2IMMUNOLOGIE by BEN CHIR

IMMUNOLOGIE

Immunologie : c’est la réaction d’un organisme (agent étranger) qui pénètre dans un autre organisme. Cet agent étranger est appelé Antigène (Ag). On a réaction grâce à la synthèse d’anticorps (Ac). La réaction Ag/Ac est très spécifique. Ces anticorps sont parfois utilisés comme des outils, en immunocytologie, biologie moléculaire et médicale.

Chapitre 1 :

LE DEROULEMENT DE LA REPONSE IMMUNITAIRE. Lors de la réaction, il y a intervention de cellules immunitaires. Ces cellules produisent des effecteurs dont le rôle est de détruire l'antigène (Ag) par un mécanisme qui doit être très spécifique : destruction des éléments étrangers mais pas cellules de l’individu. On a 2 types de réaction :  réaction à médiation humorale (produit des anticorps ->Ac)  Réaction à médiation cellulaire (cellules tueuses : lymphocytes cytotoxiques) Il y a des interactions entre ces deux réactions.

I\ La capture et la présentation de l’Ag A\ La capture (ou captation). C’est la première étape. L'Ag pénètre et des monocytes (s’ils sont dans le sang) ou des macrophages (s’ils sont dans les tissus) vont le capturer. Ces cellules sont présentes partout et surtout près des lieux de pénétration de l'Ag (muqueuses et peau). On trouve aussi des cellules dendritiques qui peuvent capturer l'Ag. Les plus importantes de cette catégorie sont les cellules de Langerhans situées sous la peau. La capacité de ces cellules est la phagocytose (avale l'Ag). Le macrophage reconnaît l'Ag de manière non-spécifique.

Macrophage Ag Noyau

B\ La présentation. L'antigène (bactérie, virus,...) est composé entre autres de protéines, association d'acides aminés (AA). Au cours de la destruction, les protéines seront coupées. On trouvera alors des peptides de 9 AA. Les sucres vont aussi êtres coupés. Dans la cellule phagocytante, des éléments sont capables de fixer des peptides de 9 AA. Cette molécule migrera vers la membrane pour présenter le peptide à l'extérieur. C'est le CMH (Complexe Majeur d'Histocompatibilité). 3

Le CMH II est très spécifique du système immunitaire. Ce sont des cellules présentatrices de l'antigène (CPAg). Une CPAg est soit :



monocyte



macrophage



cellule dendritique

II\ Reconnaissance. Le peptide est reconnu de manière spécifique par les lymphocytes T. Ils possèdent un récepteur qui peut reconnaître un peptide porté par le CMH. Les lymphocytes B produiront ensuite des Ac mais en reconnaissant l'Ag directement à l'état soluble. Les LT et LB peuvent communiquer grâce à des cytokines.

III\ Les acteurs de la réponse immunitaire spécifique. A\ Les lymphocytes T. Morphologiquement LB et LC sont quasiment identiques, ce sont des cellules avec un gros noyau. Ils peuvent reconnaître spécifiquement l'Ag grâce à un récepteur à Ag. Ces cellules vont être sélectionnées à leur naissance (celles reconnaissant le soi seront détruites). Lors d'une infection, on observe un phénomène d'expansion des cellules spécifiques à l'Ag (prolifération).

Les LT proviennent du thymus (au-dessus du cœur). Ceux-ci peuvent être de deux types :



T auxiliaires (Taux., Th) qui vont reconnaître l'Ag puis produire des cytokines pour aider les autres cellules à fonctionner.



T cytotoxiques (Tc) : cellules tueuses qui jouent surtout un rôle quand infection par un virus

Les 2 familles portent le TCR. Ce récepteur ne reconnaît que l'Ag dégradé : un peptide associé au CMH. Quand il le reconnaît :



Th -> CMH II/peptide



Tc -> CMH I/peptide

B\ Les lymphocytes B Ils possèdent aussi un récepteur : le BCR. C'est un anticorps de membrane. Les Anticorps sont des Immunoglobulines (Ig).

Ils sont spécifiques mais reconnaissent l'Ag sous forme soluble. Ils changent alors de forme et se mettent à exprimer des récepteurs aux cytokines. Quand les cytokines arrivent, ils se mettent à proliférer.

Ils subissent alors une différenciation et deviennent des plasmocytes. Ils se mettront alors à libérer des Ac qui vont participer à la destruction de l'Ag.

C\ Les cytokines.    

C'est une famille de molécules. On les appelle : Interleukines quand elles permettent une interaction entre deux cellules Lymphokines quand elles sont produites par un lymphocyte Interférons TNF (Tumor Necrosis Factor)

Les lymphocytes, les macrophages,... les produisent mais aussi certaines cellules comme les cellules du placenta. Elles agissent sur les cellules du système immunitaire mais aussi sur d'autres cellules.  Interleukine 1 (IL1) : elle est produite par les macrophages. Elle va agir au niveau des LTh mais aussi des LB.  IL2 et IFN alpha (interféron) (=type1<-Th1) : sont produites par un LTh une fois qu'il a reconnu le peptide associé au CMH. L'IL1 permet l'augmentation de cette production. Elles permettent d'activer la prolifération des LTh et active les LTc.  IL4, 5,6,10,13 (type2<-Th2) : activent les LB. Elles ont un rôle dans l'expansion clonale et la différenciation. Elles sont produites par les LTh. Le rôle essentiel des cytokines est de stimuler l'activité des cellules.

Quand il n'y a plus d'Ag, tout s'arrête mais il reste des LT ou LB mémoire qui permettront une réaction plus rapide.

Chapitre 2 :

Les organes lymphoïdes. Introduction. Les organes lymphoïdes sont le regroupement du système immunitaire. Les organes secondaires de ce système permettent de favoriser la réponse immunitaire. Dans ces organes, on assiste à un tri des cellules et à une sélection dans les organes lymphoïdes centraux. Les organes lymphoïdes primaires sont composés par la moelle osseuse et le thymus : ce sont des lieux de différenciation des cellules. Les organes secondaires sont des lieux d’activation et de réponse immunitaire. Ils sont composés par : des ganglions (sur la lymphe), la rate (sur la voie sanguine), les amygdales et les plaques de Peyer (au niveau de l’intestin).

I\ Les organes lymphoïdes primaires. A\ La moelle osseuse. Cette moelle est la source de tous les leucocytes (Lb et Lt, CPAg, granulocytes). On assiste à une prolifération cellulaire intense et à la différenciation des monocytes et des Lb. Les précurseurs des Lt vont ensuite migrer vers le thymus pour mûrir. Globules rouges Cellules souches Macrophages, cellules dendritiques Leucocytes Granulocytes Lt et Lb.

