembre se pasó una alícuota al laboratorio de Virología donde se realizó la prueba de inmunodifusión en agar para influenza, la cual dió negativa el 14 de noviembre. Ese mismo día se repitió la prueba de hemoaglutinación por duplicado usando todos los pozos de la placa, el título alcanzado fue de 1:256. Con el resto del LAA del huevo 2 se inocularon 3 huevos para un segundo pasaje el 14 de noviembre, el embrión del huevo 3 murió el primer día (no se recolectó) y los dos restantes el día 5, la recolección se realizó el 20 de noviembre, el 22 se hizo la prueba de hemaglutinación, título 1:16 y el siguiente día se repitió la prueba en la 8

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placa completa por duplicado, el título fue de 1:2048. La cantidad de LAA permitió esta vez hacer extracción de ácidos nucleícos para realizar la prueba de PCR y se remitió parte del LAA al laboratorio de Virología, la muestra repitió negativa por inmunodifusión en agar gel para influenza aviar pero dio positiva la prueba IHA para la enfermedad de Newcastle el día 26 de noviembre. El titulo final obtenido fue mayor a 1:128, sin embargo, no fue posible obtener la titulación final debido a la poca existencia disponible de la muestra. En la fig 1, se presenta el resultado del PCR comercial, se observa una banda esperada (320 pb) en el carril 1, vacuna B1, carril 2, antígeno NDV AG136, carril 3, muestra del LAA 1002-2 así como en el 6, control positivo de la prueba y carril 9, dilución 1:1000 de la muestra extraída del segundo pasaje. No se observó amplificación en los carriles 4, control de reactivos (agua), 5 control negativo de la prueba o en los 7 y 8 resultado de la amplificación de las diluciones 1:1000 de la vacuna B1, y el antígeno NDV AG136 respectivamente.

Fig 1. PCR Newcastle comercial

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Fig 2. Electroferograma de la secuencias sentido 5’ y antisentido 3’ 10 Análisis molecular de una cepa de virus de Newcastle de origen vacunal aislada a partir de un hisopado cloacal de aves sanas en Costa Rica http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/111105.pdf

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Fig 3. Dendrograma de los diferentes genotipos del virus de Newcastle 11 Anรกlisis molecular de una cepa de virus de Newcastle de origen vacunal aislada a partir de un hisopado cloacal de aves sanas en Costa Rica http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/111105.pdf

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El electroferograma de la secuenciación se muestra en la fig 2, tanto de la secuencia sentido como antisentido (complementaria inversa) de la muestra 1002-2 las cuales se analizaron con el programa DNASTAR (USA) usando como patrón la secuencia La Sota obtenida del Genbank con el número de acceso AY845400. Es importante notar que en ciertas regiones donde la secuencia no es nítida en uno de los sentidos la secuencia es compensada en el otro sentido. La muestra 1002-2 aislada en el Laboratorio de Seguridad del Departamento Diagnóstico Veterinario del LANASEVE, se ubica en el genotipo 2, junto con las cepas vacunales B1 y La Sota tanto la secuenciada como la obtenida del Genbank así como también la cepa EU239663, no se observó diferencias en la secuencia de nucleótidos en estas secuencias con un valor boostrap de 99. Dentro del genotipo 2, pero en un nodo diferente se observan otras secuencias como Beaudette C y Texas G.B (ambas velogénicas), separada de estas se encuentra la cepa mesogénica DQ452298, fig 3. Finalmente, en la figura 4, se muestra la comparación de los dominios del sitio de corte del precursor de la proteína F (112117). Las cepas lentogénicas del dendrograma fig 3 de los genotipos 2 y 1 presentan la misma composición de aminoácidos que a la cepa aislada en nuestro laboratorio. La cepa AF309418 que aparece en el dendrograma junto con la cepa aislada 1002, corresponde a la cepa vacunal lentogénica Hitchner B1. Fig 4.- Dominio del sitio de corte del precursor de la proteína F0 12 Análisis molecular de una cepa de virus de Newcastle de origen vacunal aislada a partir de un hisopado cloacal de aves sanas en Costa Rica http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/111105.pdf

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Debido a problemas de infraestructura, se decidió utilizar la prueba de mortalidad promedio de huevos embrionados en vez del índice de patogenicidad intracerebral. Después de inoculados los huevos se determinó que la menor dilución en la que murieron todos embriones fue 10-8 y que el periodo en el que se logró el 100% de la mortalidad fue mayor a 90 horas.

Discusión Las cepas velogénicas de la enfermedad de Newcastle están incluidas en la lista de la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE), por lo que su diagnóstico debe ser notificado a este organismo, lo que conlleva a realizar estrictas medidas cuarentenarias, el sacrificio inmediato de las aves involucradas en el brote, así como embargos comerciales (6). Por esta razón la caracterización y posterior diferenciación de este tipo de cepas con respecto a las mesogénicas y lentogénicas es de suma importancia. Esta caracterización puede ser realizada con técnicas “in vivo” como el índice de patogenicidad intracerebral (ICPI) realizado en pollitos de un día de edad, el tiempo promedio de muerte de huevos embrionados (MDT) libre de patógenos específicos y el índice de patogenicidad intravenoso (IVPI) realizado en aves de 6 semanas de edad, además de estas pruebas biológicas la OIE ha aceptado también el patrón de aminoácidos derivado de la secuenciación de nucleótidos en el sitio de corte de la proteína F como criterio adicional de virulencia (15). En este estudio se implementó el criterio utilizando la técnica molecular como metodología válida para determinar el grado de virulencia de la cepa aislada en el laboratorio, a partir de huevos embrionados SPF, y se reforzó el criterio con la prueba MDT. Adicionalmente, se realizó un análisis filogenético para establecer el posible origen de la cepa aislada. El conocer los linajes o genotipos de cualquier agente infeccioso es muy importante desde el punto de vista epidemiológico, ya que permite rastrear el origen de estos y así tomar medidas de control para evitar futuros brotes. Con respecto a Newcastle varias panzoótias se han dado en el mundo correspondientes a los genotipos II, III y VI. En Japón, el genotipo VII está empezando a desplazar al VI en aves domésticas (17). En Costa Rica no tenemos cepas velogénicas circulando y se vacuna con cepas lentogénicas. Aún no hemos generado estudios sobre la situación de posibles cepas lentogénicas en aves acuáticas las que según la 13 Análisis molecular de una cepa de virus de Newcastle de origen vacunal aislada a partir de un hisopado cloacal de aves sanas en Costa Rica http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/111105.pdf

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literatura podrían jugar un papel importante en la epidemiología de VNC en brotes en aves domésticas o industriales (18). El virus de Newcastle afecta alrededor de unas 250 especies de aves, siendo las aves acuáticas las más resistentes, las cuales pueden ser reservorios de la enfermedad (18). Nuestro país al igual que el resto del istmo Centroamericano es un corredor biológico y poseemos gran diversidad de aves y entre esa gran variedad tenemos especies que podrían ser portadoras de la enfermedad (19), razón por la cual es necesario estar constantemente muestreando las granjas industriales, así como los casos de denuncias de presencia de signos clínicos en aves de traspatio y a nivel de laboratorio responder con un diagnóstico preciso en el menor tiempo posible. Por esta razón se han desarrollado diferentes metodologías como: PCR tiempo real para diferenciar entre cepas de alta y media patogenicidad, sin embargo, este tipo de pruebas podrían no detectar todas las cepas debido a mutaciones en los genes donde se unen los iniciadores o las sondas (5). Los iniciadores usados en este estudio fueron seleccionados de regiones bastante conservadas con muy pocos polimorfismos según se constató cuando se compararon con secuencias de los diferentes genotipos obtenidos del genbank. A nivel molecular se han usado enzimas de restricción que reconocen el sitio de corte del gen F y que logren diferenciar entre cepas de baja o alta patogenicidad (20). Sin embargo; la eficacia de este método también está sujeta a que no se den mutaciones en la secuencia de nucleótidos, por lo que la secuenciación del gen F sigue siendo la técnica de elección para demostrar molecularmente el grado de virulencia de la cepa aislada así como la presencia de estas mutaciones. Publicaciones previas han establecido que la secuenciación del gen F o en su defecto de regiones que van del nucleótido (nt) 47 al 420 nt o del 329 nt al 582 pueden ser usados para determinar relaciones filogenéticas de cepas de Newcastle, seleccionando el fragmento de nucleótidos de la región variable 47 al 420 nt como el fragmento de referencia o estándar para el genotipeo de las cepas de Newcastle (18, 21, 22). En un estudio realizado en China en el que se aislaron 30 cepas de brotes desde 1996 hasta el 2005 en el que se compararon estas 3 regiones, los autores concluyen que la secuenciación del gen F completo sería la mejor opción para realizar análisis filogenéticos (21). Así mismo señalan, que la secuenciación del sitio de corte de la proteína F no es suficiente para caracterizar adecuadamente la patogenicidad de una cepa del virus de Newcastle, por lo que deben de realizarse además 14

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ensayos “in vivo”. Otro estudio también realizado en China comparó también 3 regiones del gen F que van del nt 47 al 420, 329 al 582, y del 47 l a1708, a diferencia del estudio anterior estos autores señalan que estas 3 regiones pueden ser usadas para realizar análisis filogenéticos; pero concuerdan en indicar que el sitio de corte no es suficiente para caracterizar con precisión la virulencia de la cepa (22, 23). Según el manual de pruebas diagnósticas y vacunas para los animales terrestres de la OIE, en la definición de caso de enfermedad de Newcastle, dada la extrema variación de los signos clínicos y virulencia observada por las cepas de este virus se decidió que para reportar un brote de enfermedad de Newcastle, la cepa debe de cumplir con uno de los siguientes criterios de virulencia: Un índice de patogenicidad intracerebral mayor o igual a 0.7 o cumplir con el patrón de aminoácidos descrito anteriormente para cepas mesogénicas o velogénicas, si dicho patrón no puede ser establecido debe recurrirse al índice (ICPI). Un aspecto importante que se debe recalcar es que a diferencia de los estudios Chinos citados previamente en los que se señala la importancia de caracterizar los aislamientos con el uso de pruebas biológicas, los animales de donde provino la muestra 1002-2 eran aves de 15 semanas que no presentaban ningún tipo de signo clínico. En el estudio de Qin et al, las aves presentaron mortalidades que variaron de un 90% en animales jóvenes a menos de un 2% en aves de postura, en las que se observó una caída en la producción de huevos de un 90 a un 40% (21), en el segundo estudio de Tan et al, la mortalidad fue de 71% en palomas mensajeras, dos meses después se presentó un brote en pollos con una mortalidad de un 97% (22), Con respecto a las pruebas biológicas en el estudio de Qin et al, (21) dos muestras caracterizadas por el ICPI y por la secuencia de aminoácidos como velogénicas, fueron catalogadas como lentogénicas por el IVPI (21), mientras que en un estudio realizado en Canadá durante un brote en Cormoranes, el ICPI clasificó 5 aislamientos como mesogénicos (0.7- < 1.60) y 6 velogénicos (> 1.60), mientras que el IVPI en estos mismos aislamientos fueron 9 lentogénicos (<1.40) y 2 velogénicos (> 1.60), (según la clasificación de ICPI e IVPI dada por Qin, (21) mientras que todos los 15 aislamientos aislados en el brote en Canadá presentaron la secuencia RRQKR*F correspondiente a cepas mesogénicas o velogenicas (24). De estos resultados se desprende que estos índices tampoco presentan una buena correspondencia entre sí. Nosotros nos inclinamos por el índice MDT por lo práctico de la prueba ya que no requería lidiar con 15

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los animales lo que representa: manejo adecuado e instalaciones con un mayor grado de bioseguridad, el resultado del MDT apoyó los resultados moleculares indicando que la cepa aislada correspondía a un virus lentogénico. Un método in vitro que podría diferenciar entre cepas de velogénicas de lentogénicas es el uso de proteasas tales como tripsina la cual es fundamental para que se formen placas en cultivos celulares infectados con cepas lentogénicas, mientras que con cepas virulentas no es necesario el uso de tripsina para que se formen dichas placas, sin embargo; esta técnica también presenta sus excepciones (18) y no está avalada por la OIE. El uso de esta metodología como el de ICPI (sin el uso de controles de cepas velogénicas) podría ser implementada y evaluada en nuestro laboratorio, siempre y cuando las condiciones de infraestructura lo permitan, para realizar una mejor caracterización de cualquier otra cepa que se logre aislar en un futuro Con respecto a la validez del tamaño del fragmento para realizar análisis de secuencias podemos señalar que en el presente estudio, el fragmento amplificado y secuenciado (320 pb) cubre un 73% de la región nt 47 al 420 y se extiende 37 nt mas hacia el extremo 3 prima. Otros autores han realizado estudios filogenéticos con fragmentos incluso más pequeños 252 pb del 282 nt al 535 nt (25). El fragmento secuenciado aquí, pudo discriminar entre los diferentes genotipos del virus de Newcastle según los resultados obtenidos en la fig 3, indicando que la cepa aislada pertenece al genotipo II del virus de Newcastle y lo que es más importante fue capaz de diferenciar entre las cepas lentogénicas y velogénicas dentro de este genotipo; no obstante, no permitió diferenciar entre las cepas B1, la Sota, la secuencia EU23966l y la cepa aislada en el LANASEVE. Comparando el fragmento que va del nt 47 al 146 del gen F (el cual no es abarcado por la región amplificada en este estudio), en estas mismas secuencias obtenidas del genbank, (excepto la 1002-2 ) la cepa B1 se diferencia de la Sota por 4 nucleotidos y la Sota presenta un nucleótido de diferencia cuando se compara con la secuencia EU23966 (datos no mostrados).

En conclusión debido al aislamiento de una cepa del virus de Newcastle a partir de hisopados cloacales realizada en el LANASEVE, se implementaron metodologías moleculares y biológicas como el índice MDT, para caracterizar esta cepa demostrándose que el aislamiento 1002-07 correspondió a una cepa lentogénica vacunal, ubicada dentro 16 Análisis molecular de una cepa de virus de Newcastle de origen vacunal aislada a partir de un hisopado cloacal de aves sanas en Costa Rica http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/111105.pdf

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del genotipo 2, y que dichas metodologías son herramientas valiosas para la caracterización de cepas de Newcastle en futuros estudios. Agradecimientos. A todas la personas que leyeron el borrador de este artículo y nos dieron sus sugerencias. En especial a la Sra. Esmeralda Vásquez y al Sr. Fabián Carbajal técnicos del Laboratorio de Seguridad quienes realizaron el aislamiento viral y la hemaglutinación, el índice MDT así como la extracción del ARN y a la Sra. Alejandra Ballestero, quien realizó la prueba de Inhibición de la Hemaglutinación. Bibliografía 1. 2. 3. 4. 5.

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REDVET: 2009 Vol. 10, Nº 11 Recibido 11.05.09 - Ref. prov. MAY050926 – Revisado 03.08.09 - Aceptado 30.10.09 Ref. def. 110905_REDVET - Publicado 15.11.09 Este artículo está disponible en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109.html concretamente en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/110905.pdf REDVET® Revista Electrónica de Veterinaria está editada por Veterinaria Organización® Se autoriza la difusión y reenvío siempre que enlace con Veterinaria.org® http://www.veterinaria.org y con REDVET® - http://www.veterinaria.org/revistas/redvet - http://revista.veterinaria.org

19 Análisis molecular de una cepa de virus de Newcastle de origen vacunal aislada a partir de un hisopado cloacal de aves sanas en Costa Rica http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/111105.pdf

Efecto de la aplicación de GnRH-análogo después del destete sobre el desempeño reproductivo de la cerda - Effect of GnRH-analogue application after weaning on reproductive performance of sows) Romo Rubio Javier Alonso1*, Romo Valdez Juan Manuel1,2, Acuña Meléndez Omar Salvador1, Güémez Gaxiola Héctor Raúl1,2, Rubén Barajas Cruz1, Juárez Barranco Felipe1 y Félix Camacho Silvia Alicia1 * Doctor en Ciencias Pecuarias; Profesor de Tiempo Completo, titular del curso de Producción Porcina de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma de Sinaloa 1 Miembros del Cuerpo Académico Salud y Producción Animal de la FMVZ-UAS 2 Granja Porcina “La Huerta”, Culiacancito, Culiacán, Sinaloa * E-mail: romo60@uas.uasnet.mx C. Postal. Solón Sabre Morrel No. 3097, Fraccionamiento Universidad 94, Culiacán, Sinaloa. Resumen Con el objetivo de determinar el efecto de la aplicación de 50 µg de gonadorelina 24 y 72 h después del destete sobre el desempeño reproductivo de la cerda se llevó a cabo un experimento con un diseño completamente al azar. Se utilizaron 92 cerdas híbridas. Los tratamientos consistieron en: 1) Cerdas que recibieron la aplicación de 1mL de solución estéril a las 24 y 72 h posdestete (testigo; n = 41) y 2) Cerdas que recibieron la aplicación de 50 µg de gonadorelina (Fertagyl®, Lab. Intervet) a las 24 y 72 h posdestete (GnRH-A; n = 51). La aplicación de 50 µg de gonadorelina a las 24 y 72 h posdestete tendió a disminuir (P = .07) el ICP (7 ±4.7 vs. 5.6 ±2.6 días); mejoró (P < .05) la tasa de presentación de celo dentro de los primeros siete días posdestete (80 vs. 94%), pero no modificó (P = .14) la tasa de parto a primer servicio posdestete (88 vs 94%). La aplicación de gonadorelina tendió a disminuir (P ≤ .09) el número de lechones nacidos vivos y no modificó (P = .33) el peso de la camada al nacimiento. Los resultados indican que la aplicación de 50 µg de gonadorelina a las 24 y 72 h posdestete es una herramienta disponible para aumentar el número de cerdas que entran en celo dentro de los primeros siete días posdestete. Palabras claves: Gonadorelina, Desempeño reproductivo, Cerda

