Analisis de aguas LAB: Ensayos microbiologicos.
AlbertoMiguez Figueiras.
Indice:
preparacion de medios de cultivo: tabla de medios de cultivo y especificaciones: determinacion de aerobios: Diluciones y Filtraciones para las siguientes:(coliformes totales , fecales ,y enterococos fecales) determinacion de coliformes totales y fecales. Determinacion de enterococos fecales. Determinacion de esporas de clostridios sulfitoreductores. Plan de trabajo. Conclusion final.
Preparacion de los medios de cultivo: Prepararemos los medios de culrivo siguiendo las indicaciones que aparecen en el producto comercial, calculando la masa necesaria para la cantidad de agua que utilizaremos , teniendo en cuenta los g por L que indica el frasco. Una vez determinado este dato , lo tomamos y diluimos llevando a cabo las especificaciones pertinentes , como llevar a ebullicion , o añadir reactios exentos en la concentracion inicial del producto comercial. Una vez conseguido se guardara en un frasco y se realiza su autoclavado a las condiciones que exija el producto tanto de temperatura como de tiempo en el autoclave. Tabla de medios y especificaciones: Agar Nutritivo: 23g/l
Color:
Autoclavado:
beige
121ºC-15´
22ºC 72H 37ºC 48H
Agar Endo: 58,1g Endo/l +20ml etanol llevar a ebullicion.
Color:
Autoclavado:
incubacion:
Rosa
No se autoclava 37°C 24 h
Modo de uso:
reactivo de Schiff. *Se consideran miembros del grupo coliformes todos los microorganismos que producen colonias rojas con un brillo metálico
Agar FC: 57,1g/l
Color:
Autoclavado:
incubacion:
azulado
No se autoclava
44.5 +/- 0.2"C
24 h
*Cuando el medio es ácido, por fermentación de la lactosa, el azul de anilina produce un color azul, oscuro o claro, sobre las colonias de coliformes fecales. *Despues de preparar el medio añadir 10 m1 de una solución de ácido rosólico al 1 % en NaOH 0.2 N. Ajustar el pH hasta 7.4. Calentar hasta ebullición, dejar enfriar y repartir en las placas.
Agar KF: 76,4g/l
Color:
Autoclavado:
incubacion:
+ 10 ml TTC (cloruro de trifenil tetrazolio) al 1 %.
Marron claro
No autoclavar
37ºC 48H
*La adición de cloruro de trifenil tetrazolio al 1 %(TIC) hace que los enterococos tengan un color rojo oscuro como resultado de la reducción tetrazólica a un azocolorante ácido.
Agar SPS: utilizar doble concentracion.
Color:
Autoclavado:
incubacion:
Miel.
Según producto comercial.
37ºC 24-48H
Observaciones: En este caso los medios de cultivo ya estaban preparados previamente . Determinacion de Aerobios: Procedimiento: -2 Prepararemos cuatro diluciones de la muestra de agua,dos de 10 , y dos de -4, 10 para realizar posteriormente cultivos en placa , por el metodo de inclusion. Tomando 1 y 0,1 ml de las diluciones , junto al medio de cultivo Agar nutritivo. Preparacion de las diluciones:
Preparacion de las muestras en placa:
*como observamos en la imagen derecha , la muestra se prepara vertiendo la cantidad necesaria de agar nutritivo atemperado sobre la cantidad medida de agua , una vez vertido se homogeniza moviendo la placa , cubriendo asi toda la superficie interior de la misma. Este metodo se conoce como metodo de inclusion.Una vez realizado,Se deja solidificar cubriendo la placa parcialmente con la tapa , y posteriormente se voltea y se acondiciona para el cultivo a la temperatura deseada.
Todo este proceso debe ejecutarse en las condiciones de asepsia mas adecuadas que disponga el tecnico. Resultados de las pruebas: imagenes de resultados 37ยบC: dilucion 10
-4
0,1ml 168 UFC
dilucion 10
-2
1ml +300 UFC
imagenes erobios 22ยบC 72H. -4 dilucion 10
0,1 ml 25 UFC
dilucion 10
-2
1 ml 33 UFC
para la resolucion de la prueba tomaremos los datos que se enmarquen entre no menos de 30 y no mas de 300 UFC.
Diluciones y Filtraciones para las tres pruebas siguientes:(coliformes totales , fecales ,y enterococos fecales) Para determinar estos datos , realizaremos cultivos sobre filtraciones por membrana de la muestra de agua preparada en diluciones similares a las -2 -4 anteriores , 10 , y 10 , pero en este caso llevadas a 100 ml totales y utilizaremos 40ml por muestra como cantidad de filtrado. Para este, tomaremos un kit esterilizado de filtrado, previamente autoclavado , un filtro esteril de celucosa , y una bomba de vacio que ejercera la presion suficiente para retirar el medio acuoso dejando en el filtro los posibles microorganismos del agua. Una vez finalizado el filtrado , se tomarรก el filtro utilizado , manteniendo en todo momento la maxima asepsia posible , para ello utirizaremos unas pinzas y un mechero , y , depositaremos el filtro sobre el agar que , previamente hayamos preparado y solidificado en la proporcion idonea en la placa o placas en este caso. Siempre que realicemos este paso , fijaremos el filtro desde un borde del contorno interior de la placa en contacto con el agar , e iremos dejando con cierta presion el resto del filtro , asegurandose que no queden burbujas de aire que deterioren la prueba.
