Vol. 3 Núm. 4 abr-jun 2011

REVISTA MEXICANA DE MEDICINA DE LA

Asociaci贸n Mexicana de Medicina de la Reproducci贸n, A.C.

Volumen 3, n煤mero 4, abril-junio 2011

REVISTA MEXICANA DE MEDICINA DE LA

Mesa Directiva 2010-2011 Dr. Ranferi Gaona Arreola Presidente

Dr. Álvaro Santibáñez Morales Tesorero

Dr. Carlos Gerardo Salazar López Ortiz Vicepresidente

Dr. Raymundo Preciado Ruiz Protesorero

Dr. Alfonso Orta García Secretario

Dr. Gerardo Andrés Alba Jasso Dr. Juan Carlos Alcivia García Dra. Gabriela García Jiménez Dra. Laura Hernández Gurrola Dr. Marcelino Hernández Valencia Vocales

Dr. Víctor Saúl Vital Reyes Prosecretario

Comité Editorial para la Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción Editor Dr. Gerardo Velázquez Cornejo

2008-2011

Co-Editores Dr. Juan Carlos Hinojosa Cruz Dr. Carlos G. Salazar López Ortiz Dr. Manuel Mario Matute González Dra. Imelda Hernández Marín Dr. Guillermo Santibáñez Moreno

2008-2011 2008-2011 2008-2011 2008-2011 2010-2011

Comité Editorial 2008-2011 Distrito Federal Dra. Judith Ablanedo Aguirre Dr. Manuel Álvarez Navarro Dr. Luis Ignacio Aviña Cueto Dr. Juan Carlos Barros Delgadillo Dr. Gerardo Barroso Villa MVZ Esperanza Carballo Mondragón Dr. Silvio Cuneo Pareto Dr. Julio Francisco de la Jara Díaz Dr. Ranferi Gaona Arreola Dr. Fernando Gaviño Gaviño Dra. Imelda Hernández Marín Dr. Marcelino Hernández Valencia Dr. Juan Carlos Hinojosa Cruz Dr. Alberto Kably Ambe Dra. Olivia Marín Romero Dra. Ma. Teresa Márquez Cristino Dr. Manuel Mario Matute González Dr. Héctor Mondragón Alcocer Dr. Carlos Morán Villota M. en C. Paloma Neri Vidaurri

Dr. Carlos G. Salazar López Ortiz Dr. Héctor Rogelio Santana García Dr. Álvaro Santibáñez Morales Dr. Claudio Serviere Zaragoza Dra. Rosario Tapia Serrano Dr. Sergio Téllez Velasco Dr. René Toro Calzada Biol. Gerardo Villegas Moreno Dr. Víctor Saúl Vital Reyes Otras sedes Dr. Álvaro Sevilla y Ruiz Dr. Ernesto Gallardo Lozano Dr. Efraín Pérez Peña Dr. Carlos Félix Arce Dr. Rafael Alfonso Sánchez Usabiaga Dr. Eduardo del Río Dr. Adán Olivero Ceballos Dr. Alfonso Batiza Reséndiz Dr. Antonio Gutiérrez Gutiérrez Dr. Luis Arturo Ruvalcaba Castellón

Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción Volumen 3, núm. 4, abril-junio, 2011

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EDITORIAL 57,481,307 mujeres mexicanas…

Gerardo Velázquez Cornejo ARTÍCULOS DE REVISIÓN Vitrificación de ovocitos y embriones Martha Isolina García Amador, Rocío Martínez Armas, Luis Arturo Ruvalcaba Castellón El papel de la proteómica en la definición del secretoma embrionario humano MG Katz Jaffe, S McReynolds, DK Gardner, WB Schoolcraft Fragmentación del ADN espermático: mecanismos de origen, repercusión en los resultados reproductivos y análisis Denny Sakkas, Juan G Álvarez ARTÍCULOS ORIGINALES Características que optimizan la selección de donantes de óvulos Laura Fabiola Guadarrama García, Heidi Trejo Castañeda, Zarela Lizbeth Chinolla Arellano, Jeimy Pedraza Cepeda, Felipe Caldiño Soto, Sandra Cubillos García, Silvio Cuneo Pareto El valor de la suplementación de la fase lútea con valerianato de estradiol y progesterona en un programa de reproducción asistida Israel Obed Carmona Ruiz, Roberto Santos Haliscak, Pedro Galache Vega, Samuel Hernández Ayup, Víctor Alfonso Batiza Reséndiz, Pablo Díaz Spíndola, María Lidia Arenas Montezco Incidencia de embarazo múltiple en el Hospital Ángeles Lomas y su relación con las técnicas de reproducción asistida Alberto Kably Ambe, Jorge Alberto Campos Cañas, Heidy Ortiz Reyes, Jaime Ignacio Cevallos Bustillos, Diana Elena Monzalbo Núñez Determinantes en el resultado de inseminación intrauterina: análisis de 1,040 ciclos consecutivos Julio González Cofrades, Carlos Linder Efter, Gustavo Aguirre Ramos, Pablo Vilchis Nava, José Smeke Befeler, Carlos Navarro Martínez, José Antonio Rodríguez Martínez

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EDITORIAL 57,481,307 Mexican women Gerardo Velázquez Cornejo REVIEW ARTICLES Vitrification of oocytes and embryos Martha Isolina García Amador, Rocío Martínez Armas, Luis Arturo Ruvalcaba Castellón The role of proteomics in defining the human embryonic secretome MG Katz Jaffe, S McReynolds, DK Gardner, WB Schoolcraft Sperm DNA fragmentation: mechanisms of origin impact on reproductive outcome, and analysis Denny Sakkas, Juan G Álvarez ORIGINAL ARTICLES Characteristics optimizing the selection of oocytes donors Laura Fabiola Guadarrama García, Heidi Trejo Castañeda, Zarela Lizbeth Chinolla Arellano, Jeimy Pedraza Cepeda, Felipe Caldiño Soto, Sandra Cubillos García, Silvio Cuneo Pareto The value of luteal phase supplementation with estradiol valerianate and progesterone in an assisted reproduction program Israel Obed Carmona Ruiz, Roberto Santos Haliscak, Pedro Galache Vega, Samuel Hernández Ayup, Víctor Alfonso Batiza Reséndiz, Pablo Díaz Spíndola, María Lidia Arenas Montezco Incidence of multiple pregnancies at Angeles Lomas Hospital and its relation to assisted reproduction techniques Alberto Kably Ambe, Jorge Alberto Campos Cañas, Heidy Ortiz Reyes, Jaime Ignacio Cevallos Bustillos, Diana Elena Monzalbo Núñez Determinants on the results of intrauterine insemination: analysis of 1,040 consecutive cycles Julio González Cofrades, Carlos Linder Efter, Gustavo Aguirre Ramos, Pablo Vilchis Nava, José Smeke Befeler, Carlos Navarro Martínez, José Antonio Rodríguez Martínez

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Índice de materias del volumen 3

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Índice onomástico del volumen 3

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Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción es el Órgano Oficial de la Asociación Mexicana de Medicina de la Reproducción, A.C. Los artículos y fotografías son responsabilidad exclusiva de los autores. La reproducción parcial o total de este número sólo podrá hacerse previa autorización del editor en jefe. Toda correspondencia relacionada con el contenido y suscripciones deberá dirigirse al editor en jefe: WTC Montecito 38, piso 15, oficina 29, colonia Nápoles, CP 03810, México, DF. Tel.: 9000-2863. E-mail: ammr@wtcmexico.com.mx Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción: Certificado de Licitud de Título en trámite. Certificado de Licitud de Contenido en trámite. Registro de Reserva del Derecho de Autor número 04-2008-063018255800-102. Autorización como Publicación Periódica por Sepomex en trámite. Publicación realizada, comercializada y distribuida por EDICIÓN Y FARMACIA, SA de CV, José Martí 55, colonia Escandón, CP 11800, México, DF. Tel.: 5678-2811, fax: 5678-4947. Correo electrónico: articulos@nietoeditores.com.mx Impresa por Computipo Scanner Editorial S.A. Azafrán 313 y 315, Colonia Granjas México, Delegación Iztacalco, CP. 08400. México, DF.

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Editorial

57,481,307 mujeres mexicanas…

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on motivo de la reciente presentación de los resultados definitivos del Censo de Población y Vivienda 2010, en este editorial se analizan algunos de sus resultados, particularmente los relacionados con la población femenina.

El Instituto Nacional de Estadística y Geografía (INEGI) es el organismo autónomo responsable de coordinar y dirigir el Sistema Nacional de Información Estadística y Geográfica y de producir y difundir todos sus análisis. El Censo de Población y Vivienda 2010 se realizó del 31 de mayo al 25 de junio.

Los resultados preliminares del censo se dieron a conocer el 25 de noviembre de 2010 y los definitivos, el 3 de marzo de 2011. Al 12 de junio de 2010 el censo contabilizó 112,336,538 personas residentes en el territorio mexicano, con una tasa de crecimiento anual de 1.4% para el periodo 2000 a 2010. Desde 1895, año en que iniciaron los censos, la población ha mostrado un crecimiento sostenido, excepto entre 1910 y 1921, periodo en el que la tasa de crecimiento anual fue de 0.5%. La tasa de crecimiento anual alcanzó un máximo de 3.4% en el decenio de 1960 y, desde entonces, ha ido disminuyendo hasta la tasa actual de 1.4%.

Del total de residentes en México en 2010, se contabilizaron 54,855,231 hombres (48.8%) y 57,481,307 mujeres (51.2%), lo que significa que hay 95 hombres por cada 100 mujeres.

Llama la atención que nacen más de 103 hombres por cada 100 mujeres, pero en los primeros años la mortalidad de los niños es mayor que la de las niñas.

Entre los 15 y 19 años de edad el número de hombres y mujeres es similar; sin embargo, a partir de los 20 años se incrementa el número de mujeres debido, principalmente, a la mayor migración internacional masculina y www.nietoeditores.com.mx

a la mortalidad más elevada de los hombres. Es notoria la diferencia entre los sexos después de la edad de 70 años: por cada 100 mujeres en ese grupo de edad hay 84 hombres, situación que se da por la mayor supervivencia de las mujeres.

De los datos proporcionados por el censo, es posible estimar la población de mujeres en edad reproductiva (15 a 50 años de edad), aunque haya mujeres por debajo y arriba de esas edades que también se reproducen. De las 57,481,307 mujeres, 31,420,895 (54.6%) están en edad reproductiva (Figura 1). Si esa información se extrapola a algunos problemas reproductivos que afectan a las mujeres, podrían hacerse algunas estimaciones muy interesantes. Por ejemplo, si la prevalencia de endometriosis se calcula en 10% en mujeres en edad reproductiva, significa que podría haber 3,142,089 mujeres afectadas por este padecimiento. Si se calcula que una de cada cuatro mujeres después de la edad de 30 años tiene miomas uterinos, ello implica que –al haber 16,253,635 mujeres entre 30 y 50 años de edad (28.2% del total de mujeres)– aproximadamente 4,063,408 mexicanas podrían estar afectadas por miomas uterinos, 6,000,000

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Figura 1. Mujeres en edad reproductiva.

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esto sin considerar que las mujeres menores y mayores de esos límites de edad también pueden tener miomas.

Por último, si consideramos que del total de mujeres mexicanas 39.5% están casadas y 14.1% viven en unión libre, significa que 53.6% de ellas se encuentran en pareja. En ese mismo orden de ideas, de las 31,420,895 mujeres que se encuentran en edad reproductiva, alrededor de 16,841,599 están formando una pareja. Si se estima que una de cada seis parejas es infértil, entonces en nuestro país hay aproximadamente 2,806,933 parejas infértiles.

En cuanto a la estructura de la población (Figura 2), puede observarse que la pirámide de población del Censo 2010 se ensancha en el centro y se reduce en la base: la proporción de niños ha disminuido y la de adultos se ha incrementado. En el año 2010 la población menor de 15 años representó 29.3% del total, mientras que la que se encontraba en edad laboral (15 a 64 años) constituyó 64.4%, y la población en edad avanzada representaba 6.3% de los habitantes del país. En contraste, en el año 2000 la participación de estos grandes grupos de edad era de 34.1, 60.9 y 5%, respectivamente. Esta transformación en la estructura por edad es muy importante, porque muestra que el país transita por una etapa en la que el volumen de la población en edades laborales alcanza su mayor peso relativo en relación con la población en edades dependientes.

La población mexicana sigue siendo predominantemente joven; sin embargo, la disminución de la mortalidad y el descenso de la fecundidad han propiciado su envejecimiento paulatino. Ello explica que la edad

mediana, es decir, la que divide a la población en dos partes iguales, en el año 2010 haya sido de 26 años, cuando en 2000 este indicador era de 22 y en 1990, de 19 años.

Algunos de los indicadores que se generan con la información del Censo 2010 muestran las transformaciones que acompañan al proceso de transición demográfica de la sociedad mexicana. Éste es el caso del promedio de hijos nacidos vivos, indicador de la fecundidad, que muestra un descenso hasta llegar ahora a 1.7 hijos para el total de mujeres de 15 a 49 años, cifra que en 1990 y 2000 fue de 2.4 y 2.0, respectivamente. La disminución es perceptible en cada grupo de edad y es más acentuada entre las mujeres que se encuentran en la etapa final de su periodo reproductivo, es decir, las que tienen entre 45 y 49 años. Las mujeres de este grupo de edad tenían 2.2 hijos menos en 2010 de los que tenían en 1990; es decir, hubo una reducción de 40% en la fecundidad medida por el número promedio de hijos nacidos vivos.

La educación es un concepto clave en relación con la fecundidad de la población femenina, pues les permite tener mayor autonomía en la toma de decisiones concernientes a su comportamiento reproductivo. Las diferencias de la fecundidad según el nivel de escolaridad son claras.

Así, las mujeres más escolarizadas tienen menos hijos que las de menor escolaridad; es decir, mientras las mujeres sin estudios tienen 3.5 hijos, las de instrucción media superior tan sólo tienen 1.1, lo que significa una diferencia de más de dos hijos entre estos dos grupos.

En todos los grupos de edad de los municipios de menor índice de desarrollo humano la fecundidad es sistemáticamente mayor y la diferencia crece, conforme

Figura 2. Estructura de la población en 1990, 2000 y 2010.

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aumenta la edad de las mujeres, hasta llegar a 3.1 hijos entre las mujeres del grupo de 45 a 49 años (5.9 contra 2.8). Es decir, la fecundidad en los municipios con menores niveles de condiciones de vida es más del doble de la que se observa en los municipios de mayor nivel de índice de desarrollo humano.

Las tasas específicas de fecundidad por grupo de edad y la tasa global de fecundidad para los años 1999 (2.9) y 2009 (2.4) permiten hacer las comparaciones correspondientes (Figura 3). Los datos confirman la tendencia a la baja, ya observada en años anteriores. En las edades de 20 a 34 años la disminución es de alrededor de 18%.

Se destacan los significativos descensos relativos en las mujeres mayores de 39 años, lo que refleja la limitación definitiva de la fecundidad. La fecundidad de las mujeres de 15 a 19 años muestra una de las menores disminuciones, que representa 11.7% en este periodo.

En cuanto a la educación, la información censal muestra que 94.7% de la población de 6 a 14 años asiste a la escuela. Hace 20 años 85.8% de los niños en estas edades asistían a centros educativos, lo que implica 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 15

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Figura 3. Tasa específica por grupo de edad en 1999 y 2009.

Nota: las tasas se presentan para 1999 y 2009 debido a que para su cálculo se utilizan los nacimientos ocurridos en el año anterior al levantamiento de la información.

Fuente: INEGI. XII Censo General de Población y Vivienda 2000; Censo de Población y Vivienda 2010.

que se ha incrementado en alrededor de nueve puntos porcentuales la asistencia total. La población de 15 a 24 años que asiste a la escuela se incrementó en los últimos 20 años en 10 puntos porcentuales. En 1990, 30.2% de las personas en esas edades asistía a la escuela; en 2010, 40.4% asistía a algún centro educativo. Al mismo tiempo, se redujo la brecha entre hombres y mujeres.

Hoy, 40.1% de las mujeres y 40.8% de los hombres de ese grupo de edad van a la escuela.

La tasa de analfabetismo es un indicador básico relacionado con el nivel de bienestar de la población y se refiere a la población de 15 años y más que no sabe leer ni escribir. Debido al incremento de la cobertura de la educación básica, la tasa de analfabetismo de la población de 15 años y más disminuyó 5.5 puntos porcentuales entre 1990 y 2010. En 1990, 12.4% de las personas de 15 años y más no sabían leer ni escribir y en 2010 esta cifra se redujo a 6.9%. Desde una óptica generacional, la tasa de analfabetismo disminuye conforme menor es la edad de las personas, lo que da cuenta de la diferencia en las oportunidades educativas y de los avances entre las generaciones. Para los hombres y las mujeres jóvenes (15-29 años) esta tasa es de 1.9%, lo que sugiere que la población joven es prácticamente alfabeta. Sin embargo, conforme aumenta la edad, la tasa de analfabetismo se incrementa y tiene un componente mayor de mujeres. La diferencia entre sexos en la generación de 75 años y más es de casi nueve puntos porcentuales.

Todos los datos anteriores permiten comprobar no sólo los cambios en la estructura de la población mexicana, sino también la mejoría que los mexicanos, y en particular las mexicanas, han experimentado en diversos aspectos, como fecundidad, educación y equidad, entre otros aspectos. Esta importantísima información nos permite extrapolar la forma en que diversos trastornos reproductivos afectan a la mujer mexicana.

Dr. Gerardo Velázquez Cornejo

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Normas para autores Los manuscritos deben elaborarse siguiendo las recomendaciones del Comité Internacional de Editores de Revistas Médicas (N Engl J Med 1997;336:309-15) y se ajustan a las siguientes normas: 1. El texto deberá entregarse impreso, por cuadruplicado, en hojas tamaño carta (21 × 27 cm), a doble espacio, acompañado del disquete con la captura correspondiente e indicando en la etiqueta el título del artículo, el nombre del autor principal y el programa de cómputo con el número de versión. (Ejemplo: Estrógenos en el climaterio. Guillermo Martínez.

Word 6.0).

2. Las secciones se ordenan de la siguiente manera: página del título, resumen estructurado, abstract, introducción, material y método, resultados, discusión, referencias, cuadros, pies de figuras.

3. La extensión máxima de los originales será de 15 hojas, de los casos clínicos 8 hojas y cuatro figuras o cuadros. Las revisiones no excede­ rán de 15 hojas.

En la primera página figurará el título completo del trabajo, sin superar los 85 caracteres, los nombres de los autores, servicios o departamentos e institución (es) a que pertenece (n) y la dirección del primer autor. Si todos los autores pertenecen a servicios diferentes pero a una misma institución el nombre de ésta se pondrá una sola vez y al final. La identificación de los autores deberá hacerse con uno hasta cuatro asteriscos (*,**,***,****); si son más autores utilice números en super­índice.

4. Para fines de identificación cada hoja del manuscrito deberá llevar, en el ángulo superior izquierdo, la inicial del nombre y el apellido paterno del primer autor y en el ángulo derecho el número progresivo de hojas.

5. Todo material gráfico deberá enviarse en diapositivas, en color o blanco y negro, nítidas y bien definidas. En el marco de cada diapositiva se anotará, con tinta, la palabra clave que identifique el trabajo, el número de la ilustración, apellido del primer autor y con una flecha se indicará cuál es la parte superior de la figura. Si la diapositiva incluyera material previamente publicado, deberá acompañarse de la autorización escrita del titular de los derechos de autor.

6. Las gráficas, dibujos y otras ilustraciones deben dibujarse profe­ sionalmente o elaborarse con un programa de cómputo y adjuntarlas al mismo disquete del texto señalando en la etiqueta el programa utilizado.

7. Los cuadros (y no tablas) deberán numerarse con caracteres arábigos.

Cada uno deberá tener un título breve; al pie del mismo se incluirán las notas explicativas que aclaren las abreviaturas poco conocidas. No se usarán líneas horizontales o verticales internas. Todos los cuadros deberán citarse en el texto.

8. Tipo de artículos: la revista publica artículos originales en el área de investigación clínica o de laboratorio, editoriales, artículos de revisión, biotecnología, comunicación de casos y cartas al editor. Se reciben artículos en los idiomas español e inglés.

9. Resumen. La segunda hoja incluirá el resumen, de no más de 250 palabras y deberá estar estructurado en antecedentes, material y método, resultados y conclusiones. Con esta estructura se deberán enunciar claramente los propósitos, procedimientos básicos, metodología, principales hallazgos (datos concretos y su relevancia estadística), así como las conclusiones más relevantes. Al final del resumen proporcionará de 3 a 10 palabras o frases clave. Enseguida se incluirá un resumen (abstract) en inglés.

10. Abstract. Es una traducción correcta del resumen al inglés.

11. Texto. Deberá contener introducción, material y métodos, resultados y discusión, si se tratara de un artículo experimental o de observación.

Otro tipo de artículos, como comunicación de casos, artículos de revisión y editoriales no utilizarán este formato. a) Introducción. Exprese brevemente el propósito del artículo. Resuma el fundamento lógico del estudio u observación. Mencione las referencias estrictamente pertinentes, sin hacer una revisión extensa del tema. No incluya datos ni conclusiones del trabajo que está dando a conocer. b) Material y método. Describa claramente la forma de selección de los sujetos observados o que participaron en los experimentos (pacientes o animales de laboratorio, incluidos los testigos).

Identifique los métodos, aparatos (nombre y dirección del fabricante entre paréntesis) y procedimientos con detalles suficientes para que otros investigadores puedan reproducir los resultados.

Explique brevemente los métodos ya publicados pero que no son bien conocidos, describa los métodos nuevos o sustancialmente modificados, manifestando las razones por las cuales se usaron y evaluando sus limitaciones. Identifique exactamente todos los medicamentos y productos químicos utilizados, con nombres genéricos, dosis y vías de administración. c) Resultados. Preséntelos siguiendo una secuencia lógica. No repita en el texto los datos de los cuadros o figuras; sólo destaque o resuma las observaciones importantes. d) Discusión. Insista en los aspectos nuevos e importantes del estudio. No repita pormenores de los datos u otra información ya presentados en las secciones previas. Explique el significado de los resultados y sus limitaciones, incluidas sus consecuencias para la investigación futura. Establezca el nexo de las conclusiones con los objetivos del estudio y absténgase de hacer afirmaciones generales y extraer conclusiones que carezcan de respaldo. Proponga nueva hipótesis cuando haya justificación para ello. e) Referencias. Numere las referencias consecutivamente siguiendo el orden de aparición en el texto (identifique las referencias en el texto colocando los números en superíndice y sin paréntesis).

Cuando la redacción del texto requiera puntuación, la referencia será anotada después de los signos pertinentes. Para referir el nombre de la revista utilizará las abreviaturas que aparecen enlistadas en el número de enero de cada año del Index Medicus. No debe utilizarse el término “comunicación personal”. Sí se permite, en cambio, la expresión “en prensa” cuando se trata de un texto ya aceptado por alguna revista, pero cuando la información provenga de textos enviados a una revista que no los haya aceptado aún, citarse como “observaciones no publicadas”. Se mencionarán todos los autores cuando éstos sean seis o menos, cuando sean más se añadirán las palabras y col. (en caso de autores nacionales) o et al.(si son extranjeros). Si el artículo referido se encuentra en un suplemento, agregará Suppl X entre el volumen y la página inicial.

La cita bibliográfica se ordenará de la siguiente forma en caso de revista:

Torres BG, García RE, Robles DG y col. Complicaciones tardías de la diabetes mellitus de origen pancreático. Rev Gastroenterol Mex 1992;57:226-9.

Si se trata de libros o monografías se referirá de la siguiente forma:

Hernández RF. Manual de anatomía. 2ª ed. México: Méndez Cervantes, 1991;pp:120-9.

Si se tratara del capítulo de un libro se indicarán el o los autores del capítulo, nombre del mismo, ciudad de la casa editorial, editor del libro, año y páginas.

12. Trasmisión de los derechos de autor. Se incluirá con el manuscrito una carta firmada por todos los autores, conteniendo el siguiente párrafo: “El/los abajo firmante/s transfiere/n todos los derechos de autor a la revista, que será propietaria de todo el material remitido para publicación”. Esta cesión tendrá validez sólo en el caso de que el trabajo sea publicado por la revista. No se podrá reproducir ningún material publicado en la revista sin autorización.