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Abstract With the objective of determine the effect of the gonadoreline injection after weaning on reproductive performance of sows, a completely randomized design experiment was performed. 92 hybrid sows were used. Treatment consisted in: 1) Sows receiving injection of 1 mL of saline solution at 24 and 72 hours after weaning (Ctrl; n = 41); or 2) Sows receiving 50 µg of gonadoreline (Fertagyl®, Lab. Intervet) at 24 and 72 hours after weaning (GnRH; n = 51). Gonadoreline application tended (P = .07) to diminished the weaningto-estrus interval (7 ±4.7 vs. 5.6 ±2.6 days); and improved (P < .05) estrous rate inner first seven days after weaning (80 vs. 94%); but did not modified (P = .14) the farrowing rate after weaning first service (88 vs. 94%). Gonadoreline application tended to reduce (P ≤ .09) live born piglet number, and did not modifies (P = .33) litter weight at born. Results indicates that 50 µg of gonadoreline application at 24 and 72 hours after weaning is a available tool to increase the number of sows that return to estrous inner first seven days after weaning. Key Words: GnRH, Reproductive performance, Sow. Introducción El reinicio de la actividad cíclica después del destete es clave en el desempeño reproductivo posterior de las cerdas (King y Martin, 1989). La presentación del estro está asociada con la presencia de folículos grandes y sanos seleccionados durante el periodo de proestro para su maduración preovulatoria (Sirois y Fortune, 1988). Durante este periodo, la concentración de progesterona disminuye y los folículos grandes producen 17β-estradiol, el que está involucrado en la iniciación del estro a través del mecanismo de retroalimentación positiva, que éste ejerce sobre los centros hipotalámicos e hipofisiarios (Ireland, 1987). Esto estimula la liberación de pulsos de hormona luteinizante (LH) inducidos por el GnRH, así como la elevación preovulatoria LH, quien finalmente es la responsable de la ovulación de los folículos grandes (Clarke, 1987). La falla de la cerda para retornar al estro puede ser debido, al menos en parte, a una elevada sensibilidad del eje hipotálamo-hipófisis al mecanismo de retroalimentación negativa ejercida por los estrógenos (Almond y Dial, 1990). En este sentido, se ha observado que un incremento del nivel sérico de los estrógeno precede la elevación preovulatoria de la LH por alrededor de 48 h, tanto durante el ciclo estral (Henricks et al., 1972) como en el estro posdestete en la cerda (Stevenson et al., 1981). Este incremento depende del número de folículos preovulatorios presentes en el ovario de la cerda después del destete (Bracken et al., 2006). Efecto de la aplicación de GnRH-análogo después del destete sobre el desempeño reproductivo de la cerda http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/110906.pdf

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El GnRH y sus agonistas/análogos actúan sobre el desarrollo folicular del ovario e indirectamente sobre la función del cuerpo lúteo vía la inducción de la liberación de LH y FSH desde la hipófisis (Conn y Crowley, 1994). La administración de GnRH incrementa los niveles de LH y FSH en la circulación periférica dentro de 2 a 4 h (Chenault et al., 1990). Estas gonadotropinas actúan directamente uniéndose a su receptor específico ubicado sobre los folículos y las células lúteas. Por lo que, el GnRH-A se ha convertido en una alternativa para estimular el crecimiento folicular y la ovulación (Hühn et al., 1996). En este sentido, se ha observado que el estro y la ovulación son inducidos por administración pulsátil de GnRH-A en cerdas prepúberes (Lutz et al., 1984), en lactación (Cox y Britt, 1982), así como en cerdas con anestro pospartum (Britt et al., 1985), reduciendo los efectos depresivos del amamantamiento y catabolismo lactacional sobre la secreción de gonadotropinas (Brüssow et al., 1996). Al respecto, Szabó et al. (1991; 1992) observaron mejoras en el tamaño de la camada al nacimiento, así como en el número de cerdas que entran en estro dentro de los primeros siete días después del destete cuando aplicaron GnRH-A, tanto después como antes del destete, respectivamente. Romo et al. (2005) observaron que la aplicación de GnRH-A cuatro días antes del destete mejora la tasa de parto al primer servicio posdestete en la cerda joven. Por lo que, el objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de la aplicación de acetato de gonadorelina, un análogo de GnRH, a las 24 y 72 h después del destete en el desempeño reproductivo de las cerdas. Material y Métodos El trabajo se realizó en la granja “La Huerta” localizada en el municipio de Culiacán Sinaloa, en el Noroeste de México (24º45’ N; 107º 31’ W; 23 msnm), durante el periodo comprendido entre febrero y diciembre de 2007. Se utilizaron 92 cerdas multíparas híbridas, las cuales fueron asignadas al azar a uno de dos tratamientos: 1) Inyección de 1mL de solución fisiológica a las 24 y repetido a las 72 h después del destete (Testigo; n = 41) y 2) Aplicación de 50 µg de gonadorelina a las 24 y repetida a las 72 h posdestete (GnRH-A; n = 51). El manejo de los grupos de tratamiento fue similar en cada una de las etapas del ciclo reproductivo. Las cerdas destetadas fueron alojadas en corrales colectivos con piso de concreto totalmente techadas, con acceso permanente a agua de bebida y alimentación a libre acceso con una dieta a base de maíz-soya (15% PC y 3.4 Mcal. de EM por kg de alimento). La revisión de celos se realizó por la mañana (08:00 h am) y por la tarde (17:00 h pm), con la ayuda de un semental vasectomizado. Las cerdas fueron declaradas en celo cuando aceptaron ser montadas por el macho, mismas que fueron inseminadas con semen fresco 12 h después del reflejo de aceptación Efecto de la aplicación de GnRH-análogo después del destete sobre el desempeño reproductivo de la cerda http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/110906.pdf

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del macho; el servicio reproductivo consistió en la aplicación de tres dosis seminales con intervalos de 12 h en una jaula individual de gestación, en donde permanecieron hasta cinco días antes de la fecha probable de parto o hasta el momento en que se detectaron como no gestantes. El diagnóstico de gestación se realizó tres semanas después de ser inseminadas con la ayuda de un semental y a los 35 días con ultrasonografía en tiempo real. Durante el periodo de gestación recibieron 2 kg de alimento/día de una dieta de gestación (15% PC y 3.1 Mcal. de EM por kg de alimento), y en todo momento tuvieron acceso al agua de bebida. Las cerdas fueron trasladadas al área de maternidad, salas totalmente cerradas con ventilación forzada y techo con aislamiento térmico, cinco días antes de la fecha probable de parto, en donde fueron atendidas al momento del mismo. El total de lechones nacidos (TLN), lechones nacidos vivos (LNV), intervalo de celo posdestete (ICP), tasa de parto al primer servicio posdestete (TP) y el número de cerdas que presentaron estro dentro de los primeros siete días posdestete (TE), fueron registrados durante un ciclo reproductivo. Análisis estadístico. A los resultados de TLN, LNV e ICP se les aplicó un análisis de varianza para un diseño completamente al azar (Hicks, 1973), utilizando el módulo de análisis de Varianza/covarianza del procedimiento para Modelos Lineales Generales de la Versión 8, del Paquete Estadístico Statistix®; se fijó un alfa máximo de 0.05 para aceptar diferencia estadística y se consideró a cada cerda como la unidad experimental. El modelo matemático utilizado será: Yi = µ + GnRH-Aj + Ei; donde: Yi es la variable de respuesta (TLN, LNV, PCN, ICP); µ es la media general del experimento; GnRH-Ai es el efecto del i-ésimo nivel de GnRH-A, y Ei es el error aleatorio. La tasa de parto al primer servicio posdestete y porcentaje de cerdas que entraron en celo dentro de los primeros siete días posdestete se analizaron mediante la prueba de χ2 utilizando tablas de contingencia 2 x 2 (Hicks, 1973).

Resultados y Discusión El efecto de la aplicación de 50 µg de gonadorelina 24 y 72 h después del destete en el intervalo destete a celo de la cerda se muestran en el cuadro 1.

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Cuadro 1. Efectos de la aplicación de GnRH-análogo 24 y 72 h posdestete en intervalo destete a celo de la cerda. Variables

EEM1

Tratamientos

Valor de P

Cerdas, n ICP, días 2 1

Testigo

GnRH-A

41 7.0

51 5.6

0.39

.07

Error estándar de la media de los dos tratamientos, Intervalo celo posdestete.

Los efectos de la aplicación de 50 µg de gonadorelina 24 y 72 h después del destete en la tasa de parto al primer servicio posdestete y en la tasa de presentación de celo en los primeros siete días posdestete se muestran en los Cuadros 2 y 3, respectivamente. Cuadro 2. Efectos de la aplicación de 50 µg de gonadorelina 24 y 72 h después del destete en la tasa de parto al primer servicio posdestete. Variables Cerdas, n Cerdas paridas, n Cerdas no paridas, n Tasa de parto, %

Tratamientos Testigo GnRH-A 33 48 29 45 4 3 88 94

Valor de P

0.14

Cuadro 3. Efectos de la aplicación de 50 µg de gonadorelina 24 y 72 h después del destete en la tasa de presentación de celo en los primeros siete días posdestete. Variables Cerdas, n Cerdas que presentaron celo dentro de los primeros 7 días posdestete, n Cerdas que presentaron celo después de 7 días posdestete, n Tasa de presentación de celo dentro de los primeros 7 días posdestete, %

Tratamientos Testigo GnRH 41 51 33

80a

94b

Literales diferentes en el mismo renglón indican diferencias estadísticas. P < 0.05

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En este estudio la aplicación de 50 µg de gonadorelina a las 24 y repetido a las 72 h después del destete de la cerda tendió (P = 0.07) a disminuir en un 20% (de 7 a 5.6 d) el intervalo entre el destete y la presentación de celo; además, se incrementó (P < 0.05) en 14% (80 vs 94%) la proporción de cerdas que manifestaron estro dentro de los primeros siete días después del destete. Estos resultados son similares a los observados por Szabó et al. (1991), ellos observaron que el 96.7% de las cerdas entraron en estro en respuesta a la aplicación de GnRH-A 48 h después del destete. En otro estudio realizado por Szabó et al. (1992), observaron que el tratamiento con GnRH-A al final del periodo de lactación (día 19) redujo al 50% el número de cerdas que fallaron para retornar al estro después del destete, e incrementó en un 42% la proporción de cerdas que entraron en estro dentro de los primeros siete días después del destete. Cox y Britt (1982); Rojanasthien et al. (1987); De Rensis et al. (1991) observaron un incremento en el desarrollo folicular en respuesta a la administración de GnRH-A durante la lactación, lo que es consistente con los resultados obtenidos en este experimento. La aplicación de 50 µg de acetato de gonadorelina a las cerdas 24 y 72 h a después del destete no modificó (P = 0.14) la tasa de parto al primer servicio posdestete; estos resultados difieren de lo observado por Romo et al. (2005), quienes encontraron que la aplicación de gonadorelina cuatro días antes del destete incrementa la tasa de parto al primer servicio posdestete en las cerdas jóvenes; ellos observaron un incremento del 15% (69 vs 84%) en este indicador reproductivo. Los resultados del presente estudio indican que la aplicación de gonadorelina a las 24 y 72 h después del destete incrementa el número de cerdas que entran en celo dentro de los primeros siete días después del destete y tiende a disminuir el intervalo de destete a celo en la cerda. Cuadro 4. Efectos de la aplicación de 50 µg de GnRH-análogo 24 y 72 h después del destete en el total de lechones nacidos, lechones nacidos vivos y peso de la camada al nacimiento. Variables

Tratamientos

EEM1 Valor de P

Testigo

GnRH

Total de lechones nacidos, n

11.034

10.067

.306 1

.12

Lechones nacidos vivos, n

10.172

9.111

.308 0

.09

Peso de la camada al nacimiento, kg

14.397

13.493

.450 9

.33

Cerdas, n

Error estándar de la media de los tratamientos

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Los efectos de la aplicación de 50 µg de gonadorelina 24 y 72 h después del destete en el total de lechones nacidos por camada, lechones nacidos vivos por camada y peso de la camada al nacimiento se muestran en el Cuadro 4. Conclusiones La aplicación de 50 µg de acetato de gonadorelina a la cerda, 24 y 72 h después del destete, aumenta el porcentaje de cerdas que presentan estro dentro de los primeros siete días después del destete lo que constituye una herramienta útil para mejorar el desempeño reproductivo de la cerda destetada. Agradecimientos: Los autores del presente documento agradecen el apoyo recibido por parte del Programa de Fortalecimiento y Apoyo a Proyectos de Investigación-UAS en su convocatoria 2007 (PROFAPI-UAS-2007); así como al Sr. Juan Güémez Rodriguera, propietario de la granja porcina “La Huerta”, por las facilidades otorgadas para realizar el trabajo de investigación. Literatura citada • Almond G.W. and G.D. Dial. 1990. Estradiol feedback inhibition of luteinizing hormone concentrations in the anestrous sow. J. Anim. Sci. 68:1077-1086. • Bracken, C. J., R. P. Radcliff, B. L. McCormack, D. H. Keisler, and M. C. Lucy. 2006. Decreased follicular size during late lactation caused by treatment with charcoal-treated follicular fluid delays onset of estrus and ovulation after weaning in sows1. J. Anim. Sci. 84:2110–2117. • Britt, J.H., J.D. Armstrong, N.M. Cox, and K.L. Esbenshade. 1985. Control of follicular development during and after location in sow. J. Reprod. Fertil. Vol. 33 (Suppl.1):37-54. • Brüssow, K.P., W. Jöchle, and U. Hühn. 1996. Control of ovulation with a GnRH analog in gilts and sows. Theriogenology. 46:925-934. • Chenault, J. R., D. D. Kratzer, R. A. Rzepkowski, and M. C. Goodwin. 1990. LH and FSH response of Holstein heifers to fertirelin acetate, gonadorelin and buserelin. Theriogenology 34(1):81-98 • Clarke, I. J. 1987. Control of GnRH secretion. J. Reprod. Fertil. (Suppl.) 34:1-8

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REDVET: 2009 Vol. 10, Nº 11 Recibido 05.03.09 - Ref. prov. M030903B – Revisado 28.06.09 - Aceptado 26.10.09 Ref. def. 110906_REDVET - Publicado 15.11.09 Este artículo está disponible en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109.html concretamente en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/110906.pdf REDVET® Revista Electrónica de Veterinaria está editada por Veterinaria Organización® Se autoriza la difusión y reenvío siempre que enlace con Veterinaria.org® http://www.veterinaria.org y con REDVET® - http://www.veterinaria.org/revistas/redvet - http://revista.veterinaria.org

Efecto de la aplicación de GnRH-análogo después del destete sobre el desempeño reproductivo de la cerda http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/110906.pdf

Relationships of systemic IgG antibody response and lesions caused by Oestrus ovis L. larvae (Diptera: Oestridae) in infected goats - Interacciones de la respuesta sistémica de anticuerpos IgG y las lesiones causadas por larvas de Oestrus ovis L. (Diptera: Oestridae) en cabras infectadas Angulo-Valadez, Carlos E.: Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, La Paz, B.C.S., México | Cepeda-Palacios, Ramón: Universidad Autónoma de Baja California Sur, La Paz, B.C.S. México | Ascencio, Felipe: Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, La Paz, B.C.S., México | Jacquiet, Philippe: UMR INRA/ENVT 1225 Interactions hôtes Agents Pathogènes, Toulouse, France | Dorchies, Philippe: UMR INRA/ENVT 1225 Interactions hôtes Agents Pathogènes, Toulouse, France | Ramírez-Orduña, Juan Manuel: Universidad Autónoma de Baja California Sur, La Paz, B.C.S. México. *Contacto: Tel.: +52 612 123 88 00x5412; fax: +52 612 123 88 22. Correo electrónico: rcepeda@uabcs.mx (R. Cepeda-Palacios). Abstract This is the abstract, Oestrus ovis (Diptera: Oestridae) is a nasosinusal parasite of sheep and goats that affects the wellbeing and performance of the hosts. Our objectives were (1) to analyze associations of host phenotypic characteristics (age, weight, sex), O. ovis larval characteristics, systemic antibody IgG response, and lesions in sinusal and horn cavities in naturally infected goats, and (2) to estimate the serodiagnostic value of salivary gland antigens for oestrosis diagnosis by ELISA test in goats naturally exposed to O. ovis infection. O. ovis third-instar larvae (L3) were collected, then dissected to remove the salivary gland and to obtain the antigens source (SGC). A total of 251 goats were necropsied. The host’s weight, age and sex were individually recorded. The sinusal and horn cavities were examined for the presence of O. ovis larvae. Cavitary lesions and lesion intensity in infected goats (n=38) were scored according to a severity table. Sera (n=125) were analyzed by ELISA to detect specific humoral IgG responses. Annual prevalence of goat oestrosis was 73.9%. A low positive association (r=0.38, P<0.05) was observed between larval burden and severity of sinus lesions. In general, high sensitivity (90.82%) and low specificity (25.93%) were observed in ELISA. As conclusions, major pathological damages Relationships of systemic IgG antibody response and lesions caused by Oestrus ovis L. larvae (Diptera: Oestridae) in infected goats http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/110907.pdf

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caused by O. ovis were associated with the presence of early L2 and early L3 larvae, probably enhanced by larval molting. SGC antigens were proven valuable antigens for oestrosis diagnosis by ELISA test in goats. Keywords: Oestrus ovis | Salivary gland antigens | IgG response | ELISA test | Goats.

Resumen Oestrus ovis (Diptera: Oestridae) es un parásito nasosinusal de las cabras y las ovejas que afecta el bienestar y el rendimiento de sus hospedadores. Nuestros objetivos fueron (1) analizar las asociaciones de características fenotípicas del hospedador (peso, sexo, edad), características larvarias de O. ovis, la respuesta de IgG, y las lesiones en las cavidades sinusales y cornuales de cabras infectadas, y (2) estimar el valor de los antígenos de la glándula salival para el serodiagnóstico de la estrosis caprina usando la prueba de ELISA. Se capturaron larvas de tercer estadio (L3), se disectaron para remover la glándula salival y obtener la fuente de antígenos (CGS). Se examinaron en necropsias 250 cabras. El peso, sexo y edad fueron registrados. Los senos frontales y cavidades cornuales se examinaron para la presencia de O. ovis. La intensidad de las lesiones en cabras infectadas (n=38) se registraron de acuerdo con una tabla de severidad. Los sueros (n=125) se analizaron por ELISA para detectar la respuesta humoral de IgG. La prevalencia anual de la estrosis caprina fue 73.9%. Una asociación baja positiva (r=0.38, P<0.05) se observó entre la carga larvaria y la severidad de las lesiones encontradas. En general, se observaron alta sensibilidad (90.82%) y baja especificidad (25.93%) en la prueba de ELISA. Como conclusiones, los daños patológicos mayores se asociaron al número y presencia de larvas tempranas L2 y L3, probablemente inducidos por la muda larvaria. Los antígenos CGS demostraron ser valiosos en la prueba de ELISA para el diagnóstico de la estrosis caprina. Palabras clave: Oestrus ovis | Antígenos de la glándula salival | respuesta de IgG | Prueba de ELISA | Cabras.