*en esta imagen el color del agar es indiferente , ya que , dependiendo de la prueba a realizar , seleccionaremos un medio de cultivo u otro.
 Determinacion de coliformes totales y fecales: Medios: Condiciones:
C.T: Agar Endo
C.F: Agar FC
37C---24H
Resultados:
44,5ÂşC +/- 1ÂşC ----- 24H
-2
-4
Dilucion 10 C.T: negativo
C.F:
Dilucion 10 negativo
C.T:
negativo
C.F: negativo
Imagenes: coliformes totales: -2
dilucion 10
0 UFC
-4
dilucion 10
0 UFC
coliformes fecales: -2
dilucion 10
0 UFC
dilucion 10
-4
0 UFC
Observaciones: determinamos las pruebas negativas por no aparecer colonias reconocibles como posibles coliformes totales , y fecales. En el medio de cultivo para determinar los coliformes fecales , observamos
que , ha habido un fallo en la preparacion del medio , que posiblemente ha variado el ph , de este , ademas de variar su tonalidad, lo que ha afectado a la prueba negativamente.  Determinacion de enterococos fecales: Medio:
Agar KF
Condiciones:
37ÂşC
Resultados:
------
48H
-2
-4
Dilucion 10
Dilucion 10
Negativo:
Negativo;
Imagenes:
-2
dilucion 10
0 UFC
-4
dilucion 10
0 UFC
Observaciones: determinamos la prueba como negativa por carecer colonias de color reconocible como posibles enterococos fecales.
Determinacion de esporas de clostridios sulfito-reductores. Realizaremos esta prueba tomando 20ml en un caso del liquido madre, y por otro lado , tomaremos 10ml del liquido madre y 10 ml de agua destilada., En dos tubos diferenciados introduciremos estas cantidades, y las dejaremos durante 10´ a 80ºC al baño maria , en choque termico , para eliminar los microorganismos no deseados en la prueba(ya que los clostridios no se veran afectados por esta temperatura). En este intervalo de tiempo , en condiciones de asepsia, prepararemos dos tubos diferenciados con 20 ml de agar sps a doble concentracion atemperados , y los introduciremos en un baño maria a 60 ºC junto con los tubos de muestras de agua , tras el choque termico. Una vez ajustadas las temperaturas , introduciremos con cuidado las muestras de agua en los tubos de sps, sin dejar crear burbujas ni grumos , y homogenizaremos mediante la tecnica del roll tube. Cubriremos si es posible con un tapon de agar blanco , o con un tapon que asegure el cierre practicamente ermetico del tubo , para no deteriorar la prueba, y los introduciremos en las condiciones idoneas de cutivo durante el tiempo necesario:37ºC entre 24-48H
Medio:
Agar SPS
Condiciones: Resultados:
37ºC
------
24-48H
20ml
Dilucion 10ml
negativo
negativo
Imagenes:
Observaciones: *en este caso el medio ya estaba preparado y distribuido en un frasco autoclavado, las condiciones optimas para esta prueba hubieran sido la realizacion del medio ya preparado en el / o los tubos a utilizar para la prueba.
Plan de trabajo: *los medios de cultivo se encuentran previamente preparados.
Lunes
Preparacion de diluciones , filtrados y placas de la prueba de coliformes totales , y de enterococos fecales. preparacion de la prueba de aerobios.
Martes
Observacion de las pruebas de coliformes totales Denuevo preparacion y realizacion del filtrado , y diluciones para las pruebas de aerobios.(debido a un fallo en el procedimiento anterior.) esterilizacion de material y comprobacion de medios para realizar las pruebas de clostridios el jueves.
Miercoles
Observacion de resultados de las pruebas de enterococos fecales.
Jueves
Preparacion y realizacion de las pruebas de esporas de clostridios sulfito-reductores. Observacion de resultados sobre pruebas de aerobios a 37ºC 48H
Viernes
Observacion de resultados sobre esporas de clostridios sulfito reductores. Observacion de resultados sobre aerobios a 22ºC 72H
Conclusion final : Analisis de muestra de agua de rio , tomada por el Dr. Carlos de Paz. Comienzo de las pruebas el lunes 1/04/2013- finalizacion 4/04/2013 Aerobios:
Aerobios totales : 1,68+107 aerobios totales /ml a 37ºC Aerobios fecales :3,3+103 aerobios fecales /ml a 22ºC
Coliformes :
Totales:
0 UFC en 100ml – ausencia en 100ml
Fecales: 0 UFC en 100ml-ausencia en 100ml Enterococos:
0 UFC en 100ml-ausencia en 100ml
Esporas de clostridios sulfito-reductores:
0 UFC en 20ml-ausencia en 20ml
A priori podriamos señalar que aparentemente el agua de la muestra , seria potable según la normativa vigente , pero , teniendo en cuenta los errores cometidos , y las muestras , deberiamos realizar denuevo las pruebas , y verificar alguna de ellas añadiendo mas analisis que determinen con mayor seguridad los resultados , como la tincion de gramm , la prueba de la catalasa , oxidasa,... A mayores , la duracion y los intervalos de tiempo desarrollados no permiten evaluar con precision y como prueba valida este analisis , ya que la muestra de agua manipulada se encontraba fuera de los parametros idoneos para ello.