cours 7 et 8 enzymologie by BEN CHIR

CINETIQUES ENZYMATIQUES INTRODUCTION I – Quelques définitions II – Facteurs indispensables III – Quelques rappels de thermodynamique IV – Notion de site actif V – Réaction à un substrat et un produit 1 – notion de complexe enzyme-substrat 2 – les différentes phases de la réaction 3 – l’équation de Michaelis et Menten 4 – constante de Michaelis ou KM 5 – cas où [S]<<KM 6 – représentations linéaires 7 – constante catalytique kcat

CINETIQUES ENZYMATIQUES V – Cinétique Michaelienne (suite) 8 – unités de vitesse d’une réaction enzymatique 9 – effet de la concentration en enzyme

VI – Inhibition enzymatique 1 – inhibition compétitive 2 – inhibition non compétitive 3 – inhibition incompétitive

VII – Effet des constantes physiques 1 – effet du pH 2 – effet de la température

VIII- Allostérie

CINETIQUES ENZYMATIQUES IX – Réactions à plusieurs substrats 1 – fixation aléatoire 2 – fixation ordonnée 3 – mécanisme Ping-Pong

Glossaire

Introduction

INTRODUCTION Contexte historique •1750-1760, Réaumur et Spallanzani  Mise en évidence d’une activité enzymatique : expérience sur suc gastrique du gésier d'oiseaux (digestion in-vitro de viande ou grains prébroyés)

• 1833-1870 : Payen et Persoz  extraits d'orge en germination  peuvent transformer l'amidon

Introduction

• 1850 : Berzelius • 1890 : Fisher définit les compare catalyseurs propriétés principales chimiques et biologiques des enzymes =  même processus protéines jouant rôle de catalyseurs biologiques à très forte efficacité • 1878 : Von Kühne  Dans levures = substance • 1910 :V. Henri et responsable de Michaëlis = définition fermentations des paramètres cinétiques  Il l'appelle enzyme (du grec "en" = dans et "zûmé" = le jus)

Introduction

• 1950 : Purification, identification et caractérisation de l'uréase par Sumner (prix Nobel) • 1960 : Sanger (deux fois Nobel) synthèse chimique RNase (la plus petite enzyme : 13 700 Da) • 1960 : J. Monod et Koshland étudient l'allostérie et la cinétique catalytique  notion de régulation

Classification

Classification des enzymes On connaît environ 10.000 enzymes (dont 600 endonucléases de restriction) 1 : Oxydoréductases (transfert d'électrons, d’atomes d’hydrogène ou fixation d’oxygène) 2 : Transférases (transfert d'atomes ou de groupes d'atomes autres que ceux 1) 3 : Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH issus de l’eau) 4 : Lyases (Coupure des liaisons par d'autres modes autres que l'hydrolyse). 5 : Isomérases (réaction conservant la formule brute du composé) 6 : Ligases (formation des liaisons CC, CO, CN, CS, CP, N-métal). Ce sont des synthétases utilisant l’énergie des XTP.

Nomenclature

Nomenclature Depuis 1961, l'Union Internationale de Biochimie a codifié la nomenclature et la classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle. Toutes les enzymes actuellement connues sont répertoriées sous un numéro portant 4 nombres séparés par des points et précédés de EC (Enzyme Commission number) : (EC x1.x2.x3.x4). La signification des nombres est la suivante : X1 : Le premier nombre pouvant varier de 1 à 6 indique le type de réactions X2 : Le deuxième définit son mécanisme d'action. Dans le cas des oxydoréductases on distingue les déshydrogénases, les monooxygénases et les dioxygénases. X3 : Le 3e nombre désigne la nature de la molécule qui sert d'accepteur, lorsqu'il s'agit d'un transfert d'électrons. X4 : Le 4e nombre est un numéro d'ordre dans le groupe et dans le sousgroupe. Lorsqu'une enzyme se termine par 99, cela signifie qu'elle est incomplètement caractérisée

Nomenclature

Exemples - Hexokinase (EC 2.7.1.1) -Glucokinase (EC 2.7.1.2) -Phospholipase A1 (3.1.1.32) -Phospholipase A2 (3.1.1.4) -la trypsine du pancréas ( 3.2.21.4) -la chymotrypsine (3. 4. 21. 1) du pancréas -la thrombine (3.4.21.5) du plasma sanguin -la papaïne (3.4.22.2) protéine végétale -collagénase (3.4.24;3) -les Nucléosidases (3.2.2.1) -Citrate synthase (4.1.3.7) Pour plus d’informations : http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/

CINETIQUES ENZYMATIQUES 

I – Quelques définitions II – Facteurs indispensables III – Quelques rappels de thermodynamique IV – Notion de site actif V – Réaction à un substrat et un produit 1 – notion de complexe enzyme-substrat 2 – les différentes phases de la réaction 3 – l’équation de Michaelis et Menten 4 – constante de Michaelis ou KM 5 – cas où [S]<<KM 6 – représentations linéaires 7 – constante catalytique kcat

DEFINITIONS

Chez tous les organismes vivants, 99,9% des réactions chimiques sont catalysées par des molécules de nature protéique que l’on appelle enzymes.

Un ou une enzyme est un catalyseur biologique d’une réaction chimique se déroulant au sein du vivant.

Un enzyme accélère la transformation d’une ou de plusieurs molécules en une ou plusieurs autres molécules.

Les molécules transformées s’appellent substrats et les molécules obtenues sont appelées produits.

DEFINITIONS

CINETIQUES ENZYMATIQUES  

COENZYMES

Pour catalyser correctement une réaction chimique, un enzyme a parfois besoin d'une molécule "exogène". Le cofacteur d’un enzyme est une molécule qui apporte un groupement chimique important pour la catalyse enzymatique, groupement que ne possède pas l’enzyme seul. Il peut s’agir d’un ion ou d’un coenzyme. Il y a deux familles de coenzymes : - ceux qui ne sont que transitoirement liés à l’enzyme et que l’on considère alors comme des co-substrats (dialysable), - ceux que l’on nomme groupes prosthétiques et qui sont liés de façon covalente à la protéine.

COENZYMES

apoenzyme (inactif)

cofacteur

holoenzyme (actif)

COENZYMES

Cofacteur

Réaction impliquée

Biotine

Carboxylation

Coenzyme à cobalamine (vit B12) Coenzyme A Coenzymes flaviniques Acide folique Coenzymes à nicotinamide

Alkylation Transfert de groupe acyl Oxydo-réduction Transfert de groupe acyl Oxydo-réduction

Phosphate de pyridoxal

Transfert de groupe amino

Tétrahydrofolate

Transfert de groupe à un carbone

Thiamine pyrophosphate

Transfert de groupe aldéhyde

CINETIQUES ENZYMATIQUES   

Rappels de thermodynamique

CH2-COO HO-C-COO

aconitase

H-CH-COO citrate

CH2-COO H-C-COO

HO-CH-COO isocitrate

Rappels de thermodynamique

ENZYMOLOGIE

Énergie libre, G°

Réactif S

Énergie de GIBBS de la réaction

∆G°

Produit P

Coordonnées de la réaction

∆G°<0 d’où réaction SP possible

Rappels de thermodynamique

RAPPELS

∆G° = -RT ln Kéq ∆G° = -RT ln

[P] [S]

Si ∆G°<0 alors ln

éq

Équation de VAN'T HOFF R = 8,3145 J.K-1.mol-1

éq

[P] [S]

éq

>0 :

éq

on a donc, à l’équilibre, beaucoup plus de P que de S, la réaction est en faveur de la transformation de S en P.

