Apilamiento genético en colza para mejorar la resistencia al cancro del tallo

Un trabajo del INTA que se propuso desarrollar nuevas líneas de colza resistentes a esta enfermedad.

Por: Bessone, V.; Acosta, M.G.; Schutt, L.S; Lassaga, S.L. y Gieco L.C. Laboratorio de Biotecnología – Departamento Mejoramiento – INTA-EEA Paraná Contacto: bessone.victoria@inta.gob.ar

¿POR QUÉ MEJORAR COLZA?

La colza (Brassica napus L.), también conocida como canola, constituye el tercer cultivo oleaginoso a nivel mundial, luego de la palma y la soja y presenta una alta demanda por sus características industriales para la producción de biocombustibles y sus propiedades nutricionales que la hacen apta para consumo humano. Comparado con otras fuentes de aceite vegetal, por ejemplo, de soja, el aceite de colza es único por contener ácidos grasos de cadenas mayores a 18 carbonos. Altas concentraciones de estos ácidos de cadena larga le proveen características de estabilidad, viscosidad y lubricidad que lo hacen un aceite altamente adecuado para usos industriales y alimenticios.

La adopción de cultivares de colza comenzó a finales de los años setenta y hoy en día se cultivan en todo el mundo por su aceite comestible. En Sudamérica, los principales países productores son Argentina, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay. En nuestro país, la producción fue variando año a año. El año 2012 fue el que se destacó, con una producción de 128.320 toneladas en todo el país. Luego la misma disminuyó por diferentes factores de comercialización, por lo que estos valores fueron disminuyendo. En el último año se produjeron 40.000 t en total según registros oficiales.

Diferentes estudios han demostrado que una dieta baja en ácidos grasos saturados y alta en monoinsaturados puede jugar un papel importante en la disminución del riesgo de enfermedades coronarias mediante la reducción de la síntesis de colesterol. El aceite de colza cumple este rol, ya que tiene el nivel más bajo de ácidos grasos saturados de todos los aceites comestibles y el segundo nivel más alto de grasas monoinsaturadas. En Argentina, la buena calidad comercial del grano de colza, como oleaginosa alimenticia, está definida según las normas de comercialización del país (Norma VII, SAGPyA, 1994), e incluyen el contenido de aceite (>43 %), ácido erúcico (<2 %) y glucosinolatos (< 20 µmol g-1).

COLZA Y MEJORAMIENTO EN INTA

En 2008, la Estación Experimental Agropecuaria Paraná del INTA inició un programa de mejoramiento genético de colza, que constituye el único programa de este tipo en nuestro país. En este se prioriza la selección de materiales que presenten alto potencial de rendimiento, resistencia a enfermedades y mejora de la calidad industrial, con el objetivo de obtener nuevo germoplasma adaptado a la región de cultivo en Argentina. Algunas líneas experimentales del programa, junto a cultivares comerciales, fueron evaluadas fenotípicamente para resistencia al cancro del tallo (Leptosphaeria maculans Ces & de Not. [Anamorfo: Phoma lingam (Tode) Desm.], encontrándose que varias poseen resistencia a aislamientos obtenidos en diferentes localidades de la región de cultivo por el grupo de trabajo del Departamento Mejoramiento.

CANCRO DEL TALLO, LA PRINCIPAL ENFERMEDAD

La gravedad de una epidemia del cancro del tallo y la extensión de las pérdidas en rendimiento varían mucho, dependiendo de la susceptibilidad del cultivar, de las condiciones climáticas y de diversidad de razas del patógeno presente en una región dada.

El patógeno sobrevive principalmente en el rastrojo de colza, donde puede permanecer por 4 o 5 años, dependiendo de la velocidad de descomposición del mismo. Los factores climáticos, principalmente temperaturas entre 15 a 25 ºC y precipitaciones frecuentes (lluvias y lloviznas), favorecen la distribución de la enfermedad. Ingresa en forma de esporas a través de heridas en los cotiledones u hojas jóvenes para infectar las plantas, expandiéndose y causando lesiones grisáceas en las mismas, denominadas máculas. Luego se propaga a través de las nervaduras hasta el pecíolo para llegar al tallo, donde provoca lesiones que obstruyen los haces vasculares ocasionando que el transporte de agua y nutrientes hacia arriba y debajo de la herida en la planta se interrumpa. Esto conlleva a una disminución en la formación y llenado de los granos, y cuando el tallo se debilita considerablemente como resultado de la infección, la planta puede volcarse, ocasionando mayores pérdidas. En la Figura 1 se muestran los síntomas en cada etapa.