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Artículo de revisión

Vitrificación de ovocitos y embriones Martha Isolina García Amador,* Rocío Martínez Armas,* Luis Arturo Ruvalcaba Castellón* RESUMEN En 1983, Trounson y colaboradores fueron los primeros en sumergir un ovocito directamente en nitrógeno líquido con tasas aceptables de supervivencia y fertilización, pero bajas de segmentación. En 1984, Zeilmarker y su grupo reportaron el primer nacimiento luego de transferir embriones descongelados. En este artículo se revisan los aspectos generales de esta técnica y los resultados de la vitrificación de ovocitos, cigotos y embriones.

Palabras clave: vitrificación, criopreservación, vitrificación de ovocitos, vitrificación de embriones.

ABSTRACT In 1983, Trounson et al sumerged an oocyte directly on liquid nitrogen with acceptable rates of survival and fertilization, but low rates of cleavage. In 1984, Zeilmarker et al reported the first birth after transfering defrozen embryos. This paper reviews the general aspects of vitrification technique, as well as the results of the oocytes, cygotes and embryos vitrification.

Key words: vitrification, cryopreservation, oocyte vitrification, embryo vitrification.

E

n 1983 Trounson y col.1 fueron los primeros en sumergir un ovocito directamente en nitrógeno líquido con aceptables tasas de supervivencia y fertilización, pero bajas de segmentación. En 1984, Zeilmarker y col. comunicaron el primer nacimiento luego de transferir embriones descongelados.2 El primer nacido de un ovocito criopreservado fue reportado por Chen en 1986, quien utilizó la congelación lenta y dimetilsulfóxido (DMSO).3 Esta técnica fue mejorando a través de los años como resultado de cambios en los componentes de los medios de cultivo utilizados: medios basados en colina,4 reducidos en so-

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Instituto Mexicano de Infertilidad, Guadalajara, Jalisco.

Correspondencia: Dra. Martha Isolina García Amador. Instituto Mexicano de Infertilidad. Blvd. Puerta de Hierro 5150-503C, colonia Plaza Corporativa Zapopan, CP 45116, Zapopan, Jalisco.

Correo electrónico: mgarciaamador@yahoo.com Recibido: febrero, 2011. Aceptado: abril, 2011.

Este artículo debe citarse como: García-Amador MI, MartínezArmas R, Ruvalcaba-Castellón LA. Vitrificación de ovocitos y embriones. Rev Mex Reprod 2011;3(4):143-149. www.nietoeditores.com.mx

dio,5,6 optimización de crioprotectores7,8 y, por supuesto, de la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI),9 que generó nuevas promesas en factor masculino severo y marcó un punto de inflexión en la fertilización hasta entonces limitada por el endurecimiento de la zona pelúcida ovocitaria secundario a las bajas temperaturas durante el proceso de congelación.10,11 Rall y Fahy12 establecieron que la vitrificación consistía en solidificar una solución por enfriamiento rápido.

Al inducir un estado vidrioso por elevación extrema de su viscosidad, demostraron su aplicación práctica en la criopreservación de embriones mamíferos y la consideraron una alternativa potencial a la congelación lenta.

Kuleshova y col.,13 en 1999, reportaron el primer nacido vivo derivado de la vitrificación de ovocitos humanos, luego de vitrificar 17 ovocitos con etilenglicol (40%) y 0.6 M/L de sucrosa en open pulled straws (OPS). Desde su descripción, importantes modificaciones han nutrido la técnica potenciando resultados que demuestran su eficacia y seguridad clínica.

ASPECTOS TERMINOLÓGICOS RELACIONADOS Una revisión a la terminología empleada para los procesos criobiológicos implicados en la vitrificación ha

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García Amador MI y col.

sido realizada recientemente. Shaw y Jones, en 2003, establecieron claramente el significado en criobiología de los términos congelación (freezing) y descongelación (thawing), y afirmaron que sólo podían usarse para procedimientos donde se formaran o derritieran cristales de hielo (como sinónimo de deshielo o derretimiento).14 Cooling y warming, cuyo significado en inglés es enfriamiento y calentamiento, sólo se refieren a cambios de temperatura y pueden utilizarse indistintamente para la congelación tradicional y para la vitrificación. El consenso actual entre los criobiólogos es usar los términos congelación-descongelación para la congelación lenta y procesos relacionados, y calentamiento-enfriamiento para la vitrificación, es decir, términos vinculados con los cambios de temperatura y no de formación y derretimiento de cristales de hielo.

Con base en estos argumentos, se ha propuesto, como primer paso en la dirección correcta, reemplazar de manera adecuada los términos en las etiquetas de los medios de vitrificación, como soluciones de calentamiento (warming solutions) en lugar de soluciones de descongelación (thawing solutions).15 VITRIFICACIÓN Es la solidificación de una solución a bajas temperaturas, no por cristalización, sino por elevación de su viscosidad (Rall y Fahy, 1985), y supone el uso de crioprotectores en mínimo volumen y elevadas concentraciones a velocidad ultra-rápida de enfriamiento.

Aspectos generales de la técnica

En la vitrificación, la célula y su entorno se solidifican en una forma similar al vidrio sin que se formen cristales de hielo. Es una técnica en la que se utilizan altas concentraciones de crioprotectores en mínimo volumen y elevadas velocidades de enfriamiento (15,000-30,000ºC/ min),16 lo que genera como consecuencia la ausencia de cristales de hielo durante los procesos de congelación-descongelación,17 una mejor conservación de la ultraestructura y menor daño a la fisiología ovocitaria.18 Borini y col. señalaron que los protocolos subóptimos para criopreservación de ovocitos pueden causar daño subletal vinculado con capacidad limitada para la fertilización.19

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La alta osmolaridad de la solución de vitrificación rápidamente deshidrata la célula. Sumergirla bruscamente en nitrógeno líquido la solidifica, de manera que el agua intracelular no tiene tiempo para formar cristales y provocar daño a los organelos intracelulares, lo que incrementa su potencial de supervivencia.20 Algunos autores siguen mostrando preocupación por las altas concentraciones de crioprotectores utilizadas, por su potencial citotoxicidad y por la posibilidad de contaminación relacionada con el uso de sistemas abiertos.21 Contaminación cruzada

Se ha mencionado el riesgo de contaminación cruzada por patógenos bacterianos o virales secundario al uso de sistemas abiertos que permiten el contacto directo con el nitrógeno líquido, e incluso con el vapor de éste, en los tanques de almacenamiento.22,23 Al respecto se ha sugerido filtrar el nitrógeno con un filtro de 0.2 µm, el cual puede eliminar bacterias y hongos, para luego almacenarlo en el tanque de nitrógeno líquido en fase de vapor, o exponerlo a luz ultravioleta.

Se destaca la incapacidad que tienen algunos gérmenes para penetrar una zona pelúcida intacta e infectar la célula.24 También contribuyen a disminuir la posibilidad de contaminación los lavados a los que se someten los ovocitos y los embriones luego de ser descongelados, y los sistemas secos de almacenamiento.

Se ha propuesto la colocación de las muestras y las herramientas (cryotop, open pulled straws, OPS, etcétera) después del enfriamiento en el interior de pajillas preenfriadas, preferiblemente de alta seguridad (CBS Strauss), selladas al calor y almacenadas en contenedores comunes sin peligro de contaminación cruzada. Para el enfriamiento, puede cortarse uno de los extremos de la pajilla, removerse la herramienta con la muestra y sumergirse directamente en el medio de calentamiento.

Este abordaje fue usado por Vajta, en 1998, y Bielanski y Animan lo probaron recientemente.25 Isachenko y col. compararon los resultados obtenidos al vitrificar 376 embriones pronucleares a los que previamente se les había realizado biopsia, asignados al azar a uno de dos grupos (cada grupo de 183 embriones).

En el grupo 1 la vitrificación se hizo en pajillas abiertas y estiradas (open pulled straw, OPS) que se colocaron directamente en nitrógeno líquido (vitrificación directa);

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Vitrificación de ovocitos y embriones

en el otro grupo, se hizo en una pajuela estéril de inseminación de 90 mm cerrada (sistema aséptico; OPS, straw in straw).

Las tasas de desarrollo a blastocisto expandido después de cultivo in vitro fueron de 25% en el grupo con vitrificación directa, y de 23% en el grupo con straw in straw, y se concluyó que la vitrificación de embriones pronucleares, sometidos previamente a biopsia, colocados en pajillas estiradas abiertas (OPS) y en un recipiente herméticamente cerrado, antes de sumergirla en el nitrógeno líquido, permite un aislamiento confiable, evita la contaminación por microorganismos patógenos y no afecta la supervivencia si hay descongelación rápida con remoción simultánea de los crioprotectores.26 La realización de un estudio serológico, cervical o seminal para Mycoplasma, ureaplasma, virus de la hepatitis B o C, VIH, herpes tipo II, entre otros, en todas las parejas contempladas para ciclo de reproducción asistida, ovodonadoras y donantes de semen permitirá un doble mecanismo de protección ante el riesgo de contaminación cruzada.

En el Instituto Mexicano de Infertilidad (IMI), de Guadalajara, Jalisco, los ovocitos de metafase II identificados por la extrusión del primer cuerpo polar, excedentes o destinados por alguna otra indicación, son vitrificados en cryotop según la técnica descrita por Kuwayama.27 Existen otros dispositivos para vitrificar ovocitos, embriones, o ambos (Cuadro 1).

Técnica

Inicialmente, los ovocitos se depositan en la solución de equilibrio que contiene etilenglicol a 7.5% y dimetilsulfóxido a 7.5% (ES), haciendo puentes entre las gotas Cuadro 1. Algunas herramientas o dispositivos utilizados para la vitrificación de ovocitos o embriones Autores

Dispositivo

Kuleshova (1999), Chen (2000), Cuello (2008)

Open pull straw (OPS)

Park (1999), Yoon (2000), Son (2003) Papis (2000) Lieberman (2002), Vanderzwalmen (2003) Katayama (2003), Kuwayama (2005) Lane (2001), Mukaida (2001) Kuwayama (2005) Lin, Chen Chiang (2008)

Cooper Grids Microdrops Hemistraw Cryotop Croloop Cryotip Cryoleaf

con la pipeta Pasteur en dos ocasiones cada tres minutos hasta completar 10 minutos.

Luego, se trasladan a la solución de vitrificación, compuesta por etilenglicol a 15%, dimetilsulfóxido a 15% y sucrosa (0.5 M,VS). En ésta son aspirados y devueltos tres o cuatro veces antes de ser depositados sobre la superficie del cryotop (Kitazato Supply Co., Fujinomiya, Japón).

Finalmente, el cryotop se sumerge en nitrógeno líquido para la colocación de su cubierta protectora y ser almacenado en el tanque de nitrógeno.

Calentamiento o descongelación

1. Los ovocitos se depositan en solución descongelante (TS) a 37ºC durante un minuto. Seguidamente en solución diluyente (DS) por tres minutos, y después se trasladan a la solución de lavado (WS1) durante cinco minutos y (WS2) por cinco minutos más.

2. Los ovocitos supervivientes se dejan en medio de cultivo dos a cuatro horas y posteriormente se microinyectan mediante la técnica convencional de inyección intracitoplasmática de espermatozoides.

Se han hecho algunas modificaciones a la técnica original, principalmente en cuanto a tiempos y volúmenes, en diferentes pasos. Se incorporará un nuevo suplemento en la solución de vitrificación de manera específica (comunicación vía telefónica con el Dr. Masashige Kuwayama), la hidroxipropilcelulosa con la finalidad de mejorar las ya excelentes tasas de supervivencia, fertilización y segmentación.

Resultados de la vitrificación de ovocitos

Kuwayama reportó el primer embarazo a partir de ovocitos vitrificados utilizando cryotop en el año 2002, en Japón. Los resultados publicados en 2005 fueron: supervivencia de 91% (58/64), segmentación de 81%, embriones en estadio de blastocisto en 50%, implantación de 11.2% (12/107), y 41% de embarazos por embrión transferido.28 En la actualidad, muchos centros de reproducción en todo el mundo han implantado su técnica con excelentes resultados y reproducibilidad.

Katayama29 reportó, luego de la descongelación de ovocitos vitrificados, índices de supervivencia de 94%; de fertilización por inyección intracitoplasmática de espermatozoides de 91% y división celular de 90%. Kim

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García Amador MI y col.

(2006) encontró un índice de supervivencia de 81%, y de fertilización y división celular de 63.8 y 95.9%, respectivamente;30 Lucena y col. (2006), de 8.2% (13/159);31 Antinori y su grupo (2007), de 11.8% (39/330);32 Cobo (2008) obtuvo cifras de supervivencia de 96.9% y de fertilización de 76.3%;33 mientras que Schoolcraft y col.

(2009) registraron tasas de implantación por ovocito “desvitrificado” de 8.8% (14/160).34 En un estudio multicéntrico se publicaron resultados obstétricos y perinatales de 165 embarazos (200 lactantes) derivados de la vitrificación de ovocitos en cryotop o cryoleaf. La proporción de embarazo múltiple fue de 17% (26 fueron gemelares y dos, triples). Se realizó cesárea en 37% de los embarazos únicos (n = 51). El peso promedio de los nacidos únicos fue de 2,920 ± 37 g y de 2,231 ± 55 g para los múltiples. La incidencia de anomalías congénitas en esa cohorte de nacidos vivos fue de 2.5% (dos defectos septales ventriculares, una atresia biliar, una anomalía ósea en el miembro inferior y un hemangioma de piel, comparable con las concepciones espontáneas en mujeres fértiles, o de mujeres fértiles en ciclos de fertilización in vitro).35 Vitrificación y alteraciones en el huso meiótico

El aparato microtubular del huso meiótico es una estructura dinámica que facilita la segregación de los cromosomas en células hijas durante la mitosis y en el primer y segundo cuerpos polares durante la meiosis.

Algunos autores han señalado alteraciones en la segregación de los cromosomas durante la meiosis II, derivadas de la exposición a bajas temperaturas.36-39 Otros sugieren que el huso meiótico puede sobrevivir a procesos de congelación-descongelación sin consecuencias, o al menos sin incremento en el número de aneuploidías en los embriones resultantes, dado que se pierde durante la congelación y se recupera después de la descongelación y cultivo.40-43 De Santis considera que éste no debe ser un indicador de la función ovocitaria.44 La criopreservación de ovocitos se ha analizado también mediante microscopio de luz polarizada, el cual ofrece la oportunidad de visualizar el huso meiótico de manera no invasora. La estructura ordenada de los microtúbulos del huso genera el fenómeno de birrefringencia que crea una diferencia en contraste entre el huso y el resto de la célula. Esto puede detectarse por medio de

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algún método de imágenes, como el poloscopio, que amplifica las señales de birrefringencia y hace cuantificable el grado de orientación de los microtúbulos.45 Notola y col. (2009) evaluaron, mediante microscopia electrónica y de manera comparativa, los posibles efectos que los protocolos de vitrificación pueden tener en las características ultraestructurales de ovocitos vitrificados en cryoleaf y cryoloop. Específicamente, se valoró la presencia y extensión de vacuolas citoplasmáticas, la calidad de los organelos, la textura de la zona pelúcida, la integridad del citoplasma, la apariencia del espacio perivitelino y el arreglo del huso meiótico. Se analizó el comportamiento de 35 ovocitos, 10 vitrificados en cryoleaf, 10 en cryoloop y 15 en el grupo control (fresco). Estos ovocitos mostraron características similares a los ovocitos en fresco en cuanto a forma y textura del citoplasma. En los tres grupos (los dos de vitrificación y el fresco) se observaron vacuolas esporádicas. El número de gránulos corticales estuvo anormalmente reducido en los ovocitos criopreservados, y en algunas ocasiones estuvo vinculado con una compactación incrementada del aspecto interno de la zona pelúcida.46 También se han descrito características atípicas, como una tendencia a la elongación del huso, protrusión de los cromosomas fuera del mismo y aumento en la distancia polo-polo de la mano de una disminución en lo ancho (en la porción ecuatorial) del huso meiótico (14.9 ± 2.3 µm) en comparación con el control en fresco (12.4 ± 2.6 µm) [p = 0.001].47 La repercusión de algunas manifestaciones continúa siendo incierta, y para algunos autores es razonable sospechar que podrían indicar un incremento en el riesgo de errores meióticos.48 Vitrificación de cigotos

De manera teórica, puede hacerse la vitrificación a los embriones en todos los estados de preimplantación. No hay suficiente sustento científico para aseverar cuál de los estados embrionarios en particular tolera mejor los cambios que implica la técnica, además de que las diferencias estructurales limitan la comparación. Aunque para algunos la congelación en pronúcleos pareciera ser el estado ideal para la criopreservación embrionaria,49 no es en realidad el estadio más común de criopreservación del excedente en fresco en un ciclo de fertilización in

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Vitrificación de ovocitos y embriones

vitro. Uno de los inconvenientes descritos del embrión en otras etapas de desarrollo es que la apariencia morfológica no aporta suficientes elementos que permitan intuir su calidad y potencial implantatorio.

En un estudio realizado en el Instituto Mexicano de Infertilidad (IMI) de julio de 2006 a enero de 2008 se evaluó la supervivencia, segmentación y proporción de embarazos tras la vitrificación y descongelación de 104 cigotos y 314 embriones en cuatro células. La edad promedio fue de 34.6 ± 4.9 años (n = 26) para el grupo I, y de 33.8 ± 4.5 años para el grupo II (n = 85). La supervivencia fue de 86 y 89%, respectivamente. En el grupo I, la proporción de embarazos fue de 50% (13/26) y no hubo pérdida gestacional. En el grupo II, fue de 28% (24/85), y hubo tres pérdidas gestacionales. No se encontraron diferencias significativas al comparar edad, porcentajes de supervivencia ni promedio de embriones transferidos; sí las hubo en la proporción de embarazo (χ2 = 5.22; gl 1; p < 0.05).50 Vitrificación de embriones

En 2007 Ali y col. observaron que una disminución en la velocidad de congelación reducía las tasas de supervivencia embrionaria y debía ser compensada por altas concentraciones intracelulares de crioprotectores.51 La exposición a los crioprotectores también puede ser dañina, aun cuando no haya congelación, si no se realiza en la forma correcta.52 En un metanálisis reciente se compararon los resultados obtenidos en la criopreservación de embriones por congelación lenta y vitrificación. Sólo se eligieron cuatro de 873 estudios, tres de los cuales eran ensayos controlados con asignación al azar. Se compararon 8,824 blastocistos congelados por vitrificación (n = 7,482) vs congelación lenta (n = 1,342). Las tasas de supervivencia y de segmentación embrionaria fueron significativamente mayores después de la vitrificación, en comparación con la congelación lenta (razón de momios: 15.57, intervalo de confianza de 95%: 3.68 a 65.82; al azar modelo de efectos). La revisión concluyó que la vitrificación está vinculada con tasas de supervivencia significativamente mayores que la congelación lenta.53 Debido a que sólo un pequeño número de blastocistos está disponible para la criopreservación, es necesaria una forma simple, rápida y confiable para optimizar el

resultado de la transferencia. Mukaida, en 2001, reportó el primer nacimiento exitoso después de la transferencia de blastocistos humanos vitrificados utilizando el cryloop,54 y subsecuentemente encontró altas tasas de supervivencia (87.5%), implantación (29%) y embarazo (44%) después de 223 ciclos usando cryoloop.55 Zhang y col., en 2009, criopreservaron embriones en los días 3, 4 o 5 después de la biopsia, y compararon los resultados luego de vitrificarlos (tres horas después de la biopsia) con los de un grupo control. La vitrificación la realizaron con cryoleaf (Medicult). Obtuvieron tasas similares de supervivencia para los embriones vitrificados en estado de mórula (tras biopsia y sin biopsia): 87.5 vs 92%, p = 0.037. La supervivencia en los blastocistos fue mayor para el grupo de biopsia (95.7%) que para el de control (81.4%), p = 0.035.56 Revitrificación de embriones

En estudios previos se ha evaluado la seguridad de los ciclos de congelación y recongelación usando embriones de ratón, y se ha demostrado que éstos podían sobrevivir a tres ciclos de congelación-descongelación y ser capaces de desarrollarse in vitro57-59 tras la recongelación (congelación lenta).

Hace poco, Takahashi y Araki (2004) reportaron el nacimiento de un bebé saludable derivado de un embrión revitrificado en estado de blastocisto.60 Yoko y col.61 hicieron un estudio comparativo con pacientes en ciclo de in vitro a las que se les transfirieron embriones vitrificados inicialmente en estado de pronúcleos, que fueron descongelados y revitrificados en estado de mórula o blastocisto por tener todavía embriones supernumerarios, y un grupo control en el que se transfirieron embriones tras un solo ciclo de vitrificación. La tasa de cancelación que encontraron fue de 28% para el grupo de estudio vs 17.4% para el grupo control, diferencia estadísticamente no significativa, con tasas de supervivencia similares: 84 vs 88.9%. Las tasas de embarazo por ciclo de transferencia fueron de 27.8 vs 25.9%. La proporción de aborto espontáneo fue de 32 vs 20% (diferencia no significativa).

En 2009, Ruvalcaba y col.62 reportaron un embarazo exitoso a partir de ovocitos vitrificados donados, revitrificación en estadio de cuatro células con posterior “descongelación” y transferencia en el mismo estadio.

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De momento, ésta es una herramienta que puede utilizarse en casos estrictamente necesarios; deberán realizarse más estudios para avalar su seguridad clínica.

Es fundamental que se informe a la pareja de los beneficios y riesgos de continuar el tratamiento. Conviene, para prevenir embriones excedentes después de una primera vitrificación, que al momento de la aspiración sólo se insemine una parte razonable de los ovocitos que genere un justo número de embriones; en el caso de vitrificación de embriones, no deben pasar de tres o cuatro por herramienta (cryotop, cryoleaf, cryoleaf, etcétera).

CONCLUSIÓN La vitrificación es un método simple que ha revolucionado la criobiología y es de gran utilidad clínica en los centros de reproducción asistida. Al margen del dispositivo utilizado (cryotop, cryoleaf, cryoloop, etcétera), los resultados alcanzados en el orden de supervivencia y preservación de la función han demostrado que es una técnica segura, reproducible y de alto rendimiento.

REFERENCIAS 1. Trounson A, Mohr L. Human pregnancy following cryopreservation, thawing and transfer of an eight-cell embryo. Nature 1983;305:707-709.

2. Zeilmarker GH, Alborda AT, Van Gient Y, Rijkmans CMPM, Drogendjik AC. Two pregnancies following transfer of intact frozen-thawed embryos. Fertil Steril 1984;42:293-296.

3. Chen C. Pregnancy after human oocytes cryopreservation.

Lancet 1986;11:884-886.

4. Quintans CJ, Donaldson MJ, Bertolino MV, Pasqualini RS. Birth of two babies using oocytes that were cryopreserved in a choline based freezing medium. Hum Reprod 2002;17:3149-3152.

5. Boldt J, Tidswell N, Sayers A, Kilani R, Cline D. Human oocyte cryopreservation: 5 years experience with a sodium depleted slow freezing method. Reprod BioMed Online 2006;13:96-100.

6. Boldt J, Cline D, McLaughlin D. Human oocyte cryopreservation as an adjunct to IVF- embryo transfer cycles. Hum Reprod 2003;18:1250-1255.

7. Fosas N, Marina F, Torres PJ, Jové I, et al. The births of five Spanish babies from cryopreserved donated oocytes. Hum Reprod 2003;18:1417-1421.

8. Fabbri R, Porcu E, Marsella T, Rocchetta G, et al. Human oocyte cryopreservation: new perspectives regarding oocyte survival. Hum Reprod 2001;16:411-416.

148

9. Palermo G, Joris H, Devroey P, Van Steiterghem A. Pregnancies after intracytoplasmic injection of a single spermatozoon into a oocyte. Lancet 1992;340:17-18.

10. Van Steiterghem A, Nagy Z, Joris H, Liu J, et al. High fertilization and implantation rates after intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod 1993;8:1061-1066.

11. Porcu E, Fabbri R, Seracchioli R, Ciotti PM, et al. Birth of a healthy female after intracytoplasmic sperm injection of cryopreserved human oocytes. Fertil Steril 1997;68:724-726.

12. Rall WF, Fahy GM. Ice free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification. Nature 1985;313:573-575.

13. Kuleshova L, Gianaroli L, Magli C, Ferraretti A, Trounson A. Birth following vitrification of a small number of human oocytes: Case report. Hum Reprod 1999;14:3077-3079.

14. Shaw JM, Jones GM. Terminology associated with vitrification and other cryopreservation procedures for oocytes and embryos. Hum Reprod Update 2003;9:583-605.