B\ Le thymus. Il reçoit les cellules immatures provenant de la moelle osseuse. C’est dans cet organe qu’il va y avoir la sélection des Lt qui reconnaissent le soi pour les détruire. Les Lt acquièrent ici leur récepteur. (95% des Lt non matures sont éliminés). Si on pratique une thymectomie sur un souriceau (néo-né), il n’y a plus de réponse immunitaire : les Lt Lb sont absents. Remarques : - Les Lb sont sélectionnés dans la moelle, mais leur processus de maturation n’est pas connu. - Les Lb ont d’abord été trouvé chez les oiseaux où leur sélection était réalisée dans la «bourse de Fabricius ». - Chez le fœtus, le foie joue le rôle du thymus. 8

Structure du thymus. Le thymus est un ensemble de deux lobes situés au-dessus du cœur. Chaque lobe est constitué de lobules séparés les uns des autres par du tissu conjonctif. Un lobule est constitué de deux parties : la partie externe (le cortex) où se trouvent en général les lymphocytes immatures qui prolifèrent très vite et la médulla qui contient les lymphocytes matures à très faible division cellulaire. Lobes Lobule Tissu conjonctif

Cortex externe Médulla Cel. épithéliales

Les cellules épithéliales nourrissent les Lt pour son bon développement. On trouve dans le thymus, des macrophages, des cellules dendritiques (avec CMH II). Les Lt matures passent ensuite dans la circulation sanguine pour rejoindre les organes lymphoïdes secondaires. Au fil du temps, le thymus involue et se détruit.

II\ Les organes lymphoïdes secondaires. Ce sont des organes qui font de la surveillance immunitaire Leurs caractéristiques communes : - Ils possèdent toutes les cellules nécessaires à la réponse immunitaire. - Ils reçoivent par voie sanguine ces cellules nécessaires (du thymus et de la moelle). - On trouve des cellules réticulaires qui présentent très bien l’Ag. - Ils sont situés près des frontières de l’organisme. - Ils la capacité d’un développement maximum en présence de l’Ag (forte sensibilité). Le système lymphatique permet le retour des Ac par les capillaires qui drainent les tissus. Au niveau du canal thoracique, on a un maximum de débit et ce canal va déverser son contenu dans la veine sous-clavière gauche. On a donc une circulation totale des Lb et Lt dans l’organisme. La détection des Ag est alors assez facile et les ganglions situés sur la lymphe permettent une réponse rapide.

A\ Les ganglions lymphatiques. 



Ce sont des amas de cellules placés tous le long de la circulation lymphatique. Ces amas permettent l’exclusion des agents pathogènes. Les macrophages reconnaissent les Ag, les phagocytent puis les présentent. Ils permettent le développement de la réponse immunitaire et servent aussi à la filtration. La structure : quand ils ne sont pas activés, leur diamètre est compris entre 10 et 15mm.Les ganglions sont entourés d’une capsule fibreuse et composés de cellules spécifiques. On parle de ganglions encapsulés. Vaisseaux lymphatiques afférents Zone externe Centre germinatifs de Lb en prolifération Zone intermédiaire Zone centrale Capsule fibreuse Vaisseau lymphatique efférent. 9

  

La zone externe contient les lb et sert de centre germinatif pour les Lb qui se différencient en se multipliant. La zone intermédiaire contient principalement des CPAg et des Lt. La zone centrale, elle, contient un peu de tout.

B\ La rate. La rate est un organe lymphoïde placé sur la circulation sanguine qui permet la filtration des Ag venant du sang. C’est un organe très vascularisé où le sang arrive par l’artère splénique. La rate peut renvoyer les cellules différenciées dans la circulation sanguine.

Pulpe rouge Artériole Pulpe blanche

Zone T (contient les Lt) Artériole Zone B (contient les Lb non stimulés). La pulpe rouge est le site de destruction des vieilles hématies mais aussi le lieu de stockage des jeunes hématies. On trouve des follicules primaires et des amas de Lb stimulés (centres germinatifs) avec autour, des macrophages. La rate est un organe qui est aussi encapsulé. Remarque : un Lb ou un Lt ne reste pas plus de 30 minutes dans le sang.

C\ Les formations lymphoïdes associées aux muqueuses. 1\ Les amygdales. On les trouve principalement au niveau du pharynx et elles prennent pour cible les Ag venant de la respiration ou des aliments. L’être humain possède six amygdales différentes. - Deux amygdales palatines situées au niveau du palais. - Deux amygdales tubaires situées à la sortie de la trompe d’eustache. - Une amygdale linguale (à la base de la langue). - Une amygdale pharyngée (derrière le pharynx). Ces amygdales sont des amas de tissus lymphoïdes avec des centres germinatifs et des Lt qui se baladent. Les amygdales sont des ébauches de ganglions.

2\ Les plaques de Peyer. On les trouve au niveau de l’intestin grêle. Ces plaques sont beaucoup plus indifférenciée qu’une amygdale. Cellule M Villosités intestinales Plaque de Peyer Ganglion mésentérique Sang Canal thoracique 10

On trouve ces plaques du duodénum à l’iléon. Leur nombre est compris entre 2 et 300 mais on en trouve en général près de 300. Les cellules M sont des cellules très fines qui permettent à l’Ag de passer mais sans le modifier. Les Lb synthétisés ici produisent des IgA qui peuvent sortir dans la lumière pour attaquer l’Ag une fois qu’ils sont passés dans le sang et revenus au niveau de l’intestin.

III\ La circulation des Lb et des Lt. Le canal thoracique draine de 2 à 5 millions de lymphocytes en 24 heures. En une journée, 1 à 2% des lymphocytes passent dans le sang. Les cytokinines peuvent accélérer l’arrivée des lymphocytes dans un endroit. Quand un Ag arrive, il y a accumulation de Lt/Lb dans les ganglions les plus proches. Le nombre de lymphocytes entrant va alors augmenter alors que le nombre de lymphocytes sortant va diminuer : on va avoir une hypertrophie de ces ganglions. Les Lb formés dans l’intestin reviennent vers leur muqueuse d’origine : c’est le phénomène de « homing ».