El principal objetivo en este trabajo fue seleccionar líneas de colza experimentales de INTA que posean diferentes genes de resistencia a cancro del tallo con el fin de iniciar un programa de apilamiento genético para el desarrollo de nuevas líneas resistentes.

Figura 1 Principales tipos de lesiones causados por Phoma lingam durante el ciclo de crecimiento de la colza.

Figura 2 (arriba) Metodología empleada para seleccionar líneas resistentes.

Figura 4 (a) (debajo) (abajo derecha) a) Escala de Bansal y col. (1994).

¿CÓMO SE HIZO EL ENSAYO?

Las etapas del trabajo se muestran en la Figura 2.

INOCULACIONES ARTIFICIALES

• Se realizaron pequeñas incisiones con aguja histológica en cotiledones de 12- 15 días de edad (Figura 3 a).

• Se inocularon con 10 µL de suspensión de conidios de Phoma lingam (aislamiento local) (Figura 3 b).

• Se incubaron durante 48 horas a HR 100 % (cubierta plástica) y luego mantenidas en invernáculo con fotoperiodo de 16 horas de luz y con un rango de temperatura entre 15 a 25 °C hasta la evaluación de los síntomas. A los 14 días posteriores a la inoculación, se realizó la evaluación de los síntomas y la selección fenotípica.

Figura 3 (arriba) a) Cotiledones de colza con incisiones a ambos lados de la nervadura. b) Cotiledones de colza inoculados 10 µL de suspensión de conidios de Phoma lingam.

Figura 4 (b) Detalle del tipo de reacción desarrollo en cotiledones de líneas de colza.

Tabla 1 (abajo) Genes de resistencia estudiados e información relacionada a sus marcadores moleculares asociados

MARCADORES MOLECULARES (MM)

• Señaladores de diferentes regiones del genoma.

• Permiten evidenciar variaciones (polimorfismos) en la secuencia del ADN entre dos individuos, modifiquen estas o no su fenotipo.

• Puede ser parte de un gen o puede no tener una función conocida.

• Deben estar ligados al gen de interés

SELECCIÓN FENOTÍPICA Las líneas ensayadas se clasificaron según el grado de severidad observado en las lesiones utilizando la escala de Bansal y col. (1994) (Figura 4 a). Se consideraron los grados 0 y 1 como fenotipos resistentes (R), 1 y 2 como moderadamente resistentes (MR) y los grados 3 y 4 como susceptibles (S). Se seleccionaron aquellas líneas que presentaron grados entre 0 a 2 (R y MR), y se descartaron las líneas consideradas como susceptibles (Figura 4 b).

De un total de 469 lìneas, 59 fueron seleccionadas por resultar resistentes o moderadamente resistentes.

SELECCIÓN GENOTÍPICA Las 59 líneas seleccionadas se caracterizaron genotípicamente mediante marcadores moleculares (MM), para identificar y seleccionar aquellas que tuvieran uno o más genes de resistencia. De los 16 genes de resistencia informados en trabajos previos, se eligieron 4 cuyos respectivos MM específicos estaban disponibles. Los mismos se encuentran detallados en la Tabla 1.

Para ello, se les extrajo el ADN a cada una de las líneas y se amplificaron por la técnica molecular de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Luego, fueron separados y visualizados mediante electroforesis y tinción de los geles, con diferentes protocolos en cada uno (Figura 5).

Figura 5 Imágenes de los pasos que se realizan en el laboratorio. Se muestra desde el armado de la PCR hasta la corrida en geles de agarosa o poliacrilamida para su posterior visualización asociados.

Tabla 2 (derecha) Líneas experimentales de colza con genes de resistencia a cancro del tallo.

¿CUÁLES FUERON LOS RESULTADOS?

En la Tabla 2 se detalla el número de líneas que poseen los genes de resistencia evaluados y se diferencian aquellas que presentaron más de un gen de resistencia.

Como puede observarse en la Tabla 2, 21 líneas tuvieron más de un gen de resistencia, lo que resulta muy beneficioso para el objetivo de apilar genes de resistencia en un nuevo germoplasma; 24 líneas presentaron un gen de resistencia en su germoplasma; y las 14 líneas restantes que se habían seleccionado por ser fenotípicamente resistentes o moderadamente resistentes no presentaron los genes de resistencia estudiados, por lo que podrían ser fuente de nuevas resistencias a trabajar e incorporar.