15. Vajta G, Nagy ZP, Cobo A, Conceicao J, Yovich J. Vitrification in assisted reproduction: myths, mistakes, disbeliefs and confusion. Reprod BioMed Online 2009;19(S3):1-7.

16. Hong SW, Chung HM, Lim JM, Ko JJ, et al. Improved human oocyte development after vitrification: a comparison of thawing methods. Fertil Steril 1999;72:142-146.

17. Gardner DK, Sheehan CB, Rienzi L, Katz-Jaffe M, Larman MG. Analysis of oocyte physiology to improve cryopreservation procedures. Theriogenology 2007;67:64-72.

18. Lieberman J, Tucker MJ. Effect of carrier system on the yield of human oocytes and embryos as assessed by survival and developmental potential after vitrification. Reproduction 2002;124:483-489.

19. Borini A, Bonu MA, Coticchio G, Bianchi V, et al. Pregnancies and births after oocyte cryopreservation. Fertil Steril 2004;82:601-605.

20. Bianchi V, Coticchio G, Fava L, Flamigni C, Borini A. Meiotic spindle imaging in human oocytes frozen with a slow freezing procedure involving high sucrose concentration.

Hum Reprod 2005;20(4):1078-1083.

21. Tedder RS, Zuckerman MA, Goldstone AH, Hawkins AE, et al. Hepatitis B transmission from contaminated cryopreservation tank. Lancet 1995;346:137-140.

22. Bielanski A, Nadin-Davis S, Sapp T, Lutze-Wallace C. Viral contamination of embryos cryopreserved in liquid nitrogen.

Cryobiology 2000;40:110-116.

23. Bielanski A, Bergeron H, Lau PCK, Devenish J. Microbial contamination of embryos and semen during long term banking in liquid nitrogen. Cryobiology 2003;46:146-152.

24. Fountain D, Ralston M, Higgins N, Gorlin JB, et al. Liquid nitrogen freezers: a potential source of microbial contamination of hematopoietic stem cell components. Transfusion 1997;37:585-591.

25. Bielanski A, Hanniman A. Non-cross-contamination of bovine embryos with microbes using the OPS vitrification system.

Reprod Fertil Dev 2007;29:232(abstract).

26. Isachenko V, Montag M, Isachenko E, van der Ven Hans.

Vitrification of mouse pronuclear embryos after polar body biopsy without direct contact with liquid nitrogen. Fertil Steril 2005;84(4):1011-1016.

27. Kuwayama M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: the Cryotop method.

Theriogenology 2007;67:73-80.

Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción Volumen 3, núm. 4, abril-junio, 2011

Vitrificación de ovocitos y embriones

28. Kuwayama M, Vajta G, Kato O, Leibo SP. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes.

Reprod BioMed Online 2005;11:300-308.

29. Katayama P, Stehlik J, Kuwayama M, Kato O, Stehlik E. High survival rate of vitrified oocytes results in clinical pregnancy.

Fertil Steril 2003;80:223-224.

30. Kim TJ, Hong S, Cha KY. Vitrified oocytes produce excellent pregnancy rate. Fertil Steril 2006;86(2):126-127.

31. Lucena E, Bernal DP, Lucena C, Rojas A, et al. Successful ongoing pregnancies after vitrification of oocytes. Fertil Steril 2006;85:108-111.

32. Antinori M, Licata E, Dani G, Cerusico F, et al. Cryotop vitrification of human oocytes results in high survival rate and healthy deliveries. Reprod BioMed Online 20007;14:72-79.

33. Cobo A, Kuwayama M, Pérez S, Ruiz A, et al. Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method. Fertil Steril 2008;89:1657-1664.

34. Schoolcraft W, Keller J, Schienker T. Excellent embryo quality obtained from vitrified oocytes. Reprod BioMed Online 2009;19(6):820-823.

35. Chian RC, Huang JY, Tan SL, Lucena E, et al. Obstetric and perinatal outcome in 200 infants conceived from vitrified oocytes. Reprod BioMed Online 2008;16(5):608-610.

36. Pickering SJ, Johnson MH. The influence of cooling on the organization of the meiotic spindle of the mouse oocyte.

Hum Reprod 2007;2:207-216.

37. Pickering SJ, Braude PR, Johnson MH, Cant A, Currie J. Transient cooling to room temperature can cause irreversible disruption of the meiotic spindle in the human oocyte. Fertil Steril 1990;54:102-108.

38. Zenses MT, Bielecki R, Casper RF, Leibo SP. Effect of chilling to 0 degrees C on the morphology of meiotic spindles in human metaphase II oocytes. Fertil Steril 2001;75:769-777.

39. Wang WH, Meng L, Hackett RJ, Odenbourg R, Keefe DL. Limited recovery of meiotic spindles in living human oocytes after cooling-rewarming observed using polarized light microscopy. Hum Reprod 2001;16:2374-2378.

40. Boiso I, Marti M, Santalo J, Ponsa M, et al. A confocal microscopy analysis of the spindle and chromosome configuration of human oocytes cryopreserved at the germinal vesicle and metaphase II stage. Hum Reprod 2002;17:1885-1891.

41. Rienzi L, Martínez F, Iacobelli M, Minasi MG, et al. Polscope analysis of meiotic spindle changes in living metaphase II human oocytes during the freezing and thawing procedures.

Hum Reprod 2004;19:655-659.

42. Cobo A, Rubio C, Gerli S, Ruiz A, et al. Use of fluorescence in situ hybridization to assess the chromosomal status of embryos obtained from cryopreserved oocytes. Fertil Steril 2001;75:354-360.

43. Cobo A, Pérez S, De los Santos MJ, Zulategui J, et al.

Effect of different cryopreservation protocols on the metaphase II spindle in human oocytes. Reprod BioMed Online 2008;1(3):350-359.

44. De Santis I. Polar body morphology and spindle imaging as predictor of oocyte quality. Reprod BioMed Online 2005;11:36-42.

45. Keefe D, Liu L, Wang W, Silva C. Imaging meiotic spindles by polarization light microscopy: principles and applications to IVF. Reprod BioMed Online 2003;7:24-29.

46. Nottola SA, Coticchio G, Sciajno R, Gambardella A, et al.

Ultrastructural markers of quality in human mature oocytes vitrified using cryoleaf and cryoloop. Reprod BioMed Online 2009;19(Suppl.3):17-27.

47. Coticchio G, Bromfield JJ, Gambardella A, Scaravelli G, et al. Vitrification may increase the rate of chromosome misalignment in the metaphase II spindle of human mature oocytes. Reprod BioMed Online 2009;19(S3):29-34.

48. Bromfield JJ, Coticchio G, Hutt K, Sciajno R, et al. Meiotic spindle dynamics in human oocytes following slow-cooling cryopreservation. Hum Reprod 2009;24:2114-2123.

49. Damario MA, Hammit DG, Galanits TM, Session DR, Dumesic DA. Pronuclear stage cryopreservation after intracytoplasmic sperm injection and conventional IVF: implications for timing of the freeze. Fertil Steril 1999;72:1049-1054.

50. García MI, Martínez R, Ruvalcaba LA. Estadío conveniente para vitrificación en cryotop; cigoto versus embrión en estadío de 4 células. 9º Taller de la Red Latinoamericana de Reproducción. Cancún, 2009.

51. Ali J, Shelton J. Development of vitrification solutions. In: Tucker M, Lieberman J, editors. Vitrification in assisted reproduction: A User’s Manual and Trouble-Shooting Guide.

London: Informa Healthcare; 2007:3-44.

52. Paynter S. A rational approach to oocyte cryopreservation.

Reprod BioMed Online 2005;5:578-586.

53. Kalliopi L, Kolibianakis E, Venetis C. Cryopreservation of human embryos by vitrification or slow freezing: a systematic review and meta-analysis. Fertil Steril 2008;90:186-193.

54. Mukaida T, Nakamura S, Tomiyama T, Wada S, et al. Successful birth after transfer of vitrified human blastocysts with use of a cryoloop containerless technique. Fertil Steril 2001;76:618-620.

55. Mukaida T, Nakamura S, Tomiyama T, Wada S, et al. Vitrification of human blastocysts using cryoloop: clinical outcome of 223 cycles. Hum Reprod 2003;18:384-391.

56. Zhang X, Trokoudes MK, Pavlides C. Vitirification of biopsed embryos at cleavage, morula and blastocyst stage. Reprod BioMed Online 2009;19:526-531.

57. Macnamee M, Wick K, Rainsbury P, Sathanandan M, et al.

How robust are early human embryos? Lancet 1990;8:636.

58. Baker A, Check JH, Lurie D, Hourani C, Hoover L. Pregnancy achieved with pronuclear-stage embryos that were cryopreserved and thawed twice: a case report. J Assist Reprod Genet 1996;13:713-715.

59. Farhat M, Zentner BS, Lossos F, Bdolah Y, et al. Successful pregnancy following replacement of embryos previously: a case report. Hum Reprod 2001;16:337-339.

60. Takahashi T, Araki Y. Successfully healthy baby delivery from human refrozen blastocyst embryos by vitrification. J Mamm Ova Res 2004;21:162-165.

61. Kumasako Y, Otsu E, Utsunomiya T, Arayaki Y. The efficacy of the transfer of twice frozen-thawed embryos with the vitrification method. Fertil Steril 2009;91(2):383-386.

62. Ruvalcaba LA, García MI, Medina FJ, Montoya J y col.

Embarazo exitoso derivado de ovocitos donados vitrificados y revitrificados en estadío de cuatro células utilizando el cryotop. Reporte de caso. Rev Mex Reprod 2009;2(1):36-37.

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Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción 2011;3(4):150-159

Artículo de revisión

El papel de la proteómica en la definición del secretoma embrionario humano* MG Katz Jaffe, S McReynolds, DK Gardner, WB Schoolcraft Actualmente se ha insistido en la necesidad de la selección embrionaria, no sólo para transferir embriones con mejores posibilidades de implantación. Los llamados “omics” –entre los cuales se cuentan los “proteomics”– nos permiten lograr una mejor selección embrionaria no invasiva, además de conocer más sobre los procesos celulares del embirón. Esta tecnología aún está en desarrollo, y aunque son alentadoras las posibilidades, es importante tomar en cuenta que son muchas las proteínas implicadas. Además de conocer sus productos, es importante establecer sus correlaciones e interacciones para poder establecer un modelo que nos lleve a un factor de predicción adecuado.

RESUMEN La evaluación no invasiva de gametos y embriones se considera un aspecto importante en la tecnología de reproducción asistida.

Actualmente, la selección de embriones para transferencia se basa en índices morfológicos. Aunque exitoso, el campo de la tecnología de reproducción asistida se beneficiaría de un método cuantitativo no invasivo para la determinación de la viabilidad. Las técnicas ómicas, incluidas la transcriptómica, proteómica y metabolómica, han empezado a proporcionar evidencia de que los gametos y embriones viables poseen perfiles moleculares únicos con biomarcadores potenciales que pueden utilizarse para la selección del desarrollo, de la viabilidad, o de ambas. A diferencia del genoma humano que es relativamente fijo y estable en todo el cuerpo humano, el proteoma humano, estimado en más de un millón de proteínas, es más complejo, diverso y dinámico. Las proteínas en sí mismas contribuyen a la homeostasia fisiológica de cualquier célula o tejido. De interés particular en la tecnología de reproducción asistida es el secretoma, las proteínas producidas dentro del embrión y secretadas en el ambiente circundante. La definición del secretoma embrionario humano tiene el potencial de expandir nuestro conocimiento de los procesos celulares embrionarios, incluido el complejo diálogo entre el embrión en desarrollo y su ambiente materno, y también puede ayudar en la identificación de los embriones con mayor potencial de implantación. Los avances en las técnicas proteómicas han permitido la caracterización no invasiva del secretoma embrionario humano con la investigación en curso enfocada en la correlación con el resultado. Desde una perspectiva clínica, la selección de embriones basada en la evaluación morfológica y el análisis no invasivo del secretoma embrionario humano puede aumentar el éxito de la FIV y resultar en la transferencia rutinaria de embriones individuales.

Palabras clave: proteómica, embrión, secretoma, evaluación no invasiva.

ABSTRACT Non-invasive gamete and embryo assessment is considered an important focus in assisted reproductive technologies (ART). Currently, the selection of embryos for transfer is based on morphological indices. Though successful, the field of ART would benefit from a noninvasive quantitative method of viability determination. Omics technologies, including transcriptomics, proteomics and metabolomics, have already begun providing evidence that viable gametes and embryos possess unique molecular profiles with potential biomarkers that can be utilized for developmental and/or viability selection. Unlike the human genome that is relatively fixed and steady throughout the human body, the human proteome, estimated at over a million proteins, is more complex, diverse and dynamic. It is the proteins themselves that contribute to the physiological homeostasis in any cell or tissue. Of particular interest in ART is the secretome, those proteins that are produced within the embryo and secreted into the surrounding environment. Defining the human embryonic secretome has the potential to expand our knowledge of embryonic cellular processes, including the complex dialogue between the developing embryo and its maternal environment, and may also assist in identifying those embryos with the highest implantation potential. Advances in proteomic technologies have allowed the non-invasive profiling of the human embryonic secretome with ongoing research focused on correlation with outcome. From a clinical perspective, embryo selection based on morphological assessment and non-invasive analysis of the human embryonic secretome may improve IVF success and lead to routine single embryo transfers.

Key words: proteomics, embryo, secretome, non-invasive assessment.

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urante la década pasada, ha habido un gran enfoque en la caracterización molecular de diversos sistemas biológicos y estados de enfermedad. El genoma humano consta de ∼25,000 genes y el transcriptoma humano proporciona a los investigadores datos valiosos sobre la expresión genética. Sin embargo, el proteoma humano –definido como el complemento PROteico del genOMA humano– dicta en realidad la función celular y determina en última instancia el fenotipo (Figura 1). Por sí mismo el proteoma es dinámico, cambia constantemente mediante sus propias interacciones, afectado por estímulos internos y externos. Los avances en las técnicas proteómicas han empezado a arrojar luz sobre la diversidad y complejidad del proteoma humano, estimado en más de un millón de proteínas. Una variedad de muestras biológicas está bajo investigación, con insistencia en la identificación de proteínas implicadas en estados de enfermedad específicos, a fin de desarrollar nuevas pruebas diagnósticas y pronósticas.1 De particular interés para los investigadores es el secretoma, las proteínas producidas por células y secretadas en cualquier momento o bajo ciertas condiciones fisiológicas.2 Diversos tipos de fluidos biológicos, incluido el suero y un medio acondicionado, se han analizado en busca de proteínas secretadas que puedan definir un estado particular de enfermedad o progresión.3,4 A partir del análisis de proteomas séricos de una variedad de pacientes con cáncer se descubrió una serie de biomarcadores sustitutos del cáncer. Aunque muy prometedores, algunos de los biomarcadores aptos son relativamente abundantes, compartidos entre diferentes cánceres humanos y sobreexpresados en otras enfermedades humanas, como las autoinmunitarias.3 Es fundamental la validación futura de los biomarcadores oncológicos aptos en grandes cohortes independientes de pacientes. Con el desarrollo de nuevas técnicas proteómicas sensibles, los investigadores se están concentrando en el descubrimiento de proteínas séricas

*

Traducido de: Katz Jaffe MG, McReynolds S, Gardner DK, Schoolcraft WB. The role of proteomics in defining the human embryonic secretome. Reprod Hum Mol 2009;15(5):271-277.

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poco abundantes que son más sensibles y específicas del cáncer. En esta revisión se discute el papel de la proteómica en el estudio del secretoma embrionario de mamíferos. La definición y caracterización del secretoma embrionario de mamífero ampliará nuestro conocimiento de la embriogénesis temprana, promoverá nuestra comprensión del papel embrionario durante la implantación y contribuirá potencialmente al desarrollo de una evaluación no invasiva de viabilidad.

EVALUACIÓN EMBRIONARIA Actualmente, la selección de embriones para transferencia se basa en criterios morfológicos detallados.5 Aunque relativamente exitoso, el campo de la tecnología de reproducción asistida se beneficiaría de más métodos cuantitativos de determinación de la viabilidad para aumentar el éxito de la FIV y disminuir la incidencia de embarazos múltiples.6 Durante la década pasada, una disminución en la cantidad de embriones para transferencia se ha correlacionado con una reducción significativa de embarazos de orden superior.7 Sin embargo, los embarazos gemelares continúan reflejando un alto porcentaje de embarazos por FIV con elevados riesgos para la salud de la madre y los fetos, que incluyen parto prematuro, bajo peso al nacimiento, mortalidad perinatal y otras complicaciones relacionadas con el embarazo.8 Por consiguiente, la promesa de mejorar las tasas de embarazo por FIV con más métodos cuantitativos de selección embrionaria tiene la capacidad de optimizar la transferencia exitosa de embriones individuales.

PROTEÓMICA Y EL EMBRIÓN MAMÍFERO Las proteínas traducidas a partir de transcripciones de ARN son directamente responsables de la función celular como se ilustra en la Figura 1. Aunque valiosos, se ha demostrado que los estudios de expresión genética de estas transcripciones de ARN a menudo no predicen la abundancia de las proteínas o su función. Por ejemplo, en un estudio en células madre embrionarias –en el que se investigaron comparaciones pares de cambios en el ARNm y los niveles de expresión de proteína– se observaron bajos niveles de correlación.9 Además, al examinar la relación entre las proteínas y la abundancia

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desarrollo del embrión.14 Recientemente, los avances en las técnicas proteómicas, con el desarrollo de la espectrometría de masa, han hecho posible identificar grupos de proteínas dentro de cantidades limitadas de fluidos biológicos y tejidos complejos.15,16 ESPECTROMETRÍA DE MASA: UNA HERRAMIENTA PODEROSA EN LA PROTEÓMICA GLOBAL

Figura 1. Diagrama esquemático que esboza la complejidad de la función celular incluidas las técnicas ómicas asociadas: genómica, transcriptómica, proteómica y metabolómica que contribuyen al estudio y comprensión de los sistemas biológicos.

de ARNm en levaduras, se encontró que el análisis de transcripciones de ARNm era insuficiente para predecir la expresión proteica.10 Varios mecanismos, incluida la degradación dirigida de ARNm y de proteína, pueden ser utilizados por la célula durante la regulación de la transcripción-traducción, lo que resulta en falta de asociación entre la expresión genética, las transcripciones de ARN y la expresión proteica. En consecuencia, es vital una investigación a fondo del proteoma humano para entender la función celular y comprender los procesos biológicos y los estados de enfermedad.

A pesar de los nuevos avances en las técnicas proteómicas, el conocimiento del proteoma de embriones mamíferos de preimplantación sigue siendo limitado. El efecto combinado de una plantilla limitada, baja expresión proteica y la falta de sensibilidad de las plataformas proteómicas han contribuido como los obstáculos principales. A pesar de estos obstáculos, ha habido algunas excelentes publicaciones, de las cuales se describe una selección en el Cuadro 1. Los estudios proteómicos tempranos utilizaron electroforesis bidimensional (2D) en gel en combinación con el análisis computarizado de imágenes en gel para construir y analizar las bases de datos de proteínas de embriones de ratón en fase de preimplantación.11,12 La técnica de Western blot también se ha utilizado para identificar la expresión de proteínas conocidas,13 o para detectar modificaciones postranslacionales, como la fosforilación, relacionadas con el

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La espectrometría de masa se ha convertido rápidamente en una tecnología importante en la caracterización proteómica. La búsqueda de una alteración consistente y significativa en el perfil de expresión proteica entre grupos específicos de muestras ha revelado características importantes de un estado de enfermedad o de un proceso fisiológico. La espectrometría de masa supone una fuente de iones para la producción de especies cargadas en la fase gaseosa, y un analizador, que pueda separar iones de acuerdo con su proporción masa-carga (m/z). Algunos métodos de ionización utilizados comúnmente incluyen la ionización por electrospray y la ionización-desorción láser de superficie (SELDI, por sus siglas en inglés), las cuales están acopladas a analizadores de “tiempo de vuelo” (TOF, por sus siglas en inglés), trampa de iones o cuadrupole. La espectrometría de masa SELDI-TOF, con chips de captura específica de afinidad a proteínas, permite el análisis rápido, costo-efectivo y de alto rendimiento de volúmenes pequeños de muestras (rango de microlitros) y permite que la sensibilidad esté en el rango de picomoles a femtomoles. Las proteínas ligadas son activadas con láser liberando de este modo iones gaseosos mediante desorción-ionización. El tubo TOF está bajo un vacío el cual causa que los iones más pequeños viajen más rápido hacia el detector permitiendo de este modo la separación de estos iones de acuerdo con la proporción m/z representada como un perfil de proteína.17 La tecnología se ha aplicado a una serie de tejidos y fluidos biológicos con un especial enfoque en oncoproteómica, incluida la detección temprana, capacidad metastásica y resultado terapéutico de una variedad de diferentes cánceres.18 La identificación de proteínas siguiendo el perfil de espectrometría de masa típicamente se realiza mediante digestión con proteasas generando diferentes productos de escisión identificables

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El papel de la proteómica en la definición del secretoma embrionario humano

Cuadro 1. Publicaciones seleccionadas que destacan el uso de la proteómica en la evaluación y desarrollo embrionario Modelo

Caracterización

Hallazgos clave

Referencia

Ratón

Electroforesis 2D en gel

Latham y col. (1992)11

Ratón

Electroforesis 2D en gel

Conejo

Western blot

Ratón

Western blot

Porcino

EM MALDI-TOF Western blot

Ratón

EM SELDI-TOF

Humano

EM SELDI-TOF

Se construyó una base de datos de proteínas en gel 2D para embrión de ratón. Se caracterizaron los cambios en los patrones de síntesis proteica durante el desarrollo normal de preimplantación desde la fertilización hasta el estadio de blastocisto Se construyeron bases de datos de proteínas para embriones de ratón compactados de ocho células y en estadio de blastocisto. Se documentaron los cambios cuantitativos generales en las concentraciones de proteínas En blastocistos de conejo se expresaron isoformas de proteína transportadora de glucosa sensible a insulina (GLUT4 y GLUT8) y proteína receptora de insulina El aumento en la fosforilación de SAPK/JNK y p38MAPK se correlacionó negativamente con el desarrollo del embrión de ratón La proteína vault mayor (MVP) se acumuló en embriones que no se desarrollaron normalmente in vitro Los embriones que generaron por debajo de 5% (bajo) de oxígeno fueron más parecidos a embriones de ratón derivados in vivo. Las condiciones con oxígeno alto (20%) se asociaron con la regulación a la baja de 10 proteínas-biomarcadores Se identificaron diferentes perfiles proteicos entre los blastocistos tempranos y expandidos, y entre blastocistos en desarrollo y embriones en degeneración

Shi y col. (1994)12

Navarrete Santos y col. (2004)13

Wang y col. (2005)14

Sutovsky y col. (2005)20

Katz-Jaffe y col. (2005)21

Katz-Jaffe y col. (2006a)22

SAPK/JNK: proteína cinasa activada por estrés-cinasa Jun; p38 MAPK: proteína cinasa mitógeno-activada 38; EM MALDI-TOF: espectrometría de masa de desorción-ionización láser asistida por matriz-tiempo de vuelo; EM SELDI-TOF: espectrometría de masa de ionización-desorción láser de superficie-tiempo de vuelo.

con el análisis de espectrometría de masa en tándem y la búsqueda en la base de datos de proteínas.19 Ha comenzado a utilizarse la tecnología de espectrometría de masa como una plataforma proteómica en el estudio del desarrollo del embrión de preimplantación (Cuadro 1). La proteína vault mayor (MVP, por sus siglas en inglés) se identificó como una proteína expresada en embriones de preimplantación porcinos utilizando espectrometría de masa de desorción/ionización láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF, por sus siglas en inglés) y Western blot. Se demostró que la MVP se acumulaba en embriones porcinos de baja calidad que no se desarrollaron normalmente in vitro.20 Además, recientemente la espectrometría de masa SELDI-TOF

se ha utilizado para generar perfiles proteicos en todos los estadios del desarrollo embrionario de mamíferos.21,22 Se observaron diferencias en los perfiles proteicos entre blastocistos tempranos y expandidos, así como entre blastocistos en desarrollo y embriones degenerados.