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Introduction Oestrus ovis (Diptera: Oestridae) is a worldwide spread insect, which larvae are obligate parasite of the upper respiratory tract of sheep and goats. O. ovis flies deposits first instar (L1) into the host nostrils and they develop toward second (L2) and third (L3) instars inside of the host. During the infection, sneezing and nasal mucus discharges are the main evident clinical signs in infected animals. Host humoral and cellular immune responses are provoked by O. ovis infective larvae during their development (i.e. mainly L2 and L3 instars, Tabouret et al., 2003). Among them, the systemic IgG antibody response has been the best immune reaction for oestrosis diagnosis purposes and seroepidemiological studies using both somatic extracts or excreted – secreted products (ESP) as coating antigens in ELISA (Suárez et al., 2005; Alcaide et al., 2005a). Previously, Tabouret et al. (2001) demonstrated that salivary gland antigens are the most antigenic proteins to be potentially used for the disease diagnosis in sheep. However, to date there are no available reports on the value of salivary gland antigens for diagnosing oestrosis in goats. In addition, despite O. ovis infection has been reported to be associated with host’s phenotypic characteristics (AboShehada et al., 2003; Yilma and Genet, 2000; Cepeda et al., 1998), the relationships among immune responses and nasal-sinusal lesions caused by O. ovis larvae have not been investigated in infected goats so far. Our objectives were (1) to analyze associations of host phenotypic characteristics (age, weight, sex), O. ovis larval burden with larval development characteristics, systemic antibody IgG response, and the severity of lesions in sinusal and horn cavities in naturally infected goats, and (2) to estimate the serodiagnostic value of salivary gland antigens for oestrosis diagnosis by ELISA test in naturally exposed goats to O. ovis infection. Material and methods Oestrus ovis collection and larval dissections O. ovis third-instar larvae (L3) were collected from the head of goats slaughtered in La Paz, Baja California Sur, Mexico. Larvae were washed with a PBS (pH 7.4) solution containing penicillin (100 U ml-1) and streptomycin (100 µg ml-1) prior to dissection (Angulo-Valadez et al., 2007). Briefly, larvae were checked for viability (absence of integumental fungal attacks, damages to cuticle, diminished vigor). Each live larva was fixed to a paraffined Petri dish with entomological pins and dissected under a stereomicroscope using ophthalmic

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surgical equipment. Dissection was carried out on an ice bath using cold (4–10 °C) PBS-antibiotics as liquid medium. After removing ventral coelomic wall, as well as the surrounding fat body, tracheal and nervous tissues, the entire salivary gland (n=25) was collected and placed in a tube with PBS-antibiotics. Salivary gland antigens Salivary glands were centrifuged (10,000 g x 20 min at 4 °C) to expel the contents and the supernatant was recovered (SGC) and stored (– 20 °C) until use as coating antigens in ELISA tests. Protein concentration of SGC was determined using the bicinchroninic acid assay kit (BCA, Pierce, Rockford, Illinois). To ensure that SGC antigens were not degraded prior using in ELISA, protein integrity was achieved visually by polyacrylamide gel electrophoresis (Laemmli, 1970) and proteolytic activity was determined by Azocoll test (Angulo-Valadez et al., 2007). Necropsy analysis and sera A total of 251 slaughtered goats were slaughtered and necropsied. Before goat slaughtering, host live body weight, age (determined by dental examination) and sex were individually recorded. Each goat’s head was carefully examined (Yilma y Dorchies, 1993) for L2 and L3 O. ovis larvae at the sinus and horn cavities. Larval numbers were counted and developmental instars were identified according to Zumpt (1965). Blood samples from randomly selected goats (n=125) collected and sera were obtained by centrifugation (1500 g for 5 min at 4 °C), and then frozen at -20 °C until analysis of IgG antibody response. Oestrosis lesions in infected goats A table for classifying the lesions and lesion intensity caused by O. ovis infective larvae was constructed, based on findings of oestrosis at necropsy in infected animals (Table 1). During six months (n=9 sampling dates), the lesions found in sinus and horn cavities of infected goats (n=38) were recorded. Average age and body live weight of the sampled goats were 2.39±1.40 and 36.83±13.21, respectively. The normal mucosa of kids never infected (n=4) was used as reference. The number of O. ovis larvae was recorded and its larval development (from early L2 to L3D5 larvae, i.e. 3 to 11 interstadia) classified according to Cepeda-Palacios et al. (1999). All analyses were done by the same trained technician.

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Table 1. Scale used for evaluation of severity of lesions caused by O. ovis larvae in the sinusal and horn cavities of necropsied goatsa. Severity of lesions

Lesion score

Absent

Low

Moderate

High

The score of lesions were additive and the lesion severity in a particular host was the sum of each lesion finding as: the presence of blood or pus, the quantity of secreted mucus, and the level of inflammation according to the relative thickness of the mucosa. The normal mucosa of kids never infected (n=4) was used as reference

ELISA tests A standardized ELISA using SGC as coating antigens was used (Angulo-Valadez et al., 2009). Briefly, SGC antigens were diluted at 2.5 µg/ml in carbonate buffer (pH 9.6), distributed (100 µl) in 96 well plates (Nunclon surface, Nunc, Denmark). The antigen-coated wells were then incubated with a 10% skimmed milk solution (200 µl). Triplicate serum samples (100 µl) diluted 1:50 in PBST were added. The plates were incubated (100 µl) with horseradish peroxidaseconjugated anti-goat IgG whole molecule (Sigma, A5420 St. Louis, MO) diluted (1:2000) in carbonate buffer. The wells were washed three times in all steps with PBST (0.01 M phosphate, 0.15 M sodium chloride, pH 7.4 and 0.1% Tween 20) except after skimmed milk step. Then, 100 µl per well of the chromogen (0.4 mg/ml OPD; Sigma, St. Louis, MO, USA) was added. All incubations were done by 30 minutes at 25°C. Optical densities (OD) were determined with a spectrophotometer (BioRad, Microplate reader 3350-UV) by measuring the absorbance at 454 nm. All samples were performed in triplicate. The average of the each sample values was used in final calculations. Pools of negative (n=19 uninfected kids) and positive (n=5 naturally O. ovis infected goats) sera were used as controls and PBS wells as blank. The cut off value was established to be the mean of negative control + 3SD. Statistical analysis Necropsy and sera data were grouped into two periods (springsummer and autumn-winter) according to dates of sampling. ELISA data were analyzed using epidemiological software of tabulated data (EPIDAT 3.1, 2006). Descriptive statistics of host and larval variables were calculated and simple linear correlation analyses were carried out. The effects of larval development stadia and anatomic side on

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the severity of lesions were evaluated by one-way ANOVA. All analyses were done by Statistica software (Statsoft, 1998). Results O. ovis infection and host phenotypic characteristics The necropsy data of naturally exposed goats to O. ovis infection are summarized in Table 2. Annual overall prevalence of goat oestrosis was 73.9%. For the spring-summer and autumn-winter, oestrosis prevalences were 72.9% and 75.3%, respectively. The total number of larvae recovered from the sinus and horn cavities in infected goats during spring-summer period was 648 larvae (L3, n=423; L2, n=228), while in the autumn-winter period, 424 larvae were obtained (L3 n=267; L2 n=158). Table 2. Host phenotypic characteristics and larvae recovered from the sinusal and horn cavities at necropsy examinations of goats naturally exposed to O. ovis infectiona. Host/ O. ovis

Mean

S.D.

Live body weight

193

35.3

11.9

Age

191

3.5

2.5

Male

Goat

Female

126

Intensity of infection L2 larvae

105

3.7

4.4

L3 larvae

121

5.7

5.1

Total larvae

139

7.7

7.8

n=Valid number of necropsied goats.

Live weight (range 8-95 kg) and age (range <1 year to 10 years, based on 0-4 dental pair replacement and wear of permanent teeth) of necropsied goats were found significantly correlated (r=0.43, P<0.05). However, the total number of larvae and/or the larval development were not correlated with body live weight, age, or sex of the infected hosts.

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Systemic IgG antibody response The systemic IgG antibody response against SGC antigens was significantly correlated with total larval count (r=0.27, P<0.05) and with number of L3 larvae (r=0.31, P<0.05). There were not associations among systemic IgG level and age, body live weight, or sex of the goats. Severity of lesions caused by O. ovis Relationship of host characteristics development, and lesions

with

larval

burden,

larval

None correlation (P>0.05) was found among phenotypic characteristics (body live weight, age, or sex) with total count of larvae as well as with O. ovis larval development (Table 3). Moreover, no association (P>0.05) was observed between weight or age of the host and severity of lesions found in sinusal and horn cavities. Table 3. Descriptive statistics of O. ovis infection and severity of oestrosis lesions in sinusal and horn cavities of goats. Variable

Mean

S.D.

2.61

3.41

2.39

3.49

5.69

3.46

5.07

3.77

3.50

3.94

Right lateral

5.19

3.56

Left lateral

4.97

3.53

Lateral average

5.08

3.45

O. ovis No. Larvae right lateral left lateral a

Larval development right lateral left lateral

Total no. of larvae Severity of oestrosis lesions in sinus and horn cavitiesb

Average larval developmental of O. ovis in the host was recorded from early L2 to L3D5 larvae (3 to 11 interstadia) classified according to Cepeda-Palacios et al. (1999). b A scale for scoring severity of lesions caused by O. ovis infective larvae was constructed (see Table 1).

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Relationship of larval burden and development with severity of oestrosis lesions The number of O. ovis larvae and the severity of the lesions in frontal sinus of infected goats are shown in Table 3. Maximum values of severity were observed when 6 larvae or more were found in a particular host sinus (mean severity=10). Severity of lesions was the highest when larvae reached the early L2 larvae or early L3 developmental stadia (Figure 1). Figure 1. Relationships of O. ovis larval number (A) and development (B) on the severity of lesions of sinusal and horn cavities in necrpsied goatsa. 12.0

Severity of lesions

10.0 8.0 6.0 4.0 2.0 0.0 0

3-4

6-8

10-13

Number of larvae L2 and L3

Severity of lesions

12 10 8 6 4 2 0 0

Larval development a

Severity of lesions was measured based on an additive scale from 0 to 4 (Mean±S.D.)

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ELISA analysis Results of ELISA are shown in Table 4 and Table 5. In general, a high sensitivity and low specificity were observed using SGC as coating antigens. Sensitivity of the ELISA was higher during the autumnwinter period. In contrast, specificity was higher during the springsummer period (data not shown in tables). Table 4. Diagnosis of oestrosis in goats by ELISA using SGC as coating antigens and by necropsy examination in naturally infected goats. ELISA

Necropsy

Positive

Negative

Seropositive

Seronegative

Total a

Necropsy examinations of the sinus and horn cavities of slaughtered goats (n=125); goats were considered infected if at least one L2 or L3 larva was present at necropsy.

Table 5. Predictive diagnosis of oestrosis by ELISA in goats naturally exposed to O. ovis infectiona. Parameter

Total (%)

Sensitivity

90.82

Specificity

25.93

Positive predictive value

89.38

Negative predictive value

71.18

Apparent prevalence

87.20

Actual prevalenceb

78.40

125

Necropsy examinations of the sinus and horn cavities of slaughtered goats; the goats were considered infected if the presence of at least one L2 or L3 instar larvae was detected. b Actual O. ovis prevalence in goats from which serum samples were collected.

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Discussion Cepeda et al. (1998) reported both, a permanent O. ovis fly infective activity and high oestrosis prevalence in goats (85.4%) throughout the year in Baja California Sur, Mexico. In our study, the presence of L2 and L3 mature larvae found in sinusal and horn cavities during the study confirmed such results. These variables were especially favorable to investigate host-O. ovis relationships under field conditions. Interestingly, severities of lesions were mainly related to the presence of early L2 and early L3 larval interestadia. This suggests that the strongest pathological damage and immune stimulation were provoked during or immediately after larval molt. According to Innocenti et al. (1997) proteins derived from the larval cuticle are capable to stimulate the host immune system, therefore shedding of old cuticle and the new cuticle should be considered because this pathological effect may be associated to the O. ovis larval molt phenomena. In addition, Tabouret et al. (2003) found that pathological damages in infected sheep were more severe in sinus cavities and associated to the presence of L2 and L3 larvae. Interestingly, host live body weight and age were not negatively associated with the number of O. ovis larvae or larval development. Accordingly, older animals usually had always higher opportunities to be repetitively infected during their lifetime and to develop posterior immunity. Therefore, it seems that exist a failure in natural acquired immunity or immune resistance of goats to O. ovis infections. In addition, reports on acquired immunity in infected sheep are also conflicting. Despite that Manchenko and Manchenko (1989) demonstrated the important role of the sheep immune system on survival of O. ovis larvae, Jacquiet et al. (2005) found that after experimental repetitive infections with O. ovis, lambs did not develop immune resistance, which lead to think that probably a down immune regulation inside the sheep host was provoked by the parasite (Jacquiet et al., 2005; Dorchies et al., 2006). On the other hand, our ELISA tests using SGC as coating antigens showed high sensitivity and low specificity. However, the necropsy analysis was limited to examine the sinus and horn cavities only. This result, however, seems similar to previously reported ELISA tests in which excretory-secretory products (a mixture of salivary gland secretions and larval excretions) of O. ovis has been used in both sheep (Suรกrez et al., 2005; Alcaide et al., 2005a) and goats (Alcaide et al., 2005b; Sรกnchez-Andrade et al., 2005) species. Therefore, specificity value of ELISA could be improved by examination of full nasal cavities. On this regard, it was reported that ELISA test using SGC as a coating antigen improved sheep oestrosis diagnosis (i.e. compared with L2 crude extracts), but a low relative specificity was

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obtained (Angulo-Valadez et al., 2008). In our study, the ELISA tests used resulted in higher apparent prevalence than the actual prevalence (determined after necropsy in sinus and horn cavities of goats). This means that some non- sinus infected goats showed high titers of specific IgG antibodies to O. ovis, resulting in false positive serodiagnoses. False positive cases observed might be due to nonspecific reactions, or some goats did not host any larvae in the sinuses but they might have hosted undetected larvae in nasal cavities. Other possible explanation is that false positive cases were previously infected but larvae were already expelled by the sampling time. It has been reported that high levels of specific IgG antibodies can persist after the expulsion of any remaining mature larvae or after larvicidal treatments (Jacquiet et al., 2005). It is a promising fact that the major O. ovis salivary gland antigens are recognized by the immune system of both ovine and caprine species (Tabouret et al., 2001; Angulo-Valadez et al., 2007). These preliminary findings may be useful in the future for development of oestrosis diagnosis. Therefore, the following goal should be to purify specific salivary gland antigens for evaluation in ELISA tests, and to identify the most appropriate for oestrosis diagnosis in sheep and goats. As conclusions, age and weight of the host not influenced the O. ovis larval populations in naturally infected goats. Major pathological damages caused by O. ovis were associated with the presence of early L2 and early L3 larvae, probably enhanced by larval molting. SGC antigens were proven valuable antigens for oestrosis diagnosis by ELISA test in goats. Acknowledgments Authors are grateful with technicians Ing. Zoot. Ana Valverde Onofre and Diana Tapiz Victoria for technical assistance. This research was partially supported by ECOS-ANUIES CONACYT 2009 program. References • •

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REDVET: 2009 Vol. 10, Nº 11 Recibido 26.03.09 - Ref. prov. M030914B – Revisado 28.09.09 - Aceptado 30.10.09 Ref. def. 110907_REDVET - Publicado 15.11.09 Este artículo está disponible en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109.html concretamente en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/110907.pdf REDVET® Revista Electrónica de Veterinaria está editada por Veterinaria Organización® Se autoriza la difusión y reenvío siempre que enlace con Veterinaria.org® http://www.veterinaria.org y con REDVET® - http://www.veterinaria.org/revistas/redvet - http://revista.veterinaria.org

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Estado de conocimiento de las concentraciones de cadmio, mercurio y plomo en organismos acuáticos de Venezuela - Current state of knowledge of the concentrations of cadmium, mercury and lead from aquatic organisms of Venezuela Salazar-Lugo, Raquel Departamento de Bioanálisis, Núcleo de Sucre, Universidad de Oriente. Postgrado de Biología Aplicada, Laboratorio de Proteínas e inmunotoxicidad, cerro del medio, Núcleo de Sucre, Universidad de Oriente, Cumaná, Estado Sucre, Venezuela 6101. E-mail: raquelugove@yahoo.com RESUMEN En Venezuela, la contaminación por metales pesados está relacionada con el desarrollo de la industria siderúrgica y petrolera, así como a la explotación indiscriminada de otros metales como el oro. Está bastante documentada la contaminación del lago de Maracaibo dado al desarrollo en sus cercanías de actividades urbanas, industriales, mineras y agropecuarias; del lago de Valencia, del río Tuy, Orinoco y Manzanares, entre otros En este trabajo se revisa el estado de conocimiento, en los últimos 10 años, de la concentración de plomo, cadmio y mercurio en especies acuáticas de diferentes áreas del País. Palabras clave: plomo| mercurio| cadmio| Venezuela| especies acuáticas

ABSTRACT Contamination due to trace metals in Venezuela is related with indiscriminate exploitation of metals like gold, transport of river runoff, oil and siderurgica industries and urban zones. The Tuy, Orinoco, Tigre, Manzanares rivers and others basins as Valencia and Maracaibo lakes has been reported as polluted for many years. In this work, we reviewed the state of knowledge, in the last 10 years, of metals concentrations specially lead, cadmium and mercury, in aquatic species from diverse areas of country. Key words: lead| mercury| cadmium| Venezuela| aquatic organisms.

