Revista argentina de Microbiologia by Willy Benitez Aranda

D-glucosamina reduce la formación de biofilm de Staphylococcus epidermidis 1

REVISTA ARGENTINA DE

PUBLICACIÓN DE LA ASOCIACIÓN ARGENTINA DE MICROBIOLOGÍA Aparece en Biological Abstracts, Chemical Abstracts, Veterinary Bulletin, Index Veterinario, EMBASE (Excerpta Medica) Medline (Index Medicus), Tropical Diseases Bulletin, Abstracts on Hygiene and Communicable Diseases, Literatura Latinoamericana en Ciencias de la Salud (LILACS), Periódica, LATINDEX, SciELO, Science Citation Index Expanded y Redalyc.

DIRECTORA Silvia Carla Predari Instituto de Investigaciones Médicas Alfredo Lanari - UBA

SECRETARIO DE REDACCIÓN José A. Di Conza Facultad de Famacia y Bioquímica - UBA - CONICET Facutad de Bioquímica y Ciencias Biológicas - UNL

COMITÉ EDITOR Alicia I. Arechavala

Ana M. Jar

Héctor R. Morbidoni

Hospital Francisco J. Muñiz - GCBA

Facultad de Ciencias Veterinarias - UBA

Facultad de Ciencias Médicas UNR - CIUNR

Mauricio G. Carobene

Claudia I. Menghi

Facultad de Medicina - UBA - CONICET

Hospital de Clínicas - Facultad de Farmacia y Bioquímica - UBA

Inés E.García de Salamone

Beatriz N. Passerini de Rossi Facultad de Farmacia y Bioquímica - UBA

Facultad de Agronomía - UBA

ASESORES CIENTÍFICOS C. Bantar J.C. Basílico M.I. Berría H.M. Bianchini N. Binsztein R. Campos G. Carballal A. Cataldi J.J. Cazzulo

S.R. Costamagna C. Coto M. D’Aquino R. de Torres A.H. Frade A. Gentile A. Giri J.E. González S. González Ayala

N. Leardini G.A. Leotta H. Lopardo W.P. Mac Cormack D. Masih M. Mollerach R. Negroni F. Nicola T. Orduna

R. Raya V. Ritacco H.R. Rodríguez A.P. de Ruiz Holgado A. Schudel L. Scolaro F. Sesma R. Soloaga H. Terzolo G. Vaamonde

ASESORES EN EL EXTERIOR A. Amoroso (Bélgica) J. Arbiza (Uruguay) J.A. Ayala (España) P. Feng (EE.UU.) E. García López (España)

M. Gottschalk (Canadá) R. Guerrero (España) M.J. Mendes Giannini (Brasil) M. Philipp (EE.UU.) F. Queiroz Telles (Brasil)

A. Restrepo (Colombia) G. San Blas (Venezuela) G. Schmunis (EE.UU.) A. Steinbüchel (Alemania) M. Tolmasky (EE.UU) J. Vila Estape (España)

Secretaria: Deán Funes 472, C1214AAD Buenos Aires; Tel./Fax: (54-11) 4932-8858 y (54-11) 4932-8948; E-mail: info@aam.org.ar; http://www.aam.org.ar

Personería Jurídica 000908 Registro Nacional de la Propiedad Intelectual Nº 269649 I.S.S.N. 0325-7541

$ $ U$D U$D

120 240 100 200

Suc. 4 - B

Socios AAM Argentina no socios América Latina Otros países

Correo Argentino

SUSCRIPCIÓN ANUAL (cuatro números anuales)

Franqueo Pagado Concesión Nº 4195 Tarifa Reducida Concesión Nº 628

REVISTA ARGENTINA DE D-glucosamina reduce la formación de biofilm de Staphylococcus epidermidis 1 VOLUMEN 44 Nº 2 • ABRIL-JUNIO 2012

ÍNDICE EDITORIAL La nano, el mano y la microbiología clínica Héctor R. Morbidoni, Ana M. Jar MICROBIOLOGÍA BÁSICA *Detección del gen ompA de Chlamydophila pecorum en aves en cautiverio, en la Argentina María C. Frutos, Fernando Venezuela, Ximena Kiguen, Viviana Ré, Cecilia Cuffini Dos aislamientos de Salmonella Infantis multirresistentes se comportan como hipoinvasivos pero con elevada proliferación intracelular José A. Di Conza, Marta E. Mollerach, Gabriel O. Gutkind, Juan A. Ayala MICROBIOLOGÍA CLÍNICA Y ENFERMEDADES INFECCIOSAS Obtención y evaluación preliminar de un virus canarypox recombinante como candidato a vacuna antirrábica Flavia Zanetti, Liliana Rudak, Matías Micucci, Daniela Conte Grand, Andrea Luque, Susana Russo, Oscar Taboga, Oscar Pérez, Gabriela Calamante Caracterización genotípica de aislamientos de Escherichia coli obtenidos de cerdos con diarrea posdestete y enfermedad de los edemas Fabiana A. Moredo, Javier Cappuccio, Lucas Insarralde, Carlos J. Perfumo, María A. Quiroga, Gerardo A. Leotta CHROMagar KPC. Comparación con el método propuesto por los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC, EE.UU.) para el estudio de portación rectal y evaluación de falsos positivos Laura Errecalde, Sandra Cogut, Mariana Erbin, Liliana Jordá Vargas, Eugenia Cattani, Tamara Posse, Silvia Tutzer, Ricardo Hermes, Sara Kaufman *Dos casos de infección del tracto urinario causados por cepas de Escherichia coli O157:H7 productoras de toxina Shiga María del P. Gadea, Natalia Deza, María I. Mota, Carolina Carbonari, Mitila Robatto, Beatriz D’Astek, Victoria Balseiro, Cristina Bazet, Eduardo Rügnitz, Valérie Livrelli, Felipe Schelotto, Marta Rivas, Gustavo Varela Aporte de la técnica de PCR en el diagnóstico de Mansonella ozzardi en zonas endémicas de la Argentina María F. Degese, Marta G. Cabrera, Silvio J. Krivokapich, Lucía Irazu, Marcelo A. Rodríguez, Eduardo A. Guarnera MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Portación y caracterización de Staphylococcus aureus en manipuladores de alimentos Graciela B. Jordá, Raúl S. Marucci, Adriana M. Guida, Patricia S. Pires, Eduardo A. Manfredi

101

MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Y AMBIENTAL *Uso del escobajo como sustrato para el crecimiento de hongos de la pudrición blanca, la producción de enzimas ligninolíticas y la decoloración de tinturas Laura Levin, Luis Diorio, Emmanuel Grassi, Flavia Forchiassin 105 *Biodegradación de fenol en cultivos estáticos por Penicillium chrysogenum ERK 1: habilidades catalíticas y fitotoxicidad residual Erika A. Wolski, Viviana Barrera, Claudia Castellari, Jorge F. González 113 ARTÍCULO ESPECIAL *Bioprospección de microorganismos marinos. Potencialidades y desafíos para Argentina Hebe M. Dionisi, Mariana Lozada, Nelda L. Olivera IMÁGENES MICROBIOLÓGICAS Endosimbiosis de Arcobacter butzleri en Acanthamoeba castellanii Heriberto Fernández, María Paz Villanueva, Gustavo Medina Querión de Celso Mónica Saiz, Lorena P. Uribe, Andrés Gallardo Martínez Instrucciones para los autores Guía para la preparación de los manuscritos * En Inglés

122

133 134 135

D-glucosamina reduce la formación de biofilm de Staphylococcus epidermidis REVISTA ARGENTINA DE 1

VOLUMEN 44 Nº 2 • APRIL-JUNE 2012

INDEX EDITORIAL The nanotech, the “mano” and the clinical microbiology Héctor R. Morbidoni, Ana M. Jar GENERAL MICROBIOLOGY *Detection of the ompA gene of Chlamydophila pecorum in captive birds in Argentina María C. Frutos, Fernando Venezuela, Ximena Kiguen, Viviana Ré, Cecilia Cuffini Two multidrug-resistant Salmonella Infantis isolates behave like hypo-invasive strains but have high intracellular proliferation José A. Di Conza, Marta E. Mollerach, Gabriel O. Gutkind, Juan A. Ayala CLINICAL MICROBIOLOGY AND INFECTIOUS DISEASES Development and preliminary assessment of a recombinant canarypox virus as an antirabic vaccine candidate Flavia Zanetti, Liliana Rudak, Matías Micucci, Daniela Conte Grand, Andrea Luque, Susana Russo, Oscar Taboga, Oscar Pérez, Gabriela Calamante Genotypic characterization of toxigenic Escherichia coli isolated from pigs with postweaning diarrhea (PWD) and edema disease (ED) Fabiana A. Moredo, Javier Cappuccio, Lucas Insarralde, Carlos J. Perfumo, María A. Quiroga, Gerardo A. Leotta CHROMagar KPC. Comparison with the method proposed by the Centers for Disease Control and Prevention (CDC, USA) for rectal screening and evaluation of false positive results Laura Errecalde, Sandra Cogut, Mariana Erbin, Liliana Jordá Vargas, Eugenia Cattani, Tamara Posse, Silvia Tutzer, Ricardo Hermes, Sara Kaufman * Two cases of urinary tract infection caused by Shiga toxin-producing Escherichia coli O157:H7 strains María del P. Gadea, Natalia Deza, María I. Mota, Carolina Carbonari, Mitila Robatto, Beatriz D’Astek, Victoria Balseiro, Cristina Bazet, Eduardo Rügnitz, Valérie Livrelli, Felipe Schelotto, Marta Rivas, Gustavo Varela Contribution of the PCR assay to the diagnosis of Mansonella ozzardi in endemic areas of Argentina María F. Degese, Marta G. Cabrera, Silvio J. Krivokapich, Lucía Irazu, Marcelo A. Rodríguez, Eduardo A. Guarnera FOOD MICROBIOLOGY Carriage and characterization of Staphylococcus aureus in food handlers Graciela B. Jordá, Raúl S. Marucci, Adriana M. Guida, Patricia S. Pires, Eduardo A. Manfredi

101

INDUSTRIAL AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY *Grape stalks as substrate for white rot fungi, lignocellulolytic enzyme production and dye decolorization 105 Laura Levin, Luis Diorio, Emmanuel Grassi, Flavia Forchiassin *Biodegradation of phenol in static cultures by Penicillium chrysogenum ERK1: catalytic abilities and residual phytotoxicity Erika A. Wolski, Viviana Barrera, Claudia Castellari, Jorge F. González 113 SPECIAL ARTICLE *Bioprospection of marine microorganisms: potencial and challenges for Argentina Hebe M. Dionisi, Mariana Lozada, Nelda L. Olivera MICROBIOLOGICAL IMAGES Endosymbiosis of Arcobacter butzleri in Acanthamoeba castellanii Heriberto Fernández, María Paz Villanueva, Gustavo Medina Kerion celsi Mónica S. Saiz, Lorena P. Uribe, Andrés Gallardo Martínez Instructions to authors Manuscript preparation checklist * In English

122

133 134 135

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 63-64 EDITORIAL

ISSN 0325-7541

63 Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 63-64

Each of us have things and thoughts and descriptions of an amazing universe in our possession that kings in the 17th century would have gone to war to possess.

KARY MULLIS

(Premio Nobel de Química 1993)

La “nano”, el “Mano” y la microbiología clínica The nanotech, the “Mano” and the clinical microbiology

No hay duda de que las ciencias biológicas han logrado importantes avances durante el siglo pasado, a partir del desarrollo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Esta reacción, desarrollada conceptualmente en los años setenta, vio la luz a mediados de los ochenta y está basada en el genial concepto introducido por Kary Mullis, un bioquímico estadounidense que obtuvo en 1993 el Premio Nobel de Química a consecuencia de su invento (2). La reacción de amplificación de secuencias de ácidos nucleicos permitió clonar fácilmente cualquier gen, como paso ineludible para su posterior estudio, y es, sin duda, una de las bases sobre las que se han apoyado las tecnologías desarrolladas consecutivamente; entre ellas la secuenciación de ácidos nucleicos, los micro y macroarreglos y la PCR en tiempo real. Básicamente, la PCR es una reacción de replicación de ácido desoxirribonucleico (ADN) a escala “mega”, que se lleva a cabo in vitro en presencia de una ADN-polimerasa termoestable, una cantidad diminuta de ácido nucleico que sirve como molde para la replicación, los cuatro nucleótidos trifosfatos requeridos como sustratos de la polimerasa, ciertas soluciones tampón y dos oligonucleótidos cebadores –uno para cada hebra de ADN– que, al hibridizar con las secuencias que se van a amplificar, ofrecen un punto de partida para la polimerización (3). Así, miles de millones de copias de una secuencia específica se producen en un par de horas, con solo unos 30 ciclos de reacción de PCR. Esta tecnología no solo catapultó a Mullis al premio Nobel, sino que abrió incontables e inesperadas puertas a la investigación, aun en aspectos no directamente relacionados con la biología. En efecto, el desarrollo de la técnica de PCR produjo una revolución en los procesos de electrónica y física aplicada, y llevó a mejoras de diseño y funcionamiento en los aparatos utilizados para la reacción, llamados termocicladores. A su vez, los avances en el clonado de genes y en la producción de proteínas recombinantes causaron un efecto dominó en áreas como la secuenciación de ácidos nucleicos y el análisis de mezclas complejas de proteínas. Una última evolución conceptual ha sido el desarrollo de la PCR en tiempo real, en la cual el uso de marcadores fluorescentes específicos adicionados a los oligonucleótidos permite seguir la cantidad de ADN amplificado y, por lo tanto, su cuantificación directa a través de un sistema de censado óptico. El progreso en los procesos de miniaturización ha llevado a la generación de herramientas micrométricas, diseñadas para ejecutar una variedad de ensayos. Estas herramientas integran todas las etapas del ensayo en un único pequeño instrumento, concepto conocido como “laboratorio en un chip” (1). Esta sucesión de cambios comandó la evolución de la física aplicada a la biología y generó nuevos modelos de trabajo, entre los cuales se destaca con enorme potencialidad el uso de la escala “nano”, es decir, aquella que utiliza componentes cuyo tamaño es de una milmillonésima parte del tamaño “normal” (10-9 m), en el intervalo de 1 a 100 nm. El trabajo académico e industrial en este área es intenso y está dirigido al empleo de las nanotecnologías en el diagnóstico por imágenes, el diagnóstico y el seguimiento de patologías y la determinación de biomarcadores, entre otras muchas aplicaciones que nos sorprenden todos los días desde las revistas especializadas. En el caso de la microbiología clínica, las consecuencias de estas nanotecnologías son tan asombrosas como fue en su momento la irrupción de la PCR y el desarrollo de microtécnicas basadas en microlitros de materiales, de muestras o de reactivos. En efecto, la nanofluídica (manipulación de líquidos y soluciones a escala nano de volumen) se rige por leyes físicas que se alejan de las imperantes en la escala macro. Algunas de estas divergencias explican la reducción de la viscosidad y permiten generar dispositivos de escala muy pequeña, en los cuales se puede manejar el régimen de flujo y la velocidad de encuentro de los distintos reactivos y analitos de una muestra biológica. A su vez, esto se traduce en una mayor especificidad y sensibilidad de las técnicas.

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 63-64

Los nuevos aprovechamientos de materiales como siliconas, plásticos e incluso papel, usados como soportes de estos dispositivos, junto con la posibilidad de recurrir a manipulaciones genéticas para producir reactivos (proteínas inmunogénicas, anticuerpos recombinantes, etc.), han desembocado en una posibilidad que se va tornando cada vez más en una realidad concreta: el desarrollo de materiales de diagnóstico de enfermedades infecciosas al lado del paciente. La evaluación in situ de la presencia de un agente infeccioso se realiza con muestras de volumen mínimo, equipamientos muy simples, de bajo costo, y dispositivos descartables. Aunado al escaso consumo de reactivos y al abaratamiento de costos al llegar a etapas de producción masiva, este tipo de elementos o equipos, que pueden ser utilizados en lo que se denomina tecnología diagnóstica Point-of-Care (POC), parecen ser una panacea para los países de bajos recursos o con zonas geográficas de difícil acceso, donde el paciente está lejos de los centros de mediana complejidad. Algunos ejemplos de estas nuevas tecnologías los constituyen los microchips para inmunoensayos, para citometría de flujo y, sorprendentemente, para el diagnóstico de resistencia a antibióticos en muestras biológicas, los que utilizan células bacterianas individuales. En nuestro país, investigadores de la Universidad Nacional de San Martín, conjuntamente con grupos del Instituto Nacional de Tecnología Industrial (INTI), han desarrollado sistemas portátiles para el diagnóstico de enfermedades animales y humanas. Hasta el momento se han producido prototipos que permiten detectar anticuerpos específicos contra la brucelosis y la fiebre aftosa en el ganado, y contra la enfermedad de Chagas y el síndrome urémico hemolítico en humanos (para mayor detalle, visitar la página web http://www.inti.gob.ar/ sabercomo/sc107/inti3.php). Tiempo atrás, una icónica historieta argentina, “El Eternauta”, mostraba a un personaje extraterrestre con manos que tenían más de los cinco dedos humanos naturales. Este personaje, el “Mano”, era capaz de operar a enorme velocidad equipos con paneles plagados de botones y controles, gracias a sus dedos extras. Cuarenta años más tarde, no nos sorprendemos de ver a nuestros jóvenes manejando sus teclados de tecnología celular a gran velocidad en cualquier situación de la vida cotidiana. Parece acertado asumir que en un futuro cercano, la microbiología clínica estará tan impactada y modificada por las nanotecnologías como en su momento lo estuvo por la PCR, el Western blot o las hibridizaciones de ácidos nucleicos. Por lo tanto, sería prudente comenzar a introducir en el dictado de los cursos de microbiología los conceptos teóricos de las nuevas nanotecnologías, a fin de despertar el interés de los profesionales jóvenes y de los alumnos de las carreras con incumbencia en salud. De esa manera, se ayudaría a que los profesionales que en un futuro asistan al cambio de tecnologías puedan hacerlo desde una posición que no solo les permita comprenderlas como usuarios, sino también perfeccionarlas, participando de los desarrollos tecnológicos correspondientes.

HÉCTOR R. MORBIDONI Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología Facultad de Ciencias Médicas Universidad Nacional de Rosario, Argentina E-mail: morbiatny@yahoo.com

ANA M. JAR Cátedra de Inmunología Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad de Buenos Aires, Argentina E-mail: amjar@fvet.uba.ar

1- Figeys D, Pinto D. Lab-on-a-chip: a revolution in biological and medical sciences. Anal Chem 2000; 72: 330A-5A. 2- Mullis KB, Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol 1987; 155: 335-50. 3- Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 1988; 239: 487-91. doi:10.1126/science.2448875.

ISSN 0325-7541

ompA gene BREVE of C. pecorum in captive birds INFORME

65 Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 65-68

Detection of the ompA gene of Chlamydophila pecorum in captive birds in Argentina MARÍA C. FRUTOS 1*, FERNANDO VENEZUELA 1, XIMENA KIGUEN 1, VIVIANA RÉ 1, CECILIA CUFFINI 1 1

Instituto de Virología “Dr. J. M. Vanella”, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Córdoba. Enfermera Gordillo Gómez s/n Ciudad Universitaria (5016) Córdoba, Argentina. *Correspondence. E-mail: mariaceliafrutos@gmail.com

ABSTRACT Bacteria belonging to the family Chlamydiaceae cause a broad spectrum of diseases in a wide range of hosts, including humans, other mammals and birds. However, very little is known about chlamydial infections in birds in our region. In the present study, we examined 28 clinically normal birds in illegal captivity that were confiscated in the province of Córdoba, Argentina. The objective was to detect Chlamydophila spp. in cloacal swabs by genetic analysis of the ompA gene. Nested-PCR of the ompA gene identified five samples as Chlamydophila pecorum and the sequence analysis demonstrated the presence of the ompA gene of C. pecorum in these birds. On the other hand, Chlamydophila psittaci was not detected. These birds could be either asymptomatic reservoirs or subclinical carriers of C. pecorum. This is the first report of the detection of C. pecorum in Argentina. Key words: Chlamydophila pecorum, birds in captivity, ompA gene, sequence analysis

RESUMEN Detección del gen ompA de Chlamydophila pecorum en aves en cautiverio, en la Argentina. Las bacterias que pertenecen a la familia Chlamydiaceae causan un extenso espectro de enfermedades en una amplia gama de huéspedes, incluidos los seres humanos, otros mamíferos y aves. Sin embargo, se sabe muy poco acerca de las infecciones por clamidias en aves de nuestra región. Esta investigación examinó 28 aves clínicamente normales mantenidas en cautiverio ilegal, que fueron confiscadas en Córdoba, Argentina. El objetivo fue detectar Chlamydophila spp. en hisopados cloacales por análisis del gen ompA. La PCR anidada del gen ompA reveló la presencia de Chlamydophila pecorum en cinco muestras. El análisis de secuencias demostró la presencia del gen ompA de C. pecorum en estas aves. Por el contrario, Chlamydophila psittaci no se detectó. Estas aves pueden ser reservorios asintomáticos o portadores subclínicos de C. pecorum. Este es el primer informe de la detección de C. pecorum en la Argentina. Palabras clave: Chlamydophila pecorum, aves en cautiverio, gen ompA, análisis de secuencias

Chlamydophila psittaci, the causing agent of avian chlamydiosis, occurs worldwide and has been detected in a wide variety of both wild and domestic birds. However, other clamydiae also have a zoonotic potential (3). Chlamydophila pecorum strains have been isolated from ruminants, swine and koalas in several countries. C. pecorum is associated with conjunctivitis, encephalomyelitis, enteritis, pneumonia, polyarthritis, abortion, and reproductive and urinary tract diseases (1, 3, 8). In an assay carried out in free healthy pigeons in Japan, three fecal samples were found to be C. pecorum-positive by PCR (7). The epidemiology of Chlamydia infection in animals in Argentina is unknown. Thus, the aim of the present study was to detect Chlamydia spp. in illegally captive birds in Córdoba city, Argentina.

Cloacal swabs were collected from 28 birds living in illegal captivity without any clinical signs or evidence of chlamydiosis and were referred to the Instituto de Virología, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. According to provincial law N.º 1751, which prohibits catching and commercialization, these birds were considered illegal possessions. Therefore, they were confiscated by the Secretaría Provincial del Medio Ambiente in September 2010. The cotton swabs were placed in 1 ml of sucrose-phosphate-glutamate, and 200 µl were subjected to DNA extraction using the Accuprep Genomic DNA Extraction Kit (BIONEER, Alameda, CA, USA) according to the manufacturer’s instructions. DNA extract (5 µl) was used to amplify a 576-bp fragment of the variable domains II, III and IV of the

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 65-68

ompA gene of Chlamydophila, using primers 191CHOMP (GCI YTI TGG GAR TGY GGI TGY GCI AC) and CHOMP 371 (TTA GAA ICK GAA TTG IGC RTT IAY GTG IGC IGC), as described by Kaltenböck et al. (2) and modified by Sachse and Hotzel (5). Five samples were positive by PCR. Nested-PCR using primers 218PSITT (GTA ATT TCI AGC CCA GCA CAA TTY GTG)/CHOMP 336 (CCR CAA GMT TTT CTR GAY TTC AWY TTG TTR AT) showed that none of the samples was positive for C. psittaci (389 bp) and that five (17.85 %) were positive for C. pecorum (441 bp) with primers 204 PECOR (CCA ATA YGC ACA ATC KAA ACC TCG C)/CHOMP 336(CCR CAA GMT TTT CTR GAY TTC AWY TTG TTR AT). The latter were confirmed by sequencing. For sequence analysis, the nested-PCR products were purified with the QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) and subjected to direct nucleotide sequencing reaction in both directions using an ABI automatic sequencer. The ompA sequences obtained were submitted to GenBank and relatedness

of newly characterized sequences was assessed by analysis with 2.2.19 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). Phylogenetic analyses were constructed with Mega software version 4, using the NeighborJoining method and their reliability was assessed by bootstrap (2,000 replicates) (6). Nine reference sequences of the ompA region of the C. pecorum genome (403 bp) were included in this analysis. The corresponding accession numbers, country of origin, host and clinical condition of these isolates are shown in Table I. The tree was rooted with the ompA sequence of the Chlamydophila abortus strain (accession number CR848038.1). The phylogenetic analysis showed that the five sequences clustered with C. pecorum. The ompA sequence of the C. pecorum strains was highly homologous and shared more than 98 % similarity with each other. Blast searches revealed that all novel ompA gene sequences shared high homology with the ompA from the iC2, iC3, iC4, 3638/ 3 and 4283/3 strains.

Table 1. Characteristics of C. pecorum isolates analyzed or used as reference strains Host

Clinical condition

Country origin

Reference

GenBank accesion

Sus scrofa (Wild Boar)

polyarthritis

Austria

Kaltenboeck et al. (1993)

M73039

Capra hircus (Goat)

unknown

New Zeland

O’Keefe et al. (2001)

AY055109

B13

Bos Taurus (Cow)

posthitis

Germany

Wittenbrink et al. (1990)

EU350136

C. pecorum L71 CapraNZ

Bahr14

Bos Taurus (Cow)

pneumonia

Germany

Wittenbrink Unpublished data.

EU350137

1710S

Sus scrofa (Goat)

abortion

Austria

Kaltenboeck et al. (1993)

M73033

iB1

Ovis aries (Lamb)

no clinical signs

France

Rodolakis et al. (1989)

EU684924

Capra hircus (Goat)

no clinical signs

France

Rodolakis et al. (1989)

EU684931

824

Ovis aries (Lamb)

conjunctivitis

Scotland

McClenaghan et al. (1984)

EU684922

E58

Bos Taurus (Cow)

encephalomyelitis

USA

McNutt and Waller (1940)

EU837071

3638/3

unplished

unknown

France

Yousef Mohamad (2009)

GQ228186

4283/3

upplished Cyanocompsa brissonii

unknown

France

Yousef Mohamad (2009)

GQ228187

ARG AMB P2

(Ultramarine Grosbeak)(1) Paroaria coronata

no clinical signs

Argentina

this paper

JN16880

ARG AMB P6

(Red-crested Cardinal) (1) Piranga flava

no clinical signs

Argentina

this paper

JN16881

ARG AMB P7

(Hepatic Tanager) (1) Gubernatrix cristata

no clinical signs

Argentina

this paper

JN16882

ARG AMB P9

(Yellow Cardinal) (1) Sicalis luteola

no clinical signs

Argentina

this paper

JN16883

ARG AMB P10

(Grassland Yellow – finch) (1)

no clinical signs

Argentina

this paper

JN16884

iC2, iC3, iC4

(1)

Narosky and Yzurieta, 2007.

ompA gene of C. pecorum in captive birds

All local strains were characterized by a thymine at position 132, resulting in Asn instead of Lys in the VD IV of the ompA gene (Figure 1). The discrepancy found in this position could be defined as a marker of local strains (Figure 1). In 98 % of the cases, the bootstrap values in the ompA phylogenetic tree supported the conclusion that all local strains belong to the same group (Figure 2). This chlamydia has generally been associated with the detection in ruminants (10). However, Tanaka et al. detected this chlamydia in birds similar to those

studied here. Nevertheless, the homology with these sequences could not be assessed because they are not available at GenBank. C. pecorum infection did not appear to be associated with any clinical signs of these birds. Thus, these birds could be either asymptomatic reservoirs or subclinical carriers of C. pecorum. The epidemiological significance of C. pecorum infection is not clear to us at this stage. Further studies are needed to estimate the zoonotic role of this pathogen.

Figure 1. Comparison of MOMP VD IV sequences. Dots represent residues that are identical to those in iC2, iC3, iC4, 3638/3, and 4283/3 MOMP. The first and the last residues in the IV domain are given as its position in the complete alignment.

C. abortus S26/3

Figure 2. Phylogenetic three analysis of the ompA region of the C. pecorum genome (403 bp) of the Argentinean isolates and C. abortus as rooted. Strains belonging to this study are initiated by ARG and marked with asterisks. The bootstrap (> 50 %) is indicated in the branch nodes.

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 65-68

Competing interests The authors declare that they have no competing interests. Acknowledgements: this work was partially supported by SECyT-UNC 05/H181, Mincyt-Cba 1427/09, Mincyt-Pid 113/11. This short communication has been prepared in the context of the collaboration promoted by the Provincial Secretariat for Environmental Protection and Sustainable Development, Córdoba, Argentina.

REFERENCES 1. Jackson M, White N, Giffard P, Timms P. Epizootiology of Chlamydia infections in two free-range koala populations. Vet Microbiol 1999; 65: 255-64. 2. Kaltenböeck B, Schmeer N, Schneider R. Evidence for numerous omp1 alleles of porcine Chlamydia trachomatis and novel chlamydial species obtained by PCR. J Clin Microbiol 1997; 35: 1835-41.

3. Longbottom D, Coulter L. Animal chlamydiosis and zoonotic implications. J Comp Pathol 2003; 128: 217-44. 4. Narosky T, Yzurieta D. Fam. Emberizidae. In: Vázquez Mazzini, editores. Guía para la identificación de aves de Argentina y de Uruguay, 15a edición. Buenos Aires, Argentina, Vázquez Mazzini, 2007, p. 265-75. 5. Sachse K, Hotzel H. Detection and differentiation of Chlamydiae by nested-PCR. Methods Mol Biol 2002; 216: 123-36. 6. Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. MEGA4: Molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Mol Biol Evol 2007; 24: 1596-9. 7. Tanaka C, Miyazawa T, Watarai M, Ishiguro N. Bacteriological survey of feces from feral pigeons in Japan, J Vet Med Sci 2005; 67: 951-3. 8. Yousef Mohamad K, Rodolakis A. Recent advances in the understanding of Chlamydophila pecorum infections, sixteen years after it was named as the fourth species of the Chlamydiaceae family. Vet Res 2010; 41: 27-37.

Recibido:30/8/2011- Aceptado: 4/5/2012

ISSN 0325-7541

Salmonella INFORME Infantis BREVEhipoinvasiva y persistente

69 Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 69-74

Dos aislamientos de Salmonella Infantis multirresistentes se comportan como hipoinvasivos pero con elevada proliferación intracelular JOSÉ A. DI CONZA 1,2*, MARTA E. MOLLERACH1, GABRIEL O. GUTKIND1, JUAN A. AYALA3 1

Facultad de Farmacia y Bioquímica - Universidad de Buenos Aires, Junín 956 (1113) Ciudad Autónoma de Buenos Aires; 2 Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas - Universidad Nacional del Litoral, Paraje el Pozo (3000) Santa Fe, Argentina; 3 Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa”. Consejo Superior de Investigaciones Científicas, (28049) Madrid, España. *Correspondencia. E-mail: jdiconza@fbcb.unl.edu.ar

RESUMEN En este trabajo se investigó la presencia de determinantes característicos de plásmidos de virulencia en dos aislamientos clínicos de Salmonella Infantis portadores de plásmidos de multirresistencia. Además, se estudió la capacidad de invasión y proliferación en células eucariotas no fagocíticas. Ninguno de los aislamientos de S. Infantis mostró los determinantes genéticos que caracterizan a los plásmidos de virulencia para este género (operón spv). Los ensayos de invasión sobre líneas celulares eucariotas mostraron que los aislamientos de S. Infantis presentan una capacidad de invasión disminuida pero persisten y proliferan en el citoplasma, independientemente de utilizar una línea celular permisiva (HeLa) o no permisiva (NRK) para tal fin. Finalmente, no se observaron indicios microscópicos que podrían hacer sospechar un efecto bactericida de estas líneas celulares sobre los aislamientos estudiados. Palabras clave: Salmonella Infantis, multirresistencia, capacidad de invasión, proliferación intracelular

ABSTRACT Two multidrug-resistant Salmonella Infantis isolates behave like hypo-invasive strains but have high intracellular proliferation. In this work, plasmid-encoded virulence factors in two Salmonella Infantis isolates carrying multiresistance plasmids were investigated. In addition, their invasion and proliferative ability in non-phagocytic cells was studied. None of them showed the typical determinants of virulence plasmids (spv operon). The invasion assays of S. Infantis isolates on eukaryotic cells showed a decreased ability to invade but they remained and proliferated in the cytoplasm regardless of having used a permissive (HeLa) or non-permissive (NRK) cell line. Finally, there was no microscopic evidence suggesting a bactericidal effect of these eukaryotic cell lines on the isolates tested. Key words: Salmonella Infantis, multiresistance, invasion ability, intracellular proliferation

Las especies de Salmonella son patógenos intracelulares facultativos y generalmente colonizan mamíferos, aves y reptiles. En la mayoría de las infecciones producidas en humanos, se desarrolla una gastroenteritis autolimitada que cursa con multiplicación bacteriana dentro de la submucosa intestinal y diarrea (9, 10). En algunos casos, la invasión del microorganismo puede causar septicemia; el patógeno puede persistir en sangre y provocar infecciones crónicas (10). Algunos genes que codifican los factores de virulencia residen dentro de grandes plásmidos de virulencia. Estos plásmidos se han encontrado solo en unas pocas serovariedades de Salmonella enterica: Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Salmonella Dublin y Salmonella Choleraesuis (2).

Hasta el momento, no ha habido comunicación de estos plásmidos en Salmonella Infantis. Se cree que la presencia de estos plásmidos es necesaria durante la fase sistémica de la enfermedad causada por Salmonella spp. no tifoideas. Los plásmidos de virulencia contienen una región altamente conservada de 7,8 kb denominada spv (Salmonella plasmid virulence). El operón spv está formado por cinco genes designados spvRABCD. A su vez, se han caracterizado dos replicones independientes, repB y repC. Ambos son funcionales y pueden coexistir o estar presentes en forma independiente (14, 15). El efecto de los plásmidos de virulencia en la proliferación de Salmonella en macrófagos es controvertido (11, 15). Existen evidencias de que los

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 69-74

genes spv capacitan a la cepa para infectar bazo e hígado, por aumento en la replicación bacteriana dentro de la célula del hospedador. Cuando S. enterica infecta otros sitios diferentes del intestino y causa una enfermedad sistémica, se requiere una terapia rápida y adecuada. El cuadro se complica aún más si la cepa aislada es resistente a múltiples drogas. Desde un principio se ha pensado que estos plásmidos de virulencia están poco relacionados con la resistencia a los antibióticos, pero en la actualidad existen informes sobre la presencia de grandes plásmidos híbridos de virulencia/resistencia (2, 3) en las serovariedades Typhimurium y Choleraesuis, y se postula que estos surgieron como resultado de eventos de recombinación entre diferentes plásmidos (12, 14). Poco se sabe sobre la presencia simultánea de determinantes de virulencia en plásmidos de resistencia en otras serovariedades. El objetivo de este trabajo fue investigar la presencia de determinantes característicos de plásmidos de virulencia en dos aislamientos clínicos de Salmonella Infantis multirresistentes, y comparar el comportamiento de invasión y proliferación intracelular de dichos aislamientos en distintas líneas de células eucariotas. Los dos aislamientos clínicos de Salmonella enterica serovar Infantis fueron recuperados de pacientes pediátricos internados en el Hospital de Niños “Ricardo Gutiérrez” de la ciudad de Santa Fe, en los años 1996 y

1997. Estos aislamientos (denominados S07 y S21) presentan, al menos, un plásmido conjugativo que codifica múltiples mecanismos de resistencia. El perfil de resistencia a los antibióticos y los determinantes genéticos asociados se resumen en la Tabla 1 (5, 6). Para identificar plásmidos de virulencia, se investigó por PCR e hibridación sobre colonias la presencia del gen de virulencia plasmídico spvC (por ser el más conservado entre las distintas serovariedades dentro de la región spv) y de los replicones característicos repB y repC. Las condiciones de PCR, los cebadores empleados y el tamaño de los fragmentos esperados fueron los descritos por Chu et al. (4). Como control de amplificación e hibridación se utilizó la cepa S. Typhimurium OU5045, cepa de laboratorio C5, cedida gentilmente por el grupo de trabajo responsable de la publicación recién citada. Además de los aislamientos clínicos de Salmonella S07 y S21, se incluyó también la cepa de S. Typhimurium SL1344, portadora del plásmido de virulencia; esta cepa fue utilizada como referente para los ensayos de invasión y proliferación bacteriana en células eucariotas (7, 13). Los aislamientos de S. Infantis S07 y S21 no presentaron ninguno de los marcadores genéticos evaluados, lo cual indica que estas cepas no portarían un plásmido de virulencia característico. Estos resultados concuerdan con los publicados por otros autores (2,

TABLA 1. Patrón de resistencia y determinantes genéticos asociados en los aislamientos clínicos de Salmonella Infantis S07 y S21 Cepas Espécimen clínico Perfil de resistencia(1) BLEE(2) blaTEM-1(3) blaOXA-2(4) blaCTX-M-2(5) aac(6´)-Ib (6) sul1(7) intI1(8) ISCR1(9) Tamaño plásmido

S07

S21

Material fecal

Sangre

AMP, PIP, CEF, GEN, KAN, TOB, NET, NIT, SUL

AMP, PIP, CEF, CXM, CTX, CAZ, FEP, AZM, GEN, KAN, TOB, NET, NIT, SUL (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) 73 kb

(-) (+) (+) (-) (+) (+) (+) (-) >55 kb

(+) presente, (-) ausente; (1)AMP: ampicilina, PIP: piperacilina, CEF: cefalotina, CXM: cefuroxima, CTX: cefotaxima, CAZ: ceftacidima, FEP: cefepima, AZM: aztreonam, GEN: gentamicina, KAN: kanamicina, TOB: tobramicina, NET: netilmicina, NIT: nitrofurantoína, SUL: sulfonamida; (2)detección fenotípica de ß-lactamasa de espectro extendido (BLEE); (3)gen que codifica la ß-lactamasa de espectro ampliado TEM-1; (4)gen que codifica la ß-lactamasa OXA-2; (5) gen que codifica la BLEE CTX-M-2; (6)gen que codifica una 6´-N-acetiltransferasa que confiere resistencia a aminoglucósidos; (7)gen que confiere resistencia a sulfonamidas; (8)gen que codifica la integrasa IntI1 característica de los integrones de resistencia clase 1; (9)secuencia de inserción ISCR1 que forma parte de integrones clase 1 inusuales o complejos.

Salmonella Infantis hipoinvasiva y persistente

15), quienes destacan que estos plásmidos, al parecer específicos de serovariedad, se encuentran con mayor frecuencia en las serovariedades Typhimurium, Choleraesuis y Enteritidis, y hasta el presente, no se describió ningún caso en la serovariedad Infantis. La cepa de referencia S. Typhimurium SL1344 mostró la presencia del gen spvC y solo uno de los replicones, repB. Si bien los aislamientos de S. Infantis estudiados no presentan el gen spvC, no puede descartarse la presencia de otros genes del operón spv o de marcadores de virulencia no conocidos en el plásmido de resistencia. Posteriormente, se efectuaron estudios in vitro de invasión y proliferación intracelular con los aislamientos S21 y S07 en cultivos de células eucariotas no fagocíticas (línea epitelial HeLa, ATCC CCL2, y fibroblastos NRK, ATCC CRL1570). Los ensayos de infección bacteriana de células eucariotas se realizaron aplicando algunas modificaciones a la metodología utilizada por MartinezMoya et al. (13). Brevemente, las monocapas de células eucariotas se obtuvieron en una placa de 24 pocillos, a una densidad entre 5 y 8 x 104 células/pocillo. Antes de proceder a la infección, estas células se lavaron con buffer fosfato salino (PBS) pH = 7,4 y se añadió medio fresco MEM o DMEM, más 10 % de suero fetal bovino (Gibco) (SFB). Luego se añadió un volumen conocido de bacterias (crecidas en medio LB durante 14 a 16 h, a 37 ºC y sin agitación), a razón de 10 bacterias/células, aproximadamente, y se incubó a 37 ºC en atmósfera de CO2 al 5 % durante 30 minutos. Las células infectadas se lavaron con PBS (3 veces) y se incubaron durante 2 h en MEM o DMEM con 10 % de SFB, el cual contenía 300 mg/ml de amicacina (Sigma Ch. Co., EE.UU.). Este antibiótico mata a las bacterias extracelulares sin afectar la viabilidad de las bacterias intracelulares, ya que no penetra la membrana citoplasmática eucariota. A las 2 h posinfección, las células se lavaron con PBS (3 veces) y se añadió MEM o DMEM con 10 % de SFB adicionado con 200 mg/ml de amicacina. Se incubó en las mismas condiciones hasta cumplir las 24 h de infección. Para determinar el número de bacterias viables intracelulares a las 2 y a las 24 h de infección, las células contenidas en 2 pocillos diferentes se lavaron 3 veces con PBS, se añadió Triton X-100 1 % (100 ml) y se incubó 5 minutos a 37 ºC. Tras añadir 400 ml de PBS y agitar, se realizaron diluciones seriadas en PBS para su posterior recuento en placas de LB. Los resultados de estos ensayos fueron comparados con los obtenidos con cepas de referencia: S. Typhimurium SL1344, portadora de plásmido de virulencia, y la cepa isogénica curada de

plásmido SV4277 (gentileza del Dr. David Cano, Sevilla, España). Además, se incluyó a la cepa SV21 obtenida mediante transformación de la cepa SV4277 con el plásmido de multirresistencia de S21 (5). Se realizaron entre 3 y 5 ensayos de infección por cepa bacteriana. La capacidad de invasión (Cinv) se calculó dividiendo el número de bacterias intracelulares viables a las 2 h posinfección por el número de bacterias extracelulares añadidas para infectar, y el índice de proliferación (Ipro) se calculó dividiendo el número de bacterias viables intracelulares a largo tiempo (24 h) por el número de bacterias viables intracelulares obtenido a las 2 h. Los resultados se trataron estadísticamente efectuando el análisis de la varianza de un factor fijo (ANOVA) y realizando el test a posteriori (test de Dunnett) con el programa “GraphPad InStat tm” v2.02. Sobre las células HeLa, la cepa virulenta SL1344 presentó una Cinv de 0,15 y el número de bacterias viables intracelulares (Ipro) aumentó 4,8 veces a las 24 h de infección. La cepa isogénica SV4277 mostró resultados similares. Sin embargo, los aislamientos clínicos S07 y S21 mostraron una Cinv al menos 5 veces menor, y el Ipro fue hasta 10 veces mayor que en las cepas controles (Tabla 2). Resultados similares se observaron con la cepa SV21. El análisis de la varianza reveló que existen diferencias significativas en la capacidad de invasión (p < 0,0001) y en el índice de proliferación (p = 0,0361) entre los distintos grupos bacterianos. Al realizar el test a posteriori, se observaron diferencias significativas en cada una de las cepas con plásmidos de multirresistencia frente a ambos controles, tanto en la capacidad de invasión (p < 0,01), como en la de proliferación intracelular (p < 0,05). El notorio aumento en el Ipro de las cepas clínicas en células HeLa motivó el estudio de infección sobre la línea celular NRK, considerada como no permisiva para la proliferación intracelular de la cepa SL1344 (13). Los resultados del ensayo corroboraron la falta de proliferación de la cepa SL1344 en esta línea celular. La variante SV4277 presenta un Ipro < 1, lo que estaría indicando no solo la falta de proliferación, sino también la menor persistencia intracelular. Pese a esto, los aislamientos S07 y S21 mostraron una Cinv menor (igual que lo observado en células HeLa) y un Ipro entre 20-50 veces mayor que la cepa SL1344 (Tabla 2). El análisis de la varianza de un factor fijo para ambos parámetros mostró que existen diferencias altamente significativas (p < 0,0001) entre los distintos grupos bacterianos. Al realizar el test a posteriori, se observaron diferencias altamente significativas (p < 0,01) de los

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 69-74

TABLA 2. Capacidad de invasión e índice de proliferación obtenidos en las líneas HeLa y NRK Células HeLa

Células NRK

Cepas

Capacidad de invasión (%)(1)

Índice de proliferación (1)

Capacidad de invasión (%) (1)

Índice de proliferación (1)

SL1344 SV4277 S07 S21 SV21

0,145 0,177 0,027 0,026 0,031

4,80 3,25 43,63 40,38 36,31

0,299 ± 0,240 ± 0,079 ± 0,081 ± 0,061 ±

1,26 ± 0,39 0,60 ± 0,17 48,59 ± 2,73 21,76 ± 2,98 32,84 ± 5,99

± ± ± ± ±

0,023 0,031 0,012 0,006 0,013

± 0,68 ± 0,78 ± 26,58 ± 32,54 ± 20,37

0,063 0,075 0,016 0,005 0,019

(1) Los resultados se expresan como la media aritmética dentro de un intervalo dado por la desviación estándar (X ± SD).

aislamientos clínicos frente a los controles en ambas determinaciones. Carlson et al. (1) clasifican a las cepas como hipoinvasivas si existe una reducción de la invasión relativa de al menos un 50 % respecto de lo observado con las cepas controles. Si respetamos este criterio, se puede considerar a los aislamientos clínicos analizados como hipoinvasivos, independientemente de la línea celular empleada. Esta característica ya ha sido descrita en algunos aislamientos clínicos multirresistentes de S. Typhimurium DT104 (y otros fagotipos) estudiados sobre la línea celular Hep-2. Los estudios de virulencia sobre modelos murinos mostraron que las cepas hipoinvasivas presentan una leve disminución en la capacidad de causar letalidad (1). Por otro lado, en este trabajo se advirtió un aumento de la proliferación intracelular de los aislamientos de Salmonella Infantis, inclusive en la línea eucariota previamente descrita como no permisiva para tal fin. In vitro se ha observado que las células epiteliales, a diferencia de determinadas líneas de fibroblastos, han resultado ser más permisivas para el crecimiento intracelular bacteriano. Hay evidencias que sugieren que tanto factores del huésped como del patógeno contribuyen a un ajuste fino de la tasa de crecimiento intracelular (8); de qué modo estos factores se interrelacionan para este ajuste es un tema aún poco conocido. Para profundizar sobre el comportamiento de los aislamientos internalizados en ambas líneas celulares, se analizó por microscopía de inmunofluorescencia confocal la integridad, la morfología y el número de bacterias intracelulares a las 24 h posinfección. Las bacterias se detectaron por fluorescencia mediante tinción del ADN con DAPI (que también tiñe el núcleo celular) y con anticuerpo de conejo anti-LPS específico (Difco Laboratories, EE.UU.), donde la reacción inmunológica se completa con un segundo anticuerpo

de cabra anti-IgG de conejo, marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Sigma). El ensayo fue realizado como se describió previamente (6, 13). En el interior de las células HeLa, S. Typhimurium SL1344 prolifera activamente manteniendo su morfología bacilar normal, mientras que en las células NRK no se aprecia crecimiento bacteriano y la bacteria altera su morfología de bacilar a cocoide. Estas mismas observaciones fueron señaladas por otros autores como Martínez-Moya et al. (13), al ensayar esta cepa frente a las mismas líneas celulares. Además, dichos autores han advertido, mediante microscopía electrónica de transmisión, claros signos de degradación y lisis bacteriana dentro de las células no permisivas NRK y 3T3 (efecto bactericida de las líneas celulares). Sin embargo, S. Infantis S21 se encuentra proliferando activamente tanto en el citoplasma de HeLa como de NRK (Figura 1). A su vez, las bacterias intracelulares mantienen su morfología bacilar en ambas líneas. La ausencia de estructuras filamentosas o redondeadas dentro del citoplasma celular sugiere una falta de actividad bactericida de la célula NRK sobre S21. Un paso esencial en el proceso de patogenicidad de Salmonella spp. está sujeto a la capacidad del microorganismo para inducir su absorción por las células epiteliales en el intestino. Evaluando los valores de Cinv obtenidos, los aislamientos de S. Infantis parecen menos agresivos que las cepas controles. Sin embargo, sabiendo que se requiere de la proliferación intracelular para poder manifestar la máxima capacidad de virulencia, los resultados observados en los valores de Ipro marcan la tendencia opuesta. En principio, estas características podrían estar ligadas a factores desconocidos presentes en el plásmido de multirresistencia de S21, ya que los resultados de invasión y proliferación se repitieron al realizar los ensayos de infección con la cepa transformante SV21. En la actualidad, se considera la secuenciación

Salmonella Infantis hipoinvasiva y persistente

total de este plásmido para evaluar la presencia de secuencias comunes o nuevos factores bacterianos que podrían influir en los eventos de invasión, proliferación o persistencia intracelular al infectar células eucariotas no fagocíticas.