La búsqueda preliminar en la base de datos identificó algunos de los candidatos proteicos que podrían estar directamente vinculados con la embriogénesis.22 Necesita considerarse la naturaleza dinámica y sensible del proteoma a variables durante la recolección, almacenamiento, manejo y procesamiento de la muestra, y un protocolo consistente necesita estar acompañado de datos proteómicos reproducibles.23 El prejuicio de los datos causado por la calibración de la espectrometría

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de masa y la corriente del instrumento a lo largo del tiempo y entre laboratorios también puede introducir artefactos. Esto puede controlarse corriendo muestras en repeticiones, realizando habitualmente calibraciones internas y externas e incluyendo muestras adecuadas de control con cada serie.

EL SECRETOMA EMBRIONARIO Se propone que los embriones viables poseen un proteoma único con algunas de estas proteínas secretadas en el medio de cultivo circundante contribuyendo potencialmente al secretoma. En consecuencia, un análisis proteómico no invasivo del secretoma de embriones mamíferos a lo largo del desarrollo antes de la implantación puede ayudar a revelar los factores secretados que reflejan competencia y viabilidad de desarrollo.

Uno de los estudios más tempranos del secretoma embrionario humano reveló la liberación de 1-o-alquil2-acetil-sn-glicero-3-fosfocolina (paf), un factor soluble que es producido y secretado por embriones mamíferos de preimplantación. paf funciona de manera autocrina como un factor de supervivencia durante el desarrollo embrionario. También crea un espectro de alteraciones de la fisiología materna que incluyen activación plaquetaria.24 La leptina, un pequeño péptido pleiotrópico, también se ha observado en el medio acondicionado de blastocistos en un modelo humano in vitro para estudiar las interacciones entre el embrión y las células epiteliales endometriales.25 Se demostró que los blastocistos humanos competentes secretaron concentraciones de leptina en el medio circundante más altas que los embriones detenidos. Se ha planteado la hipótesis de que la leptina secretada por el blastocisto inicia un efecto ligando mediado por receptor con receptores de leptina en el endometrio materno estableciendo un diálogo molecular durante la ventana de implantación.26 Se ha demostrado que la acrogranina, una proteína que regula el crecimiento celular epitelial, es secretada en el medio circundante por embriones de ratón en preimplantación.27 Una vez que se agregó acrogranina al medio de cultivo, se promovió la formación del blastocisto. Se cree que la acrogranina actúa directamente en las células trofoectodérmicas de forma autocrina. Además, este estudio reveló que la adición de anticuerpos

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antiacrogranina al medio circundante retrasó el inicio de la formación del blastocisto. Se ha sugerido que la acrogranina es expresada por el útero e influye en el desarrollo embrionario de forma similar a la de la acrogranina agregada exógena que promueve la formación del blastocisto en cultivo.27 Recientemente, Sakkas y col.28 caracterizaron una molécula soluble secretada por los blastocistos humanos que modula la regulación de la expresión de HOXA10 en una línea celular del epitelio endometrial. Esta forma de interacción recíproca embrio-endometrial podría transformar el ambiente uterino local afectando el desarrollo embrionario y el proceso de implantación. Además, la detección de antígeno G leucocitario humano soluble (sHLA-G, por sus siglas en inglés) en el medio de FIV de embriones en el día 3 ha indicado mayores tasas de embarazo en embriones positivos a sHLA-G.29,30 Sin embargo, estos resultados no han sido absolutos con embarazos establecidos a partir de embriones negativos a sHLA-G. Asimismo, se han registrado diferencias técnicas que incluyen la incapacidad de medir la producción de sHLA-G en algunos sobrenadantes.31 En general, cada uno de estos estudios individuales del secretoma se ha enfocado sólo en la variable individual. Al considerar la naturaleza multifactorial del desarrollo embrionario mamífero, sería razonable asumir que se requeriría más de un factor individual para predecir la competencia de desarrollo o el potencial de implantación (o ambos).

ESPECTROMETRÍA DE MASA Y EL SECRETOMA EMBRIONARIO Con la espectrometría de masa SELDI-TOF, se observaron las firmas distintivas del secretoma cada 24 horas del desarrollo embrionario desde el momento de la fertilización hasta el estadio de blastocisto. Estas firmas del secretoma podrían identificar de forma única los estadios del desarrollo embrionario, independiente de la morfología. Se observaron algunas proteínas a lo largo de varios estadios embrionarios, mientras que otras fueron más estadioespecíficas.32 De manera interesante, la comparación de especies entre el secretoma de ratón y el humano reveló una diversidad limitada; similar a la de la proteína paf, la cual se ha observado en el secretoma de todas las especies de mamíferos estudiadas hasta la fecha.24

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La transición desde transcripciones y proteínas maternas heredadas hasta la activación del genoma embrionario y la expresión de proteínas embrionarias clave debe ocurrir para el desarrollo embrionario continuo.33 En particular, se observaron proteínas únicas en el secretoma embrionario después de la activación del genoma embrionario.32 Así, los embriones con un genoma activado correctamente, y por tanto, un proteoma y secretoma embrionario completamente funcional pueden tener un mayor potencial de competencia de desarrollo.

La correlación de las firmas del secretoma con el desarrollo en curso del blastocisto reveló una proteína de 8.5 kDa. La expresión limitada de esta proteína de 8.5 kDa a partir del secretoma de embriones en degeneración, en conjunto con su significativamente alta expresión a partir del secretoma de blastocistos en desarrollo, indica potencialmente una asociación entre esta proteína y la competencia de desarrollo (p < 0.05). La espectrometría de masa en tándem y la base de datos de identificación de secuencias peptídicas indicaron que el mejor candidato para esta proteína de 8.5 kDa era la ubiquitina.32 La ubiquitina es un componente del sistema proteosómico dependiente de ubiquitina, que identifica proteínas para degradación. El sistema está implicado en una serie de procesos fisiológicos que incluyen la proliferación y la apoptosis. Se ha demostrado que la ubiquitina secretada es estimulada en los fluidos corporales en ciertos estados de enfermedad y esta acumulación proporciona evidencia de un aumento en el recambio proteico.34,35 La ubiquitina también se ha implicado en el desempeño de una papel decisivo durante la implantación en mamíferos mediante el control de las actividades y el recambio de moléculas clave en la señalización.36 La investigación en curso está enfocada en la identificación de las proteínas restantes secretadas, así como la correlación con la competencia de desarrollo y la implantación.

Otro aspecto de las técnicas de reproducción asistida que podría beneficiarse del análisis no invasivo es la detección genética preimplantación (PGS, por sus siglas en inglés). La PGS implica la biopsia de cuerpos polares o células embrionarias y se ha convertido en un procedimiento clínico rutinario en muchas clínicas de FIV para la detección de anormalidades cromosómicas específicas en embriones humanos. Los procedimientos de biopsia son invasivos para el embrión en crecimiento

y podrían afectar potencialmente el desarrollo posterior.

Una investigación inicial sobre si los embriones con anormalidades cromosómicas podrían distinguirse de embriones euploides mediante su respectivo secretoma identificó que blastocistos en incubación euploides para 10 cromosomas exhibieron perfiles de secretoma notablemente diferentes a los de blastocistos en incubación aneuploides para 10 cromosomas. Además, los embriones aneuploides en degeneración exhibieron un perfil de secretoma significativamente diferente al de blastocistos aneuploides en incubación.37 Con avances en las técnicas genómicas que permiten un análisis cromosómico exhaustivo de los 23 pares de cromosomas en una célula individual,38 ha llegado a ser realista un abordaje “ómico” integrado, que discrimina las firmas de secretoma entre blastocistos euploides y aneuploides individuales. Se procesaron microgotas de medio de cultivo de FIV consumada de blastocistos individuales de calidad transferible (n = 33) y se analizaron mediante espectrometría de masa SELDI-TOF determinando una huella digital del secretoma del blastocisto.

Cada blastocisto individual se sometió a hibridación genómica comparativa para un análisis cromosómico exhaustivo de los 23 pares de cromosomas; con 19 identificados como euploides y 14 como aneuploides.38 De los 14 blastocistos aneuploides, 9 tuvieron aneuploidía cromosómica única y 5 eran caóticos con más de dos cromosomas implicados. Las huellas digitales del secretoma de blastocistos individuales identificaron firmas proteicas que permitieron la discriminación entre constituciones cromosómicas euploides y aneuploides.39 Después de un análisis estadístico, se identificó una nueva serie de nueve biomarcadores expresados de manera diferencial (p < 0.05). Cada uno de los nueve biomarcadores fue reproducible en las 33 muestras de secretoma clasificando un secretoma-blastocisto euploide de un secretoma-blastocisto aneuploide.39 La Figura 2 muestra cuadros de tres ejemplos de esta serie, incluido un biomarcador que mostró una expresión disminuida en el secretoma de blastocistos aneuploides (p < 0.05, Figura 2A), y dos biomarcadores que se demostró que tienen expresión aumentada en el secretoma de blastocistos aneuploides (p < 0.05, Figura 2B y C). La investigación en curso está enfocada en el aumento del tamaño de la muestra para confirmar la reproducibilidad, incluido

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Katz Jaffe MG y col.

Figura 2. Ejemplos de biomarcadores que se expresaron diferencialmente en las firmas del secretoma de blastocistos euploides (n = 19) comparados con el secretoma de blastocistos aneuploides (n = 14) (p < 0.05).

(A) Cuadro que revela disminución significativa en la expresión de un biomarcador de 3.1 kDa en el secretoma de blastocistos aneuploides comparados con el secretoma de blastocistos euploides (p < 0.0001). (B y C) Dos cuadros que muestran aumento significativo en la expresión de biomarcadores de 2.9 y 5.2 kDa en el secretoma de blastocistos aneuploides comparados con el secretoma de blastocistos euploides (p < 0.002 y p < 0.0009, respectivamente). El eje superior del cuadro indica el percentil 75, y el inferior, el percentil 25. La línea interna representa la mediana.

un análisis prospectivo para validar la discriminación de blastocistos euploides y aneuploides. La capacidad de analizar no invasivamente la combinación de la competencia de desarrollo y la constitución cromosómica podría representar una poderosa herramienta de selección de viabilidad en las técnicas de reproducción asistida.

MICROARREGLO PROTEICO Además de la tecnología de espectrometría de masa, existen otras plataformas proteómicas en investigación que parecen prometedoras para la definición del secretoma embrionario humano. En particular, los

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microarreglos proteicos tienen la ventaja agregada de ofrecer información complementaria a los estudios del transcriptoma, así como eliminar la necesidad de identificación proteica de seguimiento. Recientemente, un estudio que utilizó microarreglos proteicos comparó el medio acondicionado de blastocistos agrupados con un medio de control y reveló el aumento en la expresión del receptor 1 de factor de necrosis tumoral soluble (TNF) e interleucina (IL) 10, y la disminución en la expresión de proteína estimulante de macrófagos (MSP) alfa, factor de células madre (SCF), quimiocina (C-X-C motif) ligando 13 (CXCL13), receptor 3 a ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAILR3) y proteína inflamatoria de macrófagos (MIP) 1beta.40 El análisis adicional que investigó las diferencias potenciales entre el medio acondicionado agrupado de blastocistos que se implantaron versus el medio agrupado que resultó en falla en la implantación reveló disminución significativa de dos proteínas, CSCL13 y GM-CSF, en el medio de blastocistos implantados. Se ha identificado que GM-CSF es una proteína que en medios de cultivo de blastocistos humanos y de ratón promueve el desarrollo embrionario y la implantación.41 La disminución de la expresión de GM-CSF observada por Dominguez y col.40 puede indicar un mecanismo autocrino en el mantenimiento del desarrollo del blastocisto y la implantación potencial.

No se observó aumento significativo de ninguna de las 120 proteínas incluidas en este microarreglo proteico en el medio acondicionado de blastocistos implantados.40 Las grandes cantidades de muestra requeridas y otras limitantes de sensibilidad de la plataforma restringieron el estudio a la investigación de muestras agrupadas en contraste con muestras de medios individuales. Otros asuntos relacionados con la plataforma incluyen el alto costo de los microarreglos proteicos, el bajo número de blancos en comparación con la espectrometría de masa u otras técnicas, y la dependencia de la existencia de anticuerpos e interacciones potenciales no específicas.42 METABOLITOS EN EL SECRETOMA EMBRIONARIO HUMANO Los metabolitos, productos funcionales finales de procesos biológicos, también están bajo investigación en el secretoma mediante métodos basados en espectroscopia

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El papel de la proteómica en la definición del secretoma embrionario humano

junto con bioinformática dirigida.43 Se ha demostrado que estos metabolitos de bajo peso molecular cambian radicalmente para reflejar un estado metabólico y ambiental particular. La espectroscopia infrarroja cercana y la espectroscopia Raman son dos métodos que se han utilizado para detectar biomarcadores específicos del estrés oxidativo en un medio de cultivo agotado con diferencias destacadas en los algoritmos generados para resultados de FIV positivos versus negativos. Se observó que los índices de viabilidad generados a partir del análisis de medios de cultivo agotados fueron mayores para embriones humanos que avanzaron para producir embarazos y nacidos vivos, en comparación con los que no se implantaron.44 Además, un estudio ciego piloto de datos recolectados retrospectivamente, que utilizaron la plataforma Raman de espectroscopia, reveló una precisión diagnóstica general de 80.5% para predecir el potencial reproductivo embrionario, el parto o la falla en la implantación.45 La proteómica y metabolómica son dos plataformas ómicas complementarias en la investigación del secretoma embrionario humano que son prometedoras para el desarrollo de métodos no invasivos de selección de embriones en el campo de las técnicas de reproducción

asistida. Con la capacidad de analizar proteínas y metabolitos en medios de cultivo agotados, lo que genera perfiles moleculares complementarios pero distintos, es factible proponer que la evaluación de viabilidad embrionaria puede incluir una combinación de ambas plataformas.

DISCUSIÓN Los avances en el campo de la proteómica, particularmente las mejoras en la detección de los instrumentos de espectrometría de masa, han hecho posible el análisis de fluidos biológicos complejos limitados, incluidos los medios de cultivo agotados, y han facilitado el análisis rápido, sensible y de alto rendimiento del secretoma.

La investigación en curso del secretoma que utiliza una variedad de plataformas proteómicas continuará proporcionando datos valiosos que aumentarán nuestra comprensión de los procesos biológicos implicados en el desarrollo embrionario de mamíferos (Cuadro 2). Este conocimiento puede contribuir con la evaluación no invasiva de la viabilidad embrionaria para su uso en las técnicas de reproducción asistida. Junto con la morfología, un método cuantitativo no invasivo de selección embrionaria

Cuadro 2. Publicaciones seleccionadas que destacan el uso de la proteómica en la definición del secretoma embrionario Modelo

Caracterización

Ratón

Western blot e inmunopre- La proteína acrogranina fue secretada por embriones cipitación en el medio circundante.

La adición de acrogranina al medio de cultivo estimuló la formación del blastocisto.

La adición de anticuerpos anti-acrogranina al medio de cultivo retrasó la formación del blastocisto ELISA Los blastocistos competentes secretaron concentraciones más altas de leptina que los embriones detenidos ELISA La detección del antígeno leucocitario humano soluble G (sHLA-G) en el medio agotado de FIV tuvo una correlación positiva con el resultado de embarazo EM SELDI-TOF Se identificaron diferentes perfiles de secretoma para cada estadio del desarrollo embrionario.

La ubiquitina, una proteína de 8.5 kDa, fue estimulada en el secretoma de blastocistos en el día 5 de desarrollo Microarreglo proteico Expresión aumentada de receptor 1 de TNF soluble e IL-10, y expresión disminuida de MSP-alfa, SCF, CXCL13, TRAILR3 y MIP-1beta en medio de cultivo de blastocistos. El medio de blastocistos implantados mostró una expresión disminuida de CSCL13 y GM-CSF

Humano Humano

Humano-ratón

Humano

Hallazgos clave

Referencia Díaz-Cueto y col. (2000)27

González y col. (2000)25 Noci y col. (2005)29 y Sher y col. (2005)30 Katz-Jaffe y col. (2006b)32

Domínguez y col. (2008)40

ELISA: ensayo inmunoenzimático ligado a enzimas; TNF: factor de necrosis tumoral.

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Katz Jaffe MG y col.

puede optimizar las transferencias exitosas de embriones individuales, reducir las pérdidas tempranas del embarazo y aumentar la cantidad de nacidos vivos. La definición del secretoma embrionario también proporcionará a los investigadores una visión de las secuencias únicas de eventos que son fundamentales para la implantación exitosa, incluidos los requerimientos más críticos del blastocisto. Si se toma en cuenta la complejidad y diversidad del embrión humano, parece razonable prever una contribución “ómica” combinada con la caracterización del secretoma embrionario humano.

Financiamiento

El financiamiento para pagar los gastos de publicación de Acceso Abierto para este artículo fue proporcionado por BioSymposia Inc.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

Traducción: Adriana Jardón A 18.

REFERENCIAS 1. Dominguez DC, Lopes R, Torres ML. Proteomics: clinical applications. Clin Lab Sci 2007;20:245-248.

2. Hathout Y. Approaches to the study of the cell secretome.

Expert Rev Proteomics 2007;4:239-248.

3. Hu S, Loo JA, Wong DT. Human body fluid proteome analysis. Proteomics 2006;6:6326-6353.

4. Kulasingam V, Diamandis EP. Proteomics analysis of conditioned media from three breast cell lines: a mine for biomarkers and therapeutic targets. Mol Cell Proteomics 2007;6:1997-2011.

5. Ebner T, Moser M, Sommergruber M, Tews G. Selection based on morphological assessment of oocytes and embryos at different stages of preimplantation development: a review. Hum Reprod Update 2003;9:251-262.

6. Sakkas D, Gardner DK. Noninvasive methods to assess embryo quality. Curr Opin Obstet Gynecol 2005;17:283-288.

7. Stern JE, Cedars MI, Jain T, Klein NA, et al. Assisted reproductive technology practice patterns and the impact of embryo transfer guidelines in the United States. Fertil Steril 2007;88:275-282.

8. Pinborg A. IVF/ICSI twin pregnancies: risks and prevention.

Hum Reprod Update 2005;11:575-593.

9. Williamson AJ, Smith DL, Blinco D, Unwin RD, et al. Quantitative proteomics analysis demonstrates post-transcriptional regulation of embryonic stem cell differentiation to hematopoiesis. Mol Cell Proteomics 2008;7:459-472.

10. Gygi SP, Rochon Y, Franza BR, Aebersold R. Correlation between protein and mRNA abundance in yeast. Mol Cell Biol 1999;19:1720-1730.

11. Latham KE, Garrels JI, Chang C, Solter D. Analysis of embryonic mouse development: construction of a high-

158

19.

20.

21.

22.

23.

24.

25.

26.

27.

resolution, two-dimensional gel protein database. Appl Theor Electrophor 1992;2:163-170.

Shi CZ, Collins HW, Garside WT, Buettger CW, et al. Protein databases for compacted eight-cell and blastocyst-stage mouse embryos. Mol Reprod Dev 1994;37:34-47.

Navarrete Santos A, Tonack S, Kirstein M, Kietz S, Fischer B. Two insulin-responsive glucose transporter isoforms and the insulin receptor are developmentally expressed in rabbit preimplantation embryos. Reproduction 2004;128:503-516.

Wang Y, Puscheck EE, Lewis JJ, Trostinskaia AB, et al.

Increases in phosphorylation of SAPK/JNK and p38MAPK correlate negatively with mouse embryo development after culture in different media. Fertil Steril 2005;1:1144-1154.

Gutstein HB, Morris JS, Annangudi SP, Sweedler JV. Microproteomics: analysis of protein diversity in small samples.

Mass Spectrom Rev 2008;27:316-330.

Jansen C, Hebeda KM, Linkels M, Grefte JM, et al. Protein profiling of B-cell lymphomas using tissue biopsies: A potential tool for small samples in pathology. Cell Oncol 2008;30:27-38.

Seibert V, Wiesner A, Buschmann T, Meuer J. Surfaceenhanced laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (SELDI TOF-MS) and ProteinChip technology in proteomics research. Pathol Res Pract 2004;200:83-94.

Cho WC. Contribution of oncoproteomics to cancer biomarker discovery. Mol Cancer 2007;6:25.

Liebler DC. Introduction to Proteomics: Tools for the New Biology. New Jersey: Humana Press; 2002.

Sutovsky P, Manandhar G, Laurincik J, Letko J, et al. Expression and proteasomal degradation of the major vault protein (MVP) in mammalian oocytes and zygotes. Reproduction 2005;129:269-282.

Katz-Jaffe MG, Linck DW, Schoolcraft WB, Gardner DK. A proteomic analysis of mammalian preimplantation embryonic development. Reproduction 2005;130:899-905.

Katz-Jaffe MG, Gardner DK, Schoolcraft WB. Proteomic analysis of individual human embryos to identify novel biomarkers of development and viability. Fertil Steril 2006a;85:101-107.

Hu J, Coombes KR, Morris JS, Baggerly KA. The importance of experimental design in proteomic mass spectrometry experiments: some cautionary tales. Brief Funct Genomic Proteomic 2005;3:322-331.

O’Neill C. The role of paf in embryo physiology. Hum Reprod Update 2005;11:215-228.

Gonzalez RR, Caballero-Campo P, Jasper M, Mercader A, et al. Leptin and leptin receptor are expressed in the human endometrium and endometrial leptin secretion is regulated by the human blastocyst. J Clin Endocrinol Metab 2000;85:4883-4888.

Cervero A, Horcajadas JA, Dominguez F, Pellicer A, Simon C. Leptin system in embryo development and implantation: a protein in search of a function. Reprod Biomed Online 2005;10:217-223.

Díaz-Cueto L, Stein P, Jacobs A, Schultz RM, Gerton GL. Modulation of mouse preimplantation embryo development by acrogranin (epithelin/granulin precursor). Dev Biol 2000;217:406-418.

Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción Volumen 3, núm. 4, abril-junio, 2011

El papel de la proteómica en la definición del secretoma embrionario humano

28. Sakkas D, Lu C, Zulfikaroglu E, Neuber E, Taylor HS. A soluble molecule secreted by human blastocysts modulates regulation of HOXA10 expression in an epithelial endometrial cell line. Fertil Steril 2003;80:1169-1174.

29. Noci I, Fuzzi B, Rizzo R, Melchiorri L, et al. Embryonic soluble HLA-G as a marker of developmental potential in embryos. Hum Reprod 2005;20:138-146.

30. Sher G, Keskintepe L, Fisch JD, Acacio BA, et al. Soluble human leukocyte antigen G expression in phase I culture media at 46 hours after fertilization predicts pregnancy and implantation from day 3 embryo transfer. Fertil Steril 2005;83:1410-1413.

31. Sargent I, Swales A, Ledee N, Kozma N, et al. sHLA-G production by human IVF embryos: can it be measured reliably? J Reprod Immunol 2007;75:128-132.

32. Katz-Jaffe MG, Schoolcraft WB, Gardner DK. Analysis of protein expression (secretome) by human and mouse preimplantation embryos. Fertil Steril 2006;86:678-685.

33. Telford NA, Watson AJ, Schultz GA. Transition from maternal to embryonic control in early mammalian development: a comparison of several species. Mol Reprod Dev 1990;26:90-100.

34. Sandoval JA, Hoelz DJ, Woodruff HA, Powell RL, et al. Novel peptides secreted from human neuroblastoma: useful clinical tools? J Pediatr Surg 2006;41:245-251.

35. Delbosc S, Haloui M, Louedec L, Dupuis M, et al. Proteomic analysis permits the identification of new biomarkers of arterial wall remodeling in hypertension. Mol Med 2008;14:383-394.

36. Wang HM, Zhang X, Qian D, Lin HY, et al. Effect of ubiquitinproteasome pathway on mouse blastocyst implantation and expression of matrix metalloproteinases-2 and -9. Biol Reprod 2004;70:481-487.

37. Katz-Jaffe MG, Stevens J, Kearns WG, Gardner DK, Schoolcraft WB. Relationship between embryonic secretome

and chromosomal abnormalities in human IVF. Fertil Steril 2006;86:S57.

38. Fragouli E, Lenzi M, Ross R, Katz-Jaffe MG, et al. Comprehensive molecular cytogenetic analysis of the human blastocyst stage. Hum Reprod 2008;23:2596-2608.

39. Katz-Jaffe MG, Fagouli E, Fillipovits J, Wells D, Schoolcraft WB. Relationship between the human blastocyst secretome and chromosomal constitution. Fertl Steril 2008;90:S80.

40. Dominguez F, Gadea B, Esteban FJ, Horcajadas JA, et al. Comparative protein-profile analysis of implanted versus non-implanted human blastocysts. Hum Reprod 2008;23:1993-2000.