RESUMEN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS

• De las 469 líneas experimentales ensayadas, 59 resultaron resistentes o medianamente resistentes al aislamiento de P. lingam utilizado.

• 24 líneas tuvieron un único gen de resistencia (Rpg3Dun, Rlm1, LepR3 o Rlm4).

• 14 presentaron dos genes de resistencia (Rlm1 y LepR3, Rlm4 y Rpg3Dun, Rlm4 y LepR3 y LepR3 y Rpg3Dun).

• 7 líneas tuvieron tres genes de resistencia (Rlm4, LpeR3 y Rpg3Dun y Rlm1, LepR3 y Rpg3Dun).

CONSIDERACIONES FINALES

• Los resultados obtenidos nos permitieron dar inicio a un programa de apilamiento genético para el desarrollo de nuevos genotipos resistentes a P. lingam, realizando cruzamientos entre las líneas que presentaron más de un gen Resistencia.

• En paralelo a la caracterización genotípica para la determinación de resistencia al cancro del tallo, se realizan otros ensayos para caracterizar el germoplasma bajo estudio y que son importantes para seleccionar líneas con cualidades superiores en el programa de mejoramiento.

Para esto, se implantaron ensayos comparativos de rendimiento, determinación del contenido de aceite y del perfil de ácidos grasos de todas las líneas bajo estudio.

GLOSARIO

Gen: segmento de ADN capaz de generar un producto. Por ejemplo, la producción de un cadena polipeptídica (proteína).

Fenotipo: Apariencia que toma un carácter (o un grupo) en un individuo concreto. Manifestación externa observable de un genotipo.

Electroforesis de ácidos nucleicos: técnica que permite separar por tamaño fragmentos de ácidos nucleicos. Los mismos atraviesan los poros de una matriz al aplicar un campo eléctrico.

PCR: (polymerase chain reaction). Técnica molecular que permite amplificar una secuencia de ADN mediante repetidos ciclos de síntesis de ADN in vitro.

Para seguir leyendo

• BANSAL V.K., KHARBANDA P.D., STRINGAM G.R. THIAGARAJAH M.R. and J.P. TEWARI. 1994. A comparison of greenhouse and field screening methods for blackleg resistance in doubled haploid lines of Brassica napus. Plant Disease 78: 276-281.

• BROWN J., DAVIS J.B., LAUVER M. AND D. WYSOCKI. 2008. USCA Colza growers’ manual. University of Idaho & Oregon State University.(Falta el número de páginas)

• DE SOUZA J.C., GIECO L.C., MILISICH H.J. 2014. Caracterización fenotípica de cultivares y líneas de colza (Brassica napus) por su resistencia a Leptosphaeria maculans. Poster. 1º Simposio Latinoamericano de Colza. 19-21 de agosto de 2014. Passo Fundo, RS, Brasil. http://www.cnpt.embrapa.br/slac/cd/pdf/DE%20SOUZA%20 -%20Caracterizacion%20fenotipica%20de%20cultivares...pdf [Verificación: mayo 2020].

• FAYYAZ L., FARHATULLAH A., ASHIQ RABBANI M., IQBAL S., MEHWISH KANWAL M, and I. NAWAZ. 2014. Genetic diversity analysis of Brassica napus/brassica campestris progenies using microsatellite markers. Pak. J. Bot., 46(3): 779-787.

• FLOR H.H. 1971. Current Status of the Gene-for-Gene Concept. Annu Rev. Phytopathol.9:275-96.

• KEEN N.T. 1990. Gene-for-Gene. Complementarity in Plant-Pathogen Interactions. Annu Rev. Genet.24:447-63.

• NORMA VII SAGPyA, 1994: http://www.senasa.gob.ar/normativas/resolucion-1075- 1994-sagpya-secretaria-de-agricultura-ganaderia-pesca-y-alimentos#anexoV

• WINDAUER L. y E.L. PLOSCHUK. 2006. Cultivos productores de aceite. En: Cultivos industriales. de la Fuente E. B., Gil A., Giménez P.I., Kantolic A. G., López Pereira M., Ploschuk E.L., Sorlino D.M., Vilariño M.P., Wassner D.F. y L.B. Windauer (Eds.). Editorial Facultad de Agronomía, Buenos Aires. p. 63-69.