Chapitre 3 :

LES ANTIGENES. Un antigène est un élément étranger à un organisme qui entraîne chez celui-ci, une réaction immunitaire. Il existe deux grandes familles d’Ag : - Les xéno-antigènes : ce sont des Ag dont l'espèce est différente de celle de l’organisme attaqué. - Les allo-antigènes : ce sont des Ag qui font parti d’une même espèce (cas des greffes).

I\ La notion d’épitope. Définition : c’est la partie d’un Ag qui est reconnue par un Ac. Elle est souvent petite (entre 12 et 18 AA). Certains épitopes sont plus reconnus que d’autres : on parle alors d’épitopes immunodominants (en général, ce sont les parties protéiques qui sont à l’extérieur). Notion de polyclonalité : on parle de sérum polyclonal quand ce sérum est composé de plusieurs Ac reconnaissant des épitopes différents mais portés par la même cellule.

Les différents types d’épitopes : Les épitopes séquentiels : c’est la partie de l’Ag en structure linéaire (12 à 18 AA qui se suivent). Les épitopes conformationnels : ces épitopes sont composés de parties qui se suivent en 3D. Les petits peptides. Ils sont aussi appelés épitopes T. Ils sont séquentiels. Les sucres (pour les Lb). Ils sont toujours séquentiels et généralement composés de 5 ou 6 oses répétés plusieurs fois sur le même sucre.

II\ Les réactions croisées. Protéine A

Ac anti A

Protéine B

Ac anti B

L’Ac reconnaît une protéine contre laquelle il n’a pas été formé. Si la protéine A porte les épitopes a, b, c, d, e, f et g, les anticorps correspondant seront anti-a, anti-b, anti-c, ..., anti-g. Si la protéine B porte au moins, un même épitope que la A, il pourra y avoir réaction croisée. Cette réaction est aussi possible si l’épitope ne diffère que d’un AA. La partie de l’Ac qui reconnaît l’épitope s’appelle le paratope.

III\ Affinité et spécificité. A\ Affinité. Ag + Ac  (K1)  (K-1) AgAc K1 est la constante d’association alors que K-1 est la constante de dissociation. K (constante d’affinité)= K1/K-1. 10^4 < K < 10^11. Quand K a une affinité de 10^4, celle est faible alors qu’une affinité de 10^11 est forte. L’affinité est la somme des forces d’attraction et de répulsion qui s’établissent entre le paratope et l’épitope. Remarque : la variation d’un AA peut fortement diminuer K.

B\ Spécificité. La spécificité d’un Ac est la capacité de celui-ci à reconnaître un Ag (spécificité de l’Ag). L’avidité (d’un Ac pour un Ag) : dans certains cas (pour certaine Ig), on peut avoir une association de cinq Ac (Ac pentamérique : les IgM). Ce type d’association permet une meilleure fixation de l’Ag en ayant toutefois un K moyen.

IV\ Immunogénicité et antigénicité.  

Une molécule est antigénique si elle se fixe sur un paratope. Une molécule est immunogénique quand elle déclenche/provoque une réaction immunitaire.

Un haptène : c’est une petite molécule, de faible poids moléculaire (évidemment) qui n’est généralement pas de notre organisme mais qui est trop petite pour pouvoir déclencher une réaction immunitaire. Un haptène est donc antigénique mais pas immunogénique. Les haptènes peuvent être des sels de métaux lourds (Ni, Cr …), des substances végétales, des produits chimiques de synthèse (pesticides). On se sert d’eux (in-vitro) pour fabriquer des Ac aux pesticides. Ovalbumine avec les épitopes a,b,c,d,e,f,g,h

Injection dans un lapin Récupération du sang de lapin avec des Ac anti-a,anti-b,…,anti-h et un Ac anti DNP

Hap /DNP

On teste ensuite les réactions entre ce nouveau sérum d’anticorps et d’autres Ag. Anticorps + Complexe AgAc Ova-DNP Ova-NIP BSA-DNP BSA-NIP

++ ++ + -

Dans le cas de la réaction entre l’Ac anti-DNP et la BSA-DNP, seul l’Ac anti-DNP réagit

Classement croissant des facteurs contrôlant l’immunogénicité : La taille doit être suffisante. L’Ag doit avoir la structure la plus étrange possible La présence d’une structure tridimensionnelle La voie d’administration : * quand l’administration est intradermique, il y a une réponse des Lt ; * pour une administration sous-cutanée, on a une réponse des Ac ; * dans le cas d’une administration orale ou nasale on a aussi une réponse par des Ac et en particulier par les IgA ; * par intraveineuse et avec de gros Ag, on aura une réponse forte par des Ac et des macrophages alors que dans le cas de petits Ag solubles, on aura une réponse faible mais efficace.

Le système de l’adjuvant (mélange de substances) : cet adjuvant permet d’augmenter l’immunogénicité de l’Ag. On a deux manières d’action différentes. Il y a création d’une réponse immunitaire de forte importance (réaction inflammatoire) où l’Ag est piégé pour être présenté plus longtemps au système immunitaire : on a alors une augmentation de l’immunogénicité. L’adjuvant de Freund : - incomplet : c’est une émulsion d’huiles, d’eau et d’émulsifiants (savons) qui piège l’Ag. - complet : c’est un complexe d’eau, d’huiles, d’émulsifiants et de morceaux de bactéries tuées (phase 1 et 2).

Chapitre 4 :

LES ANTICORPS.

I\ La bipolarité des Ig. -

Les Ig ont : Une fonction de reconnaissance (parie hypervariable). Une fonction effectrice (destructrice) qui est réalisée grâce une partie commune (conservée) à toutes les Ig.

En réalité, on doit parler de fonctions effectrices. La partie commune : Permet de fixer le complément (série de protéines présentes dans le sérum) qui est activé par les Ac pour lyser les Ag. - Permet le passage de la barrière placentaire pour protéger le fœtus d’agents pathogènes. - Permet de traverser les différents épithéliums. - Permet de fixer l’Ac sur certaines cellules (phagocytaires, tueuses). On a donc une dualité de fonctions qui entraîne une dualité de structures. La réponse polyclonale donne une hétérogénéité à la réponse immunitaire. -

II\ Le modèle topologique des Ig. La structure des Ig a été découverte entre 1959 et 1962. Cette découverte a rapporté un prix Nobel à Porter et à Eldman. Porter a essayé de cliver (avec des enzymes) la molécule (l’Ig) pour en détermine les différentes fonctions. Eldman, lui, a voulu réaliser un déroulage de l’Ig.