Rappels de thermodynamique

 Attention, un ∆G°<0 signifie : la réaction est thermodynamiquement possible.

L’oxydation complète du saccharose par l’O2 est très exergonique (∆G° très <0): saccharose + 12 O2  12 H2O + 12 CO2 + énergie (chaleur)

pourtant le sucre dans votre placard en contact avec l’O 2 de l’air ne s’enflamme pas en libérant eau et gaz carbonique.

La réaction est possible et elle a bien lieu, mais sans catalyseur, elle se déroule à une vitesse imperceptible. Pourquoi ?

Rappels de thermodynamique

Parce que la molécule S, pour se transformer en molécule P, doit passer une barrière d’énergie de GIBBS maximale.

Cette barrière correspond à l’énergie nécessaire pour que la molécule S soit sous une conformation correcte pour être transformée en molécule P, i.e. pour que S atteigne son état de transition.

Rappels de thermodynamique

Énergie libre, G°

État de transition (non catalysé) X‡

∆G°‡

Énergie de GIBBS d’activation

non catalysé

Réactif S

Énergie de GIBBS de la réaction

∆G°

Produit P

Coordonnées de la réaction

Rappels de thermodynamique

L’état de transition X‡ n’est obtenu en proportions appréciables que pour des températures très élevées.

La réaction dans des conditions douces de température n'est probable que pour un très petit nombre de molécules (très faible vitesse de l’ordre d’une centaine de réactions/min).

L’enzyme fixe le substrat et l’oriente de façon constante et optimale.

L’enzyme permet ainsi d’abaisser l’énergie de cet état de transition.

Rappels de thermodynamique

Énergie libre, G°

X‡

État de transition (non catalysé)

∆G°‡

EX‡

non catalysé

État de transition (catalysé)

∆G°‡ Énergie de GIBBS

Réactif S

catalysée

d’activation

∆G°

Produit P

Coordonnées de la réaction

Rappels de thermodynamique

soit

deux molécules pouvant réagir ensemble pour donner

une troisième molécule.

Le passage de S1+S2 à P est très favorable (∆G°<0). Pour qu’il ait lieu, S1 et S2 sont mélangés. Pour que les deux molécules puissent réagir, il faut qu’elles se rencontrent en un point bien précis : Rencontre productive

Rencontre non productive

Rappels de thermodynamique

On imagine alors que la probabilité d’avoir une rencontre productive, et donc une réaction, est faible.  Afin de favoriser les rencontres productives, il est nécessaire d’augmenter le nombre total de rencontres en augmentant la température du milieu (agitation thermique). Seule une augmentation de température permettra un nombre suffisant de rencontres productives et donc une vitesse de réaction élevée.

Cinétique chimique Avec un enzyme, la situation est différente : la protéine fixe toujours de la même façon les molécules S1 et S2, de manière à ce qu’elles soient toujours orientées de façon optimale.

Rappels de thermodynamique

ENZYME Site actif S1

Rappels de thermodynamique

En présence d’enzyme !

Dans ce cas, l’énergie thermique du milieu suffit à former le complexe enzyme-substrats, d’autant plus que les formes géométriques de ces molécules et leurs propriétés physico-chimiques sont complémentaires.

Une fois formé, le complexe enzyme-substrat(s) a de fortes chances de fabriquer le(s) produit(s) final(ux) sans qu’il ne soit apporté une énergie calorifique élevée au milieu.

L’enzyme permet donc d’accélérer fortement la réaction en augmentant la probabilité de rencontre de S1 et S2 en les fixant à proximité l’un de l’autre dans son site actif.

ANIMATION1

ANIMATION2

Rappels de thermodynamique

MODELE DE FISHER : CLE-SERRURE SUBSTRAT SUBSTRAT

+ ENZYME

ENZYME

Rappels de thermodynamique

1958-MODELE DE KOSHLAND : AJUSTEMENT INDUIT SUBSTRAT SUBSTRAT

+ ENZYME

ENZYME

CINETIQUES ENZYMATIQUES    

Notions de site actif

La structure tridimensionnelle de l’enzyme fait apparaître une zone qui lie les substrats et permet leur réaction. On appelle cette région de la protéine le site actif ou site catalytique. De par les repliements de la chaîne polypeptidique, le site actif ou site catalytique est constitué d’acides aminés qui peuvent être très éloignés les uns des autres dans la structure primaire. représentation schématique de l’uridine transférase +

NH3

380 62 79 129 141 180

site actif

282298

COO-

Notions de site actif

noyau uridine du substrat

R N

H N

O N

H O

O C

H H

Cα H CH3

chaîne latérale thréonine de l’enzyme

H O CH2

chaîne latérale sérine de l’enzyme

CINETIQUES ENZYMATIQUES     

I – Quelques définitions II – Facteurs indispensables III – Quelques rappels de thermodynamique IV – Notion de site actif V – Réaction à un substrat et un produit

 1 – notion de complexe enzyme-substrat 2 – les différentes phases de la réaction 3 – l’équation de Michaelis et Menten 4 – constante de Michaelis ou KM 5 – cas où [S]<<KM 6 – représentations linéaires 7 – constante catalytique kcat

Complexe enzyme-substrat

En 1903, le français Victor Henri montre qu’un enzyme peut fixer un ligand.

En 1913, Maud Menten introduit avec Leonor Michaelis un nouveau concept qui révolutionne les études des réactions biologiques.

Notion de complexe enzyme-substrat

Complexe enzyme-substrat

milieu rĂŠactionnel contenant Ă t=0 une concentration de substrat [S]0

Complexe enzyme-substrat

MolĂŠcules de substrat

Complexe enzyme-substrat

ajout de l’enzyme [E]T [E]T pour [E]TOTALE

milieu réactionnel contenant à t=0 une concentration de substrat [S]0

on est au temps 0

Complexe enzyme-substrat

Molécule d’enzyme

Complexe enzyme-substrat

E+S

E+P

à t=0, la concentration en substrat est désignée [S]0

la concentration en enzyme est désignée [E]T et reste constante tout au long de la mesure

à t=0, la concentration du complexe enzyme-substrat, [ES], est égale à 0

à t=0, la concentration en produit est égale à 0

Complexe enzyme-substrat K1

E+S K-1

EP K-2

E+P

K-3

Apparition du Produit au cours du temps [P]

La vitesse peut être mesurée avec l'apparition du produit.

Vitesse initiale

d [ P] dt

t Phase préstationnaire

Phase stationnaire

[ES]

[S]>>[E]

L'enzyme se charge

Effet du produit

[EP]

Le produit qui s'accumule La vitesse ralentie la réaction est constante. (loi d'action de masse)

équilibre

[ES]

[EP]

La concentration du produit reste constante

En enzymologie classique, on s'intéresse à la phase stationnaire (linéaire) en mesurant la vitesse initiale. Il y a un maximum d'enzyme liée avec le substrat. D’où la vitesse maximale

Cinétique enzymatique P

La détermination de la vitesse initiale se fait en mesurant l 'apparition du produit en fonction du temps.

