IFTAB II
EXERCICES D’ENZYMOLOGIE Exercice 1 : CALCUL D’ACTIVITES La lactase hydrolyse le lactose en glucose et galactose. On détermine la vitesse d’hydrolyse du lactose par la lactase (β-galactosidase) (E.C. 3.2.1.23) dans les conditions initiales. Il apparaît 0,672x10-2 moles de glucose en 10 minutes. On a introduit dans le milieu 1 mL de solution enzymatique dont la teneur en protéines est de 2,85 g.L-1. a) Ecrire l’équation de la réaction b) Que signifie le terme « conditions initiales », Préciser les conditions de concentrations en substrat. c) Calculer la concentration d’activité catalytique de la préparation en enzymatique en UI.mL-1 et en Kat.mL-1 d) Calculer l’activité spécifique de l’enzyme en UI.mg-1 et en Kat.mg-1 e) Calculer l’activité molaire spécifique en considérant que l’on est en présence d’une enzyme pure.(PM = 135000 Da) Exercice 2 : CALCUL D’ACTIVITES Une enzyme E est constitué de 2 sous-unités identiques de poids moléculaires voisins de 50 000 Da .La réaction catalysée est : E S P On dispose d'un extrait de E contenant 3 mg de protéines par mL et dans lequel I'enzyme est pure à 80 %. La détermination d'activité est réalisée par spectrophotométrie à 512 nm, longueur d'onde à laquelle le produit P absorbe mais non le substrat S. Le coefficient d'absorption molaire du produit est égal dans les conditions de la mesure à 5 000 mol-1.L.cm-1. La cuve utilisée a une largeur de 1 cm. Le milieu réactionnel, tamponné à pH 7 et thermostaté à 30 °C, contient une concentration saturante en substrat. Son volume est de 3 mL. On utilise pour la détermination 100 µL d'extrait de E diluée au 500ème. On arrête la réaction en ajoutant 2 ml de réactif d'arrêt au milieu réactionnel après 2 minutes de temps de réaction. La variation d'absorbance lue est égale à 0,6 unité d'absorbance. Calculer la concentration d'activité catalytique dans l'extrait E et l'activité spécifique. En déduire le Turn Over Number à 30 °C et pH 7. Exercice 3 : Etude cinétique d’une enzyme On réalise sur une préparation pure en enzyme la mesure de l'apparition du produit en fonction du temps pour une concentration en substrat de 0,1mol.L-1 dont voici les résultats. Temps en minute
0
0,5
1
2
3
4
5
[Produit] en µmol.L-1
0
109
205
405
489
534
555
1. Tracer le graphique de la concentration de produit en fonction du temps. 2. Déterminer la vitesse initiale de la réaction enzymatique On mesure la vitesse initiale pour différentes concentrations de substrat. [S] en mol.L-1 -1
Vi en µmol.minute
0,0125
0,025
0,05
0,1
133
167
190
compléter
3. Donner la signification de Vmax et Km. 4. Déterminer graphiquement les constantes cinétiques de cette enzyme. Exercice 4 : ETUDE CINETIQUE DE LA PHOSPHORYLATION DU GLUCOSE Le glucose est dégradé dans l’organisme par la voie de la glycolyse. La première réaction de cette voie est une phosphorylation du glucose qui peut être catalysée par deux enzymes différentes : la glucokinase ou l' hexokinase. On se propose d’étudier les caractères cinétiques de ces deux enzymes vis à vis de leur substrat commun : le glucose. La vitesse initiale de la réaction a été mesurée pour des concentrations différentes en substrat à 20°C et à pH=7. Les résultats expérimentaux sont reproduits dans le tableau ci-dessous. La concentration en enzyme utilisée pour les deux séries d’expériences est la même. [Glucose]i en mol.L-1
Vi avec la glucokinase en µmol.L-1.min-1
[Glucose]i en mol.L-1