41. Robertson SA. GM-CSF regulation of embryo development and pregnancy. Cytokine Growth Factor Rev 2007;18:287298.

42. Spisak S, Tulassay Z, Molnar B, Guttman A. Protein microchips in biomedicine and biomarker discovery. Electrophoresis 2007;28:4261-4273.

43. Brison DR, Hollywood K, Arneson R, Goodacre R. Predicting human embryo viability: the road to non-invasive analysis of the secretome using metabolic footprinting. Reprod Biomed Online 2007;15:296-302.

44. Seli E, Sakkas D, Scott R, Kwok SC, et al. Noninvasive metabolomic profiling of embryo culture media using Raman and near-infrared spectroscopy correlates with reproductive potential of embryos in women undergoing in vitro fertilization. Fertil Steril 2007;88:1350-1357.

45. Scott R, Seli E, Miller K, Sakkas D, et al. Noninvasive metabolomic profiling of human embryo culture media using Raman spectroscopy predicts embryonic reproductive potential: a prospective blinded pilot study. Fertil Steril 2008;90:77-83.

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Artículo de revisión

Fragmentación del ADN espermático: mecanismos de origen, repercusión en los resultados reproductivos y análisis* Denny Sakkas, Juan G Álvarez Actualmente, la fragmentación del ADN en el espermatozoide se ha convertido en un punto focal para el diagnóstico y tratamiento de la infertilidad. Conocer los mecanismos que inducen el daño puede ayudarnos a lograr mejores tratamientos y a analizar las posibilidades de embarazo.

Hoy día, además de existir varias pruebas diagnósticas, también se han desarrollo y aplicado algunas técnicas para seleccionar espermatozoides, las cuales deben ser del conocimiento general.

RESUMEN Objetivo: revisar los mecanismos responsables de la fragmentación del ADN en los espermatozoides humanos, incluidos los que ocurren durante la espermatogénesis y el transporte a través del aparato reproductivo. Los mecanismos examinados incluyen: apoptosis en el epitelio de los túbulos seminíferos, defectos en la remodelación de la cromatina durante el proceso de espermiogénesis, daño al ADN inducido por radicales de oxígeno durante la migración de los espermatozoides desde los túbulos seminíferos hacia el epidídimo, activación de las caspasas y endonucleasas espermáticas, daño inducido por quimio y radioterapia y el efecto de los tóxicos ambientales. También se discuten las diferentes pruebas utilizadas actualmente para el análisis de fragmentación de ADN espermático y los factores que determinan el valor predictivo de la prueba de fragmentación de ADN espermático y sus implicaciones en el diagnóstico y tratamiento de la infertilidad. Finalmente, también se escudriña cómo las roturas de las cadenas de ADN en el genoma embrionario o las modificaciones de nucleótidos del ADN heredados del genoma paterno podrían afectar al embrión y la descendencia. En particular se discute cómo los espermatozoides anormales pueden ser tratados por el ovocito y cómo las anormalidades en el ADN espermático –que no hayan sido reparadas satisfactoriamente por el ovocito después de la fertilización– pueden interferir con el desarrollo embrionario y fetal normal.

Conclusiones: el ADN espermático puede modificarse a través de varios mecanismos. La integridad del genoma paterno es, por tanto, de suma importancia en el inicio y mantenimiento de un embarazo viable en la concepción natural y en un procedimiento asistido de reproducción. La necesidad de diagnosticar los espermatozoides a nivel nuclear es un área que requiere mayor conocimiento para mejorar el tratamiento de la pareja infértil.

Palabras clave: fragmentación de ADN, fertilización in vitro, radicales de oxígeno, estrés oxidativo, caspasas, endonucleasas, quimioterapia, radiación ionizante.

ABSTRACT Objective: To review the mechanisms responsible for DNA fragmentation in human sperm, including those occurring during spermatogenesis and transport through the reproductive tract. The mechanisms examined include: apoptosis in the seminiferous tubule epithelium, defects in chromatin remodeling during the process of spermiogenesis, oxygen radical-induced DNA damage during sperm migration from the seminiferous tubules to the epididymis, the activation of sperm caspases and endonucleases, damage induced by chemotherapy and radiotherapy, and the effect of environmental toxicants. The different tests currently used for sperm DNA fragmentation analysis and the factors that determine the predictive value of sperm DNA fragmentation testing and their implications in the diagnosis and treatment of infertility are also discussed. Finally, we also scrutinize how the presence in the embryonic genome of DNA strand breaks or modifications of DNA nucleotides inherited from the paternal genome could impact the embryo and offspring.

In particular we discuss how abnormal sperm could be dealt with by the oocyte and how sperm DNA abnormalities, which have not been satisfactorily repaired by the oocyte after fertilization, may interfere with normal embryo and fetal development.

Conclusion(s): Sperm DNA can be modified through various mechanisms. The integrity of the paternal genome is therefore of paramount importance in the initiation and maintenance of a viable pregnancy both in a natural conception and in assisted reproduction.

The need to diagnose sperm at a nuclear level is an area that needs further understanding so that we can improve treatment of the infertile couple.

Key words: DNA fragmentation, in vitro fertilization, oxygen radicals, oxidative stress, caspases, endonucleases, chemotherapy, ionizing radiation.

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Fragmentación del ADN espermático

L

os espermatozoides con daño en el ADN son capaces de fertilizar de manera eficiente un óvulo.1-3 Sin embargo, la pregunta sigue siendo cuáles son los efectos más probables en el desarrollo embrionario y fetal normal cuando el genoma paterno introduce nucleótidos o ADN con daños que no han sido reparados por el ovocito después de la fertilización.4-7 Una cantidad relativamente alta de mujeres no logra tener un embarazo a pesar de la ausencia aparente de un factor masculino o femenino de infertilidad. Es probable que muchas de estas parejas tengan un factor masculino de infertilidad de tipo genómico, el cual puede incluir daño en el ADN espermático, alteraciones meióticas o aneuploidía espermática. Sin embargo, la capacidad del ovocito y del embrión humano de reparar el daño al ADN es poco conocida y nuestro conocimiento actualmente se limita a un cierto número de estudios de expresión genética que muestran que el embrión y el ovocito están equipados con mecanismos para hacer frente a algunas anomalías en el ADN paterno.8,9 Primero, la capacidad del ovocito de iniciar la reparación depende, en gran medida, de la calidad citoplásmica y genómica del ovocito, la cual es afectada de manera importante por el aumento de la edad. Segundo, la calidad del ADN espermático presente en un espermatozoide está cada vez más ligada a la edad paterna10 y esto puede agravar aún más la disminución de la tasa de embarazo observada en mujeres de edad avanzada.11 Se ha postulado que, en embriones generados in vivo e in vitro, la presencia por encima de un umbral crítico de daño sin reparar en el ADN explica el bloqueo en el desarrollo embrionario observado después de la implantación en embriones con un cariotipo normal. Estudios recientes sugieren que este tipo de daño se expresa durante y después de la implantación y se ha caracterizado como efecto paterno tardío.12,13 También hay indicios de altos niveles de daño en el ADN en una muestra de esperma con incapacidad para obtener blastocistos14 y se cree que, entre la activación posembrionaria del genoma

*

Traducido de: Sakkas D, Alvarez JG. Sperm DNA fragmentation: mechanisms of origin impact on reproductive outcome, and analysis. Fertil Steril 2010;93(4):1027-1036.

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y el estadio de blastocisto, se produce cierta pérdida de embriones de preimplantación.15,16 El daño en el ADN encontrado en el embrión no siempre se relaciona con el daño en el ADN en el espermatozoide que fertilizó el ovocito. Un nivel significativo de anormalidades del ADN surge del ovocito. Si se toman como ejemplo estudios de aneuploidía, los problemas en el ovocito siguen siendo el factor que más contribuye.17,18 Las técnicas analíticas futuras pueden concentrarse en el uso combinado de sondas cromosómicas y pruebas de fragmentación de ADN en biopsias de embriones, lo que permitiría un análisis más robusto, que incluya no sólo el diagnóstico de enfermedades monogénicas y aneuploidía, sino también el grado de daño del ADN en el embrión, lo que permitiría seleccionar embriones de la más alta calidad genómica. Otra estrategia potencial para examinar si el daño al ADN ha sido o no reparado por el ovocito o el embrión sería mediante el análisis de fragmentación de ADN en células trofoblásticas obtenidas mediante biopsia del blastocisto.

MECANISMOS DE FRAGMENTACIÓN DEL ADN ESPERMÁTICO ¿Cómo ocurre el daño al ADN espermático? El daño al ADN en los espermatozoides puede afectar al ADN mitocondrial y al ADN nuclear y puede ser inducido mediante seis mecanismos principales. Éstos pueden ocurrir durante la producción o el transporte de las células espermáticas e incluyen (Figura 1): 1) apoptosis durante el proceso de espermatogénesis; 2) roturas en las cadenas de ADN producidas durante la remodelación de la cromatina espermática durante el proceso de espermiogénesis; 3) fragmentación postesticular del ADN inducida principalmente por radicales de oxígeno (incluidos el radical hidroxil y óxido nítrico) durante el transporte espermático a través de los túbulos seminíferos y el epidídimo; 4) fragmentación del ADN inducida por caspasas endógenas y endonucleasas, y 6) daño al ADN inducido por tóxicos ambientales.

De estos seis mecanismos, el daño postesticular durante el transporte de los espermatozoides a través del epidídimo puede tener una participación importante en el origen de la fragmentación del ADN espermático.

Esto está apoyado por informes previos que demuestran

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Sakkas D y Álvarez JG

Figura 1. Mecanismos principales de inducción de daño al ADN en espermatozoides durante la producción o el transporte de las células espermáticas: (i) apoptosis durante el proceso de espermatogénesis; (ii) roturas en las cadenas de ADN producidas durante la remodelación de la cromatina espermática durante el proceso de espermiogénesis; (iii) fragmentación postesticular del ADN inducida principalmente por radicales de oxígeno durante el transporte espermático a través de los túbulos seminíferos y el epidídimo (el aumento del daño en el ADN está indicado por el tamaño de los destellos rojos y el oscurecimiento gradual en el tracto); (iv) fragmentación del ADN inducida por caspasas endógenas y endonucleasas; (v) daño en el ADN inducido por radio y quimioterapia; y (vi) daño en el ADN inducido por tóxicos ambientales.

Sakkas. Sperm DNA fragmentation. Fertil Steril 2010.

que la fragmentación del ADN es mayor en el esperma epididimal caudal y eyaculado19,20 en comparación con los espermatozoides testiculares. Informes recientes confirmaron esta hipótesis.21 Sin embargo, la pregunta sigue siendo si las fallas durante la espermatogénesis han hecho al esperma más susceptible al daño postesticular.

Inducción de la apoptosis durante el proceso de espermatogénesis

Durante el proceso de espermatogénesis el mecanismo de selección de células germinales gobernado por la célula de Sertoli es responsable de la inducción de la apoptosis en 50 a 60% de todas las células germinales

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que entran en la meiosis I. Estas células están asignadas con marcadores apoptóticos de tipo Fas y deben ser fagocitadas y eliminadas por la célula de Sertoli con la que estas células germinales están asociadas.22-24 Sin embargo, este mecanismo no siempre puede operar eficazmente y un porcentaje variable de estas células germinales defectuosas entra en el proceso de remodelación espermática durante la espermiogénesis y posteriormente aparecen en la eyaculación. En relación con la falla de este mecanismo de selección, los resultados de un estudio reciente de Burrello y coautores25 sugieren que existe una disociación entre la calidad genómica en la célula germinal y la remodelación espermática que ocurre durante el

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Fragmentación del ADN espermático

proceso de espermiogénesis. Es decir, una célula germinal puede tener su núcleo “desorganizado” por la apoptosis o ser aneuploide y, aún así, los espermatozoides tendrán una morfología normal. Por tanto, cuando un espermatozoide con morfología normal es microinyectado no necesariamente significa que la calidad genómica también es normal. De manera interesante, recientemente se propuso que el mecanismo de apoptosis en la espermiogénesis puede estar menos relacionado con el de muerte celular, pero ser más responsable del proceso de “desprendimiento” del citoplasma en los estadios finales de la maduración espermática.26 Se ha demostrado que en hombres con oligospermia, la probabilidad de que un espermatozoide con morfología normal sea aneuploide es mucho mayor que cuando el hombre es normospérmico.25 Probablemente esto está relacionado con la detención parcial de la maduración asociada con alteraciones meióticas. El hecho de que un porcentaje variable de espermatozoides en la eyaculación exprese marcadores apoptóticos, por ejemplo, Fas, fosfatidilserina, Bcl-XL, p53,27-30 indica que este fenómeno podría ser utilizado para seleccionar espermatozoides no apoptóticos a partir de muestras de semen.31 Un método introducido recientemente con este propósito es el uso de microesferas anexina-V-conjugadas (ANMB Microbead Kit; Miltenyl Biotec, Alemania). El principio en el que se basan estas columnas es que los espermatozoides apoptóticos expresan fosfatidilserina en la hoja externa de la membrana espermática y se fijan a la anexina-V. Cuando se aplica un campo magnético a las columnas, los espermatozoides unidos a anexina-V se conjugan con las microesferas magnéticas y son retenidos en la columna, mientras que los espermatozoides no apoptóticos pasan a través de la columna.32 Roturas de ADN durante el proceso de espermiogénesis

Las alteraciones en la reestructuración de la cromatina durante el proceso de espermiogénesis puede resultar en la fragmentación del ADN. McPherson y Longo33-35 postularon que la existencia de cortes de ADN en los espermatozoides eyaculados puede ser un indicador de una maduración incompleta durante la espermiogénesis.

Postularon que el empaquetado de cromatina puede requerir la actividad de nucleasas endógenas para crear y

ligar cortes que facilitan la protaminación. Se cree que estos cortes proporcionan alivio a la tensión torsional para ayudar al arreglo de la cromatina durante el reemplazo de las histonas por protaminas y se cree que ocurre el mismo procedimiento en humanos.36 Las alteraciones en el control de este proceso pueden resultar en anomalías en el empaquetamiento de la cromatina o cortes no reparados de ADN. Estas roturas de ADN ocurrirían antes de la espermiación y es probable que los hagan más susceptibles al ataque postesticular.

Fragmentación postesticular de ADN espermático

Estudios recientes muestran que los espermatozoides inmaduros, los cuales producen altos niveles de ROS, pueden inducir daño en el ADN de espermatozoides maduros. Este daño se produciría después de la espermiación durante la comigración de espermatozoides maduros e inmaduros desde los túbulos seminíferos hacia la cola del epidídimo.20 Aunque la vida media de ROS es del orden de nanosegundos a microsegundos, debido a que los espermatozoides están altamente comprimidos en el epidídimo, esto facilitaría el daño al ADN inducido por ROS. El ROS puede dañar el ADN espermático directa o indirectamente a través de la activación de caspasas y endonucleasas espermáticas. Esto es consistente con el hecho de que la cocentrifugación de espermatozoides inmaduros (que producen altas concentraciones de ROS) con espermatozoides maduros resulta en la inducción de fragmentación de ADN espermático en espermatozoides maduros, debido a que bajo estas condiciones, los espermatozoides maduros e inmaduros están en contacto estrecho.37 Esto también es consistente con el hecho de que la exposición in vitro de los espermatozoides maduros a ROS resulta en daño significativo al ADN. 3,38 Asimismo, las células epiteliales del epidídimo también podrían desempeñar un papel activo en el daño al ADN inducido por ROS, 1) a través de ROS, como el radical hidroxil o el óxido nítrico39 o 2) a través de la activación de caspasas y endonucleasas espermáticas mediante factores fisicoquímicos, como temperatura alta40 y factores ambientales.41 En el primer caso, este daño teóricamente podría prevenirse con el consumo de antioxidantes, mientras que en el segundo caso este tratamiento no sería efectivo.

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Sakkas D y Álvarez JG

Esto está apoyado por el estudio de Greco y colaboradores 19 en el que el consumo de antioxidantes resultó en reducción significativa de los niveles de fragmentación del ADN espermático. Sin embargo, debe tenerse cuidado cuando se utiliza terapia antioxidante. Se informó que algunos antioxidantes, como la vitamina C, pueden aumentar la compactación de cromatina reduciendo el entrecruzamiento disulfuro en las protaminas espermáticas.42 Lo más probable es que los espermatozoides con niveles mayores de daño al ADN serían los que adquieren niveles menores de entrecruzamiento disulfuro en su cromatina espermática durante el proceso de maduración espermática en el epidídimo. Una característica interesante que ha surgido de estudios recientes es que, en general, el grado de fragmentación del ADN espermático en espermatozoides eyaculados es más alto que en los espermatozoides testiculares19,43 y en los espermatozoides del cuerpo y la cola del epidídimo –que son precisamente donde se lleva a cabo el proceso de entrecruzamiento disulfuro– y que la inducción de la fragmentación del ADN espermático en el epidídimo podría estar relacionada con su calidad genómica. Es decir, además del mecanismo de selección ejercido por la célula de Sertoli durante el proceso de espermatogénesis, habría otro mecanismo de selección en el epidídimo dirigido a eliminar los espermatozoides defectuosos genómicamente.21 El daño potencial que los espermatozoides pueden experimentar durante el paso a través del epidídimo podría limitarse eliminándolos antes de ese paso. Esto tiene mayor importancia clínica en los casos de niveles altos de fragmentación del ADN en el semen y de fracaso repetido de la FIV, donde podría recurrirse al uso de espermatozoides testiculares obtenidos por la extracción de esperma testicular (TESA o TESE, por sus siglas en inglés); preferentemente TESA, ya que es menos invasivo y tendría mayor aceptación por el ginecólogo y la paciente. Esto está apoyado por los resultados informados por Greco y colaboradores,19 en los que la microinyección de espermatozoides testiculares en pacientes que previamente mostraron falla con su esperma eyaculado, con niveles de fragmentación de ADN en semen >15%, medido por etiquetado terminal Tdt-dUTP-mediado (TUNEL, por sus siglas en inglés),

164

resultó en una tasa de embarazo clínica de 44.4% comparada con una tasa de embarazo clínica de 0% con espermatozoides eyaculados.

La fragmentación de ADN espermático inducida por el radical hidroxil y la radiación ionizante causa la formación de 8-OH-guanina y 8-OH-2’-desoxiguanosina (8-OHdG) en un primer estadio y posteriormente, fragmentación monocatenaria del ADN.44 Además, la formación del radical hidroxil puede resultar en la inducción de daño bicatenario al ADN espermático mediante la activación de caspasas y endonucleasas espermáticas.

Aunque el daño del primer tipo puede ser reparado por el ovocito o el embrión, la fertilización de un ovocito por un espermatozoide con fragmentación bicatenaria extensa del ADN es prácticamente no reparable e incompatible con el desarrollo embrionario y fetal normal.

Activación de caspasas y endonucleasas

La activación de caspasas y endonucleasas espermáticas por radicales de oxígeno y factores fisicoquímicos también puede inducir fragmentación del ADN. Estudios previos indican que la exposición del esperma de ratón a una temperatura de 40°C aumenta significativamente la fragmentación del ADN espermático.45 Recientemente, Banks y colaboradores40 demostraron la inducción de fragmentación del ADN espermático después de la exposición in vivo de testículos de ratón a una temperatura de 42°C. Debido a que el aumento en la fragmentación del ADN espermático observada en estos ratones ocurrió dentro de una hora después de la exposición al calor, los investigadores concluyeron que el daño observado debe haber ocurrido en el epidídimo y podría haber sido causado por ROS o por la activación de caspasas y endonucleasas espermáticas. Si se considera que los núcleos del esperma de ratón están empaquetados más homogéneamente, la probabilidad de que el esperma humano sea susceptible al calor es mucho mayor, debido a las menores concentraciones de protaminas en los núcleos y a la mayor heterogeneidad del empaquetado nuclear.46 Fragmentación del ADN inducida por quimioterapia y radioterapia

Se reportó que la exposición a quimioterapia y radioterapia puede resultar en la inducción de fragmentación del

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Fragmentación del ADN espermático

ADN espermático. Se cree que los tratamientos contra el cáncer afectan negativamente la fertilidad masculina y que la reducción en la producción de espermatozoides surge de los efectos citotóxicos de la quimio o radioterapia en el epitelio espermatogénico.47 Aunque en pacientes con cáncer el examen del ADN espermático ha sido limitado, un estudio reciente de O’Flaherty y colaboradores48 encontró que la integridad y compactación del ADN espermático estaban afectadas en pacientes con cáncer testicular y linfoma de Hodgkin antes de la quimioterapia. Al examinar las diferentes técnicas de evaluación del daño al ADN los investigadores concluyeron que aunque el ensayo de estructura de cromatina espermática (SCSA, por sus siglas en inglés), el TUNEL y el ensayo cometa detectaron daño en el ADN, este último era óptimo para ser utilizado en pacientes con cáncer. Se cree que una combinación del ensayo cometa con pruebas que evalúan la compactación del ADN espermático, tal como ensayos mBBr y CMA3 basados en citometría de flujo, es una estrategia confiable para caracterizar la calidad de la cromatina espermática en pacientes con cáncer al momento del almacenamiento de esperma.

Daño al ADN inducido por tóxicos ambientales

Estudios previos proporcionaron evidencia de una asociación entre la exposición a niveles altos de contaminación del aire y aumento en el daño al ADN en espermatozoides humanos. En un estudio reciente, Rubes y colaboradores41 ampliaron estas observaciones y abordaron la hipótesis de que los hombres que son homocigotos nulos para la glutatión-S-transferasa M1 son menos capaces de detoxificar metabolitos reactivos de hidrocarburos aromáticos policíclicos carcinógenos encontrados en la contaminación del aire. Por consiguiente, estos hombres son más susceptibles a los efectos de la contaminación del aire en la cromatina espermática. Con un diseño de estudio longitudinal en el cual los hombres proporcionaron muestras de semen durante periodos de contaminación de aire baja (basal) y episódicamente alta, los investigadores encontraron una asociación estadísticamente significativa entre el genotipo nulo para glutatión-S-transferasa M1 y el aumento de la fragmentación del ADN espermático. Además, los hombres con genotipo nulo para glutatión-S-transferasa

M1 también mostraron niveles más altos de fragmentación del ADN espermático en respuesta a la exposición a contaminación intermitente del aire.41 PRUEBAS DE FRAGMENTACIÓN DEL ADN Durante las pasadas dos décadas se introdujo una serie de pruebas para el análisis de la fragmentación del ADN espermático. Estas pruebas incluyen TUNEL,49 cometa,50 CMA3,51 traducción de cortes in situ,46,52, DBD-FISH (hibridación in situ de fluorescencia para detección de roturas de ADN),53 prueba de dispersión de cromatina espermática (SCD, por sus siglas en inglés)54 y SCSA.55-58 Un aspecto importante en el análisis de la fragmentación del ADN espermático es la pregunta relacionada con el tipo de roturas producidas en las cadenas de ADN, por ejemplo, si las roturas son mono o bicatenarias y si requieren un paso inicial de desnaturalización para detectar roturas en el ADN, como el SCSA, SCD, 54 o el cometa, con un pH ácido o alcalino. 59 De hecho, cuando el daño al ADN se observa bajo condiciones ácidas o alcalinas –y no bajo condiciones de pH neutro– deberíamos estar hablando de sitios de ADN ácido-alcalino lábiles.10 Asimismo, las pruebas TUNEL,49 de traducción de cortes in situ (ISNT, por sus siglas en inglés)46 y el ensayo cometa a pH neutro60 no requieren un paso inicial de desnaturalización y, por tanto, miden las roturas monocatenarias (ISNT, TUNEL y cometa) o bicatenarias (TUNEL y cometa) directamente. Debido a que el pH intracelular en el ovocito es de alrededor de 7.0,61,62 las roturas monocatenarias de ADN o los sitios ácido-alcalino lábiles no deben ser de consecuencias significativas en la formación del pronúcleo masculino, ya que a un pH neutro las cadenas de ADN no se disociarían y, por tanto, este tipo de daño sería más fácil de reparar que el daño bicatenario en el ADN. Por tanto, como un primer examen, podríamos considerar dos tipos de pruebas: 1) pruebas que miden el daño al ADN directamente, como TUNEL, ISNT, o cometa a pH neutro, y 2) pruebas que miden el daño al ADN después de la desnaturalización, como SCSA, SCD y cometa a pH ácido o alcalino.59 Un estudio reciente reportado por Borini y colaboradores13 mostró que los valores de fragmentación del

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ADN espermático en alícuotas de los mismos espermatozoides utilizados para FIV, valorados mediante TUNEL, se correlacionaron significativamente con el resultado del embarazo. Esto tiene un marcado contraste con los resultados reportados por Bungum y colaboradores,63 quienes no encontraron correlación entre los valores de fragmentación del ADN espermático en las muestras utilizadas para FIV, medidos por la prueba SCSA, y el resultado del embarazo.

