knalise t~~icrobiolox~co do ag11o. páxina 3 1
La técnica del filtro de membrana, que implica una siembra directa para la detección y cálculo de la densidad de coliformes, es tan eficaz como la fermentación en tubos múltiples para la detección de bacterias de este mismo grupo. Por tanto, se puede contar con 2 métodos estándar para la detección de las bacterias del grupo coliforme. Esta técnica es altamente reproducible, puede utilizarse para estudiar volúmenes relativamente grandes de muestra y proporciona resultados numéricos más rápidos que el método de los tubos múltiples. La técnica del filtro de membrana es extraordinariamente útil para controlar las posibles situaciones de urgencia en relación con el agua potable ypara estudiar distintas aguas naturales. Sin embargo, esta técnica tiene limitaciones, sobre todo para estudiar aguas con elevada turbidez o que contengan bacterias no coliformes. Definición: En lo que se refiere a la técnica del filtro de membrana, el grupo coliforme puede definirse como el formado por bacterias aerobias y anaerobias facultativas, Gram-, no esporuladas y de forma bacilar, que desarrollan una colonia roja con un brillo metálico en un medio tipo Endo que contenga lactosa tras una incubación de 24 horas a F C . Al estudiar cultivos puros de bacterias coliformes se observa una reacción citocromo oxidasa (CO) negativa y B-galactosidasa (ONPG) positiva. En esta técnica todas las colonias blancas o incoloras que no tienen brillo suelen considerarse no coliformes. La comparación estadística de los resultados obtenidos con el método de los tubos múltiples y el del filtro de membrana muestran la mayor precisión de este último. Aunque los datos de ambas pruebas dan resultados bastante precisos sobre la calidad del agua, los resultados numéricos no son idénticos. CBLIFQRMES TOTALES
Se consideran miembros del grupo coliformes todos los microorganismos que producen colonias rojas con un brillo metálico tras24 horas de incubación a 37°C en un medio tipo Endo. El brillo puede cubrirtoda la colonia o aparecer unicamente en la zona central o en la periferia. El grupo coliforme así definido se caracteriza por producir aldehídos a partir de la fermentación de la lactosa, característica bioquímica que forma parte de la producción de gas en la prueba de los tubos múltiples. Fundamento: El medio de cultivo tipo Endo contiene lactosa y reactivo de Schiff. En presencia de coliformes, la fermentación de la lactosa produce CO,, ácido y aldehido. El reactivo de Schiff reacciona con el aldehido produciendo un color iridiscente verdoso sobre las colonias de coliformes.
Anólise microóroloxica du agua. pisina 32
Medio: Endo agar Peptona Extracto de levadura Lactosa Cloruro sódico Fosfato dipotásico Fosfato monopotásico Sodio lauril sulfato Desoxicolato sódico Sulfito sódico Fucsina básica Etanol95% Agar-agar Agua destilada Después de preparar el medio calentando a ebullición, dejar enfriar hasta 4S°C y repartir en placas. No esterilizar en autoclave. c
Procedimiento: Se filtra una cantidad adecuada del agua a analizar, previamente homogeneizada, sobre un filtro de membrana ésteril. El volumen de agua filtrada no debe ser inferior a 30 ml. Utilizando unas pinzas previamente flameadas se coloca la membrana sobre la placa con el medio de agar Endo. Incubar las placas invertidas a 37°C 24 horas Al cabo de este tiempo se realiza un recuento directo de las colonias recubiertas de un color iridiscente verdoso. El brillo puede cubrir toda la superficie de la colonia o sólo la parte central o la periferia. Los resultados se expresan en no de colonias por 100 m1 de muestra Confirmación de coliformes totales Para evitar resultados positivos falsos debe verificarse la fermentación de la lactosa mediante la reacción de las colonias con brillo a citocromo oxidasa (CO) y 13galactosidasa (ONPG). Es preferible comprobartodas las colonias, o al menos un 10% de las mismas cuando en una muestra más de 50 sean de tipo coliforme. La comprobación puede realizarse por una fermentación en tubos, que requiere medios de cultivo diferentes y se precisan de 48 a 96 horas, o por una prueba rápida (4 horas) de dos reacciones bioquímicas clave. También pueden utilizarsesistemas comerciales rnultiprueba para Enterobacteriaceae.
La verificación rápida de las colonias se basa en las reacciones de citocromo oxidasa (CO) y de í3-galactosidasa (ONPG = ortonitrofeniol-6-D-galactopiranósido). Las coliforrnes se caracterizan por carecer del enzima citocromo oxidasa y por poseer el enzima R-galactosidasa, necesaria para fermentar la lactosa.
Análise mrcrobiolrir~coda agua. posina 33
La presencia de citocromo oxidasa se verifica con NN-dimetil-p-fenilendiamina. En presencia de oxígeno y citocromo c las especies que producen enzima citocromo oxidasa oxidan al reactivo para formar un compuesto coloreado. El ortonitrofenil-í3-D-galactopiranósido(ONPG) ratifica la presencia de E-galactosidasa, pues el reactivo, incoloro, es hidrolizado en su presencia, liberando ortonitrofenol, compuesto cromogénico amarillo. Expresión de resultados: La densidad de coliformes debe darse por 100 ml de muestra. Se debe calcular utilizando filtros de membrana que tengan 20-80 colonias de coliformes y no más de 200 colonias de todos los tipos por membrana. Para recuentos de coliformes comprobados, ajústese el recuento inicial, teniendo en cuenta el porcentaje de comprobación positiva, y exprésese como recuento comprobado de coliformes por 100 ml. COLIFORMES FECALES Se utiliza un medio de lactosa enriquecido y una temperatura de incubación de 44.510.2"C. Esta temperatura permite seleccionar los microorganismos del grupo coliforme procedentes de fuentes fecales de los procedentes de otras fuentes ambientales. Fundamento: El medio contiene lactosa y azul de anilina. Cuando el medio es ácido, por fermentación de la lactosa, el azul de anilina produce un color azul, oscuro o claro, sobre las colonias de coliformes fecales. Medio: FC agar Bacto-triptosa Proteosa peptona Extracto de levadura Cloruro sódico Lactosa Sales biliares Azul de anilina Agar-agar Agua destilada Despues de preparar el medio añadir 10 m1de una solución de ácido rosólico al 1% en NaOH 0.2 N. Ajustar el pH hasta 7.4. Calentar hasta ebullición, dejar enfriar y repartir en las placas. No esterilizar en autoclave. Procedimiento: Se filtra una cantidad adecuada del agua a analizar, previamente homogeneizada, sobre un filtro de membrana estéril. El volumen de agua filtrada no debe ser inferior a 30 ml.
Master en Ciencia e Tecnoloxia Ambiental
Anulise microbroloxico da agrio. pixina 31
Utilizando unas pinzas previamente flameadas se coloca la membrana sobre la placa con el medio de agar FC. Incubar las placas invertidas a 44.520.2"C 24 horas Al cabo de este tiempo se realiza un recuento directo de las colonias azules. Cualquier otra colonia de color crema claro o gris no son coliformes fecales. Normalmente se observan pocas colonias de coliformes no fecales en el medio FC debido a la acción selectiva de la elevada temperatura y a la adición de la sal del ácido rosólico. 4 Fi Expresión de resultados: Los resultados se expresan en número de&+mias por 100 mi de muestra. Se debe calcular utilizando filtros de membrana que tengan 20-60 colonias de coliformes fecales. El limite es más restrictivo que el de coliformes totales (20-80) debido al mayor tamaño de las colonias en el medio FC. -2
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