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1 INTRODUCCIÓN En Venezuela, a pesar de que existen leyes que regulan la concentración de elementos metálicos en los cuerpos de agua y en los organismos, el aumento de las concentraciones ambientales de metales pesados producto de la actividad antropogénica se ha convertido en un problema (Decreto 883, Gaceta oficial No 5021, 1995). Esta situación se hace compleja dado a la naturaleza de los metales como componentes de la tierra, y a que muchos de estos elementos son esenciales para que los organismos realicen sus funciones vitales, por lo que estos han desarrollado mecanismos bioquímicos que permiten su captura, manejo y almacenamiento. Metales como el mercurio, cadmio y plomo no son esenciales para la vida. De estos metales, el cadmio es un contaminante reciente; es utilizado en numerosas industrias, se encuentra en la naturaleza ligado al zinc con quien presenta fuertes analogías químicas. En los sistemas biológicos puede competir con el zinc, el cobre y el calcio por los sitios de unión de estos elementos en las macromoléculas. Su competencia con el calcio, se debe a que en el estado iónico (Cd2++) presenta un radio iónico semejante a ese elemento; esto lleva a que pueda remplazarlo en los huesos, dando como resultado la deformación de los mismos. A nivel molecular, su efecto está relacionado con la inhibición parcial de la cadena transportadora de electrones, específicamente a nivel del complejo III en el sitio de unión de la semiubiquinona, afectando la transferencia de electrones; la semiubiquinona, es conocida que transfiere un electrón al oxígeno molecular para formar el anión superóxido, esto explica el efecto oxidativo inducido por este metal en la células. El cadmio puede acumularse en el riñón y en el hígado e induce inmunosupresión (Nordberg, 2009). El mercurio es un metal sumamente móvil de tal forma que la contaminación por este elemento resulta un problema mundial. Se han encontrado altas concentraciones de mercurio en corales en zonas prístinas de Panamá, y se sugiere que la presencia de este metal en estos organismos se debe a su transporte desde las áreas de alta minería y tala de árboles (Guzmán y García, 2002). A nivel molecular, la causa del daño celular provocado por el mercurio probablemente se deba a su interacción con grupos tioles de las proteínas y péptidos, inactivándolos. Igualmente, la forma metil-mercurio es altamente tóxica porque puede atravesar la barrera hematoencefálica debido a que forma un complejo metil-mercurio-cisteína el cual mimetiza al aminoácido metionina y de esta forma utiliza al transportador para este aminoácido para entrar en las células cerebrales, (especialmente en los astrocitos), ejerciendo su ya descrito efecto sobre las biomoléculas (Bridges y Zalups 2005; Hoffmeyer y col., 2006). Estado de conocimiento de las concentraciones de cadmio, mercurio y plomo en organismos acuáticos de Venezuela http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/110909.pdf

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2 El plomo, al igual que el mercurio, es conocido desde la antigüedad y su toxicidad se ha asociado a la enfermedad denominada el saturnismo la cual resulta de la competencia de este metal con el hierro, interfiriendo en la síntesis de ferroporfirinas. No está del todo claro el mecanismo molecular por medio del cual este elemento produce neurotoxicidad y carcinogénesis, pero las evidencias demuestran que interfiere en la ruta de traducción de señales, de manera particular con las proteinquinasas dependientes de calcio, las cuales juegan un rol importante en la proliferación celular. De allí que se piense que compite con el calcio y estimula la progresión del ciclo celular (Lu y col., 2001). Se ha sugerido una asociación entre la alta incidencia de anencefalia y la presencia de altas concentraciones de plomo, mercurio y vanadio en el ambiente de poblaciones de la costa oriental del Lago de Maracaibo, estado Zulia (Romero y col., 1998). Algunos organismos acuáticos tienden a bioacumular metales pesados a concentraciones superiores a las del medio y aunado a esto, está el problema de la biomagnificación de estos elementos en su paso a través de la cadena trófica. De allí la necesidad de realizar una revisión del estado de conocimiento de las concentraciones de metales no esenciales, tales como el cadmio, mercurio y plomo en organismos acuáticos de Venezuela, debido a que constituyen un recurso alimenticio esencial en la dieta de la población venezolana. DESARROLLO Presencia de mercurio, plomo y cadmio en cuerpos de agua Venezuela tiene legislaciones para el manejo de las costas que incluyen los Parques Nacionales y otras áreas bajo regulación especial, asimismo existen Decretos que regulan el contenido de metales en cuerpos de agua. Sin embargo la protección de estos cuerpos de agua no es eficiente y existen fuerzas económicas que ignoran estas regulaciones. En el País, la contaminación de los cuerpos de agua con metales como plomo, mercurio y cadmio, está relacionada con el desarrollo de la industria siderúrgica y petrolera, así como a la explotación indiscriminada de otros metales como el oro. En el caso específico del plomo, a la utilización de la gasolina con plomo. El enriquecimiento con cadmio y plomo de cuerpos de agua cercanos a zonas industrializadas ha sido reportado desde hace algunas décadas; sin embargo, la literatura al respecto sigue siendo escasa no solo en Venezuela sino en toda el área del Caribe (Fernández y col, 2007; García y col., 2008). Algunas de las cuencas mejor estudiadas desde hace más de veinte años son las del río Tuy, Estado Miranda, el Lago de Maracaibo, Estado Estado de conocimiento de las concentraciones de cadmio, mercurio y plomo en organismos acuáticos de Venezuela http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/110909.pdf

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3 Zulia y el Lago de Valencia, Estado Carabobo (Figura 1); la contaminación por metales en estas cuencas se debe al desarrollo en sus cercanías de actividades urbanas, industriales, mineras y agropecuarias; siendo el Lago de Maracaibo el cuerpo de agua mayormente contaminado; en vista del papel protagónico que ha jugado en el desarrollo de la industria petrolera (Rivas y col., 2005). En el Lago de Valencia, se ha reportado un aumento exponencial de los metales pesados; en el caso del cadmio este aumento se evidenció a partir de los años 1978-1980 (Bifano y Mogollón, 1995; Mogollón y col., 1996). El efecto de la contaminación del río Tuy se ve reflejada en las elevadas concentraciones de cadmio y plomo reportadas en sedimentos superficiales y agua de las costas de Río Chico y de Boca de Paparo, litoral central (estado Miranda) zonas costeras localizadas en las áreas de influencia de este rio (Acosta y col. ,2002). En áreas costeras cercanas a los desarrollos petroquímicos se evidencian concentraciones de plomo y cadmio por encima de las establecidas por la normativa ambiental internacional, afectando parques nacionales localizados en las cercanías (Rada y Losada, 2000; García y col., 2008). Para el año 1989 se publican los primeros reportes de contaminación por mercurio en el río Roscio localizado en el estado Bolívar (Shrestha y Ruiz, 1989) relacionado con la explotación del oro en esa región. Más recientemente, Rojas de Astudillo y col., (2005) reportan la presencia de mercurio en sedimentos de áreas del delta del Orinoco, región alejada de la zona de influencia de la explotación de oro, lo que demuestra la facilidad de movilización de este elemento. En la región del Golfo Triste se realizó una cronología de mercurio en esqueletos de corales Siderastrea siderea y Mostastraea faveolata encontrándose que la biodisponibilidad de este metal se relacionó con el inicio de las actividades de la planta de Soda caústica y fertilizantes del Complejo petroquímico de Morón (Estado Carabobo; Ramos y col., 2009). La evaluación de otras cuencas como las del río Tigre y la laguna de Unare, Estado Anzoátegui (Fermín, 2002; Vaquero y col., 2004, Márquez y col., 2008a); La laguna de Castillero, Estado Bolívar (Márquez y col., 2008b); El río manzanares y el Golfo de Cariaco, Estado Sucre (Márquez y col., 2000; Martínez, 2002) indican que existe contaminación por cadmio y plomo entre moderada a alta; encontrándose las mayores concentraciones de estos elementos en los sedimentos. La ausencia de mercurio en algunas de las evaluaciones realizadas está relacionada mas con la no determinación de este metal que con el hecho de que no se encuentre presente en esas aguas. En todos los casos evaluados los autores concluyen que el enriquecimiento

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4 de las aguas con metales pesados está asociado con la actividad antropogénica. Contenido de cadmio, plomo y mercurio en peces de Venezuela Venezuela tiene una ictiofauna marina diversa y característica de las cuatro ecoregiones o ambientes ecológicos definidos que conforman sus costas; además de los grandes y numerosos ríos que posee con especies piscícolas autóctonas Tres de estas áreas están influenciadas por los drenajes de los grandes ríos de Suramérica incluyendo el Orinoco; a saber, la plataforma atlántica incluido el Golfo de Paria, el área de fertilidad de la plataforma continental de la región nororiental del país y parcialmente, el litoral Central, el cual tiene además la influencia de ríos altamente contaminados como El Tuy; la última ecoregión está constituida por las grandes áreas estuarinas y su zona de influencia, la cual incluye el sistema Lago de Maracaibo (Cervigón, 2005). Trabajos pioneros indican que desde hace veinte años atrás muchas especies pesqueras de importancia económica ya presentaban concentraciones de mercurio y plomo que en algunos casos estaban en los límites permisibles (Ulrich, 1981; Shrestha y col., 1988; Sánquiz y col., 2000). Sin embargo, en la última década, son escasos los estudios publicados al respecto. En la tabla I se presentan los registros de evaluaciones reportadas (años 1999-2009) del contenido de cadmio, mercurio y plomo en algunas especies piscícolas de Venezuela. Las especies provenientes de zonas impactadas tienen mayores concentraciones de metales (Marcano y Troconis, 2001; Fermín, 2002; Dorta y Sosa, 2004, Márquez y col, 2008 a y b). La cachama (Colossoma macropomum) proveniente de lagunas aparentemente no impactadas, presenta concentraciones moderadas de plomo y cadmio, lo que sugiere la movilidad de estos elementos y probablemente esté relacionado con procesos de bioconcentración y biomagnificación (Tabla I). Al respecto, al evaluar las concentraciones de cadmio y plomo en los peces de los ríos Guasare y Carichuano (Estado Zulia) se observó que estas superan en 100 veces los valores reportados para el agua de estos ríos (valores en agua: 0,01 y 0,02 mg/L para cadmio y de 0,05 y 0,1 mg/L para plomo (Vanegas y Hernández, 2003). Similar a lo observado por estos autores, Márquez y col., (2008 a) señalan que el cadmio y el plomo fueron indetectables en el agua de la laguna de Unare (Estado Anzoátegui); sin embargo, los peces, provenientes de la laguna, presentaron altas concentraciones de estos metales (Tabla I).

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5 TABLA I. Concentración de cadmio, plomo y mercurio en peces de Venezuela TABLE I. Cadmium, lead and mercury concentration in Venezuelan fishes Organismo

Procedencia

Lebranche (M. Liza)

Laguna de Unare, Estado Anzoátegui

3,33 µg/g 0,052 µg/g

10,44 µg/g 0,22 µg/g

0,04 µg/g

0,28 µg/g

Lisa (M. curema)

(M. gainardiunus)

Laguna de Unare, Estado Anzoátegui Costas de Cumaná

Dorta y Sosa (2004). Márquez et al (2008) 0,40±0,04

0,056 µg/g

Curvina (M. ancylodon)

Robalito (C.ensiferus) Róbalo (Centropomus undecimalis)

Trucha de mar (D. radiale)

Márquez et al (2008)

0,12 µg/g Marcano y Troconis (2001) Márquez et al (2008)

Laguna de Unare, Estado Anzoátegui Lamparosa (S.vomer)

Referencia

Estado Falcón: Costas de Punto Fijo

1,38 ± 0,24 µg/g

Marcano y Troconis (2001)

Costas de Punto Fijo

1,25 ± 0,03 µg/g

Marcano y Troconis (2001)

Costas de Punto Fijo

1,09 ± 0,07 µg/g

Marcano y Troconis (2001)

0,072 µg/g Laguna de Unare, Estado Anzoátegui

No detectable

Márquez et al (2008)

Costas de Punto Fijo

0,99 ± 0,08 µg/g

Marcano y Troconis (2001)

Corocoro (A. surinamensis)

Costas de Punto Fijo

0,65 ± 0,11 µg/g

Marcano y Troconis (2001)

Armadillo (H. watwata)

Estado Zulia: Lago de Maracaibo

0,72 ± 0,13 µg/g

Marcano y Troconis (2001)

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6 Manamana (A. laticeps )

Sardina (P. barromeri)

Carite (S. maculatus)

Lago de Maracaibo

0,41 ± 0,05 µg/g

Marcano y Troconis (2001)

Estado Sucre: Costas de Cumaná

0,49 ± 0,03 µg/g

Marcano y Troconis (2001)

Costas de Cumaná

0,79 ± 0,11 µg/g

Marcano y Troconis (2001)

Vieja (A. pulcher)

Estado Zulia, Río Guasare,

Bagre amarillo (P. clarias)

2,54−3,55 mg/Kg

6,2±0−8,93 ±0,77 mg/Kg

Vanegas (2003)

Río Guasare

1,82−3,28 mg/Kg

4,95−8,13± 1 mg/Kg

Vanegas (2003)

Guabina (H. malabaricus)

Río Guasare

1 mg/Kg

8,83 mg/Kg

Vanegas (2003)

Bocachico (P. reticulatus)

Río Guasare

0,85−3,4 mg/Kg

7,15−10,29 ±5,25 mg/Kg

Vanegas (2003)

Chupatierra (G. steindachneri)

Río Guasare

1,13−3,18 mg/Kg

0,30−12,42 mg/Kg

Vanegas (2003)

Chaguita (A. magdalenae)

Río Guasare

2,58−3,19 mg/Kg

6,39±2,758,91±2,72 mg/Kg

Vanegas (2003)

Pez aguja (C. hiyeta)

Río Guasare

4,08±0,88 mg/Kg

4,49±0,19 mg/Kg

Vanegas (2003)

(C. kraussii)

Río Guasare

2,42−4,83 mg/Kg

5,56±2,5−7, 88±1,82 mg/Kg

Vanegas (2003)

Armadillo (R. magdalenae)

Río Guasare

2,48−3,40 mg/Kg

5,71−9,31 mg/Kg

Vanegas (2003)

(R. dayi)

Río Guasare

2,86−3,03 mg/Kg

6,98±2 mg/Kg

Vanegas (2003)

(P. suborbitalis)

Río Guasare

3,2 mg/Kg

16,43 mg/Kg

Vanegas (2003)

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7 (C. dearborni)

Laguna de los Patos Cumaná, Estado Sucre

Bagre (C. maracaiboensi)

Zona norte, lago de Maracaibo, estado Zulia

Bagre cuinche Calthorops spixi

Laguna de Unare, Estado Anzoátegui

Curvina (S. herbergü)

Zona norte, lago de Maracaibo, estado Zulia

Macabí/Malacho Elops saurus

Laguna de Unare, Estado Anzoátegui

Cachama (C. macropomum)

Laguna Caigual Edo. Delta Amacuro

19,48 ± 5,81 µg/mg

22,85± 20 ug/mg

Toledo et al., (2000)

1,115 mg/Kg (0,052− 4,942) 0,09 µg/g

Márquez et al (2008)

0,22 µg/g

0,814 mg/Kg (0,310− 0,543) 0,88 µg/g

0,16 µg/g

8,16µg/gp s

5,90 µg/gps

Sánquiz et al., (1999)

Sánquiz et al., (1999) Márquez et al (2008)

No detectable

Datos obtenidos por el autor

Contenido de metales pesados en invertebrados acuáticos de Venezuela Invertebrados como los moluscos son conocidos por su capacidad de bioconcentrar metales pesados por lo que resultan organismos utilizados en las evaluaciones de metales pesados en ambientes acuáticos. En la tabla II se muestran los datos (1999-2009) de la concentración de metales reportadas para algunas especies de importancia comercial. Todos los organismos evaluados presentan concentraciones de cadmio de baja a moderada. Se observa que el mejillón marrón P. perna proveniente del Golfo de Cariaco presenta los valores más altos de cadmio y plomo, los autores sugieren que las altas concentraciones de estos elementos metálicos en el mejillón podría estar relacionado con las descargas de efluentes procedentes de industrias procesadoras de productos del mar (Castillo y col., 2005). Las concentraciones de cadmio y plomo reportadas por Boada y col., (2007), en camarones aunque parecieran mas altas que las reportadas para el camarón, presentan desviaciones muy grandes lo que sugiere que los valores reportados son muy heterogéneos. Estado de conocimiento de las concentraciones de cadmio, mercurio y plomo en organismos acuáticos de Venezuela http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/110909.pdf

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8 La influencia de la explotación minera en el alto y medio Orinoco se ve reflejada en el aumento sostenido de la concentración de mercurio en el mejillón Perna viridus, y en la ostra Crassostrea sp; Rojas de Astudillo y col., (2002) reportan para estas especies concentraciones moderadas de mercurio; dos años después, Rojas (2005) evaluando dos de las zonas antes reportadas por Rojas de Astudillo y col., (2002) encuentra que en las muestras provenientes de Río Caribe, Estado Sucre se observan concentraciones de mercurio de 1 mg/Kg de masa seca en 8,5% de éstas; este valor representa el límite máximo permisible para consumo humano, mientras que el 3%; de las muestras provenientes de Chacopata, zona supuestamente no impactada, presentan valores igual o superior a 1 mg/Kg; aunque este porcentaje es bajo, es indicativo que esos organismos ya están siendo afectados por la presencia de mercurio en esta zona (Tabla II) TABLA II. Concentración de cadmio, plomo y mercurio en moluscos y crustáceos de Venezuela. TABLE II. Cadmium, lead and mercury concentration en crustacean and mussels of Venezuela Organismo Cangrejo (C. ornato)

Procedencia BocaripoChacopata (Estado Sucre)

Cd 17,02 mg/g

Pb 0.13 mg/g

Bivalvo (L. plei)

Puerto la Cruz. (Estado. Anzoátegui)

0,13 µg/g

6,87µg/g

Segura (2006)

0.33 µg/g

5,78 µg/g

Segura (2006)

Playa Caicara, (Estado Anzoátegui)

0,59-0,88 µg/g

2,98-4,12 µg/g

Rivero (2006)

Estado Miranda:

<1-1,9 µg/g

<1,5-4,9 µg/g

LaBrecque et al., (2004)

Boca de Paparo

1,23-6,31 µg/g

Río Chico

2,60-5,64 µg/g

Pepitona ( A. zebra) Guacuco (T. matroides)

0.02-1.80 µg/g

Referencia Pérez et al. (2004)

Acosta y Lodeiros (2004)

Playa Güiria 0,7-6,52 µg/g

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Camarón (P. brasiliensis)

Estado Anzoátegui

0,08- 3,67 ppm

0,003-2,03 ppm

Segura (2006)

Camarón blanco (P. schmitti)

Laguna de Unare

0,065 µg/g

0,26 µg/g

Márquez et al (2008)

Calamar (L. ple)i

Estado Anzoátegui

0,00,13ppm

1,82- 6,87 ppm

Segura (2006)

Mejillón (P. viridis)

GuacaGuatapanare (Estado Anzoátegui)

0,02-0,09 ppm

1,86- 3,52 ppm

Arias de Díaz y García (2001)

Estado Sucre Isla de Margarita (Estado Nueva Esparta)

0,022 µg/gps

2,5-5,7 ppm

0,021 µg/g

0,02- 0,00 µg/gps 0,03 µg/g

0,433 µg/gps

Estado Sucre: Chacopata

Arias de Díaz y García (2001) Rojas de Astudillo et al., (2002)