Vi avec l’hexokinase en µmol.L-1.min-1
5,0.10-3
1,61
5,0.10-5
0,490
6,7.10-3
2,00
6,7.10-5
0,575
10,0.10-3 -3
20,0.10
-3
50,0.10
2,67
10,0.10-5
0,607
2,93
-5
0,806
-5
0,893
4,17
20,0.10 50,0.10
Déterminer les valeurs de KM et de Vm pour ces deux enzymes. Comparer les deux KM. Conclure. Comparer les deux Vm. Conclure. Sachant que la glycémie normale est d' environ 5 mmol.L-1, indiquer si chacune de ces deux enzymes agit dans les conditions d’obtention de la vitesse maximum. Quelle serait l’influence d’une augmentation importante de la glycémie? Correction exercice 1: a) Réaction :
b) Conditions initiales : ce sont les conditions qui permettent de mesurer la vitesse initiale de la réaction, en particulier le substrat doit être en large excès par rapport à l’enzyme pour que v = vi le plus longtemps possible. c) Calcul de la concentration d’activité enzymatique – En UI.mL-1 : l’unité internationale est la quantité d’enzyme qui catalyse la transformation de 1 µmole de substrat par minute. Il apparaît 0,672x10-2 moles soit 6720 µmole de glucose en 10 minutes, ainsi, d’après la stœchiométrie de la réaction, 6720 µmole de lactose ont été hydrolysée en 10 minutes soit 672 µmole par minute pour un volume de 1 mL. Donc la concentration d’activité enzymatique est de 672 UI.mL-1 – En Kat.mL-1 : le katal est la quantité d’enzyme qui catalyse la transformation de 1 mole de substrat par seconde. donc la concentration d’activité enzymatique est égale à 0,672 10-2/60x10x1 = 1,12 10-5 kat.mL-1 d) Activité spécifique de l’enzyme S’exprime en UI.mg-1.ou en Kat.mg-1 La concentration en protéines de la solution est de 2,85 g .L-1, dans 1 mL de solution il y a donc 2,85 mg de protéine D’où activité spécifique de l’enzyme = (672/2,85)x1 = 236 UI.mg-1.ou (1,12 10-5/2,85)x1 = 3,92 Kat.mg-1 e) Activité molaire spécifique de l’enzyme Le poids moléculaire de l’enzyme est 135 000 Da, 2,85 mg représentent donc 2,85.10-3/135000 = 2,1.10-8 mole. D’où activité molaire spécifique de l’enzyme = (672/2,1.10-8)x1 = 3,18.1010 UI.mol-1.= (1,12 10-5/2,1.10-8)x1 = 530 Kat.mol-1 Correction exercice 2: La vitesse est suivie par spectrophotométrie, ainsi pour calculer la vitesse de disparition du substrat on va utiliser la loi de Beer-Lambert : Abs = ε.l.c, ici seul le produit de la réaction absorbe donc Abs = ε.l.[P] et la variation de concentration de P est ∆Abs = ε.l.∆[P] ∆[P] = ∆Abs/ ε.l = 0,6/ 5000x1 = 1,2 10-4 mol.L-1 = 120 µmol.L-1 Le milieu réactionnel a un volume final de 3 + 0,1 = 3,1 mL, la quantité de produit apparu est donc de 120 x 3,1.10-3 = 0,372 µmol en 2 min soit 0,186 µmol.min-1. D’après la stœchiométrie de la réaction le nombre de moles de P apparues est égal au nombre de moles de S disparues donc le nombre de moles de S transformées = 0,1806 µmol.min-1. On a employé pour cela 100 µL d’extrait enzymatique dilué au 500ème, La concentration d’activité enzymatique est donc égale à (0,186/0,1)x500 = 930 UI.mL-1 à 30 °C et pH 7. 1 mL d’extrait enzymatique contient 3 mg de protéines donc l’activité spécifique de l’enzyme = (930/3)x1 = 310 UI.mg-1 à 30 °C et pH 7.
Dans l’extrait enzymatique l’enzyme est pure à 80 % donc sur les 3 mg de protéines il y a 3x0,8 = 2,4 mg d’enzyme E, le PM de E est 2x50 000 Da , donc 2,4 mg représentent 2,4.10-3/100 000 = 2,4.10-8 mole. de E donc l’activité molaire spécifique de l’enzyme = (930/2,4.10-8)x1 = 3,875.1010 UI.mol-1 à 30 °C et pH 7. Correction exercice 3: 1. graphique : [P] = f (temps).