Détermination de la vitesse initiale pour différentes concentrations en substrat

La vitesse initiale correspond à la vitesse instantanée mesurée au temps t=0. Soit la pente de la tangente à l'origine. S 1 Vi1

Cinétique enzymatique : Mesure de Vi1 et report sur Vi=F(S)

Détermination de la vitesse initiale pour différentes concentrations en substrat

Vi1 S 1 Vi1

Cinétique enzymatique : Mesure de Vi2 et report sur Vi=F(S)

Vi P

Vi2 S 2

Vi1

S 1 Vi1

Vi2

Cinétique enzymatique : Mesure de Vi3 et report sur Vi=F(S)

Vi P Vi3

S 3

Vi2 S 2

Vi1

Vi2 Vi3

Vi1

S 1 Vi4= Vi5

Cinétique enzymatique : Mesure de Vi4 et report sur Vi=F(S)

Vi S 4

Vi4 Vi3

S 3

Vi2

S 2

Vi1

Vi2 Vi3

Vi1

S 1 Vi4= Vi5

Cinétique enzymatique : Mesure de Vi5 et report sur Vi=F(S)

S 5 S 4

Vi Vi5 = Vi4

S 3

Vi3 Vi2

S 2

Vi1

Vi2 Vi3

Vi1

S 1 Vi4= Vi5

Cinétique enzymatique De P = f(T) à Vi = f(S)

S 5 S 4

Vmax Vi5 = Vi4 Vi3

S 3

Vi2

Vmax/2

S 2

Vi1

Vi2 Vi3

Vi1

S 1 Vi4= Vi5

S5 S

Complexe enzyme-substrat état préstationnaire

[S]0

E+P [P]

Concentrations

E+S

état poststationnaire

état stationnaire

[S] [E]libre [ES]

[E]libre [ES]

[P]

Temps

CINETIQUES ENZYMATIQUES     

I – Quelques définitions II – Facteurs indispensables III – Quelques rappels de thermodynamique IV – Notion de site actif V – Réaction à un substrat et un produit

 1 – notion de complexe enzyme-substrat  2 – les différentes phases de la réaction 3 – l’équation de Michaelis et Menten 4 – constante de Michaelis ou KM 5 – cas où [S]<<KM 6 – représentations linéaires 7 – constante catalytique kcat

Phases de la réaction

3 états lors de la cinétique état pré-stationnaire état stationnaire état post-stationnaire

Phases de la réaction

état pré-stationnaire ne dure que quelques secondes, le temps de mélanger enzyme et substrat

substrat

produit

Phases de la rĂŠaction

ĂŠtat stationnaire

Phases de la réaction état préstationnaire

Concentrations

E+S

état poststationnaire

état stationnaire

E+P [P]

[S]

[P] [ES]

d[ES] =0 dt

[E]libre Temps

[S] [E]libre [ES]

Phases de la rĂŠaction

ĂŠtat post-stationnaire

Phases de la réaction

mesure d’une activité enzymatique La concentration en enzyme doit rester constante au sein de tous les essais.

Les paramètres physico-chimiques (température, force ionique et pH) du milieu doivent rester stables pour tous les essais.

Sauf expérience particulière, le seul paramètre variable doit être la concentration en substrat.

Phases de la rĂŠaction

[P]apparu [S]0 ď&#x192;¤

temps [E]T = cste dans tous les essais

Phases de la rĂŠaction

phase stationnaire

phase post-stationnaire

[P]apparu

temps [E]T = cste dans tous les essais

Phases de la réaction

[S] mM 0 0,5 1 2 5 10 20 30

Vi (µM de P/min) 0 35 50 88 160 280 300 310

Phases de la rĂŠaction

vitesse initiale (Vi)

Vmax

Hyperbole quadrilatĂ¨re

[E]T cste concentration en substrat [S]

Phases de la réaction

Cinétique (phase stationnaire) en fonction de la concentration du substrat

Plus il y a de substrat, plus l'enzyme est rapide. C'est la loi d'action de masse.

Vmax V

Néanmoins, cette augmentation n'est pas infinie(comme tout processus biologique), et l'enzyme finit par être saturé à la vitesse Vmax. (réaction d'ordre 0) Attention, pour les mesures on atteint Vmax de façon asymptotique. En réalité, il est difficile de mesurer Vmax car il faut beaucoup de substrat pour vraiment atteindre Vmax (en théorie [S]=∞)

[S]

A faible concentration la vitesse est linéaire en fonction de la concentration de substrat. C'est une réaction d'ordre 1

[S]

courbe cinétique (V en fonction de [S]) classique des enzymes Michaeliennes. C'est une hyperbole

Phases de la réaction K1

E+S K-1

EP K-2

E+P

K-3

Conditions (phase stationnaire). 1 On travaille à de très faible concentration de substrat 2 Il y a beaucoup plus de substrat que d'enzyme

[S]>>[P]

[S]>>[E]

3 les formes de l'enzyme libres et de l'enzyme lié au substrat sont en équilibre (rapide). Kd =

[ E ][ S ] [ ES ]

Avec ces conditions, on peut simplifier la réaction K1

E+S K-1

E+P

Comme, il y a peu de produit le retour K-2 est négligeable

CINETIQUES ENZYMATIQUES     

I – Quelques définitions II – Facteurs indispensables III – Quelques rappels de thermodynamique IV – Notion de site actif V – Réaction à un substrat et un produit

 1 – notion de complexe enzyme-substrat  2 – les différentes phases de la réaction  3 – l’équation de Michaelis et Menten 4 – constante de Michaelis ou KM 5 – cas où [S]<<KM 6 – représentations linéaires 7 – constante catalytique kcat

Équation de Michaelis-Menten

E+S

k k

E+P

-1

La vitesse d’apparition du produit P (vitesse de la réaction catalysée par l’enzyme) dépend de k2 et de la concentration en ES.

vi = k2 [ES]

La [ES] dépend de sa vitesse de formation et de sa vitesse de disparition. vformation ES = k1 [E] [S] vdisparition ES = k-1 [ES] + k2 [ES] = (k-1 + k2) [ES]

Équation de Michaelis-Menten état préstationnaire

Concentrations

E+S

état poststationnaire

état stationnaire

E+P [P]

[S]

[P] [ES]

d[ES] =0 dt

[E]libre Temps

[S] [E]libre [ES]

Équation de Michaelis-Menten

Pendant l'état dit "stationnaire" ou en "vitesse initiale", les vitesses de formation et de disparition de ES sont égales.

vformation ES = vdisparition

(k-1 + k2) [ES] = k1 [E] [S] Si on réarrange l’expression mathématique :

k [E] [S] [ES] = (k + k ) 1

-1

[ES] =

[E] [S]

(k-1 + k2)

Équation de Michaelis-Menten

[ES] =

[E] [S]

(k-1 + k2)

On simplifie l’équation en définissant une nouvelle constante, K M, appelée constante de Michaelis et Menten :

KM =

(k-1 + k2)

Si on réarrange l’expression mathématique :

[ES] =

[E] [S]

Équation de Michaelis-Menten

[ES] =

[E] [S]

Si l’on regarde le numérateur de cette équation, la [S] est égale (en approximation) à celle de départ ([S]0), puisque la concentration en substrat est très largement supérieure à celle en enzyme. La concentration en enzyme libre [E] est difficile à appréhender expérimentalement mais on sait qu'elle doit être égale à la concentration totale en enzyme ([E]T) moins la concentration en enzyme lié ([ES]).