Agradecimientos: este trabajo fue financiado con subsidios ANPCyT y UBA otorgados a GG; con proyecto BFU2009-9200 del MICINN, Gobierno de España, otorgado a JAA, y con fondos de la UNL otorgados a JDC. GG, MM y JDC son miembros de la carrera de investigador científico de CONICET.

BIBLIOGRAFÍA

Figura 1. Microscopía de inmunofluorescencia. Las flechas marcan la morfología bacilar de S. Infantis S21 en células no permisivas NRK (aumento 600X) procesadas 24 h posinfección. Imagen obtenida con: (I) contraste de fase y tinción con DAPI (marcaje de ADN tanto de las células eucariotas como de las bacterias); (II) tinción con DAPI; (III) inmunofluorescencia empleando un anticuerpo primario anti-LPS de Salmonella y un anticuerpo secundario anti-IgG de conejo marcado con FITC.

1. Carlson SA, Browning M, Ferris KE, Jones BD. Identification of diminished tissue culture invasiveness among multiple antibiotic resistant Salmonella typhimurium DT104. Microb Pathog 2000; 28: 37-44. 2. Chu C, Chiu CH. Evolution of the virulence plasmids of nontyphoid Salmonella and its association with antimicrobial resistance. Microbes Infect 2006; 8: 1931-6. 3. Chu C, Chiu CH, Wu WY, Chu CH, Liu TP, Ou JT. Large drug resistance virulence plasmids of clinical isolates of Salmonella enterica serovar Choleraesuis. Antimicrob Agents Chemother 2001; 45: 2299-303. 4. Chu C, Hong S, Tsai C, Lin W, liu T, Ou JT. Comparative physical and genetic maps of the virulence plasmids of Salmonella enterica serovars Typhimurium, Enteritidis, Choleraesuis, and Dublin. Infect Immun 1999; 67: 2611-4. 5. Di Conza J, Ayala J, Power P, Mollerach M, Gutkind G. Novel class 1 integron (InS21) carrying the bla CTX-M-2 gene in Salmonella enterica serovar Infantis. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46: 2257-61. 6. Di Conza JA. Caracterización de β-lactamasas asociadas a integrón de clase 1 y evaluación de factores de virulencia en plásmidos de salmonelas. Tesis Doctoral 2004. Universidad de Buenos Aires. 7. García del Portillo F, Jungnitz H, Rohde M, Guzmán CA. Interaction of Salmonella enterica serotype Typhimurium with dendritic cells is defined by targeting to compartments lacking lysosomal membrane glycoproteins. Infect Immun 2000; 68: 2985-91. 8. Garcia del Portillo F. Salmonella intracellular proliferation: where, when and how? Microbes Infect 2001; 3: 1305-11. 9. Groisman EA, Blanc-Potard AB, Uchiya K. Pathogenicity islands and the evolution of Salmonella virulence. En: Hacker JBK, editor. Pathogenicity islands and other mobile virulence elements. Washington D.C., ASM Press, 1999, p. 127-50. 10. Groisman EA, Ochman H. The Path to Salmonella. ASM News 2000; 66: 21-7. 11. Guiney DG, Fang FC, Krause M, Libby S. Plasmid-mediated virulence genes in non-typhoid Salmonella serovars. FEMS Microbiol Lett 1994; 124: 1-10.

Revista Argentina de MicrobiologĂa (2012) 44: 69-74

12. Herrero A, Mendoza MC, Threlfall EJ, Rodicio MR. Detection of Salmonella enterica serovar Typhimurium with pUOStVR2-like virulence-resistance hybrid plasmids in the United Kingdom. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2009; 28: 1087-93. 13. Martinez-Moya M, de-Pedro MA, Schwarz H, Garcia del Portillo F. Inhibition of Salmonella intracellular proliferation by non-phagocytic eucariotic cells. Res Microbiol 1998; 149: 309-18.

14. Mendoza M del C, Herrero A, Rodicio MR. Evolutionary engineering in Salmonella: emergence of hybrid virulenceresistance plasmids in non-typhoid serotypes. Enferm Infecc Microbiol Clin 2009; 27: 37-43. 15. Rotger R, CasadesĂşs J. The virulence plasmids of Salmonella. Int Microbiol 1999; 2: 177-84.

Recibido:8/11/2011- Aceptado:12/2/2012

ISSN 0325-7541

Canarypox ARTÍCULOrecombinante ORIGINAL como vacuna antirrábica

75 Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 75-84

Obtención y evaluación preliminar de un virus canarypox recombinante como candidato a vacuna antirrábica FLAVIA ZANETTI1,2*, LILIANA RUDAK3, MATÍAS MICUCCI3, DANIELA CONTE GRAND1,2, ANDREA LUQUE4, SUSANA RUSSO4, OSCAR TABOGA1,2, OSCAR PÉREZ3, GABRIELA CALAMANTE2 1 Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET); 2Instituto de Biotecnología, Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (CICVyA-INTA). Casilla de Correo 25 (1712) Castelar, Buenos Aires; 3Servicio de Vacuna Antirrábica, Instituto Nacional de Producción de Biológicos (ANLIS), “Dr. Carlos G. Malbrán”. Av. Vélez Sarsfield 563 (1282), Ciudad Autónoma de Buenos Aires; 4Departamento de Rabia y Pequeños Animales de la Dirección General de Laboratorios y Control Técnico (DILAB), Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (SENASA). Av. Fleming 1653 (1640) Martínez, Buenos Aires, Argentina. * Correspondencia. E-mail: fzanetti@cnia.inta.gov.ar

RESUMEN En la Argentina, la rabia está circunscripta a algunas provincias del norte. La disponibilidad de nuevas vacunas que eliminen la manipulación del virus rábico y que permitan el control de la enfermedad es de importancia estratégica nacional y regional. Las vacunas basadas en poxvirus recombinantes se han utilizado con éxito como vacunas antirrábicas a nivel mundial. Si bien estos sistemas no están disponibles comercialmente, la plataforma de obtención de virus canarypox (CNPV) recombinantes ya ha sido implementada en nuestro laboratorio. El objetivo de este trabajo fue obtener y evaluar un candidato a vacuna antirrábica basado en CNPV recombinantes que expresan la glicoproteína G (RG) del virus rábico (RV). Se construyó un virus recombinante que expresa la secuencia codificante de RG (CNPV-RG). La inoculación de ratones con este virus indujo altos títulos de anticuerpos seroneutralizantes de RV (3,58 y 9,76 UI/ml después de una o dos inmunizaciones, respectivamente) y protegió al 78 % de los animales desafiados intracerebralmente con RV. Además, se determinó que el CNPV-RG posee una potencia relativa de 3,5 UI/ml. Los resultados obtenidos constituyen la primera etapa en la evaluación del CNPV-RG como candidato a vacuna antirrábica. Se requerirán nuevos ensayos para confirmar su utilidad en especies de interés veterinario. Palabras clave: virus canarypox recombinante, vacuna antirrábica, glicoproteína G

ABSTRACT Development and preliminary assessment of a recombinant canarypox virus as an antirabic vaccine candidate. In Argentina, rabies is limited to some northern provinces. Availability of new vaccines abolishing the handling of the rabies virus and allowing disease control has regional and national strategic importance. Vaccines based on recombinant poxviruses have been successfully used as antirabic vaccines worldwide. Although these systems are not commercially available, the platform to obtain recombinant canarypox viruses (CNPV) has been previously set up in our laboratory. The aim of this work was the development and evaluation of an antirabic vaccine candidate based on recombinant CNPV expressing the rabies virus (RV) glycoprotein G (RG). A recombinant virus (CNPV-RG) expressing the RG coding sequence was designed. Inoculation of mice with this virus induced high RV seroneutralizing antibodies (3.58 and 9.76 IU/ml after 1 or 2 immunizations, respectively) and protected 78% of intracerebrally RV-challenged animals. In addition, it was determined that CNPV-RG has a relative potency of 3.5 IU/ml. The obtained results constituted the first stage of CNPV-RG evaluation as antirabic vaccine candidate. Further assays will be necessary to confirm its utility in species of veterinary interest. Key words: recombinant canarypox virus, rabies vaccine, glycoprotein G

INTRODUCCIÓN La rabia es una enfermedad infecto-contagiosa de evolución aguda, habitualmente mortal. Es causada por el virus rábico (RV), el cual se transmite entre algunas especies de animales de sangre caliente y el hombre. De este modo, la rabia constituye una de las principales zoonosis con distribución mundial, responsable de aproximadamente 60 000 muertes humanas por año (32, 41).

En la década del sesenta, la República Argentina presentaba una delicada situación sanitaria con al menos 12 provincias con focos activos de transmisión de rabia canina. Frente al aumento del número de casos, en 1976 se fortaleció el Programa de Control de Rabia tomando medidas de intervención basadas en la vacunación masiva de los perros (principal reservorio y vector de rabia urbana), la eliminación de los reservorios sin dueño y sin control, la vigilancia epidemiológica y la educación sanitaria de la población (21). La citada

campaña de vacunación permitió, hacia mediados de los años 90, controlar la transmisión de la rabia, al limitar su presencia a algunas provincias del norte argentino. Aunque desde entonces se registra un número reducido de casos de rabia canina, la enfermedad aún permanece presente en esa región del país debido a la existencia de especies silvestres (principalmente zorros y murciélagos hematófagos e insectívoros) que funcionan como reservorios del virus y que esporádicamente infectan al hombre, a animales domésticos y a otros de interés económico (bovinos, equinos, porcinos, ovinos y caprinos). La vacunación es el método preventivo más económico y efectivo para la profilaxis y el control de las enfermedades infecciosas. Con la vacunación se estimulan específicamente los mecanismos de defensa del organismo antes de la interacción con el patógeno, de manera que el hospedador inicie una rápida respuesta frente a la infección. En la Argentina, las vacunas antirrábicas de primera y segunda generación para uso veterinario emplean como agente inmunizante al virus inactivado luego de su amplificación en tejido nervioso de animales o en cultivos celulares, respectivamente (21). Si bien estas vacunas son efectivas, presentan ciertas desventajas relacionadas con su obtención y administración. Esto se debe a que la producción requiere la utilización y el sacrificio de un gran número de animales, o la manipulación de grandes cantidades del patógeno en plantas productoras, con estrictas condiciones de bioseguridad. Esto implica que el personal debe estar específicamente entrenado y poseer inmunidad, con un título de anticuerpos protectores validado. Entre las desventajas inherentes a su aplicación podemos mencionar la aparición de reacciones adversas locales asociadas a los adyuvantes presentes en la formulación y la posibilidad de transmisión de patógenos no detectados (virus, bacterias, priones). La necesidad de disponer a nivel mundial de vacunas antirrábicas seguras, efectivas y de bajo costo ha llevado al desarrollo y evaluación de nuevos inmunógenos desde hace aproximadamente tres décadas. En este sentido, existen numerosos informes en la bibliografía que describen la utilización de vectores virales (replicativos o no) para el clonado y la expresión de la glicoproteína G del virus rábico, principal antígeno responsable de inducir inmunidad celular y humoral protectora en el hospedador (6, 17, 20, 36, 39, 42). De este modo, se obtuvieron virus recombinantes basados en adenovirus canino (2, 15, 16, 19) y humano (24, 38), en herpesvirus canino (43), en virus rábico no

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 75-84

replicativo (4), en virus de la pseudorrabia (44) y en los siguientes poxvirus: vaccinia (8, 18, 37); virus vaccinia modificado, cepa Ankara (Modified vaccinia virus: MVA) (35); racoonpox (viruela de mapache) (9), fowlpox (viruela de ave de corral) (30) y canarypox (viruela de canario) (29). La inmunización de ratones y otras especies con estos vectores confirió protección frente al desafío letal con virus rábico. Una ventaja destacable de los avipoxvirus, como el virus fowlpox (FWPV) o el canarypox (CNPV), es su capacidad de infectar productivamente solo a sus hospedadores naturales. Estos virus pueden iniciar una infección abortiva por inoculación en especies no aviares o por infección de líneas celulares derivadas de mamíferos. Sin embargo, los antígenos foráneos insertados en estos vectores pueden ser sintetizados, procesados y presentados en la superficie de células no permisivas y desencadenar repuestas inmunes de tipo celular y humoral (26, 30). De este modo, la inmunización se consigue en ausencia de replicación viral, con lo que se elimina la posibilidad de una diseminación del vector desde los animales vacunados hacia animales susceptibles o hacia el medio ambiente. Además, el adecuado perfil de seguridad de las vacunas basadas en CNPV recombinantes está demostrado en estudios del National Institute of Health (NIH) para su utilización como vacuna contra el sida y como terapia antitumoral en humanos (http:// c l i n i c a l t r i a l s . g ov ; h t t p : / / w w w. i av i . o r g / Pa g e s / home.aspx). En particular, recientemente se publicaron los resultados de un ensayo clínico (RV144, fase III) realizado en Tailandia, que evalúa una vacuna contra HIV basada en CNPV recombinantes. Por primera vez, se mostró cierta eficacia (31,2 %) en la prevención de la infección por HIV (34). En este trabajo describimos el desarrollo local de un candidato a vacuna antirrábica basado en un virus canarypox recombinante que expresa la glicoproteína G del virus rábico. La capacidad inmunogénica y protectora del virus recombinante se evaluó en el modelo murino. La potencia del candidato vacunal se comparó con la potencia de una vacuna antirrábica de uso veterinario en la Argentina.

MATERIALES Y MÉTODOS Virus y células Las líneas celulares Vero (American Type Culture Collection, ATCC CCL-81) y BHK-21 (ATCC CCL-10) se propagaron en medio mínimo esencial de Eagle (MEM-E, Life Technologies Inc., NY, EE.UU.) suplementado con 10 % de suero fetal bovino (Internegocios, Argentina).

Canarypox recombinante como vacuna antirrábica Los cultivos primarios de fibroblastos de embrión de pollo (FEP) se prepararon a partir de embriones de 11 días, libres de patógenos específicos (SPF), adquiridos en el Instituto Rosenbusch de la Argentina. Estos se crecieron en medio 199 (Life Technologies Inc.) suplementado con 10 % de suero fetal bovino. La cepa vacunal Abbatista 95 del CNPV, gentilmente cedida por el Dr. Samus, se utilizó para la obtención de virus canarypox recombinantes. La cepa Abbatista 95 se comercializa en la Argentina como vacuna viva atenuada –liofilizada– contra la difteroviruela del canario (Diftervac®, Laboratorios LaDiPreVet, La Plata) y, en nuestro laboratorio, fue adaptada al crecimiento en FEP. La cepa Challenge Virus Standard del virus rábico, amplificada en cerebro de ratón, fue provista por la Organización Panamericana de la Salud (OPS). En el INPB ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”, este virus se propagó en cerebro de rata lactante (CVS) y luego se adaptó al crecimiento en cultivos de células Vero (CVSVero). Esta cepa es uno de los componentes de las vacunas antirrábicas de primera generación que se utilizan hasta la fecha en la Argentina. La vacuna antirrábica de referencia nacional elaborada por SENASA, cepa Virus Pasteur propagada en monocapas de células BHK-21 clon 13 e inactivada por tratamiento con bromoetilenimina (BEI, Merck, Alemania) 0,1 mM (PV-BHK 3), se estandarizó con la vacuna de referencia internacional 5 º patrón de la Organización Mundial de la Salud (OMS) y se usó como control en los ensayos de potencia.

Construcción del vector de transferencia VT-C-GUS-RG El ARN viral de la cepa CVS-Vero se extrajo con el reactivo comercial de Trizol®LS (Invitrogen, CA, EE.UU.) a partir del sobrenadante del cultivo de células Vero infectadas. Una alícuota del ARN extraño se utilizó como templado para la obtención del ADN copia en una reacción de transcripción reversa junto con hexámeros al azar como oligonucleótidos iniciadores. Posteriormente, la región genómica codificante de la glicoproteína G (RG) se amplificó por PCR en dos fragmentos de 922 y 673 pares de bases, utilizando los pares de oligonucleótidos iniciadores RG1 (1-17)-RG4 (903-922) y RG3 (903-922)-RG2 (1559-1575), respectivamente. Estos cebadores fueron diseñados sobre la base de las secuencias de otras cepas CVS del virus rábico, depositadas en el GenBank (CVS: AJ506997, CVS-B2c: AF042824, CNV-N2c: AF325714). Las secuencias y características de los oligonucleótidos utilizados en este trabajo se indican en la Tabla 1.

77 Los productos de amplificación de PCR se clonaron en el vector comercial pGem®-T Easy (Promega, Madison, EE.UU.) y se liberaron nuevamente por digestión con las enzimas EcoRI y NsiI o NsiI y SmaI (New England BioLabs, Inc., MA, EE.UU.). Los fragmentos obtenidos se subclonaron en el vector pE/L –disponible en nuestro laboratorio (5)– digerido con las enzimas EcoRI y SmaI. Esto se realizó mediante una reacción de ligación triple, de manera de obtener la secuencia completa del gen RG bajo regulación del promotor sintético temprano-tardío E/L de poxvirus (Figura 1A). El cassette de expresión E/L-RG-t se liberó por digestión con la enzima NotI y se subclonó en el mismo sitio del vector VT-C-GUS (5) digerido parcialmente, con lo que se obtuvo el vector de transferencia denominado VT-C-GUSRG (Figura 1B). Este vector porta, además, un cassette para la expresión del gen marcador uidA, cuyo producto es la enzima β-glucuronidasa bacteriana (GUS), bajo regulación del promotor H6 de poxvirus. Ambas construcciones se encuentran flanqueadas por secuencias correspondientes al gen no esencial CNPV 048, para permitir la recombinación homóloga in vivo (5). La identidad del gen codificante de RG se corroboró por secuenciación, utilizando el equipo ABI PRIS® 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Japón).

Obtención y selección de virus canarypox recombinantes Un cultivo de FEP (80-90 % de confluencia) se infectó con CNPV en una relación de una partícula viral por cada 10 células. A las 2 h posinfección, el cultivo infectado se transfectó con una mezcla de 10 μg del ADN purificado de VT-C-GUS-RG y 31 μl de lipofectina (Invitrogen), y se incubó a 37 ºC en atmósfera de 5 % de CO2 hasta la visualización de efecto citopático. El virus recombinante producido, denominado CNPV-RG, se seleccionó por su capacidad de generar placas de lisis azules cuando el sustrato de la enzima marcadora GUS, X-Gluc (5bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucurónido, Inalco, Italia) se agregó en el cultivo agarizado (5, 11). Posteriormente, el virus fue purificado por seis pasajes sucesivos bajo agar hasta obtener un stock homogéneo (100 % de placas de lisis azules).

Caracterización molecular del virus CNPV-RG por PCR Con los virus CNPV y CNPV-RG se infectaron monocapas de FEP en una relación de una partícula viral por cada 10 células. Cuando el efecto citopático fue de aproximadamente 100 %, las monocapas se lavaron y se resuspendieron en PBS (NaCl 0,14 M; KCl 0,003 M; Na2HPO 4 0,008 M; KH2PO4 0,0015 M; pH 7,2). A partir de una alícuota de estas suspensiones celulares se realizó la extracción de ADN total

Tabla 1. Secuencia de los oligonucleótidos utilizados Oligonucleótidos

Secuencia nucleotídica

Sitios de restricción

Fuente

RG1 (sentido)

CAGAATTCATGGTTCCTCAGGTTCT

EcoRI

Este trabajo

RG2 (antisentido)

ATTCCCGGGTCACAGTCTGRTCTCA

SmaI

Este trabajo

RG3 (sentido)

GTCTGGATGCATTAGAGT

NsiI

Este trabajo

RG4 (antisentido)

ACTCTAATGCATCCAGAC

NsiI

Este trabajo

BPC1 (antisentido)

TCCGCTTGTACAGATGGT

CPC1 (sentido)

GATTGAAGATACAGGATTCT

(5) Este trabajo

outGUS (antisentido)

CAGCCTCGGGAATTGCTAC

(5)

La secuencia de los oligonucleótidos se indica en orientación 5´ - 3´. En letra subrayada se señalan los sitios de restricción incorporados a la secuencia. En negrita se señalan los codones de iniciación (ATG) y el triplete complementario al de terminación (TCA)

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 75-84

Nsi I

Eco RI

Not I

922pb

EcoR I

Sma I Not I t

E/L

T4 ADN

Nsi I

Eco RI

Not I

Sma I Not I RG

E/L

Ligasa

pE/L

Sma I

Nsi I

pE/L/RG

673pb

Not I

E/L

048i

Not I

uidA

048d

VT-C-GUS/NotI (digestión parcial)

T4 ADN Ligasa

048i

E/L

Not I

t t

uidA

048d

VT-C-GUS-RG

Figura 1. Esquema de la construcción de VT-C-GUS-RG Se esquematizan las estrategias de clonado para la obtención del plásmido intermediario pE/L/RG (A) y el vector de transferencia VT-C-GUS-RG (B). 922pb/673pb: amplicones de la secuencia codificante de la glicoproteína G (RG) del virus rábico obtenidos con los pares de cebadores RG1-RG4 y RG3-RG2, respectivamente. E/L: promotor sintético temprano-tardío E/L de poxvirus, H6: promotor del gen H6 del virus vaccinia, GUS: gen uidA, t: secuencias terminadoras de la transcripción de poxvirus. Las secuencias de interés se encuentran flanqueadas por secuencias del gen CNPV048 para permitir la recombinación homóloga con el genoma del virus canarypox. Sobre la base de la secuencia genómica del CNPV (33), se definió que 048i corresponde a un fragmento de aprox. 600 pb, con inicio en la posición 59.528, y que 048d corresponde a un fragmento de aprox. 1700 pb, con inicio en la posición 57.247

por el método descrito por Dellaporta et al. (7). Para comprobar la pureza del stock viral recombinante, el material genético obtenido se utilizó como templado en una reacción de PCR diseñada para obtener dos productos de amplificación de distinto tamaño, según se esquematiza en la Figura 2A. La reacción se realizó en presencia de los oligonucleótidos BPC1, outGUS y CPC1 (Tabla 1), este último al doble de concentración, y el tiempo de elongación se ajustó de manera tal que la amplificación sobre el genoma recombinante estuviera favorecida para la obtención del producto más corto (combinación de cebadores CPC1-outGUS) y no fuera suficiente para la amplificación del producto de mayor tamaño (combinación de cebadores CPC1BPC1).

Análisis de la expresión de la proteína RG por Western blot Se infectaron monocapas confluyentes de BHK-21 con los virus CNPV o CNPV-RG utilizando una relación de 4 partículas

virales por cada 10 células. A las 24 h posinfección, las células se cosecharon, se lavaron con PBS y se resuspendieron en buffer de extracción (Tris-HCl 50 mM pH 8, NaCl 150 mM, NP40 1 %). Los extractos proteicos se incubaron en hielo durante 45 min y se centrifugaron a 10 000 g durante 2 min. Las muestras proteicas se resuspendieron en buffer Laemmli (Tris-HCl 62,5 mM pH 6,8; dodecilsulfato de sodio, SDS 2 %; azul de bromofenol 0,25 %; glicerol 5 %, β-mercapto-etanol 3 %) y se sembraron sobre un gel de poliacrilamida (PAGE 12 % -SDS). Luego de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad Laboratories, CA, EE.UU.). La expresión de la proteína RG se determinó mediante la técnica de Western blot utilizando un suero policlonal equino anti-virus rábico (dilución 1/100) obtenido en SENASA, y un suero anti-IgG equina conjugado a peroxidasa de rábano (dilución 1/1000, Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., EE.UU.). La presencia de la proteína RG recombinante se reveló mediante precipitación de sustrato 4-cloro-1-naftol (Tris-HCl 42 mM pH 7,5; 4-Cl-1-naftol 0,05 %; H2O 2 0,02 %).

Canarypox recombinante como vacuna antirrábica

B CPC1

outGUS

BPC1

pH6-uidA

pE/L-RG

2400 pb

CPC1

BPC1

CNPV048

600 pb

Figura 2. Análisis por PCR de los virus canarypox recombinantes CNPV-RG A) Representación esquemática de los genomas del virus canarypox recombinante (esquema superior) y no recombinante (esquema inferior). Se indica la ubicación de los oligonucleótidos utilizados en la reacción de amplificación por PCR. Las líneas indican el tamaño esperado de los amplicones. B) Electroforesis en gel de agarosa 1 %, teñido con bromuro de etidio, de los productos de amplificación por PCR utilizando como templado ADN de cultivos de FEP no infectados (FEP NI), clones virales N.º 37 y 38 de CNPV-RG, vector de transferencia VT-C-GUS-RG (VT), y virus no recombinante (CNPV). En la reacción se incluyó un control sin ADN (C-). Como marcador de peso molecular (MPM) se utilizó 1 Kb DNA Plus (Invitrogen)

Ensayos de potencia del virus CNPV-RG Durante el trabajo con animales se cumplió la disposición N.° 6344/96 de ANMAT, que reglamenta los bioterios de laboratorios elaboradores de especialidades medicinales y/o de análisis para terceros. Los ensayos de potencia relativa del virus CNPV-RG se realizaron en el modelo murino. Para ello, grupos de 10-11 ratones de la cepa BALB/c de 5-6 semanas se vacunaron por vía intraperitoneal aplicando un esquema dosis-refuerzo. En el primer ensayo se determinó la capacidad de la vacuna de inducir inmunidad protectora. Los ratones se inmunizaron a los 0 y 21 días utilizando una dosis fija de 2x107 unidades formadoras de placas (UFP) de los virus CNPV o CNPV-RG, purificados sobre colchón de sacarosa (5). En el segundo experimento se evaluó la potencia relativa de la vacuna CNPV-RG. Se realizó una modificación del protocolo del National Institute of Health (NIH) para una vacuna en estudio (40). Los animales se vacunaron los días 0 y 21 con 0,5 ml de las diluciones 1:5, 1:25 y 1:125 de un cultivo de FEP infectado con el virus CNPV-RG (título inicial de 4,2 x 106 UFP/ml). En ambos experimentos se incluyeron grupos controles de animales no vacunados o inmunizados a los 21 y 28 días con diluciones 1:5, 1:25 y 1:125 de la vacuna antirrábica PV-BHK 3. En el día 35, todos los animales se desafiaron por inoculación intracerebral con una dosis comprendida entre 12 y 50 DL50/ 0,03 ml del virus CVS (40). Los ratones se observaron durante un período de 14 días; se llevó el registro del número de animales muertos o con signos clínicos compatibles con rabia respecto del total. Las muertes ocurridas durante los primeros 4 días posdesafío se registraron como inespecíficas.

Determinación de anticuerpos neutralizantes del virus rábico Se utilizó el protocolo de determinación de anticuerpos in vivo según Fitzgerald (12). Brevemente, los sueros del primer ensayo obtenidos a los días 20 o 34 se agruparon en pools, se realizaron diluciones seriadas en base 5 y se incubaron 1 h a

37 ºC con una dosis fija (comprendida entre 12 y 50 DL50) de la cepa CVS de virus rábico. Como control se analizó en paralelo una inmunoglobulina equina estandarizada con la inmunoglobulina antirrábica de referencia de la OMS. Esta inmunoglobulina equina (IgG) se obtuvo por precipitación con sulfato de amonio a partir de un suero equino hiperinmune, según el protocolo descrito por el Instituto Panamericano de Protección de Alimentos y Zoonosis (INPPAZ, Nota Técnica N.° 8 2-IX-75). Las mezclas se inocularon intracerebralmente en ratones adultos (11 a 14 g) naive de la cepa CF-1, los cuales se observaron durante un período de 14 días para llevar un registro del número de animales muertos y sobrevivientes.

Análisis de datos El test estadístico de Reed y Muench (25) se utilizó para calcular la dilución efectiva 50 (DE50) y la dilución protectora 50 (DP50) en los ensayos de potencia y seroneutralización, respectivamente. La potencia del candidato vacunal CNPV-RG se calculó como la relación entre los valores de las inversas de las DE50 obtenidas para dicho virus respecto de las obtenidas para la vacuna de referencia. Análogamente, pero relacionando las DP50, se determinaron los títulos de anticuerpos neutralizantes de RV inducidos por la inmunización con el virus recombinante. Todos los resultados se expresaron en unidades internacionales por ml (UI/ml); a las vacunas y gammaglobulinas de referencia se les asignó el valor de 1.

RESULTADOS Construcción y caracterización in vitro del virus canarypox recombinante CNPV-RG Se desarrollaron virus CNPV recombinantes que portan la secuencia codificante de la glicoproteína G

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 75-84

del virus rábico interrumpiendo el gen viral no esencial CNPV048. Como se muestra en la Figura 2B, mediante amplificación por PCR se confirmó que los virus recombinantes CNPV-RG (clones N.º 37 y 38) portan la secuencia del gen heterólogo y se encuentran puros (ausencia de genoma viral no recombinante), ya que solo se amplificó un fragmento de 2,4 kpb correspondiente al genoma viral recombinante. La expresión de la proteína RG se confirmó mediante Western blot utilizando un suero anti-virus rábico. La presencia de una banda reactiva de aproximadamente 60 kDa se detectó en las muestras provenientes de células infectadas con CNPV-RG, mientras que no se detectó señal en las muestras provenientes de células no infectadas o infectadas con CNPV (Figura 3). Finalmente, la estabilidad genética del virus recombinante se confirmó mediante PCR luego de 10 pasajes ciegos en FEP (resultado no mostrado). En conjunto, estos resultados demuestran que el virus recombinante CNPV-RG por ta y expresa la secuencia codificante de la glicoproteína G del virus rábico. Respuesta inmune y protección en ratones vacunados con CNPV-RG La capacidad del virus recombinante CNPV-RG de inducir una respuesta inmune humoral y de conferir protección frente al desafío con virus rábico se evaluó en un primer ensayo utilizando el modelo murino, según se describe en Materiales y Métodos. Los títulos de anticuerpos neutralizantes de RV determinados en los sueros de los ratones vacunados se muestran en la Tabla 2. La vacuna antirrábica de referencia (PV-BHK 3) indujo la síntesis de anticuerpos neutralizantes; el título observado fue mayor cuanto mayor fue la cantidad de masa antigénica administrada. Como era esperado, los sueros de los

CNPV

CNPV-RG MPM

- 72 kDa - 55 kDa -43 kDa

Figura 3. Expresión de la proteína RG a partir de CNPV-RG Los extractos proteicos se analizaron mediante la técnica de Western blot. La flecha indica la banda reactiva del tamaño esperado. Los extractos proteicos se obtuvieron a partir de cultivos de BHK-21 no infectados (NI) o infectados con el clon viral N.º 37 del virus canarypox recombinante (CNPV-RG) y no recombinante (CNPV). MPM: marcador de peso molecular preteñido Page Ruler (Fermentas, EE.UU.)

ratones no vacunados o inmunizados con el virus no recombinante CNPV no presentaron actividad neutralizante de RV, mientras que en los sueros de ratones vacunados con el virus CNPV-RG se determinaron títulos seroneutralizantes de 3,58 y 9,76 UI/ml luego de una y dos inmunizaciones, respectivamente. En la Tabla 2 se muestran los valores de supervivencia obtenidos para cada grupo experimental luego del desafío. Todos los ratones no vacunados o vacunados con el virus CNPV murieron dentro del período de observación. En este ensayo, la vacuna antirrábica PV-BHK 3 protegió al 100 % (dilución 1:5), al 87,5 % (dilución 1:25) y al 50 % (dilución 1:125) de los animales vacunados, mientras que en el grupo de ratones inmunizados con CNPV-RG, 7 de 9 animales sobrevivieron, lo que resulta en una protección del 78 %. A un año del desafío, se determinó que los sueros de los ratones sobrevivientes del grupo CNPV-RG presentaron actividad neutralizante del virus rábico, con un título de 7,39 UI/ml. Determinación de la potencia relativa del candidato vacunal CNPV-RG Con el objetivo de determinar la potencia relativa del virus CNPV-RG, se realizó un segundo experimento de inmunización y desafío de ratones, siguiendo el protocolo descrito en Materiales y Métodos. Este ensayo permite comparar los niveles de protección conferidos por una vacuna en estudio y una vacuna antirrábica de referencia. Luego del desafío se calculó la dilución que protegió al 50 % de los animales (DE50). En este experimento, se obtuvo un valor de 1:49 y de 1:174 para PV-BHK 3 y CNPV-RG, respectivamente. La relación entre ambos valores de DE50 permitió calcular una potencia relativa de 3,5 UI/ml para el candidato vacunal CNPV-RG (Tabla 3).

DISCUSIÓN En la actualidad, en el área de la medicina veterinaria se requieren vacunas antirrábicas que sean seguras y efectivas. Los vectores virales de expresión no replicativos constituyen la herramienta de elección para el desarrollo de nuevos inmunógenos que cumplan con este propósito. En particular, el virus canarypox cepa ALVAC, se utilizó para la expresión de la glicoproteína G del virus rábico (1, 3). Los ensayos de potencia demostraron que la eficacia protectora del virus canarypox recombinante (ALVACRG) fue 100 veces mayor que la de un vector basado

Canarypox recombinante como vacuna antirrábica

Tabla 2. Títulos de anticuerpos neutralizantes (UI/ml) y supervivencia frente al desafío con virus rábico en ratones Supervivencia(4)

Título seroneutralizante Grupos experimentales

Día 20

Día 34

N.º sobrevivientes/ N.º total (% sobrevivientes)

Sin inmunizar CNPV 2x107 UFP CNPV-RG 2x10 7 UFP PV-BHK 3 Dilución 1:5 PV-BHK 3 Dilución 1:25 PV-BHK 3 Dilución 1:125

ND 0 3,58 ND ND ND

ND 0 9,76 3,30 2,18 0,97

0/10 (0) 0/6(1) (0) 7/9 (2) (78) 9/9(2) (100) 7/8(3) (87,5) 5/10 (50)

DE50 1:106

Los títulos de anticuerpos neutralizantes se definieron como la más alta dilución de suero que incubada con una dosis fija de virus rábico e inoculada intracerebralmente en ratones protege al 50 % de los animales desafiados (DP50). Los valores obtenidos se normalizaron a unidades internacionales (UI/ml) por división con la DP50 de una inmunoglobulina antirrábica control estandarizada con la inmunoglobulina de referencia de la OMS. ND: no determinado. (1) Cuatro ratones murieron luego de la primera inmunización; (2) un ratón murió a las 24 h posdesafío (muerte inespecífica); (3) dos ratones murieron a las 24 h posdesafío (muerte inespecífica); (4) el desafío se realizó inoculando intracerebralmente 30 DL50 del virus CVS por ratón

Tabla 3. Potencia relativa del candidato vacunal CNPV-RG Grupos experimentales

Protección (1) N.º sobrevivientes/N.º total

(2)

DE50

(3)

CNPV-RG Dilución 1:5 CNPV-RG Dilución 1:25 CNPV-RG Dilución 1:125

7/8 10/11 5/6(3)

1/174(4)

PV-BHK 3 Dilución 1:5 PV-BHK 3 Dilución 1:25 PV-BHK 3 Dilución 1:125

7/9(3) 7/9(3) 3/10

1/49

La dilución que protegió al 50 % de los animales (DE50) se calculó por el método de Reed y Muench (25). La potencia del CNPV-RG se calculó como la relación entre los valores de las inversas de las DE50 obtenidas para dicho virus respecto de las obtenidas para la vacuna de referencia. (1) Los animales utilizados en este ensayo se desafiaron con 50 DL50 de virus CVS. (2) El título inicial del CNPV-RG fue 4,2 x 106 UFP/ml. (3) Entre uno y cinco ratones murieron a las 24 h posdesafío (muerte inespecífica). (4) La dilución 1:625 del CNPV-RG no protegió a ningún ratón (0 % de supervivencia)

en fowlpox (FPV-RG), pero similar a aquella del virus replicativo vaccinia, V-RG (29). Estos datos, sumados al excelente perfil de seguridad de ALVAC-RG para animales y humanos (3, 13, 28), permitieron obtener la licencia para su uso como vacuna antirrábica en gatos, en Estados Unidos y Canadá (23). Basándonos en los buenos resultados obtenidos con ALVAC-RG, se decidió desarrollar en nuestro laboratorio un candidato vacunal utilizando la cepa Abbatista 95 del virus canarypox como vector no replicativo para la expresión de la proteína G del virus rábico. El vector viral utilizado en este trabajo fue obtenido en nuestro laboratorio y está protegido a través de la patente argentina N° AR052743B1. La inmunidad protectora inducida por el virus

CNPV-RG obtenido se evaluó en el modelo murino. La presencia de anticuerpos neutralizantes del virus rábico en los sueros de los ratones vacunados con CNPV-RG purificado indicó la correcta síntesis de novo de la glicoproteína G y su capacidad para inducir una respuesta inmune humoral, que pudo ser detectada hasta un año después de la última vacunación. Los títulos de anticuerpos neutralizantes inducidos por CNPV-RG superaron ampliamente el valor de 0,5 UI/ ml, asociado con la protección en animales (22), y fueron altos comparados con aquellos inducidos por la vacuna antirrábica nacional de referencia. Sin embargo, la protección fue menor en los ratones vacunados con CNPV-RG que en los animales inmunizados con las diluciones 1:5 y 1:25 de la

vacuna PV-BHK 3. Esto puede deberse a que no siempre existe una estricta correlación entre los niveles de anticuerpos neutralizantes y el grado de protección conferido, tal como fue descrito por Hu et al. (16). Los resultados obtenidos en el ensayo de potencia sugieren que el candidato vacunal, producido como extracto de células infectadas con CNPV-RG, sería capaz de brindar una buena protección in vivo frente al virus rábico debido a que dicho vector presentó un valor de potencia relativa superior al de la vacuna de referencia. Los experimentos presentados aportan datos preliminares y promisorios sobre la evaluación del virus CNPV-RG como candidato a vacuna antirrábica para uso veterinario. De todos modos, los valores de potencia relativa como así también el nivel de anticuerpos neutralizantes inducidos por este vector deberán corroborarse con un número mayor de experimentos en el modelo murino. Para ello será necesario aumentar la escala de producción de cultivos de FEP infectados con el virus CNPV-RG y establecer un protocolo de elaboración validado. Esto permitirá contar con la suficiente cantidad de inóculo para continuar con su caracterización. Se prevé analizar el perfil de seguridad del virus recombinante, la efectividad de la inmunización utilizando diferentes vías de administración, las dosis mínimas inmunizantes y protectoras, la duración de la inmunidad luego de la aplicación de una sola dosis, la utilidad del virus CNPVRG en presencia de anticuerpos maternos antirrábicos, etc. Otro factor importante que se tendrá en cuenta será la optimización de la presentación antigénica, lo que podría conllevar un mejor reconocimiento por parte del sistema inmune y un aumento de los niveles de protección en el hospedador. En la bibliografía se ha descrito que la potencia de una vacuna antirrábica basada en vectores virales no replicativos está determinada, principalmente, por su capacidad para expresar la glicoproteína G (19). En este sentido, se demostró que la sobreexpresión de esta proteína incrementa significativamente la velocidad de aparición de la respuesta inmune humoral al virus rábico en el hospedador, así como su magnitud (4, 10). Además, existen trabajos que indican que la nucleoproteína (N) activa linfocitos T colaboradores y citotóxicos, con lo que se facilita la producción de anticuerpos neutralizantes y se potencia la respuesta inmune (14, 27, 31). Sobre la base de estos resultados, podrían obtenerse CNPV recombinantes que expresen dos copias del gen codificante de RG o que expresen simultáneamente las proteínas RG y N del virus rábico.

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 75-84

La rabia paralítica o paresiante es la rabia del ganado transmitida por mordedura de murciélagos hematófagos. En la República Argentina, el área endémica abarca las provincias del norte, donde la mortalidad del ganado infectado afecta la economía regional. La vacunación de los animales es voluntaria y, en general, solo se realiza cuando se detectan brotes en el campo o en las inmediaciones, y cesa una vez que el brote fue controlado, por lo cual la enfermedad reaparece una vez que transcurrió el período interepidémico. Si bien en el ganado infectado no existe transmisión horizontal de la enfermedad, este representa un riesgo para la salud pública, ya que constituye un reservorio del virus por ser la principal fuente de alimentación del vampiro. En este contexto sería interesante evaluar, a futuro, la utilidad del virus recombinante CNPV-RG para la prevención de la rabia paresiante en zonas del país actualmente endémicas, y en aquellas áreas potencialmente afectadas debido a las modificaciones en los patrones de migración de los murciélagos, que se registran a causa del cambio climático. En consecuencia, la disponibilidad de nuevas vacunas que eliminen la manipulación del agente infeccioso y que permitan el control de la enfermedad en animales de interés económico es de importancia estratégica nacional y regional. Finalmente, podemos mencionar que el conjunto de los resultados preliminares presentados en este trabajo muestran un futuro promisorio del virus CNPV-RG como candidato a vacuna antirrábica de nueva generación para uso en el área de la medicina veterinaria.

Agradecimientos: los autores agradecen al INTA, por la financiación recibida (Proyectos Específicos AEGR 2414 y AERG 232141), al Dr. O. Zabal y su equipo, por la realización de los cultivos primarios de embrión de pollo, y a M. J. Mónaco, S. Díaz, J. De Filippo y G. Fernández, por su asistencia técnica.