0,03 µg/g Rio Caribe

Güiria

0,02 µg/g

Rojas (2005)

0,688 µg/gps

Rojas de Astudillo et al., (2002)

0,080,01 µg/g

0,05±0,02 µg/g

Rojas, (2005) Rojas de Astudillo et al., (2002) Rojas de Astudillo et al., (2002)

Mejillón marrón (P. perna)

Golfo de Cariaco (Estado Sucre)

4,60±2,61 ug/g

9,76±5,39 ug/g

Castillo et al., (2005)

Estado de conocimiento de las concentraciones de cadmio, mercurio y plomo en organismos acuáticos de Venezuela http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/110909.pdf

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Ostra (Crassostrea sp)

Isla de Margarita (Estado Nueva Esparta)

>0,01 µg/g

Estado Sucre: Chacopata

0,22 ± 0,01 µg/g

Güiria

0,08 ± 0,02 µg/g

0,02 µg/g

Rojas de Astudillo et al., (2002)

0,05 µg/g

Rojas de Astudillo et al., (2002)

0,01 µg/g

Yaguaraparo 0,03 µg/g

0,03 µg/g

Chacachacare <0,01 µg/g Pedernales (Estado Delta Amacuro)

0,04 µg/g

Rojas de Astudillo et al., (2002)

0,04 µg/g 0,05 µg/g

Bivalvo (Donax spp)

Pepitona (A. zebra)

Estado Anzoátegui

0,09 ± 0,13 ppm

0,12- 8,87 ppm

Segura (2006)

Estado Anzoátegui

0,19 ± 0,33 ppm

1,50 -6,20 ppm

Segura (2006)

Almeja (P. solida)

Zona norte, Lago de Maracaibo (Estado Zulia)

Camarón (P. schmitti)

Golfo de Cariaco (Estado Sucre)

(F. subtilis)

(F. nodialis

0,08±0,22 µg/gps

29,27±29,27 µg/gps

0,065 µg/g

0,26 µg/g

0,687 mg/Kg

Sánquiz et al (1999)

0,838 mg/Kg

Boada et al., (2007)

Márquez et al., 2008

Estado Anzoátegui: Laguna de Unare,

0,83±3,83 µg/gps

19,05±22,28 µg/gps

Estado Sucre: Golfo de

2,30± 5,40 µg/gps

8,60±5,40 µg/gps

Boada et al., (2007)

Estado de conocimiento de las concentraciones de cadmio, mercurio y plomo en organismos acuáticos de Venezuela http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/110909.pdf

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11 Cariaco Boada et al., (2007) (F. subtilis)

Golfo de Paria

0,10±0,11 µg/gps

7,10±10,56 µg/gps

0,30±0,37 µg/gps

No detectado

0,71±1,30 µg/gps

8,69±8,11 µg/gps

Boada et al., (2007)

(F. nodialis)

(F. brasiliensis)

Isla de Margarita (Estado Nueva Esparta)

Boada et al., (2007) Boada et al., (2007)

Perspectivas La contaminación de cuerpos de agua del país por los metales cadmio, mercurio y plomo está repercutiendo negativamente en las especies que en ellos habitan las cuales, en algunos casos, presentan concentraciones de estos elementos por encima de los valores recomendados por la OMS en alimentos utilizados para el consumo humano (OMS, 1999). Un monitoreo de las zonas impactadas, de las posibles zonas de influencia y de los organismos que allí habitan así como la ejecución de las normativas vigentes para el control ambiental podría ayudar a mejorar la calidad del ambiente y en consecuencia, la salud de las poblaciones humanas. CONCLUSIONES La movilidad de los elementos evaluados (cadmio, plomo y mercurio) y probablemente, los procesos de bioconcentración y biomagnificación podrían explicar la presencia de moderadas concentraciones de estos elementos en los organismos provenientes de las zonas de influencia de los ríos y de zonas aparentemente no impactadas Existe escasa información sobre las concentraciones de los metales cadmio, mercurio y plomo en organismos acuáticos de Venezuela, sin embargo, la literatura revisada reporta que las concentraciones de estos metales en los peces y en otras especies superan hasta cien veces las concentraciones determinadas en las aguas y sedimentos. Estado de conocimiento de las concentraciones de cadmio, mercurio y plomo en organismos acuáticos de Venezuela http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/110909.pdf

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12 Agradecimiento: Los autores agradecen al Fondo Nacional de Ciencia Investigación y Tecnología (FONACIT) proyecto de investigación UDOFONACIT G2005000775 y al Consejo de Investigación de la Universidad de Oriente, Núcleo de Sucre, Cumaná, BIBLIOGRAFÍA • Acosta, V., Lodeiros, C., Senior, W., Martínez, G. Niveles de metales pesados en sedimentos superficiales en tres zonas litorales de Venezuela. Interciencia, 2002, vol. 27, nº 20, p.1-6. • Acosta, V., Lodeiros, C. Metales pesados en la almeja Tivela mactroides (Born, Bibalvia Veneridae) en localidades costeras con diferentes grados de contaminación en Venezuela. Ciencias Marinas, 2004, vol. 30, nº 2, p. 323-333. • Bifano, C. I., Mogollón, J. L. Metallic contaminant profile in sediment cores from lake Valencia, Venezuela. Environm Geochem Health, 1995, vol.17, nº 3, p.113-118. • Boada, M., Moreno, M., Gil, H., Marcano, J., Maza J. Metales Pesados (Cu+2, Cd+2, Pb+2, Zn+2) en Músculo y Cefalotórax de Camarones Silvestres Litopenaeus schmitti, Farfantepenaeus subtilis, F. notialis y F. brasiliensis de la Región Oriental de Venezuela. Revista Científica (Venezuela), 2007, vol.17, nº 2, p. 186-192. • Bridges, C.C., Zalups, R.K. Molecular and ionic mimicry and the transport of toxic metals. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2005, vol. 204, p. 274-308. • Castillo, I., Acosta, V., Martínez, G., Núñez, M. Niveles de metales pesados en gónadas y músculo aductor del mejillón marrón Perna perna, cultivado en la ensenada de Turpialito, golfo de Cariaco, estado Sucre, Venezuela. Zootecnia Trop (Venezuela), 2005, vol. 23, nº 2, p.141-154. • Cervigón, F. La ictiofauna marina de Venezuela: una aproximación ecológica. Bol. Inst. Oceanogr. Venezuela, Univ. Oriente, 2005, vol. 44, nº 1, p.3−28. • Decreto 883. Gaceta Oficial de La República de Venezuela (1995).. Normas para la clasificación y el control de la calidad de los cuerpos de agua y vertidos o efluentes líquidos No 5,021. Extraordinario. • Dorta, A., Sosa, P. Determinación de niveles de Pb, Cd, Cr, Cu, Fe, Ni y Zn en tejidos de lisa (Mugil caurema) y lebranche (Mugil lisa) capturados en la laguna de Unare, Estado Anzoátegui. Acta Cient. Ven., 2004, vol. 55, nº 1, p. 70 (resumen). • Fermín, I. Estudio geoquímico de los sedimentos superficiales de la laguna de Unare. Edo. Anzoátegui. Venezuela. Tesis de Grado no publicada. Universidad de Oriente, Venezuela. 2002. 70 pp. • Fernández, A., Singh, A., Jaffe, R. A literatura review on trace metals organic compounds of antropogenic origin in the wider Caribbean Region. Marine Polution. Bull,. 2007, vol. 54, nº 11, p.1681-1691. Estado de conocimiento de las concentraciones de cadmio, mercurio y plomo en organismos acuáticos de Venezuela http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/110909.pdf

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REDVET: 2009 Vol. 10, Nº 11 Recibido 29.03.09 - Ref. prov. M030923B – Revisado 14.10.09 - Aceptado 29.10.09 Ref. def. 110909_REDVET - Publicado 15.11.09 Este artículo está disponible en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109.html concretamente en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/110909.pdf REDVET® Revista Electrónica de Veterinaria está editada por Veterinaria Organización® Se autoriza la difusión y reenvío siempre que enlace con Veterinaria.org® http://www.veterinaria.org y con REDVET® - http://www.veterinaria.org/revistas/redvet - http://revista.veterinaria.org

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Respuesta inmune a la infección por Leishmania infantum en caninos - Immune response to infection by Leishmania infantum in dogs Irlene Evelyne Rodríguez Villamizar: Microbióloga., M.Sc Microbiología Docente Tiempo Completo Medicina Veterinaria y ZootecniaGrupo de Investigación Microbiología Aplicada CORHUILA-GMAC Corporación Universitaria del Huila “CORHUILA” Irlene.rodriguez@corhuila.edu.co

Resumen La leishmaniasis visceral canina (LVC) es una enfermedad infecciosa clásicamente asociada al protozoo Leishmania spp, que se manifiesta con un amplio espectro patológico, desde infecciones asintomáticas hasta procesos viscerales fatales. El control de la infección implica el desarrollo de una respuesta inmune protectora, que en el caso de los perros es dicotómica, caracterizada tanto por mecanismos humorales como celulares. Los mecanismos humorales involucran anticuerpos y complemento mientras que el mecanismo celular implica la activación de macrófagos y linfocitos T con la producción de citocinas. El objetivo de esta revisión es ofrecer un panorama general de los mecanismos inmunológicos, células y moléculas que intervienen durante el establecimiento de la infección por Leishmania en perros. Palabras clave: leishmaniasis visceral canina, L. infantum, citocinas, anticuerpos, linfocitos T ABSTRACT Canine Visceral Leishmaniosis (CVL) is an infectious disease classically associated with the protozoan Leishmania spp, which cause a broad pathological spectrum, ranging from asymptomatic infection to fatal visceral processes. Infection control involves the development of a protective immune response, which in the case of dogs is dichotomous, characterized by both humoral and cellular mechanisms. Humoral mechanisms include antibodies and complement but cellular mechanism involved alveolar macrophages and T lymphocytes activation with the production of cytokines. The aim of this review is to provide an 1 Respuesta inmune a la infección por Leishmania infantum en caninos http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/111104.pdf

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overview about the immunological mechanisms, cells and molecules involved during the establishment of the Leishmania infection in dogs. Key words: Canine Visceral Leishmaniasis, L. infantum, cytokines, antibodies, T lymphocytes

Introducción La LVC es una enfermedad producida por L. infantum, protozoo flagelado de la familia Tripanosomatidae [10], que constituye un serio problema de Salud Pública, a razón de su carácter zoonótico y afectación de la salud animal. La Organización Mundial de la Salud (OMS) considera esta enfermedad tropical como una de las más importantes, de ahí que ha sido incluida en el programa especial de investigación y formación de enfermedades infecciosas (TDR) señalándola como prioritaria para la investigación y el control [13]. En Colombia, la leishmaniasis es endémica; al norte del Departamento del Huila, la prevalencia de infección en caninos es de 17.2% [5]. Leishmaniasis visceral canina La LVC es una enfermedad infecciosa de evolución crónica, cuya visceralización puede aparecer luego de la inoculación cutánea [12], en la que la respuesta de tipo celular tiene un papel importante en el curso de la infección y establecimiento de la enfermedad. La transmisión de L. infantum es altamente especializada [9] y está condicionada al hallazgo de un reservorio apropiado de infección, un vector adecuado (género Phlebotomo) y población susceptible [11]. Una característica importante de la LVC es su carácter focal, limitándose a zonas donde concurren condiciones adecuadas para el mantenimiento del vector, aspecto que incrementa el riesgo de transmisión zoonótica [17]. Desde el punto de vista del diagnóstico, esta enfermedad adquiere especial importancia a razón de generar una amplia variedad de manifestaciones en los caninos, por lo que es necesario incluir la leishmaniasis en el diagnóstico diferencial de otras patologías [15]. Respuesta inmune humoral La respuesta de anticuerpos en caninos depende de aspectos como la 2 Respuesta inmune a la infección por Leishmania infantum en caninos http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/111104.pdf

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forma clínica de la enfermedad, la cantidad de parásitos y el estado de la infección [16]. Los caninos, sean asintomáticos o no, desarrollan generalmente una respuesta humoral específica, no obstante, se ha evidenciado que la producción de anticuerpos por el animal infectado no ejerce efecto protector frente a la enfermedad [20]. En un estudio realizado en Colombia, se reporta como un canino procedente de una zona no endémica presenta un patrón antigénico similar al de un canino infectado [21] que podría sugerir una asociación entre los desordenes fisiopatológicos, la evolución clínica de la enfermedad y las respuestas celular y humoral. En el perro se han descrito dos poblaciones: aquellos que generan una respuesta inmune celular activa con una baja concentración de anticuerpos y que se asocian con resolución de la enfermedad y aquellos que presentan una producción anormal de anticuerpos con altas concentraciones de IgG e IgE no protectoras que se correlacionan con sintomatología clínica y progresión de la enfermedad. [1]. Los datos experimentales, sugieren que los anticuerpos prevalentes en animales enfermos son IgG1 e IgG2, luego de un tratamiento largo, lo que se observa es que el nivel de IgG1 disminuye pero el nivel de IgG2 se mantiene constante [4], la predominancia de estos isotipos de IgG podría sugerir su posible utilidad como marcadores de enfermedad. Varios métodos serológicos han sido ensayados para determinar respuesta humoral en caninos frente a L. infantum, pero en su proceso de aplicación se ha encontrado que existen perros que tienen bajos títulos de anticuerpos que podrían corresponder a reacciones cruzadas o inespecíficas [21], por lo que es ciertamente complejo determinar si realmente existe un papel importante de los anticuerpos in vivo frente a la infección y curso patológico de la enfermedad. En un estudio se reporta como la formación de complejos inmunes circulantes en leishmaniasis canina favorece el establecimiento de la enfermedad, sugiriéndose además que estarían compuestos por antígenos del parásito, anticuerpos del hospedador, nucleoproteínas y anticuerpos nucleares o autoanticuerpos [6]. Respuesta inmune celular 3 Respuesta inmune a la infección por Leishmania infantum en caninos http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/111104.pdf

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L. infantum facilita su proceso de fagocitosis o de opsonización a través de receptores del complemento como CR1 y CR2 expresados sobre la superficie de los macrófagos (MA), moléculas intermedias del complemento c3b/c4b depositadas en su superficie, receptores para Fc y receptores para la glucoproteína gp63 [8]. Cuando el proceso de internalización se hace a través de los receptores Fc de L. infantum fagocitado u opsonizado se genera la producción de intermediarios de oxígeno (explosión respiratoria) favoreciendo la fusión fagosomalisosoma, en donde tiene lugar la destrucción de éste por la actividad de enzimas líticas liberadas de los gránulos citoplasmáticos del MA, con la consecuente formación de péptidos de naturaleza proteica que serán luego procesados [18]. No obstante, este parásito es experto en la supervivencia dentro del MA, de manera que tiene la capacidad de suprimir la producción de radicales tóxicos o de citocinas, desencadenando la apoptosis o muerte celular del MA. Los péptidos de L. infantum procesados son acoplados a moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad tipo I (MHC I) que actúan como una plataforma sobre la cual se combina el péptido del parásito y de esta manera es presentado a los linfocitos T citotóxicos CD8+, generando una respuesta citotóxica que culmina en la destrucción del péptido. Ahora bien, cuando el péptido es acoplado a las moléculas MHC II, éste será presentado a los linfocitos T del tipo CD4+, que secretan sustancias que favorecen la estimulación de un clon complementario de linfocitos B para que inicien la síntesis de anticuerpos específicos en respuesta al péptido [2]. En el modelo canino, se ha observado un fenómeno de polarización en la respuesta de las células T CD4+ basado en el perfil de citocinas. Se ha evidenciado que las células Th1 producen IFN-γ, IL-2 y TNF-α cuyo papel preponderante en términos de respuesta inmune protectora en perros infectados con L. infantum ha sido la activación de MA [22], lo que se traduce en muerte intracelular del parásito y explicaría el fenómeno de resistencia canina a la infección. En cuanto al papel de la IL-12 se ha sugerido que la expresión simultánea de ésta junto con IL-2 e INF-γ conducen a un proceso de retraso en el establecimiento de la enfermedad en perros infectados experimentalmente [19]. El papel de la cascada de citocinas producidas por las células Th2 en el 4 Respuesta inmune a la infección por Leishmania infantum en caninos http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/111104.pdf

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perro no es muy claro, mientras que en el modelo humano la IL-10 se ha asociado al proceso patológico [7], en caninos los datos experimentales de las implicaciones de ésta Interleucina en enfermedad activa es controversial. Algunos autores han evidenciado una elevada expresión de esta citocina en animales infectados [19] que explicaría la elevada carga parasitaria, favoreciéndose la progresión de la infección. No obstante, otros autores han sugerido que el establecimiento de una infección sintomática en este modelo no puede ser relacionada a la expresión de la IL-10 [3]. La actividad de la IL-4 tampoco es clara en LVC, algunos reportes experimentales sugieren una elevada expresión de esta citocina en animales sintomáticos pero no en animales asintomáticos [14] que podría explicar el incremento en la producción de anticuerpos por los linfocitos B, estableciéndose una respuesta humoral que no protege frente al parásito. Conclusiones En contraste con virus y bacterias, los procesos infecciosos generados por protozoarios son prolongados y crónicos. Un parásito intracelular exitoso en un proceso de éstos, modulará la respuesta celular, suprimiendo aquellos eventos que no favorezcan su proliferación y potenciando otros que le garanticen supervivencia. A pesar del conocimiento de los diversos mecanismos que intervienen en la respuesta inmune a L. infantum, aún existen dos preguntas sin resolver: 1).Por qué la mayoría de los caninos infectados no desarrollan una respuesta protectora frente a la infección, por lo que se consideran animales 'susceptibles', en los que finalmente se establece el proceso patológico propio de la leishmaniosis y, 2) Cómo es la evolución o proporción de los portadores asintomáticos de L. infantum en la población canina, categorizados como animales resistentes o clínicamente enfermos. Lo anterior sugiere, la necesidad de profundizar en los aspectos patológicos de esta enfermedad, es decir, los diversos matices de la interacción hospedero- parásito, de manera que se posibilite el desarrollo de nuevas estrategias orientadas hacia el control de la infección en caninos, que tendría una incidencia directa en la disminución de la transmisión a humanos; así como la caracterización de aspectos asociados a virulencia de L. infantum que permitan desarrollar 5 Respuesta inmune a la infección por Leishmania infantum en caninos http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/111104.pdf

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nuevas técnicas de diagnóstico rápidas que contribuyan de manera efectiva y temprana al diagnóstico del médico veterinario que hace trabajo de campo y de esa manera detener el proceso de infección y de paso la transmisión al humano. Referencias Bibliográficas 1.