A\ Approche biochimique. On réalise une hydrolyse ménagée avec de la papaïne (à partir des Ig d’un lapin). On obtient alors trois fragments I, II et III : - Les fragments I et II sont capables de fixer l’Ag. De plus ces deux fractions se ressemblent beaucoup (identiques ?). Ils sont appelés les fragments Fab. - Le fragment III ne reconnaît pas l’Ag et il cristallise à froid. Il est appelé fragment Fc. Chaque fragment pèse 50Kda. Ils forment deux sites de fixation pour l’Ag et un site effecteur.

B\ Approche chimique. On détruit tous les ponts di-sulfures (S-S), puis on ajoute de l’urée à 8M. La mise en contact avec l’urée va permettre le déroulage des parties en 3D. On obtient alors quatre chaînes : - Deux lourdes (H) de 50Kda 15

Deux légères de 25Kda. Ces chaînes sont retenues par des liaisons non-covalentes mais très fortes. On fait ensuite une chromatographie de partage. On obtient le graphe suivant : -

Quantité de protéines

66%

33%

Elution H L Ce graphe montre que l’on a une molécule symétrique.

C\ Approche immunochimique. Sérum anti-H Sérum anti-L

Fab + ++

Fc ++ -

Tableau présentant les résultats des réactions entre les sérums anti-H et anti-L avec les fragments Fab et Fc.

D\ Modèle topologique des Ig. 150Kda

2 Fab 2 Fc n*H = n*50 ; m*L = m*25 ; H+L = 75Kda = ½ Ig ; Fab = 50Kda = L + H/x = 25 + 50/x = 25+(50/2) = L+ H/2 ; Fc = 2* H/2 = 2 demi-chaînes H. On a donc 2 Fab pour 1 Fc S S S Fd S S S Lieu de coupure par la papaïne Quand on coupe avec de la pepsine, on obtient un fragment de 100Kda : ce sont les deux fragments Fab associés qui vont alors former le fragment Fab’2. Le fragment Fc est coupé en petits bouts qui rendent ce fragment invisible.

III\ Régions constantes et régions hypervariables. On a deux types de chaînes L : les chaînes  et . Par contre, on a plusieurs types de chaînes H. En 1965, Putman a séquencé la chaîne  de souris, puis, celle de l’homme. La chaîne  (comme la ) est composée de 214 AA. La partie COOH terminale est très conservée. En position

191, on a de la valine ou de la leucine. La partie NH2 terminale est, elle, très variable. Hilochnam en a conclu qu’il y avait deux gènes différents (un pour la partie constante et un pour la partie variable). V

C

NH2

COOH Cystéine pour réaliser une liaison S-S. C S–S

S–S

S-S

CH1

CH2

S-S

110 AA C’est un domaine de type Ig.

214 AA



V

CH3

-S-S-S-S-

Domaine de type Ig

Les protéines qui ont ce domaine sont de la grande famille des Ig. Le site de fixation de l’Ag se trouve sur la chaîne L et sur la chaîne H. On distingue trois zones hypervariables où se fait la fixation : ce sont les CDR1, CDR2, CDR3. D’un point de vue spatial, on a deux plans. Le premier plan est composé de trois feuillets  et le deuxième est composé de quatre des feuillets de même type. Ces deux plans sont liés par des liaisons S-S. Les régions variables sont situées en haut des petites boucles. Au niveau de la région charnière, on a beaucoup de proline et de cystéine qui permettent une grande flexibilité pour pouvoir fixer convenablement l’Ag. Les autres AA servent à maintenir la structure en place.

IV\ Les différentes classes et sous-classes d’Ig. -

Les différences sont basées sur les chaînes H. On trouve : Les IgG : IgG1 66%, IgG2 23%, IgG3 7%, IgG4 4%. Les IgM.

Les IgA : IgA1, IgA2, IgA3. Les IgD. Les IgE.

Ces différentes Ig ont des chaînes dont les tailles, les poids, les charges et les compositions sont différents.

A\ Les IgG. Ce sont les IgG les plus importantes (70 à 75% des Ig totales). Elles ont un poids moléculaire de 146Kda. Les IgG3 sont toutefois plus lourde car leur région charnière est plus longue. Ces IgG sont majoritaires dans la réponse secondaire. On note des différences entre les quatre sous-classes. On trouve deux ponts S-S chez G1 et G4, quatre de ces ponts chez les G2 et quinze ponts chez les G3. On trouve trois domaines constants sur la chaîne  (3 CH). Leur localisation est intra et extracellulaire. Elles ont un rôle anti-bactérien.

B\ Les IgM (fig.18). Les IgM représentent 10% des Ig totales. Leur chaîne H pèse 65Kda. Ces chaînes H permettent de s’associer sous forme de pentamères (jusqu’à 970Kda). On les trouve seulement dans les compartiments extra-vasculaires. Elles permettent la destruction d’agents infectieux en majorité dans la réponse primaire. On trouve quatre domaines constants sur la chaîne µ (4 CH). Ces Ig sont très riches en oligosaccharides. Leur association en pentamère est possible grâce à la cystéine et à une chaîne J au centre. Il ne semble pas y avoir de liaison charnière. Remarque : ces IgM ont une avidité pour fixer l’Ag.

C\ Les IgA (fig.17, 3 CH). Elles représentent 15 à 20% des Ig totales. 80% de ces Ig sont monomériques et 20% sont sous forme de dimères (caractéristique spéciale à l’homme). On les trouve au niveau des muqueuses (salive, colostrum, lait, sécrétions trachéobronchiques et génitales) et de l’intestin. Leur poids moléculaire est de 385Kda sous forme de dimère A1 et A2. Ces Ig sont associées à une pièce sécrétoire qui leur permet d’être sécrétée. La chaîne J permet la formation des dimères. Les IgA se fixent sur les cellules épithéliales avec un récepteur qui est intégré par la cellule et qui va servir de pièce sécrétoire. On trouve beaucoup d’IgA1 dans le sérum et les IgA2 dans les sécrétions (seuls les dimères vont être excrétés). Ces IgA ont un rôle de protection des muqueuses.

D\ Les IgD (3 CH). Elles possèdent trois domaines et sont principalement situées sur les membranes. Elles devraient participer à la différenciation des Lb.

E\ Les IgE. On les trouve peu dans le sérum (on en a plus chez les allergiques). Elles sont présentent sur les membranes cellulaires (basophiles). Les basophiles et les mastocystes peuvent fixer IgE puis sécréter des histamines quand les IgE sont activées. Elles ont un rôle antiparasitaire et sont responsables des allergies. On trouve quatre domaines variables et pas de région CH.