BIBLIOGRAFÍA 1. Aguilar-Setién A, Campos Y, Cruz E, Kretschmer R, Brochier B, Pastoret P. Vaccination of vampiro bats using recombinant vaccinia-rabies virus. J Wild Dis 2002; 38: 539-44. 2. Bout-Cararo C, Contreras V, Fournier A, Jallet C, Guibert J, Dubois E, Thiery R, Bréard E, Tordo N, Richardson J, Schwartz-Cornil I, Zientara S, Klonjkowski B. Canine adenoviruses elicit both humoral and cell-mediated immune responses against rabies following immunization of sheep. Vaccine 2011; 29: 1304-10. 3. Cadoz M, Meignier B, Plotkin S, Strady A, Taylor J, Tartaglia J, Paoletti E, Plotkin S. Immunization with canarypox virus expressing rabies glycoprotein. Lancet 1992; 339: 1429-32.

Canarypox recombinante como vacuna antirrábica 4. Cenna J, Tan G, Papaneri A, Dietzschold B, Schnelly M, McGettigan J. Immune modulating effect by a phosphoproteindeleted rabies virus vaccine vector expressing two copies of the rabies virus glycoprotein gene. Vaccine 2008; 26: 6405-14. 5. Conte Grand D. Vectores virales de expresión basados en virus canarypox recombinantes: su desarrollo y evaluación como inmunógenos derivados de patógenos de interés pecuario. Tesis doctoral. 2006; Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad de Buenos Aires. 6. Cox J, Dietzschold B, Schneider L. Rabies virus glycoprotein II. Biological and serological characterization. Infect Immun 1977; 16: 754-9. 7. Dellaporta S, Word J, Hicks J. A plant molecular DNA minipreparation, versión II. Plant Mol Biol Rep 1983; 1: 12-21. 8. Esposito J, Brechling K, Baer G, Moss B. Vaccinia virus recombinants expressing rabies glycoprotein protect against rabies. Virus Gene 1987; 1: 7-21. 9. Esposito J, Knight J, Shaddock J, Novembre F, Baer G. Successful oral rabies vaccination of racoons with raccons poxvirus recombinants expressing rabies virus glycoproteins. Virology 1988; 165: 313-6. 10. Faber M, Pulmanausahakul R, Hodawadekar S, Spitsin S, McGetiggan J, Schnell M, Dietzchold B. Overexpression of the rabies virus glycoprotein results in enhancement of apoptosis and antiviral immune response. J Virol 2002; 76: 3374-81. 11. Ferrer F, Zanetti F, Calamante G. Diseño y construcción de vectores de transferencia para la obtención de virus vaccinia Ankara modificado (MVA) recombinantes. Rev Argent Microbiol 2007; 39: 138-42. 12. Fitzgerald E. Potency test for antirabies serum and immunoglobulin.In: Meslin F, Kaplan M, Koprowski H, editors. Laboratory Techniques in Rabies, 4th edition. Geneva, World Health Organization, 1996, p. 417-22. 13. Fries L, Tartaglia J, Taylor J, Kauffman E, Meignier B, Paoletti E, Plotkin S. Human safety and immunogenicity of canarypoxrabies glycoprotein recombinant vaccine: an alternative poxvirus vector system. Vaccine 1996; 14: 428-34. 14. Fu Z, Dietzschold B, Schumacher C, Wunner W, Ertl, H, Koprowski H. Rabies virus nucleoprotein expressed in and purified from insect cells is efficacious as a vaccine. Proc Natl Acad Sci USA1991; 88: 2001-5. 15. Henderson H, Jackson F, Bean K, Panasuk B, Niezgoda M, Slate D, Li J, Dietzschold B, Mattis J, Rupprecht C. Oral immunization of raccons and skunks with a canine adenovirus recombinant rabies vaccine. Vaccine 2009; 27: 7194-7. 16. Hu R, Zhang S, Fooks A, Yuan H, Liu Y, Li H, Tu C, Xia X, Xiao Y. Prevention of rabies virus infection in dogs by a recombinant canine adenovirus type-2 encoding the rabies virus glycoprotein. Microb Infect 2006; 8: 1090-7. 17. Kawano H, Mifune K, Ohuchi M, Mannen K, Cho S, Hiramatsu K, Schichijo A. Protection against rabies in mice by cytotoxic T cell clone recognizing the glycoprotein of rabies virus. J Gen Virol 1990; 71: 281-7. 18. Kieny M, Lathe R, Drillien R, Spehner D, Skory S, Schmitt D, Wiktor T, Koprowski H, Lecocq J. Expression of rabies virus glycoprotein from a recombinant vaccinia virus. Nature 1984; 312: 163-6. 19. Li J, Faber M, Papaneri A, Faber M-L, McGettigan J, Schnell M, Dietzschold B. A single immunization with a recombinant canine adenovirus expressing the rabies virus G protein confers protective immunity against rabies in mice. Virology 2006; 356: 147-54.

83 20. Macfarlan R, Dietzschold B, Koprowski H. Stimulation of cytotoxic T-lymphocyte responses by rabies virus glycoprotein and identification of an immunodominant domain. J Mol Immunol 1986; 23: 733-41. 21. Manual de Normas y Procedimientos para la Vigilancia, Prevención y Control de Rabia del Ministerio de Salud de la Nación, 2007; República Argentina. 22. Monaco F, Franchi P, Lelli R. Studies on an inactivated vaccine against rabies virus in domestic animals. Dev Biol (Basel) 2006; 125: 233-9. 23. Poulet H, Minke J, Pardo M, Juillard V, Nordgren B, Audonnet J-C. Development and registration of recombinant veterinary vaccine, the example of the canarypox vector plataform. Vaccine 2007; 25: 5606-12. 24. Prevec L, Campbell J, Christie B, Bibek L, Graham F. A recombinant human adenovirus vaccine against rabies. J Infect Dis 1990; 161: 27-30. 25. Reed L, Muench H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am J Hyg 1938; 27: 493-7. 26. Somogyi P, Frasier J, Skinner M. Fowlpox virus host range restriction: gene expression, DNA replication and morphogenesis in nonpermissive mammalian cells. Virology 1993; 197: 439-44. 27. Takida-Sonoda Y, Fujii H, Mifune K, Ito Y, Hiraga M, Nishizono A, Mannen K, Minamoto N. Resistance of mice vaccinated with rabies virus internal structural proteins to lethal infection. Arch Virol 1993; 132: 51-65. 28. Taylor J, Meignier B, Tartaglia J, Languet B, VanderHoeven J, Franchini G, Trimarchi C, Paoletti E. Biological and immunogenic properties of a canarypox-rabies recombinant, ALVAC-RG (vCP65) in non-avian species. Vaccine 1995; 13: 539-49. 29. Taylor J, Trimarchi C, Weinberg R, Languet B, Guillemin F, Desmettre P, Paoletti E. Efficacy study on a canarypoxrabies recombinant virus. Vaccine 1991; 9: 190-3. 30. Taylor J, Weinberg R, Languet B, Desmettre P, Paoletti E. A recombinant fowlpox virus inducing protective immunity in non-avain species. Vaccine 1988; 6: 497-503. 31. Tollis M, Dietzschold B, Viola C, Koprowski H. Immunization of monkeys with rabies ribonucleoprotein (RNP) confers protective immunity against rabies. Vaccine 1991; 9: 134-6. 32. Tordo N, Bahloul C, Jacob Y, Ballet C, Perrin P, Badrane H. Rabies: epidemiological tendencies and control tools. Dev Biol (Basel) 2006; 125: 3-13. 33. Tulman E, Afonso C, Lu Z, Zsak L, Kutish G, Rock D. The genome of canarypox virus. J Virol 2004; 78: 353-66. 34. Vaccari M, Poonam P, Franchini G. Phase III HIV vaccine trial in Thailand: a step toward a protective vaccine for HIV. Expert Rev Vaccine 2010; 9: 997-1005. 35. Weyer J, Rupprecht C, Mans J, Viljoen G, Nel L. Generation and evaluation of a recombiant modified vaccinia virus Ankara vaccine for rabies. Vaccine 2007; 25: 4213-22. 36. Wiktor T, Gyorgy E, Schlumberger H, Sokol F, Koprowski H. Antigenic properties of rabies virus components. J Immunol 1973; 110: 269-76. 37. Wiktor T, Macfarlan R, Reagan K, Dietzschold B, Curtis P, Wunner W, Kieny M, Lathe R, Lecocq J, Mackett M, Moss B, Koprowski H. Protection from rabies by a vaccinia virus recombinant containing the rabies virus glycoprotein gene. Proc Natl Acad Sci USA 1984; 81: 7194-8.

Revista Argentina de MicrobiologĂa (2012) 44: 75-84

38. Wiktor T, Plotkin S, Koprowski H. Rabies vaccine. En: Plotkin SA, Mortimer EA, editors.Vaccines. Saunders WB, Philadelphia, 1988, p. 474-91. 39. Wiktor T. Cell-mediated immunity and post-exposure protection from rabies by inactivated vaccine of tissue culture origin. Dev Biol Stand 1977; 40: 225-30. 40. Wilbur L, Aubert M. The NIH test for potency. En: Meslin F, Kaplan M, Koprowski H, editors. Laboratory Techniques in Rabies, 4th edition. Geneva, World Health Organization, 1996, p. 360-8. 41. World Health Organization. WHO expert consultation on rabies. First report. (WHO technical report series, N.Âş 931). 2005; World Health Organization, Geneva, Switzerland.

42. Wunner W, Dietzschold B, Curtis P, Wiktor T. Rabies subunit vaccines. J Gen Virol 1983, 64: 1649-56. 43. Xuan X, Tuchiya K, Sato I, Nishikawa Y, Onoderaz Y, Takashima Y, Yamamoto A. Biological and immunogenic properties of rabies virus glycoprotein expressed by canine herpesvirus vector. Vaccine 1998; 16: 969-76. 44. Yuan Z, Zhang S, Liu Y, Zhang F, Fooks A, Li Q, Hu R. A recombinant pseudorabies virus expressing rabies virus glycoprotein: Safety and immunogenicity. Vaccine 2008; 26: 1314-21.

Recibido: 22/3/2011- Aceptado: 15/2/2012

ISSN 0325-7541

ETEC y STEC en cerdos con diarrea posdestete y enfermedad de los edemas 85 Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 85-88 INFORME BREVE

Caracterización genotípica de aislamientos de Escherichia coli obtenidos de cerdos con diarrea posdestete y enfermedad de los edemas FABIANA A. MOREDO1*, JAVIER A. CAPPUCCIO2, LUCAS INSARRALDE2, CARLOS J. PERFUMO2, MARÍA A. QUIROGA2, GERARDO A. LEOTTA3 1

Cátedra de Microbiología, 2Cátedra de Patología Especial, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP. Calle 60 y 118, (1900) La Plata, Pcia. de Buenos Aires. 3IGEVET CCT - La Plata - CONICET. Argentina. *Correspondencia. E-mail: fmoredo@fcv.unlp.edu.ar

RESUMEN El objetivo del trabajo fue caracterizar mediante PCR 47 aislamientos de Escherichia coli recuperados de 32 cerdos con diagnóstico clínico de diarrea posdestete (DPD) y de 3 cerdos con enfermedad de los edemas (ED). Sobre 44 aislamientos provenientes de cerdos con DPD, 42 (95,5 %) fueron caracterizados como E. coli enterotoxigénicos (ETEC) y 2 (4,5 %) como E. coli productores de toxina Shiga (STEC). Catorce aislamientos de ETEC (33,3 %) fueron positivos para los genes estI/estII/fedA. El genotipo más complejo fue eltA/estII/east1/faeG/aidA. Los aislamientos provenientes de cerdos con ED se clasificaron como STEC porcinos y fueron portadores de stx2e/aidA. Once aislamientos (25 %) fueron portadores del gen que codifica la expresión de la adhesina AIDA-I. Sin embargo, en ningún aislamiento se detectaron los genes que codifican la expresión de las adhesinas F5, F6, F41, de intimina y de “Paa”. La prevención de la DPD y de la ED podría realizarse mediante el desarrollo de vacunas que generen anticuerpos contra las adhesinas de las cepas de E. coli prevalentes en la Argentina. Palabras clave: ETEC, STEC, diarrea posdestete, enfermedad de los edemas, cerdos

ABSTRACT Genotypic characterization of toxigenic Escherichia coli isolated from pigs with postweaning diarrhea (PWD) and edema disease (ED). The purpose of this work was to characterize 47 Escherichia coli strains isolated from 32 pigs diagnosed with postweaning diarrhea and tree pigs with edema disease by PCR. Forty two (95.5 %) of the strains isolated from diarrheic pigs were characterized as enterotoxigenic E. coli (ETEC) and 2 (4.5 %) as Shiga toxin-producing E. coli (STEC). Fourteen (33.3 %) ETEC strains were positive for est/estII/fedA genes. The most complex genotype was eltA/estI/faeG/aidA. Strains isolated from pigs with ED were classified as porcine STEC and were stx2e/aidA carriers. Eleven (25 %) strains carried the gene encoding adhesin protein AIDA-I. However, genes coding for F5, F6, F41, intimin and Paa were not detected. The development of vaccines generating antibodies against prevalent E. coli adhesins in Argentina could be useful for the prevention of PWD and ED. Key words: ETEC, STEC, postweaning diarrhea, edema disease, pigs

La diarrea posdestete (DPD) es una entidad de distribución mundial en granjas de cerdos en confinamiento (5). Sumado a factores ambientales, sociales y nutricionales (5), en la DPD actúa como agente desencadenante Escherichia coli enterotoxigénico (ETEC), aunque también pueden estar involucradas cepas de E. coli productoras de toxina Shiga (STEC) (10). Los microorganismos del grupo ETEC se caracterizan por la producción de adhesinas fimbriales y enterotoxinas. Estas últimas se clasifican en termolábil (LT) y termoestables (STa, STb y EAST1) (5). En la DPD, estos agentes colonizan el intestino delgado de los lechones en las primeras horas posteriores al destete, adhiriéndose a las microvellosidades

de los enterocitos a través de alguno de sus factores fimbriales, particularmente F4 y F18 (3, 5). El grupo STEC comprende cepas de E. coli positivas para el factor de adhesión F18, las cuales producen una variante de toxina Shiga, la Stx2e, que se asocia a la enfermedad de los edemas (ED) (10). La Stx2e producida en el intestino delgado se absorbe y se une a su receptor glicolipídico (Gb4) que se encuentra localizado sobre las células endoteliales, esto produce angiopatía degenerativa con aumento de la permeabilidad capilar y la presencia de edema en el meso, el estómago, el subcutis y el encéfalo; en este último caso se observan desórdenes neurológicos (11). Recientemente se describió la presencia de un

nuevo subgrupo de ETEC aislados de cerdos con DPD o ED, negativos a factores de colonización fimbriales, pero que expresan una adhesina no fimbrial relacionada con la adherencia difusa, la AIDA-I (10). La AIDA-I puede expresarse como única adhesina o conjuntamente con F18 (5, 7). Leclerc et al. (7) observaron la aparición de nuevos factores de virulencia en cepas ETEC, como el denominado Paa (porcine attaching and effacing associated), originalmente asociado a cepas de E. coli enteropatógenas porcinas (PEPEC). En la Argentina, la información sobre los patotipos y genotipos asociados a DPD y ED es escasa. Si bien se cuenta con datos acerca de la frecuencia de las toxinas LT, STa, STb y Stx2e (9, 13), no se dispone de información acerca de factores de colonización, especialmente los no fimbriales. El objetivo del trabajo fue realizar la caracterización genotípica de aislamientos de E. coli recuperados de cerdos con diagnóstico clínico y anatomopatológico de DPD o ED. Durante los meses de febrero y marzo de 2010 y febrero de 2011, se obtuvieron 47 aislamientos de E. coli toxigénicos a partir de 32 cerdos de la categoría posdestete (21 a 42 días de vida) con signología clínica característica de DPD, y de 3 cerdos con diagnóstico clínico de ED. Los cerdos pertenecían a siete granjas de producción porcina en confinamiento, localizadas en las provincias de Buenos Aires, Santa Fe y Córdoba. Por cada granja se analizaron entre 3 y 9 cerdos (Tabla 2). El aislamiento y la caracterización fenotípica se realizaron utilizando la metodología previamente descrita (9). Se seleccionaron entre 5 y 10 colonias características de E. coli con diferente perfil fenotípico, por cada animal. En las muestras de los 35 cerdos se identificó al menos un genotipo de E. coli toxigénico. Para la caracterización genotípica de ETEC y STEC, se utilizó PCR en tiempo final (1, 2, 6, 10). Del total de aislamientos analizados, 44 se obtuvieron a partir de animales con DPD y 3 de ejemplares con ED. Se utilizó como ADN templado una colonia de cada aislamiento en estudio, lisada durante 15 minutos a 100 ºC en 150 μl de buffer Tris-EDTA/Tritón. En la Tabla 1 se describen los genes analizados, las secuencias de oligonucleótidos utilizados y el tamaño de los fragmentos amplificados. Se utilizaron como cepas de referencia E. coli 7805 (eltA/estI/estII/faeG/east1), E. coli 81-603 A (fasA), E. coli 1073 B44 (fanC/F41), E. coli 88-1199 (fedA), E. coli LS77-1 I (stx2e) y E. coli EDL933 (eae/paa). De los 44 aislamientos provenientes de cerdos con DPD, 42 (95,5 %) se clasificaron como ETEC y 2 (4,5 %) como STEC porcinos, estos últimos presentaron como único gen marcador de virulencia stx2e. Catorce

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 85-88

aislamientos ETEC (33,3 %) fueron positivos para los genes que codifican STa/STb/F18. Esta combinación se observó en tres de las siete granjas estudiadas (Buenos Aires, Córdoba, Santa Fe). Siete aislamientos ETEC (16,6 %) fueron positivos para la combinación de genes que codifican STa/STb. El genotipo más complejo fue eltA/estII/east1/faeG/aidA (N = 1), seguido por eltA/estII/east1/faeG (N = 1), estI/estII/fedA/aidA (N = 5), eltA/estI/estII/east1 (N = 1), eltA/estII/east1 (N = 1), east1/aidA (N = 7). El gen que codifica la enterotoxina enteroagregativa termoestable 1 (EAST1) se detectó en 16 cepas ETEC (36,4 %), pero solo en 7 fue este el único marcador de virulencia. Las 3 cepas aisladas a partir de cerdos con ED se clasificaron como STEC porcinos y presentaron la combinación de genes stx2e/aidA. Entre los genes que codifican la expresión de adhesinas, el más frecuente fue el que codifica la expresión de la adhesina fimbrial F18 (40,4 %), seguido por el gen que codifica F4 (4,2 %). Todos los aislamientos estudiados fueron negativos al investigar los genes que codifican las fimbrias F5, F6, F41 y las adhesinas afimbriales intimina y Paa. En la Tabla 2 se presentan los diferentes genotipos encontrados en cada granja. Estos resultados coincidieron con lo encontrado en EE.UU. asociados a animales con DPD (14). Al igual que en el presente trabajo, Matiuzzi et al. (8) hallaron un mayor porcentaje de cepas aisladas de animales con DPD portadoras del gen que codifica las toxinas STb (68,1 %), seguido por el gen que codifica STa (61,4 %). En un estudio previo realizado en la Argentina, se detectó estI solo en el 21,3 % de los aislamientos (13). En el presente trabajo se detectó el gen eltA (toxina LT) en el 9 % de los aislamientos analizados, un porcentaje menor que el descrito en otros estudios (8, 13). En este trabajo fue posible identificar el gen que codifica la expresión de la adhesina AIDA-I en 11 de los 44 aislamientos provenientes de animales con DPD (25 %) y en 3 aislamientos recuperados de animales con ED. En este último caso, se lo detectó como único factor de colonización. Niewerth et al. (11) demostraron la importancia de esta adhesina no fimbrial en asociación con F18 y Stx2e en la patogénesis de la DPD y de la ED. Respecto de la producción de la EAST1, se observó la presencia del gen que la codifica en diferentes combinaciones

ETEC y STEC en cerdos con diarrea posdestete y enfermedad de los edemas

Tabla 1. Genes analizados y secuencias de los oligonucleótidos cebadores utilizados para la caracterización de los aislamientos ETEC y STEC recuperados de cerdos con DPD y ED Tamaño del fragmento amplificado (pb)

Referencia

GGTGATTTCAATGGTTCG ATTGCTACGTTCAGCGGAGCG

764

F5-Fw F5-Rv

TGGGACTACCAATGCTTCTG TATCCACCATTAGACGGAGC

450

fasA

F6-Fw F6-Rw

TCTGCTCTTAAAGCTACTGG AACTCCACCGTTTGTATCAG

333

fedA

F18-Fw F18-Rv

GTGAAAAGACTAGTTTATTTC CTTGTAAGTAACCGCGTAAGC

510

F41

F41-Fw F41-Rv

GAGGGACTTTCATCTTTTAG AGTCCATTCCATTTATAGGC

431

paa

Paa-Fw Paa-Rv

ATGAGGAAACATAATGGCAGG TCTGGTCAGGTCGTCAATAC

350

aidA

AIDA-I-F AIDA-I-R

ACAGTATCATATGGAGCCA TGTGCGCCAGAACTATTA

585

eae

EAE-Fw EAE-Rv

CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC CCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG

864

eltA

LTA-1 LTA-2

GGCGACAGATTATACCGTGC CCGAATTCTGTTATATATGTC

696

estI

STa1 STa2

TCTTTCCCCTCTTTTAGTCAG ACAGGCAGGATTACAACAAAG

166

estII

STb1 STb2

ATCGCATTTCTTCTTGCATC GGGCGCCAAAGCATGCTCC

172

east1

East11a East11b

CCATCAACACAGTATATCCGA GGTCGCGAGTGACGGCTTTGT

111

stx2e

Stx2eA Stx2eB

CCTTAACTAAAAGGAATATA CTGGTGGTGTATGATTAATA

230

Gen

Nombre

Secuencia (5´-3´)

faeG

F4-Fw F4-Rv

fanC

DPD: diarrea posdestete; ED: enfermedad de los edemas

Tabla 2. Genotipos de los aislamientos ETEC y STEC recuperados de cerdos con DPD o ED. Granja

Localización

Cuadro clínico

Animales analizados

Genotipo

Aislamientos

Buenos Aires

DPD

stx2e

estI/estII/fedA/aidA estI/estII/fedA

3 8

Santa Fe

DPD

estI/estII/fedA/aidA estI/estII/fedA estI/estII

2 1 7

Santa Fe

DPD

eltA/estII/east1/faeG/aidA eltA/estII/east1/faeG

1 1

Santa Fe

DPD

eltA/estI/estII/east1 eltA/estII/east1

1 1

Córdoba

DPD

east1/aidA east1

5 7

Córdoba

DPD

estI/estII/fedA

Buenos Aires

stx2e/aidA

DPD: diarrea posdestete; ED: enfermedad de los edemas

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 85-88

(Tabla 2). Si bien está en discusión su valor cuando se presenta solo, en este estudio se lo observó asociado a los genes que codifican la toxina STb o el factor de adherencia AIDA-I en 9 cepas, por lo que podría considerarse como importante marcador de virulencia de E. coli asociado a DPD. Es interesante mencionar que en estudios previos se demostró asociación de F4/LT/STa y STb/EAST1 con casos de DPD (11, 12). Los datos obtenidos aportan nueva información sobre los patotipos y genotipos de E. coli asociados a DPD y ED en nuestro país, y constituye el primer relevamiento de factores de colonización fimbriales y no fimbriales. El reconocimiento de los factores de virulencia y adherencia de las cepas de E. coli toxigénicas asociadas a DPD y ED en granjas de cría intensiva de cerdos permitirá implementar medidas de prevención tendientes a controlar el estado sanitario de las piaras. En ese contexto sería de gran valor el desarrollo de vacunas que generen anticuerpos contra las adhesinas de las cepas de E. coli productoras de DPD y de ED prevalentes en la Argentina. Agradecimientos: Los autores agradecen al Dr. Gustavo Zielinski y a la Dra. Nora Lía Padola por la remisión de cepas de referencia. Trabajo parcialmente financiado con subsidio PICT 2005 N.º de resolución BID 1728 OC/AR PICT 200533987 Resolución Directorio ANPCyT 217/2006 otorgado por la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Ministerio de Ciencia, Tecnología e Innovación Productiva de la Nación y subsidio perteneciente al Proyecto de Incentivos a Docentes-Investigadores V184, otorgado por la Universidad Nacional de La Plata.

BIBLIOGRAFÍA 1. Blanco M, Blanco J, González E, Mora A, Jansen W, Gomes T, Zerbini F, Yano T, Pestana de Castro AF, Blanco J. Genes coding for enterotoxins and verotoxins in porcine Escherichia coli strains belonging to different O:K:H serotypes: relationship with toxic phenotypes. J Clin Microbiol 1997; 35: 2958-63. 2. Chapman T, Wu X, Barchia I, Bettelheim K, Driesen S, Trott D, Wilson M, Chin JJ. Comparison of virulence gene profiles of Escherichia coli strains isolated from healthy and diarrheic swine. Appl Environ Microbiol 2006; 72: 4782-95. 3. Dubreuil J. STb and AIDA-I: The missing link? Critical Rev Microbiol 2010; 1-9.

4. Dubreuil J. Escherichia coli STb toxin and colibacillosis: knowing is half the battle. FEMS Microbiol Lett 2008; 278: 137-45. 5. Fairbrother J, Nadeau E, Gyles C. Escherichia coli in postweaning diarrhea in pigs: an update on bacterial types, pathogenesis, and prevention strategies. Anim Health Res Rev 2005; 6: 17-39. 6. Karch H, Bohm H, Schmidt H, Gunzer F, Aleksic S, Heesemann J. Clonal structure and pathogenicity of Shigalike-producing, sorbitol-fermenting Escherichia coli O157:H-. J Clin Microbiol 1993; 31: 1200-5. 7. Leclerc S, Boerlin P, Gyles C, Dubreuil J, Mourez M, Fairbrother J, Harel J. paa, originally identified in attaching and effacing Escherichia coli, is also associated with enterotoxigenic E. coli. Res Microbiol 2007; 158: 97-104. 8. Matiuzzi da Costa M, Sá e Silva M, Spricigo D, Mazzini Witt N, Beutinger Marchioro S, Kolling L, Palmira A, de Vargas C. Caracterização epidemiológica, molecular e perfil de resistência aos antimicrobianos de Escherichia coli isoladas de criatórios suínos do sul do Brasil. Pesq Vet Bras 2006; 26: 5-8. 9. Moredo F, Vigo G, Sanz M, Aguirre J, Armocida A, Perfumo C. Caracterización enterotoxigénica y estudio de sensibilidad antimicrobiana in vitro de cepas de Escherichia coli aisladas de cerdos con cuadros clínicos de diarrea pre y posdestete. Analecta Vet 1998; 18: 29-34. 10. Ngeleka M, Pritchard J, Appleyard G, Middleton D, Fairbrother J. Isolation and association of Escherichia coli AIDA-I/STb, rather than EAST1 pathotype, with diarrhea in piglets and antibiotic sensitivity of isolates. J Vet Diagn Invest 2003; 15: 242-52. 11. Niewerth U, Frey A, Voss T, Le Bouguénec C, Baljer G, Franke S, Schmidt A. The AIDA autotransporter system is associated with F18 and Stx2e in Escherichia coli isolates from pigs diagnosed with edema disease and postweaning diarrhea. Clin Diag Lab Inmunol 2001; 8: 143-9. 12. Osek J. Detection of the enteroaggregative Escherichia coli heat-stable enterotoxin 1 (EAST1) gene and its relationship with fimbrial and enterotoxin markers in E. coli isolates from pigs with diarrhea. Vet Microbiol 2003; 91: 65-72. 13. Parma A, Sanz M, Viñas M, Cicuta M, Blanco J, Boehringer S, Vena MM, Roibon WR, Benitez MC, Blanco J, Blanco M. Toxigenic Escherichia coli isolated from pigs in Argentina. Vet Microbiol 2000; 72: 269-76. 14. Zhang W, Zhao M, Ruesch L, Omot A, Francis D. Prevalence of virulence genes in Escherichia coli strains recently isolated from young pigs with diarrhea in the US. Vet Microbiol 2007; 123: 145-52.

Recibido: 16/8/2011- Aceptado: 24/4/2012

ISSN 0325-7541

CHROMagar KPC INFORME BREVE

89 Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 89-93

CHROMagar KPC. Comparación con el método propuesto por los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC, EE.UU.) para el estudio de portación rectal y evaluación de falsos positivos LAURA ERRECALDE*, SANDRA COGUT, MARIANA ERBÍN, LILIANA JORDÁ VARGAS, EUGENIA CATTANI, TAMARA POSSE, SILVIA TUTZER, RICARDO HERMES, SARA KAUFMAN Hospital Juan A. Fernández. Cerviño 3356 (1425) Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. * Correspondencia. E-mail: lerrecalde@yahoo.com.ar

RESUMEN Se cultivaron 81 hisopados rectales en el medio CHROMagar KPC y por el método del CDC. Fueron positivos para Klebsiella pneumoniae KPC en CHROMagar KPC, 9/81 y 6/81 con el método del CDC. El medio CHROMagar KPC tuvo dos falsos positivos: 1 K. pneumoniae y 1 Acinetobacter sp. Los falsos positivos del método CDC fueron: 25 Acinetobacter spp., 2 Escherichia coli y 4 K. pneumoniae. El empleo del medio CHROMagar KPC resultó ser un método con mayor recuperación de aislamientos productores de KPC y menos falsos positivos que el método del CDC. Para evaluar los falsos positivos en el medio CHROMagar KPC se cultivaron 1247 hisopados rectales. Se obtuvieron 1021 negativos, 171 K. pneumoniae KPC y 55 (4,4 %) falsos positivos. Debido al desarrollo de falsos positivos en el medio CHROMagar KPC, se debe confirmar por caracterización fenotípica la presencia de KPC en las bacterias aisladas. Palabras clave: CHROMagar KPC, KPC, vigilancia KPC

ABSTRACT CHROMagar KPC. Comparison with the method proposed by the Centers for Disease Control and Prevention (CDC, USA) for rectal screening and evaluation of false positive results. Eighty one rectal swabs (RS) were cultured on CHROMagar KPC and the CDC method. Of the 81 samples, 9 were positive for KPC-producing Klebsiella pneumoniae on CHROMagar KPC, and 6 for the CDC method. CHROMagar KPC had two false positive (FP) results: 1 K. pneumoniae and 1 Acinetobacter sp. FP results on the CDC method were: 25 Acinetobacter spp., 2 Escherichia coli and 4 K. pneumoniae. CHROMagar KPC yielded a better recovery of KPCproducing bacteria and less FP results than CDC method. In order to evaluate FP results on CHROMagar KPC, 1247 RS were cultured and yielded 1021 negatives, 171 KPC-producing K. pneumoniae and 55 FP (4.4 %). Because of the FP results growing on CHROMagar KPC, KPC must be phenotypically confirmed in the bacteria isolated. Key words: CHROMagar KPC, KPC, screening KPC

La resistencia a carbapenems en la familia Enterobacteriaceae puede deberse a dos mecanismos principales: 1) Modificaciones en la permeabilidad de la membrana externa, asociadas con β-lactamasas de espectro extendido (BLEE) o hiperproducción de AmpC. 2) Producción de β-lactamasas con actividad hidrolítica específica sobre los carbapenems, llamadas carbapenemasas (8). El primer mecanismo no parece tener potencial epidémico, probablemente debido a que el microorganismo posee una capacidad reducida por haber perdido su porina mayor, mientras que las cepas que poseen carbapenemasas suelen ser altamente epidémicas (14). La enzima KPC (de Klebsiella pneumoniae carbapenemasa) es una serincarbapenemasa que pertenece

a la clase A de Ambler y al grupo 2f de Karen Bush, y es una de las más frecuentemente aisladas, no solo en K. pneumoniae sino también en otros géneros y especies. Tiene la capacidad de hidrolizar a todos los antibióticos β-lactámicos incluyendo sus combinaciones con inhibidores. Está localizada en elementos genéticos móviles/movilizables (transposones/plásmidos), lo que le otorga un gran potencial de diseminación. Las resistencias asociadas que acarrean estos plásmidos producen cepas con resistencia a la mayoría de las familias de antibióticos, lo que deja muy pocas alternativas de tratamiento. Una gran proporción de los brotes descritos en el mundo se deben a K. pneumoniae ST258 (8). En nuestro país, el primer aislamiento de KPC se produce a fines del año 2006 en K. pneumoniae y

Citrobacter freundii (10). Sin embargo, a partir de agosto de 2009 se produjo un incremento de seis veces en el número de aislamientos de blaKPC-2, 94 % de los cuales fueron ST258 (5). Para limitar la diseminación de estas cepas epidémicas dentro del ámbito hospitalario, el Centers for Disease Control and Prevention (CDC) propone la detección temprana de por tadores gastrointestinales por un método de vigilancia activa y la implementación de medidas de control de infecciones. Estas medidas incluyen el aislamiento de contacto de los pacientes infectados o colonizados, la intensificación del lavado de manos y el establecimiento de protocolos de limpieza, entre otras (1). En nuestro hospital, el primer aislamiento de K. pneumoniae portadora de KPC se obtuvo en abril de 2010 de un paciente con infección urinaria (4). El aislamiento fue caracterizado en el Centro Nacional de Referencia como ST258 y portador del gen blaKPC-2. Además, este aislamiento presentó identidad clonal con otros aislamientos de K. pneumoniae portadores de KPC aislados en 16 hospitales del área metropolitana de Buenos Aires (12). Durante el mes de junio de 2010 se producen dos nuevos aislamientos confirmados blaKPC-2 y, ante la sospecha de transmisión de la bacteria entre pacientes dentro del hospital, se inició la vigilancia activa de portadores intestinales en las unidades de cuidados intensivos y clínica médica. Para esta búsqueda fue necesario elegir un método de screening rápido, sensible y específico. El medio CHROMagar KPC (CHROM) constituye un método de screening para detectar la producción de KPC altamente sensible y específico (7, 9, 13).

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 89-93

Consiste en un agar cromogénico con el agregado de un suplemento que inhibe el desarrollo de bacterias gram positivas y negativas sensibles a los carbapenems. Las bacterias crecen de distintos colores de acuerdo con sus propiedades enzimáticas específicas. Permite informar resultados negativos en 24 h y positivos en 48 h. También existen otros métodos para detectar microorganismos que producen KPC, entre ellos el propuesto por el CDC (2, 6). Este último es un método en dos etapas, la primera utiliza un enriquecimiento en caldo y la segunda un medio selectivo y diferencial como el agar EMB de Levine. Permite informar resultados negativos en 48 h y positivos en 72 h. Los objetivos de nuestro trabajo fueron: 1) Comparar el desempeño del medio CHROM con el método propuesto por el CDC para el estudio de colonización rectal. 2) Evaluar el desarrollo de falsos positivos (FP) en el medio CHROM. En una primera instancia (10/6 al 17/6/2010), los hisopados rectales se procesaron según las dos metodologías, para lo cual se tomaron dos hisopados rectales por paciente (n = 81). Un hisopado rectal se cultivó en CHROM preparado según las instrucciones del fabricante. Se incubó 24 h a 35 °C en atmósfera aeróbica y se estudiaron todas las colonias positivas que podían indicar presencia de carbapenemasas: colonias azul metálico (Klebsiella, Citrobacter y Enterobacter) y colonias rosadas (Escherichia coli) (Figura 1). Estas se tipificaron mediante métodos convencionales y se realizó la prueba de sinergia entre carbapenems (imipenem, meropenem

Figura 1. Aspecto de las colonias que desarrollaron en CHROMagar KPC. A) K. pneumoniae KPC, B) E. coli KPC

CHROMagar KPC

y ertapenem 10 µg) y el ácido 3-aminofenilborónico (APB 300 µg, Britania) para la búsqueda de serincarbapenemasas de clase A, y con EDTA/SMA (740/2000 µg, Britania) para la búsqueda de metalo β-lactamasas. La distancia entre los discos se calculó de la siguiente manera: radio del carbapenem + radio del APB + 5 mm. El disco de EDTA se ensayó a 1,5 cm de centro a centro de los discos del carbapenem. Se consideraron productores de KPC aquellos aislamientos que presentaron sinergia entre el APB y los carbapenems. Los halos de inhibición para los carbapenems se interpretaron según las normas del CLSI (3). En las bacterias productoras de AmpC se utilizaron tabletas diagnósticas (Rosco Diagnostica A/S, Taastrup, Dinamarca) con meropenem (10 µg), meropenem + APB y meropenem + cloxacilina para descartar la presencia de carbapenemasas. El APB tiene la doble capacidad de inhibir a las carbapenemasas de clase A y también a las β-lactamasas AmpC, mientras que la cloxacilina inhibe solamente a las AmpC. Para interpretar los resultados se utilizaron los puntos de corte sugeridos por el fabricante. El segundo hisopado rectal se cultivó según el método propuesto por el CDC. Se suspendió el hisopo en 5 ml de caldo tripteína de soja con el agregado de un disco de ertapenem o meropenem de 10 µg y se incubó el caldo a 35 °C en atmósfera aeróbica durante 24 h. Luego se repicaron 100 µl del caldo a agar EMB de Levine, se incubó a 35 °C en atmósfera aeróbica durante 24 h. Se estudiaron las colonias mucosas fermentadoras de lactosa mediante tipificación por métodos convencionales y búsqueda de carbapenemasas de igual manera que en el paso anterior. Se consideró resultado positivo el desarrollo de bacterias productoras de carbapenemasa por el método fenotípico. Se consideró resultado negativo la ausencia de desarrollo bacteriano. Se consideró resultado FP toda vez que se obtuvieron colonias de color azul metálico o de color rosado en el medio CHROM, o colonias fermentadoras de lactosa con el método del CDC, en las que no se detectó carbapenemasa por el método fenotípico. Se comparó la recuperación de enterobacterias productoras de carbapenemasa y de FP por ambos métodos. Abarcando un período de mayor extensión (10/6/ 2010 al 31/5/2011), se realizó la evaluación de FP en el medio CHROM sobre un total de 1247 hisopados rectales (uno por paciente). Las bacterias que desarrollaron se estudiaron de la misma manera que en la etapa anterior. De los 81 hisopados rectales sembrados según

ambos métodos, 9 fueron positivos para K. pneumoniae (fenotipo probable KPC) en CHROM, mientras que solo 6 fueron positivos por el método del CDC. Los FP en CHROM correspondieron a los siguientes casos: 1 K. pneumoniae resistente a carbapenems (probable BLEE e impermeabilidad) y 1 Acinetobacter sp. Por el método del CDC se obtuvieron los siguientes FP: 4 K. pneumoniae, 3 sensibles y 1 resistente a carbapenems (probable BLEE e impermeabilidad), 25 Acinetobacter spp. y 2 E. coli sensibles a carbapenems. Todos los aislamientos sensibles a carbapenems presentaron halos de inhibición > 23 mm para imipenem, meropenem y er tapenem. Se puede observar el desempeño comparativo de ambos métodos en la Tabla 1. De 1247 hisopados rectales evaluados en el medio CHROM, 1021 (81,9 %) fueron negativos, 171 (13,7 %) fueron positivos para K. pneumoniae APB (+) (probable KPC) (2 muestras positivas en cultivo mixto con E. coli APB +) y 55 (4,4 %) resultaron FP. Los FP se distribuyeron como sigue: 38 K. pneumoniae resistentes a carbapenems (probable BLEE e impermeabilidad), 15 Acinetobacter spp., 1 E. coli resistente a carbapenems (probable hiperexpresión de AmpC e impermeabilidad) y 1 Enterobacter sp. resistente a carbapenems (probable AmpC desreprimida e impermeabilidad). Todos los FP presentaron resistencia al ertapenem, mientras que respecto del imipenem y meropenem fueron sensibles, intermedios o resistentes. Para realizar la vigilancia de portación intestinal se compararon dos metodologías: la propuesta por el CDC y el agar cromogénico CHROMagar KPC. El método propuesto por el CDC tiene la ventaja de ser accesible para cualquier laboratorio de microbiología y tener bajo costo. La concentración del carbapenem en el caldo sería de 2 µg/ml, si se considera que todo el antibiótico eluye del disco. Como desventajas, la técnica requiere dos días de incubación. En la Tabla 1 podemos observar que el medio CHROM detectó 3 K. pneumoniae KPC que no fueron detectadas por el método del CDC. Ambas metodologías tuvieron desarrollo de FP, pero a diferencia de lo que ocurrió con el sistema CHROM, donde solo desarrollaron bacterias resistentes a carbapenems, por el método del CDC se aislaron 2 E. coli y 3 K. pneumoniae sensibles a carbapenems. Además, por el método del CDC se obtuvo desarrollo de Acinetobacter spp. en 25 muestras. Si bien Acinetobacter no forma colonias fermentadoras de lactosa, su desarrollo dificultó la observación de otras colonias, de modo que este método resulta muy engorroso y exige reaislar, con

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 89-93

Tabla 1. Desempeño comparativo del CHROMagar KPC y del método propuesto por el CDC N.° de hisopados n = 81

CHROMagar KPC

Positivo

Negativo

K. pneumoniae sensible a carbapenems

Negativo

Acinetobacter spp.

Negativo

Acinetobacter sp. + E. coli sensible a carbapenems

K. pneumoniae resistente a carbapenems

Acinetobacter sp.

Acinetobacter sp. + E. coli sensible a carbapenems

la consiguiente demora del resultado en un día más (96 h). Entendemos que el intenso desarrollo de bacterias con el método del CDC se debe a que el caldo TS actúa como multiplicador, tanto de cepas sensibles como resistentes. En la publicación donde originalmente se presenta este método, se señala que el antibiótico no eluye al 100 %, dado que aísla cepas con CIM de hasta 0,25 µg/ml (6). La recuperación de FP en el medio CHROM fue de 55/1247 hisopados rectales (4,4 %); 38/55 fueron K. pneumoniae resistentes a carbapenems (probable BLEE e impermeabilidad). Es importante distinguir estas cepas de las productoras de KPC, ya que estas últimas requieren aislamiento del paciente, mientras que en el caso de cepas con BLEE e impermeabilidad esto no es necesario. También obtuvimos un aislamiento de E. coli y uno de Enterobacter cloacae con probable AmpC desreprimida (o hiperexpresión de AmpC en E. coli) e impermeabilidad. Con ambos microorganismos resultó útil en la detección el uso de las tabletas diagnósticas que contienen meropenem + cloxacilina como inhibidor exclusivo de AmpC. En ambos casos, al igual que en presencia de cepas de K. pneumoniae no productoras de carbapenemasa, no es necesario aislar al paciente. No fueron calculadas la sensibilidad y la especificidad del método, por carecer de un método de referencia, pero el porcentaje de K. pneumoniae con BLEE e impermeabilidad es mayor que el comunicado por otros autores (13), lo que sugiere que este sería un método menos específico. Probablemente esto se deba a que en nuestro país estas cepas existen en alta proporción (aproximadamente 14 % de 6700 cepas nosocomiales examinadas por la red Whonet en 2007) (11).

Método del CDC

Cabe destacar que entre los hisopados rectales positivos, en dos muestras se obtuvo E. coli productora de KPC (confirmada por el Centro Nacional de Referencia) en cultivo mixto con K. pneumoniae KPC. Hasta el momento no se aislaron en materiales clínicos distintos a los hisopados de este estudio (Errecalde L, comunicación personal). Las conclusiones de nuestro trabajo son: a) Comparando el medio CHROMagar KPC con el método del CDC, el primero resultó ser un método más rápido, con mayor recuperación de aislamientos productores de KPC y menor detección de FP que el segundo. b) Debido a las características epidemiológicas de la Argentina, se observa el desarrollo en el CHROMagar KPC de cepas resistentes a carbapenems por mecanismos no enzimáticos, que no requieren poner al paciente en aislamiento de contacto. Por este motivo es importante caracterizar fenotípicamente a todas las bacterias que desarrollan en este medio. Agradecimientos: al Servicio de Antimicrobianos del INEIANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” por la caracterización molecular de las cepas. A la Dra. Liliana Guelfand por la lectura crítica de este manuscrito. Al personal médico y de enfermería del hospital Juan A. Fernández, por la colaboración en la toma de muestras. A la enfermera en control de infecciones Lic. Carmen Ramallo.

BIBLIOGRAFÍA 1. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Guidance for control of infections with carbapenemresistant or carbapenemase-producing Enterobacteriaceae in acute care facilities. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2009; 58: 256-60.