[E] = [E]T – [ES] [ES] =

[E] [S] KM

devient

[ES] =

([E]T – [ES]) [S] KM

Équation de Michaelis-Menten

Si on développe

cela devient

([E]T – [ES]) [S]

[ES] = [ES] =

KM [E]T [S] – [ES] [S]

[ES] + [ES] ( 1 +

KM [ES] [S]

KM [S]

[E]T [S]

) =

[S] [ES] = [E]T

[E]T [S]

KM 1+

[S]

Équation de Michaelis-Menten

[S]

[ES] = [E]T

1+ Vi = k2 [ES]

Or on sait que :

Donc on peut écrire :

[S]

KM [S]

Vi = k2 [E]T

1+ On peut simplifier :

vi = k2

[S]

[S] [E]T

KM KM

KM +

[S]

= k2

[E]T

[S]

KM + [S]

Équation de Michaelis-Menten

vi = k2 [E]T

[S]

KM + [S]

On sait que lorsque toutes les molécules d’enzyme sont saturées, [ES] = [E]T et la vitesse de transformation du substrat en produit est alors maximale :

Vmax = k2 [E]T L’équation de Michaelis-Menten devient :

Vitesse initiale

vi = Vmax

[S]

KM + [S]

CINETIQUES ENZYMATIQUES     

I – Quelques définitions II – Facteurs indispensables III – Quelques rappels de thermodynamique IV – Notion de site actif V – Réaction à un substrat et un produit

 1 – notion de complexe enzyme-substrat  2 – les différentes phases de la réaction  3 – l’équation de Michaelis et Menten  4 – constante de Michaelis ou K M

5 – cas où [S]<<KM 6 – représentations linéaires 7 – constante catalytique kcat

Constante de Michaelis-Menten

vi = Vmax

[S]

KM + [S]

Peut-on attribuer à KM une signification concrète? [S] ½ Vmax = Vmax Si vi = ½ Vmax KM + [S] ½ (KM + [S]) = [S] ½ KM = [S] - ½ [S] ½ KM = ½ [S]

KM = [S] KM est la concentration en substrat pour laquelle l’enzyme fonctionne à la moitié de sa vitesse maximale

KM est inversement proportionnelle à l’affinité de l’enzyme. Plus l’affinité est élevée, et moins il faudra de substrat pour que l’enzyme fonctionne.

Constante de Michaelis-Menten

KM s’exprime en unité de concentration de substrat.

KM = [S] mole/L µmole/L mg/L g/L etc…

lorsque vi = ½ Vmax Nomenclature : M signifie Michaelis mais, officiellement, il faudrait écrire cette constante Km

Vitesse initiale (vi)

Constante de Michaelis-Menten

Vmax Pente initiale = Vmax/KM

Â˝ Vmax

concentration en substrat [S]

CINETIQUES ENZYMATIQUES     

I – Quelques définitions II – Facteurs indispensables III – Quelques rappels de thermodynamique IV – Notion de site actif V – Réaction à un substrat et un produit

 1 – notion de complexe enzyme-substrat  2 – les différentes phases de la réaction  3 – l’équation de Michaelis et Menten  4 – constante de Michaelis ou K  5 – cas où [S]<<K M

6 – représentations linéaires 7 – constante catalytique kcat

[substrat]<<KM

Vitesse initiale (vi)

vi = Vmax

[S]

KM + [S]

Vmax

[S]<<KM concentration en substrat [S]

[substrat]<<KM

vi = Vmax

[S]

KM + [S]

In vivo, la [S] est rarement saturante. Le rapport [S]/KM est compris entre 0,01 et 1 de sorte qu’au maximum la moitié des sites actifs est occupée par le substrat. Prenons une condition où KM >> [S] : si Vmax = k2 [E]T et

vi = Vmax

[S]

devient

KM + [S]

vi =

kcat

Dans ces conditions [E]T ≈ [E]libre (puisque [S] très petit)

vi = kcat

kcat

[E] [S]

est une constante de vitesse (apparente d’ordre 2)

k2 = kcat [E]T [S]

[substrat]<<KM

kcat/KM est l’efficacité catalytique de l’enzyme. On l'appelle également k A.

Lorsqu’un enzyme peut utiliser plusieurs substrats, k cat/KM permet d’estimer quel sera le substrat le plus utilisé par la protéine.

Plus le substrat est « bon » et plus le rapport k cat/KM est élevé (forte activité catalytique donc forte kcat et forte affinité donc faible KM).

CINETIQUES ENZYMATIQUES     

I – Quelques définitions II – Facteurs indispensables III – Quelques rappels de thermodynamique IV – Notion de site actif V – Réaction à un substrat et un produit

 1 – notion de complexe enzyme-substrat  2 – les différentes phases de la réaction  3 – l’équation de Michaelis et Menten  4 – constante de Michaelis ou K  5 – cas où [S]<<K  6 – représentations linéaires M

7 – constante catalytique kcat

Représentations linéaires

On peut facilement déterminer KM et Vmax si l’on a les concentrations en substrats utilisées et les vitesses enzymatiques mesurées à ces concentrations. Pour cela il faut linéariser l’équation de Michaelis-Menten. Il existe plusieurs façon de procéder : Lineweaver - Burk Hanes Eadie - Hofstee Eisenthal - Cornish-Bowden

Représentations linéaires

Lineweaver - Burk

[S]

vi = Vmax

KM + [S]

Si on écrit l’équation en double inverse :

[S]

Vmax

KM +

[S]

En réarrangeant on obtient :

vi Or

1 vi

Vmax = k2 [E] = kcat [E] T

kcat [E]

x T

1 [S]

KM +

[S]

Vmax

[S]

Vmax

[S]

Vmax

kcat [E]

ou T

[E] vi

1 [S]

kcat

Représentations linéaires

Lineweaver - Burk 1 vi

pente =

KM Vmax

Vmax

1 1

[S]

Il s'agit de la représentation la plus utilisée par les enzymologistes même s'il vaudrait mieux utiliser d'autres représentations plus adaptées… ANIMATION

Représentations linéaires

Hanes Si on multiplie l'égalité de Lineweaver-Burk par [S] :

1 vi

Vmax

[S]

devient

Vmax

Graphique de Hanes ou de Woolf

[S] vi

KM Vmax

x [S]

Vmax

[S] vi KM

pente =

Vmax

- KM [S]

1 Vmax

Représentations linéaires

Eadie - Hofstee Il s'agit de multiplier l'égalité de Lineweaver-Burk par vi x Vmax :

1 vi

KM Vmax

[S]

1 Vmax

devient

vi = Vmax - KM x

vi Vmax

pente = KM

Vmax/KM

vi/[S]

vi [S]

Représentations linéaires

Eisenthal - Cornish-Bowden

vi = Vmax

L'équation de Michaelis-Menten peut se réécrire ainsi :

Vmax = vi +

x KM

[S] Vmax V*max v5 v v34 v2 v1

-[S]5 -[S]4 -[S]3

-[S]2 -[S]1

* M

[S]

KM + [S]

CINETIQUES ENZYMATIQUES     

I – Quelques définitions II – Facteurs indispensables III – Quelques rappels de thermodynamique IV – Notion de site actif V – Réaction à un substrat et un produit

cat

Constante catalytique

est appelée constante catalytique ou

cat

Elle est proportionnelle au nombre de réactions que peut effectuer une molécule d’enzyme par unité de temps (les anglais appellent cela le «turn-over number»).