V\ La génétique de la diversité. Théorie de la solution clonale. Récepteur aux cytokines

Multiplication Plasmocyte

Différenciation

Variable Constante Chaîne H : ¼ V ; ¾ C Chaîne L : ½ V ; ½ C

Preyer et Bernett donnent l’hypothèse que les deux parties sont synthétisées par deux familles de gènes différentes. Tongawa a eu un prix Nobel en 1982 ou 1983.

A\ Organisation des gènes. Rappel génétique : Exon Intron ADN

transcription

A.A. Protéine

ARN transcrit primaire

m a t u r a ti o n

ARNm traduction

AAAA

Chaîne L : V1

Chaîne H : V1

Chaînes Gène V Segment D Segment J Segment C

H 46-50 27 6 9

L 34 0 5 1

L 26-29 0 4-5 4-5

Le segment C correspond à la partie C. Les segments V, D, J constituent la partie variable. Dans une cellule qui ne produit pas d’Ac, on a une grande distance entre le premier V et le codon C. L’ADN des cellules productrices d’Ac présente une distance beaucoup plus faible. L’ADN des cellules produisant des Ac est différent des autres cellules. Les 95 premiers acides aminés de la partie variable sont codés par le segment V et les autres par le segment J. La partie constante est codée par un fragment C.

1\ La chaîne lourde. Protéine

2\ Réarrangement. Ce phénomène a lieu dans les Lb où l’ADN est modifié : un fragment V s’associe à un fragment J puis à un fragment C grâce à une recombinase (enzyme).

B\ La recombinaison. 1\ La chaîne L. La recombinaison a lieu pendant la fabrication d’un Lb. * ADN (cellule dans la moelle) V1

Action d’une recombinase : réarrangement par mécanisme aléatoire * ADN réarrangé de cellule pré-B V1

Transcription par une transcriptase * ARN transcrit primaire V4

Maturation * ARNm

synthèse de protéine (ribosome) (traduction) * Protéine V4

2\ La chaîne H. Le changement de l’ADN a aussi lieu pendant la fabrication du Lb. * ADN V1

Action d’une recombinase * ADN après la première recombinaison V1

Action d’une recombinase

Partie sortie par une recombinase

* ADN après la seconde recombinaison V1

Transcription * ARN transcrit primaire V1

Maturation * ARNm V4

Traduction * Protéine

Partie variable, 110AA. Partie constante, 330AA. Chez les souris, il existe une faible diversité de chaînes . On note la présence de pseudogènes (exemple : le J4). Pour les chaînes , on a beaucoup plus de différences : on a 350 V, 5 J et 1 C qui permettent 1400 regroupements différents. En réalité, l’ADN est précédé d’un peptide signal : L

Séquence leader



on aura une protéine de la forme : L

Cette séquence leader permet l’entrée dans le RE. L’Ac va ensuite être transporté et deviendra membranaire ou sécrété. Le fragment L se trouve devant chaque fragment V1. Vh :

V : 99 AA ; D : 3 AA ; J : 102 AA.

Pendant la vie fœtale, les fragments V les plus proches de J1 semblent être préférés. Dans les cancers de Lb, 85% des cellules utilisent les 20 V principaux.

C\ La diversité des Ig. 1\ Recombinaison. L

H H La chaîne légère est formée par les segments V et J. La chaîne lourde est synthétisée grâce aux fragments V, D et J. La chaîne  de l’homme présente 150 possibilités, la chaîne  en présente 150 et la chaîne H en présente 36000.

2\ Variabilité et recombinaison. 



On a des coupures non-strictes et avec parfois des erreurs dues à la recombinase : ce sont des erreurs génétiques qui permettent des variations infinies par un, deux ou trois nucléotides. Les ajouts de nucléotides : cet ajout est possible grâce à une enzyme qui peut ajouter un ou plusieurs nucléotides.

3\ Mutations somatiques. Les mutations somatiques ont lieu presque tout le temps. Elle se déroule dans l’ADN qui code pour la partie du CDR (et généralement la troisième). Les mutations somatiques sont des changements d’un ou deux nucléotides. Ces mutations permettent une sélection des Lb qui ont une affinité de plus en plus importante. On observe beaucoup de ces mutations quand on a un passage d’un Lb à un plasmocyte (on parle de maturation d’affinité).

VI\ Les gènes de la région constante des chaines H. Des Ig de types différents peuvent avoir la même partie variable. Une fois que celle-ci est sélectionnée, il peut y avoir des modifications de la partie constante. Un myélome est un cancer des plasmocytes (un lymphome est un cancer des Lb) : on peut avoir une multiplication importante mais toujours avec la même partie variable. Ce grand taux de cet Ac a pu trouver des IgM et des IgG avec la même partie variable. Le mécanisme de changement de chaîne H se fait après la recombinaison mais sans être dépendant. IgM

IgD Ces Ig ont la même partie variable : c’est une commutation de classe («switch »).

A\ La structure des gènes : Chez la souris, on a plusieurs fragments C dans la chaîne H Jn

Cµ

C

C

C

Chez l’homme, on a la chaîne suivante : Jn

Cµ

C

C3

C1

C1

C’

C2 A

C

C4

C

C

On note la présence d’un codon stop entre chaque gènes (allèles). Les gènes C1 et C sont des pseudo-gènes. On compte plus de gènes que d’Ig. Après avoir enlevé les pseudo-gènes, on obtient un gène par sous-classe. Avant chaque gène C, on a une séquence particulière : la séquence «switch » (commutation de classe) : séquence S pour le site de recombinaison.

B\ Epissage différentiel (pour Cµ et C). Dans la transcription, on transcrit Cµ et C. V

Cµ

C

Maturation V

C

IgD

Cµ

IgM

On a donc des Lb qui portent une IgM et à la fois une IgD.

C\ Recombinaison. V

Cµ

C1

Création d’une boucle qui sera coupée ADN C1 V D J

C1

Transcription ARN

C1

VII\ Ig membranaires et Ig sécrétées. BCR Ac

La seule différence est sur la partie C terminale. Les AA terminaux sont hydrophobes et servent à l’ancrage dans la membrane en formant des hélices .