CHROMagar KPC

2. Centers for Disease Control and Prevention (CDC) . 17/3/2009. Laboratory protocol for detection of carbapenem-resistant or carbapenemase-producing Klebsiella spp. and E. coli from rectal swabs. http//www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/ar/ Klebsiella_or_Ecoli.pdf. 3. Clinical and Laboratory Standards Institute. Disk diffusion. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; 20th Informational Supplement Update, 2010; M100S20 U. CLSI, PA, EE.UU. 4. Errecalde L, Tutzer S, Jordá Vargas L, Cogut S, Cattani E, Elbert G, Pasterán F, Corso A, Kaufman S. Klebsiella pneumoniae productora de serincarbapenemasa tipo KPC (KPKPC): comunicación de 4 aislamientos. Evaluación del CHROMagar KPC (CHROM) para estudios de portación rectal. XII Congreso Argentino de Microbiología. VI Congreso de la Sociedad Argentina de Bacteriología, Micología y Parasitología Clínica-SADEBAC. I Congreso de Microbiología Agrícola y Ambiental-DiMAyA, Presentación oral 27471. Rev Argent Microbiol 2010; 42 Supl 1: 8. 5. Gomez S, Pasterán F, Faccone D, Tijet N, Rapoport M, Lucero C, Lastovetska O, Albornoz E, Galas M, KPC group, Melano R, Corso A, Petroni A. Clonal dissemination of Klebsiella pneumoniae ST258 harbouring KPC-2 in Argentina. Clin Microbiol Infect 2011; 17: 1520-4. 6. Landman D, Salvani J, Bratu S, Quale J. Evaluation of techniques for detection of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae in stool surveillance cultures. J Clin Microbiol 2005; 43: 5639-41. 7. Moran Gilad J, Carmeli Y, Schwartz D, Navon-Venezia S. Laboratory evaluation of the CHROMagar KPC medium for identification of carbapenem-nonsusceptible Enterobacteriaceae. Diagn Microbiol Infect Dis 2011; 70: 565-7. 8. Nordmann P, Cuzon G, Naas T. The real threat of Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing bacteria. Lancet Infect Dis 2009; 9: 228-36.

9. Panagea T, Galani I, Souli M, Adamou P, Antoniadou A, Giamarellou H. Evaluation of CHROMagar KPC for the detection of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae in rectal surveillance cultures. Int J Antimicrob Agents 2011; 37: 124-8. 10. Pasterán F, Otaegui L, Guerriero L, Radice G, Maggiora R, Rapoport M, Faccone D, Di Martino A, Galas M. Klebsiella pneumoniae carbapenemase-2, Buenos Aires, Argentina. Emerg Infect Dis 2008; 14: 1178-80. 11. Pasterán F, Mendez T, Guerriero L, Rapoport M, Corso A. Sensitive screening tests for suspected class A carbapenemase production in species of Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol 2009; 47: 1631-9. 12. Pasterán F, Lucero C, Rapoport M, Albornoz E, Gómez S, Faccone D, Petroni A, Grupo KPC, Corso A. Emergencia y diseminación en múltiples hospitales de Argentina del clon pandémico ST258 de Klebsiella pneumoniae productor de KPC: ¿camino a la endemicidad? XII Congreso Argentino de Microbiología. VI Congreso de la Sociedad Argentina de Bacteriología, Micología y Parasitología Clínica-SADEBAC. I Congreso de Microbiología Agrícola y Ambiental-DiMAyA, Resúmen 27202. Rev Argent Microbiol 2010; 42 Supl 1: 153. 13. Samra Z, Bahar J, Madar-Shapiro L, Aziz N, Israel S, Bishara J. Evaluation of CHROMagar KPC for rapid detection of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol 2008; 46: 3110-1. 14. Schechner V, Straus-Robinson K, Schwartz D, Pfeffer I, Tarabeia J, Moskovich R, Chmelnitsky I, Schwaber M, Carmeli Y, Navon-Venezia S. Evaluation of PCR-based testing for surveillance of KPC-producing carbapenemresistant members of the Enterobacteriaceae family. J Clin Microbiol 2009; 47: 3261-5.

Recibido:25/10/2011- Aceptado:2/1/2012

ISSN 0325-7541

94 INFORME BREVE

Revista Revista Argentina Argentina de de Microbiología Microbiología (2012) (2012) 44: 44: 94-96 94-96

Two cases of urinary tract infection caused by Shiga toxin-producing Escherichia coli O157:H7 strains MARÍA DEL P. GADEA1, NATALIA DEZA2, MARÍA I. MOTA1,3, CAROLINA CARBONARI2, MITILA ROBATTO3, BEATRIZ D’ASTEK2, VICTORIA BALSEIRO1, CRISTINA BAZET3, EDUARDO RÜGNITZ 4, VALÉRIE LIVRELLI5, FELIPE SCHELOTTO1, MARTA RIVAS2, GUSTAVO VARELA1* 1

Departamento de Bacteriología y Virología, Facultad de Medicina, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay; Servicio Fisiopatogenia, INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”, Buenos Aires, Argentina; 3 Laboratorio de Patología Clínica. Facultad de Medicina, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay; 4 Departamento de Medicina Interna, Facultad de Medicina, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay; 5 Clermont Université, Université d’Auvergne, JE 2526, Clermont-Ferrand, France. * Correspondence. E-mail: gvarela@higiene.edu.uy

ABSTRACT STEC strains can infect extra-intestinal sites such as the human urinary tract and sometimes cause severe complications. We report two cases of urinary tract infection caused by STEC in two elderly women with comorbidities. Although both strains belonged to the O157:H7 serotype and carried genes associated with severe illness, none of the patients developed hemolytic uremic syndrome (HUS). These findings provide additional evidence for the presence of these agents in our country and in the region, and highlight the need to maintain an active surveillance system of HUS cases, placing special emphasis on the study of other sites of infection in patients with nondiarrheal HUS. Key words: E. coli O157:H7, STEC, urinary tract infection

RESUMEN Dos casos de infección del tracto urinario causados por cepas de Escherichia coli O157:H7 productoras de toxina Shiga. En los seres humanos, las cepas STEC pueden producir infección en sitios extraintestinales, como el tracto urinario, y causar complicaciones graves. Comunicamos dos casos de infección urinaria por STEC en dos mujeres ancianas con comorbilidades. Aunque ambas cepas correspondieron al serotipo O157:H7 y portaban los genes asociados con enfermedad grave, ninguna de las pacientes desarrolló síndrome urémico hemolítico (SUH). Estos hallazgos constituyen una evidencia adicional de la presencia de estos agentes en nuestro país y en la región, y destacan la necesidad de mantener un sistema activo de vigilancia, con especial énfasis en el estudio de otros sitios de infección en pacientes que presentan SUH no asociado a diarrea. Palabras clave: E. coli O157:H7, STEC, infección del tracto urinario

Shiga toxin (Stx)-producing Escherichia coli (STEC) can cause diarrhea, hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome (HUS). Post-enteric HUS, a life-threatening complication, is characterized by thrombocytopenia, microangiopathic hemolytic anemia and acute renal failure. Moreover, STEC strains can infect the human urinary tract and also cause non-diarrheal HUS (1, 6). The ability of STEC strains to cause severe disease in humans is related to the capacity to secrete Stx1, Stx2, and/or variant toxins (1), encoded by lysogenic bacteriophages. Another virulence factor of STEC strains is a 94-kDa outer membrane protein, called intimin. It is

M.P.G., N.D. and M.I.M. contributed equally to this work.

encoded by an eae gene located within a 34-kb chromosomal pathogenicity island termed locus of enterocyte effacement (LEE). This locus is associated with intimate adherence to epithelial cells, initiation of host signal transduction pathways and formation of attaching-and-effacing intestinal lesions (1). Some STEC strains also produce an enterohemorraghic hemolysin (EHEC-Hly), encoded by a large plasmid-borne (90-kb) ehxA gene, which has been associated with severe clinical disease in humans (1). In the present report we describe two cases of urinary tract infection (UTI) caused by STEC O157:H7 in adults who did not develop HUS.

E. coli O157:H7 in urinary tract infections

First case. An 84-year-old woman with a medical history of hypertension, vaginal prolapse and a stage 3 chronic kidney disease was admitted to hospital on July 5, 2010 with fever and anorexia. She had watery diarrhea during 48 hours prior to admission, without fever, nausea or vomiting. Diuresis was maintained. Laboratory tests yielded the following results: serum potassium 8.5 mEq/l (normal range 3.5-5.5 mEq/l), azotemia 1.65 g/l (normal range 0.2-0.6 g/l), creatinine 1.78 mg/dl (normal range 0.2-0.6) mg/dl, and hemoglobin 9.6 mg/dl (normal range 12-16 mg/dl). The blood cell count, peripheral blood smear and liver function tests were normal. The urine analysis showed some polymorphonuclear leukocytes. The clean-catch midstream urine specimen yielded a pure culture with a count of 105 CFU/ml. The patient received 3 g of ceftriaxone i/v per day, with good clinical outcome. The isolate (IH1) was identified as E. coli O157 (99 % probability) using the Vitek 2 Compact System (bioMérieux, Inc., Marcy l’Etoile, France) and was then sent to the Bacteriology and Virology Department-Institute of Hygiene, Universidad de la República, and to the National Reference Laboratory of Argentina, to complete its characterization. Second case. A 72-year-old woman with a medical history of urinary incontinence and repeated urinary infections, living in an elderly long term care facility located in the same town as that of the first patient, was admitted to hospital with symptoms of acute cystitis on October 25, 2010. In 2002, she had undergone total hysterectomy and bilateral anexectomy due to an ovarian mucinous cystadenoma. The urine analysis showed leukocytes, erythrocytes and 0.3 g/l proteinuria. The clean-catch midstream urine specimen yielded a pure culture with a count higher than 105 CFU/ml and the isolate (IH2) was identified as E. coli O157 (99 % probability) using the Vitek 2 Compact System. The patient received 15 mg/kg of cefuroxime axetil orally every 24 hours, with good clinical outcome. The strain was also submitted to the abovementioned laboratories to complete its characterization. Confirmation of isolates as E. coli was performed through biochemical tests and the serotyping was conducted using antisera provided by the Instituto Nacional de Producción de Biológicos - ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”. Antimicrobial susceptibility to amikacin, ampicillin, ceftriaxone, cefuroxime, ciprofloxacin, cloramphenicol,

colistin, gentamicin, nalidixic acid, nitrofurantoin, streptomycin, tetracycline, and trimethoprimsulfamethoxazole was established according to Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) guidelines (2). The stx1, stx2, and rfbO157 genes were detected by multiplex PCR as described by Leotta et al. (4), while the ehxA, eae, and fliCH7 genes were investigated according to previously described procedures (5). In order to determine Stx production, bacterial supernatant and periplasmic cell extracts were used on Vero cells for cytotoxicity assays (5). The orientation of the inver tible DNA element containing the fimA promoter was determined using a PCR-RFLP assay (7). Phage typing was performed by the method described by Khakhria et al. (3). Strain IH1 was characterized as E. coli O157:H7 harboring the stx1, eae-γ1, ehxA, flicH7 and fimA (phase off) genes of phage type (PT) 39. Meanwhile, the strain IH2 was characterized as E. coli O157:H7 harboring the stx1/stx2, eae-γ1, flicH7 and fimA (phase off) genes of PT40. The expression of toxicity in Vero cell assays, and of flagellar antigens by slide agglutination were demonstrated in both isolates. Both strains were susceptible to all antibiotics tested. Unusual cases of HUS involving patients presenting with UTI have been previously reported. The O-groups of the STEC strains involved were OX3, O5, O103, O138, O145, and O157 (6). However, this is the first report in Uruguay and in the region of extra intestinal STEC infections. It provides evidence of two episodes of UTI occurring in two elderly women with previous gynecologic and urinary disease, which are known predisposing factors favoring access and settlement of bacteria in the urinary tract. The first patient also had a previous watery diarrhea episode; however, no studies were conducted for detection of enteropathogens. Although both strains belonged to the O157:H7 serotype and carried genes associated with severe illness, neither patient developed HUS. Neither the origin and the reservoir of the recovered O157:H7 STEC strains, nor the epidemiologic link between both UTI cases could be established. Furthermore, both strains showed different stxgenotypes and PTs. We can assume that the STEC O157:H7 strains reached the urinary tract by the ascending route from the gastrointestinal tract. Both patients had known predisposing factors that favored it.

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 94-96

Between 2002 and 2008, we studied 36 children with clinical diagnoses of post-enteric HUS; in three cases we recovered STEC strains of serotypes O157:H7, O111:NM, and O26:H11, and in a fourth case a STEC O26:H11/O145:HNT co-infection was detected (8). However, there have been no previous local or regional reports of non-diarrheal HUS caused by STEC or UTI episodes due to this pathogen. The detection of STEC O157:H7 in urine infections provides additional evidence about the presence of this serotype in the region, reinforcing the importance of conducting active surveillance of gastrointestinal and urinary infections caused by STEC. Written consent: both patients have given their informed consent for the case reports to be published.

Acknowledgements: this work was partially supported by a grant from the Comisión Sectorial de Investigación Científica (CSIC)-UdelaR, Montevideo, Uruguay and by the ECOS-Sud Program (U08B02).

REFERENCES 1. Caprioli A, Morabito S, Brugère H, Oswald E. Enterohaemorrhagic Escherichia coli: emerging issues on virulence and modes of transmission. Vet Res 2005; 36: 289-311.

2. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; 21st Informational Supplement, 2011; M100-S21, Wayne, PA, EE.UU. 3. Khakhria R, Duck D, Lior H. Extended phage-typing scheme for Escherichia coli O157:H7. Epidemiol Infect 1990; 105: 511-20. 4. Leotta GA, Chinen I, Epszteyn S, Miliwebsky E, Melamed IC, Motter M, Ferrer M, Marey E, Rivas M. Validación de una técnica de PCR múltiple para la detección de Escherichia coli productor de toxina Shiga. Rev Argent Microbiol 2005; 37: 1-10. 5. Mora A, Blanco M, Blanco JE, Alonso MP, Dahbi G, Thompson-Carter F, Usera MA, Bartolomé R, Prats G, Blanco J. Phage types and genotypes of human and animal Shiga toxin-producing Escherichia coli O157:H7 in Spain: identification of two predominating phage types (PT2 and PT8). J Clin Microbiol 2004; 42: 4007-15. 6. Starr M, Bennett-Wood V, Bigham AK, de Koning-Ward TF, Bordun AM, Lightfoot D, Bettelheim KA, Jones CL, Robins Browne RM. Hemolytic-uremic syndrome following urinary tract infection with enterohemorrhagic Escherichia coli: case report and review. Clin Infect Dis 1998; 27: 310-5. 7. Toma C, Nakasone N, Miliwebsky E, Higa N, Rivas M, Suzuki T. Differential adherence of Shiga toxin-producing Escherichia coli harboring saa to epithelial cells. Int J Med Microbiol 2007; 298: 571-8. 8. Varela G, Chinen I, Gadea P, Miliwebsky E, Mota MI, González S, González G, Gugliada MJ, Carbonari CC, Algorta G, Bernadá M, Sabelli R, Pardo L, Rivas M, Schelotto F. Detection and characterization of Shiga toxin-producing Escherichia coli from clinical cases and food in Uruguay. Rev Argent Microbiol 2008; 40: 93-100.

Recibido: 29/11/2011 - Aceptado: 7/5/2012

ISSN 0325-7541

Diagnóstico de Mansonella ozzardi por la técnica de PCR INFORME BREVE

97 Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 97-100

Aporte de la técnica de PCR en el diagnóstico de Mansonella ozzardi en zonas endémicas de la Argentina MARÍA F. DEGESE*, MARTA G. CABRERA, SILVIO J. KRIVOKAPICH, LUCIA E. IRAZU, MARCELO A. RODRÍGUEZ, EDUARDO A. GUARNERA Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud “Dr. Carlos G. Malbrán”, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, Departamento de Parasitología. Av. Vélez Sarsfield 563 (1281) Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. *Correspondencia. E-mail: mfdegese@anlis.gov.ar

RESUMEN Mansonella ozzardi es un nematode parásito tisular, agente etiológico de mansonellosis en casi la totalidad de los países latinoamericanos. En Argentina la mansonellosis ha sido descrita a lo largo de la región de las yungas. Su diagnóstico microscópico puede dar resultados falsos negativos en microfilaremias bajas. El objetivo del presente estudio fue optimizar su diagnóstico molecular y comparar los resultados con los obtenidos mediante las pruebas microscópicas de Knott, de gota gruesa y de extendido hemático fino, en 92 muestras de sangre de pacientes de zona endémica. La técnica de PCR seguida de la secuenciación del producto amplificado presentó una sensibilidad del 100 % frente al método de Knott, considerado como referencia, e incluso permitió identificar 7 casos más de la parasitosis. Palabras clave: Mansonella ozzardi, diagnóstico, PCR, Argentina

ABSTRACT Contribution of the PCR assay to the diagnosis of Mansonella ozzardi in endemic areas of Argentina. Mansonella ozzardi is a tissue-dwelling parasitic nematode, the causative agent of mansonelliasis in almost all Latin American countries. It has been described along the Argentine Yungas region. The microscopic diagnosis can yield false-negative test results at low microfilaremia levels. The aim of this study was to optimize the molecular diagnostic technique and compare it with the Knott’s method and standard blood smear procedures (thin blood films and thick smears) in 92 blood samples of individuals from an endemic area. The PCR technique followed by the sequencing of the amplified product yielded 100 % sensitivity compared to the Knott’s test, which is considered a reference method. Seven more cases of this parasitosis could only be identified with the molecular technique. Key words: Mansonella ozzardi, diagnosis, PCR, Argentina

Mansonella ozzardi es un nematode filárico, agente etiológico de mansonellosis en casi la totalidad de los países latinoamericanos. Esta afección es transmitida por insectos dípteros hematófagos de los géneros Culicoides y Simulium. Los parásitos adultos, de sexo separado, miden de 3 a 7 cm y se localizan en los plexos mesentéricos; desde allí las hembras fecundadas depositan las microfilarias, de aproximadamente 200 micrones de longitud, en la sangre y, en menor número, en el tejido celular subcutáneo (3). Las microfilarias humanas fueron descritas en la Argentina por primera vez en 1913 por Biglieri y Aráoz, en la provincia de Tucumán (2), tras un relevamiento del índice malárico en la región. Estos investigadores consideraron que se trataba de una nueva especie a la que denominaron Microfilaria tucumana. Estudios posteriores revelaron la existencia de M. ozzardi a lo largo de toda la nuboselva tucumano-oranense o

región de las yungas (10). El vector identificado en esta zona es el Culicoides lahillei (5). No se conoce una enfermedad definida atribuible a esta parasitosis. Se han descrito casos aislados con adenopatías, linfoedemas, artralgias y mialgias (3) y, en estudios recientes, ha sido asociada a la presencia de lesiones oculares (4). Tradicionalmente, el diagnóstico se realiza a través de la observación de las microfilarias al microscopio óptico, en sangre capilar o venosa, por medio de diversos métodos, entre ellos el examen directo de la sangre o gota fresca, el examen de extendidos hemáticos en capa fina y gota gruesa teñidos con Giemsa (EF y GG, respectivamente), el método de Knott (KNOTT) y la filtración por membrana de la sangre (FM). Los tres últimos son utilizados como métodos de concentración. Eventualmente, el diagnóstico de la mansonellosis constituye un hallazgo incidental cuando se realizan

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 97-100

exámenes hematológicos de rutina o durante la búsqueda de otras parasitosis en extendidos sanguíneos, debido a la falta de entidad clínica. Aun cuando el método microscópico es práctico, económico y permite identificar la especie, requiere de un observador experimentado y puede dar resultados falsos negativos en pacientes con microfilaremia baja. En un estudio reciente realizado en Brasil (11), la técnica de PCR demostró mayor sensibilidad que la FM cuando ambos métodos fueron comparados con la técnica de GG. El objetivo del trabajo fue optimizar el diagnóstico de infección por M. ozzardi a través de una técnica de PCR y comparar los resultados con los alcanzados mediante técnicas de microscopía óptica de uso habitual en la rutina en nuestro laboratorio. Se seleccionaron al azar 92 pacientes residentes de Sargento Moya (latitud: 27°13’59.88"S, longitud 65°32’60.00"O), departamento de Monteros, provincia de Tucumán. Este lugar forma parte de la ecorregión de las yungas, donde existe alta prevalencia de mansonellosis. Se obtuvo sangre entera con EDTA, sangre en formol al 2 % (1 ml de sangre venosa/10 ml de formol al 2 %, para realizar KNOTT) y extendidos hemáticos de capa fina. Solo en 10 de los 92 pacientes estudiados se realizaron, además, extendidos hemáticos de gota gruesa. Se emplearon las técnicas de EF, GG y KNOTT, esta última, con observación directa del sedimento

(KNOTTD) y poscoloración de Giemsa (KNOTTG) (6). Las muestras de sangre entera se dividieron en alícuotas, estas se colocaron en criotubos de 300 µl y se conservaron a -20 ºC. Se extrajo el ADN de dichas muestras con el método de extracción de proteinasa K y fenol-cloroformo (1). El ADN obtenido se resuspendió en 30 ul de agua bidestilada estéril; la calidad y cantidad del ADN se evaluaron por electroforesis en gel de agarosa al 1 % y fluorescencia al UV con bromuro de etidio y marcadores de peso molecular. Las muestras se conservaron a 4 ºC hasta su uso. Para determinar la especificidad analítica del ensayo, se extrajo ADN de larvas de Toxocara cati y Toxocara canis, de Strongyloides stercoralis y de Dirofilaria immitis. Para la identificación de las microfilarias se utilizaron los cebadores MoITS, situado a 227 pb del extremo 3’ del ITS2, y NC2, situado en el extremo 5’ del ADNr 28 S, para amplificar una región del ADN ribosomal de 295 pb, específica de Mansonella ozzardi (7). La mezcla de reacción de PCR se realizó en un volumen final de 25 µl, que contenía 2 µl de ADN templado; 0,5 U de Taq polimerasa (Invitrogen); 10 mM de Tris-HCl pH 9,6; 50 mM de KCl; 1,5 mM de MgCl2, 60 µM de cada dNTP, 5 pmol de NC2 y 10 pmol de MoITS2. Las condiciones de ciclado (termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient) incluyeron una primera desnaturalización a 94 ºC durante 120 seg, seguida por 35 ciclos de 15 seg a 94 ºC (desnaturalización),

300 pb 200 pb

Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa (2 %) de los productos de la PCR. Las calles 1 a 12 muestran los resultados obtenidos con las muestras N.º 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 15, 18, 19 y 20, respectivamente. Calles 13 y 14: controles negativos. Calle 15: marcador de PM (100 pb). Se observa la banda de 295 pb en las calles 1, 2, 3, 6, 9, 10 y 11

Diagnóstico de Mansonella ozzardi por la técnica de PCR

30 seg a 52 ºC (hibridación) y 30 seg a 72 ºC (extensión), con una extensión final de 10 min a 72 ºC (7). Como control negativo se utilizó agua bidestilada estéril. Los fragmentos de ADN amplificados por PCR fueron determinados por electroforesis en geles de agarosa al 2 % y comparados con un marcador de tamaño molecular de 100 pb (Fermentas), tras teñir con bromuro de etidio (Figura 1). Las muestras que dieron la señal esperada fueron purificadas con columnas de purificación de productos de amplificación de PCR a partir de geles de agarosa (Nucleospin Extract II). La secuencia de nucleótidos de los productos de amplificación fue determinada por la secuenciación automática del ADN utilizando el ABI PRISM Big DyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin Elmer Applied Biosystems). La electroforesis en gel se llevó a cabo en el secuenciador automático de ADN ABI 377 (Perkin Elmer). Los datos de secuenciación fueron analizados por el programa Chromas LITE 2.01 y las secuencias fueron alineadas y comparadas con la base de datos genética a través del programa Mega 4.0.1., para comprobar que los fragmentos de ADN amplificados de las muestras en estudio correspondían a M. ozzardi. La secuencia nucleotídica obtenida se encuentra disponible en la base de datos GenBank con el número de acceso JN871884. La PCR dio la señal esperada en el 57,6 % de las muestras (53/92). El método KNOTTG arrojó resultados positivos en el 50 % de las muestras (46/ 92); el KNOTTD en el 45,6 % (42/92) y el examen de EF en el 27,2 % (25/92). Las muestras positivas por EF también lo fueron por los otros métodos, así como las muestras positivas por KNOTTD fueron positivas también por KNOTTG y PCR, y 7 muestras fueron solo positivas por PCR.

No se obtuvo señal cuando se utilizó como templado para la PCR el ADN de larvas de T. cati y T. canis, de S. stercoralis y de D. immitis. Para la estimación del rendimiento diagnóstico de la PCR, se compararon los resultados de las muestras analizadas por PCR y por KNOTTG, este último considerado como método de referencia en nuestro laboratorio. Los resultados fueron los siguientes: sensibilidad diagnóstica del 100,0 % (IC95%: 90,4100,0), especificidad diagnóstica del 84,8 % (IC95%: 70,5-93,2); valor predictivo negativo (VPN) del 100 % (IC95%: 88,8-100,0) y valor predictivo positivo (VPP) del 86,8 % (IC95%: 74,0-94,1). Para estimar si existen diferencias en la capacidad de discriminación diagnóstica de ambos métodos se aplicó el test de Mc Nemar, el que reveló diferencias significativas (p: 0,016) (Tabla 1). La secuenciación de los fragmentos de ADN amplificados permitió identificarlos como pertenecientes a M. ozzardi. Los métodos microscópicos permitieron su identificación sobre la base de las características morfológicas. Las técnicas de microscopía que concentran la muestra seguidas de la coloración de Giemsa aumentan la posibilidad de encontrar microfilarias. En este sentido, el método KNOTT dio mejores resultados que el de GG porque concentra mayor volumen de muestra, en concordancia con lo que informan otros autores (6). El rendimiento diagnóstico de la PCR nos permite concluir que el método molecular presentó una excelente sensibilidad diagnóstica en comparación con el método de KNOTTG. Del análisis estadístico se desprende que las diferencias significativas encontradas (Mc Nemar: p < 0,05) se deben a las discrepancias observadas en 7 muestras, que fueron negativas por KNOTTG y positivas por PCR.

Tabla 1. Rendimiento de las técnicas de PCR (1) y de KNOTTG(2) en el diagnóstico de la mansonellosis KNOTTG

PCR

Parámetro

Intervalo de confianza 95 %

Sensibilidad

100,0

(90,4-100,0)

Especificidad

84,8

(70,5-93,2)

VPP (3)

86,8

(74,0-94,1)

100,0

(88,8-100,0)

VPN (1)

(4) (2)

seguida de secuenciación de los fragmentos amplificados; método de Knott con observación poscoloración de Giemsa; (3) valor predictivo positivo; (4) valor predictivo negativo

100

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 97-100

Para intentar comprender la causa de estas diferencias, se tuvo en cuenta el análisis de secuenciación de los fragmentos de ADN amplificados por PCR. Los resultados mostraron que, efectivamente, las 7 muestras eran de M. ozzardi, es decir, que estas muestras no arrojaron resultados falsos positivos de la PCR, sino que dieron resultados falsos negativos de KNOTTG. Además, no se observaron señales positivas de la PCR con otros nematodes ensayados, lo que indicaría una buena especificidad analítica del método. Este hallazgo representa un aporte de las técnicas de biología molecular en la optimización del diagnóstico de infección por M. ozzardi. Este método pudo identificar 7 casos positivos que no habían sido detectados por los métodos tradicionales ensayados. Otros autores han demostrado la mayor sensibilidad de esta técnica comparada con la de FM (11). La mayor sensibilidad de la PCR hace posible la búsqueda del parásito en una pequeña fracción de muestra y permite llegar a un diagnóstico específico a través del análisis de secuenciación del producto obtenido. Los métodos microscópicos suelen requerir pasos previos de concentración de un volumen considerable de muestra. En pacientes con sospecha de la enfermedad por residir en sitios endémicos, la PCR permitió diagnosticar la infección en casos donde la microscopía fue negativa, probablemente debido a una microfilaremia baja. Se sugiere considerar esta prueba en el diagnóstico de infección por M. ozzardi, principalmente en estudios epidemiológicos tendientes a conocer la prevalencia de la infección, para avanzar en el conocimiento de esta parasitosis.

BIBLIOGRAFÍA 1. Angel SO, Matrajt M, Margarit J, Nigro M, Illescas E, Pszenny V, Amendoeira R, Guarnera E, Garberi JC. Screening for active toxoplasmosis in human patients by DNA hybridizations with ABGTg7 probe in blood samples. J Clin Microbiol 1997; 35: 591-5. 2. Araoz R, Biglieri JM. Casos de microfilaria observados por primera vez en Tucumán. An Dept Nac Higiene 1915; 22:151-9. 3. Botero O, Restrepo M. Mansonellosis. En: Botero O, Restrepo M, editores. Parasitosis humanas, 3ª edición. Medellín, Colombia, 1998, p. 304-5. 4. Cohen JM, Ribeiro JA, Martins M. Ocular manifestations in mansonelliasis. Arq Bras Oftalmol 2008; 71: 167-71. 5. Dantur Juri MJ. Entomological aspects of filariasis in Argentina. I Congreso Internacional de Zoonosis y Enfermedades Emergentes, 2011, Resumen 29058, p. 98, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. 6. Medios auxiliares para el diagnóstico de las infecciones filáricas. Organización Mundial de la Salud, 1997. 7. Morales-Hojas R, Post RJ, Shelley AJ, Maia-Herzog M, Coscarón S, Cheke RA. Characterisation of nuclear ribosomal DNA sequences from Onchocerca volvulus and Mansonella ozzardi (Nematoda: Filarioidea) and development of a PCRbased method for their detection in skin biopsies. Int J Parasitol 2001; 31: 169-77. 8. Newton LA, Chilton NB, Beveridge I, Gasser RB. Systematic relationships of some members of the genera Oesophagostomum and Chabertia (Nematoda: Chabertiidae) based on ribosomal DNA sequence data. Int J Parasitol 1998; 28: 1781-9. 9. Taranto N. Microfilaria tucumana (Mansonella ozzardi). En: El niño enfermo. Segunda Cátedra de Pediatría. Facultad de Ciencias Médicas. Universidad Nacional de Rosario. Tomo 1, editorial de la UNR, 2005, 221. 10. Taranto N, Castelli E. Detección de un foco de microfilarias en el noroeste argentino. Rev Argent Microbiol 1988; 20: 49-51. 11. Vera LJ, Basano Sde A, Camargo Jde S, França AK, Ferreira Rde G, Casseb AA, Medeiros JF, Fontes G, Camargo LM. Improvement of a PCR test to diagnose infection by Mansonella ozzardi. Rev Soc Bras Med Trop 2011; 44: 380-2.

Recibido:25/10/2011- Aceptado: 18/4/2012

ISSN 0325-7541

Staphylococcus aureus en manipuladores de alimentos INFORME BREVE

101 Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 101-104

Portación y caracterización de Staphylococcus aureus en manipuladores de alimentos GRACIELA B. JORDÁ*1, RAÚL S. MARUCCI1, ADRIANA M. GUIDA1, PATRICIA S. PIRES1, EDUARDO A. MANFREDI2 1

Cátedra de Microbiología General, Carrera de Bioquímica, Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales, Universidad Nacional de Misiones. Mariano Moreno 1375 (3300) Posadas, Misiones; 2 INEI-ANLIS “Dr. Carlos Malbrán”. Av. Vélez Sarsfield 563 (1281) Ciudad Autónoma de Buenos Aires. Argentina. *Correspondencia. E-mail: gracielajorda@hotmail.com

RESUMEN Staphylococcus aureus es una causa de intoxicaciones alimentarias por su capacidad de producir enterotoxinas. Los manipuladores de alimentos que portan S. aureus productores de enterotoxinas pueden provocar intoxicaciones alimentarias. Se estudiaron muestras tomadas de fosas nasales de 88 manipuladores de alimentos en la provincia de Misiones. El 37,5 % de los individuos analizados eran portadores de S. aureus. Mediante técnicas de amplificación (PCR), se detectaron genes que codifican la producción de enterotoxinas en 13 de los 33 aislamientos obtenidos (39,4 %) y en el 14,7 % de los manipuladores. De estos aislamientos, 10 portaban el gen sea y 3 el gen sec. El estudio de sensibilidad a los antibióticos mostró un 100 % de sensibilidad a teicoplanina, gentamicina y rifampicina; 2 aislamientos fueron resistentes a clindamicina y a eritromicina y 4 resultaron resistentes a la meticilina. Estos resultados son un alerta e indicarían la necesidad de desarrollar medidas racionales para reducir el riesgo potencial de intoxicaciones alimentarias. Palabras clave: Staphylococcus aureus, manipuladores de alimentos, intoxicaciones alimentarias

ABSTRACT Carriage and characterization of Staphylococcus aureus in food handlers. Staphylococcus aureus causes food poisoning due to its ability to produce enterotoxins. Food handlers carrying enterotoxin-producing S. aureus can contaminate food, thus leading to food poisoning. Samples were obtained from 88 food handlers in the Province of Misiones, Argentina. S. aureus was isolated from nasal swaps and PCR amplification was performed for genes encoding staphylococcal enterotoxins. A total of 37.5 % food handlers were positive for S. aureus. Expression of enterotoxin genes was found in 13 of the 33 (39.4 %) S. aureus isolates studied, accounting for 14.7 % of food handlers. Gene sea was detected in 10 isolates followed by gene sec in 3 isolates. All isolates were susceptible to teicoplanin, gentamicin and rifampicin. Four isolates were resistant to methicillin whereas 2 isolates were resistant to clindamycin and erythromycin. These results constitute a critical alert and indicate the need for developing rational measures to reduce the potential risk of food poisoning. Key words: Staphylococcus aureus, food handlers, food poisoning

Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) se encuentran ampliamente extendidas y constituyen un problema prioritario de salud pública, tanto en países desarrollados como en aquellos en vía de desarrollo (4). El agente etiológico más frecuente de las intoxicaciones de origen alimentario es Staphylococcus aureus. La presencia de este microorganismo se asocia con la contaminación introducida por los manipuladores de alimentos, el incumplimiento de buenas prácticas de manufactura o la utilización de materia prima contaminada (2-5, 8, 12, 13). S. aureus es un microorganismo ubicuo que puede colonizar la nasofaringe, la piel y las mucosas de hombres y animales, y puede establecerse en un medio

ambiente propicio. Suele contaminar alimentos y, eventualmente, producir una intoxicación aguda debido a la presencia de una toxina emética muy resistente al calor y a las enzimas proteolíticas. Las principales enterotoxinas involucradas son designadas con letras de la A a la U; dentro de la variedad C existen tres subtipos (4, 11). Al ingerirse el alimento contaminado, la enterotoxina se encuentra ya formada, por lo que el período de incubación es muy corto (menos de tres horas). Las manifestaciones clínicas características, que en general cursan sin fiebre, comprenden náuseas, vómitos intensos, espasmo abdominal y diarrea. En algunos casos se observa moco y sangre en los vómitos o en las heces (4, 11). El cuadro suele presentar una evolución favorable, con tendencia a la recuperación

102

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 101-104

en 24-48 h, aunque pueden producirse formas graves con hipotensión, hipotermia y shock (4). Debido a que las enterotoxinas estafilocócicas son las responsables del cuadro clínico y persisten en los alimentos cocinados, aun cuando el microorganismo ya no resulte viable (5, 9, 14), no solo es importante investigar la presencia de la bacteria, sino también establecer si se trata de aislamientos productores de enterotoxina. El sistema regulador de la expresión de los factores de virulencia de S. aureus se asocia fuertemente a la capacidad de este microorganismo de multiplicarse hasta niveles aproximados a 106 UFC/g. Los factores ambientales, entre otros la temperatura, desempeñan un papel importante en la expresión de los genes de las enterotoxinas estafilocócicas (4). Dado que la presencia de S. aureus en las fosas nasales, las fauces y la piel del hombre es frecuente, los manipuladores de alimentos que no utilizan correctamente guantes y barbijos o que no cumplen con otras recomendaciones de buenas prácticas potencian el riesgo de contaminación de los alimentos en los procesos de elaboración y comercialización (4). En la actualidad, Misiones es una de las provincias argentinas de mayor afluencia turística y este hecho demanda optimizar las pautas de calidad en los servicios de gastronomía. Por lo tanto, es necesario que el personal involucrado en la manipulación de los alimentos conozca la importancia de los procedimientos que permiten reducir los riesgos de transmisión de este microorganismo, a fin de preservar la salud de los consumidores. Al no existir informes nacionales ni locales, se diseñó el presente trabajo con el objetivo de detectar la portación de S. aureus en manipuladores de alimentos en la provincia de Misiones, evaluar la producción de enterotoxinas y determinar la sensibilidad a los antibióticos en los aislamientos obtenidos.

Se incluyeron en el estudio 88 manipuladores de alimentos afectados a dos restaurantes de la ciudad de Posadas y a uno de la ciudad de Puerto Iguazú (restaurantes I, III y II, respectivamente, en la Tabla 1), y de cuatro sucursales de una panadería de Posadas. Los establecimientos cumplimentaban los requerimientos legales de habilitación. La autorización para la toma de muestra al personal afectado a las distintas tareas se logró con la firma de un acta-acuerdo con los propietarios de los establecimientos, que incluyó la invitación a participar, el consentimiento del personal involucrado, la confidencialidad de los resultados y la implementación de actividades de capacitación sobre la importancia de las buenas prácticas de manufactura, en la modalidad de talleres. Las edades de los manipuladores fluctuaron entre los 24 y 59 años; 22 eran mujeres y 66 eran hombres. Las muestras se obtuvieron de la zona nasofaríngea mediante hisopos de dacrón estériles (Eurotubo, Deltalab) y se remitieron inmediatamente al Laboratorio de Microbiología General que funciona en el Módulo de Farmacia y Bioquímica de la Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales de la Universidad Nacional de Misiones. Las muestras se inocularon en placas de agar manitol salado (Britania) y se incubaron a 37 °C durante 24-48 h (5). Las colonias compatibles con S. aureus fueron sometidas a la observación microscópica con tinción de Gram e identificadas mediante las siguientes pruebas bioquímicas: catalasa, coagulasa, DNasa, Voges Proskauer, sensibilidad a la novobiocina y fermentación anaeróbica de la glucosa. El estudio de la sensibilidad a los antibióticos se efectuó mediante la técnica de difusión en agar, según la metodología recomendada por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Se utilizaron discos (Britania) con los siguientes agentes antibacterianos: oxacilina (1 µg), clindamicina (2 µg), eritromicina (15 µg), cefoxitina (30 µg),

Tabla 1. Distribución de S. aureus y presencia de genes productores de enterotoxinas en aislamientos obtenidos de manipuladores de alimentos de la provincia de Misiones Portación de S. aureus

Origen y tamaño muestral Establecimiento Restaurante I (Posadas) Restaurante II (Pto. Iguazú) Restaurante III (Posadas) Panaderías (4 locales) (Posadas) Total

N 23 16 16 33 88

N 10 6 3 14 33

% 43,5 37,5 18,8 42,4 37,5

Genes productores de enterotoxinas sea 3 4 3 10

seb 0

sec 2 1 3

sed 0

see 0

Staphylococcus aureus en manipuladores de alimentos

teicoplanina (30 µg), rifampicina (5 µg) y gentamicina (10 µg). Los aislamientos de S. aureus se conservaron en agar tripteína de soja semisólido hasta su derivación al Servicio Fisiopatogenia del Depar tamento de Bacteriología del INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”, cumpliendo con las normas de envío vigentes. Los genes que codifican las enterotoxinas A, B, C, D y E, más frecuentemente asociadas a brotes de intoxicación alimentaria, se detectaron mediante técnicas de biología molecular. Se utilizó una PCR múltiple A-B-C para la detección de los genes sea, seb, sec1, sec2 y sec3 de S. aureus enterotoxigénico, y otra PCR mútiple D-E para la detección de los genes sed y see, según el protocolo descrito por Manfredi et al. (11). Se obtuvieron 33 aislamientos de S. aureus de los 88 individuos analizados, lo que implica un 37,5 % de portación de este microorganismo en manipuladores de alimentos. La distribución con respecto al sexo fue la siguiente: 25 hombres y 8 mujeres. De los 33 aislamientos, 13 fueron potencialmente enterotoxigénicos: 10 presentaron el gen que codifica la enterotoxina A y 3 el que codifica la enterotoxina C. No se demostró la presencia de los genes codificantes de las enterotoxinas B, D ni E. La Tabla 1 muestra la distribución de los aislamientos de S. aureus y de los genes codificantes de enterotoxinas que surgió del relevamiento efectuado. El análisis de sensibilidad a los antibióticos mostró que todos los aislamientos de S. aureus presentaron halos de inhibición frente a teicoplanina, a gentamicina y a rifampicina, y 2 fueron resistentes a la clindamicina y a la eritromicina. Se encontró resistencia a meticilina en 4 aislamientos. En los establecimientos estudiados, la prevalencia de portadores nasales de S. aureus resultó, en promedio, del 37,5 %, con un rango que varió entre el 18,8 % y el 43,5 %. Estos valores son compatibles con lo que informan algunas comunicaciones nacionales e internacionales, donde la prevalencia osciló entre el 25 % y el 45 % (1, 3, 5, 12). En este trabajo se detectó un 39,4 % de aislamientos que portaban los genes codificantes de enterotoxinas (14,7 % de los manipuladores estudiados); esta frecuencia resultó inferior a las comunicadas en otras investigaciones de Latinoamérica, donde se observaron valores superiores al 50 % (5, 10). El gen predominante en este estudio fue sea, lo que coincide con lo referido en comunicaciones internacionales (3, 5, 8, 10). No se ha observado la producción simultánea de dos o más grupos toxigénicos, como informan Figueroa et al. (5).

103

El estudio de sensibilidad a los antibióticos mostró que la mayoría de los aislamientos obtenidos de los manipuladores de alimentos fueron sensibles a los antibióticos ensayados y de uso frecuente en la terapia, en coincidencia con los datos obtenidos por Acco et al. (1). El porcentaje de resistencia a meticilina (12 %) superó el 5,9 % informado por Cifuentes et al. (2). Otros autores, en cambio, no hallaron resistencia a dicho antibiótico (5). S. aureus es uno de los patógenos responsables de las intoxicaciones alimentarias, de modo que es importante estar alerta con respecto a las cepas aisladas en la comunidad y su comportamiento frente a los antibióticos. Este trabajo contribuye al conocimiento de portación de S. aureus en manipuladores de alimentos en la provincia de Misiones, información no disponible hasta el presente para esa provincia y escasamente en el resto del país (6). Sería interesante promover la realización de trabajos similares en otras jurisdicciones de la Argentina, para conocer la frecuencia de aislamientos de S. aureus potencialmente enterotoxigénicos en manipuladores de alimentos en el país en su conjunto. Nuestra expectativa es que este trabajo contribuya de forma significativa al conocimiento del problema y que se implementen medidas tendientes a reducir el número de las intoxicaciones alimentarias por S. aureus.

AGRADECIMIENTOS: a la Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales (UNaM), por el uso de las instalaciones y los servicios prestados durante la realización de este trabajo. A los establecimientos gastronómicos, por la financiación de los medios de cultivo utilizados, y, especialmente, a su personal, por permitir la toma de muestras clínicas y colaborar en este tarea.

BIBLIOGRAFÍA 1. Acco M, Ferreira F, Henriques J, Tondo E. Identification of multiple strains of Staphylococcus aureus colonizing nasal mucosa of food handlers. Food Microbiol 2003; 20: 489-93. 2. Cifuentes M, Prado V, Ojeda A. Prevalencia de portación de Staphylococcus aureus meticilino resistente en estudiantes de medicina y población general. Rev Chil Infectol 1998; 15: 161- 9. 3. Dantas MC. Tipificaçao fenotípica e genotípica de Staphylococcus aureus isolados de manipuladores, leite e queijo, Minas Frescal, 2006. Tese submetida ao PPGMT/ IPTSP/UFG como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Medicina Tropical, área de concentração: Microbiologia. Goiana-Go Universidade Federal de Goiás. Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública Programa de Pós-graduação em Medicina Tropical.

104

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 101-104

4. Fernández-Crehuet Navajas J, Carnero Varo M, Pinedo Sanchez A. Intoxicaciones y toxinfecciones alimentarias. En: Piédrola Gil. Medicina preventiva y salud pública. 11.a edición. Barcelona, Elsevier Masson, 2008, p. 577-9. 5. Figueroa G, Navarrete P, Caro M, Troncoso M, Faúndez G. Portación de Staphylococcus aureus enterotoxigénicos en manipuladores de alimentos. Rev Med Chile 2002; 130:85964. 6. Grumelli Y, Aliverti F, Brocardo MS, Aliverti V, Brusa V, Copes J, Leotta G. Portación de Staphylococcus aureus coagulasa positivo en manipuladores de alimentos. XII Congreso Argentino de Microbiología, resumen 27323. Rev Argent Microbiol 2010, 42 Supl 1: 107. 7. Hatakka M, Asplund K, Korkeelala HJ. Genotypes and enterotoxicity of Staphylococcus aureus isolated from hands and nasal cavities of flight-catering employees. J Food Prot 2000; 63: 1487-91. 8. Jaime Borges L. Caracterizaçao de microorganismos isolados em manipuladores e dietas enterais de dois hospitais publicos de Goiania, 2010. Tese submetida ao PPGMT/IPTSP/UFG como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Medicina Tropical, área de concentração: Microbiologia. Goiana-Go Universidade Federal de Goiás. Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública Programa de Pós-graduação em Medicina Tropical. 9. Løvseth A, Loncarevic S, Berdal K. Modified Multiplex PCR Method for detection of pyrogenic exotoxin genes in staphylococcal isolates. J Clin Microbiol 2004; 42: 3869-72.