Vmax = kcat [E]T

µmole de P. mL-1.sec-1

µmole de E . mL-1 sec-1

Constante catalytique

Exemple : si dans un tube de 2 mL, on a 10 nmoles d’enzyme, une concentration saturante en substrat, et on mesure une vitesse d’apparition du produit de 30 µmoles/mL/min. Calculer le turn-over number.

Dans le tube il y a une concentration saturante en substrat donc l’enzyme fonctionne en Vmax.

Constante catalytique

On calcule la quantité de produit apparue dans le tube chaque minute : 2 mL x 30 µmoles/mL/min = 60 µmoles/min Il y a donc 60 µmoles de produit fabriquées par min par les 10 nmoles d’enzyme présentes dans le tube. 60 µmoles/min / 10 nmoles d’enzyme = 6000 réactions/min

ou 100 réactions/sec Le turn-over number est donc de 6000 réactions/min ou 100 réactions/sec. Chaque molécule d’enzyme catalyse 100 réactions chaque seconde. k2 ou kcat est égale à 100 sec-1.

Constante catalytique

E Ă&#x2030;tat de transition

Constante catalytique

k E

En approximation

Ă&#x2030;tat de transition

Constante catalytique Enzyme

Substrat

Acétylcholinestérase

Acétylcholine

Anhydrase carbonique

KM (mM)

kcat (s ) -1

kcat/KM (M-1·s-1)

0.095

14 000

147 368 421

CO2

1 000 000

83 333 333

HCO3-

400 000

15 384 615

1100

40 000 000

36 363 636

Catalase

H 2 O2

Chymotrypsine

N-acétylglycine éthyl ester

440

0.051

0.1

N-acétylvaline éthyl ester

0.17

1.9

0.66

190

287 878

Fumarate

0.005

800

160 000 000

Malate

0.025

900

36 000 000

10 000

400 000

0.006

0.5

83 333

N-acétyltyrosine éthyl ester Fumarase Uréase

Urée

Lysozyme

hexa N acetylglucosamine

On peut remarquer pour le lysozyme que malgré un mauvais Kcat, l'enzyme est efficace grâce un bon KM. De même l'anhydrase carbonique et la catalase ont une très mauvaise affinité pour leur substrat mais une très bonne constante catalytique. Ce qui en font les enzymes parmi les plus efficaces Grace à ces analyse ont peut déterminer les substrats "le plus physiologique" et l'activité probable de l'enzyme. (Une enzyme peut avoir plusieurs activité.) Ex chymotryspsine

Constante catalytique

Pourquoi mesurer Kcat et KM? Caractérisation On peut mesurer ces constantes pour caractériser une enzyme envers un substrats. Spécificité de l'enzyme En testant différents substrats on peut déterminer les type de substrat reconnu par l'enzyme (KM) et on peut voir l'efficacité Kcat) de la réaction selon la nature chimique du substrat (ex type de liaison). Rôle physiologique de l'enzyme Le rapport Kcat/KM peut nous aider à trouver le ou les substrats naturels de l'enzyme (ère génomique). Mutation rationnelle et mécanisme enzymatique. En testant différents mutants on peut déterminer les acide aminés impliqués dans la reconnaissance (il modifie le KM) et ceux directement impliqué dans la réaction (il modifie Kcat).

Constante catalytique

Biotechnologie La compréhension du mécanisme et la caractérisation de l'enzyme permet d'avoir un intérêt biotechnologique. Stabilisation (T°, pH, Sel,..), Mutants plus actifs, … Une mutation peut parfois changer la conformation d'une enzyme sans être directement impliquée. Mais en général, en modifiant un acide aminé, on peut changer la réactivité de l'enzyme. (Changement conformationnel, changement des propriétés physicochimiques, flexibilité, …) Et en changeant la réactivité on change KM ,donc Kcat et Km sont intimement liés.

KM =

( k−1 + kcat ) k1

D'autre part un acide aminé réactif est aussi lié à la fixation du substrat

CINETIQUES ENZYMATIQUES 

V – Cinétique Michaelienne (suite)

 8 – unités de vitesse d’une réaction enzymatique 9 – effet de la concentration en enzyme

VI – Inhibition enzymatique 1 – inhibition compétitive 2 – inhibition non compétitive 3 – inhibition incompétitive

VII – Effet des constantes physiques 1 – effet du pH 2 – effet de la température

VIII- Allostérie

Unités utilisées

Unités de vitesse

quantité / volume / temps mg µg mmole µmole

h min

mole

sec

Exemple

vi = 600 µmoles de P / L / min

Unités utilisées

Unités de vitesse : système international Par convention, il a été décidé que chaque fois qu’une quantité d’enzyme donnée produirait 1 µmole de produit par min cela correspondrait à 1 U ou 1 UIE (unité internationale enzymatique).

Exemple

vi = 600 µmoles de P / L / min correspond à

vi = 600 U / L = 600 UIE / L

Unités utilisées

Unités de vitesse : système international Aujourd'hui, l'unité recommandée est le katal (kat). Elle correspond à l’apparition d’une mole de produit par seconde (activité énorme jamais retrouvée physiologiquement). On utilise donc des sous multiples le mkat, le µkat, le nkat, etc…

Exemple

vi = 600 µmoles de P / L / min correspond à

vi = 10 µmoles de P / L / sec donc à

vi = 10 µkat / L

CINETIQUES ENZYMATIQUES 

V – Cinétique Michaelienne (suite)

 8 – unités de vitesse d’une réaction enzymatique  9 – effet de la concentration en enzyme VI – Inhibition enzymatique 1 – inhibition compétitive 2 – inhibition non compétitive 3 – inhibition incompétitive

VII – Effet des constantes physiques 1 – effet du pH 2 – effet de la température

VIII- Allostérie

Effet de la concentration de E

Fixons [S] et faisons varier [E] : [P] [E3]>[E2]>[E1] [E3] [E2]

[E1]

t Plus il y a d'enzyme plus la rĂŠaction est rapide. Par contre cela ne change pas l'ĂŠquilibre

La courbe V = f ([E]) est une droite

(V = d[P] / dt)

CINETIQUES ENZYMATIQUES 

V – Cinétique Michaelienne (suite)

 8 – unités de vitesse d’une réaction enzymatique  9 – effet de la concentration en enzyme 

VI – Inhibition enzymatique

 1 – inhibition compétitive  2 – inhibition non compétitive  3 – inhibition incompétitive VII – Effet des constantes physiques 1 – effet du pH 2 – effet de la température

VIII- Allostérie

Mécanisme général d'une inhibition enzymatique

EI + S

-1

ESI

I I + k + k E+S ES E+P 1

-1

Inhibition Enzymatique (Mécanisme)

Equation et Description

Guide Animé

Compétitive

Non-compétitive

Substrat

Même Inhibiteur Site actif E + S← → ES → E + P + I ↓↑ EI [I] se lie seulement à [E] libre,en compétition avec [S]; L’excès de [S] chasse [I].