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18. 19. 20.

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REDVET: 2009 Vol. 10, Nº 11 Recibido 18.04.09 - Ref. prov. MAY050901B – Revisado 30.07.09 - Aceptado 08.08.09 Ref. def. 110904_REDVET - Publicado 15.11.09 Este artículo está disponible en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109.html concretamente en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/110904.pdf REDVET® Revista Electrónica de Veterinaria está editada por Veterinaria Organización® Se autoriza la difusión y reenvío siempre que enlace con Veterinaria.org® http://www.veterinaria.org y con REDVET® - http://www.veterinaria.org/revistas/redvet - http://revista.veterinaria.org

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Relationships between cow-calf sensory cues and the postpartum interval in suckler cows - Relaciones entre vínculos sensoriales vaca-ternero y duración del anestro post-parto en vacas nodrizas Álvarez-Rodríguez, Javier: Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria, Gobierno de Aragón | Revilla, Ricardo: Centro de Transferencia Agroalimentaria, Gobierno de Aragón | Sanz, Albina: Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria, Gobierno de Aragón D/e: jalvarezr@aragon.es Abstract At present, it is known that the suppressive influence of suckling on reproduction is independent of the neurosensory pathways from the teat or the udder; and that the maternal-offspring bond is the essential component of the prolonged postpartum anoestrus induced by suckling in beef cows. It has been shown that olfaction and vision are equally effective in allowing the calf identification by its dam, and that abolition of both senses attenuate the negative effects of suckling on luteinizing hormone (LH) secretion. This review indicates that the net effects of suckling or pseudo-suckling on the central regulation of tonic LH release are determined by the ability of the dam to identify the calf as its own or as unrelated. The use of several nursing systems (i.e. early weaning, temporary weaning and restricted suckling) to achieve early post-partum ovarian cyclicity are discussed. The management practices that limit suckling must also avoid close cow-calf association to reduce long postpartum intervals to first ovulation. Keywords: Beef cattle | suckling | anoestrus | post-partum physiology

Resumen En la actualidad, se sabe que la influencia supresiva del amamantamiento sobre la reproducción es independiente de las vías neurosensoriales del pezón o la ubre, y que el vínculo maternal vacaternero es el componente esencial de un prolongado anestro postparto inducido por la crianza en vacas nodrizas. Se ha

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demostrado que el olfato y la vista son igualmente eficaces en la identificación de la vaca sobre el ternero, y que la abolición de ambos sentidos atenúa los efectos negativos del amamantamiento sobre la secreción de hormona luteinizante (LH). Esta revisión indica que los efectos netos del amamantamiento o pseudo-amamantamiento sobre la regulación central de liberación tónica de LH son determinados por la capacidad de la madre de identificar a su cría como propia o como ajena. Se discute la utilidad de diversos sistemas de crianza como el destete precoz, el destete temporal y el amamantamiento diario restringido para acortar el período de inactividad cíclica ovárica postparto. Las prácticas de manejo que limitan el amamantamiento deberían asimismo limitar la asociación próxima entre vaca y ternero para reducir la duración del anestro postparto. Palabras clave: vacuno de carne | amamantamiento | anestro | fisiología del post-parto

1. Introduction The target calving interval of suckler beef cattle have to be around 1 year and taking into account that pregnancy is an event of invariable duration (275-285 days), postpartum intervals to first ovulation (PPI) should not exceed 85 days. Following parturition, the restoration of pituitary luteinizing hormone (LH) stores occurs paralleled by concomitant increases in releasable pools of LH, which appear to peak between 2 and 4 week after calving (reviewed by Williams, 1990). Nevertheless, extended periods of acyclicity often follow. Suckling is a major effect delaying the resumption of post-partum ovarian cyclicity when nutrient intake and body reserves are not limiting factors (reviewed by Short et al., 1990; Williams, 1990; Wettemann et al., 2003). The inhibition of episodic LH release provoked by suckling may be influenced by the secretion of hypothalamic opioid peptid βendorphin, in response to the suckling stimulus (Malven et al., 1986; Boland et al., 1990). Concentrations of endogenous opioid peptides in neural tissue are affected by suckling, and it has been observed that short-term administration of opioid antagonists increase LH secretion in suckled anoestrous cows (Williams and Griffith, 1995). The aim of this review is to describe the main sensory cues between cow-calf pair (tact, vision, olfaction and hearing) to aid designing management strategies that allow optimising reproductive performance in suckler beef cattle.

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2. Sensory cues 2.1. Tact through nursing frequency If calves are permanently weaned at birth, PPI of cows is markedly reduced relative to suckled counterparts. In an attempt to separate the effects of energy demands from lactation, presence of mammary tissue and suckling, Short et al. (1972) compared the postpartum intervals of suckled, non-suckled and non-suckled mastectomized cows. The suckled cows in their experiment had a PPI to first oestrus of 65 vs. 25 (P>0.05) and 12 (P<0.01) days for the non-suckled and non-suckled mastectomized cows, respectively. By adjusting nutrient intake to maintain constant live-weight among groups, these authors concluded that both suckling and the presence of mammary tissue without suckling could delay postpartum oestrus independent of lactation energy demands. Wettemann et al. (1978) provided data from range cows that support this concept and concluded that suckling intensity increased PPI, with no differences (P>0.05) across natural (67.0 ± 6.4 d; n=12) and foster (63.12 ± 9.2 d; n=9) calves but greater when cow raised two calves 94.6 ± 11.5 d; n=11; P<0.05). Neural connections from the mammary gland have been implicated as primary relays for signals that originate with the calf and that theoretically suppress function of the LH pulse generator. However, until recently, little effort has been made to define the time course of events leading to diminished gonadotropin release or the specific sensory cues required to produce it. Williams et al. (1987) initially reasoned that if the suckling process evokes a specific response from the central nervous system that alters the control of tonic LH release, an artificial stimulus such as hand milking should elicit a similar response and this should not be dependent on lactation. However, both of these hypotheses proved false, at least within a 24-h period. In the same study, these authors examined the ability of various related cues to cause acute and chronic effects on gonadotropin release and oestrus by testing the effects of suckling (negative control), non-suckling (positive control), milking eight times daily (on the basis of a previous work where calves suckled these times during a 24-h period under confinement conditions), presence of a nuzzled calf, and a combination of milking eight times daily and calf presence. They observed that cows in all but the suckled group exhibited the typical weaning response with regard to tonic LH secretion, although behavioural oestrus was not uniformly associated with these apparent ovulations.

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Results of these studies confirmed a requirement for specific somatosensory input from the suckling calf in order to inhibit gonadotropin release. Further studies revealed that somatosensory effects of suckling apparently cannot be blocked by placing latex “mask” over the teats and udder of the cow and even the chronic presence of the mask and its manipulation by the calf actually may enhance the inhibiting effects of suckling on resumption of cyclicity (McVey and Williams, 1991). In this regard, mastectomized cows maintained with their natural calves with unlimited interaction exhibited anovulatory periods similar to suckled-intact cows (Viker et al., 1989) and to milked cows maintained with muzzled calves with unlimited oral access to the inguinal region (MacMillan, 1983). Williams (1990) approached to this question by testing the hypothesis that the teat of the cow contains somatosensory pathways capable of modulating hypothalamic-hypophyseal function via neural input to the hypothalamus or higher brain centres. Perhaps these putative receptors distinguish between the somatosensory input of suckling vs. that of manual milk removal. In turn, only the suckling offspring could elicit a response capable of impinging fully on neural centres controlling gonadotropin secretion. If this hypothesis was correct, neural pathways that control milk ejection reflex must be different from those that suppress gonadotropin secretion. These ascending arcs must relay their message by causing release of specific neurotransmitters within a currently undefined hierarchy of neurons that eventually modulate hypothalamic function. The chronic presence of this stimulus may increase the sensitivity of hypothalamic neurons, such as those involving the opioid peptides, to estradiol negative feedback. This in turn would enhance opioid or adrenergic tone (via norepinephrine) and decrease spontaneous firing of the pulse generator. In this hypothetical model, multiunit electrical activity may be suppressed, GnRH remains sequestered and pituitary LH release is inhibited. In order to study the role of mammary somatosensory pathways in suckling-mediated anovulation, Williams et al. (2001) conducted a serial of experiments to evaluate endocrine, lactation and reproductive features of an experimental animal model employing complete neural disconnection of the udder in beef cows and then to utilize the validated model. Crossbred beef cows were randomly assigned to suckled/sham-operated control, weaned (calf removed)/sham-operated control, and suckled/mammary-denervated groups between days 14 and 18 post-calving. Additional cows were divided into weaned or suckled unoperated control groups. Complete mammary anaesthesia was attained in all denervated cows but sensory perception was not affected in sham-operated controls. Although acute sham-surgery attenuated weaning-induced increases in LH pulse and ovulation frequency, normal responses to weaning

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were observed in unoperated controls as well as in sham-operated controls 1 year later. Finally, denervated-suckled cows that had been denervated before conception exhibited LH secretion patterns and mean PPI was similar to those of intact-suckled cows. In contrast, the intact-weaned group responded within 2 weeks postcalving with an increased frequency of LH pulses, and PPI were shortened compared to the other groups. The conclusion was that suckling-mediated anovulation is not dependent upon mammary somatosensory cues. In addition, suckling frequency and duration is associated with suckling-mediated anovulation. However, in two studies where cows nursed calves from 2 to 23 times daily for the first 6 weeks old, variation in suckling frequency by single calves was unrelated to rebreeding activity in the dam (Williams et al., 1984b; Day et al., 1987). Table 1 summarizes the suckling behaviour observed in several studies performed in a broad rank of environments, breeds and calf managements. Table 1. Suckling behaviour in beef cattle Breed/purpos Calf age (suckling (days) frequency)

Calf Calf feeding management

Suckling Bouts (times/day)

0-180

Milk and pasture

Range

4.6 (0-30 d)2 4.8 (60-90 d) 3.0 (150-180 d)

Beef (AS)

0-100

Milk

Confinement

Rank 4.4-5.5

Beef (AS)

3-53

Milk

Confinement

Beef (AS)

0-120

Milk and pasture

Beef (AS)

Milk

Suckling duration per bout (min)

Suckling duration (min/day)

Source

38.8 (0-30 d) 55.9 (60-90 d) 30.7 (150-180 d)

Drewry et al. (1969)

Rank 8.511.4

Rank 45.9-53.4

Lewandrowski et al. (1983)

12.5 (d 3-11), 8.5 (d 17-39), 7.5 (d 45-53).

8 (d 3-11), 9 (d 1753).

100 (d 3-11), 76.5 (d 17-39), 67.5 (d 45-53).

Williams et al. (1984b)

Range

5.0 (rank 1 to 11) (0-120 d)

46 (rank 11 to 99) (d 0-120)

Odde et al. (1985)

Confinement

4.3 (3 calves) 3.7 (1 calf)

12.2 (3 calves) 7.8 (1 calf)

50.4 (3 calves) 29.3 (1 calf)

Pérez et al. (1985)

8.7 (d 52167) (Exp. 1), 8.4 (d 1780) (Exp. 2).

64 (d 52), 44 (d 167) (Exp. 1), 80 (d 17), 42 (d 80) (Exp. 2).

Day et al. (1987)

9.9 (0-180 d)

Lidfors et al. (1988)

Dairy (AS)

Day 45

Beef (AS)

52-167 (Exp. 1), 17-80 (Exp. 2).

Milk and pasture.

Range

8.6 (d 52), 4.5 (d 167) (Exp.1); 11.3 (d 17), 3.8 (d 80) (Exp. 2).

Beef (AS)

0-180

Milk and pasture

Range

4.3

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Beef (AS)

1-123

Zebu and crossbred (dual purpose, RS)4

0-180

Crossbred B.taurus x B.indicus (dual purpose, RS)

0-100

Dairy (AS)

5-45

Milk and pasture Milk, pasture and concentrat e Milk, pasture and concentrat e (Exp. 1) Milk and pasture (Exp. 2) Milk and pasture

Range

14 (d 1) 12 (d 7 and 65) 10 (d 123)

Range

3.8 (Zebu), 3.2 (crossbred)

2.8 (Zebu), 2.3 (crossbre d)

23.6 (Zebu), 18.8 (crossbred)

Das et al. (2001)

Range

3.4 (Exp. 1) 2.0 (Exp. 2)

20.8 (Exp. 1) 32.3 (Exp. 2)

PérezHernández et al. (2002)

Range

Rank 4-5

Rank 29-32

Zimmermann et al. (2003)

Lidfors et al. (1994)

2.1.1. Nursing systems Some of different management strategies to address long PPI in suckler cattle are (modified from Galina et al., 2001): a) Early weaning a few days postpartum, or weaning at 3-5 months; b) Partial weaning for 24, 48, 72 or 96 h (followed or not by induction of ovulation and oestrus synchronization); c) Restricted suckling once- or twice-daily for 30-60 min, or overnight; d) Delayed suckling for 6 to 8 h after milking (dual purpose cows). Under natural conditions, most cows only allow their own calves to suckle (Lewandrowski et al., 1983). Therefore, it is possible that only cow’s own calf can attenuate gonadotropin release (Williams and Griffith, 1995). Nonetheless, as explained before, when a cow adopts an additional calf, PPI is extended markedly (Wettemann et al., 1978). Williams and Griffith (1995) tested the hypothesis that exteroceptive cues responsible for the suppression of LH secretion are specifically attributable to the dam’s own calf and, therefore, are a product of the maternal offspring bond. The latter authors found that removal of natural calves from cows resulted in the expected increases in serum LH concentrations and pulse frequency within 48 h, and suckling by unrelated calves every 6h for 4 days did not prevent these increases. However, suckling by cow’s own calf at 6 h intervals maintained the suppressed pattern of LH release typical of suckled anovulatory females. Moreover, the onset of luteal activity in weaned and unrelated-suckled groups were nearly identical, both of

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them being markedly reduced compared with cows suckling their own calves. Early weaning can be a valuable tool to reduce PPI (Bellows et al., 1974), but the economics favour its use only under adverse conditions due to the high cost and intensive labour associated with early-weaned calves (Williams, 1990; Blanco et al., 2005). Partial weaning is normally used when it is followed by induction of ovulation and oestrus synchronization. The success of this practice per se is dependent on the postpartum stage and duration of calf removal, obtaining better results with 72 h than with 48 h, but even further time (96 h) is needed according to Shively and Williams (1987) to provoke ovulation in acyclic cows. Other authors found no improvement in reproductive performances with this calf management (Wright et al. 1987; Bonavera et al., 1990). Several studies (Acosta et al., 1983; Shively and Williams, 1989; Short et al., 1990; Williams, 1990; Zalesky et al., 1990; Lamb et al., 1999) have found that restricted suckling twice-daily is not enough to reduce PPI, and only once-daily suckling is useful as a calf management strategy to improve reproductive performance. However, in cows with moderate condition (around 2.5 on a 1-5 scale), restricted suckling twice a day has advanced the resumption of ovarian ciclicity (Revilla, 1997; Sanz et al., 2001), but this practice has no effect when cows suffer negative energy balance in early lactation (Sanz et al., 2006). The behavioural trends of the previous study revealed as well that the number of licks from cows to calves was significantly higher in cows suckling once- than twice-daily (55.5±16.1 vs. 22.5±4.8) to the detriment of licking their-selves (0.1±0.1 vs. 2.7±0.8), although both suckling systems allowed raising calves without impairing the maternal bond (Alvarez et al., 2006). Other factors may contribute to the inhibitory effects of suckling on postpartum reproduction, and time of suckling during the solar day has been proposed as one of those factors. Two reports using Bos Taurus cattle in South Africa have indicated that calves were less likely to suckle from 22:00 h to dawn (2.2% of suckling events observed) during the period when ovulation and anoestrus were ending (Stewart et al., 1993a), and that nightime suckling maintained the anovulatory state longer than daytime suckling (22 vs. 57% of cows cycling at 30 days post-partum, Stewart et al., 1993b). Nevertheless, Gazal et al. (1999) found in Bos indicus x Bos taurus cows that although mean number of suckling bouts per 24 h was greater for the ad libitum suckled group than either night- or daysuckled groups (5.9±0.4 vs. 3.8±0.1 and 3.9±0.3, respectively),

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suckling episodes were not confined to a particular period during the 24-h period, occurring at a periodicity of 4 to 6 h, and PPI did not differ among groups. These results questioned the previous conclusions in Bos Taurus in which eliminating nightime suckling reduces PPI. Therefore, the suckling systems discussed previously, which alter the frequency and duration of nursing, may be conditioned by the physical contact that allows recognition between dam and young. Calves maintained with mastectomized cows exhibited chronic “pseudo-suckling”, which was defined as positioning by the calf in the reverse parallel or perpendicular position, bunting, oral manipulation of skin of the leg or flank, and characteristic head to tail contact between cow and calf. If cow-calf interaction is restricted mechanically (Williams et al., 1987) or spatially (Viker et al., 1993; Stevenson et al., 1994), eliminating direct oral contact with the inguinal region, the anovulatory state is not maintained. Hence, the direct oral contact with the inguinal region and, therefore, the mere perception of being suckled may be sufficient for prolonging the period of anovulation (Williams and Griffith, 1995). Hoffman et al. (1996) provided evidence that the presence of a nonsuckling calf prolongs the PPI of its dam, but not to the same extent as a continuously present calf allowed ad libitum suckling. Extended PPI in cows with presence of a nonsuckling calf indicated that calf presence without suckling is a factor that limits the onset of ovarian cyclicity in suckled cows. Release of cortisol is independent of suckling, because the return of a nonsuckling calf (without suckling) increased cortisol. The afore-mentioned effects of suckling stimulus on the resumption of cyclicity interact with cow’s nutritional status (Warren et al., 1988; Schillo, 1992; Browning et al., 1994; Jolly et al., 1995; Sanz et al., 2004a; Sanz et al., 2004b), and may be more marked in dual purpose and/or crossbred than in hardy breeds (Marongiu et al., 2002; Sanz et al., 2003; Sanz et al., 2005). Moreover, PPI is generally longer in Bos indicus compared to Bos Taurus (Chenoweth, 1994). 2.2. Vision, olfaction and hearing The role of vision and olfaction in suckling-mediated inhibition of LH secretion has been broadly investigated in cattle (Williams and Griffith, 1995; Griffith and Williams, 1996; Williams et al., 1996). Olfaction plays a critical role in the development of maternal selectivity, with a minimum time required for sensitization of 5 min,