* ADN

* Transcription

Cµ

* Maturation de deux types :

IgA

mIgM sIgM IgE

Cellule souche

VJ (L) VDJ (H)

IgG

1 DJ (H) 2 VDJ (H), 3VJ sIgM IgM

IgD Plasmocyte

VIII\ La dynamique de la réponse avec anticorps. A\ Rappel sur l’activation des Lb. -

Les anticorps ont pour origine les cellules souches de la moelle osseuse. Les cellules pro-B : on assiste à la première recombinaison des chaines lourdes (D-J). Les cellules pré-B : on a la recombinaison qui donne la chaîne VDJ-µ. Les Lb immatures : on a une recombinaison qui donne la chaîne L (, ) (IgM). Les Lb matures : on a des IgM et des IgD. Ces quatre mécanismes se font en absence d’Ag. Ils vont ensuite quitter la moelle osseuse. Lb

Une fois dans le sang, le Lb perd son IgD dont le rôle est inconnu.

Lb mémoires

Plasmocytes Ac

Les plasmocytes ont des RE et des Golgi très important (dans les tissus et les organes lymphoïdes secondaires).

B\ Les réponses I et II. [Ac] Réponse 2 Plateau

croissance

Réponse 1 Décroissance Temps

Mise en contact avec l’Ag (t=0).    

Latence initiale

Phase de décroissance : catabolisme naturel des Ac (naturels) Fixation sur l’Ag Elimination de la circulation sanguine La cinétique est différente entre les différentes réponses. IgG IgE

7 jours    

28 jours 30 jours

42 jours

Les cinétiques sont différentes entre les différentes réponses (la secondaire est beaucoup plus rapide et sans latence. Il y a beaucoup plus d’Ac dans la réponse secondaire que dans la primaire (dix fois plus importante). Pendant la réponse primaire, on a surtout les IgM, pendant la réponse secondaire on a surtout des IgG. Affinité des Ac pour l’Ag. Peu d’Ag Beaucoup d’Ag IgM Pas de maturation d’affinité.

Ag1 Ag2 Dans la réponse primaire, on a des IgM et dans la réponse secondaire on a plutôt des IgG qui permettent d’augmenter l’affinité. Ce changement d’affinité varie en fonction de la

quantité d’Ag. Quand on a peu d’Ag, les Lb sélectionnés sont ceux qui ont la meilleure affinité qui fonctionnent et aussi avec de nombreuses mutations somatiques en réponse secondaire.

Chapitre 5 :

LES TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES.

I\ Les Ac monoclonaux. Lb Lb

Lb qui va mourir

Cellule cancéreuse

Mutation

Formation d’Ac monoclonaux

L’adjuvant de Freund : On récupère ces Lb qui donnent un Ac monoclonal. On va ensuite injecter dans une souris la protéine X d’un myélum. On récupérera ensuite la rate et les ganglions. On va obtenir des Lb dont on va faire fusionner les membranes grâce à du PolyEthylènGlycol. On obtient alors un hybridome à qui l’on va faire subir une dilution limitée. Après cette phase, on récupère les Lb et les cellules hybrides. On les place ensuite dans trois milieux différents : Lb Cellules hybrides

Milieu HGPRT+ et TK+ Mort des cellules

Milieu HGPRT- et TKMort des cellules

Milieu HGPRT+ et TK+ Vie et survie des cellules

Les acides aminés sont utilisés pour les synthèses d’ADN ; on inhibe ces synthèses grâce à l’aminoptérine. On peut avoir des voies alternes de synthèses, comme l’hypoxanthine qui, utilisée par l’enzyme HGPRT, peut donner les bases puriques (A et G). La thymidine, associée à l’enzyme TK (thymidine kinase), permet la synthèse des bases pyrimidiques (C, T et U). Pour réaliser les fusions, on utilisera un myélum HGPRT- ou de nombreuses cellules de cette qualité. Le mélange contient de l’aminoptérine, de l’hypoxanthine et de la thymidine : on appelle ce milieu, un milieu HAT. On place les Ac récupérés dans des puits et après vérification, on a toujours un Ac monoclonal.

II\ La réaction secondaire Ag/Ac. A\ L’immunoprécipitation. 

On a deux types de précipités AgAc : Selon l’aspect qualitatif (présence ou non d’Ag, d’Ac). Si on a suffisamment de précipité, on a la reconnaissance de l’Ag. C’est une réaction rapide (quelques minutes). Il faut toutefois une bonne quantité de sérum. Antigène A Anneau réactionnel Sérum anti-A



Aspect quantitatif : c’est un phénomène de zone. Cet aspect est étudié depuis 1933 par Heidelberg. On étudie les différences entre les concentrations en Ag et en Ac. On fixe l’anti-sérum (quantité fixe) et on fait varier la quantité d’Ag. Ag

Centrifugation

Immunoprécipité

Zone 1 : Excès d’Ac

Zone 2 :

Zone 3 Excès d’Ag

Zone d’équivalence

+ Ag (+) + Ac(-) +Ag (-);+Ac(-) + Ag (-)

+ Ac (+)

Zone 1 : on réalise une augmentation progressive de la concentration en Ag. Zone 2 : c’est une zone de stabilité. Zone 3 : quand il a trop d’Ag, on a une diminution de la quantité d’immunoprécipité. Après l’étude du surnageant, on partage celui-ci en deux : Ag

+ Ag  Si Ag + Ac  + + Ag  + Si Ac + Ac  -

C’est la théorie des réseaux de Marak donnée en 1934. On observe un précipité car il y a la création d’agrégats moléculaires trop gros qui ne sont plus solubles. Chaque Ac peut fixer deux Ag grâce à leurs deux sites de fixation. On a un anti-sérum polyclonal car, si cet anti-sérum est monoclonal, on ne peut pas avoir d’agrégats et alors on ne peut pas avoir de précipité. Agrégats se réalisant dans la phase 2.

Réaction AgAc spécifique de la zone 1.

Réaction AgAc spécifique de la zone 3.