Es importante observar que aunque la prueba TUNEL se utiliza frecuentemente para la determinación de la apoptosis celular, la positividad del TUNEL no es sinónimo de apoptosis, ya que el daño al ADN inducido por el radical hidroxil o la radiación ionizante también causa fragmentación del ADN que puede ser detectada como un resultado positivo por la prueba TUNEL.64 El concepto reportado en muchos artículos de evaluación del ADN espermático que establece que la prueba TUNEL se asocia con la apoptosis es una gran sobreestimación de la capacidad de esta prueba.

Hasta la fecha, la prueba estudiada más extensamente desde el punto de vista clínico es la prueba SCSA, desarrollada por Evenson y colaboradores.55,58,65-68 La prueba SCSA, según Evenson, mide la susceptibilidad del ADN a la desnaturalización después de la exposición a un ácido débil. El ADN de espermatozoides con una estructura de cromatina normal no se desnaturaliza, mientras que si el ADN está algo dañado y contiene roturas en las cadenas de ADN, éste puede alcanzar diferentes grados de desnaturalización. Para determinar el grado de desnaturalización del ADN espermático, después del tratamiento con un ácido débil, las células espermáticas son teñidas con naranja de acridina. Debido a que el naranja de acridina es un fluorocromo metacromático, muestra fluorescencia verde cuando está intercalado entre ADN bicatenario intacto y muestra fluorescencia roja en ADN monocatenario. El grado de daño al ADN es medido por citometría de flujo y se expresa como índice de fragmentación del ADN o IFA. Estudios previos indican que un valor IFA > 27% se asocia con falla de embarazo en tecnología de reproducción asistida.57,69 Sin embargo, como se indicó, informes recientes desafían el valor predictivo de la prueba SCSA.2,70,71 Sin embargo, debe advertirse que la prueba SCSA se ha

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sometido a mayor escrutinio que otras pruebas y que otros estudio clínicos pueden revelar limitaciones en otras pruebas, como las pruebas TUNEL y SCD/Halo.

VALOR PREDICTIVO DE LAS PRUEBAS DE FRAGMENTACIÓN DE ADN ESPERMÁTICO El valor predictivo de las pruebas de fragmentación del ADN espermático depende de una serie de factores. Éstos incluyen: 1. Tipo de daño al ADN: daño monocatenario versus bicatenario al ADN. Como aproximación general, el daño monocatenario al ADN es de mejor pronóstico y más fácil de reparar que el daño bicatenario al ADN. Como se comentó, la fragmentación monocatenaria del ADN puede ser causada por cortes en el ADN no reparados durante el proceso de remodelación de la cromatina. También podría estar causada por daño inducido por radicales de oxígeno. El daño bicatenario al ADN habitualmente es causado por apoptosis, hidrólisis por caspasas y endonucleasas, y por daño inducido por radicales de oxígeno mediante la activación de caspasas y endonucleasas. La extensión del daño bicatenario al ADN inducido por radicales de oxígeno durante el paso de los espermatozoides a través del epidídimo puede estar determinada no sólo por los niveles de radicales de oxígeno producidos por espermatozoides inmaduros, células epiteliales de epidídimo o leucocitos activados, sino también por los niveles de enzimas antioxidantes presentes en la luz del epidídimo.39 2. Porcentaje de espermatozoides con daño en el ADN. A la fecha la mayor parte de los estudios han analizado este aspecto de la relación entre la fertilidad y el daño al ADN espermático. En general, los resultados apuntan a mayor utilidad de las pruebas de ADN espermático en relación con la concepción natural e inseminación intrauterina antes que los tratamientos de tecnología de reproducción asistida, como FVI normal e inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI, por sus siglas en inglés).72 Es importante tener en cuenta que la calidad del ADN espermático en los espermatozoides utilizados en la fertilización es el único factor im-

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Fragmentación del ADN espermático

portante. En las técnicas, como FIV o ICSI, aunque un alto porcentaje de espermatozoides de la muestra puede tener ADN dañado, todavía puede seleccionarse un espermatozoide “sin daño al ADN”.

Se requiere comprender mejor la extensión del daño al ADN en espermatozoides individuales y la forma en que diferentes técnicas de procesamiento espermático pueden eliminar espermatozoides con daño al ADN. 3. Extensión del daño al ADN por espermatozoide.

Las principales cuestiones que no se han probado en humanos son: 1) ¿Cuál es el grado de daño al ADN en un espermatozoide individual? y 2) ¿A cuánto daño al ADN espermático puede hacer frente un ovocito? En estudios con ratones se demostró una correlación entre cantidades cada vez mayores de inductores de daño al ADN (calor y radiación) y el resultado reproductivo.73-75 Por ejemplo, los estudios de Ahmadi y Ng74,75 mostraron que se alcanzaban tasas de fertilización de alrededor de 60% cuando los espermatozoides fueron sometidos a 0, 5, 10, 50 y 100 GY. Sin embargo, el desarrollo del blastocisto disminuyó de 49.8% en el grupo control a 2.3% con espermatozoides expuestos a dosis de 5-100 GY. De los blastocistos transferidos en el grupo control, 33.9% se convirtieron en fetos vivos, mientras que estas tasas fueron de 20 y 0% cuando los espermatozoides se expusierona dosis de 5 y 10 GY. Los investigadores concluyeron que el desarrollo embrionario y fetal está mucho más relacionado con el grado de daño al ADN y que el ovocito tiene la capacidad de reparar el daño al ADN espermático cuando está dañado en menos de 8%.

4. Si existe daño combinado de nucleótidos y fragmentación del ADN. El daño postesticular al ADN espermático inducido por el radical hidroxil o después de la exposición a radiación ionizante está asociado con el daño a nucleótidos del tipo 8-OHdG. Como se indicó previamente, con este tipo de daño, en un primer estadio el daño producido es de tipo 8-OHdG, seguido de la fragmentación bicatenaria del ADN que puede estar mediada por caspasas y endonucleasas.

Las implicaciones del daño combinado de nucleótidos y la fragmentación de cadenas de ADN es que, además de su valor diagnóstico (el daño inducido

por radicales de oxígeno es sensible al tratamiento antioxidante), puede tener un peor pronóstico, ya que la mayor parte de las células espermáticas será afectada por uno u otro tipo de daño.

5. Si el daño al ADN afecta intrones o exones. Más de 90% del ADN está compuesto de intrones. Por consiguiente, la probabilidad de que el daño al ADN afecte los exones, que son las secuencias que codifican proteínas, es relativamente baja. Por tanto, la pregunta es si la mayor parte del daño al ADN es de naturaleza arquitectónica y si esto puede tener implicaciones a largo plazo.

6. Capacidad del ovocito de reparar el daño al ADN espermático en el espermatozoide que lleva a cabo la fertilización. De los diferentes factores que tienen repercusión en el valor predictivo de las pruebas de fragmentación de ADN espermático, la capacidad de reparación del ADN que tiene el ovocito posiblemente es el más importante. El ovocito de ratón tiene la capacidad de reparar el daño al ADN espermático,76 aunque esta capacidad es limitada y puede variar de ovocito en ovocito e, incluso, entre diferentes cohortes de ovocitos del mismo paciente o de diferentes pacientes. También puede depender de la edad de la mujer. Asimismo, la capacidad del ovocito de reparar el daño al ADN espermático en el espermatozoide encargado de la fertilización también depende del tipo de daño al ADN. Como se indicó, el daño al ADN espermático puede clasificarse como mono y bicatenario. En general, el daño monocatenario al ADN es más fácil de reparar que el daño bicatenario, aunque existe evidencia de que las polimerasas también pueden reparar el daño bicatenario al ADN.77 Por consiguiente, aun si el espermatozoide encargado de la fertilización tuviera daño al ADN en su genoma, el ovocito podría reparar este daño y, por tanto, sería irrelevante para el desarrollo embrionario y fetal. Sin embargo, no es posible determinar si el ovocito sería capaz de reparar este daño. Además, las pruebas de fragmentación de ADN disponibles actualmente no pueden proporcionar información sobre la “reparabilidad” del daño al ADN. Por consiguiente, hay dos niveles de incertidumbre que no pueden resolverse con las pruebas diagnósticas actualmente disponibles. Sin

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embargo, si postulamos que el daño irreparable al ADN espermático no es compatible con el desarrollo embrionario y fetal normal, en las parejas en las que el hombre tiene fragmentación del ADN espermático de tipo irreparable, no debe lograrse un embarazo y la pareja acudiría a clínicas de infertilidad con infertilidad de largo tiempo de evolución o falla repetida del embarazo en tecnología de reproducción asistida sin causa aparente. Si la fragmentación del ADN espermático es el factor limitante, las estrategias dirigidas a disminuir los niveles de fragmentación de ADN deben mejorar el resultado de embarazo en parejas sin causa aparente de su problema de infertilidad.

Como se expuso, los reportes demostraron que el daño al ADN espermático es significativamente menor en los túbulos seminíferos en comparación con la cola del epidídimo21,78 o el esperma eyaculado,19 y que el uso de espermatozoides testiculares en parejas con falla repetida para lograr un embarazo en tecnología de reproducción asistida y alta fragmentación del ADN espermático en semen resultó en aumento significativo de las tasas de embarazo en estas parejas.19,79 Además, un informe reciente muestra que las tasas de embarazo en los primeros ciclos de TESA-ICSI son relativamente altas (Cuadro 1). Estos resultados son consistentes con el concepto de que en parejas con infertilidad de larga evolución o falla repetida para lograr un embarazo con tecnología de reproducción asistida sin causa aparente, la fragmentación del ADN espermático podría ser el factor limitante responsable de su falla de embarazo, y que el uso de espermatozoides testiculares con niveles muy bajos de fragmentación del ADN elimina del ovocito la carga de reparación de ADN del espermatozoide encargado de la fertilización. Sin embargo, el uso de esperma testicular puede no siempre solucionar el problema, ya que el daño al ADN espermático también puede ocurrir en el epitelio de los túbulos seminíferos mediante apoptosis o deberse a defectos en la remodelación de la cromatina durante el proceso de espermiogénesis. No obstante, en la mayoría de los casos, el daño al ADN espemático ocurre o aumenta en el epidídimo y, por consiguiente, los niveles de fragmentación de ADN en los espermatozoides testiculares deben ser menores.19

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Cuadro 1. Resultados de TESA-ICSI en parejas con falla repetida a FIV y niveles altos de fragmentación del ADN espermático en semen Características Parámetros de semen y casos Casos evaluados Casos de TESA-ICSI realizada IFA promedio en semen Concentración espermática promedio (millones/mL) Edad masculina promedio Resultados Tasa de fertilización Número de embriones transferidos Tasa de embarazo clínico Tasa de embarazo en el primer ciclo TESA-ICSI

Valores 68 31 39.4% 44.7 41.9 58% (20-100%) 2.3 40% 93%

IFA: índice de fragmentación del ADN; TESA-ICSI: extracción de espermatozoides testiculares-inyección espermática intracitoplasmática.

Sakkas. Sperm DNA fragmentation. Fertil Steril 2010.

Un asunto que debe considerarse cuando se utilizan espermatozoides testiculares es la posibilidad de microinyectar espermatozoides testiculares con una probabilidad alta de tener anormalidades cromosómicas. Es bien sabido que la tasa de aneuploidía en los espermatozoides testiculares es mayor que en el esperma eyaculado. Esto podría deberse a la eliminación selectiva de los espermatozoides aneouploides durante el paso a través del epidídimo.80 Sin embargo, la conclusión de que la tasa de aneuploidía en el esperma testicular es significativamente mayor que en el esperma eyaculado proviene, en la mayor parte, de estudios que utilizaron espermatozoides de hombres gravemente oligospérmicos o azoospérmicos. En contraste, en la mayoría de los pacientes con altos niveles de fragmentación de ADN en espermatozoides eyaculados en los cuales está indicado el uso de espermatozoides testiculares, la concentración de espermatozoides en el semen es normal y, por consiguiente, no nos estamos enfrentando con hombres gravemente oligospérmicos o azoospérmicos donde el riesgo de aneuploidía espermática es mayor. En un informe reciente se demostró que las tasas de embarazo, utilizando espermatozoides testiculares en parejas con niveles altos de fragmentación de ADN, fueron significativamente mayores que al utilizar espermatozoides

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Fragmentación del ADN espermático

eyaculados y que las tasas de aborto espontáneo fueron significativamente menores (Cuadro 2). Si el uso de espermatozoides testiculares en parejas con niveles altos de fragmentación de ADN espermático fuera un riesgo significativo, las tasas de embarazo deberían ser menores y las tasas de aborto espontáneo, mayores. Sin embargo, los resultados indican lo contrario y que ésta es una técnica relativamente segura cuando se aplica a estas parejas.13 7. Tipo de prueba de fragmentación de ADN utilizado.

Como se indicó, deben recomendarse de preferencia las pruebas que miden directamente el daño al ADN sin un paso previo de desnaturalización, como TUNEL; especialmente cuando se combinan con citometría de flujo. Esto aumenta la capacidad de reproducir el resultado de la prueba, así como su confiabilidad.

8. Procesamiento de los espermatozoides en tecnología de reproducción asistida. El daño al ADN puede ocurrir durante el procesamiento de los espermatozoides.

Estudios previos demostraron que la incubación de semen a temperatura ambiente81 o a 37°C82 después de su aislamiento mediante centrifugación por gradiente de densidad puede resultar en aumento de los niveles de fragmentación de ADN espermático. También, la criopreservación de los espermatozoides puede causar aumento en la fragmentación del ADN.83 Además, la centrifugación de semen bruto puede aumentar la fragmentación de ADN. Por tanto, el procesamiento de los espermatozoides en tecnología de reproducción asistida debe regirse por el principio primum non nocere. Es decir, 1) debe evitarse la

incubación innecesaria de semen y suspensiones de espermatozoides; 2) la centrifugación por gradiente de densidad parece ser la mejor manera de procesamiento de semen,84-89 y 3) deben utilizarse métodos de criopreservación que minimicen la fragmentación de ADN espermático. Un valor IFA puede ser normal en el semen licuado y anormal en los espermatozoides utilizados para la tecnología de reproducción asistida. Esto dará resultados falsos-negativos y alterará el valor predictivo de las pruebas de fragmentación de ADN espermático. Una manera de minimizar el efecto de la incubación del semen en la fragmentación del ADN sería mediante la disminución del tiempo entre el procesamiento del semen y la inseminación.

Además, en el caso de la criopreservación de espermatozoides, debe recomendarse el uso de medios complementados con antioxidantes. Un aspecto importante que debe tomarse en cuenta acerca de la relación entre el procesamiento de espermatozoides y la fragmentación de ADN es que, en caso de que una cantidad crítica de espermatozoides en la muestra de semen tenga cromatina intacta, el procesamiento de espermatozoides puede resultar en el enriquecimiento de estos espermatozoides y, por tanto, aumentar las oportunidades de lograr un embarazo viable.

9. Número de ovocitos. En parejas en quienes el nivel de fragmentación del ADN es relativamente alto, la probabilidad de que se produzcan embriones normales o embarazos viables dependerá, al menos parcialmente, de la cantidad de ovocitos obtenidos en metafase II y de su capacidad de reparar el daño al ADN en los espermatozoides fertilizantes. Por ejemplo, si se obtienen

Cuadro 2. Resultado de embarazo en pacientes con niveles altos de fragmentación de ADN espermático al ser tratados con espermatozoides eyaculados en comparación con espermatozoides testiculares

Espermatozoides eyaculados (n = 42) Espermatozoides testiculares (n = 30) Valor p

Tasa de embarazo bioquímico

Tasa de embarazo clínico

Tasa de implantación

Tasa de aborto espontáneo

6.9%

13.79%

6.56%

75%

2.5%

40%

28.09%

6.25%

NS

.035

.0021

.017

Nota: todos los pacientes incluidos en el estudio tuvieron un valor del índice de fragmentación de ADN >20% mediante TUNEL; análisis estadístico mediante prueba de ji al cuadrado.

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10 ovocitos en metafase II, la probabilidad de tener un embarazo será mayor que si sólo se obtiene un ovocito. En el segundo caso (un solo ovocito obtenido), la probabilidad de obtener al menos un embrión derivado de un espermatozoide con ADN intacto que fertilizó un ovocito normal o de un espermatozoide con ADN dañado que fertilizó un ovocito con alta capacidad de reparación de ADN será mucho más baja que en el primer caso (10 ovocitos obtenidos). En el primer caso, la selección de embriones y la transferencia de dos embriones aumenta significativamente la probabilidad de obtener al menos un embrión con ADN intacto a partir del cual se puede derivar un embarazo viable. Sin embargo, esto no invalida el valor de las pruebas de fragmentación de ADN en estas parejas.

Por consiguiente, el número de ovocitos disponibles en metafase II es un factor importante que afecta el valor predictivo de las pruebas de fragmentación de ADN. Lo mismo aplicaría a ciclos naturales o de inseminación intrauterina (IIU) en los cuales la cantidad de ovocitos obtenidos es usualmente uno. En este escenario, las tasas de embarazo dependerían más del valor de la prueba de fragmentación de ADN, ya que la probabilidad de obtener un embrión con ADN intacto es más baja y, además, no se tiene la ventaja de transferir dos o tres embriones como en el caso de la FIV. Por tanto, el valor predictivo negativo de las pruebas de fragmentación de ADN debe ser mayor en ciclos naturales o de IIU. Esta hipótesis es consistente con los resultados del estudio de Duran y colaboradores,90 en el que encontraron que los valores de fragmentación de ADN, estimados mediante la prueba TUNEL, se correlacionaron estrechamente con las tasas de embarazo en ciclos de IIU. Para concluir, se propone que el valor predictivo de las pruebas de fragmentación de ADN, πtest, es la suma de varios factores: πtest= π(1) + π(2)+ π(3) ... +π(n), donde π(n) representa muchos de los factores discutidos previamente, y a cada factor se le puede dar un peso diferente.

APLICACIONES AL DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DE LA INFERTILIDAD ¿Cuáles son las implicaciones de las pruebas de ADN espermático en el diagnóstico y tratamiento de la in-

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fertilidad? La fertilización de ovocitos en metafase II por espermatozoides con daño al ADN podría resultar en defectos en el desarrollo embrionario, falla en la implantación, o en aumento en la tasa de aborto espontáneo.13,14,91-95 Los ovocitos maduros con mecanismos funcionales de reparación de ADN tienen la capacidad de reparar el daño moderado al ADN espermático.96,97 Sin embargo, los ovocitos cuyos mecanismos de reparación de ADN no son funcionales o que han sido dañados por factores endógenos (radicales libres) o exógenos (radiación, tóxicos ambientales) no serían capaces de reparar este daño.

Un aspecto importante que está surgiendo actualmente relacionado con las pruebas de fragmentación de ADN espermático es la existencia de subgrupos de parejas infértiles que acuden a clínicas de infertilidad con infertilidad de larga evolución o falla repetida a FIV sin una causa aparente en las cuales el daño “irreparable” al ADN espermático puede ser el factor limitante responsable de su problema de infertilidad. Esto puede ayudar a explicar, al menos en parte, por qué las tasas de embarazo en los primeros ciclos de TESA-ICSI son relativamente altas en estas parejas.79 Estos datos sugieren que si el embarazo no tiene lugar en el primer ciclo TESA-ICSI, la causa de infertilidad en estas parejas puede estar en cualquier otra parte. Actualmente, existe cierta controversia respecto del valor predictivo de las pruebas de fragmentación de ADN espermático en tecnología de reproducción asistida. Incluso al utilizar pruebas con un alto valor predictivo, como TUNEL mediante citometría de flujo, dada su baja especificidad, debida principalmente a la capacidad del ovocito de reparar el ADN espermático, los valores de fragmentación de ADN espermático no siempre se correlacionan con el resultado de embarazo. Algunos investigadores reportan tal correlación y otros no. En un informe reciente, Collins y colaboradores98 concluyen que “la pequeña pero estadísticamente significativa asociación entre los resultados de las pruebas de integridad de ADN espermático y el embarazo en ciclos FIV e ICSI, no es suficientemente fuerte para proporcionar una indicación clínica para el uso rutinario de estas pruebas en la evaluación de la infertilidad masculina. Es posible que subgrupos aún por determinar de parejas infértiles puedan beneficiarse de las pruebas de integridad de ADN espermático.” Esta

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Fragmentación del ADN espermático

evaluación implica que las pruebas de fragmentación de ADN espermático pueden ser aplicadas selectivamente a parejas con mal pronóstico en tecnología de reproducción asistida. Como se indicó, hay una serie de factores que afectan el valor predictivo de las pruebas de fragmentación de ADN, lo cual puede ayudar a responder esta pregunta. Sin embargo, tal vez la explicación más probable a esta aparente paradoja está relacionada con el tipo de daño al ADN: reparable versus irreparable. Por ejemplo, dos pacientes pueden tener el mismo valor de la prueba de fragmentación de ADN mediante TUNEL (por ejemplo, 50%); sin embargo, el pronóstico puede ser completamente diferente, ya que en un caso el daño al ADN puede ser reparable y en el otro no. Sin embargo, esto en sí mismo no explica por qué las tasas de embarazo serían tan bajas en el segundo caso. Para que esto aplique, todos los espermatozoides deben tener algún tipo de daño al ADN y este daño no puede ser reparado por el ovocito o el embrión. Debe aplicar un escenario de tipo “efecto iceberg”. Dado el hecho de que uno de los mecanismos más importantes de fragmentación del ADN espermático es el daño oxidativo durante el paso a través del epidídimo y, como se mencionó, de una combinación de daño a nucleótidos (por ejemplo, 8-OHdG y daño bicatenario al ADN), es posible que, en estas parejas, el daño al ADN afectaría la mayor parte de las células espermáticas, a pesar de que las pruebas actuales permiten medir sólo una fracción de este daño al ADN. Por consiguiente, el valor de 50% sería engañoso. Vale la pena considerar el concepto de que algunos pacientes con un tipo más grave de daño al ADN (por ejemplo, daño al ADN que no es reparable por el ovocito o el embrión) pueden beneficiarse de las pruebas de fragmentación de ADN y el uso de espermatozoides con valores bajos de fragmentación de ADN. Desafortunadamente, al menos en el escenario clínico, actualmente no están disponibles pruebas que permitan la diferenciación de estos tipos de daño al ADN. Sin embargo, recientemente el 2D-COMET se introdujo como una prueba nueva que puede distinguir entre estos dos tipos de daño.99 Esta prueba puede ayudar a evaluar el efecto del daño bicatenario al ADN espermático en el resultado de embarazo de tecnología de reproducción asistida y aumentar la especificidad de las pruebas de fragmentación de ADN. Además del daño al ADN calculado mediante pruebas

como TUNEL, cometa, SCD o SCSA, con excepción de la prueba 8-OHdG, actualmente no están disponibles pruebas que midan otros tipos de daño al ADN (oxidativo y no oxidativo) que puedan estar presentes en el ADN espermático. Hasta que se desarrollen estas pruebas, la especificidad de las pruebas de fragmentación de ADN espermático continuará siendo baja.

Por tanto, con base en los factores que determinan el valor predictivo de las pruebas de fragmentación de ADN espermático, el valor clínico de las pruebas de fragmentación de ADN en la predicción del resultado de embarazo en tecnología de reproducción asistida debe basarse necesariamente en dos supuestos principales: 1) el daño al ADN debe afectar toda la población de espermatozoides en la muestra, y 2) el daño al ADN presente en estos espermatozoides no puede ser reparado por el ovocito. Si alguno de estos supuestos no se aplica, no podría esperarse correlación significativa entre un índice de fragmentación de ADN anormal y el resultado de embarazo en tecnología de reproducción asistida.