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with up to 5 h of effect in the absence of the calf (Hudson and Mullord, 1977). However, cows rendered anosmic after the maternal bond has been established, recognized their calves visually, allowed them to suckle and continued to exhibit an inhibited pattern of LH secretion in a suckled environment (Griffith and Williams, 1994). Neither blindness nor anosmia in cows nursing their own calves caused disinhibition of gonadotropin secretion (Griffith and Williams, 1996). In this study, at 3 weeks after calving cows were separated from their calves and allowed to be suckled by their own calf or an unrelated calf every 6 h for 6 days. Blind, olfactory-intact cows recognized their calves by smell, and anosmic, sighted cows recognized their calves by sight. Cows that were both blind and anosmic, and were forced to suckle unrelated calves, exhibited increases in pulse frequency of LH for 6 days. When both senses were abolished, cows could not identify the calf as their own or as unrelated, behaving as cows with weaned calves and having the typical increase in LH secretion. Both weaning (total absence of calfrelated stimuli) and suckling by an unrelated calf results in a rapid escape from the inhibitory influence previously maintained by the cow’s own calf. Thus, the maternal-offspring bond is essential for the suckling-induced anovulation, and cows can use both olfactory and visual cues to identify own and unrelated offspring. A sequence of estrogen priming, genital stimulation (oxytocinergic effect) and olfaction may be the primary communication link that drives the full establishment of maternal behavioural responses in the sheep, and although no data are available, it is assumed that similar events characterize the development of maternal behaviour in cows (Williams and Griffith, 1995). Le Neindre (1984) proposed from a behavioural point of view that cows recognize their young through olfactive and visual cues, while calves first use visual and hearing cues, discriminating dam’s moos from unrelated ones (Barfield et al., 1994). In sheep, the recognition through olfaction is believed to be based upon the offsprings’ individual olfactory signature that emanates from their body coat, specifically from the anal region. Many of the odours from the anal region of most animals have been associated with pheromones that are specifically detected by the vomeronasal organ and that influence a variety of reproductive activities from sexual maturation to maternal behaviour (reviewed by Booth, 2006). In cattle, maximum maternal responsiveness is critical at parturition, when there is an increased opioid effect (Williams and Griffith, 1995),

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which is maintained during early lactation in suckled beef cows, suppressing LH secretion (Malven et al., 1986; Whisnant et al., 1986). Although no relationship between intra-cerebral oxytocin release and suckling-induced inhibition of gonadotropin secretion has been found in cattle, there is an inverse relationship between factors facilitating maternal behaviour and factors modulating gonadotropin secretion (Silveira et al., 1993). Suckling stimulates peripheral oxytocin release and increases opioid tone in cattle; however, cows forced to suckle unrelated calves showed reduced frequency of peripheral oxytocin release and rapid resumption of pulsatile LH secretion, relative to cows suckling their own calves. Hence, suckling by unrelated calf might not maintain a hypothalamic opioid tone that can inhibit neuronal stimulation of GnRH secretory neurons (Williams and Griffith, 1995). These authors hypothesized that there is a close linkage between physiological variables that modulate maternal behaviour, opioidergic tone, and the LH pulse generator during suckling-mediated anovulation in cows. In summary, the suppressive influence of suckling is independent of the neurosensory pathways within the teat or the udder (Williams et al., 1984a; Cutshaw et al., 1991; McVey and Williams, 1991; Viker et al., 1993; Williams et al., 1993), and that the maternal-offspring bond is the essential component of the prolonged postpartum anoestrus induced by suckling in beef cows (Silveira et al., 1993; Lamb et al., 1997). It has been shown that olfaction and vision are equally effective in allowing the calf identification by its dam (Griffith and Williams, 1996), and abolition of both senses attenuate the negative effects of suckling on LH secretion (Stagg et al., 1998). Although partial weaning provokes an increase in pulsatile LH frequency (Shively and Williams, 1987), several authors question its usefulness to induce ovarian cyclicity in postpartum cows, unless at the same time progestogen-based treatments are applied (Troxel et al., 1980; Walters et al., 1982; Smith et al., 1983; Williams et al., 1987). The management practices that limit suckling must also limit close cow-calf association to reduce deep postpartum anoestrus. Bearing in mind that pre- and post-partum nutrition are primary factors determining the interval to first post-partum ovulation (Stagg et al. 1998; Sanz et al., 2004a), the suckling strategy may exert the greatest effect on cows with an intermediate body condition score at calving (2.5 on a 1-5 scale) and meeting maintenance requirements throughout lactation. Moreover, in case that restricted suckling at short intervals (once- or twice-daily for 30-60 min) needs to be applied, the isolation from visual and olfaction cues between cow-calf pair may improve reproductive performance of beef herds.

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REDVET: 2009 Vol. 10, Nº 11 Recibido 04.02.09 - Ref. prov. E0924B – Revisado 27.06.09 - Aceptado 31.10.09 Ref. def. 110908_REDVET - Publicado 15.11.09 Este artículo está disponible en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109.html concretamente en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/110908.pdf REDVET® Revista Electrónica de Veterinaria está editada por Veterinaria Organización® Se autoriza la difusión y reenvío siempre que enlace con Veterinaria.org® http://www.veterinaria.org y con REDVET® - http://www.veterinaria.org/revistas/redvet - http://revista.veterinaria.org

Relationships between cow-calf sensory cues and the postpartum interval in suckler cows http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/110908.pdf

Piometra en una yegua: reporte de un caso – Pyometra in a mare: a case report González del Pino, Francisco Javier. Dr. Medico Veterinario. MP 114. Argentina Contacto: fgdelpino@hotmail.com

Resumen El artículo describe el caso clínico de una piometra en un equino hembra de raza Peruano de Paso de 19 años de edad, diagnosticado mediante ecografía y su resolución mediante la técnica de lavaje uterino, utilizando una sonda tipo Foley. Método simple y práctico para el veterinario que trabaja a campo. Palabras claves: piometra, ecografía, lavaje uterino, equinos.

Summary The article describes a clinical case of a pyometra in 19 years old Peruvian Pasos female equine. This endometritis was diagnosed by transrectal ultrasound scanning and microbiological analysis. Streptococcus zooepidemicus, sensible to Penicillin and Amikacin, was isolated from uterine lavage. The mare was treated by an uterine lavage technique, using a Foley catheter. After 8 days, a negative microbiological culture and non-inflammatory endometrial tissue was observed. This case report elucidates a simple and practical method for veterinarian that works in field conditions. Key Word: pyometra, ultrasound, uterine lavage, mare Introducción Se denomina piometra a la infección supurativa, aguda o crónica, del útero, con la acumulación de pus en la luz uterina. Generalmente es el cerviz funcionalmente cerrado, el que impide la salida de pus. 1 Otra causa puede ser un cerviz fibroso, tortuoso e irregular, o que presenta adherencias, condiciones que impiden el drenaje de las secreciones glandulares normales y de las secreciones uterinas purulentas. Cuando se eliminan las adherencias cervicales o bien se dilata manualmente el cerviz puede obtenerse un fluido de color amarillento y de consistencia viscosa.

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En algunos casos este fluido se acumula en ausencia de lesiones cervicales, presumiblemente debido a una alteración en la capacidad uterina para eliminar los exudados que se generan a posterior de los servicios o durante el estro y que luego sufren una contaminación bacteriana. 2 Estos exudados ejercen una tensión gravitacional sobre un útero flácido y distendido que se ubica por debajo del borde de la pelvis lo cual impide su drenaje. La piometra en la yegua puede ser clasificada dentro de dos tipos: de cerviz abierto o de cerviz cerrado. En los casos de cuello abierto puede observarse la presencia de un fluido de consistencia acuosa o cremosa escurriendo por los labios vulvares, no así en los casos de piometra a cuello cerrado en donde el fluido se acumula en el útero, el cual finalmente se distiende y adopta la forma de un balón. Las yeguas con piometra rara vez muestran alteraciones sistémicas evidenciables, aunque algunas sufren anemia leve. La mayoría de los casos son diagnosticados en forma casual durante los exámenes de rutina. Debido a esto, la mayoría de los casos se tornan de tipo crónico. 3 Cuando está presente una piometra, la misma puede ser diagnosticada por medio de la ecografía transrectal, durante la cual se detecta en el interior de los cuernos y/o del cuerpo uterino la presencia de un fluido ecogénico que presenta partículas “centellantes”. El uso de un hisopado uterino para realizar un cultivo permite identificar el organismo causante, y un biopsia determinar el grado de extensión y compromiso generado por la enfermedad a nivel uterino.

Descripción del caso clínico Anamnesis Se presentó, en el año 2007, un Equino hembra de 19 años de edad, de raza Peruano de Paso, para realizar un diagnóstico de preñez. La yegua había sido previamente inseminada durante tres ciclos estrales consecutivos. Se le realizaron 3 inseminaciones día de por medio, durante el período de celo de cada ciclo estral, sin lograr preñarla, por lo cual la yegua entraba nuevamente el celo. El animal no recibió ninguna asistencia veterinaria con el objetivo de determinar las posibles causas de los fracasos en las reiteradas inseminaciones. Posteriormente durante el cuarto ciclo estral consecutivo y luego de haber sido inseminada en la forma descripta anteriormente, el animal

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del caso no repitió celo, por lo cual el propietario del mismo supuso su posible preñez, solicitando un examen profesional para confirmar la misma. Examen físico En el examen físico no se encontró ninguna alteración sistémica evidenciable, incluso el animal se encontraba en muy buenas condiciones físicas. Durante la observación clínica de la región perineal y vulvar no se observó ninguna descarga purulenta ni la presencia de costras adheridas a la piel de dicha zona. A la palpación rectal se detectó que el útero estaba distendido como si se tratara de una preñez normal, pero llamó la atención que durante la maniobra de rebote no se pudiera determinar la presencia de un feto. Por lo citado anteriormente y sospechando de que podía tratarse de una piometra, se procedió a realizar un examen ecográfico. Durante el examen se observó la presencia de un fluido turbio con intensos patrones ecogénicos (híperecoicos), debidos a la presencia de partículas suspendidas en el mismo, (figuras Nº 1 y 2) imágenes compatibles con un cuadro de piometra, además no se pudo determinar la presencia de un feto.

Figura 1: Imagen ecográfíca del útero conteniendo un fluido turbio con patrones hiperecogénicos (flecha). La distancia entre las barras laterales corresponde a 10 mm.

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Figura Nº 2: Imagen ecográfíca del útero donde se observa la presencia de partículas hiperecogénicas grandes (flechas) suspendidas dentro del contenido, las cuales tiene la apariencia de copos de nieve en modo B.

Por insistencia del profesional actuante y para evitar un impacto negativo mayor en la fertilidad de la yegua, se sugirió comenzar con el tratamiento lo antes posible. El tratamiento para la resolución de la piometra consistió en la dilatación digital del cerviz, luego de lo cual se observó la presencia de un contenido purulento escurriendo por la vagina y la vulva (Figura Nº 3).

Figura Nº 3: salida de pus por vagina y vulva luego de dilatar manualmente el cerviz

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Ante estos hallazgos, se dispuso colocar un catéter intrauterino de uso equino (tipo Foley de plástico o silicona de 80 cm de largo y con un balón en su extremo, marca Bivona) por vía transcervical para drenar el contenido uterino (Figuras Nº 4 y 5).

Figura Nº 4 y 5: colocación de la sonda tipo Foley por vía transcervical para el drenaje de la piometra

Se recuperaron alrededor de 6 litros de un exudado purulento de color amarrillo y muy viscoso (Figuras Nº 6, 7, 8 y 9). Se procedió a tomar una muestra para realizar cultivo y antibiograma, a partir de los cuales se determinó la presencia de Streptoccus zooepidemicus, sensible a Penicilina y Amikacina.

Figura Nº 6: contenido purulento proveniente del útero

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Figuras Nº 7 y 8: recolección y cuantificación del contenido purulento de tipo viscoso. Se recuperaron alrededor de 6 litros.

Figura Nº 9: características físicas (color: amarillento y consistencia; viscosa) del material recolectado durante el drenaje de la piometra

Luego de haber recuperado la mayor cantidad posible del exudado, se realizaron lavajes uterinos diarios para eliminar todos los detritos que pudieran permanecer hasta la resolución del problema. Los lavajes se realizaron durante los dos primeros días con Solución Fisiológica estéril precalentada a 38ºC, (Figuras Nº 10, 11 y 12) en forma continua, hasta el momento en que la recuperación de dicha solución presentó un color similar al de la infundida originalmente (Figura Nº 13). Continuándose con dos lavajes utilizando la misma solución más el agregado de Iodopovidona al 0,5%.

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Figuras 10 y 11: lavajes uterinos con solución Fisiológica para eliminar los restos de contenido purulento. Figura Nº 12: liquido recuperado luego de varios lavajes sucesivos

Figura Nº 13: líquido obtenido en el último lavaje del primer día.

Para asegurarse la eliminación de todo el líquido perfundido dentro del útero se aplicaron 20 UI de Oxitocina por vía intramuscular al finalizar cada tratamiento diario. A partir del tercer día y una vez ya obtenidos los resultados del laboratorio, se continuaron los lavajes diarios únicamente con solución Fisiológica y realizados como se describió anteriormente. Al finalizar los mismos se infundieron 100 ml de solución Fisiológica conteniendo 5 millones de Penicilina sódica.

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Durante el séptimo y octavo día de tratamiento, el líquido recuperado en el primer lavaje presentó características similares al infundido, por lo cual en el octavo día se realizó un hisopado uterino, que fue enviado a un laboratorio para hacer citología y cultivo con el fin de confirmar la eliminación del agente etiológico. Al ser corroborada su ausencia, el décimo día se dio por concluido el tratamiento. Finalmente se le recomendó al propietario realizar una biopsia uterina para obtener un diagnóstico más fehaciente del grado de compromiso a nivel del tejido uterino que pudiera haber quedado como secuela, como así también un mejor pronóstico de la futura performance reproductiva de la yegua, pero prefirió no realizarla en ese momento y posponerla hasta la próxima temporada reproductiva. La yegua no fue inseminada nuevamente por lo cual esa temporada permaneció vacía. Discusión En este caso clínico el diagnóstico de la piometra fue realizado en forma accidental, ya que al tratarse de una patología muy poco frecuente en la especie equina y al no causar signos clínicos evidenciables a nivel sistémico, suele pasar desapercibida. Además por tratarse de una piometra a cuello cerrado no se observó la presencia de exudado escurriendo por la vulva. La patología diagnosticada en forma presuntiva durante el tacto rectal, fue diagnosticada mediante ecografía transrectal y confirmada al dilatar el cerviz con la sonda Foley, lo cual permitió el drenaje del contenido purulento. Con los datos obtenidos a partir del cultivo y antibiograma de dicho material, se instauró un tratamiento adecuado, acorde a las posibilidades económicas del dueño y factible de realizar por un veterinario trabajando con recursos limitados como ocurre en aquellos que trabajan en condiciones de campo y no en una clínica. El mismo consistió en realizar lavajes uterinos diarios con Solución Fisiológica y Iodopovidona, a los que luego se les sumó el antibiótico correspondiente. A partir de los resultados obtenidos de la segunda citología y cultivo (con el fin de evaluar el tratamiento), los cuales fueron negativos, se dio por finalizada la terapia. Finalmente se le recomendó al dueño realizar una biopsia uterina dentro de los 30 días de finalizado el tratamiento, para poder evaluar la eficacia del mismo, el grado en que el útero había sido dañado y finalmente a partir de estos datos emitir un pronóstico de la futura performance reproductiva de la yegua.

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Conclusión El uso de la ecografía transrectal es de gran ayuda para establecer un diagnóstico fehaciente de una piometra, sospechada a partir de un tacto rectal y en la cual no hay otros signos que manifiesten su presencia. La resolución de la misma es relativamente sencilla, pero sería muy importante realizar también una biopsia uterina al finalizar el tratamiento para evaluar el grado de compromiso uterino y finalmente poder emitir un pronóstico más exacto de la futura performance reproductiva de dicha yegua. Referencias 1. Jubb, K.V.F., P.C. Kennedy, N. Palmer (1990). Patología de los animales domésticos. 3ra. Edición, Capitulo 4. El Sistema genital femenino. Ed. Hemisferio Sur, p. 375-377. 2. Ricketts, S.W. (1992). Terapéutica actual en medicina equina 2. Sección 13 Reproducción. Alteraciones Uterinas. Editorial Prensa Veterinaria Argentina, p. 544-545. 3. Van Camp, S.D. (1993). Uterine abnormalitities. Diseases of the mares reproductive tract. In: Equine Reproduction. McKinnon A, O. Voss J,L. Section D. Chapter 44. Copyright Lea and Febiger, p. 393. 4. Caudle, A.B. (1997). Bacterial Causes of infertility and abortion. In Current Therapy in Large Animal Theriogenology. Youngquist R, S. Section I. Equine Theriogenology. Chapter 21. Copyright W.B. Saunders Company, p. 179-180

REDVET: 2009 Vol. 10, Nº 11 Recibido 11.06..09 - Ref. prov. JUL0915B – Revisado 04.10.09 - Aceptado 25.10.09 Ref. def. 110901_REDVET - Publicado 15.11.09 Este artículo está disponible en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109.html concretamente en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/110901.pdf REDVET® Revista Electrónica de Veterinaria está editada por Veterinaria Organización® Se autoriza la difusión y reenvío siempre que enlace con Veterinaria.org® http://www.veterinaria.org y con REDVET® - http://www.veterinaria.org/revistas/redvet - http://revista.veterinaria.org

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Algunas consideraciones sobre la deshidratación en perros beagle antes de su uso en investigaciones biomédicas Some considerations on the dehydration in beagle dogs before their use in biomedical research. Arencibia Arrebola Daniel Francisco1, Rosario Fernández Luis Alfredo2, Infante Bourzac Juan Francisco1, Fariñas Medina Mildrey1, López Feria Yulieé1, Díaz Rivero Daiyana1 1 Instituto Finlay, Vicepresidencia de Investigaciones, Calle 17 e/ 198 y 200, Apartado Postal 16017, Reparto Siboney, Municipio Playa, Ciudad Habana, Cuba. 2 Centro de Química Biomolecular, Calle 21 esquina a 200, Apartado Postal 16042, Reparto Atabey, Municipio Playa, Ciudad Habana, Cuba. Teléfonos: 2716911, 2715013. Contacto: darencibia@finlay.edu.cu Resumen El agua y los electrolitos son elementos vitales para la vida, deben mantenerse en constante equilibrio en el interior del organismo, dentro de límites de variación muy estrechos. Para ello los mamíferos poseen mecanismos que compensan las agresiones del medio, que tienden a romper este equilibrio. Estos reciben el nombre de mecanismos reguladores (el riñón, la hormona antidiurética y la aldosterona). Las alteraciones patológicas del equilibrio hidrosalino o lo que es igual, el equilibrio del agua y del sodio, se conocen como contracciones y expansiones del volumen del espacio extracelular. Una de las causas fundamentales de disminución de peso, la aparición de animales con anemia y desfavorable estado físico en los perros de la raza beagle lo constituyen los cuadros de diarreas, vómitos e inapetencia por otras enfermedades sobre todo en la etapa de cuarentena o durante nuestras investigaciones biomédicas las cuales impiden que se utilicen animales aptos y sanos para dicho fin. En el presente trabajo tenemos como objetivo realizar una guía práctica sobre como clasificar, diagnosticar y tratar la deshidratación en perros beagle, para de esta forma llegar al final de los estudios con la mayor calidad y cantidad de animales requeridos, asegurando la rapidez con la cual contrarrestar los efectos desfavorables que ocasiona la deshidratación. Para un buen diagnóstico, pronóstico y tratamiento es fundamental saber el tipo de deshidratación, cantidad de

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líquido perdido, estado de salud integral del animal y fluidos con los que contamos. Palabras clave: Sodio | deshidratación | perros beagles | hipotónica.