10. Mamprim Filho A Enterotoxinas de Staphylococcus coagulase positiva e negativa isoladas das fossas nasais e mãos de manipuladores de alimentos, 2006. Dissertação (mestrado). Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu. 11. Manfredi E, Leotta G, Rivas M. PCR múltiple para la detección de los genes sea, seb, sec, sed y see de Staphylococcus aureus. Caracterización de aislamientos de origen alimentario. Rev Argent Microbiol 2010; 42: 212-5. 12. Raddi MSG, Leite CQF, MendonÇa, CP. Staphylococcus aureus: portadores entre manipuladores de alimentos. Rev Saúde Públ S. Paulo 1988; 22: 36-40. 13. Riquelme Gyimesy LF. Incidencia de Staphylococcus aureus en platos fríos listos para el consumo en locales de comida italiana y medidas para su control. Memoria para optar al título de Ingeniero en Alimentos, 2007. Universidad Nacional de Chile. Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas. Departamento de Ciencias de los Alimentos y Tecnología Química. 14. Soriano JM, Blesa J, Rico H, Molto JC, Mañes J. Incidence of Staphylococcus aureus in meals from cafeterias. J Food Saf 2002; 22: 135-40. 15. Suárez MJ, Arias ML, Gamboa MM. Detección de la enterotoxina A de Staphylococcus aureus mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y su correlación con las pruebas de coagulasa y termonucleasa. Arch Latinoam Nutr 2008; 58: 59-63.

Recibido:18/11/2011-Aceptado:13/2/2012

ISSN 0325-7541

Fungal lignocellulases and decolorization in grape stalks ARTÍCULO ORIGINAL

105 Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 105-112

Grape stalks as substrate for white rot fungi, lignocellulolytic enzyme production and dye decolorization LAURA LEVIN*, LUIS DIORIO, EMANUEL GRASSI, FLAVIA FORCHIASSIN Laboratorio de Micología Experimental, Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, PROPLAME-PHRIDEB, CONICET, Universidad de Buenos Aires. Ciudad Universitaria, Pabellón II, Piso 4, (1428) Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. *Correspondence. E-mail: lale@bg.fcen.uba.ar

ABSTRACT The aim of this work was to evaluate the potential of grape stalks, an agroindustrial waste, for growth and lignocellulolytic enzyme production via solid-state fermentation, using the following three white rot fungi: Trametes trogii, Stereum hirsutum and Coriolus antarcticus. The decolorization of several dyes by the above mentioned cultures was also investigated. Similar values of dry weight loss of the substrate were measured after 60 days (33-43 %). C. antarcticus produced the highest laccase and Mn-peroxidase activities (33.0 and 1.6 U/g dry solid). The maximum endoglucanase production was measured in S. hirsutum cultures (10.4 U/g), while the endoxylanase peak corresponded to T. trogii (14.6 U/g). The C. antarcticus/grape stalk system seems potentially competitive in bioremediation of textile processing effluents, attaining percentages of decolorization of 93, 86, 82, 82, 77, and 58 % for indigo carmine, malachite green, azure B, remazol brilliant blue R, crystal violet and xylidine, respectively, in 5 h. Key words: grape stalks, solid state fermentation, white rot fungi, lignocellulolytic enzymes, dye degradation

RESUMEN Uso del escobajo como sustrato para el crecimiento de hongos de la pudrición blanca, la producción de enzimas ligninolíticas y la decoloración de tinturas. El objetivo de este trabajo fue evaluar el potencial del escobajo, un residuo agroindustrial, como sustrato para el crecimiento y la producción de enzimas lignocelulósicas de tres hongos causantes de pudrición blanca en la madera: Trametes trogii, Stereum hirsutum y Coriolus antarcticus. Para ello se utilizaron técnicas de fermentación en estado sólido. También se ensayó la decoloración de colorantes industriales sobre estos cultivos. La pérdida de peso seco del sustrato fue similar después del día 60 (33-43 %). C. antarcticus produjo las mayores actividades de lacasa y Mn-peroxidasa (33,0 y 1,6 U/g peso seco). La mayor actividad endoglucanasa fue medida en cultivos de S. hirsutum (10,4 U/g), y la mayor actividad endoxilanasa en T. trogii (14,6 U/g). El sistema C. antarcticus/escobajo mostró un importante potencial para su aplicación en la biorremediación de efluentes textiles, con porcentajes de decoloración de 93, 86, 82, 82, 77 y 58 % para índigo carmín, verde de malaquita, azure B, azul R brillante de remazol, cristal violeta y xilidina, respectivamente, en 5 h. Palabras clave: escobajo, fermentación en estado sólido, hongos de la pudrición blanca, enzimas lignocelulósicas, decoloración

Argentina is a leading wine-producing country in the world. The quality and productivity of its wineries are very competitive compared with those of more traditional wine- producing countries such as France, Italy and Spain. Given its production output, Argentina rates as the main Latin American producer and has a significant growth potential. The Argentine Wine Production Statistics Institute stated that during 2009, crop yields reached approximately 2,137,000 tons of grapes and wine production was about 1,076 million liters (17). This picture also shows the need for adopting a sustainable management of the resources employed and for recycling the important amount of

residues produced. Disposal and landfill of those wastes present environmental and social drawbacks. New technologies were proposed not only for their reuse in agriculture, but also for the production of common and novel products for other sectors (31). Pomace is the main solid residue of wine production, which contains 45 % grape skins, 30 % seeds and 25 % grape stalks. It constitutes 12 % of a fresh grape’s weight. In Argentina, it accounts for around 213,000 tons/y (17). Grape stalks have a high degree of fibers [lignin (22.94 %), cellulose (29.95 %) and hemicellulose (35.33 %)] and a high percentage of nutritive mineral elements, especially nitrogen and potassium (25). The

106

use of grape stalks in the form of single cell protein after solid state fermentation (SSF) has been proposed as ruminant feed or feeding component (32). Results indicate that, after biological lignin removal, the cellulose is better accessible to rumen microorganisms, and due to its good protein value and low lignin content, it has a similar value of digestibility as forages (5460 %). SSF is another way of producing a variety of compounds like ethanol, citric acid, gluconic acid, carotenoids, xanthan, etc. (31). Enzyme production is a growing field of biotechnology. Most enzyme manufacturers produce enzymes using submerged fermentation (SmF) techniques. In general, enzyme titers in SSF are higher than in SmF, when comparing the same strain and fermentation broth (39). White rot fungi (WRF) are so far unique in their ability to completely degrade all components of lignocellulosic materials. Cellulose biodegradation is a synergistic process involving endo-β-1,4-glucanase, cellobiohydrolase and β-glucosidase. Hydrolysis of xylans mainly requires the action of endo-β-1,4xylanase and β-xylosidase. The capability to degrade lignin is due to their extracellular nonspecific and nonstereoselective enzyme system composed by laccases, lignin peroxidases (LiPs) and Mn-peroxidases (MnPs), which function together with H2O 2-producing oxidases and secondary metabolites (5, 10, 26). The same unique nonspecific mechanisms that give these fungi the ability to degrade lignin also allow them to degrade a wide range of pollutants, among them: polycyclic aromatic hydrocarbons, chlorinated phenols, polychlorinated biphenyls, dioxins, pesticides, explosives and dyes (35, 44). Purified laccases, LiPs and MnPs of different fungi are able to decolorize dyes of different chemical structure (16, 19, 34, 35). All of these enzymes are industrially important; therefore organisms able to produce them are interesting in view of the potential importance in industrial processes such as bioremediation, biobleaching of pulp paper, degradation and detoxification of recalcitrant substances or in the food industry. Thus, the efficient production of these enzymes in a low-cost medium is interesting for biotechnological applications. Moreover, the valueadded conversion of the bioproducts from winemaking can help in reducing the negative costs and demonstrating sustainability in winemaking (31). Various agricultural substrates/byproducts and WRF have been used successfully in SSF for ligninolytic enzyme production (39). Two closely related substrates were assayed in SSF for lignocellulolytic enzyme production: grape seeds, as substrate for laccase production by Trametes hirsuta (28, 30) and grapevine

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 105-112

cutting wastes as substrate for laccase, MnP, cellulose and xylanase production by Cerrena unicolor (13). Grape stalks were assayed as substrate for ligninolytic enzyme production by Phanerochaete chrysosporium during semi-solid-state cultivation. Grape stalks cultures of this fungus led to a decolorization of around 70 % of Poly R-478 after 8 days of dye incubation (41). Grape stalks added to submerged cultures of Trametes versicolor induced laccase production. Supernatants of T. versicolor cultured in such substrate proved their capacity to decolorize phenol red (25) and indigo carmine (27). But as far as we know, grape stalks had never been assayed before as sole substrate for the production of lignocellulolytic enzymes by WRF in SSF. Several studies have demonstrated the ability of WRF to decolorize synthetic dyes. However, most studies on dye decolorization have been carried out using liquid culture conditions or solid cultures on agar plates, which, however, do not reflect the natural living conditions (e.g. in wood and other lignocellulosic substrates) of WRF. SSF was chosen here because it mimics the natural environment of the WRF. Textile dye decolorization has been demonstrated with cell suspensions, immobilized cells, crude enzymatic extracts and purified ligninolytic enzymes (1, 12, 16, 19, 20). The major drawback to using an enzyme preparation is that once the enzymes become inactivated, decolorization activity ceases. However, with a whole cell culture, the enzymes could be continually replenished. Immobilized cultures tend to have a higher level of activity and are more resilient to environmental perturbations such as pH, or exposure to toxic chemical concentrations than suspension cultures (33, 38). Immobilization by encapsulation in a matrix such as alginate may be too costly for wastewater treatment, while surface immobilization on an inexpensive material such as woodchips or lignocellulosic wastes is cheaper (43). Trametes trogii (BAFC 463), Coriolus antarcticus (BAFC 266), and Stereum hirsutum (BAFC 2234) are Argentinean strains of WRF that had proved to be efficient ligninolytic enzyme producers in previous studies (21, 23, 24, 30). Their ability to decolorize a wide range of textile dyes has been recently demonstrated (12, 16, 20, 22, 23, 29). The aim of this work was to evaluate the potential of grape stalks as support for their growth and lignocellulolytic enzyme production under solid state conditions. The in vivo and in vitro decolorization of several dyes, by the above mentioned cultures was also investigated in order to assess their degradative abilities.

Fungal lignocellulases and decolorization in grape stalks

MATERIALS AND METHODS Fungal strain and culture conditions Trametes trogii (BAFC 463; MYA 28-11), S. hirsutum (BAFC 2234) and C. antarcticus (BAFC 266) (Basidiomycota) were obtained from the Centro de Colecciones de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires (BAFC), and maintained at 4 ºC on ME agar (malt extract 1.2 %, glucose 1 %, agar 2 %) slants. Incubation was carried out at 28 ºC under stationary conditions in 100 ml Erlenmeyer flasks for up to 60 days. Grape stalks cut into pieces of 3-5 cm [15 g per Erlenmeyer (dry basis)] was used as solid substrate for cultures, moistened with 20 ml of distilled water and 5 ml mycelial suspension (inoculum) (initial moisture content 65 %). The medium was autoclaved for 20 min at 121 ºC, and aseptically inoculated with the mycelial suspension.To prepare the inoculum, Erlenmeyer flasks containing ME medium were inoculated with one agar plug (25 mm2) cut out from the margin of a 5-day-old colony grown on ME agar and incubated for 5 days at 28 °C and the mycelium obtained was blended in three cycles of 15 s. For all experiments, measurements were carried out in triplicate parallel cultures. The values are reported as the mean with a standard deviation of (SD) less than 10 %.

Sample preparation Weight losses were determined on the basis of the initial and final dry weights, drying the content of each flask to constant weight at 80 °C. Enzyme extraction: crude extracts were obtained by adding 5 ml of distilled water per g wet solid, to the contents of each flask, stirring for 20 min, followed by centrifugation. The supernatants were stored at -20 ºC until enzyme determination.

Enzyme assays Laccase activity (E.C:1.10.3.2) was measured with 2,2'azino bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) in 0.1 M sodium acetate buffer (pH 3.6). Oxidation of ABTS was determined by the increase in A420 (ε420 = 36/mM cm) (8). Mnperoxidase activity (MnP) (E.C:1.11.1.13) was measured using phenol red as the substrate in 0.1 M sodium dimethylsuccinate buffer (pH 4.5) (ε610 = 22/mM cm) (14). Lignin peroxidase activity (LiP) (E.C:1.11.1.14) was assayed by the azure B method (2). Ligninolytic activities were measured at 30 ºC. Endo-β-D-1,4glucanase (E.C:3.2.1.4), and endo-β-D-1,4-xylanase (E.C:3.2.1.8) activities were determined by measuring the reducing sugars released from carboxymethyl cellulose or oat xylan, respectively, as substrates, in 50 mM sodium acetate buffer, pH 4.8, at 50 ºC. Liberated reducing sugars were quantified by the Somogyi-Nelson method (45), using either glucose or xylose as standards. International enzymatic units (U) were used (µmol/min). Enzymatic activities in the extracts recovered from the solid-state cultures were reported in U/ml. In terms of production, the activity was defined as U/g dry residue (substrate plus mycelium) (U/g).

In vivo decolorization experiments The reaction mixture contained in 1g wet material (substrate plus fungus, 40 days post-inoculation) in 10 ml of different dyes (concentration 100 μM). Six dyes belonging to five different classes were analyzed. Decolorization was determined by measuring the decrease of dye absorbance at its maximum visible wavelength 505, 588, 592, 608, 618, and 650 nm, respectively for: xylidine [acid red 26: azoic dye, CI (colour index N.º): 16150], remazol brilliant blue R (RBBR, reactive blue 19: anthraquinone dye, CI 61200), indigo carmine (acid blue 74: indigoic dye, CI 73015), malachite green (basic green 4: triphenylmethanic dye, CI 42000) and crystal violet (gentian violet: triphenylmethanic dye, CI 42555), and azure B (heterocyclic dye, CI 52010). The initial pH of the solutions was

107

5.2 for all dye systems. An abiotic control (substrate without fungus) was conducted in parallel. A blank treatment containing no dye was used as a control to evaluate possible color changes due to water extractives liberated by the fungal colonized substrate. Results are expressed as percentage of dye decolorization after 5 h.

In vitro decolorization experiments The decolorization capacity of the cell-free extracts was also evaluated. The reaction was carried out in test tubes at 30 ºC. The reaction mixture contained 1 ml of crude filtrate, and either 20 µM of malachite green or 30 µM of the other dyes assayed. Boiled extracts were used as controls.

RESULTS AND DISCUSSION Growth characteristics: dry weight loss and reducing sugars Time course of reducing sugars and dry weight loss of the substrate are shown in Figure 1. Loss in total dry weight in the substrate was measured after 60 d of fermentation (33-43 %). Data for reducing sugars, produced by enzymatic substrate hydrolysis showed that on day 40 they had been almost completely metabolized. Enzyme activities The time course of lignocellulolytic enzyme production by T. trogii, C. antarcticus and S. hirsutum, in SSF using grape stalks as substrate was studied. Extracts from cultures were assayed to determine the activities of cellulases, xylanases, and ligninases. Figure 2 illustrates the lignocellulolytic enzyme profiles. Laccase (Figure 2A), MnP (Figure 2B), endoglucanase (Figure 2C) and endoxylanase (Figure 2D) were measured. Attempts to detect LiP were unsuccessful. If produced in this medium, LiP levels could be too low to be detected (2). On the other hand, the extraction procedure may not have been appropriate to guarantee the recovery of the enzymes adsorbed on the substrate (46). LiP activity had been previously detected in another T. trogii strain (11). Regarding ligninases, the highest laccase activity (33 U/g) was produced by C. antarcticus after 40 d. On that same date, this fungus also produced the peak of MnP (1.62 U/g); afterwards both activities decreased shar ply. Maximum endoglucanase titers were produced by S. hirsutum after 60 d (10.44 U/g). The highest endoxylanase levels (14.56 U/g) were detected in T. trogii after 20 d of cultivation, but this activity decreased to virtually zero on day 60 post-inoculation. Endoglucanase production by T. trogii followed a similar pattern. Laccase activity of T. trogii as well as endoglucanase and endoxylanase

108

Revista Argentina de MicrobiologĂa (2012) 44: 105-112

(A)

(B)

Figure 1. Time course of dry weight loss (A) reducing sugars (mg/ml of aqueous extract) (B) when culturing T. trogii, C. antarcticus and S. hirsutum on grape stalks.

(A)

(B)

(C)

(D)

Figure 2. Time course of laccase (A), MnP (B), endoglucanase (C) and endoxylanase (D) production by T. trogii, C. antarcticus and S. hirsutum in solid state cultures, grown on grape stalks. Means of three independent experiments with a SD less than 10 % are shown.

activities of S. hirsutum, and C. antarcticus endoglucanase activity reached their peak value on the last sampling day. All these activities, with the exception of the endoglucanase activity from S. hirsutum, showed a lineal increase from day 20 to the last fermentation day. Therefore, higher enzyme activities might have been achieved if the cultivation time had been prolonged. Ligninolytic systems of WRF are mainly activated during the secondary metabolic phase of the fungus

(5). But the three fungi growing in SSF, which were assayed in this study, produced hydrolases along with oxidases also during trophophase in parallel with growth (taking into account that on day 20, glucose was not depleted from the medium), showing that these enzymes may not be secondary metabolites. Previously, lignocellulosic substrates had shown to efficiently induce high amounts of ligninolytic enzymes in other white rot basidiomycetes, for

Fungal lignocellulases and decolorization in grape stalks

example some of the highest records of laccase production were obtained in Coriolopsis rigida (108 U/g) (15) and T. hirsuta (68.4 U/g) (40), both fungi grown on barley bran. The deuteromycete Aspergillus awamori produced 40.4 U/g of endoxylanase and 9.6 U/g of endoglucanase when grown in SSF on grape pomace (7). Although the activities attained in this work are lower than those recorded in such substrates, this is the first report proving the feasibility of using grape stalks as substrate for SSF lignocellulolytic enzyme production by WRF. Because of its low cost, worldwide abundance and the resulting high levels of enzyme production, the SSF using grape stalks as principal substrate could be used to scale up the production of lignocellulases. Dye decolorization The cultures of the three fungi demonstrated potential to decolorize a broad spectrum of chemically different dyes. All the dyes tested were decolorized to some extent, with varying percentages of decolorization (Table 1). Forty-day-old cultures of C. antarcticus showed the highest ability to decolorize the different dyes assayed (in coincidence with maximal laccase and MnP activities determined), attaining percentages of decolorization of about 93, 86, 82, 82, 77, and 58 % for indigo carmine, malachite green, azure B, RBBR, crystal violet and xylidine, respectively, in 5 h. Decolorization was due to two simultaneous effects: the physical process of adsorption on the mycelium, and the enzymatic degradation caused by the ligninolytic enzymes produced by the fungi. Decolorization due to adsorption on the support was negligible, as determined with the abiotic control. Extracting dyes (with alcoholic extraction solution) from heavily colonized substrates for quantification proved difficult. Nevertheless, the role of adsorption in dye decolorization appears to be minimal. The dyes were rapidly removed from the medium, as a

109

result of the physical adsorption process, but they were later eliminated both from the solution and the mat surfaces, as a consequence of the enzymatic degradation. Similar results were obtained recently, when adsorption of a textile dye by dead biomass pellets of T. versicolor was determined and compared with dye removal by enzymatic degradation (4), while adsorption demonstrated to be important in dye decolorization by Pestalotiopsis guepinii (42). The results obtained in this work are in coincidence with previous decolorization studies applying these three strains. The ability of S. hirsutum to decolorize and detoxify indigo carmine, xylidine and malachite green under SSF conditions using either: wheat bran, soya bran or a mixture of both (1:1), had been previously investigated (29). Seventeen-day cultures on soya bran showed the highest decolorization values: 68 % for xylidine (20 µM) after 120 min of contact time, 90 % for malachite green (10 µM) after 90 min. Cultures on wheat bran/soya bran showed to be more efficient to degrade indigo carmine (20 µM) (95 % after 30 min). Polyacrylamide gel electrophoresis revealed a correspondence between decolorization bands and laccase activity bands; thus, laccase activity could be associated with the process of dye decolorization. Detoxification assays were carried out, using the extraction liquid from malachite green degradation. Detoxification of malachite green was up to 100 % after 2 h of contact time (29). T. trogii (BAFC 463) is an outstanding producer of laccase. In an optimized SSF wood-based medium supplemented with malt extract, peptone and copper, it produced up to 901 U/g of laccase and 20 U/g of MnP (21). While in SmF T. trogii extracellular fluids which rendered the highest ligninolytic production (45.32 U/ml laccase, 0.21 U/ml MnP) also showed the greatest ability to decolorize the dyes xylidine, malachite green and anthraquinone blue at rates of 2.14; 1.35 mg and 3 mg dye/l x h, respectively (22). Eighteen day-

Table 1. Degree of decolorization (%/ 5h) of xylidine, crystal violet, remazol brilliant blue R (RBBR), indigo carmine, malachite green and azure B (100 µM) by T. trogii, S. hirsutum and C. antarcticus solid state cultures grown on grape stalks for 40 days

Xylidine Crystal violet RBBR Indigo carmine Malachite green Azure B

T. trogii

S. hirsutum

C. antarcticus

9.6 (1)

7.3

47.5

18.4 (1)

8.4

29.8

3.8(1)

6.4

56.5

26.4(1)

29.3

74.0

3.6(1)

24.5

64.4

14.7(1)

3.5

9.3

110

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 105-112

old C. antarcticus cultures on ME medium were able to decolorize 28 -100 % of five different dyes added in an hour, representing decolorization rates of 5.3, 3.9, 6.6, 22.5, and 22.5 mg/l x h of malachite green, RBBR, xylidine, indigo carmine and Poly R-478, respectively (23). The different rates reflect different capacities of the cultures to remove dyes with diverse chemical structures. Indigo carmine is a dye, which was shown to be easily decolorized by different wood rotting fungi. It can be degraded either by purified laccase, LiP or MnP (16, 34, 36, 37) Jarosz-Wilkoazka et al. (18) also demonstrated that anthraquinonic dyes were decolorized by fungi easier and faster than azoic dyes. A low efficiency of decolorization of some azoic dyes compared to other dye types was also reported for P. chrysosporium and T. versicolor (49). Microorganisms do not readily degrade azoic dyes. Sulpho and azoic groups do not occur naturally, thus sulphonated azoic dyes are recalcitrant to biodegradation. Biodegradability of azoic dyes depends on the presence of very specific changes in their molecular structure. Anthraquinone, azoic and indigoic dyes were decolorized by the laccase of T. versicolor; however, the mechanism of laccase-catalyzed decomposition was different depending on dye structures. Anthraquinone was directly oxidized by the laccase, azoic and indigo dyes were not the substrates of laccase and small molecule metabolites mediated the interaction between the dyes and the enzyme. The decolorization rate of nonsubstrate dyes was limited by the concentration of mediating compounds rather than by laccase activity in the solutions (47). When screening dye decolorizing abilities of WRF, azure B is among the most recalcitrant dyes. This dye is used to detect LiP activity because it is not oxidized by laccase or MnP alone, but it was partially decolorized in the presence of the mediators (2, 9). With the addition of the natural mediator p-coumaric acid, about 60 %

decolorization was achieved in 2 h with Trametes villosa laccase (9). The azure B decolorization ability of Flavodon flavus was tested in ME broth; about 50 % decolorization was achieved after 24 h (36). In the present work, C. antarcticus cultures decolorized 82 % of this dye after 5 h. Decolorization rates obtained in the present study were comparable to or even exceeded those previously reported for the fastest dye-degrading WRF, among them: T. versicolor and P. chrysosporium. C. antarcticus capacity to decolorize the azo dye xylidine (6.6 mg/l x h) is similar to that previously described for T. versicolor in relation to different azo dyes (3 mg/l x h (6) and 5 mg/l x h (48)), and is comparable to that of T. versicolor to decolorize RBBR (3-7 mg/l x h (6)). Moreover, its ability to decolor ize azure B is outstanding. The crude extracellular extracts were able to decolorize some of these dyes but not as efficiently as the cultures (Table 2). In a previous work, when T. versicolor was grown in a submerged culture with glucose as carbon source and the addition of grape stalks, it produced 400 U/l laccase and 36 U/l MnP (27). Sixty-two percent decolorization of phenol red (75 µM) after 72 h was observed when applying the ligninolytic fluids obtained in the abovementioned cultures (25), while indigo carmine (60 µM) was almost completely decolorized after 48 h by the extracellular fluids from T. versicolor grown under the same conditions (27). In our study, the best decolorization was obtained for indigo carmine (74 % after 2 h). Similarly, while Pleurotus ostreatus decolorized 12 of 23 industrial dyes when grown on solid media, the crude extracellular extracts were able to decolorize only 5 dyes, showing that other enzymatic mechanisms could be involved in dye decolorization in vivo experiments (37). Although laccase and MnP were detected in cellfree extracts of the three fungi assayed, probably H2O2 or other necessary factors involved in the catalytic

Table 2. Degree of decolorization (%/ 2h) of malachite green, 20 µM, xylidine, crystal violet, remazol brilliant blue R (RBBR), indigo carmine, and azure B, 30 µM, by T. trogii, S. hirsutum and C. antarcticus cell-free extracts from cultures grown on grape stalks for 40 days T. trogii Xylidine Crystal violet RBBR Indigo carmine Malachite green Azure B (1)

(1)

27.3 80.9(1) 71.81) 75.81) 89.11) 29.11)

S. hirsutum

C. antarcticus

29.5 76.9 73.6 78.7 92.7 84.0

58.4 77.0 82.1 92.8 86.3 81.7

Values represent the mean of three replicates, with a SD of less than 10 %.

Fungal lignocellulases and decolorization in grape stalks

cycle of the enzymes were lacking. These enzymes and their associated components such as H2O2 are present extracellularly, but in biobleaching studies with T. versicolor, Archibald (3) has shown that they must be constantly replenished from active biomass. Mycelial presence becomes significant if decolorization requires such biomass-associated factors. In conclusion, grape stalks appear to be a good choice when searching for lignocellulosic materials to immobilize cultures of WRF for decolorization purposes. The three fungi assayed colonized it very readily producing laccase and MnP activities, the biomass was not easily sloughed off, its integrity was maintained over a long period of time and decolorization rates of a broad spectrum of dyes were high. Moreover, the utilization of this material also helps to solve pollution problems caused by its disposal. Considering the magnitude of the decolorization obtained, the C. antarcticus/ grape stalk system may be employed in the bioremediation of colored effluents without the help of any mediator.

Acknowledgements: the authors are grateful to Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET, Argentina), Universidad de Buenos Aires for financial support and Ing. Jorge A. Ivanissevich from Mendoza Province, for supplying the grape stalks.

REFERENCES 1. Anastasi A, Spina F, Prigione V, Tigini V, Giansanti P, Varese GC. Scale-up of a bioprocess for textile wastewater treatment using Bjerkandera adusta. Bioresour Technol 2010; 101: 3067–75. 2. Archibald FS. A new assay for lignin-type peroxidases employing the dye Azure B. Appl Environ Microbiol 1992; 58: 3110-6. 3. Archibald FS. The role of fungus-fiber contact in the biobleaching of kraft brownstock by Trametes (Coriolus) versicolor. Holzforschung 1992; 4: 305-10. 4. Aretxaga A, Romero S, Sarra M, Vicent T. Adsorption step in the biological degradation of a textile dye. Biotechnol Progress 2001; 17: 664-8. 5. Blanchette RA. Degradation of the lignocellulose complex in wood. Can J Bot 1995; 73: 999-1010. 6. Borchert M, Libra JA. Decolorization of reactive dyes by the white rot fungus Trametes versicolor in sequencing batch reactors. Biotechnol Bioeng 2001; 75: 313-21. 7. Botella C, de Ory I, Webb C, Cantero D, Blandino A. Hydrolytic enzyme production by Aspergillus awamori on grape pomace. Biochem Eng J 2005; 26: 100-6. 8. Bourbonnais R, Paice MG, Reid ID, Lanthier P, Yaguchi M. Lignin oxidation by laccase isozymes from Trametes versicolor and role of the mediator 2,2’-azino-bis (ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) in Kraft lignin depolimerization. Appl Environ Microbiol 1995; 61: 1876-80.

111 9. Camarero S, Ibarra D, Martínez MJ, Martínez AT. Ligninderived compounds as efficient laccase mediators for decolorization of different types of recalcitrant dyes. App Environ Microbiol 2005; 71: 1775-84. 10. Dashtban M, Schraft H, Syed TA, Qin W. Fungal biodegradation and enzymatic modification of lignin. Int J Biochem Mol Biol 2010; 1: 36-50. 11. Dhouib A, Hamza M, Zouari H, Mechichi T, Hmidi R, Labat M, Martínez MJ, Sayadi S. Screening for ligninolytic enzyme production by diverse fungi from Tunisia. World J Microbiol Biotechnol 2005; 21: 1415-23. 12. Diorio LA, Mercuri AA, Nahabedian DE, Forchiassin F. Development of a bioreactor system for the decolorization of dyes by Coriolus versicolor f. antarcticus. Chemosphere 2008; 72: 150-6. 13. Elisashvili VI, Daushvili LP, Zakariashvili NG, Kachlishvili ET, Kiknadze MO, Tusishvili KA. Effect of supplementary carbon sources and exogenous phenolic compounds on the lignocellulolytic system of Cerrena unicolor during the solidstate fermentation of grapevine cutting wastes. Microbiology 1998; 67: 3-37. 14. Glenn JK, Gold MH. Purification and characterisation of an extracellular Mn(II)-dependent peroxidase from the lignin degrading basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. Arch Biochem Biophys 1985; 242: 329-41. 15. Gómez J, Pazos M, Rodríguez Couto S, Sanromán MA. Chesnut shell and barley bran as potential substrates for laccase production by Coriolopsis rigida under solid-state conditions. J Food Eng 2005; 68: 315-9. 16. Grassi E, Scodeller P, Filiel N, Carballo R, Levin L. Potential of Trametes trogii culture fluids and its purified laccase for the decolorization of different types of recalcitrant dyes without the addition of redox mediators. Int Biodeterior Biodegrad 2011; 65: 635-43. 17. Instituto Nacional de Vitivinicultura. Disponible en http:// www.inv.gov.ar/ 18. Jarosz-Wilkolazka A, Kochmanska-Rdest J, Malarczyk E. Fungi and their ability to decolourize azo and anthraquinonic dyes. Enzyme Microb Technol 2002; 30: 566-72. 19. Kokol V, Doliska A, Eichlerova I, Baldrian P, Nerud F. Decolorization of textile dyes by whole cultures of Ischnoderma resinosum and by purified laccase and Mn-peroxidase. Enzyme Microb Technol 2007; 40: 1673-77. 20. Levin L, Melignani E, Ramos AM. Effect of nitrogen sources and vitamins on ligninolytic enzyme production by some white-rot fungi. Dye decolorization by selected culture filtrates. Bioresour Technol 2010; 101: 4554-63. 21. Levin L, Herrmann C, Papinutti L. Optimization of lignocellulolytic enzyme production by the white-rot fungus Trametes trogii in solid-state fermentation using response surface methodology. Biochem Eng J 2008; 39: 207-14. 22. Levin L, Forchiassin F, Viale A. Ligninolytic enzyme production and dye decolorization by Trametes trogii: application of the Plackett-Burman experimental design to evaluate nutritional requirements. Process Biochem 2005; 40: 1381-7. 23. Levin L, Papinutti L, Forchiassin F. Evaluation of Argentinean white rot fungi for their ability to produce lignin-modifying enzymes and decolorize industrial dyes. Bioresour Technol 2004; 94: 169-76.

112

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 105-112

24. Levin L, Forchiassin F, Ramos AM. Copper induction of lignin-modifying enzymes in the white-rot fungus Trametes trogii. Mycologia 2002; 94: 377-83. 25. Lorenzo M, Moldes D, Rodríguez Couto S, Sanromán MA. Improving laccase production by employing different lignocellulosic wastes in submerged cultures of Trametes versicolor. Bioresour Technol 2002; 82: 109-13. 26. Martínez T, Ruiz-Dueñas FJ, Martínez MJ, del Río JC, Gutiérrez A. Enzymatic delignification of plant cell wall: from nature to mill. Curr Opin Biotechnol 2009; 20: 348-57. 27. Moldes D, Lorenzo M, Sanromán MA. Different proportions of laccase isoenzymes produced by submerged cultures of Trametes versicolor grown on lignocellulosic wastes. Biotechnol Lett 2004; 26: 327-30. 28. Moldes D, Gallego PP, Rodríguez Couto S, Sanromán MA. Grape seeds: the best lignocellulosic waste to produce laccase by solid state cultures of Trametes hirsuta. Biotechnol Lett 2003; 25: 491-5. 29. Mouso N, Levin L, Salariato DL, Papinutti VL, Forchiassin F. Decoloración y detoxificación con Stereum hirsutum, basidiomicete de pudrición blanca de la madera. En: Herkovits J, editor. Salud ambiental y humana: una visión holística. Buenos Aires, SETAC Press, 2006, p. 153-8. 30. Mouso N, Papinutti L, Forchiassin F. Efecto combinado del cobre y pH inicial del medio de cultivo sobre la produccion de lacasa y manganeso peroxidasa por Stereum hirsutum (Willd) Pers. Rev Iberoam Micol 2003; 20: 176-8. 31. Nerantzis ET, Tataridis P. Integrated enology-utilization of winery by-products into high added value products. e-JST 2006; 1: 179-89. 32. Nicolini L, Volpe C, Pezzotti A, Carilli A. Changes in in-vitro digestibility of orange peels and distillery grape stalks after solid-state fermentation by higher fungi. Bioresour Technol 1993; 45: 17-20. 33. Perullini M, Jobbágy M, Mouso N, Forschiassin F, Bilmes SA. Silica-alginate-fungi biocomposites for remediation of polluted water. J Mater Chem 2010; 20: 6479-83. 34. Podgornik H, Poljansek I, Perdih A. Transformation of indigo carmine by Phanerochaete chrysosporium ligninolytic enzymes. Enzyme Microb Technol 2001; 29: 166-72. 35. Pointing SB. Feasibility of bioremediation by white-rot fungi. Appl Microbiol Biotechnol 2001; 57: 20-33.

36. Raghukumar C, D’Souza TM, Thorn RG, Reddy CA. Ligninmodifying enzymes of Flavodon flavus, a basidiomycete isolated from a coastal marine environment. Appl Environ Microbiol 1999; 65: 2103-11. 37. Rodriguez E, Pickard MA, Vazquez-Duhalt R. Industrial dye decolorization by laccases from ligninolytic fungi. Current Microbiol 1999; 38: 27-32. 38. Rodríguez Couto S. Dye removal by immobilised fungi. Biotechnol Adv 2009; 27: 227-35. 39. Rodríguez-Couto S, San Román MA. Application of solid state fermentation to ligninolytic enzyme production. Biochem Eng J 2005; 22: 211-9. 40. Rodríguez-Couto S, Rosales C, Gundín M, Sanromán MA. Exploitation of a waste from the brewing industry for laccase production by two Trametes species. J Food Eng 2005; 64: 423-8. 41. Rodríguez-Couto S, Rodríguez R, Gallego PP, Sanromán MA. Biodegradation of grape cluster stems and ligninolytic enzyme production by Phanerochaete chrysosporium during semi-solid-state cultivation. Acta Biotechnol 2003; 23: 65-74. 42. Saparrat M, Nazareno C, Hammer E. Decolorization of synthetic dyes by the deuteromycete Pestalotiopsis guepinii CLPS no. 786 strain. J Basic Microbiol. 2006; 46: 28-33. 43. Shin M, Nguyen T, Ramsay J. Evaluation of support materials for the surface immobilization and decoloration of amaranth by Trametes versicolor. Appl Microbiol Biotechnol 2002; 60: 218223. 44. Singh H, editor. Mycoremediation, Fungal Bioremediation, 1st edition. Hoboken, NJ, John Wiley & Sons Inc, 2006, p. 1-592. 45. Somogyi MJ. Notes on sugar determination. J Biol Chem 1952; 195: 19-23. 46. Souza-Cruz P, Freer J, Siika-Aho M, Ferraz A. Extraction and determination of enzymes produced by Ceriporiopsis subvermispora during biopulping of Pinus taeda wood chips. Enzyme Microb Technol 2004; 34: 228-234. 47. Wong Y, Yu J. Laccase-catalyzed decolorization of synthetic dyes. Water Res 1999; 33: 3512-3520. 48. Yang FC, Yu JT. Development of a bioreactor system using immobilized white rot fungus for decolorization. Part I: cell immobilization and repeated-batch decolorization tests. Bioprocess Eng 1996; 15: 307-310. 49. Young L, Yu J. Ligninase-catalyzed decolorization of synthetic dyes. Water Res 1997; 31: 1187-93.

Recibido.12/7/2011- Aceptado: 6/2/2012

ISSN 0325-7541

Phenol degradation in static cultures by P. chrysogenum ARTÍCULO ORIGINAL

113 Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 113-121

Biodegradation of phenol in static cultures by Penicillium chrysogenum ERK1: catalytic abilities and residual phytotoxicity ERIKA A. WOLSKI1*,VIVIANA BARRERA2, CLAUDIA CASTELLARI3, JORGE F. GONZÁLEZ1 1

Facultad de Ingeniería, Universidad Nacional de Mar del Plata, J. B. Justo 4302 (7600) Mar del Plata; 2IMYZA, CNIA, INTA-Castelar, Castelar; 3Microbiología de Suelos y Alimentos, Unidad Integrada EEA INTA-Balcarce, Facultad de Ciencias Agrarias, Ruta Nacional 226 Km 73,5; Balcarce. Argentina. Correspondence. E-mail: ewolski@mdp.edu.ar

ABSTRACT A phenol-degrading fungus was isolated from crop soils. Molecular characterization (using internal transcribed spacer, translation elongation factor and beta-tubulin gene sequences) and biochemical characterization allowed to identify the fungal strain as Penicillium chrysogenum Thom ERK1. Phenol degradation was tested at 25 °C under resting mycelium conditions at 6, 30, 60, 200, 350 and 400 mg/l of phenol as the only source of carbon and energy. The time required for complete phenol degradation increased at different initial phenol concentrations. Maximum specific degradation rate (0.89978 mg of phenol/day/mg of dry weight) was obtained at 200 mg/l. Biomass yield decreased at initial phenol concentrations above 60 mg/l. Catechol was identified as an intermediate metabolite by HPLC analysis and catechol dioxygenase activity was detected in plate assays, suggesting that phenol metabolism could occur via ortho fission of catechol. Wheat seeds were used as phytotoxicity indicators of phenol degradation products. It was found that these products were not phytotoxic for wheat but highly phytotoxic for phenol. The high specific degradation rates obtained under resting mycelium conditions are considered relevant for practical applications of this fungus in soil decontamination processes. Key words: Penicillium chrysogenum, soil fungus, phenol, biodegradation, phytotoxicity

RESUMEN Biodegradación de fenol en cultivos estáticos por Penicillium chrysogenum ERK 1: habilidades catalíticas y fitotoxicidad residual. Un aislamiento fúngico capaz de degradar fenol como única fuente de carbono y energía fue aislado de suelos agrícolas. La caracterización molecular (basada en el empleo de secuencias de espaciadores de transcriptos internos, de factores de la elongación de la traducción y del gen de la beta-tubulina) y la caracterización bioquímica permitieron identificar a esta cepa como Penicillium chrysogenum Thom ERK1. Se estudió la degradación de fenol a 25 °C en cultivos estáticos con 6, 30, 60, 200, 350 y 400 mg/l de fenol inicial. El tiempo requerido para completar la degradación de fenol aumentó al elevarse las concentraciones iniciales de dicho compuesto. La máxima tasa de degradación específica (0,89978 mg de fenol/día/mg de peso seco) se obtuvo con 200 mg/l. El rendimiento en biomasa disminuyó con concentraciones iniciales de fenol mayores de 60 mg/l. Se identificó al catecol como intermediario metabólico por HPLC y se observó actividad de catecol dioxigenasa en placa, lo que sugiere que el metabolismo de degradación del fenol ocurre vía orto fisión del catecol. Se utilizaron semillas de trigo como indicadores de fitotoxicidad de los productos de degradación. Estos productos no fueron fitotóxicos para trigo, mientras que el fenol mostró una alta fitotoxicidad. La alta tasa de degradación específica obtenida en condiciones estáticas resulta de gran interés para la aplicación de este hongo en procesos de descontaminación de suelos. Palabras clave: Penicillium chrysogenum, hongos del suelo, fenol, biodegradación, fitotoxicidad

INTRODUCTION Soil and water contamination is now considered a serious problem in many industrialized countries. Phenol contamination may arise from a variety of sources of industrial wastewater, such as those from coal refineries, phenol manufacturing pharmaceuticals, industries of resins, paints, dyes, petrochemicals, textiles, pulp and paper mill (9). These phenolic effluents

are being discharged into water bodies and this water is used for agriculture and other purposes. Reports of incidents on phenol contamination in the area are scarce. In 2004, some information sources reported that the Iguazú River (Argentina) was affected by the discharges of petrochemical effluents which contain 0.14 mg/l of phenol and other compounds like manganese and aluminium. For these reasons, wastewaters

114

containing phenol and phenolic compounds need an appropriate treatment before discharging them into the receiving water bodies (20). Many physicochemical techniques are available to degrade these pollutants before discharging them (10). Some of these techniques are effective, but most of them are expensive and may lead to the formation of secondary toxic materials or lower mineralization, or need severe operating conditions (10). For these reasons, biological degradation is a viable and economic alternative, which leads to the complete mineralization of the xenobiotic. On the other hand, bioremediation is a well known treatment for soil contamination, which employs the use of microorganisms that are either naturally occurring or introduced into the soil in order to degrade pollutants (13). Several fungal strains have been reported to degrade phenol as the only source of carbon and energy (5, 12, 18, 19, 24), but many of them are phytopathogens or have high nutritional requirements or fail to colonize the soil and are difficult to apply for soil bioremediation. For these reasons, there is interest in the study of new, non-pathogenic soil fungal isolates. Penicillium species are commonly found in food, indoor air and soils. Particularly, the Penicillium chrysogenum has been found on dried cereals, salted meat and many other low water activity foods, but is also common in indoor air environments and salty soils (22). Several members of the genus Penicillium are good hydrocarbon-assimilating organisms and there are many reports showing their ability to transform xenobiotic compounds into less mutagenic products (4, 10). There are many examples of that: Penicillium simplicissimun SK9117 was able to grow in 800 mg/l of phenol (5), P. chrysogenum CLONA 2 isolate also completely degraded 300 mg/l of phenol in the presence of sodium chloride (58.5 g/l) (4, 9). Most of these studies were carried out in fermentors under intensive stirring. These conditions do not necessarily reflect those prevalent in an actual soil decontamination process. In this work, we repor t the isolation and both molecular and biochemical identification of a P. chrysogenum strain called ERK1, isolated from crop soils in Argentina. This fungus was able to degrade phenol as the only source of carbon and energy with high degradation rates under resting mycelium conditions. This is considered relevant for practical applications in soil decontamination processes where the fungus is also in static conditions. Degradation potential, metabolic intermediate and phytotoxicity assays were carried out.

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 113-121

MATERIALS AND METHODS Chemicals All the reagents used during this study were of analytical grade, except for phenol and catechol that were of chromatographic grade (purity 99 %) from Sigma-Aldrich (St. Louis, USA). HPLCgrade acetonitrile was from Sintorgan (Argentina). Microorganism isolation and growth conditions Soil samples were collected from commercial crop soils from Balcarce, Buenos Aires province, Argentina. The soil samples (3 g weight) were mixed with 10 ml sterile water. Serial dilutions of the culture were prepared and spread on mineral medium agar plates supplemented only with 25 mg/l of phenol as a carbon source. The plates were incubated at room temperature for 3 days. The suspected type of colony was purified and was maintained in potato dextrose agar (PDA, Gibco) at room temperature for 14 days (without phenol). For the degradation assays, the fungus was inoculated directly from the PDA plate into 150 ml of liquid minimal salt medium (LMS) supplemented with different concentrations of phenol as the only source of carbon and energy. The LMS contained: deionized water 1000 ml, MgSO4·7H2O 0.1 g, K2HPO4 0.1 g, NH4NO3 1 g, KCl 0.1g, and 25 µl of trace element solution (in mg/l: MnSO 4 15.4, FeCl3 40, ZnSO4.7H2O 6.3, CuSO 4.5H 2O 2.5, NH4.MO 7.O 2.4H 2O 0.5). pH was adjusted to 6.0. The selected isolates were identified by physiological, biochemical and molecular tests. Morphological characteristics The fungus was inoculated onto different culture media: Malt Extract Agar (MEA, Britania, Argentina), Czapek Yeast extract Agar (CYA, Britania, Argentina) and 25 % Glycerol Nitrate (G25N, Britania, Argentina) to observe the different morphological characteristics (colony diameter, color, pigments, exudates, etc.) for its identification according to Pitt (17), Pitt and Hocking (16) and Samson et al . (21). Antibiotic production In order to confirm that the fungus was a Penicillium chrysogenum isolate, its ability to produce β-lactam antibiotics was analyzed by a diffusion bioassay using Micrococcus luteus (ATCC 9341) as described by Castellari et al. (1),since the diameter of the growth inhibition zone is characteristic for each species and is also used as a complement to identify the fungal isolate (1, 8). The presence of β-lactam antibiotic was also analyzed in the culture medium were P. chrysogenum was grown with phenol as the only source of carbon and energy. Nuclear number per cell To observe the number of nuclei per cell, small portions of mycelia previously grown on PDA in darkness for 24 h at 25 ºC were submerged in 0.01 % acridine orange aqueous solution during 10 seconds. The method applied is a modification from the Yamamoto and Uchida´s staining method (28). The stained mycelium was observed under epifluorescent light with an OLYMPUS BX 51 microscope. Digital photographs were taken using the Cool Snap-Pro System. The number of nuclei was counted in 20 cells.