B\ Immunoprécipitation en milieu gélifié. On peut voir la réaction AgAc grâce à des dépôts de ces deux produits. On les place dans des puits et on les laisse se diffuser dans le milieu où ils se diluent. Quand ils se rencontrent, on voit les précipités au niveau de leur lieu de formation (les précipités ont lieu quand les deux produits sont en concentration adéquats : zone d’équivalence). Evidemment, ces arcs apparaissent quand l’Ac reconnaît l’Ag Il existe plusieurs types de diffusion : - Réaction à diffusion simple : un seul des deux éléments diffuse. - Réaction à diffusion double : les deux diffusent. - Technique à diffusion unidimensionnelle. - Technique à diffusion bidimensionnelle. La technique de Ouchterlöny est une étude des diffusions doubles et bidimensionnelles. C’est une observation d’un précipité. La diffusion est réalisée sur un gel d’Agarose (polysaccharides) extrait de l’Agar (algue du pacifique Agar-agar). Le gel mesure 1,5mm d’épaisseur. Celui-ci est percé de puits de 4 ou 5mm de diamètre. On obtient alors un précipité quand l’Ag et l’Ac se rencontrent et se reconnaissent en concentration voulue. Cette méthode est utilisée pour les études qualitatives. Ac a

Ac b

Ac c Ag 1

Ag (mélange)

Ag 2

Ac L’Ac est un Ac contre Ag 1 et Ag 2 : ces deux Ag sont les mêmes ou portent le même épitope

* L’identité partielle : Ag 1 (a,b)

Ag 2 (b,c) A

A et b

C\ Immunocytolyse. La lyse est réalisée par les molécules du complément (protéines du sérum ; de C1 à C9). Leur fixation sur l’Ac est réalisée une fois que cet Ac s’est fixé sur l’Ag. Le complément se fixe sur la partie Fc des IgG seulement : c’est la voie classique d’activation du complément. La lyse réalisée est dite «lyse complément dépendante de l’Ag ». La voie alterne est indépendante des Ac. Le complément est activé par des morceaux de l’Ag et entraîne sa lyse. 30

La technique de fixation du complément (de déviation du complément) est peu utilisée mais quand même… Cette méthode sert à détecter un Ac contre un Ag précis dans un sérum. On l’utilise dans le cas des maladies hémolytiques des bébés (problème Rh+, Rh-). Quand le sang du bébé passe dans le sang de la mère (si celle-ci n’a pas le même rhésus ; dans ce cas, elle est Rh-) qui va développer des Ac anti-Rh+. Ces Ac vont passer le placenta et aller détruire les hématies du bébé au lieu de protéger ce dernier. Cette méthode est alors utilisée pour détecter les Ac indésirables. Le complément va lyser le globule rouge : c’est une hémolyse. Une hémolyse est une lyse de globule rouge avec libération d’hémoglobine. Cette technique va permettre de détecter des Ac anti Rh+ chez une mère qui a déjà eu un enfant. L’expérience : Pour enlever le complément naturel, on chauffe 30 minutes à 56°C, ce qui Ag1 (Rh+) + Ac (anti-sérum) permet de détruire tout le complément naturel mais pas l’Ac. Premier cas : La première phase (phase de fixation) : Ag + Ac + Complément  Ag Ac Comp La seconde phase (phase de révélation) :

Ag Ac Comp

 Rien

Deuxième cas : Première phase : Ag1 + Ac + Complément  Ag1 + complément. Seconde phase : Ac-hématie + complément  hémoglobine libérée.  Dans le premier cas, les Ac cherchés sont présents.  Dans le second cas, ces Ac sont absents. Le complément est non-spécifique. La phase de fixation est invisible et demande donc une phase de révélation.

D\ Immuno-agglutination. Cette technique rejoint la méthode de précipitation et de cytolyse : c’est une agglutination de particules qui est le résultat d’une réaction d’Ac dirigés contre des Ag portés par cette particule. Le résultat est visible à l’œil nu.

Ces agglutinats permettent de visualiser la réaction AgAc. Ces particules sont souvent situées sur les hématies.

Cette réaction est réalisée par la formation d’un réseau.

Pour réaliser celui-ci, il faut diminuer les forces électrostatiques de répulsion entre cellules. Si les cellules sont dans un milieu salin à pH=7 (électriquement neutre), les cations se positionnent autour de la cellule et donne le potentiel  qui sera ici un potentiel de cations. On peut changer le potentiel salin : s’il y a moins de cations, les cellules se rapprochent. On peut changer le pH, la viscosité du milieu. Pour avoir une bonne agglutination, il faut diminuer  pour augmenter la force ionique du milieu. Pour cela, on ajoute du NaCl et on utilise des tampons avec une grande force ionique. Les différents types d’agglutinations : les particules utilisées sont souvent des cellules avec des Ag appartenant naturellement à leur membrane (par exemple, les globules rouges avec comme Ag les marqueurs du groupe sanguin). Les cellules utilisées sont souvent des hématies et des bactéries. C’est une recherche à l’envers : on connaît l’Ag et on cherche l’Ac.

1\ L’agglutination directe (l’Ag est naturellement porté par la particule). On se place dans un milieu salin (NaCl à 9 pour mille). Les Ac mesurés sont des IgM car celles-ci sont pentamériques et permettent donc de plus gros agglutinats. Ces IgM sont chargées négativement et vont attirer les cellules positivement chargées. On se sert de l’agglutination directe pour la recherche des groupes sanguins. Globules rouges

Groupe O Sucre H

Groupe A (A//O ; A//A) Groupe B (B//O ; B//B)

Groupe AB (A//B)

2\ Agglutination artificielle (ou indirect). On a des IgG (qui ont deux sites de fixation, donc une moins grande capacité pour la formation d’un réseau) et des de répulsion importante entre cellules. On va donc utiliser des artifices pour diminuer les forces de répulsion et donc, augmenter le réseau. On utilise de la papaïne pour couper de nombreuses protéines situées à la surface des membranes de globules rouges : on a une diminution des forces de répulsion. On ajoute des macromolécules qui par leur taille, vont encore diminuer ces forces de répulsion. On ajoutera ensuite, dans le sérum, des Ig anti-IgG afin d’augmenter la taille du réseau. Le test de Coombs sert à rechercher des IgG, obtenues par allo ou auto-immunisation, dans un sérum. On met des hématies dans du sérum physiologique et on essai de détecter les IgG (on se met en conditions salines pour ne pas encore avoir la formation du réseau). On ajoute alors les anti-IgG et on aura alors un possible réseau.

3\ Immuno-agglutination directe.

+ Ac 1 (IgG)

+ Ac 2 (sérum anti-IgG : test de Coombs).

Dans le cas de la réaction globules rouges contre Ac, la première phase de réaction est déjà réalisée in vivo. On récupère les globules puis on les lave de leurs parasites. Grâce aux résultats, on peut donner un diagnostic médical.

4\ Immuno-agglutination indirecte. C’est une recherche par des Ig de molécules non naturelles sur un globule rouge (par exemple, le latex se fixe très bien). On se sert de cette méthode pour rechercher des IgG libres. Rh+ (Ag) +

sérum maternel Complexe AgAc.