Como se indicó, otro aspecto importante de las aplicaciones clínicas de las pruebas de fragmentación de ADN es el uso de espermatozoides testiculares en pacientes con niveles altos de fragmentación de ADN espermático en el semen. En estos casos, debe recomendarse el uso de espermatozoides testiculares obtenidos mediante TESE o TESA. Además del uso de espermatozoides testiculares, otra estrategia que puede utilizarse en pacientes con niveles altos de fragmentación del ADN espermático es la selección de espermatozoides con niveles bajos de daño al ADN. Aunque esta estrategia se aplicaría principalmente a espermatozoides eyaculados, también podría aplicarse a espermatozoides testiculares, ya que, como se mencionó, no todo el daño al ADN espermático es postesticular. Actualmente se ha propuesto una serie de técnicas para seleccionar espermatozoides con niveles bajos de fragmentación de ADN. Éstas incluyen el uso de columnas anexina-V,100,101 las cuales han demostrado reducir significativamente el porcentaje de espermatozoides con fragmentación de ADN, según lo determinado por la prueba TUNEL y un método de selección de espermatozoides basado en la fijación de ácido hialurónico espermático.102 Otras técnicas incluyen la selección de espermatozoides desprovistos

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de vacuolas superficiales mediante ICSI de alta magnificación103 y la recientemente introducida tecnología de absorción confocal de la luz y espectroscopia de dispersión (CLASS, por sus siglas en inglés), la cual permite la visualización no invasiva de estructuras subcelulares.103 Estas estructuras pueden identificarse mediante dos modos principales: visualización directa mediante la microscopia confocal o mediante su espectro específico. En relación con las aplicaciones del modo espectral en tecnología de reproducción asistida, se uniría un espectroscopio al microscopio invertido y el espectro de estructuras subcelulares, como la cromatina espermática, puede recogerse en menos de un segundo. Por consiguiente, la tecnología CLASS puede hacer posible, en un futuro cercano, seleccionar espermatozoides con cromatina intacta para ser microinyectados a través de ICSI. Sin embargo, debe tenerse cuidado en relación con los potenciales efectos perjudiciales del uso de estas técnicas no invasivas, ya que en algunas condiciones imprevistas puede inducirse daño. Debido a que en el caso de la tecnología CLASS el tiempo de selección espermática y de exposición a luz visible estaría limitado a alrededor de un segundo, esto es más probable que se aplique a la tecnología IMSI (inyección intracitoplasmática de espermatozoides morfológicamente seleccionados), en la que el tiempo de selección espermática es significativamente mayor. Con respecto a la utilidad de IMSI en ART, un estudio reciente indica que los niveles de fragmentación de ADN, según lo evaluado mediante la prueba de dispersión de cromatina espermática, en espermatozoides individuales seleccionados mediante IMSI, son insignificantes en espermatozoides sin vacuolas (Gosalvez y col., resultados no publicados).

En conclusión, la fragmentación de ADN en el núcleo espermático generó una plétora de artículos durante la década pasada. La distinción entre todos los espermatozoides afectados versus sólo los espermatozoides con “ADN dañado” es sumamente relevante para el manejo clínico de estos pacientes. En relación con la tecnología de reproducción asistida, la responsabilidad debe ahora cambiarse a la identificación de los espermatozoides con ADN dañado y cómo seleccionar poblaciones de espermatozoides o espermatozoide individuales “normales”. Finalmente, la presencia de espermatozoides con

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ADN fragmentado es irrefutable cualesquiera que sean los mecanismos de su origen, el efecto en el embrión y la descendencia, y la necesidad de diagnosticarlo es un área crítica que requiere un conocimiento más profundo.

Agradecimientos: Los autores agradecen a la Dra. Esther Velilla y a la Dra. Estefanía Toro por la asistencia técnica en la realización de la prueba TUNEL y al Dr. Ferrán García por la recuperación de espermatozoides testiculares en los estudios TESA-ICSI. También agradecen a la Dra. López-Teijón por sus valiosos comentarios y su apoyo incondicional en esta investigación.

Traducción: Adriana Jardón A

REFERENCIAS 1. Lopes S, Sun JG, Jurisicova A, Meriano J, Casper RF. Sperm deoxyribonucleic acid fragmentation is increased in poor-quality semen samples and correlates with failed fertilization in intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril 1998;69:528-532.

2. Gandini L, Lombardo F, Paoli D, Caruso F, et al. Full-term pregnancies achieved with ICSI despite high levels of sperm chromatin damage. Hum Reprod 2004;19:1409-1417.

3. Aitken RJ, Gordon E, Harkiss D, Twigg JP, et al. Relative impact of oxidative stress on the functional competence and genomic integrity of human spermatozoa. Biol Reprod 1998;59:1037-1046.

4. Fatehi AN, Bevers MM, Schoevers E, Roelen BA, et al. DNA damage in bovine sperm does not block fertilization and early embryonic development but induces apoptosis after the first cleavages. J Androl 2006;27:176-188.

5. Harrouk W, Robaire B, Hales BF. Paternal exposure to cyclophosphamide alters cell-cell contacts and activation of embryonic transcription in the preimplantation rat embryo.

Biol Reprod 2000;63:74-81.

6. Harrouk W, Khatabaksh S, Robaire B, Hales BF. Paternal exposure to cyclophosphamide dysregulates the gene activation program in rat preimplantation embryos. Mol Reprod Dev 2000;57:214-223.

7. Harrouk W, Codrington A, Vinson R, Robaire B, Hales BF. Paternal exposure to cyclophosphamide induces DNA damage and alters the expression of DNA repair genes in the rat preimplantation embryo. Mutat Res 2000;461:229241.

8. Wells D, Bermudez MG, Steuerwald N, Thornhill AR, et al.

Expression of genes regulating chromosome segregation, the cell cycle and apoptosis during human preimplantation development. Hum Reprod 2005;20:1339-1348.

9. Gasca S, Pellestor F, Assou S, Loup V, et al. Identifying new human oocyte marker genes: a microarray approach.

Reprod Biomed Online 2007;14:175-183.

Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción Volumen 3, núm. 4, abril-junio, 2011

Fragmentación del ADN espermático

10. Wyrobek AJ, Eskenazi B, Young S, Arnheim N, et al. Advancing age has differential effects on DNA damage, chromatin integrity, gene mutations, and aneuploidies in sperm. PNAS 2006;103:9601-9606.

11. Belloc S, Cohen-Bacrie P, Benkhalifa M, Cohen-Bacrie M, et al. Effect of maternal and paternal age on pregnancy and miscarriage rates after intrauterine insemination. Reprod Biomed Online 2008;17:392-397.

12. Tesarik J, Greco E, Mendoza C. Late, but not early, paternal effect on human embryo development is related to sperm DNA fragmentation. Hum Reprod 2004;19:611-615.

13. Borini A, Tarozzi N, Bizzaro D, Bonu MA, et al. Sperm DNA fragmentation: paternal effect on early post-implantation embryo development in ART. Hum Reprod 2006;21:28762881.

14. Seli E, Gardner DK, Schoolcraft WB, Moffatt O, Sakkas D. Extent of nuclear DNA damage in ejaculated spermatozoa impacts on blastocyst development after in vitro fertilization.

Fertil Steril 2004;82:378-383.

15. Shoukir Y, Chardonnens D, Campana A, Sakkas D. Blastocyst development from supernumerary embryos after intracytoplasmic sperm injection: a paternal influence? Hum Reprod 1998;13:1632-1637.

16. Dumoulin JC, Coonen E, Bras M, van Wissen LC, et al.

Comparison of in-vitro development of embryos originating from either conventional in-vitro fertilization or intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod 2000;15:402-409.

17. Fragouli E, Wells D, Thornhill A, Serhal P, et al. Comparative genomic hybridization analysis of human oocytes and polar bodies. Hum Reprod 2006;21:2319-2328.

18. Sher G, Keskintepe L, Keskintepe M, Ginsburg M, et al.

Oocyte karyotyping by comparative genomic hybridization [correction of hybrydization] provides a highly reliable method for selecting “competent” embryos, markedly improving in vitro fertilization outcome: a multiphase study. Fertil Steril 2007;87:1033-1040.

19. Greco E, Scarselli F, Iacobelli M, Rienzi L, et al. Efficient treatment of infertility due to sperm DNA damage by ICSI with testicular spermatozoa. Hum Reprod 2005;20:226230.

20. Ollero M, Gil-Guzman E, Lopez MC, Sharma RK, et al.

Characterization of subsets of human spermatozoa at different stages of maturation: implications in the diagnosis and treatment of male infertility. Hum Reprod 2001;16:19121921.

21. Suganuma R, Yanagimachi R, Meistrich ML. Decline in fertility of mouse sperm with abnormal chromatin during epididymal passage as revealed by ICSI. Hum Reprod 2005;20:3101-3108.

22. Billig H, Chun SY, Eisenhauer K, Hsueh AJ. Gonadal cell apoptosis: hormone-regulated cell demise. Hum Reprod Update 1996;2:103-117.

23. Pentikainen V, Erkkila K, Dunkel L. Fas regulates germ cell apoptosis in the human testis in vitro. Am J Physiol 1999;276:310-316.

24. Sakkas D, Mariethoz E, Manicardi G, Bizzaro D, et al. Origin of DNA damage in ejaculated human spermatozoa. Rev Reprod 1999;4:31-37.

25. Burrello N, Arcidiacono G, Vicari E, Asero P, et al. Morphologically normal spermatozoa of patients with secretory oligoasthenoteratozoospermia have an increased aneuploidy rate. Hum Reprod 2004;19:2298-2302.

26. El-Domyati M, Al-Din A, Barakat M, El-Fakahany H, et al.

DNA repair and apoptosis in testicular germ cells of ageing fertile males: the role of the poly(ADP-ribosyl)ation pathway.

Fertil Steril. In press.

27. Sakkas D, Moffatt O, Manicardi GC, Mariethoz E, et al.

Nature of DNA damage in ejaculated human spermatozoa and the possible involvement of apoptosis. Biol Reprod 2002;66:1061-1067.

28. Cayli S, Sakkas D, Vigue L, Demir R, Huszar G. Cellular maturity and apoptosis in human sperm: creatine kinase, caspase-3 and Bcl-XL levels in mature and diminished maturity sperm. Mol Hum Reprod 2004;10:365-372.

29. Mahfouz RZ, Sharma RK, Poenicke K, Jha R, et al. Evaluation of poly(ADP-ribose) polymerase cleavage (cPARP) in ejaculated human sperm fractions after induction of apoptosis. Fertil Steril 2008;91(5 Suppl):2210-2220.

30. Oehninger S, Morshedi M, Weng SL, Taylor S, et al. Presence and significance of somatic cell apoptosis markers in human ejaculated spermatozoa. Reprod Biomed Online 2003;7:469-476.

31. Said T, Agarwal A, Grunewald S, Rasch M, et al. Selection of non-apoptotic spermatozoa as a new tool for enhancing assisted reproduction outcomes: an in vitro model. Biol Reprod 2006;74(3):530-537.

32. Grunewald S, Paasch U, Glander HJ. Enrichment of nonapoptotic human spermatozoa after cryopreservation by immunomagnetic cell sorting. Cell Tissue Bank 2001;2:127-133.

33. McPherson S, Longo FJ. Chromatin structure-function alterations during mammalian spermatogenesis: DNA nicking and repair in elongating spermatids. Eur J Histochem 1993;37:109-128.

34. McPherson SM, Longo FJ. Nicking of rat spermatid and spermatozoa DNA: possible involvement of DNA topoisomerase II. Dev Biol 1993;158:122-130.

35. McPherson SM, Longo FJ. Localization of DNase Ihypersensitive regions during rat spermatogenesis: stagedependent patterns and unique sensitivity of elongating spermatids. Mol Reprod Dev 1992;31:268-279.

36. Marcon L, Boissonneault G. Transient DNA strand breaks during mouse and human spermiogenesis new insights in stage specificity and link to chromatin remodeling. Biol Reprod 2004;70:910-918.

37. Twigg JP, Irvine DS, Aitken RJ. Oxidative damage to DNA in human spermatozoa does not preclude pronucleus formation at intracytoplasmic sperm injection. 1998;13:1864-1871.

38. Lopes S, Jurisicova A, Sun JG, Casper RF. Reactive oxygen species: potential cause for DNA fragmentation in human spermatozoa. Hum Reprod 1998;13:896-900.

39. Britan A, Maffre V, Tone S, Drevet JR. Quantitative and spatial differences in the expression of tryptophan-metabolizing enzymes in mouse epididymis. Cell Tissue Res 2006;324:301-310.

40. Banks S, King SA, Irvine DS, Saunders PT. Impact of a mild scrotal heat stress on DNA integrity in murine spermatozoa.

Reproduction 2005;129:505-514.

Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción Volumen 3, núm. 4, abril-junio, 2011

173

Sakkas D y Álvarez JG

41. Rubes J, Selevan SG, Sram RJ, Evenson DP, Perreault SD. GSTM1 genotype influences the susceptibility of men to sperm DNA damage associated with exposure to air pollution. Mutat Res 2007;625:20-28.

42. Menezo YJ, Hazout A, Panteix G, Robert F, et al. Antioxidants to reduce sperm DNA fragmentation: an unexpected adverse effect. Reprod Biomed Online 2007;14:418-421.

43. Steele EK, McClure N, Maxwell RJ, Lewis SE. A comparison of DNA damage in testicular and proximal epididymal spermatozoa in obstructive azoospermia. Mol Hum Reprod 1999;5:831-835.

44. Cui J, Holmes EH, Greene TG, Liu PK. Oxidative DNA damage precedes DNA fragmentation after experimental stroke in rat brain. FASEB J 2000;14:955-967.

45. Sailer BL, Sarkar LJ, Bjordahl JA, Jost LK, Evenson DP. Effects of heat stress on mouse testicular cells and sperm chromatin structure. J Androl 1997;18:294-301.

46. Bianchi PG, Manicardi GC, Bizzaro D, Bianchi U, Sakkas D. Effect of deoxyribonucleic acid protamination on fluorochrome staining and in situ nick-translation of murine and human mature spermatozoa. Biol Reprod 1993;49:1083-1088.

47. Morris ID. Sperm DNA damage and cancer treatment. Int J Androl 2002;25:255-261.

48. O’Flaherty C, Vaisheva F, Hales BF, Chan P, Robaire B. Characterization of sperm chromatin quality in testicular cancer and Hodgkin’s lymphoma patients prior to chemotherapy.

Hum Reprod 2008;23:1044-1052.

49. Gorczyca W, Traganos F, Jesionowska H, Darzynkiewicz Z. Presence of DNA strand breaks and increased sensitivity of DNA in situ to denaturation in abnormal human sperm cells: analogy to apoptosis of somatic cells. Exp Cell Res 1993;207:202-205.

50. Hughes C, Lewis S, McKelvey-Martin V, Thompson W. A comparison of baseline and induced DNA damage in human spermatozoa from fertile and infertile men, using a modified comet assay. Mol Hum Reprod 1996;2:613-619.

51. Manicardi GC, Bianchi PG, Pantano S, Azzoni P, et al.

Presence of endogenous nicks in DNA of ejaculated human spermatozoa and its relationship to chromomycin A3 accessibility. Biol Reprod 1995;52:864-867.

52. Tomlinson MJ, Moffatt O, Manicardi GC, Bizzaro D, et al.

Interrelationships between seminal parameters and sperm nuclear DNA damage before and after density gradient centrifugation: implications for assisted conception. Hum Reprod 2001;16:2160-2165.

53. Fernandez JL, Vazquez-Gundin F, Delgado A, Goyanes VJ, et al. DNA breakage detection-FISH (DBD-FISH) in human spermatozoa: technical variants evidence different structural features. Mutat Res 2000;453:77-82.

54. Fernandez JL, Muriel L, Rivero MT, Goyanes V, et al. The sperm chromatin dispersion test: a simple method for the determination of sperm DNA fragmentation. J Androl 2003;24:59-66.

55. Evenson DP, Darzynkiewicz Z, Melamed MR. Relation of mammalian sperm chromatin heterogeneity to fertility.

Science 1980;210:1131-1133.

56. Evenson DP, Darzynkiewicz Z, Melamed MR. Comparison of human and mouse sperm chromatin structure by flow cytometry. Chromosoma 1980;78:225-238.

174

57. Larson KL, DeJonge CJ, Barnes AM, Jost LK, Evenson DP. Sperm chromatin structure assay parameters as predictors of failed pregnancy following assisted reproductive techniques. Hum Reprod 2000;15:1717-1722.

58. Evenson DP, Larson KL, Jost LK. Sperm chromatin structure assay: its clinical use for detecting sperm DNA fragmentation in male infertility and comparisons with other techniques. J Androl 2002;23:25-43.

59. Singh NP, Danner DB, Tice RR, McCoy MT, et al. Abundant alkali-sensitive sites in DNA of human and mouse sperm.

Exp Cell Res 1989;184:461-470.

60. Singh NP, McCoy MT, Tice RR, Schneider EL. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res 1988;175:184-191.

61. Phillips KP, Baltz JM. Intracellular pH change does not accompany egg activation in the mouse. Mol Reprod Dev 1996;45:52-60.

62. Phillips KP, Leveille MC, Claman P, Baltz JM. Intracellular pH regulation in human preimplantation embryos. Hum Reprod 2000;15:896-904.

63. Bungum M, Humaidan P, Axmon A, Spano M, et al. Sperm DNA integrity assessment in prediction of assisted reproduction technology outcome. Hum Reprod 2007;22:174-179.

64. Negoescu A, Guillermet C, Lorimier P, Brambilla E, LabatMoleur F. Importance of DNA fragmentation in apoptosis with regard to TUNEL specificity. Biomed Pharmacother 1998;52:252-258.

65. Evenson D, Jost L. Sperm chromatin structure assay: DNA denaturability. Methods Cell Biol 1994;42. Pt B:159-176.

66. Evenson D, Jost L, Gandour D, Rhodes L, et al. Comparative sperm chromatin structure assay measurements on epiillumination and orthogonal axes flow cytometers. Cytometry 1995;19:295-303.

67. Evenson DP. Flow cytometry of acridine orange stained sperm is a rapid and practical method for monitoring occupational exposure to genotoxicants. Prog Clin Biol Res 1986;207:121-132.

68. Evenson DP. Flow cytometric analysis of male germ cell quality. Methods Cell Biol 1990;33:401-410.

69. Larson-Cook KL, Brannian JD, Hansen KA, Kasperson KM, et al. Relationship between the outcomes of assisted reproductive techniques and sperm DNA fragmentation as measured by the sperm chromatin structure assay. Fertil Steril 2003;80:895-902.

70. Bungum M, Humaidan P, Spano M, Jepson K, et al. The predictive value of sperm chromatin structure assay (SCSA) parameters for the outcome of intrauterine insemination, IVF and ICSI. Hum Reprod 2004;19:1401-1408.

71. Bungum M, Humaidan P, Axmon A, Spano M, et al. Sperm DNA integrity assessment in prediction of assisted reproduction technology outcome. Hum Reprod 2007;22(1):174-179.

72. Spano M, Seli E, Bizzaro D, Manicardi GC, Sakkas D. The significance of sperm nuclear DNA strand breaks on reproductive outcome. Curr Opin Obstet Gynecol 2005;17:255-260.

73. Setchell BP, Ekpe G, Zupp JL, Surani MA. Transient retardation in embryo growth in normal female mice made pregnant by males whose testes had been heated. Hum Reprod 1998;13:342-347.

Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción Volumen 3, núm. 4, abril-junio, 2011

Fragmentación del ADN espermático

74. Ahmadi A, Ng SC. Fertilizing ability of DNA-damaged spermatozoa. J Exp Zool 1999;284:696-704.

75. Ahmadi A, Ng SC. Developmental capacity of damaged spermatozoa. Hum Reprod 1999;14:2279-2285.

76. Derijck A, van der Heijden G, Giele M, Philippens M. de BP. DNA double-strand break repair in parental chromatin of mouse zygotes, the first cell cycle as an origin of de novo mutation. Hum Mol Genet 2008;17:1922-1937.

77. Garcia-Diaz M, Dominguez O, Lopez-Fernandez LA, de Lera LT, et al. DNA polymerase lambda (Pol lambda), a novel eukaryotic DNA polymerase with a potential role in meiosis. J Mol Biol 2000;301:851-867.

78. Steele EK, McClure N, Maxwell RJ, Lewis SE. A comparison of DNA damage in testicular and proximal epididymal spermatozoa in obstructive azoospermia. Mol Hum Reprod 1999;5:831-835.

79. Alvarez J. Aplicaciones clínicas del estudio de fragmentación del DNA espermático. Revista Argentina de Andrología 2008;5.

80. Egozcue J, Sarrate Z, Codina-Pascual M, Egozcue S, et al.

Meiotic abnormalities in infertile males. Cytogenet Genome Res 2005;111:337-342.

81. Gosalvez J, Cortes-Gutierrez EI, Nunez R, Fernandez JL, et al. A dynamic assessment of sperm DNA fragmentation versus sperm viability in proven fertile human donors. Fertil Steril 2008.

82. Dalzell LH, McVicar CM, McClure N, Lutton D, Lewis SE. Effects of short and long incubations on DNA fragmentation of testicular sperm. Fertil Steril 2004;82:1443-1445.

83. Donnelly ET, Steele EK, McClure N, Lewis SE. Assessment of DNA integrity and morphology of ejaculated spermatozoa from fertile and infertile men before and after cryopreservation. Hum Reprod 2001;16:1191-1199.

84. Zini A, Mak V, Phang D, Jarvi K. Potential adverse effect of semen processing on human sperm deoxyribonucleic acid integrity 1999;72:496-499.

85. Angelopoulos T, Moshel YA, Lu L, Macanas E, et al. Simultaneous assessment of sperm chromatin condensation and morphology before and after separation procedures: effect on the clinical outcome after in vitro fertilization. Fertil Steril 1998;69:740-747.

86. Larson KL, Brannian JD, Timm BK, Jost LK, Evenson DP. Density gradient centrifugation and glass wool filtration of semen remove spermatozoa with damaged chromatin structure. Hum Reprod 1999;14:2015-2019.

87. Sakkas D, Manicardi GC, Tomlinson M, Mandrioli M, et al. The use of two density gradient centrifugation techniques and the swim-up method to separate spermatozoa with chromatin and nuclear DNA anomalies. Hum Reprod 2000;15:1112-1126.

88. Tomlinson MJ, Moffatt O, Manicardi GC, Bizzaro D, et al.

Interrelationships between seminal parameters and sperm nuclear DNA damage before and after density gradient centrifugation: implications for assisted conception. Hum Reprod 2001;16:2160-2165.

89. Twigg J, Irvine DS, Houston P, Fulton N, et al. Iatrogenic DNA damage induced in human spermatozoa during sperm

preparation: protective significance of seminal plasma. Mol Hum Reprod 1998;4:439-445.

90. Duran EH, Morshedi M, Taylor S, Oehninger S. Sperm DNA quality predicts intrauterine insemination outcome: a prospective cohort study. Hum Reprod 2002;17:3122-3128.

91. Genesca A, Caballin MR, Miro R, Benet J, et al. Repair of human sperm chromosome aberrations in the hamster egg.

Hum Genet 1992;89:181-186.

92. Parinaud J, Mieusset R, Vieitez G, Labal B, Richoilley G. Influence of sperm parameters on embryo quality 1993;60:888-892.

93. Twigg JP, Irvine DS, Aitken RJ. Oxidative damage to DNA in human spermatozoa does not preclude pronucleus formation at intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod 1998;13:1864-1871.

94. Evenson DP, Jost LK, Marshall D, Zinaman MJ, et al. Utility of the sperm chromatin structure assay as a diagnostic and prognostic tool in the human fertility clinic. Hum Reprod 1999;14:1039-1049.

95. Carrell DT, Liu L, Peterson CM, Jones KP, et al. Sperm DNA fragmentation is increased in couples with unexplained recurrent pregnancy loss. Arch Androl 2003;49:49-55.

96. Matsuda Y, Tobari I. Chromosomal analysis in mouse eggs fertilized in vitro with sperm exposed to ultraviolet light (UV) and methyl and ethyl methanesulfonate (MMS and EMS).

Mutat Res 1988;198:131-144.

97. Brandriff B, Pedersen RA. Repair of the ultravioletirradiated male genome in fertilized mouse eggs. Science 1981;211:1431-1433.

98. Collins JA, Barnhart KT, Schlegel PN. Do sperm DNA integrity tests predict pregnancy with in vitro fertilization? Fertil Steril 2008;89:823-831.

99. Enciso M, Sarasa J, Agarwal A, Fernández JL, Gosálvez J. A two-tailed Comet assay for assessing DNA damage in spermatozoa. Reprod Biomed Online 2009;18:609-616.

100. Said T, Agarwal A, Grunewald S, Rasch M, et al. Selection of nonapoptotic spermatozoa as a new tool for enhancing assisted reproduction outcomes: an in vitro model. Biol Reprod 2006;74:530-537.