Phenol degradation in static cultures by P. chrysogenum Ehrlich test The fungal isolate was examined for production of cyclopiazonic acid and other alkaloids reacting with Ehrlich’ reagent using a filter paper method as described by Frisvad and Samson (2). DNA extraction The ERK1 strain was grown on potato dextrose broth (PDB) for 3 days. The mycelium obtained was dried, freezed and disrupted with a hand-operated pellet pestle and DNA was obtained with DNeasy Plant Mini Kit QIAGEN according to the manufacturers´ protocol. The resuspended DNA was stored at -20 ºC. The DNA was quantified by electrophoresis gel with 0.8 % agarose and NanodropTM 2000 (Thermo Scientific). Polymerase Chain Reaction Internal transcribed spacer (ITS). Genomic DNA was amplified with primers ITS1 (5´-TCCGTAGGTGAACCTGCGG3´) and ITS4 (5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´) to amplify the region ITS1-5.8s-ITS2 (33). Amplifications were performed using 20 mM Tris-HCl (pH 8.4), 50 mM KCl, 0.2 mM dNTPs, 0.2 μM primer, 3 mM MgCl2, 0.4 U Taq Invitrogen (Brazil) with 10-100 ng genomic DNA in a 50 μl total volume. The amplification program was as follows: 1 min at 94 ºC, 1 cycle; 15 s at 94 ºC, 15 s at 58 ºC, 15 s at 72 ºC, 30 cycles; 7 min at 72 ºC, 1 cycle. Beta-tubulin. To amplify the beta-tubulin gene, primer pairs Bt2a (5´- GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3´) and Bt2b (5´- ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3´) (3) were applied. Amplifications were performed with the same conditions above with the amplification program reported in reference 22. Translation elongation factor (TEF). The amplification of TEF sequences was performed using the primers/pair Ef728M (5´-CATYGAGAAGTTCGAGAAGG-3´) and Ef2 (5´-GGARGTACCAGTSATCATGTT-3´) following the procedure in Samuels and Ismaiel (23). Sequencing The amplification products were cleaned with the Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (PROMEGA) and visualized with gel electrophoresis using 1 % agarose stained with ethidium bromide. The PCR products were sequenced in both directions under BigDyeTM Terminator v 3.1 (Applied Biosystems) based on the Sanger´s method. The reacted products were purified using ethanol precipitation and run with Genetic Analyzer 3130xlatUGB, Unidad de Genómica, Instituto de Biotecnología, INTA). Contigs were assembled using the CAP3 Sequence Assembly Program (PBIL, France) (6). Phylogenetic Analysis Alignments of the partial beta-tubulin gene sequences were constructed automatically using a built-in CLUSTALW implementation in MEGA software version 4 (27). Phylogenetic and molecular evolutionary analyses were conducted using MEGA 4.1. All positions containing gaps and missing data were eliminated from the dataset (Complete Deletion option). The evolutionary history was inferred using the Maximum Parsimony method; bootstrap analysis was performed in 1000 replicates with random sequence addition (10 replicates) to estimate branch support. The MP tree was obtained using the Close-Neighbor-Interchange algorithm with search level 3 in which the initial trees were obtained with the

115 random addition of sequences (10 replicates). Statistics including tree length (L), consistency index (CI), retention index (RI) and composite index were also calculated. The sequences of the beta-tubulin gene and rDNA-ITS obtained were submitted to GenBank, accession numbers HQ336382 and HQ336383. Thirteen sequences from the GenBank database were used to construct the phylogenetic analyses (Fig. 3); the sequences were chosen to represent sections of Penicillium related with the ERK1 strain, following the classification of Samson et al. (22). Eupenicillium brefeldianum was applied as outgroup taxa. Phenol degradation Degradation of phenol was analized in submerged cultures in 250 ml flasks with 150 ml of LMS medium supplemented at different phenol concentrations as the only source of carbon. Each flask was inoculated with 4 PDA agar discs containing the fungal mycelium. The cultures were incubated at room temperature in the dark in order to avoid phenol destruction under resting mycelium conditions. Non-inoculated flasks with LMS supplemented with phenol were used as controls. At different times after inoculation the mycelium from each flask was filtered and the dry weight was determined. Phenol content of the liquid medium was measured in the filtrates after removal of the mycelia. All experiments were carried out in triplicate. Results show the mean value of three independent experiments. Specific degradation rates were calculated as follows: ΔP/Δt B Where: P is phenol concentration in mg/l, t is time in days, B is biomass in mg of dry weight per litre of reactor volume. Dry weight Dry weight was determined by filtering the mycelium through a Whatman GF/A filter, rinsing twice with distilled water and drying at 100 °C until constant weight. Biomass was calculated as mg of dry weight per volume reactor (l). Analytical methods The concentration of phenol was measured using a Waters HPLC system (Millipore, Waters Division, Milford, Massachusetts, USA) consisting of a Model 590 pump, equipped with a UV detector Model 484 variable-wavelength detector set at 270 nm. A computer equipped with HPLC System Manager Software for windows CSW 32 v.1.4 (2002 DataApex Ltd. Czech Republic) was used to acquire and process chromatographic data. The separation was achieved with a Water Spherisorb ODS2 C18 (5 µm) 4.6 x 250 mm analytical column Millipore Corporation, Milford, Massachusetts, USA. Deionized water: acetonitrile (70:30, vol/vol) isocratic system was used as solvent and the flow rate was maintained at one ml/min. These compounds were identified by comparing their retention time with those of similarly treated external standards and by cochromatography. Under the above conditions, the retention time of phenol and catechol were 10.09 and 5.57, respectively. Plate assays to assess enzymatic activity Qualitative assays were performed on agar plates to determine the enzymatic activity involved in phenol degradation. Laccase, peroxidase (manganese peroxidase and lignin

116 peroxidase) and catechol dioxigenase activities were determined as described by Rubilar-Araneda (19), Levin et al. (11) and Shiffman and Cohen (26), respectively. Phytotoxicity studies The toxicity of the original and the degraded phenol was assessed by measuring the phytotoxicity effect of LMS, LMS supplemented with phenol 400 mg/l and the residue of phenol degradation on seed germination of wheat (Triticum aestivum), according to Osma et al. (15). Five replicates of 10 seeds were used for each treatment. Germination index (GI) was calculated as follows: GI=GP x La/Lc , where GP is the number of germinated seeds expressed as a percentage of control values (LMS). La is the average value of root length in the phenol solutions and Lc is the average value of root length in the control.

RESULTS Identification of the fungal isolate The fungus was grown on MEA, CYA and G25N. Mycelia showed white obverse color in all the media tested (Figure 1). The reverse colors varied from white to yellow. In CYA at 25 °C, the fungus showed yellow exudates and colonies were radially sulcated (Figure 1). The fungus grown in MEA medium did not show green color or penicillia at 25 °C. However, when these plates were stored at 4 °C for one month, green color and penicillia were observed (Figure 2 A). Microscopically, penicillia are terverticillate, smooth walled, the conidia width was 3.75 µm and phialide length 12.3 µm (Figure 2 B). The nuclear number per cell was 1 nucleus in hyphal tips and 2-8 nuclei in mature hyphae.

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 113-121

The fungus also showed inhibitory activity against Micrococcus luteus (ATCC 9341), producing a growth inhibition zone with a diameter of 45 mm in diffusion bioassays, suggesting the production of β-lactam antibiotics (Figure 2 C). The isolate was observed for production of cyclopiazonic acid and other alkaloids by the Ehrlich’s test, but no reaction was observed. Taxonomic identification of the fungus based on Pitt and Hocking (16) shows that the fungus isolated in this work is a Penicillium strain. Genomic DNA obtained with the extraction procedure yielded 35 ng/μl. A fragment of 600 bp in size was obtained with ITS1/4 primer pair. A sequence of 441 bp was obtained from the contig assembly of the sequences in both directions. The comparison with Megablast showed 100 % homology (E value 0.0) with P. chrysogenum and Penicillium comune. A fragment of 455 bp in size was obtained from the amplification with pair primers Bt2a/Bt2b. The TEF amplification product was over 500 bp in size, although the corresponding sequence obtained was 265 bp in size due to technical difficulties with the pair primers tested; therefore, it was rejected for further analyses.

Figure 1. Growth of the fungus on CYA and MEA. A: CYA, 7 days, 25 °C. B: reverse CYA, 25 °C. C: MEA, 7 days, 25 °C. D: reverse MEA, 25 °C.

Figure 2. Biochemical characteristics of the isolate. A: colony growth (one month old) in MEA. B: Penicillin 1000X. C: Antibioticsusceptibility test with Micrococcus luteus (ATCC 9341) (susceptible to β-lactam antibiotics). Clear zones indicate growth inhibition around the disk containing the fungal isolate.

Phenol degradation in static cultures by P. chrysogenum

From the Parsimony Analysis of the beta-tubulin gene sequences, 4 most parsimonious trees with L=242 steps were obtained, CI=0.643836, RI=0.603053 and Composite Index=0.473472. Branches corresponding to partitions reproduced in less than 50 % bootstrap replicates are collapsed. The percentage of replicate trees in which the associated taxa clustered together in the bootstrap test is shown next to the branches. The most parsimonious assignments of ancestral states for site #1 are shown next to each node. There were a total of 359 positions in the final dataset, out of which 64 were parsimony informative

117

(Figure 3). The clades corresponding to the sections showed high bootstrap values, with 70 % for section Chrysogena , 99 % for Roquefortii and 74 % for Viridicata with the exception of Penicillium with 27 %. Phenol degradation For kinetic studies, the fungus was grown in LMS medium supplemented with phenol as the only source of carbon and energy. Phenol degradation was tested at nominal values of 6, 30, 60, 200, 350, 400 mg/l under resting mycelium conditions (Figure 4). The actual values of phenol concentrations measured by HPLC

Figure 3. Phylogenetic tree. Maximum parsimony consensus tree with beta-tubulin gene sequences of type strains of Penicillium taxa. The percentage of replicate trees in which the associated taxa clustered together in the bootstrap test (1000 replicates) is shown next to the branches. Eupenicillium brefeldianum NRRL 710 was applied as an out group. The bars at the right of the cladogram indicate the sections of subgenus Penicillium classified by Samson et al. (2004).

Figure 4. Growth and biodegradation of phenol by P. chr ysogenum in submerged culture. Degradation of phenol was analyzed by HPLC. LMS medium was supplemented at different phenol concentration as the only source of carbon and energy and inoculated with P. chrysogenum. The cultures were incubated in the dark at 25 째C in order to avoid photodestruction of phenol and under resting mycelium conditions. Noninoculated flasks with LMS supplemented with phenol were used as controls. A, B, C, D, E and F corresponding to 6, 30, 60, 200, 350 and 400 mg/l of initial phenol concentrations, respectively.

118

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 113-121

were 6.28, 31, 60.9, 200, 347 and 400 mg/l. The incubation of P. chrysogenum ERK1 in the medium containing phenol as the sole carbon source resulted in an increase in the dry weight of the mycelia over the time, concomitant with the decrease in the concentration of phenol in the culture medium (Figure 4). In the case of 60, 200, 350 and 400 mg/l of phenol, the biomass increases until reaching a plateau value which means that the fungal growth has reached the stationary phase (Figure 4). Biomass yield was calculated for each initial phenol concentration and it decreases with the increase of the initial concentration of phenol until 200 mg/l, after which it remained essentially constant (Table 1). No further dr y weight increase was observed following phenol depletion, which demonstrated the ability of the organism to grow on phenol as the only source of carbon. The time required for complete degradation of the phenol varied at different initial phenol concentrations (Figure 4). Degradation took longer at higher phenol concentrations. For example, on day 6 the degradation percentages were 100 %, 75 %, 51 %, 25.7 %, 26 % and 8 % for 6, 30, 60, 200, 350 and 400 mg/l, respectively. For the initial phenol concentration of 200 and 350 mg/l, the conversion percentages were similar. These results agree with the degradation rates observed for both initial phenol concentration (Table 1). Figure 4 also shows that while the biomass remains constant, the degradation of phenol continues. Specific degradation rates increase until 200 mg/l, where a maximum is observed, and then decrease showing an inhibitory effect (Table 1). These results agree with that observed for biomass yield. The inhibitory activity against M. luteus (ATCC 9341) by P. chrysogenum was analyzed when phenol was used as a carbon source. In these experimental conditions, the fungus did not inhibit M. luteus (ATCC 9341) growth, suggesting that P. chrysogenum did

not produce β-lactam antibiotic when phenol is used as carbon source. HPLC analysis showed that phenol was completely degraded when used at an initial concentration of 200 mg/l (Figure 5 B). Chromatographic profiles revealed the presence of phenol metabolites formed by the fungus at very low concentrations (less than one mg/l) during the kinetic assay (on day 18) (Figure 5 C). One of the major detected compounds had the same retention time (rt) as the external standard catechol. Other products of phenol degradation were found to be minor, but could not be identified structurally. These minor compounds showed peaks around rt: 5.9, 3.29, 3.77 and 3.9, respectively. Neither laccase nor peroxidase activities (Mn peroxidases and Li peroxidases) were detected. However, catechol dioxigenase activity was observed in qualitative assays (data not shown). Fungal mycelium developed a yellow color on the plate sprayed with catechol. Phytotoxicity assay The results of phytotoxicity showed that seed germination was 100 % for wheat in the LMS medium used as a control, 95 % for seeds treated with the products of phenol degradation and 6.25 % for 400 mg/l of phenol. No root elongation was observed in the latter case. Seeds treated with phenol degradation products and control seeds showed similar root elongation, about 14 ± 7.1 mm. Therefore, GI values were: 100 % for both, while seeds treated with 400 mg/l of phenol showed a GI value of 0.4 %.

DISCUSSION Taxonomic identification of the fungus based on Pitt and Hocking (16) shows that the fungus isolated in this work is a Penicillium strain, which produces a β-lactam antibiotic showing an inhibition zone in

Table 1. Kinetic and yield values as a function of substrate concentration Initial phenol concentration (mg/l)

Biomass yield (mg of dry weight/ mg of phenol)

Specific degradation rate (mg of phenol/day/mg of dry weight)

2.29±0.016

0.19±0.012

2.31±0.030

0.33±0.021

1.24±0.082

0.48±0.043

200

0.30±0.013

0.89±0.056

350

0.29±0.056

0.78±0.062

400

0.38±0.040

0.62±0.043

Phenol degradation in static cultures by P. chrysogenum

119

Figure 5. HPLC-chromatogram of phenol biodegradation by P. chrysogenum. Kinetics at 200 mg/l of initial phenol concentration was used for this analysis. A: time zero showing the retention time of phenol (Phe: 10.01 min). B: biodegradation of phenol after 20 days. C: metabolite formed during the kinetic assay on day 18 after inoculation time.

diffusion bioassays lacking phenol, typical of P. chrysogenum, as described by Castellari et al. (1). The phylogenetic analysis based on beta-tubulin gene sequences grouped the species belonging to the same sections together as expected by the comparison with the parsimony analysis performed by Samson et al. (22), although the topology of the tree obtained showed differences with Section Chrysogena as poliphyletic. ERK 1 strain grouped with 93 % bootstrap with P. chrysogenum CBS 306.48. These results are consistent with the high homology observed when analyzed in Megablast with ITS sequences. Although the ITS sequences also yielded high homology with P. commune , the sequence analyses of the beta-tubulin gene allowed to differentiate it in a separate cluster from P. chrysogenum. The relevance of Samson et alâ&#x20AC;&#x2122;s phylogenetic analysis (22) (ibid.) lies in that the authors supported the phylogenetic clades based not only on DNA characters but also on phenotypic characters (morphology and cultural characters). Therefore, from the agreement in molecular and biochemical characterization, it has been demonstrated that the fungal isolate is very closely related to P. chrysogenum.

There are many studies describing the biodegradation of phenol using Penicillium isolates (5, 9, 12, 24, 25). Scow et al. (25) have described the mineralization of phenol at low initial concentrations by a nonidentified Penicillium species. On the other hand, Penicillium frequentans Bi 7/2 and P. simplicissimum SK9117 also use phenol as the only source of carbon and energy (5, 12). P. chysogenum CLONA 2 isolate also completely degrades 300 mg/l of phenol in the presence of sodium chloride (58.5 g/l) (9). Moreover, in this work characterization and degradation potential of a new P. chrysogenum ERK1 strain was studied. This fungus shows high specific degradation rates under resting mycelium conditions; which makes it attractive for practical applications in soil decontamination processes. In addition, preliminary results showed that the fungus was able to grow and degrade phenol in artificially contaminated soils (Data not shown). The specific degradation rates values obtained showed that an inhibition effect occurs. The comparison of the specific degradation rate between P. chrysogenum ERK1 and Penicillium frequentans Bi 7/2 (5) indicates that the rates are in the same order of magnitude, between 500-1000 mg phenol/g dry weight/day. The

120

degradation rates obtained for P. chrysogenum ERK 1 are high considering that cultures were carried out under resting mycelium conditions. In addition, the P. chrysogenum strain used in this work was not previously acclimated; for this reason future kinetics studies using the fungus with a previous acclimation period, different inocula sizes and in the presence of different co-substrates could improve degradation rates. Leitao et al. (9) described that the degradation ability of P. chrysogenum CLONA2 did not correspond to the visible growth of the mycelia. In this work, the results showed that there is a good correspondence between growth and phenol degradation until biomass remains constant. The same was obser ved for Aspergillus fumigatus degrading 200 mg/l of phenol (7). Biomass yield ranges between 2.2932 and 0.2965 (Table 1) depending on the initial phenol concentration. These values are in range with that reported for P. frequentans Bi 7/2 by Hofritcher et al. (9). The results showed that above 200 mg/l, biomass growth remained essentially constant; however P. chr ysogenum continues degrading phenol, suggesting that at this stage phenol is used only for energy requirements. Guedes et al. (4) also described that phenol concentration higher than 300 mg/l completely inhibited fungal growth of P. chrysogenum CLONA 2. A number of toxic compounds are formed during industrial processes, giving multicomponent composition of wastewaters. Therefore, the strains used for decontamination processes should not only be highly active to one contaminant but they should also be tolerant of other pollutants or possess different biodegradation abilities (24) and be adaptable to be used in mixed cultures. P. chrysogenum ERK1 showed to produce β-lactam antibiotic. However, when it was grown with phenol as a carbon source it did not show antibiotic production. In addition, the fungus was also able to degrade 2, 4, 6-trichlorophenol (data not shown). For this reason, this fungus could be used in mixed cultures to improve phenol degradation or to contribute to the degradation of multi-substrates. HPLC analysis detected an intermediate product with identical retention time to catechol; this result suggests that phenol metabolism could occur via ortho fission of catechol. On the contrary, Leitao et al. (9) could not detect catechol as intermediary metabolite. However, they showed the presence of hydroquinone but only when the fungus was grown in the presence of phenol and glucose as co-substrate. When the culture had only phenol as carbon source no intermediary metabolites were detected. Marr et al. (12) identified catechol, hydroquinone and cis, cismuconic acid as intermediary metabolites during the

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 113-121

mineralization of phenol by P. simplicissimum SK9117, showing that phenol degradation occurs via the betaketoadipate pathway. In the present work, other metabolites were also observed in HPLC chromatograms. However, future studies have to be done to determine their chemical structures. Catechol dioxigenase activity observed in plate assays agree with HPLC results, suggesting that phenol metabolism could occur via ortho fission of catechol. Phenolic effluents are being discharged into water bodies and this water can be used for agriculture. These effluents may cause serious environmental problems and health hazards if not treated appropriately. Thus, it is relevant to assess the phytotoxicity of the phenol before and after degradation. To this purpose, the phytotoxicity of plant growing media based on the germination index (GI) of seeds was evaluated as described by Osma et al. (15). This is one of the most common phytotoxic assays used in the literature. The GI combines measurements of relative seed germination and relative root elongation that are both sensitive to the presence of phytotoxic compounds. Several species have been traditionally used for evaluating phytotoxicity. However there are no standardized seed species in use worldwide (15). For this reason, wheat (Triticum aestivum) was used for this assay because it is a common crop in Argentinean fields. According to Osma et al. (15), GI values lower than 50 % mean high phytotoxicity, while values between 50 % and 80 % mean moderate phytotoxicity and values over 80 % indicate that the material is not phytotoxic. Therefore, phenol degradation products were not phytotoxic for wheat. Finally, the P. chrysogenum strain ERK1 described in the present work degrades phenol as the only source of carbon and energy, with high degradation rates and satisfactory biomass yield under resting mycelium conditions. In addition, phenol degradation products did not show any phytotoxic effects. These characteristics make P. chrysogenum ERK1 attractive to be used in phenol decontamination of soils. Acknowledgements: this research was supported by Universidad Nacional de Mar del Plata, Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCYT), and MAPFRE foundation. Dr. Wolski, E. A. is a CONICET staff scientist. We are also grateful to Hector L. Villar for providing the wheat seeds.

Phenol degradation in static cultures by P. chrysogenum

REFERENCES 1. Castellari C, Quadrelli A, Laich F. Surface mycobiota on Argentinean dry fermented sausages. Int J Food Microbiol 2010; 142: 149-55. 2. Frisvad JC, Samson RA. Polyphasic taxonomy of Penicillium subgenus penicillium. A guide to identification of food and air-borne terverticillate penicillia and their mycotoxins. Studies Mycol 2004; 49: 1-174. 3. Glass N, Donaldson G. Development of primer sets designed for use with the PCR to amplify conserved genes from filamentous ascomycetes. Appl Environ Microbiol 1995; 61: 1323-30. 4. Guedes S, Mendes B, Leitão A. Resorcinol degradation by a Penicillium chrysogenum strain under osmotic stress: mono and binary substrate matrices with phenol. Biodegradation 2010; 22: 409-19. 5. Hofrichter M, Gtinther T, Fritsche W. Metabolism of phenol, chloro- and nitrophenols by the Penicillium strain Bi 7/2 isolated from a contaminated soil. Biodegradation 1992; 3: 415-21. 6. Huang X, Madan A. CAP3: A DNA sequence assembly program. Genome Res 1993; 9: 868-77. 7. Jones K, Trudgill P, Hopper D. Evidence of two pathways for the metabolism of phenol by Aspergillus fumigatus. Arch Microbiol 1995; 163: 176-81. 8. Laich F, Fierro F, Martín JF. Production of penicilli in by fungi growing on food products: identification of a complete penicillin gene cluster in Penicillium griseofulvum and a truncated cluster in Penicillium verrucosum. Appl Environ Microbiol 2002; 68: 1211-9. 9. Leitão A, Duarte M, Oliveira J. Degradation of phenol by a halotolerant strain Penicillium chrysogenum. Int Biodeter Biodegrad 2007; 59: 220-5. 10. Leitão A. Potential of Penicillium species in the bioremediation field. Int J Environ Res Public Health 2009; 6: 1393-417. 11. Levin L, Papinutti L, Forchiassin F. Evaluation of Argentinean white rot fungi for their ability to produce lignin-modifying enzymes and decolorize industrial dyes. Biores Technol 2004; 94: 169-76. 12. Marr J, Kremer S, Sterner O, Anke H. Transformation and mineralization of halophenols by Penicillium simplicis simum SK9117. Biodegradation 1989; 7: 165-71. 13. McErlean C, Marchant R, Banat IM. An evaluation of soil colonisation potential of selected fungi and their production of ligninolytic enzymes for use in soil bioremediation applications. Antonie van Leeuwenhoek 2006; 90: 147-58. 14. Nakhla G, Suidan M, Pfeffer J. Control of anaerobic GAC reactors treating inhibitory wastewaters. J Water Pollut Control Fed 1990; 62: 65-72.

121 15. Osma J, Toca-Herrera J, Rodríguez-Couto S. Transformation pathway of Remazol Brilliant Blue R by immobilised laccase. Biores Technol 2010; 101: 8509-14. 16. Pitt J, Hocking A (editors). Fungi and food spoilage. Maryland, Aspen publisher Inc., 1999. 17. Pitt J (editor). The genus Penicillium and its teleomorphic states Eupenicillium and Talaromyces. London, Academic Press, 1979. 18. Rodríguez E, Nuero O, Guillén F, Martínez A, Martínez M. Degradation of phenolic and non-phenolic aromatic pollutants by four Pleurotus species: the role of laccase and versatile peroxidase. Soil Biol Biochem 2004; 36: 909-16. 19. Rubilar-Araneda O. Biorremediación de suelos contaminados con pentaclorofenol (PCF) por hongos de pudrición blanca. PhD tesis 2007. Universidad de la Frontera, Temuco, Chile. 20. Ruiz-Ordaz N, Ruiz-Lagunez J, Castañón-González J, Hernández-Manzano E, Cristiani-Urbina E, Galíndez-Mayer J. Phenol biodegradation using a repeated batch culture of Candida tropicalis in a multistage bubble column. Rev Latinoam Microbiol 2001; 43: 19-25. 21. Samson R, Hoekstra E, Frisvad J, Filtenborg O, editors. Introduction to food- and airborne fungi, 6th edition. The Netherlands, Utrecht: Central Bureau Voor Schimmelcultures, 2002. 22. Samson R, Seifert K, Kuijpers A, Houbraken J, Frisvad J. Phylogenetic analysis of Penicillium subgenus Penicillium using partial beta-tubulin sequences. Studies Mycol 2004; 49: 175-200. 23. Samuels G, Ismaiel A. Trichoderma evansii and T. lieckfeldtiae: two new T. hamatum-like species. Mycologia 2009; 101: 142-56. 24. Santos V, Linardi V. Biodegradation of phenol by filamentous fungi isolated from industrial effluents: identification and degradation potential. Process Biochem 2004; 39: 1001-6. 25. Scow K, Li D, Manilal V, Alexander M. Mineralization of organic compounds at low concentrations by filamentous fungi. Mycol Res 1990; 94: 793-8. 26. Shiffman D, Cohen S. Role of the imp operon of the Streptomyces coelicolor genetic element SLP1: two impencoded proteins interact to autoregulate imp expression and control plasmid maintenance. J Bacteriol 1993; 175: 6767-74. 27. Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Mol Biol Evol 2007; 24: 1596-9. 28. Yamamoto D, Uchida J. Rapid nuclear staining of Rhizoctonia solani and related fungi with acridine orange and with safranin. Mycologia 1982; 74: 145-9.

Recibido: 15/11/2011- Aceptado: 23/4/2011

ISSN 0325-7541

122 ACTUALIZACIÓN

Revista Revista Argentina Argentina de de Microbiología Microbiología (2012) (2012) 44: 44: 122-132 122-132

Bioprospection of marine microorganisms: potential and challenges for Argentina HEBE M. DIONISI*, MARIANA LOZADA, NELDA L. OLIVERA Centro Nacional Patagónico (CONICET-CENPAT), Boulevard Brown 2915, Puerto Madryn (U9120ACD), Chubut, Argentina. *Correspondence. Email: hdionisi@cenpat.edu.ar

ABSTRACT The marine environments of Argentina have a remarkable extension, as well as high biological productivity and biodiversity of both macro- and microorganisms. Despite having a great potential for biotechnological applications, the microorganisms inhabiting these ecosystems remain mostly unexplored and unexploited. In this review, we study the research topics and the interactions among Argentinean laboratories, by analyzing current articles published on biotechnology-related marine microbiology by researchers of this country. In addition, we identify the challenges and opportunities for Argentina to take advantage of the genetic potential of its marine microorganisms. Finally, we suggest possible actions that could improve the development of this research field, as well as the utilization of this knowledge to solve societal needs. Key words: bioprospection, marine microorganisms, challenges, Argentina

RESUMEN Bioprospección de microorganismos marinos: potencialidades y desafíos para Argentina. El medio ambiente marino de la Argentina tiene una notable extensión, como así también una alta productividad biológica y biodiversidad de macro y microorganismos. A pesar de presentar un gran potencial para aplicaciones biotecnológicas, los microorganismos que habitan estos ecosistemas permanecen mayormente inexplorados y sus propiedades aún no explotadas. En este trabajo de revisión, estudiamos los temas de investigación y las interacciones entre grupos de investigación argentinos, por medio del análisis de los artículos publicados hasta el momento en temáticas relacionadas con la aplicación biotecnológica de microorganismos marinos. Además, identificamos los desafíos y las oportunidades para que la Argentina tome ventaja del potencial genético de sus microorganismos marinos. Por último, sugerimos posibles acciones que podrían mejorar el desarrollo de este campo de estudio, como así también la utilización de este conocimiento para resolver las necesidades de la sociedad. Palabras clave: bioprospección, microorganismos marinos, desafíos, Argentina

INTRODUCTION Marine microorganisms remain comparatively untapped in relation to those from terrestrial and freshwater environments. As the extent of marine microbial biodiversity, and consequently natural product potential, seems to be limitless (31), marine ecosystems constitute invaluable sources for bioprospection (33). The partnership between biotechnology and the conceptual framework of microbial ecology (41, 69) provides a golden opportunity for bioprospection of these unexplored environments. The use of molecular techniques for further improvement of these natural capabilities, poses few conceptual limits to the services that these communities might provide. In Argentina, microbial communities inhabiting marine environments remain mostly unexplored and unexploited. In the second part of this review we will recount potential environments for bioprospection in this country, describe the current

research lines in this field as well as identify the challenges and opportunities for Argentina to take advantage of its genetic potential.

MARINE ENVIRONMENTS OF ARGENTINA On the South Western Atlantic Ocean, Argentina has the most extensive continental margin of South America, with an area of approximately 2,000,000 km2 (60). The continental shelf, located between the shoreline and the continental brake, accounts for approximately half of this area (37). It widens progressively to the south, reaching a maximum width of 860 km at 51º S (39). The continental shelf terminates to the east in a sharp break, located between 110 and 165 m water depth (73). The continental slope is intersected by approximately 50 canyons of variable widths and depths (60, 73). The continental rise presents a gentle slope crossed by

Bioprospection of marine microorganisms

various submarine canyons and valleys, located between 3,200 and 5,000 m water depth (60). To the east, the continental rise is connected with the abyssal plain, which reaches a maximum water depth of 6,212 m (32). Water circulation in the Argentine Sea is driven by strong tides, large freshwater discharges such as the La Plata River plume, high wind speeds and, most importantly, by the influence of two boundary currents: Brazil and Malvinas (39, 59). The Malvinas current is part of the northern branch of the Antarctic Circumpolar Current flowing northward along the continental shelf break. These high latitude waters are not as stratified as tropical waters, and thus they are rich in nutrients due to more efficient upward mixing. Warm, nutrientpoor and salty waters of the Brazil current collide with cold, nutrient-rich and relatively fresh waters of the Malvinas current at the Brazil/Malvinas Confluence (25). The location of the collision of these two currents varies seasonally between 30 and 46º S over Buenos Aires province, Argentina. This confluence creates a region of high variability of water mass properties, at a scale of 100-200 km (39). A highly complex vertical stratification structure is formed as a result of the mixing of Subtropical and Subantarctic waters, creating one of the most energetic regions of the world’s oceans (74). Intense intrusions of Malvinas current waters into the northern Patagonia continental shelf occur near 41º S (63). The most obvious evidence of the entry of these nutrient-rich waters is the high level of biological activity found in the Patagonia region, which is considered a Class I marine ecosystem with a productivity rate larger than 300 grC/m2 yr-1 (39). This high productivity has consequences on higher trophic levels as well. For example, fish catch in the Patagonian shelf is one order of magnitude higher than in Southern Brazilian waters (39). The extension of the continental shelf of Argentina allows for the development of a great diversity of marine fronts covering several scales of space and time, in particular from 32º southward (1). Fronts can be defined as a narrow zone with enhanced horizontal gradients of water properties (temperature, salinity, nutrients, etc.) that separates broader areas with different water masses or a different vertical structure (6). Fronts play a paramount role in ecological processes allowing for an exceptionally large primary production, and in many cases enhanced biological activity at higher trophic levels as well (1, 8). In addition, they offer adequate feeding and/or reproductive habitats for nektonic species and they act as retention areas for larvae of benthic species promoting the establishment of adult beds (1). Their main forcing are

123

current convergence, tides, continental run-off, wind, solar heating, bathymetry, among others (1). With more than a century of presence in Antarctica, Argentina maintains a territorial claim in an area located from south of the 60º S latitude to the South Pole, and from 25º to 74º W, which includes the Antarctic Peninsula. Argentina maintains 13 stations in this area, six of them year-round. The productivity of the marine ecosystem surrounding the Antarctic Peninsula is limited by the extreme weather conditions and low light penetration that characterize this area (www.lme.noaa.gov). The Antarctic Peninsula is one of the most rapidly warming regions on Earth, having experienced a 2 ºC increase in the annual mean temperature and a 6 ºC rise in the mean winter temperature since 1950 (23). The glacially sculpted coastline along the west coast of the Antarctic Peninsula is highly convoluted and characterized by deep embayments that are often interconnected by channels, facilitating the transport of heat and nutrients (23). During the ice-free season, a nearshore southward flow circulation is observed along this coast. This current, called the Antarctic Peninsula Coastal Current, might be critical for providing a favorable environment for biological production in this marine ecosystem (47). The circulation at the Weddell Sea, located east of the Antarctic Peninsula, is dominated by the Weddell Gyre. During this clockwise circulation the water loses a significant amount of heat as it travels from the eastern Weddell to the northern tip of the Antarctic Peninsula (72). South of the Weddell Sea, the Filchner-Ronne Ice Shelf is floating over the continental shelf (50). In these structures, ice fragments are usually calved off as icebergs from the ice front, or the ice is melted from the shelf base (50). Interestingly, free-drifting icebergs of the Weddell Sea have been suggested to be hot spots of continual micronutrient release that could serve as areas of increased production and sequestration of organic carbon (77). The Argentinean marine environments, with their notable extension, complex topography and water circulation patterns, as well as high biological productivity and biodiversity, hold numerous niches extremely valuable for the bioprospection of microorganisms with biotechnological potential. In particular, Subantarctic and Antarctic marine regions, remote and mostly pristine, contain microbial communities adapted to extreme climates that are remarkably suitable for bioprospection. In addition, marine fronts offer an exceptional concentration of microbiological life with strong annual cycle (71). In the next sections, research performed by Argentinean

124

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 122-132

researchers on marine microorganisms with biotechnological potential, as well as challenges and opportunities in this field, will be reviewed.

CURRENT RESEARCH LINES In Argentina, scientific research is contributing to the knowledge of marine microorganisms with biotechnological potential in areas such as food and pharmaceutical industries, as well as environmental protection. Table 1 shows, to the best of our knowledge, the studies published in periodic journals or books during the last two decades in biotechnology-related

marine microbiology. Out of a total of 42 articles, 11 characterized marine microorganisms isolated from Subantarctic and Antarctic regions, and/or their enzymes (Table 1). The characterized enzymes from marine isolates include hydrolases of wide industrial use such as glycosidases (15, 17) and proteases (16, 24, 54, 80-84). Cold-adapted enzymes characteristically show high catalytic efficiency at low temperatures and the possibility of heat inactivation, which make them suitable candidates for many biotechnological purposes, including food and feed industry, textile and cleaning industries, biofuel production, fine chemical synthesis, among others (13).

Table 1. Published research articles in biotechnology-related marine microbiology Biotechnological interest Microorganisms Industrial Biotechnology

Pharmaceutical Biotechnology

Lactic acid bacteria

Source

Research topic/Application

Fresh anchovies (Eugraulis anchoita)

Characterization of Leuconostoc and Lactobacillus strains for the development of anchovy-based products

References (5)

Psychrotolerant Munida subrrugosa intestinal content, bacteria Beagle Channel, Tierra del Fuego, (Shewanella sp. G5) Argentina

Cold-active ß-glucosidases for use as food additives

Psychrotolerant bacteria

Seawater and alimentary tracts of various benthonic organisms, Ushuaia coast, Tierra del Fuego, Argentina

Cold-active α-Lrhamnosidases for use as food additives

(28)

Psychrotolerant and psychrophilic bacteria

Seawater and the intestines of benthonic organisms collected from the Beagle Channel, Argentina

Cold-active proteases with industrial applications

(16)

Psychrotolerant Subantarctic sea bacteria (Pseudoalteromonas sp.)

Intracellular α-Lrhamnosidase as debittering agents for fruit juices

(40)

Subantarctic bacteria

Cold active proteases (diverse industrial applications)

(54)

Psychrotrophic Intestinal tract of hake (Merluccius (Pseudoalteromonas hubbsi), San Jorge Gulf, Chubut, sp.) Argentina

Cold active proteases (diverse industrial applications)

(24)

Antarctic bacteria

Seawater, sediments and dead marine animals, Antarctica

Cold active proteases (diverse industrial applications)

Microalgae

Native species

Lipid extraction and characterization for biodiesel production.

(64)

Fungi (Acremonium furcatum)

Intertidal sediments, Buenos Aires coast, Argentina

Amides of D-allo- and Lisoleucine derivatives with antifungal activity for plant biocontrol

(26)

Fungi (Cladosporium sp.)

Intertidal marine sediment, San Antonio Oeste, Rio Negro, Argentina

Long-chain and α,βunsaturated aldehydes with antibacterial activity

(27)

Fungi (Paecilomyces marquandii)

Marine sediments

Ureido sorbicillinol derivative (antimicrobial)

Lactic acid bacteria (Lactococcus lactis TW34)

Odontesthes platensis intestinal tract, northeast coast of Chubut, Argentina

Lactococcal bacteriocin (aquaculture antimicrobial)

Intertidal sediments, Isla de los Estados, Argentina

(15, 17)

(80-84)

(9)

(75)

Bioprospection of marine microorganisms

125

Table 1. Published research articles in biotechnology-related marine microbiology (continued) Biotechnological interest Microorganisms

Source

Research topic/Application

Pharmaceutical Biotechnology

Lactic acid bacteria

Intestinal tract, tegument and gills of marine fish, Chubut coast, Argentina

Antilisterial activity

(79)

Lactic acid bacteria

Intestinal tract, tegument and gills of fish, sediments and water, Bahía Blanca estuary, Argentina

Antimicrobial activity against fish pathogens

(76)

Microalgae (Phaeodactylum tricornutum)

Optimization of methods to increase eicosapentaenoic acid (EPA, 20:5n-3) recovery (various medical applications)

(12)

Psychrotrophic and psychrophilic oildegrading bacteria

Superficial seawater, San Jorge Gulf coast, Chubut, Argentina

Analysis of lipid storage compounds (biofuels and other applications)

Bacteria

Seawater and sediments, Comodoro Rivadavia coast, Argentina

Hydrocarbon-degradation potential and microbial community composition (bioremediation)

Bacteria

Polluted and pristine intertidal sediments, Chubut, Argentina

Alkane biodegradation (bioremediation)

Bacteria (Bacillus subtilis 09)

Intertidal sediments, San Antonio Oeste, Rio Negro, Argentina

Lipopeptide biosurfactant (bioremediation)

Bacteria

Intertidal sediments, Aristizábal and Gravina Peninsulas, Chubut, Argentina

Alkane biodegradation and biosurfactants (bioremediation)

Bacteria

Sediments, Bahía Blanca estuary, Argentina

Hydrocarbon biodegradation (bioremediation)

Bacteria

Oily bilge waste, Chubut, Argentina

Hydrocarbon biodegradation (bioremediation)

Bacteria (Aeromonas, Pseudomonas, Vibrio)

Water, Rio de la Plata estuary, Argentina

Linear alkylbenzene sulfonate biodegradation (bioremediation)

Uncultured environmental bacteria

Marine sediments from Chubut and Tierra del Fuego provinces, Argentina

Characterization and quantification of PAH biodegradation genes (bioremediation)

Bacteria Pseudomonas sp. J26

Intertidal sediments from Patagonia, Argentina

Naphthalene dioxygenase activity (bioremediation)

(70)

Halomonas spp.

Salt brine samples from Bahía Blanca Estuary and seawater from Mar del Plata, Argentina

Chemotactic response to gas oil (bioremediation)

(21)

Microalgae (Phaeodactylum tricornutum)

Strain LFF Pt 01, Lab. Fermentaciones, FBCB, UNL

Carbon metabolism with applications in aquaculture, polyunsaturated fatty acids, pharmaceutical industry

Environmental Biotechnology Bioremediation

Various technological applications

The extensive campaigns carried out by Argentinean researchers at remote, high-latitude marine environments were fundamental to the success of bioprospection in these cases. A major subject of study is the role of marine microbiota in pollutant biodegradation in coastal environments of Argentina. Research studies have involved the analysis of hydrocarbon degradation by isolates, consortia and microbial communities (18, 19, 21, 57, 58, 66, 67), production of lipid storage compounds

References

(2)

(66, 67)

(57) (20, 48, 55, 56) (58)

(18, 19) (51, 52, 53)

(62)

(22, 36, 38)

(3)

by hydrocarbon-degrading bacteria (2) as well as production of microbial surfactants to facilitate biodegradation (20, 48, 56, 58). In addition, bioremediation of bilge waste has been achieved in reactor systems (51-53). More recently, culture-independent techniques, including metagenomics, have been used for an assessment of the diversity of hydrocarbon-degrading bacterial populations and their catabolic pathways, as well as the estimation of biodegradation potential in Patagonian marine sediments (22, 35, 36, 38). The

126

biodegradation of other water pollutants such as linear alkylbenzene sulfonates by marine and estuarine isolates from the Rio de la Plata has also been described (61, 62). Studies in this area led to the identification or isolation of indigenous microorganisms which are particularly valuable for in-situ bioremediation strategies, avoiding environmental safety concerns of using allochthonous inocula. Another important topic addressed by Argentinean researchers is the study of novel antimicrobial compounds produced by marine microorganisms such as fungi (9, 26, 27) or lactic acid bacteria (75, 76, 79). For instance, the latter produce antimicrobial compounds (e.g. bacteriocins) which can be used as biological control agents or food bio-preservatives (10, 29). Another research line developed in Argentina revealed the potential of lactic acid bacteria as functional starter cultures for the development of anchovy-based products (5). Lastly, an issue that presents great potential is the cultivation and study of marine microalgae. These microorganisms have various commercial uses such as animal feedstock, as source of fatty acids for biodiesel and nutraceuticals, and as a source of other high-value biomolecules [(3, 64), Leonardo Curatti, personal communication]. Despite the lack of formal bioprospecting programs in Argentina, in contrast with other countries (42, 68), national research groups have discovered many valuable macromolecules and activities with potential biotechnological applications based on individual-based efforts during the last 20 years.