cinétique de la réaction enzymatiquee [P] en
600 500
-1
µmol.L
400 300
y = 201,31x + 3,6
200 100 temps (min)
0 0
1
2
3
4
5
2. Sur le graphique on voit que la réaction fonctionne en vitesse initiale jusqu’à un temps égal à 2 minutes, cette partie de la courbe est un droite dont l’équation est y = 201,31x + 3,6 la pente de cette droite représente la vitesse initiale, elle est égale à 201,3 µmol.min-1.L-1. 3. Signification de Vmax et Km cf. cours 4. Calcul de Vmax et Km : Représentation de Lineweaver et Burk en coordonnées inverses : 1/[S] mol-1.L 1/Vi µmol-1.minute
80 7,52.10-3
40 5,99.10-3
20 5,26.10-3
représentation de Lineweaver et Burk
-200
-150
-100
0,008 1/vi 0,007 0,006 y = 4E-05x + 0,0045 0,005 0,004 0,003 0,002 0,001 1/[S] 0 -50 -0,001 0 50 100 -0,002
Equation de la droite 1/vi = 4.10-5.1/[S] + 0,0045 Calcul de 1/Vmax : lorsque 1/[S] = 0, 1/vi = 1/Vmax donc 1/Vmax = 0,0045 µmol-1.minute donc Vmax = 222 µmol.minute-1 Calcul de 1/Km : lorsque 1/vi = O, 1/[S] = -1/Km donc –1/Km = - 112,5 mol-1.L donc Km = 8,9 10-3 mol.L-1. Calcul de vi quand [S] = 0,1 mol.L-1 : si [S] = 0,1 mol.L-1 alors 1/[S] = 10 mol.L-1 , d’après l’équation de la droite 1/vi = 4,9.10-3 µmol-1.minute donc vi = 204 µmol.minute-1.
Correction exercice 4: Calcul de Vmax et Km : Représentation en coordonnées indirectes : 1/Vi avec la glucokinase 1/[Glc]i en µmol-1.L.min mol-1.L 200 1150 100 50 20
1/[Glc]i
1/Vi avec l’ hexokinase en µmol-1.L.min
mol-1.L 200 1150 100 50 20
0,621 0,500 0,375 0,341 0,240
2,041 1,739 1,647 1,241 1,120
représentation de Lineweaver et Burk 1/vi
2,5
y = 0,0051x + 1,0295 2,0
glucokinase Hexokinase
1,5 1,0 y = 0,002x + 0,2078 0,5 0,0 -300
-200
-100
1/[Glc] 0
100
200
300
-0,5
Glucokinase : représentation de Lineweaver et Burk : équation de la droite : 1/vi = 0,002.1/[S] + 0,2078 Calcul de 1/Vmax : lorsque 1/[S] = 0, 1/vi = 1/Vmax donc 1/Vmax = 0,2078 µmol-1.L.min donc Vmax = 4,81 µmol.L-1.min-1 à 20°C et à pH = 7 Calcul de 1/Km : lorsque 1/vi = O, 1/[S] = –1/Km donc –1/Km = - 103,4 mol-1.L donc Km = 9,62 10-3 mol.L-1 à 20°C et à pH = 7. Hexokinase : représentation de Lineweaver et Burk : équation de la droite : y = 0,0051x + 1,0295 Calcul de 1/Vmax : lorsque 1/[S] = 0, y = 1/Vmax donc 1/Vmax = 1,0295 µmol-1.L.min donc Vmax = 0,97 µmol.L-1.min-1 Calcul de 1/Km : lorsque 1/vi = O, x = -1/Km donc –1/Km = - 201,8 mol-1.L donc Km = 4,95 10-3 mol.L-1. L’hexokinase a plus d’affinité pour le substrat que la glucokinase car son Km est plus petit par contre sa vitesse maximale est plus basse. La glycémie est de l’ordre de 5 mmol.L-1, soit environ égale au Km de l’hexokinase, donc la vitesse de la réaction sera de environ Vmax/2 (Cf. cours) et très inférieure au Km de la glucokinase. Dans une réaction enzymatique pour que Vmax soit atteint il faut que [S] >> Km, ce n’est pas le cas ici donc les enzymes fonctionnent « au ralenti » dans les conditions physiologiques. Si la glycémie augmente de manière importante la vitesse des enzymes va augmenter pour se rapprocher de Vmax cf. schéma V = f([S]) p10 du polycop. De plus le Km de la glucokinase vis-à-vis du glucose est élevé donc elle n'agit de manière significative que lorsque le taux de glucose intracellulaire est augmenté.