Incompétitive E

X I

Site différent E + S← → ES → E + P + + I I ↓↑ ↓ ↑ EI + S →EIS

E + S← → ES → E + P + I ↓↑ EIS

[I] se lie seulement à [ES], [I] se lie à [E] libre ou [ES]; l’excès de [S] ne chasse pas augmentation de [S] favorise l’ inhibition par[I] [I]. Juang RH (2004) BCbasics

Inhibition Enzymatique (courbes)

Courbe directe

Compétitive Vmax

Non-compétitive vo

Km Km’

[S], mM

Doubles Inverses

Vmax inchangée Km augmenté 1/vo

Km = Km’

1/vo

Incompétitive

Vmax

Vmax’

[S], mM

Vmax diminuée Km inchangé

Km’ Km

[S], mM

Vmax & Km diminués 1/vo

Deux lignes parallèles

1/ Vmax 1/Km

1/[S]

1/ Vmax 1/Km

1/[S]

1/ Vmax 1/Km

1/[S]

Juang RH (2004) BCbasics

Tableau résumé des modifications des paramètres cinétiques en présence de l'un des trois inhibiteurs précédents :

Inhibition SANS

Compétitive

VM .

[S0] ----------------------KM + [S0] [S0] -------------------------------------[I0] KM . (1 + ---------) + [S0] KI

VM ou VMapp

KM ou KMapp

-------------

[I0] KM . (1 + -----------) KI

KM . [I0] ------------------KMapp - KM

Non compétitive

Tableau résumé-----------------des modifications des paramètres VMapp . [I0] [I0]de l'un des trois KM inhibiteurs--------------------cinétiques en présence VM - VMapp (1 + précédents ---------)

VM ---------------------- . [I0] (1 + ---------) KI

[S0] -----------------------KM + [S0]

Incompétitive

VM -------------------- . [I0] (1 + --------) KI

[S0] ----------------------------------KM + [S0] -----------------[I0] (1 + ----------) KI

VM ------------------[I0] (1 + --------) KI

KM -----------------[I0] (1 + --------) KI

VMapp . [I0] ------------------VM - VMapp

Cas particulier : inhibition irréversible

Cas particuliers :

 Il est parfois possible que de fortes concentrations de substrat inhibent un enzyme. Comment l'interpréter structuralement ?

[S]

 Effet Crabtree : dans la fermentation du Glc, chez la levure, La concentration élevée en glucose exerce une répression sur les enzymes de la respiration indépendamment de la présence en oxygène dans le milieu . Ce phénomène est très important pour la vinification. La cellule produira les enzymes suivant la [] de Glc du milieu.

CINETIQUES ENZYMATIQUES 

V – Cinétique Michaelienne (suite)

 8 – unités de vitesse d’une réaction enzymatique  9 – effet de la concentration en enzyme 

VI – Inhibition enzymatique

 1 – inhibition compétitive  2 – inhibition non compétitive  3 – inhibition incompétitive  VII – Effet des constantes physiques  1 – effet du pH 2 – effet de la température

VIII- Allostérie

Effet du pH

Les enzymes sont des protéines constituées d’acides aminés pouvant porter des fonctions chimiques sensibles aux variations de pH. Ces fonctions chimiques peuvent se protonner ou se déprotonner selon le pH du milieu dans lequel se trouve l’enzyme. Zone de pH optimum

Vmax

Effet du pH

Parfois le pH influe plus sur le substrat que sur l'enzyme lui-même. En effet, le pH du milieu peut avoir un effet sur l’état d’ionisation du substrat.

CH3-CHOH-COOH AH AH

CH3-CHOH-COO- + H+ A+ H+ A-

KM élevé et KM faible Donc à pH acide, l’enzyme ne fonctionne pas car le substrat est sous forme protonnée AH.

Effet du pH

Vmax

pepsine

crĂŠatine kinase

pH 2,2

7,9

CINETIQUES ENZYMATIQUES 

V – Cinétique Michaelienne (suite)

 8 – unités de vitesse d’une réaction enzymatique  9 – effet de la concentration en enzyme 

VI – Inhibition enzymatique

 1 – inhibition compétitive  2 – inhibition non compétitive  3 – inhibition incompétitive  VII – Effet des constantes physiques  1 – effet du pH  2 – effet de la température VIII- Allostérie

Effet de la température

Augmentation de la probabilité de rencontres entre enzyme et substrat. Augmentation de la vitesse de la phase de transformation du substrat en produit (augmentation de kcat). A températures élevées, fluctuations importantes de la structure 3D de la protéine avec perte de structure tertiaire : dénaturation thermique, souvent irréversible.

Vmax

100

activation chimique

stabilité

CINETIQUES ENZYMATIQUES 

V – Cinétique Michaelienne (suite)

 8 – unités de vitesse d’une réaction enzymatique  9 – effet de la concentration en enzyme 

VI – Inhibition enzymatique

 1 – inhibition compétitive  2 – inhibition non compétitive  3 – inhibition incompétitive  VII – Effet des constantes physiques  1 – effet du pH  2 – effet de la température  VIII- Allostérie

Allostérie

Les enzymes allostériques Certaines enzymes dites allostériques (de allos, autre et stereos, site ou espace) possèdent, en plus de leur site actif, un site appelé site allostérique. Une substance appelée effecteur (on dit aussi modulateur ou regulator en anglais) peut se fixer sur ce site.

Une enzyme allostérique peut généralement avoir deux formes différentes. Une forme active et une forme inactive. L'effecteur, en se fixant sur son site allostérique, a pour effet de bloquer l'enzyme dans sa forme active ou dans sa forme inactive (ça dépend de l'enzyme). On parle alors d'effecteur inhibiteur et d'effecteur activateur.

Allostérie

Cas d’une enzyme à 2 sous-unités catalytiques :

k+2 ES

E + 1P

k1 E

K2 SES k1

E+2P k+2

E+1P k+2

Allostérie

Un effecteur inhibiteur a pour effet de bloquer une enzyme dans sa forme inactive. En se liant au site allostérique, l'effecteur inhibiteur modifie la forme de l'enzyme qui devient alors inactive. Tant que l'inhibiteur est lié au site allostérique, l'enzyme garde sa forme inactive. Elle ne fonctionne plus. Si l'inhibiteur se sépare du site allostérique, l'enzyme reprend sa forme active. Un effecteur activateur rend une enzyme normalement inactive, active en se fixant à son site allostérique. Lorsque l'activateur se fixe au site allostérique, l'enzyme prend sa forme active. Si l'activateur se sépare de l'enzyme, celle-ci reprend sa forme inactive. Bref, ce type d'enzyme ne fonctionne que si elle est liée à son effecteur. Sans l'effecteur, l'enzyme ne sert à rien.