CHALLENGES AND OPPORTUNITIES Bioprospecting, in its modern form, involves the use of advanced technologies to develop different products exploiting biodiversity (4). In particular, some key technologies, such as omics-driven approaches and novel cultivation strategies, have the potential to generate major breakthroughs in the field, as they allow the access to the yet-to-be-cultured microbial majority. These techniques are usually costly, and for marine bioprospection there are additional high costs associated with the field work. In developing countries, the resources needed to make use of their biodiversity are not always readily available (43). Building and strengthening research capacities in these countries in disciplines such as -omics, systems biology and bioinformatics is essential to allow them to actively participate in the development and commercialization of new products from their often vast microbial biodiversity (78). Besides investments, the implementation of national and

Revista Argentina de MicrobiologĂa (2012) 44: 122-132

regional collaborative research networks optimizes the use of the often scattered available resources, and encourages the utilization of multidisciplinary approaches, essential to this field. Finally, partnerships between research institutions and the local biotech industry as well as research conducted by the private sector constitute an essential gear in this machinery. Argentina belongs to the group of developing countries with an established scientific capacity (30). In particular, science and technology investments in Argentina have significantly increased over the last years. From 2004 to 2008, the proportion of the country gross domestic product (GDP) assigned to science and technology-related activities increased from 0.49 to 0.61 % (46). Although still far from the proportion allocated by developed nations, only Brazil and Chile exceed this level of investment among South American countries. Unlike developed countries, funding of research and development in Argentina mainly comes from the public sector. Government research funding is mainly provided by the National Agency for the Promotion of Science and Technology (ANPCyT) and the National Research Council (CONICET), dependent on the recently created Ministr y of Science, Technology and Productive Innovation (MINCyT). Industry only funds 26.5 % of the total investment, representing 0.14 % of the country GDP, while in countries with high-income economies it funds an average close to 65 %, 1.5 % of their GDP (46). Of an equivalent of approximately 57,000 full-time trained human resources, including researchers, PhD students and technicians working in R&D in Argentina in 2008, only 15 % corresponded to private companies (46). In the National Strategic Plan on Science, Technology and Innovation 2006-2010, biotechnology was defined as a priority area, and under this frame the ANPCyT funded 117 biotechnology-related projects during the 2006-2008 period (45). Furthermore, in 2007 a law was promulgated in Argentina to promote the development of biotechnology innovation and production processes (LEY 26270, (65)). ArgentinaÂ´s most developed biotechnological field is agricultural biotechnology due to its export-oriented agricultural sector, key for the economy of the country (30). As a consequence, public and private investments in the biotechnological field have been mostly allocated in relation to these interests. One example is the creation of INDEAR (Instituto de AgrobiotecnologĂa de Rosario, www.indear.com) an Argentina-based agricultural biotechnology company originated in a private-public partnership. This company recently acquired a second-generation sequencer (Roche 454 GS-FLX Titanium) to address questions

Bioprospection of marine microorganisms

about soil biodiversity and agricultural sustainability. This acquisition positioned Argentina as the second country in South America, after Brazil, having this technology available. Although originally obtained through an agricultural biotechnology research project, this instrument is available as a sequencing service for both the Argentinean scientific community and private companies, and could potentially benefit the field of marine biotechnology. Similarly, an Illumina MiSeq system will be available in 2012 at the sequencing service of the Biotechnology Institute, National Institute of Agropecuary Technology (INTA). Another investment that is relevant for applied marine microbiology, in this case covered by public funds, is the recent relaunching of oceanographic campaigns to the Argentine Sea and Antarctica aboard the Puerto Deseado Oceanographic vessel (www.conicet.gov.ar). This is an excellent opportunity for the bioprospection of marine microorganisms from yet-to-be explored habitats such as benthic environments. Considering the extension of the marine environments in Argentina and the diversity of niches available for bioprospection, there are relatively few research articles published in this field (Table 1). Microbiologists have historically focused mainly on basic and biomedical issues, being research in environmental microbiology much less developed. Within this field, the majority of the research work has focused on microorganisms from terrestrial environments. As an example, in three Argentinean scientific meetings held from October 2010 to May 2011 [46th Annual Meeting, Argentinean Society for Biochemistry and Molecular Biology Research (SAIB) Microbiology Section, XII Argentinean Congress of Microbiology - I Congress of Agricultural and Environmental Microbiology (AAM), and VII General Microbiology Argentinean Congress (SAMIGE)] there were approximately 8 times more abstracts of soil-related environmental microbiology studies than those focused on marine microorganisms, being the former mostly related to agricultural issues. Nonetheless, there has been an important increase in the number of publications in biotechnology-related marine microbiology in the last years, as more than 50 % of the articles were published after 2008 (Figure 1). The increase in the number of presentations at local scientific meetings also evidences this trend. Although in Argentina the research activity is highly centralized in major cities, such as Buenos Aires (46), 34 out of 42 articles have researchers outside Buenos Aires city as corresponding authors (Table 2). The Patagonian National Research Center (CENPAT-CONICET) located

127

in Puerto Madryn, Province of Chubut, leads the field, followed by PROIMI-CONICET from San Miguel de Tucumรกn city, Province of Tucumรกn (Figure 2). Fur ther more, an active collaboration among Argentinean institutions is evidenced by coauthorship (Figure 2). Interestingly, the only two articles with a corresponding author from a foreign institution were published before the year 2000 (Table 1). In subsequent years, although coauthorship with foreign groups has been frequent, the corresponding authors were Argentinean, evidencing the consolidation of research groups in the field. The private sector, in contrast, is a partner in only one full-length publication, in which the corresponding author is from Spain, and the private partner is a Spanish company (Table 2). However, the products of these partnerships are not always reflected in publications, due to confidentiality issues. Published articles in applied marine microbiology show a concentration of research interests, with the majority of the publications focusing on the study of cold-active enzymes, antibacterial compounds or hydrocarbon biodegradation from coastal environments. The existence of few subjects of study in a rather small scientific community has the advantage of allowing the development of productive collaborations within the country, as can be seen in Figure 2. However, this will certainly leave a great number of unexplored issues, and as a consequence, unmet societal needs, for example the development of pharmaceutical products, nutraceuticals or enzymes applicable in green chemical synthesis. It is important to notice that most of the research lines are still early in their exploration, studying applied issues but not

Figure 1. Productivity of Argentinean researchers in applied marine microbiology. The cumulative number of ar ticles published in scientific journals was plotted as a function of time, considering January 1994 to July 2011 time frame.

128

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 122-132

close to producing patents or products. In Argentina, biotechnological patents are still mostly held by foreign individuals and entities. The dependence index (number of patents solicited by non residents/number of patents solicited by residents) for biotechnological patents was 17.7 in 2007-2008 (45). This value is significantly higher than the index for the total of patents in the country, which is 5.5 for the same period (46). As research is an essential prerequisite for the fur ther development of biotechnology (68), it is therefore crucial to stimulate basic and applied research. Product development through private-public partnerships is also fundamental in order to decrease the level of dependence in this field. One example of such collaboration is the one between the Argentinean Antarctic Institute and Bio Sidus S.A. This collaboration aims at isolating bacteria from Antarctica, sequencing their genomes and investigating their cold adapted enzymes useful for industrial purposes (www.biosidus.com.ar/biodiversidad.php). So far, this has resulted in the isolation of a new Antarctic marine bacterial species, Bizionia argentinensis JUB59 (EU021217) and the complete sequence of its genome (GenBank accession number AFXZ01000000) (7, 34). Large scale initiatives for the bioprospection of marine microorganisms including research groups from various fields, government institutions, nongovernment organizations as well as industry would have an even larger impact, driving marine microbial biotechnology research beyond individual-based efforts. Figure 2. Productivity and collaboration among Argentinean research institutions and with foreign institutions. Research institutions, in alphabetical order: CEIMA-UNPSJB: Centro de Estudios e Investigación en Microbiología Aplicada - Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco. CENPAT-CONICET, Centro Nacional Patagónico-CONICET; CERELA-CONICET, Centro de Referencia para Lactobacilos – CONICET; CERZOS-CONICETUNS, Centro de Recursos Naturales Renovables de la Zona Semiárida – CONICET – UNS; CRIDECIT-UNPSJB, Centro Regional de Investigación y Desarrollo Científico Tecnológico Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco sede Comodoro Rivadavia; FCEyN-UBA, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales-Universidad de Buenos Aires; FFyB-UBA, Facultad de Farmacia y Bioquímica-Universidad de Buenos Aires; IAA, Instituto Antártico Argentino; IAL-UNL-CONICET, Instituto de Agrobiotecnología del Litoral- Universidad Nacional del Litoral-CONICET; INIDEP, Instituto Nacional de Investigación y Desarrollo Pesquero; PLAPIQUI-CONICET-UNS, Planta Piloto de Ingeniería Química-CONICET-UNS; PROIMI-CONICET, Planta Piloto de Procesos Industriales y MicrobiológicosCONICET; UNLP, Universidad Nacional de La Pampa; UNMdP: Universidad Nacional de Mar del Plata. UNPSJB Trelew, Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco sede Trelew; UNS, Universidad Nacional del Sur; UNT, Universidad Nacional de Tucumán.

CONCLUSIONS AND POSSIBLE ACTIONS The extreme diversity of the microbial life inhabiting Argentinean marine environments represents a unique source of genetic information that could provide key biotechnological products and processes, if their potential is unveiled. In Argentina, the bioprospection of marine microorganisms is gaining momentum, as demonstrated by the increase in the number of published articles in this field over the last years. Recent increases in funding and research capabilities such as the availability of oceanographic vessels will be fundamental for the exploitation of yet-to-be explored habitats. Active policies tending to strengthen existing scientific capacities, to favor their connections with the private sector and to encourage the creation and development of start-up companies are essential for moving beyond this point, and as a consequence for the development of marine

Bioprospection of marine microorganisms

129

Table 2. Research productivity (measured as number of publications) of Argentinean institutions in biotechnology-related marine microbiology. Articles are described and cited in Supplementary Table 1. The main institution was inferred from the corresponding author´s affiliation. Secondary institutions are listed in order of importance taking into account number of joint publications with the main institution (between parentheses). Country of origin is Argentina unless otherwise noted Main Institution

Other collaborating Institutions

CENPAT-CONICET, Pto. Madryn, Chubut

PLAPIQUI-CONICET, Bahía Blanca, Bs. As. (3) Universidad Nacional de Luján, Luján, Bs. As. (2) PROIMI-CONICET, S.M. de Tucumán, Tucumán (2) UNPSJB, Trelew, Chubut (2)

PROIMI-CONICET, S.M. de Tucumán, Tucumán

Universidad Nacional de Tucumán, S.M. de Tucumán, Tucumán (3) Universidad Nacional de la Pampa, Santa Rosa, La Pampa (3) CENPAT-CONICET, Pto. Madryn, Chubut (1) Friedrich-Schiller-Universität, Germany (2) Universitá di Catania, Italy (1)

Instituto Antártico Argentino, Cdad. de Buenos Aires

FFyB-UBA, Cdad. de Buenos Aires (5)

UNS, Bahía Blanca, Bs. As.

CENPAT-CONICET, Pto. Madryn, Chubut (2) PROIMI-CONICET, S.M. de Tucumán, Tucumán (1)

FCEyN-UBA, Cdad. de Buenos Aires

Universidade Estadual de Campinas, Sao Paulo, Brazil (2)

CRIDECIT-UNPSJB, C. Rivadavia, Chubut

UFZ Leipzig-Halle GMBH, Germany (1)

INIDEP, M. Del Plata, Bs. As.

CRIDECIT-UNPSJB, Comodoro Rivadavia, Chubut CENPAT-CONICET , Puerto Madryn, ChubutComisión Nacional de Energía Atómica, Cdad. de Buenos Aires

CEIMA-UNPSJB, C. Rivadavia, Chubut

Number of publications 12

Universidad Nacional de Mar del Plata, Argentina

Universidad Nacional de la Pampa, La Pampa, Argentina

PROIMI-CONICET, S.M. de Tucumán, Tucumán

CERELA-CONICET, S.M. de Tucumán, Tucumán

University of Helsinki, Finland

Instituto de Agrobiotecnología del Litoral- UNL-CONICET, Santa Fe, Santa Fe

1 1 1

UNPSJB, Trelew, Chubut

CENPAT-CONICET, Puerto Madryn, Chubut

CERZOS-CONICET, Bahía Blanca, Bs. As.

UNS, Bahía Blanca, Bs. As. PLAPIQUI-CONICET, Bahía Blanca, Bs. As.

Universidad de Almería, Almería, Spain

UNPSJB, Comodoro Rivadavia, Chubut Derivados del Etilo S.A., Almería, Spain

Wilhelms-Universität Münster, Münster, Germany

UNPSJB, Comodoro Rivadavia, Chubut

Total articles

biotechnology in the country. It is acknowledged that both a top-down innovation environment (where governments provide large investments required for facilities and capabilities), and a bottom-up innovation environment (led by individuals and organizations engaged in innovation and production) are needed in order for a country to be successful in innovation (14). In fact, bottom-up innovation can also be stimulated by government policies, such as efficient intellectual property policies, transparent and consistent regulations, and tax laws favorable to R&D investment (14). In many countries, the development of marine biotechnology is considered a key strategy for solving significant environmental and societal challenges. Assessments of the situation as well as recommendations for the development of marine biotechnology

are periodically released (11, 42, 44, 49, 68). Optimally, the current Argentinean situation should be analyzed by a committee integrated by experts of various sectors, in order to elaborate specific recommendations for Argentina. However, some of the actions suggested in other countries that we feel could apply to Argentina include: (a) to conduct surveys in the private sector in order to detect current industry needs and opportunities, to better concentrate research efforts; (b) to promote mutually beneficial interaction and collaboration between academic research and industry, and create technology transfer pathways; (c) to enhance the development of new biotech companies by creating marine biotechnological institutes or biotech poles co-located with marine laboratories and/or universities; (d) to include

130

biotechnology training in undergraduate and graduate programs with emphasis in building an interdisciplinary expertise, (e) to implement awareness programs in middle-level education, for students to explore biotechnology-related career options, and (f) to develop a legal framework aiming to regulate the exploitation of marine genetic resources as well as to define rights and intellectual property issues derived from bioprospection of marine microorganisms. The implementation of a national strategy for the development of marine biotechnology with emphasis in microbiology has the potential of contributing to the creation of highly qualified jobs through the further development of the biotech industry. This development has the added value of being able to respond to societal needs by exploiting the country’s readily available marine resources in a sustainable way.

Acknowledgements: We are in debt with all the Argentinean researchers that answered our survey about their research lines. We thank Patricia Dell’Arciprete for her kind contribution with base maps of Argentina, and Andrés L. Rivas for his comments on oceanographic topics. HMD, ML and NLO are researchers from CONICET. HMD and ML (Environmental Microbiology Laboratory, CENPAT-CONICET) are supported by grants from CONICET, ANPCyT, Secretary of Science, Technology and Innovation from Chubut Province, Argentina, and the Community Sequencing Program, Joint Genome Institute, US Depar tment of Energy. NLO (Microbiology Laboratory, CENPAT-CONICET) is financed by grants from CONICET and ANPCyT.

REFERENCES 1. Acha EM, Mianzan HW, Guerrero RA, Favero M, Bava J. Marine fronts at the continental shelves of austral South America: physical and ecological processes. J Mar Syst 2004; 44: 83-105. 2. Alvarez HM, Pucci OH, Steinbüchel A. Lipid storage compounds in marine bacteria. Appl Microbiol Biotechnol 1997; 47: 132-9. 3. Arias DG, Marquez VE, Beccaria AJ, Guerrero SA, Iglesias AA. Purification and characterization of a glutathione reductase from Phaeodactylum tricornutum. Protist 2010; 161: 91-101. 4. Artuso A. Bioprospecting, benefit sharing, and biotechnological capacity building. World Dev 2002; 30: 1355-68. 5. Belfiore C, Björkroth J, Vihavainen E, Raya R, Vignolo G. Characterization of Leuconostoc strains isolated from fresh anchovy (Engraulis anchoita). J Gen Appl Microbiol 2010; 56: 175-80. 6. Belkin IM, Cornillon PC, Sherman K. Fronts in large marine ecosystems. Prog Oceanogr 2009; 81: 223-36. 7. Bercovich A, Vazquez SC, Yankilevich P, Coria SH, Foti M, Hernandez E, Vidal A, Ruberto L, Melo C, Marenssi S, Criscuolo M, Memoli M, Arguelles M, Mac Cormack WP.

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 122-132 Bizionia argentinensis sp. nov., isolated from surface marine water in Antarctica. Int J Syst Evol Microbiol 2008; 58: 2363-7. 8. Bost CA, Cotté C, Bailleul F, Cherel Y, Charrassin JB, Guinet C, Ainley DG, Weimerskirch H. The impor tance of oceanographic fronts to marine birds and mammals of the southern oceans. J Mar Syst 2009; 78: 363-76. 9. Cabrera GM, Butler M, Rodriguez MA, Godeas A, Haddad R, Eberlin MN. A sorbicillinoid urea from an intertidal Paecilomyces marquandii. J Nat Prod 2006; 69: 1806-8. 10. Calo-Mata P, Arlindo S, Boehme K, de Miguel T, Pascoal A, Barros-Velazquez J. Current applications and future trends of lactic acid bacteria and their bacteriocins for the biopreservation of aquatic food products. Food and Bioprocess Technology 2008; 1: 43-63. 11. Campillo L, Béjar F, Amayra J, Uriarte J. La biotecnología en México; situación actual y oportunidades de negocio en el sector biotecnológico de América Latina, 2005; GENES06002. Madrid, España. 12. Cartens M, Grima E, Medina A, Giménez A, González J. Eicosapentaenoic acid (20:5n-3) from the marine microalga Phaeodactylum tricornutum. J Am Oil Chem Soc 1996; 73: 1025-31. 13. Cavicchioli R, Charlton T, Ertan H, Mohd Omar S, Siddiqui KS, Williams TJ. Biotechnological uses of enzymes from psychrophiles. Microb Biotechnol 2011; 4: 449-60. 14. Committee on Global Science and Technology Strategies and their Effect on U.S. National Security. S&T Strategies of Six Countries: Implications for the United States. Washington, DC, National Academy Press, 2010, p. 110. 15. Cristóbal HA, Breccia JD, Abate CM. Isolation and molecular characterization of Shewanella sp. G5, a producer of coldactive β-D-glucosidases. J Basic Microbiol 2008; 48: 16-24. 16. Cristóbal HA, López MA, Kothe E, Abate CM. Diversity of protease-producing marine bacteria from sub-antarctic environments. J Basic Microbiol 2011; 51: 1-11. 17. Cristóbal HA, Schmidt A, Kothe E, Breccia J, Abate CM. Characterization of inducible cold-active [beta]-glucosidases from the psychrotolerant bacterium Shewanella sp. G5 isolated from a sub-Antarctic ecosystem. Enzyme Microb Technol 2009; 45: 498-506. 18. Cubitto MA, Cabezalí CB. Marine bacterium capable of preferential growth on hydrocarbons isolated from Bahía Blanca estuary. Microbios 1994; 77: 15-8. 19.Cubitto MA, Cabezalí CB. Typing and evaluation of hydrocarbon-degrading activity of a bacterial strain isolated from the Bahía Blanca estuary, Argentina. Rev Argent Microbiol 2001; 33: 141-8. 20. Cubitto MA, Morán AC, Commendatore M, Chiarello MN, Baldini MD, Siñeriz F. Effects of Bacillus subtilis O9 biosurfactant on the bioremediation of crude oil-polluted soils. Biodegradation 2004; 15: 281-7. 21. D´ Ippólito S, de Castro RE, Herrera Seitz K. Chemotactic responses to gas oil of Halomonas spp. strains isolated from saline environments in Argentina. Rev Argent Microbiol 2011; 43: 107-10. 22. Dionisi H, Lozada M, Marcos M, di Marzio WD, Loviso C. Aromatic hydrocarbon degradation genes from chronically polluted Subantarctic marine sediments. In: De Bruijn FJ. editors. Handbook of Molecular Microbial Ecology II: Metagenomics in different Habitats. Hoboken, NJ, WileyBlackwell Publisher, 2011, p. 461-73. 23. Ducklow HW, Baker K, Martinson DG, Quetin LB, Ross RM, Smith RC, Stammerjohn SE, Vernet M, Fraser W. Marine pelagic ecosystems: the west Antarctic Peninsula. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 2007; 362: 67-94.

Bioprospection of marine microorganisms 24. Estevao Belchior SG, Vacca G. Fish protein hydrolysis by a psychotrophic marine bacterium isolated from the gut of hake (Merluccius hubbsi). Can J Microbiol 2006; 52: 1266-71. 25. Franco BC, Piola AR, Rivas AL, Baldoni A, Pisoni JP. Multiple thermal fronts near the Patagonian shelf break. Geophys Res Lett 2008; 35: L02607. 26. Gallardo GL, Butler M, Gallo ML, Rodríguez MA, Eberlin MN, Cabrera GM. Antimicrobial metabolites produced by an intertidal Acremonium furcatum. Phytochemistry 2006; 67: 2403-10. 27. Gallo ML, Seldes AM, Cabrera GM. Antibiotic long-chain and [alpha],[beta]-unsaturated aldehydes from the culture of the marine fungus Cladosporium sp. Biochem Syst Ecol 2004; 32: 545-51. 28. Gastón Orrillo A, Ledesma P, Delgado OD, Spagna G, Breccia JD. Cold-active [alpha]-l-rhamnosidase from psychrotolerant bacteria isolated from a sub-Antarctic ecosystem. Enzyme Microb Technol 2007; 40: 236-41. 29. Gatesoupe FJ. The use of probiotics in aquaculture. Aquaculture 1999; 180: 147-65. 30. Hassan MHA. Building capacity in the life sciences in the developing world. Cell 2007; 131: 433-6. 31. Heidelberg KB, Gilbert JA, Joint I. Minireview: Marine genomics: at the interface of marine microbial ecology and biodiscovery. Microb Biotechnol 2010; 3: 531-43. 32. Hernández-Molina FJ, Paterlini M, Somoza L, Violante R, Arecco MA, de Isasi M, Rebesco M, Uenzelmann-Neben G, Neben S, Marshall P. Giant mounded drifts in the Argentine Continental Margin: origins, and global implications for the history of thermohaline circulation. Marine and Petroleum Geology 2010; 27: 1508-30. 33. Kennedy J, Marchesi J, Dobson A. Marine metagenomics: strategies for the discovery of novel enzymes with biotechnological applications from marine environments. Microbl Cell Fact 2008; 7: 27. 34. Lanzarotti E, Pellizza L, Bercovich A, Foti M, Coria SH, Vazquez SC, Dias R.L, Mac Cormack WP, Cicero D, Small C, Marti MA, Turjanski AG. Draft genome sequence of Bizionia argentinensis, isolated from Antarctic surface water. J Bacteriol 2011; 193: 6797-8. 35. Loviso C, Guibert L, Marcos M, Di Marzio WD, Lozada M, Dionisi H. Metagenomic analysis of aromatic ringhydroxylating dioxygenases from cold marine environments. Biocell 2010; 34 supplement: 108. 36. Lozada M, Riva Mercadal JP, Guerrero LD, Di Marzio WD, Ferrero MA, Dionisi HM. Novel aromatic ring-hydroxylating dioxygenase genes from coastal marine sediments of Patagonia. BMC Microbiol 2008; 8: 50. 37. Lutz VA, Boschi EE, Bremec CS, Cousseau MB, Figueroa DE, Rodríguez DH, Scarlato N, Viñas MD, Lewis MN, Penchaszadeh PE, Acuña FH, Aguirre ML, Akselman R, Alder VA, Baldoni A, Barría MS, Bastida RO, Boraso AS, Calvo J, Campagna C, Cañete G, Cassia MC, Cervellini PM, Chiaramonte GE, Costagliola M, Cosulich G, Daponte MC, Díaz de Astarloa JM, Elías R, Esnal GB, Excoffon AC, Freije H, García de la Rosa S, Genzano GN, Giberto DA, Guerrero R, Helbling W, Hoffmeyer MS, Incorvaia IS, Iribarne O, Jaureguizar AJ, Kogan M, Lovrich GA, Madirolas AO, Martin JP, Martos P, Mendoza ML, Marque SM, Mianzán HW, Morriconi ER, Negri RM, Obenat S, Pastor de Ward CT, Pérez de Fankhauser LB, Quintana F, Reta R, Rico R, Roux AM, Sabatini ME, Scelzo MA, Schejter L, Schiavini ACM, Silva RI, Silvoni MG, Spivak E, Trucco MI, Vallarino EA, Zelaya DG. Perspectives of marine biodiversity studies in Argentina. Gayana (Concepción) 2003; 67: 371-82.

131 38. Marcos M, Lozada M, Dionisi H. Aromatic hydrocarbon degradation genes from chronically polluted subantarctic marine sediments. 2009; 49: 602-8. 39. Matano RP, Palma ED, Piola AR. The influence of the Brazil and Malvinas Currents on the southwestern Atlantic shelf circulation. Ocean Sci Discuss 2010; 7: 837-71. 40. Mazzaferro LS, Orrillo GA, Ledesma P, Breccia JD. Dosedependent significance of monosaccharides on intracellular alpha-L-rhamnosidase activity from Pseudoalteromonas sp. Biotechnol Lett 2008; 30: 2147-50. 41. McMahon KD, Martin HG, Hugenholtz P. Integrating ecology into biotechnology. Curr Opin Biotechnol 2007; 18: 287-92. 42. Melgarejo L, Sánchez M, Reyes C, Newmark F, SantosAcevedo M. Plan Nacional en bioprospección continental y marina (propuesta técnica). Serie de Documentos Generales, 2002; 11. Bogotá, Colombia. 43. Millum J. How should the benefits of bioprospecting be shared? Hastings Center Report 2010; 40: 24-33. 44. Ministério da Saúde. Organizaçao Pan-Americana da Saúde. Ministério da Ciencia e Tecnologia. Caracterização do Estado da Arte em Biotecnologia Marinha no Brasil; Série B. Textos Básicos de Saúde, 2010; Brasilia, Brasil. 45. Ministerio de Ciencia Tecnología e Innovación Productiva. Biotecnología. Boletín Estadístico Tecnológico 2010; 4: 1-12. 46. Ministerio de Ciencia Tecnología e Innovación Productiva. Indicadores de Ciencia y Tecnología - Argentina 2008. 2010; Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. 47. Moffat C, Beardsley RC, Owens B, Van Lipzig N. A first description of the Antarctic Peninsula Coastal Current. Deep Sea Res Part 2 Top Stud Oceanogr 2008; 55: 277-93. 48. Morán AC, Olivera N, Commendatore M, Esteves JL, Siñeriz F. Enhancement of hydrocarbon waste biodegradation by addition of a biosurfactant from Bacillus subtilis O9. Biodegradation 2000; 11: 65-71. 49. National Research Council. Marine biotechnology in the twenty-first century: problems, promise, and products. Washington, DC, National Academies Press, 2002 p. 50. Nicholls KW, Østerhus S, Makinson K, Gammelsrød T, Fahrbach E. Ice-ocean processes over the continental shelf of the southern Weddell Sea, Antarctica: A review. Rev Geophys 2009; 47: RG3003. 51. Nievas ML, Commendatore MG, Esteves JL, Bucala V. Biodegradation pattern of hydrocarbons from a fuel oil-type complex residue by an emulsifier-producing microbial consortium. J Hazard Mater 2008; 154: 96-104. 52. Nievas ML, Commendatore MG, Esteves JL , Bucala V. Effect of pH modification on bilge waste biodegradation by a native microbial community. Int Biodeterior Biodegradation 2005; 151-7. 53. Nievas ML, Commendatore MG, Olivera NL, Esteves JL, Bucala V. Biodegradation of bilge waste from Patagonia with an indigenous microbial community. Bioresour Technol 2006; 97: 2280-90. 54. Olivera N, Sequeiros C, Nievas M. Diversity and enzyme properties of protease-producing bacteria isolated from subAntarctic sediments of Isla de Los Estados, Argentina. Extremophiles 2007; 11: 517-26. 55. Olivera NL, Commendatore MG, Delgado O, Esteves JL. Microbial characterization and hydrocarbon biodegradation potential of natural bilge waste microflora. J Ind Microbiol Biotechnol 2003; 30: 542-8. 56. Olivera NL, Commendatore MG, Morán AC, Esteves JL. Biosurfactant-enhanced degradation of residual hydrocarbons from ship bilge wastes. J Ind Microbiol Biotechnol 2000; 25: 70-3.

132

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 122-132

57. Olivera NL, Esteves J, Commendatore MG. Alkane biodegradation by a microbial community from contaminated sediments in Patagonia, Argentina. Int Biodeterior Biodegradation 1997; 40: 75-9. 58. Olivera NL, Nievas ML, Lozada M, del Prado G, Dionisi HM, Siñeriz F. Isolation and characterization of biosurfactantproducing Alcanivorax strains: hydrocarbon uptake strategies and alkane hydroxylase gene analysis. Res Microbiol 2009; 160: 19-26. 59. Palma ED, Matano RP, Piola AR. A numerical study of the Southwestern Atlantic Shelf circulation: stratified ocean response to local and offshore forcing. J Geophys Res 2008; 113: C11010. 60. Parker G, Paterlini CM , Violante RA. El Fondo Marino. In: Boschi E. editors. El Mar Argentino y sus Recursos Pesqueros, vol. 1, Mar del Plata, Argentina, Inst. Nac. de Investigación y Desarrollo Pesquero, 1997 p. 65-87. 61. Peressutti SR, Costagliola M, Alvarez HM. Degradation of dodecylbenzene sulfonate by bacterial consortium isolated from Rio de la Plata estuary. International Biodeterioration and Biodegradation (LABS 5) 2005; 55: 105-8. 62. Peressutti SR, Olivera NL, Babay PA, Costagliola M, Alvarez HM. Degradation of linear alkylbenzene sulfonate by a bacterial consortium isolated from the aquatic environment of Argentina. J Appl Microbiol 2008; 105: 476-84. 63. Piola AR, Martínez Avellaneda N, Guerrero RA, Jardón FP, Palma ED, Romero SI. Malvinas-slope water intrusions on the northern Patagonia continental shelf. Ocean Sci 2010; 6: 345-59. 64. Popovich C, Damiani C, Constenla D, Leonardi P. Lipid quality of the diatoms Skeletonema costatum and Navicula gregaria from the South Atlantic Coast (Argentina): evaluation of its suitability as biodiesel feedstock. J Appl Phycol 2012; 24: 1-10. 65. Presidencia de la Nación. Boletín Oficial de la República Argentina, 2007; CXV. Cdad. Autónoma de Buenos Aires, Argentina. 66. Pucci GN, Acuña A, Tonin N, Tiedemann MC, Pucci OH. Diversidad de bacterias cultivables con capacidad de degradar hidrocarburos de la playa de Caleta Córdova, Argentina. Rev Peru Biol 2010; 17: 237-44. 67. Pucci GN, Acuña AJ, Llanes ML, Tiedemann MC, Pucci OH. Identificación de bacterias marinas cultivables de la ciudad costera Comodoro Rivadavia, Argentina. Rev Biol Mar Oceanogr 2009; 44: 49-58. 68. Querellou J, Børresen T, Boyen C, Dobson A, Höfle M, Ianora A, Jaspars M, Kijjoa A, Olafsen J, Rigos G. Marine biotechnology: realising the full potential of Europe. VLIZ Special Publication 2010; 47: 21. 69. Rittmann B, Hausner M, Loffler F, Love N, Muyzer G, Okabe S, Oerther D, Peccia J, Raskin L, Wagner M. A vista for microbial ecology and environmental biotechnology. Environ Sci Technol 2006; 40: 1096-103. 70. Riva Mercadal JP, Isaac P, Siñeriz F, Ferrero M. Indigo production by Pseudomonas sp. J26, a marine naphthalenedegrading strain. J Basic Microbiol 2010; 50: 290-3.

71. Rivas AL, Pisoni JP. Identification, characteristics and seasonal evolution of surface thermal fronts in the Argentinean Continental Shelf. J Mar Syst 2010; 79: 134-43. 72. Robertson R, Padman L, Levine MD. Fine structure, microstructure, and vertical mixing processes in the upper ocean in the western Weddell Sea. J Geophys Res 1995; 100: 18517-35. 73. Romero SI, Piola AR, Charo M, Eiras Garcia CA. Chlorophyll-a variability off Patagonia based on SeaWiFS data. J Geophys Res 2006; 111: C05021. 74. Saraceno M, Provost C, Piola AR. On the relationship between satellite-retrieved surface temperature fronts and chlorophyll a in the western South Atlantic. J Geophys Res 2005; 110: C11016. 75. Sequeiros C, Vallejo M, Marguet E, Olivera N. Inhibitory activity against the fish pathogen Lactococcus garvieae produced by Lactococcus lactis TW34, a lactic acid bacterium isolated from the intestinal tract of a Patagonian fish. Arch Microbiol 2010; 192: 237-45. 76. Sica MG, Sequeiros C, Brugnoni LI, Marucci PL, Olivera N, Cubitto MA, López Cazorla AC. Estudio de una cepa bacteriana ácido-láctica aislada del estuario de Bahía Blanca para su aplicación como probiótico en acuicultura. In: Cazzaniga NJ, Arelovich HM, editors. Ambientes y recursos naturales del sudoeste bonaerense: producción, contaminación y conservación. Bahía Blanca, Editorial de la Universidad Nacional del Sur, 2009, p. 235-43. 77. Smith KL, Robison BH, Helly JJ, Kaufmann RS, Ruhl HA, Shaw TJ, Twining BS, Vernet M. Free-drifting icebergs: hot spots of chemical and biological enrichment in the Weddell Sea. Science 2007; 317: 478-82. 78. Soplín SP, Muller MR. The Development of an International Regime on Access to Genetic Resources and Fair and Equitable Benefit Sharing in a Context of New Technological Developments; Initiative for the Prevention of Biopiracy Research Documents, 2009; Year IV: 1-16. 79. Vallejo M, Olivera N, Sequeiros C, Marguet E. Actividad antilisteria de bacterias ácido lácticas aisladas de peces marinos. Analecta Veterinaria 2009; 29: 19-23. 80. Vazquez S, Rios Merino L, MacCormack W, Fraile E. Protease-producing psychrotrophic bacteria isolated from Antarctica. Polar Biol 1995; 15: 131-5. 81. Vazquez SC, Coria SH, Mac Cormack WP. Extracellular proteases from eight psychrotolerant antarctic strains. Microbiol Res 2004; 159: 157-66. 82. Vazquez SC, Coria SH, Mac Cormack WP. Properties of extracellular proteases produced by psychrotolerant bacteria isolated in the vicinities of Jubany Station. Reports on Polar and Marine Research 2008; 571: 223-31. 83. Vazquez SC, Hernandez E, Mac Cormack WP. Extracellular proteases from the Antarctic marine Pseudoalteromonas sp. P96-47 strain. Rev Argent Microbiol 2008; 40: 63-71. 84. Vazquez SC, Mac Cormack WP. Effect of isolation temperature on the characteristics of extracellular proteases produced by Antarctic bacteria. Polar Res 2002; 21: 63-71.

Recibido 9/8/2011 − Aceptado 24/10/2011

Endosimbiosis de Arcobacter butzleri en Acanthamoeba castellanii IMÁGENES MICROBIOLÓGICAS

ISSN 0325-7541

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 133 133

Endosimbiosis de Arcobacter butzleri en Acanthamoeba castellanii Endosymbiosis of Arcobacter butzleri in Acanthamoeba castellanii Las amebas de vida libre (AVL), por alimentarse principalmente de bacterias, ejercen un rol importante en el control de las comunidades microbianas del ambiente. Dentro de las AVL se destacan las especies del género Acanthamoeba y, en especial, Acanthamoeba castellanii (2). El género bacteriano Arcobacter, propuesto en 1991 por Vandamme et al. (3), está formado por 13 especies, entre las que se destaca Arcobacter butzleri por ser la de aislamiento más frecuente y por ser considerada un enteropatógeno emergente de carácter zoonótico (1). Diversas investigaciones han documentado la endosimbiosis entre diferentes especies bacterianas y amebas del género Acanthamoeba. Se ha comprobado en A. castellanii una marcada sobrevida del complejo Burkholderia cepacia, Mycobacterium bovis, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus y Campylobacter spp. (3).

Figura 1. Microscopía de contraste de fase (aumento 1250X): trofozoíto de A. castellanii mostrando células de A. butzleri en el interior de vacuolas (flecha)

Tanto A. butzleri como A. castellanii son de carácter ubicuo y también pueden compartir nichos ecológicos, en particular ambientes húmedos (1, 3). Como se desconoce la relevancia de los potenciales reservorios protozoarios con los cuales A. butzleri puede interactuar en la naturaleza y su significación en la dinámica de la epidemiología de esta bacteria, estudiamos en un modelo in vitro la posibilidad de que exista una relación simbiótica entre A. castellanii y A. butzleri. Los resultados preliminares indican que A. butzleri puede ingresar en las amebas y ubicarse en el interior de vacuolas (Figuras 1, 2 y 3). Además, dentro de ellas puede sobrevivir al menos por 10 días, de lo que se infiere que A. castellanii podría constituir un eventual reservorio de A. butzleri en el medio ambiente y actuar como vector, vehiculizando a la bacteria de un ambiente o de un hospedero a otro.

Figura 2. Microscopía de campo claro (tinción de Gram, aumento 1000X): trofozoíto de A. castellanii mostrando células de A. butzleri en el interior de una vacuola (flecha). En el recuadro aumentado se observa la presencia de seis células bacterianas

Figura 3. Microscopía electrónica de transmisión (aumento 8200X): trofozoíto de A. castellanii mostrando células de A. butzleri en el interior de una vacuola (flecha)

Agradecimientos: este trabajo contó con el apoyo financiero de los proyectos FONDECYT 1110202 y S-2007-37 DID-UACH.

BIBLIOGRAFÍA 1. Fernández H, Flores S, Inzunza F. Arcobacter butzleri strains isolated from different sources display adhesive capacity to epithelial cells in vitro. Acta Scientiae Veterinariae 2010; 38: 283-7. 2. Khan N, (editor). Acanthamoeba: Biology and Pathogenesis. Norfolk UK, Caister Academic Press, 2009. 3. Vandamme P, Falsen E, Rossau R, Hoste B, Segers P, Tytgat R, De Ley J. Revision of Campylobacter, Helicobacter, and Wolinella taxonomy: emendation of generic descriptions and proposal of Arcobacter gen. nov. Int J Syst Bacteriol 1991; 41: 88-103.

Heriberto Fernández*, María Paz Villanueva, Gustavo Medina Instituto de Microbiología Clínica. Universidad Austral de Chile Casilla 567, Valdivia, Chile. *E-mail: hfernand@uach.cl

ISSN 0325-7541

134 IMÁGENES MICROBIOLÓGICAS

Revista Revista Argentina Argentina de de Microbiología Microbiología (2012) (2012) 44: 44: 134 134

Querión de Celso - Kerion celsi Paciente de 5 años que presentaba celulitis de cuero cabelludo en la región temporal izquierda y una tumoración eritematosa, indurada, con secreción purulenta que drenaba por múltiples bocas (en espumadera); con costras de tipo melicéricas, alopecia y pediculosis asociada (Figura 1). El paciente se encontraba afebril y sin dolor. Se inició tratamiento antibiótico con cefadroxilo. Debido a la mala evolución se tomó biopsia para estudios microbiológicos. El examen microscópico directo y el cultivo para gérmenes comunes fueron negativos, al igual que el examen microscópico directo para la búsqueda de hongos. Se rotó el tratamiento a ampicilina-sulbactama y corticoides. Posteriormente, ante la falta de mejoría y la persistencia de la supuración y la flogosis, se decidió iniciar empíricamente tratamiento antifúngico con griseofulvina por diagnóstico presuntivo de querión de Celso. A las 48 h de iniciado el esquema antifúngico se evidenció mejoría de las lesiones. Luego de 10 días de incubación de los cultivos en los medios de Lactrimel y Sabouraud se obtuvo desarrollo de un hongo que fue identificado por sus características culturales y microscópicas como Trichophyton mentagrophytes. En la Figura 2 se observa la lesión al cabo de 10 días de tratamiento. La tiña de la cabeza o tinea capitis es una dermatomicosis del cuero cabelludo frecuente en niños de 3 a 7 años, y es muy rara en adultos. Algunos de los factores asociados a su presentación son la higiene personal deficiente, el hacinamiento y el bajo nivel socioeconómico (2, 4). El kerion o querión de Celso es una forma clínica supurativa de la tinea capitis, producida principalmente por Microsporum canis y T. mentagrophytes. La reacción inflamatoria es muy intensa, la lesión sobresale y drena pus por orificios foliculares (1). El nombre de querión (que en griego significa panal) se atribuye a Celso y surgió en Roma, alrededor del año 30 a. C. Durante el siglo XIX, la tiña de la cabeza era un problema de salud pública muy importante y presentaba carácter epidémico. Al parecer, los europeos la introdujeron en el continente americano (4). Trichophyton mentagrophytes es un dermatofito zoófilo que suele producir infecciones inflamatorias en los humanos. En los cultivos, las colonias son granulosas o vellosas, el color del anverso puede ser blanco, crema o amarillento; el reverso suele ser ocre o rojizo (Figura 3). En las preparaciones microscópicas se ven microconidios globulosos dispuestos en racimos y macroconidios de pared fina y lisa en forma de cigarro, con tabiques transversales. Se pueden observar hifas espiraladas en un tercio de las cepas (1, 2, 3) (Figura 4). El tiempo de desarrollo en los cultivos puede variar entre 7 a 10 días o más en algunos casos (2,3).

Figura 1. Aspecto de la lesión antes del tratamiento antifúngico; drenaje por múltiples bocas (en espumadera)

Figura 2. Aspecto de la lesión luego de 10 días de tratamiento antifúngico

BIBLIOGRAFÍA

Figura 3. Aspecto de las colonias en el medio Lactrimel luego de 10 días de incubación

Figura 4. Vista microscópica a 400X obtenida a partir del disgregado del cultivo. Se observan microconidios globulosos dispuestos en racimos e hifas en espiral

1. Arechavala A, Robles A. Micosis Superficiales. En: Basualdo J, Coto C, de Torres R, editores. Microbiología biomédica, 2.a edición. Buenos Aires, Editorial Atlante, 2006, p. 582-96. 2. Arenas R. Dermatofitosis. Micología médica ilustrada. México DF, Nueva Editorial Interamericana, 1993, p. 55-7. 3. Davise H. Medically Important Fungi. A guide to identification, 2 nd edition. Washington DC, ASM Press, 1993, p. 250. 4. Rebollo N, López Barcenas A, Arenasv R. Tiña de la cabeza. Actas Dermosifilogr 2008; 99: 91-100. Mónica S Saiz 1,Lorena P Uribe1, Andrés Gallardo Martínez2. 1 Área Laboratorio de Microbiología; 2 Área Infectología, Clínica San Lucas. Alcorta 752 (8300) Neuquén, Argentina. E-mail: msaiz02@yahoo.com.ar

D-glucosamina reduce la formación de biofilm de Staphylococcus epidermidis

REVISTA ARGENTINA DE

135

INSTRUCCIONES PARA LOS AUTORES

La Revista Argentina de Microbiología (RAM) es una publicación trimestral editada por la Asociación Argentina de Microbiología y destinada a la difusión de trabajos científicos en las distintas áreas de la Microbiología. La Asociación Argentina de Microbiología se reserva los derechos de propiedad y reproducción del material aceptado y publicado. REQUISITOS GENERALES Los manuscritos enviados a esta revista deben constituir informes de investigación original. El envío de un manuscrito implica que los autores tienen las autorizaciones institucionales para proceder a la publicación de los datos y que el mismo manuscrito (u otro de contenido similar) no ha sido previamente publicado (salvo presentaciones parciales en reuniones científicas) ni se encuentra en consideración por otra revista. Los datos originales deberán ser presentados al Comité Editor en caso de ser necesario. Se debe explicitar que los resultados que se muestran provienen de proyectos aprobados por los Comités de Bioseguridad y/o Bioética de las instituciones participantes, así como que respetan la Ley de Habeas Data en caso de incluir datos de pacientes. PRESENTACIÓN DE LOS ORIGINALES Y DERECHOS DE AUTOR Los manuscritos deben dirigirse al Comité Editor de la Revista Argentina de Microbiología acompañados de una nota de acuerdo con el siguiente modelo: “Sres. Comité Editor de la Revista Argentina de Microbiología: en mi carácter de autor responsable declaro que el resto de los autores han acordado que los represente frente a la RAM con respecto al envío del manuscrito …[Título]… y son responsables junto a mí de su contenido. Este trabajo (u otro de contenido similar) no ha sido publicado previamente ni está siendo considerado en otra revista para su publicación. Asimismo, manifiesto mi conformidad de otorgar los derechos de copia (copyright) a la Revista Argentina de Microbiología, una vez concretada la publicación”. Todos los autores de un manuscrito deberán acceder explícitamente a su publicación, serán responsables de la veracidad de los contenidos y deberán explicitar su conformidad para que uno de ellos, que es quien suscribirá la nota arriba citada, actúe como autor para la correspondencia a los fines del manejo editorial. Asimismo, los autores manifestarán su conformidad con la posición de cada uno en la lista de autores, en la que se indicará su filiación académica. Un cambio de autor o de orden de autores sólo será considerado si se solicita mediante una nota firmada por todos los autores a tal efecto. En una carta adjunta, los autores deberán especificar la existencia de conflictos de interés que puedan afectar la evaluación del manuscrito. Estos serán confidenciales y mantenidos en reserva por el Comité Editor. Deben especificarse en la sección agradecimientos las fuentes de financiación para la tarea experimental descrita en el manuscrito, ya sean éstas institucionales, oficiales o privadas. También se deberán especificar en esta sección las afiliaciones comerciales o los vínculos tales como consultorías, así como la copropiedad de licencias con fines comerciales por parte de uno o más autores. El material será analizado por el Comité Editor y sometido a la consideración de dos árbitros científicos designados para cada caso. El Comité Editor se reserva el derecho de rechazar aquellos manuscritos cuyos contenidos se superponen total o parcialmente con trabajos ya publicados, o cuyas temáticas no se correspondan con las de la RAM. Asimismo, son motivos de rechazo la falta de cumplimiento de las reglas editoriales, violaciones éticas, baja calidad científica y un uso pobre del idioma, sea éste inglés o español. El Comité Editor se reserva el derecho de efectuar las modificaciones gramaticales o de estilo que considere necesarias. ORGANIZACIÓN Y FORMATO La RAM acepta artículos originales, informes breves, artículos especiales, imágenes microbiológicas, editoriales y también edita suplementos. Se solicita leer cuidadosamente las especificaciones de cada formato a los efectos de elegir el más apropiado y de esta manera agilizar el proceso de evaluación. Los manuscritos podrán redactarse indistintamente en español o en inglés, aunque el Comité Editor estimula a los autores a escribir los trabajos en inglés para favorecer su difusión y lectura a nivel internacional. Artículos originales. Son trabajos de investigación completos y deben redactarse respetando las siguientes secciones: Título (en español y en inglés) y Título abreviado, Resumen y Palabras clave (en español y en inglés), Introducción, Materiales y métodos, Resultados, Discusión, Agradecimientos y Bibliografía. El manuscrito no deberá exceder las 8000 palabras incluyendo a todas las secciones, con hasta 6 tablas o figuras. Informes breves. Son trabajos de menor extensión, entre los que se incluyen casuísticas, casos clínicos y descripciones de técnicas o dispositivos nuevos, avalados por trabajos experimentales concluyentes. Se debe omitir la división del texto en secciones y todo el manuscrito no podrá exceder las 3000 palabras, con un máximo de quince citas bibliográficas y de tres tablas o figuras. Es necesario un análisis cuidadoso de la presentación de los datos para evitar su reiteración en el texto, en las tablas y en las figuras, a fin de mantener la característica de brevedad de este tipo de artículos. Artículos especiales. Son actualizaciones o consensos de grupos de trabajo acerca de temas de gran interés en el ámbito regional o internacional. Sus autores deben ser especialistas en la materia y el texto debe incluir una revisión bibliográfica amplia y actualizada. Los artículos especiales admiten hasta 10 000 palabras, 8 tablas o figuras y no más de 100 citas bibliográficas. Imágenes microbiológicas. Pueden corresponder a fotos de bacterias, hongos, parásitos o virus, tomadas de exámenes en fresco o con coloraciones, y observadas bajo microscopía óptica, electrónica o de fluorescencia. También se admiten otras imágenes fotográficas, por ejemplo, microorganismos en medios de cultivo, lesiones ilustrativas en pacientes o en animales de experimentación, imágenes radiográficas y ecográficas, de tomografías computarizadas, de resonancia magnética nuclear, etc. Estas imágenes, de gran valor didáctico y no necesariamente excepcionales, deben estar acompañadas de un texto explicativo y de flechas indicadoras, cuando corresponda. El conjunto no debe exceder una página impresa. Los requisitos de calidad para el envío de las imágenes se describen bajo el ítem “Figuras”.