L’étape 1 est réalisée in vitro : elle est indirecte.

Lavage + sérum anti IgG

Résultat +++

Résultat -

5\ L’agglutination passive. La particule ne possède pas naturellement l’Ag : on lui fait subir une greffe chimique (remarque : cette méthode est utile pour tester un Ag soluble). L’immuno-agglutination est beaucoup plus sensible que l’immunoprécipitation. La particule n’est pas directement impliquée dans l’agglutination. Avec cette technique, on dose les facteurs rhumatoïdiques (anti IgM ou G) qui sont dans le liquide synovial des gens atteints d’arthrite.

III\ La réaction primaire AgAc. A\ L’immuno-fluorescence. On a une visualisation de la réponse grâce à un fluorochrome. Les fluorochromes sont des substances qui, quand elles sont soumises à un rayon lumineux, deviennent instables (passent à un état excité) et qui, pour revenir à l’état fondamental, émettent une longueur d’onde différente de la longueur d’onde absorbée ( émise >  absorbée).  L’isothiocyanate de fluoriscine (ou FITC) absorbe à =490nm et émet à =517nm (vert).  L’isothiocyanate de rhodamine absorbe à =550nm et émet à =580nm (rouge, orangé).  La phycoérythrine est un autre fluorochrome.  La lecture est réalisée à un microscope à fluorescence. 1\ Immuno-fluorescence directe. Le fluorochrome est fixé à l’Ac qui reconnaît l’Ag que l’on veut trouver. Ag différents coupe de cellules ou de tissus

+ Ac

Lavage Passage dans un microscope à fluorescence.

On bloque tous les sites où l’Ac peut se fixer de manière non spécifique (on met beaucoup de lait écrémé, de BSA, de protéines). On ajoute ensuite un Ac non spécifique de sérum humain ou de veau fœtal mais en enlevant le complément. 2\ Immuno-fluorescence indirecte. 1ère réaction : avec un Ac1 spécifique à l’Ag mais non marqué. Ac anti Ac 1 Lavage

Observation en microscopie à fluorescence Lavage On peut avoir un système d’amplification (*2 ou *3). C’est un avantage scientifique car l’immuno-fluorescence peut être réalisée sur des cellules vivantes.

B\ Cytométrie de flux. La cytométrie de flux est une méthode fiable de comptage de cellules vivantes. Emission proportionnelle à la granulosité de la cellule Lumière incidente

Déviation proportionnelle à la taille de la cellule. Cette méthode de cytométrie de flux est utilisée en immunohistochimie pour l’étude des tissus et en immunocytochimie pour l’étude des cellules. Dot Plot : nuage ou ensemble de points

Taille [FSC]

[SSC] Structure Selon le type de fluorochrome, on utilise différents types de laser et après le comptage on obtient le nombre de cellules fluorescentes. Le problème est que cette technique ne fonction pas sur les tissus. On peut faire des doubles ou des triples marquages.

Globules rouges inutiles.

Lb  CD 20 ; Lb  récepteurs aux cytokines. CD20

CD20

Lb Plasmocyte 35

Récepteur cytokines

Rouge Lt activés

Plasmocytes

Tout le reste

Lb non activés

Vert Grâce à cette étude, on connaît le nombre de cellules activées. Le cycle cellulaire de l’ADN. G2

Mitose

S G1

Pour étudier l’ADN, on utilise des fluorochromes comme l’iodure de propidium (uniquement sur des cellules mortes), le bromure d’éthidium (très toxique) et le hoescht 33342. Ce sont tous les trois des fluorochromes. Nombre de cellules

Fluorescence G1

Cette technique peut-être utilisée sur des êtres vivants.

C\ Technique immuno-enzymatique. Réaction principale : Substrat (lame)  Substrat coloré grâce à une réaction enzymatique.

Lavage

+ Substrat +

Coloration

Rien

La technique du test Elisa. Cette technique est composée de deux phases : une phase solide qui va réaliser la réaction enzymatique et une phase liquide qui ne possède pas de quoi réaliser cette réaction enzymatique. 1\ Elisa non compétitif direct.

antigènes

Cette phase va être lavée, puis saturée en bouchant les espaces se trouvant entre les Ag grâce à des protéines comme l’albumine, les protéines du lait, par des Ac. On lavera une nouvelle fois, on rajoutera ensuite des anticorps portant une enzyme. Cette solution va être lavée puis on lui ajoutera le substrat qui donnera une coloration jaune si les Ac portant l’enzyme sont fixés sur les Ag. Dans cette technique, on ne maîtrise pas la quantité d’Ag fixé.

2\ Elisa non compétitif indirect (Elisa sandwich).

Lavage

On rajoutera alors des Ac spécifiques à l’Ag testé qui seront associés à une enzyme. On lavera le tout, puis on ajoutera le substrat qui permettra la coloration s’il est en présence de l’Ac fixé à l’enzyme. Pour quantifier le tout, on effectuera une mesure de D.O.

3\ Elisa compétitive (méthode plus sensible que les compétitives).

D.O. x

Ag x

[Ag] non marqué

Cette réaction a lieu entre un Ag en milieu solide et une phase liquide contenant un double Ac (anti-sérum) et l’Ag à doser. On mélange les deux phases, on ajoute ensuite un nouvel Ac portant une enzyme. On lave toute la solution puis on rajoutera le substrat permettant de révéler la réaction. On a donc deux types de résultats :  Pas de coloration, donc pas de réaction enzymatique : les Ac n'ont reconnu que les Ag provenant de la phase liquide.  Il y a une coloration, donc une réaction enzymatique : les Ac ont reconnu les Ag liquides et ceux de la phase solide.

Les aspects techniques :  



La fixation des Ag est réalisée sur une plaque spécialement traitée pour fixer les protéines. Cette fixation est en général réalisée par un tampon basique. Les étapes de lavage sont effectuées avec des tampons contenant des détergeants doux qui permettent de retirer tout ce qui est fixé de manière non-spécifique. Pendant le lavage, on ajoute des protéines de saturation. Le conjugué : c’est un complexe entre un Ac ou un Ag et une enzyme. On utilise la péroxydase du radis (raifort)  H2O2  H2O + ½ O2. La phosphatase alcaline qui enlève les protéines si elle est en milieu basique. Ces enzymes sont fixées de manière covalente grâce au glutaraldéhyde qui forme un pont entre l’enzyme et l’Ac ou l’Ag. Quand on doit fixer des sucres, on utilise le périodate de sodium.