AllostĂŠrie

Allostérie

Modèle de coopérativité concerté État T

État R Modèle Monod, Wyman et Changeux 1965. Modèle "CONCERTE" ou "SYMETRIQUE" - le ligand peut se lier à un protomère quelle que soit sa conformation. Seul le changement conformationnel modifie l'affinité

Allostérie

Modèle symétrique

Conformation “T” Peu d’affinité pour S Peu d’affinité pour A Haute affinité pour I

Conformation “R” Affinité élevée pour S Affinité élevée pour A Peu d’affinité pour I

Equilibre en faveur de T en l’absence de ligand

Allostérie

Modèle symétrique

S S

La liaison de S augmente l’abondance de la forme R, favorisant dès lors la liaison de nouvelles molécules de S

Allostérie

Modèle symétrique

S S

S S S

Allostérie

Modèles de coopérativité séquentiel

Modèle Koshland 1966 Modèle "SEQUENTIEL" - la liaison du ligand induit progressivement des changements conformationnels dans les sous-unités

Allostérie

La courbe cinétique est une sigmoide

Vmax

+ Activateur + Inhibiteur

Substrat

Allostérie

Exemple de l’ATCase

Allostérie

Régulation de l’ATCase

CTP

ATCase

130

Allostérie

Conséquences de l’Allostérie • Fréquemment utilisée pour contrôler l’activité des enzymes métaboliques: – Inhibition par le produit final de la voie métabolique; – Activation par un produit généré tôt dans la voie métabolique;

• Basé sur le principe de coopérativité: – La liaison d’une petite molécule à l’enzyme modifie la structure 3-D de ce dernier et interfère avec son habileté à catalyser la réaction;

Allostérie

Ex. Dans les chaînes métaboliques, le produit final obtenu en bout de chaîne peut être un effecteur inhibiteur d'une enzyme allostérique du début de la chaîne. Plus la quantité du produit final augmente, plus la réaction qui le produit ralentit. C'est ce qu'on appelle un mécanisme de contrôle par rétro-inhibition (plus l'effet augmente, plus la cause responsable de cet effet diminue).

En plus de remplir sa fonction propre dans la cellule, le produit F est un inhibiteur allostérique de l'enzyme 1. Si la concentration de F devient trop élevée dans la cellule, la voie métabolique qui le produit est alors bloquée.

AllostĂŠrie

Conclusion

CINETIQUES ENZYMATIQUES  IX – Réactions à plusieurs substrats 1 – fixation aléatoire 2 – fixation ordonnée 3 – mécanisme Ping-Pong

Pour plus de détails consulter le site : http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/4DeuxSUBSTRATS/1Cours2SUBSTRATS.htm

Réactions à plusieurs substrats

Jusqu'à présent nous n'avons considéré que des cas simples d'enzymes ne catalysant que des réactions à un seul substrat ou à deux substrats, l'un d'eux étant l'eau ([H2O] = cste = 55,55 M).

Or, la plupart des enzymes catalysent des réactions complexes avec le plus souvent 2 substrats et 1, 2, voire 3 produits.

L'équation générale se présente de cette manière :

A + B

P + Q

Réactions à plusieurs substrats

Ces réactions à 2 substrats et 2 produits sont souvent des réactions de transfert de groupements chimiques d'une molécule à l'autre :

GX + Y

X + GY

A partir de là, un certain nombre de mécanismes réactionnels vont exister avec in fine des cinétiques caractéristiques. Mécanisme à complexe ternaire aléatoire ou fixation aléatoire Mécanisme à complexe ternaire ordonnée ou fixation ordonnée Mécanisme à enzyme modifié ou mécanisme Ping-Pong

CINETIQUES ENZYMATIQUES  IX – Réactions à plusieurs substrats  1 – fixation aléatoire 2 – fixation ordonnée 3 – mécanisme Ping-Pong

Fixation aléatoire

EGY

EXG Y

EXG-Y

complexes ternaires productifs

EX-GY

Q EQ

EA E

EAB

EB B

EPQ

EPEQ Q

Fixation aléatoire

Ka +

+ B

Kb' EAB

E +

E+P+Q

Ka'

Ka =

[E] [A] [EA]

Kb =

[E] [B] [EB]

[E]T = [E] + [EA] + [EB] + [EAB]

Ka' =

[EB] [A] [EAB]

Kb ' =

[EA] [B] [EAB]

vi = k2 [EAB]

d'où Ka ' x Kb = Ka x Kb '

vi [E]T

k2 [EAB] [E] + [EA] + [EB] + [EAB]

Fixation aléatoire Ka +

+ B Kb'

EAB

E +

A +

E+P+Q

k2 [EAB]

[E] + [EA] + [EB] + [EAB]

[E]T

K a'

k2 [E] [A] [B] vi

Ka Kb'

[E]T

[E] +

[E] [A]

[E] [B]

[E] vi

= k2

[E]T

Ka Kb' Ka Kb' Ka Kb'

vi [E]T

= k2

[E] +

Kb' [E] [A] Ka Kb'

[E] [A] [B]

Ka Kb'

[A] [B]

Ka Kb' [E] [A] Ka Kb' Kb

[E] [A] [B]

Ka Kb'

[A] [B]

Ka Kb' + Kb' [A] +

Ka Kb' [A] Kb

+ [A] [B]

Fixation aléatoire

= k2

[E]T

= k2 [E]T

[A] [B]

Ka Kb' + Kb' [A] +

+ [A] [B]

[A] [B]

Ka Kb' + Kb' [A] +

vi = Vmax

Ka Kb' [A]

Ka Kb' [A] Kb

+ [A] [B]

[A] [B]

Ka Kb' + Kb' [A] +

Ka Kb' [A] Kb

+ [A] [B]

Fixation aléatoire

[A] [B]

vi = Vmax

Ka Kb' [A]

Ka Kb' + Kb' [A] +

1 vi

Ka Kb' + Kb' [A] +

Vmax

Ka Kb' [A] Kb

+ [A] [B]

+ [A] [B] Ka' x Kb = Ka x Kb'

[A] [B] 1 vi

1 Vmax

Ka'

( 1+

Kb'

[A]

[B]

Ka Kb' [A] [B]

)

On peut écrire 1 vi

1 Vmax

[ 1+

Kb' [B]

Ka Kb'

+ ( Ka' +

[B] 1 vi

1 Vmax

)

1 [A]

[ 1+

]

Ka' [A]

+ ( K b' +

Ka Kb' [A]

)

1 [B]

]

Fixation aléatoire 1

1/vi

1 Vmax

[ 1+

pente = 1/Vmax (1 -

Ka' ) Ka

Kb' [B]

+ ( Ka' +

Ka Kb'

)

[B]

1 [A]

]



[B]

1/Vmax (Ka' -

Ka Kb' [B]

)

1/[A]

-1/Ka

1 1/vi



[A]

pente = -1/Kb Kb' 1/Vmax (1 ) Kb

1/[B]

1 Vmax

[ 1+

Ka' [A]

1/Vmax (Kb' -

+ ( Kb' +

Ka Kb' [A]

)

Ka Kb' [A]

)

1 [B]

]

Fixation aléatoire

Maintenant si Ka = Ka' et Kb = Kb' 1 vi

1 Vmax

[ 1+

Kb [B]

+ ( Ka +

Ka Kb [B]

)

1 [A]

]

1 vi

1/vi

Vmax

[ 1+

Ka [A]

+ ( Kb +

Ka Kb [A]

)

1 [B]

]

1/vi

1/[A]



[A]



[B]

-1/Ka

1/[B]

-1/Kb

CINETIQUES ENZYMATIQUES  IX – Réactions à plusieurs substrats  1 – fixation aléatoire  2 – fixation ordonnée 3 – mécanisme Ping-Pong

Fixation ordonnĂŠe

EXG Y

EXG-Y

EX-GY

complexes ternaires productifs

A E

EAB

EPQ

Fixation ordonnée

Ka E + A

Kb EA + B

EAB

E+P+Q

C'est le cas de l'alcool déshydrogénase ou de la lactate déshydrogénase où le NAD réduit ou oxydé (selon le sens de la réaction catalysée) se fixe d'abord. Ka =

[E] [A] [EA]

Kb =

[EA] [B] [EAB]

[E]T = [E] + [EA] + [EAB] vi = k2 [EAB]

d'où

vi [E]T

k2 [EAB] [E] + [EA] + [EAB]