136

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 00-00

Cartas al Editor. Pueden corresponder a comentarios o nuevos datos. Los primeros consisten en observaciones sobre los artículos publicados en la revista; los segundos están destinados a comunicar hallazgos concisos que no son apropiados para su publicación como trabajo completo o informe breve. Ambas clases de contribuciones no deben exceder las 500 palabras, deben tener título en español e inglés, no deben llevar resumen y pueden contener no más de una figura o tabla. Los autores y sus filiaciones aparecerán al pie de la carta. Se debe proporcionar solo la filiación primaria de cada autor. Los comentarios deben hacer mención del volumen y el número en que se publicó el artículo comentado, de su título completo y del apellido del primer autor. Asimismo, deben contener referencias bibliográficas que apoyen el argumento de quien envía la carta. Para considerar la publicación de un comentario, se solicitará primero una respuesta al autor de correspondencia del artículo publicado; la aprobación final y publicación de ambas quedará a criterio del editor. En el caso de una contribución presentada como nuevos datos, ésta se asignará a un editor experto en la materia, quien junto con revisores externos se encargará de su evaluación. Se debe tener en cuenta que algunos de los servicios de indexación no incluyen las Cartas al Editor en sus bases de datos. Editoriales. Abordan tópicos científicos de gran actualidad y particular relevancia para la comunidad científica especializada en la Microbiología, o trabajos de opinión sobre política científica. La oportunidad y autoría de los editoriales, así como sus lineamientos generales, quedan exclusivamente a criterio del Comité Editor. Suplementos. Corresponden a revisiones extensas de un tema específico realizadas por una o varias sociedades científicas o universidades, o a los resúmenes de las contribuciones efectuadas en el marco de eventos científicos organizados por la Asociación Argentina de Microbiología o alguna de sus Divisiones o Filiales (comunicaciones orales, paneles, conferencias, mesas redondas, etc.). Los suplementos estarán a cargo de editores invitados; sus propuestas temáticas y lineamientos generales deberán ser aceptados por el Comité Editor. La revisión de los manuscritos correspondientes a los suplementos estará a cargo de revisores elegidos por el Comité Editor (revisiones extensas) y de los editores invitados (resúmenes de eventos). El suplemento deberá ser financiado en su totalidad por la entidad que ha organizado la reunión científica, la que tendrá en cuenta que el suplemento deberá ser accesible a todos los participantes del evento o a todos los socios de la Asociación Argentina de Microbiología (por suscripción y on-line). Con respecto a la edición, el suplemento deberá respetar exactamente el formato y el estilo de la Revista Argentina de Microbiología en todos sus aspectos (tapa, tipo de papel, impresión, tablas, figuras, fotos, etc.), tal como se describe en este instructivo. Los suplementos correspondientes a los resúmenes de los eventos deben incluir en este orden: nómina de los miembros del Comité Editor de la Revista Argentina de Microbiología, datos de presentación del evento (título completo, lugar y fecha), índice en español y en inglés, agradecimientos, nómina de las autoridades del evento y mensaje/s del/de los presidente/s. A continuación se presentarán los resúmenes numerados desde el uno con números arábigos. Al final del suplemento debe incluirse el índice alfabético de autores y las “Instrucciones para los autores” de la Revista Argentina de Microbiología, en español y en inglés. El programa esquemático del evento sólo se podrá incluir en forma de tríptico, suelto en el interior del suplemento. ELABORACIÓN DE LOS MANUSCRITOS Los manuscritos se deben escribir en hoja A4 con márgenes de 3 cm de lado. Se deberá utilizar formato de fuente Times New Roman, estilo regular, tamaño 12 puntos, a doble espacio. Las letras en negrita o itálica se usarán sólo cuando corresponda. A partir del resumen, se deberán numerar consecutivamente las páginas (en el ángulo inferior derecho) y las líneas del manuscrito. Esto se aplicará tanto para el texto como para las tablas, figuras y leyendas, y también para la bibliografía. Las páginas correspondientes a las tablas, figuras y leyendas se incluirán después de la sección de bibliografía. Carátula. En la primera página se debe indicar el título del trabajo (sólo la primera letra en mayúscula, el resto en minúscula); los autores (primer nombre completo, iniciales de los nombres restantes y apellidos completos de todos los autores); lugar de trabajo (nombre de la institución y dirección postal) y título abreviado del trabajo, de hasta 50 caracteres, para cabeza de página. Si el trabajo incluye autores con distintos lugares de trabajo, se colocarán superíndices numéricos (no encerrados entre paréntesis) junto a los nombres, de manera de identificar a cada autor con su respectivo lugar de trabajo. El autor responsable de la correspondencia se indicará con un asterisco en posición de superíndice ubicado junto al nombre; se detallará su dirección de correo electrónico. En aquellos casos en que uno o varios de los autores hayan cambiado de filiación, se debe consignar la filiación donde se realizó el trabajo y al pie de página, su lugar de trabajo actual. Resúmenes. Se incluirán sólo en los artículos originales, informes breves y artículos especiales y podrán tener una extensión máxima de 250 palabras para los artículos originales y de 150 palabras para los informes breves. El primero de ellos estará redactado en el idioma empleado en el trabajo; el segundo, en el otro idioma y estará encabezado por el título completo del trabajo. Cada uno de ellos estará seguido de una lista de tres a seis palabras clave en el idioma correspondiente. Se debe evitar en los resúmenes el uso de abreviaturas y de citas bibliográficas. Dado que el resumen puede ser publicado separadamente por servicios bibliográficos, se deberá asegurar que resulte comprensible aun en ausencia del texto completo. Introducción. Debe suministrar suficiente y adecuada información sobre el tema en cuestión, como para permitir su comprensión al lector no especializado. Asimismo debe incluir la hipótesis o la base científica que guió el diseño experimental y los objetivos del trabajo definidos con claridad. Las referencias citadas en esta sección deberán ser elegidas muy cuidadosamente y ser las más importantes del tema. Materiales y Métodos. Debe contener una adecuada descripción de los métodos, aparatos, reactivos y procedimientos utilizados, con el detalle suficiente como para permitir la reproducción de los experimentos. Los procedimientos o técnicas comunes y de utilización de rutina pueden citarse por medio de una referencia (ej., determinación de la CIM según el CLSI, 2010). Los métodos nuevos o desarrollados especialmente para el trabajo deben ser descritos con detalle, como así también la fuente de drogas poco comunes o materiales biológicos (cepas bacterianas, virales, fúngicas, plásmidos, etc.). La marca y la procedencia de los reactivos, de los medios de cultivo y de los equipos deben consignarse en el texto la primera vez que se los cita identificando marca, ciudad/ estado (si correspondiera) y país de origen. Resultados. Debe incluir el diseño experimental y su base científica, así como los resultados obtenidos presentados en forma concisa como texto (preferentemente) o como tabla(s) o figura(s). Evite el uso innecesario de tablas y figuras para mencionar datos que podrían ser presentados en el texto. No duplique la misma información incluyéndola en el texto y en las tablas o figuras. Limite el número de fotografías a las mínimas necesarias para mostrar los resultados experimentales. Numere las tablas y figuras en el orden en el que se citan en el texto. Se deben evitar las repeticiones y destacar sólo los datos importantes. Se debe dejar para la sección Discusión la interpretación más extensa. Discusión. Debe hacer énfasis sobre los aspectos más importantes y novedosos del estudio, e interpretar los datos experimentales obtenidos en relación con los ya publicados. Indique las conclusiones a las que se arribó y evite la reiteración de datos y conceptos ya vertidos en secciones anteriores. Se admite la presentación de Resultados y Discusión como una sección conjunta. Agradecimientos. Esta sección se debe presentar en un solo párrafo, en un tamaño de letra menor al usado en el texto del

D-glucosamina reduce la formación de biofilm de Staphylococcus epidermidis 137 manuscrito (Times New Roman, tamaño 11 puntos). Se mencionarán en esta sección las fuentes de financiación y los individuos o instituciones que hayan contribuido con reactivos, materiales biológicos o discusión de resultados. Bibliografía. En todos los manuscritos es conveniente que el 70 % de las citas bibliográficas corresponda a los últimos 10 años y el 30 % restante se distribuya entre los trabajos clave publicados durante los años anteriores. Las citas bibliográficas se deben escribir en hoja aparte y presentarse en orden alfabético de autores, numeradas correlativamente empleando números arábigos. En el texto, las citas deben aparecer con números entre paréntesis, en correspondencia con el número con que aparecen en la bibliografía. Las referencias a comentarios personales y a trabajos inéditos deberán mencionarse en el texto como comunicación personal, escrito entre paréntesis. Para las referencias, se deberán citar la totalidad de los autores y seguir los siguientes modelos: a. Publicaciones periódicas Héritier C, Poirel L, Lambert T, Nordmann P. Contribution of acquired carbapenem-hydrolyzing oxacillinases to carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49: 3198-202. Los títulos de las revistas serán abreviados según el Index Medicus (el listado puede obtenerse en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ sites/entrez?db=journals). b. Capítulos de libros/módulos Martins Teixeira L, Siqueira Carvalho M da G, Facklam RR. Enterococcus. En: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA, editors. Manual of Clinical Microbiology, 9th edition. Washington DC, ASM Press, 2007, p. 430-42. c. Presentaciones en congresos u otros eventos científicos Aguilar M, Punschke K, Touati D, Pianzzola MJ. Estudios fisiológicos y genéticos en la bacteria sulfato reductora Desulfoarculus baarsii. Terceras Jornadas Rioplatenses de Microbiología, 1997, Resumen J2, p. 102, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. d. Presentaciones en congresos u otros eventos científicos reproducidas dentro de un suplemento publicado por una revista de publicación periódica. Fellner MD, Correa RM, Durand K, Teyssié AR, Picconi MA. Análisis del ADN circulante de virus Epstein-Barr (EBV) en pacientes inmunosuprimidos con y sin linfomas asociados. VIII Congreso Argentino de Virología, Resumen 10416. Rev Argent Microbiol 2005; 37 Supl 1: 95. e. Institucionales Clinical and Laboratory Standards Institute. Disk diffusion. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; 15th Informational Supplement, 2005; M100-S15. Wayne, PA, EE.UU. f. Tesis Brizzio A. Aplicación de una PCR múltiple para la identificación de cepas de Staphylococcus aureus toxigénicas. Tesis de Maestría en Microbiología Molecular 2009. ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” y Universidad Nacional de San Martín. g. Referencias on-line 1. Para libros on-line Sullivan CJ, editor. 1999-2001. Fungi: an evolving electronic resource for the microbiological community. ASM Press. [On-line] http://link.asmusa.de/link/service/books/91090. Consultado el 7 de setiembre de 2001. 2. Para versiones on-line de revistas disponibles en forma impresa. van der Zeiss L, Danziger VB. History of clinical microbiology. Clin Microbiol 1999; 100: 123-234. [On-line] 3. Para revistas únicamente disponibles on-line Zellnitz F, Foley PM. October 1998, posting {or revision} date. History of virology. Am Virol J 1998; 1: 30-50. [Online] http://www. avj.html. 4. Para trabajos publicados on-line como manuscritos de publicación adelantada Zheng Z, Zou J. 5 September 2001. The initial step of the glycerolipid pathway: identification of glycerol-3-phosphate/dihydroxyacetone phosphate dual substrate acyltransferases in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 10. 1074/jbc.M104749200. h. Los ítems, referencias a trabajos o a resúmenes de congresos no publicados, en proceso de publicación o bajo revisión; comunicaciones personales; patentes en aplicación o en trámite; bases de datos y páginas web deben ser citadas en el texto entre paréntesis como se muestra: … resultados similares (Gómez H, resultados no publicados) … nuevo protocolo de detección empleado (González JL, enviado para su publicación). … concentraciones de droga (López GO, 34th Intersci Conf Antimicrob Agents Chemother; abstr. 114, 1994). … nueva especie de bacteria celulolítica (Márquez W, comunicación personal) … comentados previamente por diversas fuentes (http://fcen.uba.edu.ar) Tablas. Se presentarán en hoja aparte, numeradas consecutivamente con números arábigos, encabezadas con un breve título explicativo (que en lo posible no reitere los títulos de las filas y las columnas), con las leyendas y/o aclaraciones que correspondan al pie. Las llamadas para las aclaraciones al pie se harán empleando números arábigos entre paréntesis y superíndice. Sólo los bordes externos de la primera y la última fila y la separación entre los títulos de las columnas y los datos se marcarán con línea contínua. No se marcarán las filas ni los bordes de las columnas. Figuras. Se presentarán en hoja aparte, con el número de figura en el margen superior izquierdo y en el orden que aparecen en el texto. Los dibujos deberán estar en condiciones que aseguren una adecuada reproducción. Los números, letras y signos tendrán dimensiones adecuadas para ser legibles cuando se hagan las reducciones necesarias. Las referencias de los símbolos utilizados en las figuras deberán incluirse dentro de la misma figura y no en el texto de la leyenda. Las fotografías podrán ser realizadas en color o en blanco y negro, en el formato JPEG o TIFF. Las resoluciones mínimas requeridas son 300 dpi para las imágenes y fotografías en color y escala de grises, 600 dpi para las imágenes de arte de combinación (letras e imágenes) y 1200 dpi para las imágenes de arte de línea (gráficos y dibujos). Nota: es muy importante que se use una adecuada resolución de archivo. Todas las imágenes individuales que se importan en un archivo gráfico deben estar en la resolución correcta antes de su carga. Tenga en cuenta, sin embargo, que cuanto mayor sea la resolución más grande será el archivo y más tiempo demandará su envío por medios electrónicos. Las leyendas de las figuras se presentarán reunidas en una hoja aparte, ordenadas consecutivamente con números arábigos. Secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos. Las secuencias nuevas comunicadas a través de la publicación en esta revista deberán ser depositadas en una base de datos y sus números de acceso incluidos en el manuscrito, no más tarde de la etapa de revisión. Los números de acceso deberán ser incorporados en un párrafo separado al final de la sección “Materiales y métodos” en el caso de trabajos originales, o luego del texto en el caso de informes breves. La información sobre bases de datos actualmente disponibles es la siguiente: DDBJ: Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan National Institute of Genetics; e-mail. ddbj@ddbj.nig.ac.jp; URL, http://www.ddbj.nig.ac.jp

138

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 00-00

EMBL: EMBL Nucleotide Sequence Submissions, European Bioinformatics Institute; e-mail. datasubs@ebi.ac.uk; URL, http://www.ebi.ac.uk GenBank: National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine; e-mail. info@ncbi.nlm.nih.gov; URL, http:// www.ncbi.nlm.nih.gov En lo que respecta a la presentación de nuevas secuencias de ácidos nucleicos, aquellas de hasta 50 nucleótidos pueden ser presentadas en cualquier estilo. Las secuencias de longitud importante deben ser presentadas como Figuras para reducir espacio, indicando 80 a 120 nucleótidos por línea, en un tipo de letra que lo haga fácilmente legible en las condiciones de publicación (16 cm, ancho de dos columnas de la RAM). De ser posible, se dividirán las líneas de la secuencia en bloques de 10 o 20 nucleótidos separados por un espacio o por números indicativos encima de la secuencia. Las líneas deberán estar numeradas, indicando el número correspondiente a la izquierda de la primera base de cada línea. Las anotaciones necesarias se marcarán en negrita, subrayadas o entre paréntesis. Si se requiriere presentar la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica, se indicará mediante el uso de símbolos de una letra aceptados como indicativos de aminoácidos, los que se localizarán debajo del primer nucleótido del codón codificante. Siglas. Las siglas y demás abreviaciones (cuando esto corresponda) deberán ser explicitadas después de su primera mención en el texto. Las unidades de medida se expresarán siguiendo las normas del Système International d´Unités. ENVÍO DE LOS MANUSCRITOS Los manuscritos podrán ser enviados por correo electrónico (ram@aam.org.ar) o por correo postal (Deán Funes 472, C1214AAD, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina), incluyendo una versión electrónica en CD-ROM, el que deberá estar identificado con una etiqueta o rótulo que indique el nombre del trabajo y los programas (y versiones) usados para confeccionar el texto, las figuras y las fotografías, así como el nombre de los archivos que contiene. Se recomienda incluir todo el texto del artículo en un solo archivo; en caso de haber imágenes, éstas deben enviarse en archivos separados. Se recomienda además tipear las mayúsculas, los espacios entre palabras, las itálicas y las negritas tal como se desea se muestren luego en el impreso; no dejar espacios antes y después de los subtítulos; justificar el texto y usar la tecla de tabulación y no la barra espaciadora para encolumnar las tablas. Se recomienda a los autores revisar la lista de chequeo que figura a continuación de estas instrucciones y verificar que se ha cumplido con todos los requisitos allí señalados. Antes de enviar un manuscrito, es también recomendable consultar algún ejemplar reciente de la RAM para verificar si se han seguido las pautas requeridas de formato y estilo y, eventualmente, efectuar las modificaciones necesarias. Se aconseja a los autores eliminar de las propiedades de los archivos que envíen todo tipo de información que identifique su autoría. PROCESO EDITORIAL Una vez que el manuscrito ha cumplido el proceso editorial y se encuentra listo para su publicación, se enviará por correo electrónico al autor responsable el archivo en formato pdf de la prueba de galera, para que realice las correcciones tipográficas que correspondieran. No podrá cambiar conceptos ni modificar párrafos que alteren el formato de la impresión. Se deberá imprimir el documento, realizar las correcciones sobre el texto y devolverlo por fax o como archivo escaneado por correo electrónico. Las correcciones también pueden ser enviadas por correo electrónico, especificando claramente la página, el párrafo y la línea que se desea corregir. La corrección deberá ser devuelta en un plazo no superior a los siete días corridos de remitida la prueba de galera, caso contrario se considerará como declinada su publicación. En ese momento se le enviará al autor el monto que deberá abonar para que el artículo pueda ser publicado. La Revista Argentina de Microbiología apoya las políticas para el registro de ensayos clínicos de la Organización Mundial de la Salud (OMS) y del International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE), reconociendo la importancia de estas iniciativas para el registro y la divulgación internacional de información sobre estudios clínicos, en acceso abierto. En consecuencia, solamente se aceptarán para publicación los artículos de investigaciones clínicas que hayan recibido un número de identificación en uno de los Registros de Ensayos Clínicos validados por los criterios establecidos por la OMS y el ICMJE, cuyas direcciones están disponibles en el sitio del ICMJE. El número de identificación se deberá registrar al final del resumen. Costo de la página. Por cada página publicada se cobrarán $ 75 o $ 200 si ésta incluye fotografías en color (Argentina, socios de la AAM), $ 200 o $ 600 (Argentina, no socios de la AAM) y USD 70 o USD 180 (otros países). Secretaria: Deán Funes 472, (C1214AAD) Ciudad Autónoma de Buenos Aires - Argentina; Tel.: (54-11) 4932-8858 y (54-11) 4932-8948; e-mail. info@aam.org.ar; http://www.aam.org.ar SUSCRIPCIÓN ANUAL (4 números) Socios AAM Argentina no socios América Latina Otros países

$ $ USD USD

120 240 100 200

Formas de pago Si es socio y abona sus cuotas por débito, puede suscribirse abonando con débito con solo solicitarlo por mail a secretaria@aam.org.ar con copia a contaduria@aam.org.ar Por depósito en Banco Galicia, (cualquier sucursal),cta. cte. Nº 10980/6 007/1, CBU 0070007820000010980619, enviándonos la fotocopia de la boleta de depósito por fax, aclarando nombre, domicilio y concepto del pago, a los TE/FAX: 011 4 932-8858 y 8948 -CUIT: 30-60746436-3 o escaneada por mail a contaduria@aam.org.ar Banco Nación, (cualquier sucursal), cta. cte. Nº 000969700035/74 suc. Bulnes, CBU: 0110697420069700035747, CUIT: 30-60746436-3 enviándonos la fotocopia, idem instrucciones para Bco. Galicia.

ISSN 0325-7541

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 139

Guía para la preparación de los manuscritos La siguiente lista está destinada a servir de guía para la preparación y revisión de su manuscrito de acuerdo con el estilo y formato de la revista. Para más detalles consultar las Instrucciones a los Autores (http://www.aam.org.ar). Los manuscritos que no cumplan con el formato especificado serán devueltos a los autores, retrasándose el proceso de evaluación y publicación.

Título Incluye título en español Incluye título en inglés Incluye título abreviado Autores Identifica al autor responsable Incluye dirección, teléfono y correo electrónico del autor responsable Incluye a todos los autores Incluye el lugar de trabajo de cada autor Incluye nota de presentación del manuscrito por el autor responsable Resúmenes No supera el máximo de palabras permitidas Incluye resumen en español Incluye palabras clave en español Incluye resumen en inglés Incluye palabras clave en inglés Texto No supera el máximo de palabras permitidas No supera el máximo de tablas y/o figuras permitidas Contiene las secciones correspondientes Hace uso correcto de las abreviaciones Cita la marca y procedencia de los reactivos, de los medios de cultivo y de los equipos Cita el número de acceso de las nuevas secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos Tablas y Figuras Incluye cada una en hoja aparte

Los títulos son claros y concisos Incluye las leyendas Las citas en el texto se corresponden con el número de cada tabla y figura Explica las abreviaciones no convencionales al pie de las tablas Envía las figuras y fotografías en archivos adjuntos Bibliografía Respeta estrictamente el formato requerido por la revista Ordena las citas bibliográficas en forma alfabética Incluye las referencias en el texto en correspondencia con el número con el que aparecen en esta sección Agradecimientos Cita las fuentes de financiamiento

Sí

No corresponde

140

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 00-00

REVISTA ARGENTINA DE

INSTRUCTIONS TO AUTHORS

Revista Argentina de Microbiología (RAM) is published by the Asociación Argentina de Microbiología on a quarterly basis. The aim of this journal is to publish current scientific works in the different areas of Microbiology. The Asociación Argentina de Microbiología reserves the right to use, reproduce and publish the accepted material. GENERAL REQUIREMENTS Manuscripts submitted for publication in RAM should be original research articles. Submitting a manuscript for publication implies that the authors have been authorized by the corresponding institutions to publish relevant data and that neither the manuscript nor one with substantially similar content has been previously published, except in the case of partial presentations at scientific meetings, or is being considered for publication by another journal. If necessary, original data should be submitted to the Editorial Board. It should also be made clear that results come from projects approved by the Biosafety and Bioethics Committees of the participating institutions, and that when those results include patient information they conform to the Habeas Data Act. SUBMISSION OF ORIGINALS AND COPYRIGHT Manuscripts should be addressed to the Editorial Board of Revista Argentina de Microbiología accompanied by a cover letter according to the following model: “Dear Editors of Revista Argentina de Microbiología, As corresponding author (to whom correspondence should be addressed), hereby declare that the coauthors have accepted to be represented by myself before RAM with regard to the submission of the manuscript “…Title…”, and they are jointly responsible with me for the contents of this work. Neither this manuscript (nor any other with similar contents) has been previously published or is being considered for publication by another journal. I also agree to transfer copyright to Revista Argentina de Microbiología once published”. All the authors of a manuscript should explicitly authorize its publication and will be responsible for the truthfulness of its contents. They should also express their agreement regarding the choice of one of them to become the corresponding author for editorial purposes. Furthermore, they should express their agreement with respect to their position in the list of authors, indicating their academic affiliation. A change of the corresponding author or in the order of the list of authors shall only be considered by a note signed by all the authors to that effect. The authors shall also disclose any existing conflict of interests that might affect the manuscript assessment on an attached letter. The Editorial Board shall treat all received manuscripts in strict confidence. Funding sources for research work described in the manuscript, either from public or private institutions, commercial affiliations or consultancies, as well as co-ownership of patents for business purposes by one or more authors shall be indicated under the Acknowledgements Section. Contributions will be assessed by the Editorial Board and submitted to the consideration of two scientific referees appointed for each case. The Editorial Board reserves the right to reject those manuscripts whose contents partially or totally overlap with works already published or whose topics are irrelevant to those of RAM. Furthermore, reasons for rejection are non-compliance of editorial requirements, ethical violations, low scientific quality and poor use of language, either English or Spanish. The Editorial Board reserves the right to make all necessary grammatical and style modifications. ORGANIZATION AND FORMAT RAM accepts original articles, brief reports, special articles, microbiological images, editorials and supplements. Careful reading of the specifications for each special format is recommended in order to choose the most adequate one and therefore, to expedite the evaluation proceedings. Manuscripts shall be written in Spanish or English. The Editorial Board encourages authors to use English as their language of choice so that their work reaches wider international scope and readership. Original articles. They are full research papers which must be submitted in accordance to the following sections: Title (in Spanish and English) and Short Title, Abstract and Key words (in Spanish and English), Introduction, Materials and Methods, Results, Discussion, Acknowledgements and References. Manuscripts shall not exceed 8,000 words including all the sections and shall include a maximum of 6 tables or figures. Brief reports. They are less extensive works. They include case reports, descriptions of new tecniques or equipment based on conclusive experimental work. Manuscripts should not be divided into sections and shall not exceed 3,000 words. References should be limited to fifteen citations and tables and figures to a maximum of three. Careful analysis of data presented should be observed so as to avoid their repetition in the text, tables and figures, in order to maintain the typical concision in style that characterizes this type of articles. Special articles. They are updates or workshop results on topics of regional and international weight. Their authors must be specialists in their field of study. Texts must include updated and comprehensive bibliography. Updates may include up to 10,000 words, 8 tables or figures. References should be limited to 100 bibliographic citations. Microbiological images. They may include high-quality pictures of bacteria, fungi, parasites and viruses, from direct observation or staining under optical, electronic or fluorescent microscopy. They may also include other photographic images of microorganisms in culture media, lesions in humans or laboratory animals, x-ray and ultrasound images, computed tomography scans, nuclear magnetic resonance, etc. These images having great instructional value though not necessarily ground-breaking, should be accompanied by an explanatory text and indicating arrows when necessary. The set of images should fit one printed page at most. Quality requirements for images are described under the “Figures” section below. Letters to the Editor. Letters can include either comments or new data. The comments consist in observations made on the articles published in the journal; the latter are aimed at communicating short pieces of work which do not have the appropriate length to be published as a complete work or brief report. Both contributions must not exceed 500 words, they should include the title in Spanish

D-glucosamina reduce la formación de biofilm de Staphylococcus epidermidis 141 and English, they must not have an abstract, and may contain only one figure or table. The authors’affiliations should be placed at the bottom of the letter. Only the primary affiliation of each author should be indicated. The comments should mention the volume and issue number where the article was published, as well as the complete title and the first author’s last name. Furthermore, the sender should mention the bibliographical references that support the letter contents. In order to publish a comment, the corresponding author of the published article will be first consulted, the final decision and publication will remain at the editor‘s discretion. Contributions of new facts will be submitted to a specialist editor with knowledge in the subject matter, who along with external reviewers will assess the information. It should be noted that some journal indexing services do not include Letters to the Editor in their databases. Editorials. They focus on current scientific topics of special relevance to the scientific community specialized in Microbiology, or are opinion works on scientific policies. This section is the sole domain of the Editoral Board, who will determine editorial policy and authorship, as well as the general guidelines. Supplements. They will consist of detailed reviews of a specific subject conducted by one or several scientific organizations or universities, as well as abstracts of contributions presented at scientific meetings or universities organized by the Asociación Argentina de Microbiología or any of its divisions or branches (oral communications, boards, lectures, round tables,etc.), and chaired by guest editors. Topics to be considered in the supplements and general outlines should be approved by the Editorial Board. Revision of manuscripts under the Supplements section will be in charge of reviewers appointed by the Editorial Board in the case of extensive reviewing, and of guest editors in the case of abstracts of meetings. Supplements will be wholly financed by the body organizing the scientific meeting, which will bear in mind that supplements should be distributed among participants to the meetings and all members of the Asociación Argentina de Microbiología either by subscription or on-line. As regards style and format, supplements shall strictly conform to the standards of Revista Argentina de Microbiología in all respects (cover, paper quality, printing, tables and figures, illustrations, etc.), as described in the “Instructions to Authors” section. Supplements corresponding to abstracts of meetings shall include the following information in this order: names of members of the Editorial Board of Revista Argentina de Microbiología, data about the event (complete title, venue and date), content list of meetings (in Spanish and English), acknowledgements, names of organizing officers and message delivered by the Chair/s. Abstracts consecutively numbered in Arabic numerals as from 1 (one) should subsequently follow. An alphabetical index of authors and the English and Spanish versions of the instructions to authors of Revista Argentina de Microbiología should be printed next. The meeting schedule will only be included in the Supplement as a separate leaflet in the form of a triptych. PREPARATION OF MANUSCRIPTS Manuscripts should be written in A4 paper format with 3 cm margins on each side, using Times New Roman font, regular, 12, and double-spaced. Bold and italics printing types should be used when necessary. Counting from the abstract section of the manuscript onwards, all pages should be consecutively numbered in the lower right margin, as well as the manuscript lines. This shall also apply to text, tables, figures, legends and references. Pages including tables, figures and legends shall be included after the References section. Front or title page. The first page shall include the manuscript title using capitals only for the first letter and lowercase for the rest, the author’s names (complete first name, initials of other names and surname of all authors); place of work (institution name and mailing address), and a short title of the work with a maximum of 50 characters as running head. If authors have different working places, the institutional affiliation of each autor shall be indicated by numerical superinscriptions added to their names (not between parenthesis) to identify each author with his/her affiliation. The name of the corresponding author shall be marked by an asterisk in superscript position next to his/her name. The corresponding author’s e-mail shall also be included. If one or several authors have changed his/her/their affiliation, the current affiliation where work was performed should be indicated and the current place of work in a footer. Abstracts. They will only be included in original articles, brief reports and special articles and shall have a maximum of 250 words for original and special articles, and 150 words for brief reports. The first abstract will be written in the language used in the work and the second in the other language. It shall be headed by the complete title of the work. Abstracts shall be followed by a list of three to six key words in the corresponding language. Abbreviations and bibliographic citations should be avoided. A clear understanding of abstracts should be ensured since they may be separately published by bibliographic services. Introduction. It should provide sufficient and relevant information on the topic to be analyzed to allow the understanding of non-specialized readers. It should also include the hypothesis or scientific background that guided the experimental layout of the work as well as its clearly defined objectives. References mentioned in this section should be the most relevant ones with respect to the topic and must be carefully chosen. Materials and Methods. This section should include an accurate and detailed description of the methods, equipment, reagents and procedures used, so that the experiments could be replicated. Frequently used or routine procedures and techniques may be mentioned by specific reference (eg., MIC determination by the CLSI methods, 2010). New methods or those especially developed for the study should be described in detail, as well as infrequent drug sources or biological materials (bacterial, viral, fungal strains and plasmids, etc.). Trademarks and origin of reagents, culture means and equipment should be indicated in the text the first time they are mentioned, identifying the commercial brand name, state and country of origin. Results. It should include the experimental layout and its scientific background as well as the results obtained presented in a concise way preferably as text, or as table/s or figure/s). Unnecessary use of tables and figures to mention data should be avoided when they could be included in the text. Do not repeat the same information in the text and in the tables or figures. Limit the number of photographs to the minimum necessary to support experimental results. Number the tables and figures in the order they are mentioned in the text. Avoid repetitions and include only most relevant data. In-depth interpretation will be included in the Discussion section. Discussion. Emphasis should be placed on important cutting-edge findings; experimental data should be examined in the light of previously published works. Conclusions should be presented avoiding unnecessary repetition of data and concepts already included in preceding sections. Results and Discussion can be presented as a joint section. Acknowledgements. This section shall be typed in smaller printing characters than those used in the manuscript (Times New Roman, 11). Financing sources and names of individuals and/or institutions contributing with reagents, biological material or result discussions should be briefly mentioned. References. It is convenient that 70 % whenever possible of bibliographic citations in all manuscripts correspond to the last 10 years and the remaining 30 % be distributed in key works from previous years. Names of authors cited shall be listed in

142

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 00-00

alphabetical order and numbered in sequence with Arabic numerals on a separate page. Citations in the text should appear in numbers placed between parenthesis, to coincide with the number they have in the References section. Reference to personal comments and un-published works should be presented as personal communication, written between parenthesis. References should include the name of all the authors and conform to the following models: a. Periodical publications Héritier C, Poirel L, Lambert T, Nordmann P. Contribution of acquired carbapenem-hydrolyzing oxacillinases to carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49: 3198-202. Names of journal titles shall be abbreviated according to Index Medicus, a list of which can be obtained at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ sites/entrez?db=journals. b. Chapters of books/modules Martins Teixeira L, Siqueira Carvalho M da G, Facklam RR. Enterococcus. In: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA, editors. Manual of Clinical Microbiology, 9th edition. Washington DC, ASM Press, 2007, p. 430-42. c. Presentations in scientific meetings or other events Aguilar M, Punschke K, Touati D, Pianzzola MJ. Estudios fisiológicos y genéticos en la bacteria sulfato reductora Desulfoarculus baarsii. Terceras Jornadas Rioplatenses de Microbiología, 1997, Abstract J2, p. 102, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. d. Presentations in congresses or other scientific meetings in a supplement published by a periodic academic journal Fellner MD, Correa RM, Durand K, Teyssié AR, Picconi MA. Análisis del ADN circulante de virus Epstein-Barr (EBV) en pacientes inmunosuprimidos con y sin linfomas asociados. VIII Congreso Argentino de Virología, Abstract 10416. Rev Argent Microbiol 2005; 37 Supl 1: 95. e. Institutional publications Clinical and Laboratory Standards Institute. Disk diffusion. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; 15th Informational Supplement, 2005; M100-S15. Wayne, PA, USA. f. Theses Brizzio A. Aplicación de una PCR múltiple para la identificación de cepas de Staphylococcus aureus toxigénicas. Tesis de Maestría en Microbiología Molecular 2009. INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” y Universidad Nacional de San Martín. g. On-line references 1. For on-line Books Sullivan CJ, editor. 1999-2001. Fungi: an evolving electronic resource for the microbiological community. ASM Press. (On-line) http://link.asmusa.de/link/service/books/91090. Accessed 7 September 2001. 2. For on line versions of printed journals van der Zeiss L, Danziger VB. History of clinical microbiology. Clin Microbiol 1999; 100: 123–234. (On-line) 3. For journals only available on-line Zellnitz F, Foley PM. October 1998, posting {or revision} date. History of virology. Am Virol J 1998; 1: 30-50. (On-line) http:// www.avj.html. 4. For manuscripts published on line in advance of their publication Zheng Z, Zou J. 5 September 2001. The initial step of the glycerolipid pathway: identification of glycerol-3-phosphate/dihydroxyacetone phosphate dual substrate acyltransferases in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 10. 1074/jbc.M104749200. g. Items, references to works or congress abstracts not yet published, about to be published or under revision, personal communications, existing or pending patents, databases and web pages shall be mentioned in the text between parenthesis as shown: … similar results (Gómez H, unpublished results) … new detection protocol used (González JL, Submitted for publication). … drug concentrations (López GO, 34th Intersci Conf Antimicrob Agents Chemother, abstr. 114, 1994). … new type of cellulolytic species (Márquez W, personal communication) ... previously commented by different sources (http://fcen.uba.edu.ar) Tables. They should be included on separate pages, consecutively numbered with Arabic numerals, preceded by an explanatory title, with captions and/or the corresponding explanations below. Reference marks for explanations in the form of footnotes shall use superscripted Arabic numbers betweeen parenthesis. Lines shall only be used in the external borders of the first and last row, and to separate the headings of the columns from the data. Rows and column borders shall not be inserted. Figures. They will be included on separate pages with the figure number in the upper left margin and in the order they are mentioned in the text. Drawings should be clear enough to ensure suitable reproduction. Numbers, letters and signs shall have the adequate size to be readable once reduced as needed. References to symbols used in the figures shall be included within the same figure and not in the text legend. Photographs may be in colour or black and white, in JPEG or TIFF formats. Minimum photo resolution requirements are 300 dpi for color and grayscale images and photo prints, 600 dpi for combined art images (letters and images) and 1200 dpi for images composed of lines (graphs and drawings). Note: It is very important to use the adequate file resolution. All individual images imported in a graphic file should be in the correct resolution before uploading them. Bear in mind that the higher the resolution, the larger the file and the longer it will take to send it electronically. Captions to the illustrations should be included on a separate page, in consecutive order using Arabic numerals. Aminoacid and nucleic acid sequences. New sequences informed by publication in this journal should be deposited in a database and their accession number included in the manuscript, no later than revision stage. The mentioned accession numbers should be included in a separate paragraph at the end of the Materials and Methods section in the case of original works or at the end of the text in the case of brief reports. The information about currently available databases is the following: DDBJ: Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan, National Institute of Genetics; e-mail. ddbj@ddbj.nig.ac.jp; URL, http://www.ddbj.nig.ac.jp EMBL: EMBL Nucleotide Sequence Submissions, European Bioinformatics Institute; e-mail. datasubs@ebi.ac.uk; URL, http://www.ebi.ac.uk GenBank: National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine; e-mail. info@ncbi.nlm.nih.gov; URL, http:// www.ncbi.nlm.nih.gov Nucleic acid sequences of up to 50 nucleotides included in the work developed in the manuscript may be presented in any style whatsoever. Significantly long sequences should be presented as Figures so as to reduce space, printing those having 80 to 120 nucleotides per line in a readable font according to publishing guidelines (16 cm, width of two RAM columns). If possible, the sequence

D-glucosamina reduce la formación de biofilm de Staphylococcus epidermidis 143 should be divided into blocks of 10 to 20 nucleotides separated by a space or by indicative numbers placed above the sequence. Lines should be numbered, indicating the corresponding number to the left of the first pair on each line. Any necessary comments shall be bold-typed, underlined or written between parentheses. If it is necessary to include the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence, it shall be indicated by the use of one-letter symbols accepted as amino acid indicators placed under the first nucleotide of the encoding codon. Abbreviatons. They must be made explicit when mentioned for the first in the text. Units of measurements will be expressed according to the standards of Système International d´Unités. SUBMITTANCE OF MANUSCRIPTS Manuscripts may be submitted by e-mail (ram@aam.org.ar) or ordinary mail to Deán Funes 472, C1214AAD, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina, including a CD-ROM electronic version, with a label or inscription indicating: title of work, the program and program version used for the text, figures, photographs and the title of all the files it contains. The complete text of the article should be included in only one file. If there are images, they should be sent on separate files. Besides, it is advisable that capital letters, spaces between words, italics and bold letters are typed in the same way they appear in the printed version. There should be no spaces before and after subheadings, the text should be justified and tab-setting should be used instead of the spacing bar for columns in tables. Authors should revise the check list shown after these instructions and see that all the requirements therein have been fulfilled. Before submitting the manuscripts, authors should also examine one of the latest RAM issues in order to verify if all guidelines have been followed as regards format and style and to make all necessary modifications if neccessary. Authors should delete from file properties all kind of information that could identify their authorship. EDITORIAL PROCESS Once the manuscript has completed the editorial process and is ready for publication, a file in pdf format with the galley proof shall be sent by e-mail to the corresponding editor for making the corresponding typing corrections. He/she should not change concepts nor modify paragraphs which could alter the print format. The document should be printed after making the corrections on the text and sent by fax or as a scanned file by e-mail. Corrections may also be sent by e-mail, clearly specifying the page, paragraph and line to be corrected and should be returned within seven running days of reception, otherwise it shall be assumed that its publication has been declined. At that moment, the amount to be paid for the publication of the article will be sent to the author. Revista Argentina de Microbiología follows the policies for clinical trial registration of the World Health Organization (WHO) and of the International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE), acknowledging the importance of those initiatives for the international dissemination of information on clinical research in open access format. Therefore, only articles referring to trials previously registered with an identifying number in one of the Clinical Trial Registers that meet WHO and ICMJE requirements will be accepted for publication. Their addresses are available in the ICMJE site. The identifying registration number shall be published at the end of the abstract. Publishing charges. Each published page will cost $ 75 or $ 200 (pesos) when the page includes color photographs (AAM members in Argentina,), $ 200 o $ 600 (pesos) (AAM non-members in Argentina) and U$S 70 o U$S 180 (in other countries).

The Secretary: Deán Funes 472, (C1214AAD) Ciudad Autónoma de Buenos Aires - Argentina; Tel.: (54-11) 4932-8858 and (54-11) 4932-8948; e-mail. info@aam.org.ar; http://www.aam.org.ar ANNUAL SUBSCRIPTION (4 issues) AAM members Argentina non members Latin America Other countries

$ $ USD USD

120 240 100 200

Payment: By check or money order, to the order of Asociación Argentina de Microbiología. Price includes mail postage.

ISSN 0325-7541

144

Revista Argentina de de Microbiología (2012) 44:44: 00-00 Revista Argentina Microbiología (2012) 144

Manuscript Preparation Checklist The following checklist is designed to help you prepare and revise your manuscript according to journal style and format. For additional details, consult the Instructions to Authors (http://www.aam.org.ar). Manuscripts not following the specified format shall be returned to their authors, delaying the evaluation and publication process.

Yes

Title Includes title in Spanish Includes title in English Includes abbreviated title Authors Identifies corresponding author Includes corresponding author´s address, telephone number and e-mail adress Includes all the authors Includes author´s affiliations Includes cover letter for manuscript submission signed by corresponding author Abstracts Each abstract does not exceed the maximun number of words allowed Includes an abstract in Spanish Includes key words in Spanish Includes an abstract in English Includes key words in English Text Does not exceed the maximum number of words allowed Does not exceed the maximun number of tables and/or figures allowed Has the corresponding sections Makes correct use of abbreviations Mentions trademarks and origin of reagents, culture media and equipmen Mentions accession number of new amino acids and nucleic acids sequences Tables and Figures Each of them is included on a separate page Titles are clear and concise Legends are included Citations in the text correspond with the numbers of each table and figure Abbreviations are explained as a table footnote Figures and photographs are sent in attached files References Strictly adheres to the format required by the journal Items in this section are listed in alphabetical order Citations in the text correspond with numbers appearing in this section Acknowledgements Funding sources are mentioned

Edición realizada por Orientación Gráfica Editora S.R.L. - Gral Rivas 2442 - C1417FXD Buenos Aires - Argentina Tel./Fax (011) 4501-5427 / 4504-4851 - E-mail. ogredit@yahoo.com.ar - www.ogredit.com.ar Impreso en el mes de marzo de 2012

Does not apply