Abstract The water and electrolytes are vital elements for the life; they should be stay in constant balance inside the organism, among limits of very narrow variation. For it the mammals possess mechanisms that compensate the aggressions of the environment that spread to break this balance. These receive the name of mechanisms regulators (the kidney, antidiuretic hormone and the aldosterone). The pathological alterations of the hydrosaline balance , the water and sodium balance, they are known as contractions and expansions of the extracellular space volume. One of the fundamental causes of weight decrease, the appearance of animals with anemia and unfavorable physical state in the dogs of the beagle breed constitutes of diarrheas, vomits, inappetence for other illnesses mainly in the quarantine stage or during our biomedical research which prevent that are used capable and healthy animals. The aim of this work is to carry out a practical guide to classify, to diagnose and to treat the dogs beagle dehydration, for to arrive at the final studies with the biggest quality and quantity of animals required, assuring the speed with to counteract it cause the unfavorable dehydration effects. For a good diagnosis, prognosis and treatment is fundamental to know the dehydration type, quantity of lost liquid, state of integral health of the animal and existent fluids. Key words: Sodium | dehydration | beagles dogs | hipotonic.

Introducción El agua y los electrolitos son elementos vitales para la vida, deben mantenerse en constante equilibrio en el interior del organismo, dentro de límites de variación muy estrechos. Para ello los mamíferos poseen mecanismos que compensan las agresiones del medio, que tienden a romper este equilibrio. Estos reciben el nombre de mecanismos reguladores (el riñón, la hormona antidiurética y la aldosterona). En circunstancias normales, los cambios en la osmolalidad del medio interno estimulan o deprimen la secreción de la hormona antidiurética (ADH), con aumento o disminución, respectivamente, de la reabsorción tubular de agua y cambios de la concentración de solutos en orina, plasma y líquido intersticial, lo que hace que se restablezca el equilibrio hidrosalino. Las alteraciones patológicas del equilibrio hidrosalino o lo que es igual, el equilibrio del agua y del sodio, se 2/12 Algunas consideraciones sobre la deshidratación en perros beagle antes de su uso en investigaciones biomédicas http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/110902.pdf

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conocen como contracciones y expansiones del volumen del espacio extracelular. De manera secundaria, estas producen alteraciones idénticas del volumen del espacio intracelular. La determinación de la osmolalidad plasmática y urinaria posee gran importancia para el estudio de los trastornos del volumen extracelular.1 El agua constituye el 60-70 % del peso corporal total en los perros, dicho volumen depende de la edad, raza, sexo y estado físico, en el caso de los perros beagle se consideran valores del 60-62%.2 El agua se distribuye en dos grandes compartimientos: el extracelular (AEC), con el 35 % del agua corporal total y el intracelular (AIC), con el 65 %; separados entre sí por membranas semipermeables.2 Esta conformación permite el paso de agua y solutos en una u otra dirección, pero con características de selectividad para estos últimos, que contribuyen a mantener una distribución desigual de electrolitos entre los diferentes compartimientos.2, 3 La pared celular es muy selectiva al paso de proteínas, cloruros (Cl-), potasio (K+) y sodio (Na+). El endotelio vascular y la membrana celular son permeables al agua, por lo que esta pasa libremente, por los gradientes osmóticos, de un espacio al otro.4 El agua extracelular, a su vez, se distribuye en dos compartimientos: el intersticial y el intravascular, separados por las membranas del endotelio capilar, que se mantienen en equilibrio por los mecanismos que se expresan en las leyes de Donan y de Starling, en lo fundamental.5 En condiciones normales, el agua ingresa al organismo con la ingesta de bebida, la que contienen los alimentos, y la existente dada como producto del metabolismo (agua endógena). Algunas de las funciones del agua están dadas por ser el solvente general de las sustancias nutritivas y de las hormonas, mantiene el equilibrio del medio interno y mantiene o regula la temperatura corporal.4, 5 Una de las causas fundamentales de disminución de peso, la aparición de animales con anemia y desfavorable estado físico lo constituyen los cuadros de diarreas, vómitos e inapetencia por otras enfermedades sobre todo en la etapa de cuarentena o durante nuestras investigaciones biomédicas las cuales impiden que de una forma u otra se utilicen animales aptos y sanos para dicho fin. En el presente trabajo tenemos como objetivo realizar una guía práctica sobre como clasificar, diagnosticar y tratar la deshidratación en perros de la raza beagle los cuales son muy usados en nuestras investigaciones, esta guía le permitirá al personal que trabajan en bioterios con estos animales, llegar al final de los estudios con la mayor cantidad de perros y con la calidad requerida, los cuales den una imagen lo más cercano posible a la realidad al obtener los resultados al finalizar la experiencia.

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Desarrollo Entre los datos fisiológicos de los perros Beagle encontramos que en el líquido intracelular (LIC), el K+ se encuentra en concentración de 150 mmol/L en tanto en el líquido extracelular (LEC), oscila entre 3,5-5 mmol/L.6 El magnesio (Mg++) intracelular esta en concentración de 0, 7-1,2 mmol/L. En el líquido extracelular el Na+ se encuentra en concentraciones de 135 a 150 mmol/L, el Cl- anión fundamental del líquido extracelular se encuentra en el orden de 95 a 105 mmol/L y los carbonatos de 25 a 30 mmol/L.7 El acceso al agua ha de ser libre, pues su consumo es autorregulado en función de los requerimientos diarios del animal, los que pueden variar en dependencia de varios factores como son el estado físico del animal, el alimento consumido, la temperatura ambiente, la actividad física y el temperamento del animal entre otros, pero siempre el consumo de agua estará en función de remplazar casi exactamente la cantidad perdida. Concepto de deshidratación: Significa disminución de uno o ambos compartimientos líquidos, pero no es exacto porque no expresa el verdadero acontecer fisiopatológico en la relación agua-sales (Na+), lo que es necesario tener en cuenta. La terminología usada por diferentes autores para designar los distintos tipos de deshidratación varía mucho. El considerar que el Na+ es el principal catión del LEC, se toma como referencia en su relación con el agua para definir, sobre la base de su concentración y, por tanto de la osmolalidad del LEC, los tipos de deshidratación desde el punto de vista fisiopatológico que determinan su comportamiento clínico. Debemos conocer dos cosas para resolver un caso de un animal con esta sintomatología, el tipo de deshidratación (hipotónica o hipertónica), para saber que electrolitos hay que reponer en el organismo, peso del animal y el grado para definir cuanto ha perdido y lograr el equilibrio hidrosalino con la mayor urgencia posible, ya que el tiempo constituye una variable de gran peso a considerar, por lo general define el pronóstico del cuadro clínico. Anamnesis: a través de los signos clínicos que ha presentado el paciente y que son recopilados al momento de realizar la anamnesis podemos detectar la presentación de vómitos, diarrea, poliuria, que llevan con seguridad a un estado de deshidratación subclínico o clínico.

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Objetivos de la fluidoterapia: 9 9 9 9 9 9 9 9

Corrección de la deshidratación. Recuperar volumen vascular. Apoyar al sistema vascular en anestesia. Mejorar aporte de O2 a los tejidos. Proporcionar soporte nutricional. Corregir anormalidades ácido-base. Vehiculizar fármacos. Corregir anormalidades electrolíticas.

Clasificación de la deshidratación: Isotónica: Pérdidas equivalentes de agua (H2O) y Na+ y de líquidos isotónicos. Se presenta sobre todo cuando hay trastornos gastrointestinales. En la práctica la pérdida mixta de Na+ y agua es lo más frecuente y puede ocurrir el predominio ocasional de uno de ellos, de acuerdo con la evolución del proceso puede transformarse fácilmente en deshidratación hipotónica o hipertónica. Las pérdidas obligatorias de agua en la evolución natural de un proceso de pérdida isotónica, llevan a la ligera hipertonía del LEC, lo cual provoca salida de agua de las células, afectándose entonces también el compartimiento intracelular y la deshidratación por ello es global. Las condiciones se clasifican como normonatremia (Na+= 130-150 mmol/L).8 Hipotónica: Es considerada una deshidratación secundaria extracelular, llamada depleción salina.9 En este proceso se pierde más Na+ que H2O y por tanto encontramos este electrolito por debajo de 135 mmol/L. Se observa en las diarreas, vómitos, pérdidas de sangre ocasionadas por hemorragias con indigestión insuficiente de Na+, sudoración excesiva y diuréticos usados de forma indiscriminada que traen consigo pérdidas renales excesivas de Na+, además por patologías en el sistema renal como nefritis, insuficiencia renal crónica y por trastornos endocrinos.10 No hay sed, el animal manifiesta micción frecuente (Poliuria), hocico húmedo y el tono muscular disminuido. Hipertónica: Es la llamada deshidratación simple, pura o verdadera, en la cual ocurre una deshidratación global (depleción de H2O). En este proceso se pierde mas H2O que Na+ ya que fundamentalmente el Na+ se mantiene en valores mayores a 150 mmol/L.11 Esta presente por aporte insuficiente de H2O (fracturas en las cuales el animal no tenga acceso al H2O, inapetencia e indiferencia e inclusive al H2O o por pérdida excesiva de la misma, en trastornos respiratorios combinados con fiebre alta con polipnea, obstrucción intestinal, hernia encarcerada, por atonía del H2O provocando una osmosis deshidratando internamente al animal, por diabetes insípida verdadera dada por falta de ADH, y por diabetes insípida nefrogénica dada por insensibilidad 5/12 Algunas consideraciones sobre la deshidratación en perros beagle antes de su uso en investigaciones biomédicas http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/110902.pdf

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renal a la ADH.12 El animal presenta sed, oliguria, anuria, hocico seco, aumento de temperatura, tono muscular normal. Diagnóstico del grado de deshidratación: Se debe conocer para aplicar la conducta terapéutica. Primer Grado: Los parámetros a medir son, las pérdidas de líquido corporal son del 2 al 4 %, los ojos no están hundidos, el pliegue cutáneo demora en volver a su lugar de 4 a 15 seg, no hay depresión del sistema nervioso central, temperatura normal y no hay debilidad muscular.13 Segundo Grado: Pierde de un 5 a 7% de líquido corporal, el globo ocular se encuentra semihundido, existe una ligera depresión en el arco zigomático por tanto el globo ocular se encuentra hacia adentro, el pliegue cutáneo se demora en retraerse de 16 a 25 seg, ligera depresión del sistema nervioso central, la temperatura del animal es normal y existe una ligera debilidad muscular.13 Tercer Grado: Pérdidas de líquido corporal de un 8 al 10%, el globo ocular se encuentra totalmente hundido, el pliegue cutáneo demora más de 25 seg en retraerse, no responde a los estímulos, la temperatura se encuentra aumentada y hay gran debilidad muscular.13 Tratamiento: Los tipos de fluidos administrados a los perros son muy variados, pero se pueden clasificar en base al tamaño de las moléculas disueltas en ellos en 2 grandes grupos: los fluidos cristaloides (partículas de bajo peso molecular) y fluidos coloides (partículas de alto peso molecular, con capacidad osmótica).14-18 9 Fluidos cristaloides: Ringer-Lactato (R-L), cloruro de sodio (NaCl) 0.9%, NaCl 3%, NaCl 7,5%, glucosalino, manitol 15%, glucosa al 5, 10, 50%.19 9 Fluidos Coloides: Sangre, plasma congelado, plasma fresco congelado, gelatinas, dextranos e hidroxietil-almidón (Haes-steril®).20 Para las deshidrataciones de tipo hipotónica dentro de las soluciones más utilizadas se encuentra el R-L21, 22 (contraindicado en insuficiencia hepática y linfoma) o la solución de (NaCl) (corta duración de su efecto a nivel vascular). Por lo general se aplican por vía intraperitonial o por vía intravenosa (I.V) por hemodilución, en cambio cuando la deshidratación es de tipo hipertónica se utiliza la dextrosa o glucosa al 5%, en otros casos se puede utilizar la

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dextrosa al 50% pero se debe llevar a la concentración anterior antes de ser utilizada, al mismo tiempo se puede proceder a suministrarle H2O. En los casos en que se aplique por vía I.V se debe conocer los valores hematológicos tales como hemoglobina, hematocrito y recuento de glóbulos rojos, además observar el estado de las mucosas sobre todo la ocular valorando el color y aspecto, 21 es muy frecuente la muerte por shock vascular hipovolémico en animales anémicos al ser aplicada la fluidoterapia por vía I.V. La vía oral se utiliza cuando el animal no esta grave, mantiene los signos vitales y todavía existen reflejos.22, 23 Los pasos para llevar acabo la cantidad de líquido a reponer al animal consiste entre otros en primer lugar determinar el peso corporal real (Kg), luego calcular el 60% de su peso corporal para saber la cantidad de líquido que contiene en el cuerpo,24,25 posterior a esto se determina el grado de deshidratación, para de esta forma determinar que cantidad a perdido y saber de ese 60% que cantidad debe restituirse y por último determinar si existe anemia o no, insuficiencia hepática y otros, para saber la vía, tipo de fluido y velocidad a la que debe ser administrado.25 Ejemplo de nuestra experiencia práctica en el tema: A raíz de un pedido de perros beagles de ambos sexos, los cuales se necesitaban para realizar un estudio de toxicología de dosis repetidas, durante la cuarentena se nos presentaron dos casos de animales con cuadro clínico definido de deshidratación por diarreas, 48 horas posteriores a la transportación a nuestro centro, el proceder en uno de ellos lo ponemos a su consideración, ya que en ambos se llevó a cabo la misma metodología. Un perro beagle macho de 6 meses de edad, clasificando el tipo de deshidratación como hipotónica, ocasionada por diarreas continuas, el peso del animal era de 3 kg, en el cual se valoraron los reflejos y el grado de deshidratación clasificándose como de segundo grado, por ende había perdido el 7 % del líquido corporal. Se procedió de forma rápida a determinar el estado de salud, siendo ligeramente buena no presentaba anemia, hemoglobina=12,5 g/dl, hematocrito=38%, recuento de glóbulos rojos= 5,5 x 106/µl.19 Los valores hematológicos normales en perros beagles de ambos sexos se pueden observar en la Tabla 1. 1. 3 Kg x 60% /100% = 1,8 Kg o L contiene de agua en el cuerpo. 2. 1,8 Kg ó L x 7% / 100% = 0,126 L = 126 mL. A este perro se le administró 126 mL de NaCl (0,9%) por vía I.V lentamente (gota a gota). 7/12 Algunas consideraciones sobre la deshidratación en perros beagle antes de su uso en investigaciones biomédicas http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/110902.pdf

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Tabla 1. Valores hematológicos normales en perros de la raza Beagles, ambos sexos.19 Determinación Recuento 106/µl

Glóbulos

Machos Rojos

Hembras

x 5,5 a 7,7

5,5 a 7,6

Hemoglobina (g/dl)

12,5 17,0

Hematocrito (%)

38 a 51

36 a 50

Volumen Corpuscular Medio (fl)

60 a 71

62 a 72

Media 20 a 24

20 a 24

Hemoglobina (pg)

Corpuscular

Concentración Media Hemoglobina Corpuscular (%)

de 32 a 35

a 12,3 17,0

31 a 35

Conclusiones Para asegurar la rapidez con la cual contrarrestar los efectos desfavorables que ocasionan la deshidratación en los perros de la raza beagles, sabiendo que la variable tiempo es fundamental para un buen diagnóstico, pronóstico y tratamiento, debemos sobre todo saber el tipo de deshidratación, cantidad de líquido perdido, estado de salud integral del animal y fluidos con los que contamos. Esta pequeña revisión va encaminada a lograr tales objetivos con la mayor calidad y brevedad posible. Referencias Bibliográficas 1. Vukmir, R.B., Bircher, N., Safar, P. Sodium bicarbonate in cardiac arrest: A reppraisal. Am J Emerg Med, 2002, vol 14, nº 4,p.192-206. 2. Eleff, S.M., Sugimoto, H., Shaffner, H. Acidemia and brain pH during prolonged cardiopulmonary resuscitation in dogs. Stroke, 2004, vol 31, nº 2, p.2033-2036. 3. Henry, C.J. Oncologic emergencies. In the North American Veterinary Conference, 2001,p.394-396. 4. Ward,H. Management of cancer-associated hipercalcemia. In the North American Veterinary Conference, 2003,p. 450-457. 5. Hasankhani, H., Mohammadi, E., Moazzami, F., Mokhtari, M., Naghgizadh, M.M. The effects of intravenous fluids temperature on perioperative hemodynamic situation, post-operative shivering, and recovery 8/12 Algunas consideraciones sobre la deshidratación en perros beagle antes de su uso en investigaciones biomédicas http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/110902.pdf

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REDVET: 2009 Vol. 10, Nº 11 Recibido 15.09.09 - Ref. prov. SEP0909B – Revisado 13.10.09 - Aceptado 30.09.09 Ref. def. 110901_REDVET - Publicado 15.11.09 Este artículo está disponible en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109.html concretamente en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111109/110902.pdf REDVET® Revista Electrónica de Veterinaria está editada por Veterinaria Organización® Se autoriza la difusión y reenvío siempre que enlace con Veterinaria.org® http://www.veterinaria.org y con REDVET® - http://www.veterinaria.org/revistas/redvet - http://revista.veterinaria.org

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