Fixation ordonnée Ka E + A

Kb EA + B

EAB

E+P+Q

k2 [EAB]

[E] + [EA] + [EAB]

[E]T k2 [E] [A] [B] vi

Ka Kb

[E]T

[E] +

[E] [A]

[E] vi [E]T

= k2

Ka Kb Ka Kb Ka Kb

vi [E]T

= k2

[E] +

[A] [B]

Ka Kb+ Kb [A] + [A] [B]

[E] [A] [B]

Ka Kb [A] [B]

Kb [E] [A] Ka Kb

[E]

Ka Kb

vi = Vmax

[A] [B]

Ka Kb+ Kb [A] + [A] [B]

Fixation ordonnée

[A] [B]

vi = Vmax

1 vi 1 vi

1 Vmax

( 1 +

Kb [B]

Ka Kb+ Kb [A] + [A] [B]

1 Vmax

( 1 +

Ka Kb

[B]

[A]

[B]

)

1/vi

Ka Kb [A] [B]

1 Vmax

)

[( Kb +

Ka Kb

-1/Ka

[B]

1 Vmax

1/vi

[B] 

1/Vmax

[A]

)

[A] 

1/[A]

1/Vmax

1/[B]

CINETIQUES ENZYMATIQUES  IX – Réactions à plusieurs substrats  1 – fixation aléatoire  2 – fixation ordonnée  3 – mécanisme Ping-Pong

Mécanisme ping-pong

EG-X

E-GX

E-GY

A E

EG-Y

Mécanisme ping-pong

Ka E + A

P Kb + E' + B E'B

E+Q

C'est le cas de l'aminotransférase ou de la chymotrypsine.

vi = Vmax

1 vi

1 Vmax

[A] [B]

Ka [B] + Kb [A] + [A] [B]

( 1 +

Kb [B]

Ka [A]

)

Mécanisme ping-pong P Kb + E' + B E'B

Ka E + A

E+Q

vi 1

1 Vmax

( 1 +

1/vi

+ Ka

[B]

1 [A]

)

Vmax

Kb Vmax

( 1 +

Vmax

( Kb

[B] 

1/vi

intersection 1

1 [B]

pente

Vmax

1 [B]

)

[A]

+1+

Ka [A]

)

[A] 

Ka Vmax

1 [A]

pente

1 [B]

intersection 1 Ka

Kb Vmax

1/[B]

intersection Kb

[B]

intersection

1/[A]

Ka Kb

1 [A]

1 Kb

GLOSSAIRE - Apoenzyme : c’est une enzyme sans son cofacteur, c'est-à-dire la protéine à laquelle la coenzyme se liera pour produire une hétéroenzyme. L'apoenzyme est la partie activante, responsable de la spécificité envers le substrat. Schématiquement : coenzyme + apoenzyme = hétéroenzyme. - Catalyse : modification de la vitesse d’une réaction chimique par une substance rajoutée, appelée catalyseur, que l’on retrouve inaltérée en fin de réaction et qui ne modifie pas l’équilibre thermodynamique de cette dernière. - Catalyseur : Un catalyseur est une substance étrangère à la réaction, qui n'est pas consommée par la réaction et qui modifie l'évolution d'une réaction chimique, thermodynamiquement possible. Ces modifications se traduisent par une augmentation de la vitesse et parfois par une orientation de la sélectivité de la réaction. La réaction catalytique peut être effectuée soit en phase homogène, soit en phase hétérogène. Il n'existe pas de catalyseur universel et toutes les réactions ne peuvent pas être accélérées par un catalyseur. Le choix du catalyseur dépendra donc de la réaction considérée. - Cinétique chimique : C’est l'étude de la vitesse des réactions chimiques. Certaines réactions sont totales et très rapides voire violentes, comme les explosions. D'autres sont tellement lentes qu'elles durent plusieurs années (comme la formation de la rouille), voire plusieurs siècles (comme la formation du charbon ou du pétrole). Certaines sont même tellement lentes que les réactifs de départ sont considérés comme stables, par exemple l'oxydation de l'aluminium ou encore la transformation du diamant en carbone graphite. On parle alors d'états « métastables ». - Coenzyme : partie non protéique de certaines enzymes, indispensables à leur fonctionnement. Certaines enzymes utilisent des coenzymes spécifiques qui peuvent modifier leur structure ou prendre part à la réaction concernée. Certaines coenzymes sont dérivées de vitamines (vitamine B en particulier), d'autres sont des phosphoribonucléotides, d'autres enfin sont des métaux (zinc, cuivre, magnésium). La plus connue est la coenzyme A, coenzyme des transacétylases, qui se combine à différents métabolites par une liaison riche en énergie. Une autre coenzyme, le nicotinamide-adénine-dinucléotide-phosphate (NADP), est indispensable au processus de photosynthèse. Les coenzymes sont aussi appelées cofacteurs enzymatiques.

- Cofacteur : Corps chimique intervenant obligatoirement dans une réaction enzymatique : pour transporter ou compléter un substrat pour accepter un produit comme participant à la structure de l’enzyme. - Enzyme : Protéine catalysant une réaction biochimique. Il y a six classes d'enzymes : les oxydoréductases, les transférases, les hydrolases, les lyases, les isomérases et les ligases. Protéine volumineuse ; les enzymes ont pour mission d'accélérer (catalyser) les réactions chimiques dans les organismes vivants. Il existe un grand nombre d'enzymes spécifiques qui jouent un rôle important dans les processus physiologiques (digestion, conduction nerveuse, synthèse d'hormones, etc.) - Facteur cinétique : tout paramètre permettant d’influencer la vitesse d’une transformation chimique. La température, la concentration des réactifs, la présence de catalyseurs, la lumière ou encore l’emploi d’un solvant sont des exemples de facteurs cinétiques. - Inhibiteur : substance qui diminue la vitesse d'une réaction catalysée par une enzyme. En se liant sur une enzyme, un inhibiteur peut empêcher la fixation du substrat sur le site actif, ou provoquer une déformation de l'enzyme qui rend celle-ci inactive (inhibiteur allostérique). L'inhibition des enzymes joue un rôle important dans le contrôle des mécanismes biologiques, et notamment dans la régulation des voies métaboliques. En enzymologie, les inhibiteurs sont très utilisés pour déterminer le mécanisme d'action d'une enzyme. - Ligand : En biologie, molécule se fixant sur une protéine. Cette fixation déclenche en général un effet : modification d'une activité enzymatique dans le cas d'un ligand allostérique, réponse cellulaire dans le cas d'un récepteur membranaire, d'un récepteur cytoplasmique ou d'un récepteur nucléaire d'une cellule. - Produits : Molécules libérées par l'enzyme après réaction des substrats. - Réaction autocatalytique : C’est une réaction chimique dont le catalyseur figure parmi les produits de la réaction. On dit que cette transformation est "autocatalysée". De ce fait, l'évolution de la vitesse volumique de réaction au cours du temps est peu habituelle, particulièrement pour les transformations chimiques lentes ou très lentes. - Substrat : En biochimie, c’est une molécule utilisée comme produit de départ dans une réaction chimique catalysée par une enzyme (comme l'amidon pour l'amylase). Le ou les substrats se fixent dans le site actif de l'enzyme dans une géométrie qui favorise leur réaction, transformation ou dégradation.