101. Said TM, Grunewald S, Paasch U, Glander HJ, et al.

Advantage of combining magnetic cell separation with sperm preparation techniques. Reprod Biomed Online 2005;10:740-746.

102. Jakab A, Sakkas D, Delpiano E, Cayli S, et al. Intracytoplasmic sperm injection: a novel selection method for sperm with normal frequency of chromosomal aneuploidies. Fertil Steril 2005;84:1665-1673.

103. Bartoov B, Berkovitz A, Eltes F, Kogosovsky A, et al. Pregnancy rates are higher with intracytoplasmic morphologically selected sperm injection than with conventional intracytoplasmic injection. Fertil Steril 2003;80:1413-1419.

104. Itzkan I, Qiu L, Fang H, Zaman MM, et al. Confocal light absorption and scattering spectroscopic microscopy monitors organelles in live cells with no exogenous labels. Proc Natl Acad Sci USA 2007;104:17255-17260.

Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción Volumen 3, núm. 4, abril-junio, 2011

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Artículo original

Características que optimizan la selección de donantes de óvulos Laura Fabiola Guadarrama García,* Heidi Trejo Castañeda,* Zarela Lizbeth Chinolla Arellano,* Jeimy Pedraza Cepeda,* Felipe Caldiño Soto,* Sandra Cubillos García,* Silvio Cuneo Pareto* RESUMEN Antecedentes: la donación de ovocitos es una técnica de reproducción asistida en la que el gameto femenino es aportado por una mujer distinta a la que recibirá el gameto o el embrión resultante.

Objetivo: identificar las variables que definan un perfil de buena respuesta de donantes de ovocitos.

Material y métodos: se realizó –de noviembre de 2004 a marzo de 2010– un estudio retrospectivo, longitudinal y descriptivo del primer ciclo de hiperestimulación ovárica controlada, ciclo que se llevó a cabo en 53 donadoras de ovocitos para fecundación in vitro con transferencia de embriones; se analizaron únicamente las características de las donantes que en su primer ciclo realizado lograron un embarazo (n = 19).

Resultados: en relación con las donantes nuligestas o con embarazo previo, se observó una diferencia significativa en las concentraciones de estradiol –secundarias a la aplicación de la gonadotrofina coriónica humana–, en el número de folículos maduros y en el total de ovocitos capturados y ovocitos en metafase II de las donantes con al menos un embarazo a término; no hubo diferencia en la dosis total de gonadotrofinas ni en el perfil hormonal basal.

Conclusiones: las características que optimizan la selección de donantes de ovocitos son: edad menor de 25 años, índice de masa corporal (IMC) menor de 24.9 y fertilidad probada; por tanto, las posibles mujeres aptas para ovodonación se tendrían que seleccionar con base en dichas condiciones –para obtener buenas tasas de embarazo, para utilizar menores dosis de gonadotrofinas y para originar menos complicaciones en la donante.

Palabras clave: donantes de óvulos, selección.

ABSTRACT Background: Oocyte donation is an assisted reproduction technique in which female gamete is aported by a different woman to that will receive this or the resulting embryo.

Objective: To identify the variables defining the profile of good reponse in oocyte donors.

Material and methods: A retrospective, longitudinal, descriptive study was done of the first cycle of controlled ovarian hyperstimulation of 53 donors for IVF-TE from November 2004 to March 2010. The characteristics of donors who achieved pregnancy in their first cycle were analyzed (n = 19).

Results: According to the group of nuligest or with previous pregnancy a significant difference was observed favoring donors with at least one term-pregnancy in the value of estradiol with hCG, number of mature follicles, total of captured and in metaphse II oocytes, without observing difference in the total dose of gonadotrophins nor in the basal hormonal profile.

Conclusions: Characteristics optimizing oocytes donations in a donor are a younger age than 25 years, a BMI lesser than 24.9 and tested fertility, thus, at the moment of selection of possible candidates for ovodonation these conditions should be looked for in order to obtain good rates of pregnancy and to use lower doses of gonadotrophin with the lesser probability of complications for the donor.

Key words: oocyte-donor, selection.

*

Laboratorio de Reproducción Asistida CONCIBE, México, DF.

Correspondencia: Dr. Silvio Cuneo Pareto; scuneo@concibe.com.mx Recibido: febrero, 2011. Aceptado: marzo, 2011.

Este artículo debe citarse como: Guadarrama-García LF, TrejoCastañeda H, Chinolla-Arellano ZL, Pedraza-Cepeda J y col.

Características que optimizan la selección de donantes de óvulos.

Rev Mex Reprod 2011;3(4):176-181. www.nietoeditores.com.mx

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L

a donación de ovocitos es una técnica de reproducción asistida en la que el gameto femenino es aportado por una mujer distinta a la que recibirá el gameto o el embrión resultante.1 La utilización de ovocitos de donantes ha sido posible gracias a las técnicas de fertilización in vitro. Estos procedimientos requieren que se lleve a cabo una hiperestimulación ovárica vigilada y una captura de ovocitos que pueden significar incomodidades y riesgos para las donantes. Las indicaciones principales

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Características que optimizan la selección de donantes de óvulos

para considerar la donación de ovocitos son: pacientes con hipogonadismo hipergonadotrófico, en edad reproductiva avanzada, con reserva ovárica disminuida (por intervención quirúrgica, menopausia temprana, agenesia gonadal, etc.), portadoras de algún defecto genético, con mala calidad ovocitaria o embrionaria o con múltiples intentos fallidos para concebir mediante alguna técnica de reproducción asistida.2,3 Según las guías internacionales para ser donante de ovocitos, la donante debe someterse a una evaluación física completa, a exámenes serológicos –de hepatitis B, hepatitis C, sífilis y virus de la inmunodeficiencia humana 1 y 2– y a una evaluación psicológica completa. La donante debe ser anónima y mayor de edad; preferentemente debe tener entre 21 y 34 años de edad; la fertilidad probada es deseable pero no obligatoria; se excluye a las mujeres que integran grupos de riesgo, como usuarias de drogas intravenosas, practicantes de conductas sexuales de riesgo –como prostitución, promiscuidad o contacto sexual con personas de este grupo– o presidiarias; también se excluye a las mujeres que tengan tejidos u órganos trasplantados o que en el último año se hayan realizado acupuntura, perforaciones o tatuajes, porque no es claro que estos procedimientos se hayan realizado con esterilidad.2 El éxito de la donación de ovocitos es influido por múltiples factores, como la edad de la donante de ovocitos y de la receptora, la calidad del embrión, el estado reproductivo y la receptividad endometrial.

Recientemente, la edad de la donadora es uno de los factores más importantes para obtener un buen resultado en la fertilización in vitro.4 Aun cuando se han utilizado diferentes biomarcadores indirectos para evaluar la reserva ovárica (concentraciones de hormona folículo estimulante en el día 3 del ciclo, concentraciones de estradiol en el día 3 y concentraciones de inhibina B y de hormona antimülleriana), ninguno ha sido más exacto que los demás.5,6 Sin embargo, en mujeres jóvenes fértiles los marcadores hormonales raramente son anormales, de ahí que sean utilizados como factores de predicción de respuesta ovárica.7 Otro factor que se ha asociado con la disminución de la fertilidad, con el incremento de requerimientos de gonadotrofinas, con un desarrollo folicular insuficiente y con menor número de ovocitos y porcentaje de embarazos es el índice de masa corporal (IMC). Las donadoras jóvenes con IMC

elevado requieren una dosis total mayor de gonadotrofina debido a que producen menos ovocitos totales maduros. Por tanto, el sobrepeso y la obesidad pueden reducir el porcentaje de éxito e incrementan el costo de los programas de ovodonación.8 Se ha observado que el porcentaje de embarazos es mayor en donantes jóvenes delgadas cuyo IMC es menor de 27.9 Justificación La donación de ovocitos es un tratamiento contra la infertilidad de las mujeres con insuficiencia ovárica prematura, menopausia natural o quirúrgica, falla de fertilización in vitro y enfermedades cromosómicas, entre otras afecciones; por eso, en este estudio se busca identificar las variables clínicas, bioquímicas y ultrasonográficas que definan un perfil de buena respuesta en donantes de ovocitos para de esta forma lograr mejores tasas de embarazo en las receptoras y menores riesgos y costos.

Objetivos Identificar las variables que definan un perfil de buena respuesta en donantes de ovocitos.

Identificar si la edad, el IMC y la maternidad previa de la donante de ovocitos son factores de predicción de dosis totales de gonadotrofinas utilizadas, ovocitos totales, ovocitos maduros capturados y porcentaje de embarazo.

PACIENTES y Método Se realizó –de noviembre de 2004 a marzo de 2010– un estudio retrospectivo, longitudinal y descriptivo del primer ciclo de hiperestimulación ovárica controlada, ciclo que se llevó a cabo en 53 donadoras de ovocitos para fecundación in vitro con transferencia de embriones; se analizaron únicamente las características de las donantes que en su primer ciclo realizado lograron un embarazo (n = 19). Se inició la estimulación ovárica controlada con hormona folículo estimulante recombinante, menotropinas urinarias con protocolo de reducción (o ambas) en el día 2, 3 o 4 del ciclo, se dio seguimiento ultrasonográfico y se estableció la determinación hormonal sérica; una vez que los folículos midieron 18 mm de diámetro, se aplicaron por vía subcutánea 10,000 ui de gonadotrofina

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Guadarrama García LF y col.

coriónica humana y se realizó la aspiración folicular a las 36 horas, estando bajo sedación la donante.

Se analizaron los siguiente factores: la edad, el antecedente de embarazo y el IMC y su repercusión en la dosis total de gonadotrofinas, en los ovocitos capturados y en los ovocitos en metafase II. Para comparar el antecedente de embarazo y el IMC y su repercusión en la dosis total de gonadotrofinas, en los ovocitos capturados y en los ovocitos en metafase II se utilizó la prueba no pareada de la t de Student. Para comparar los grupos de edad y su repercusión en las variables estudiadas se utilizó ANOVA y la prueba de comparación múltiple de Tukey-Kramer.

Resultados En el Laboratorio de Reproducción Asistida Concibe se revisaron, de noviembre de 2004 a marzo de 2010, 53 ciclos de estimulación ovárica en 53 pacientes donantes. Se incluyó a las donantes que cumplieron con los requisitos para pertenecer al programa; a saber, tener entre 18 y 34 años de edad, con maternidad comprobada preferentemente, con serologías negativas para hepatitis B y C, sífilis y virus de la inmunodeficiencia humana 1 y 2, con estudio toxicológico negativo, con perfil hormonal basal normal en el día 2, 3 o 4 del ciclo, con ultrasonido transvaginal basal sin evidencia de daño y con logro de embarazo (19 donantes) en su primera donación.

Respecto al IMC, los resultados de las donantes se dividieron en dos grupos: grupo 1: IMC de 18.5 a 24.9, grupo 2: IMC mayor de 25 (Cuadro 1).

En relación con el IMC, no se observaron diferencias significativas en las concentraciones hormonales basales, en las concentraciones de estradiol –secundarias a la aplicación de la gonadotrofina coriónica humana–, en el número de folículos maduros, en los ovocitos capturados y en metafase II (Figura 1) y en la dosis total de gonadotrofinas utilizadas entre las donantes con IMC de 18.5 a 24.9 y con IMC mayor de 25.

Respecto al antecedente de embarazo, los resultados de las donantes se dividieron en dos grupos: grupo 1: donantes nuligestas, grupo 2: donantes con embarazo previo (Cuadro 2).

En relación con las donantes nuligestas o con embarazo previo, se observó una diferencia significativa a favor de las donantes con al menos un embarazo a término en las concentraciones de estradiol –secundarias a la aplicación de la gonadotrofina coriónica humana–, en el número de folículos maduros y en el total de ovocitos capturados y en metafase II (Figura 2); no hubo diferencia en la dosis total de gonadotrofinas ni en el perfil hormonal basal.

Respecto a la edad, los resultados de las donantes se dividieron en tres grupos: grupo 1: menores de 25 años, grupo 2: entre 25 y 29 años, grupo 3: mayores de 30 años (Cuadro 3).

En los diferentes grupos de edad no hubo diferencias significativas en el perfil hormonal basal, en el número de folículos maduros, en el total de ovocitos capturados y en metafase II y en la dosis total de gonadotrofinas utilizadas (Figura 3).

Cuadro 1. Resultados de los grupos de donantes en relación con el IMC Índice de masa corporal Edad FSH basal LH basal Estradiol basal Estradiol disparo Folículos maduros Ovocitos capturados Ovocitos en metafase II Dosis total de gonadotrofinas

Grupo 1: IMC 18.5-24.9 (n = 14)

Grupo 2: IMC > 25 (n = 5)

p

26.86 ± 3.44 6.95 ± 2.70 3.93 ± 1.82 35.79 ± 21.21 6,040 ± 3,050 10.71 ± 3.55 21 ± 13.62 10.07 ± 7.06 2,753 ± 561

25 ± 1.22 5.48 ± 0.947 4.66 ± 0.61 36 ± 12.79 6,871 ± 5,235 17 ± 8.09 26 ± 15.13 9.60 ± 6.1) 2,594 ± 308

NS NS NS NS NS NS NS NS NS

FSH: hormona folículo estimulante; LH: hormona luteinizante.

Prueba no pareada de la t de Student (p = < 0.05).

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Nuligesta

26

10 21 0

5

10

15

20

25

30

Núm. de ovocitos Ovocitos capturados

Ovocitos en metafase II

Figura 1. Ovocitos capturados y en metafase II en relación con el índice de masa corporal de la donante.

Con embarazo previo

> 25

9.6

18.5-24.9

Índice de masa corporal

Características que optimizan la selección de donantes de óvulos

6.33 17.25

16.14 31.28

0

5

10 15 20 25 30 Núm. de ovocitos Ovocitos capturados Ovocitos en metafase II

35

Figura 2. Ovocitos capturados y en metafase II en relación con el antecedente de embarazo de la donante.

Cuadro 2. Resultados de los grupos de donantes en relación con el antecedente de embarazo Antecedente de embarazo Edad IMC FSH basal LH basal Estradiol basal Estradiol disparo Folículos maduros Ovocitos capturados Ovocitos en metafase II Dosis total de gonadotrofinas

Grupo 1: donantes nuligestas (n = 12) Grupo 2: donantes con embarazo previo (n = 7) 26.66 ± 3.14 21.62 ± 2.20 7.09 ± 2.42 4.32 ± 1.48 30.58 ± 21.32 4,727 ± 3,066 10.42 ± 3.75 17.25 ± 9.14 6.33 ± 4.29 2,749 ± 504

25.86 ± 2.67 22.70 ± 4.47 5.48 ± 2.51 3.78 ± 1.78 44.9 ± 27.9 8,886 ± 3,834* 15.71 ± 6.92* 31.28 ± 14.73* 16.14 ± 9.8* 2,645 ± 546

p NS NS NS NS NS < 0.05 < 0.05 < 0.05 < 0.05 NS

IMC: índice de masa corporal; FSH: hormona folículo estimulante; LH: hormona luteinizante.

Prueba no pareada de la t de Student (*p = < 0.05).

Cuadro 3. Análisis de variancia ANOVA y prueba de comparación múltiple de Tukey-Kramer (p < 0.05) Edad IMC FSH basal LH basal Estradiol basal Estradiol disparo Folículos maduros Ovocitos capturados Ovocitos en metafase II Dosis total de gonadotrofinas

Grupo 1: < 25 años (n = 5)

Grupo 2: 25-29 años (n = 12)

Grupo 3: > 30 años (n = 2)

p

21.72 ± 2.14 6.4 ± 4.52 3.01 ± 2.65 33 ± 11.9 7,573 ± 3,674 11.2 ± 3.96 26.60 ± 13.57 8.8 ± 3.42 2,564 ± 625

22.24 ± 3.80 7.29 ± 2.35 4.52 ± 0.83 33.5 ± 28.56 5,972 ± 4,252 13.92 ± 5.91 21.58 ± 14.09 9.83 ± 9.73 2,799 ± 392

21.6 ± 0.13 7.21 ± 0.007 4.47 ± 0.69 57 ± 4.24 4,695 ± 1,269 6 ± 1.41 17 ± 4.24 13.50 ± 9.19 2,550 ± 1,060

NS NS NS NS NS NS NS NS NS

IMC: índice de masa corporal; FSH: hormona folículo estimulante; LH: hormona luteinizante.

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Guadarrama García LF y col.

Edad (años) 25-29

< 25

8.8

26.6

9.83

21.58

> 30

13.5 0

5

17

10 15 20 Núm. de ovocitos

Ovocitos capturados

25

30

Ovocitos en metafase II

Figura 3. Ovocitos capturados y en metafase II en relación con la edad de la donante.

Discusión Bush y col. analizaron 266 donaciones de óvulos sin observar algún parámetro, como edad, tipo y días de estimulación u ovocitos capturados, que influya en el porcentaje de embarazos logrados.10 Al analizar la edad –como factor que optimice la selección de donantes– diversos autores, como Faber y col., excluyeron de los programas de ovodonación a las mujeres con una edad igual o mayor a 33 años por observar que en dicho grupo de edad había disminuido el porcentaje de embarazos clínicos y de nacidos vivos; no observaron diferencias en las donantes entre 22 y 32 años de edad.11 Flisser y col. observaron que la edad de las donantes entre 21 y 32 años no afectaba el porcentaje de embarazos.12 Fiszbajn y col. concluyeron que la edad igual o menor de 25 años es el mejor factor de predicción para embarazo.13 Respecto a la edad, en nuestro estudio observamos que el mayor número de ovocitos capturados lo obtuvimos de las mujeres menores de 29 años, sobre todo, de las donantes con edad igual o menor de 25 años, aun cuando el número de ovocitos en metafase II que obtuvimos de ellas sea menor –pero no significativo– al que obtuvimos de las donantes entre 25 y 30 años. Otro parámetro que se ha estudiado es el IMC. Según Obeso y col., cuando el IMC es igual o mayor de 25 se necesita una dosis total de gonadotrofinas significativamente mayor y el número de ovocitos en metafase II es menor que en donantes con un IMC menor de 24.9.8 Respecto a la dosis total de gonadotrofinas, observamos que los resultados de nuestras donantes con un IMC menor de

180

24.9 no difirieron significativamente de los de nuestras donantes con sobrepeso. También observamos que las donantes con un IMC igual o mayor de 25 donaron un mayor número de ovocitos totales capturados; sin embargo, las donantes con un IMC menor de 24.9 donaron un mayor número de ovocitos en metafase II, aunque el número de ovocitos no fue significativo. Las dosis totales de gonadotrofinas para las donantes con un IMC menor de 24.9 o mayor de 25 no difirieron significativamente, lo cual contrasta con lo descrito por Obeso y col.; sin embargo, estos autores analizaron donantes con un IMC mayor de 30.8 En su estudio Faber y col. encontraron que la falta de fertilidad comprobada de las donantes de ovocitos no parece tener un efecto negativo en el potencial de embarazo.11 En su serie Fiszbajn y col. observaron que en las donantes sin embarazo previo hubo un mayor número de embarazos;13 esto probablemente ocurrió porque las donantes eran más jóvenes. En nuestro estudio observamos que las donantes con embarazo previo donaron muchos más ovocitos capturados y ovocitos en metafase II que las donantes sin embarazo previo; sin embargo, la dosis total de gonadotrofinas utilizadas no difirió significativamente.

Conclusiones Estudiamos exclusivamente a las donantes de ovocitos que en el primer ciclo de donación lograron un embarazo (no analizamos el factor masculino); el objetivo fue identificar las características que optimizan la selección de las donantes que tienen más probabilidades de lograr un embarazo. Se observó que en las donantes menores de 25 años se lograban capturar más ovocitos que en las donantes de mayor edad, pero la diferencia no fue significativa; esto también se observó en las donantes con un IMC menor de 24.9. Además, las donantes que lograron más embarazos eran nuligestas; sin embargo, en las donantes con embarazo previo se utilizaron menos dosis de gonadotrofinas –aunque las dosis no fueron significativas– y se capturó un mayor número de ovocitos totales y en metafase II. En conclusión, las características que optimizan la selección de donantes de ovocitos son: edad menor de 25 años, IMC menor de 24.9 y fertilidad probada; por tanto, las posibles mujeres

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Características que optimizan la selección de donantes de óvulos

aptas para ovodonación tendrían que seleccionarse con base en dichas condiciones para obtener buenas tasas de embarazo, utilizar menos dosis de gonadotrofinas y originar menos complicaciones en la donante.

REFERENCIAS 1.

2.

3.

4.

5.

6.

Remohí J, Simón C, Pellicer A. Reproducción humana.

Madrid: McGraw-Hill Interamericana; 1996;348-359.

Guidelines for oocyte donation. The American Society for Reproductive Medicine. Fertil Steril 2002;77(5):S6-S8.

Soderstrom-Anttila V. Pregnancy and child outcome alter oocyte donation. Hum Reprod Update 2001;7:28-32.

Stolwijk A, Zielhuis G, Sauer M, Hamilton CJ, Paulson RJ. The impact of the woman’ age on the success of standard and donor in vitro fertilization. Fertil Steril 1997;67:702-710.

Gougeon A. Dynamics of follicular growth in the human: a model from preliminary results. Hum Reprod 1986;1:81-87.

Brzyski R, Muasher S, Droesch K, Simonetti S, et al.

Follicular atresia associated with concurrent initiation of gonadotropin releasing hormone agonist and follicle-

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

stimulating hormone for oocytes recruitment. Fertil Steril 1988;50:917-921.

Tomas C, Nuojua-Huttunen S, Martikainen H. Pretreatment transvaginal ultrasound examination predicts ovarian responsiveness to gonadotrophins in in-vitro fertilization. Hum Reprod 1997;12:220-223.

Obeso I, Galache P, Sepúlveda J, Díaz P, Patrizi P. The impact of body mass index on ovarian stimulation in young oocyte donors. Fertil Steril 2009;92(3, Suppl 1):S103.

Mack CK, Pascal C, Gupta N, Cekleniak NA, et al. In search of the perfect donor: age and BMI influences in egg donors.

Fertil Steril 2006;86(3 Suppl 1):S410.

Bush CJ, Beltsos AN, Sasada KL, Martin-Johnston MK, et al. Clinical response of successful donor oocyte cycles. Fertil Steril 2007;88:S141-S142.

Faber BM, Mercan R, Hamacher P, Muasher SJ, Taner JP. The impact of an egg donor’s age and her prior fertility on recipient pregnancy outcome. Fertil Steril 1997;68:370-372.

Flisser E, Kump LM, Krey LC, Licciardi F. Donor age does not impact the success of oocyte donation cycles. Fertil Steril 2006;86:S211 Fiszbajn K, Maero R, Lipowicz S, et al, Searching for the ideal donor in an oocyte donation program. Fertil Steril 2004;82(Suppl 2):S144.

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Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción 2011;3(4):182-187

Artículo original

El valor de la suplementación de la fase lútea con valerianato de estradiol y progesterona en un programa de reproducción asistida Israel Obed Carmona Ruiz,* Roberto Santos Haliscak,** Pedro Galache Vega,** Samuel Hernández Ayup,** Víctor Alfonso Batiza Reséndiz,1 Pablo Díaz Spíndola,*** María Lidia Arenas Montezco**** RESUMEN Objetivo: investigar si la adición de estradiol al esquema de progesterona como soporte de la fase lútea de ciclos de reproducción asistida en fresco mejora los resultados en un programa de esta naturaleza.

Pacientes y método: esta prueba se realizó en el Instituto para el Estudio de la Concepción Humana (IECH), en la ciudad de Monterrey, Nuevo León. Se incluyeron ciclos del programa de fertilización in vitro-inyección intracitoplasmática de espermatozoides con transferencia de embriones (FIV-ICSI con TE) entre enero y diciembre de 2009. Las pacientes se dividieron en dos grupos de acuerdo con la suplementación de la fase lútea: grupo I (n = 24), adición de valerianato de estradiol y progesterona; grupo II (n = 92), suplementación única con progesterona. Se analizaron los porcentajes de embarazo y de implantación mediante una comparación de medias con el fin de establecer una diferencia significativa en los distintos grupos formados, y las variables categóricas con la prueba de ji al cuadrado; en las variables continuas se aplicó la prueba t de Student para la comparación de medias.

Resultados: el índice de embarazo en el grupo I fue de 41.6% y en el grupo II, de 40.2% (p no significativa), en tanto que el índice de implantación fue de 14.2% para el grupo I y de 16.9% para el grupo II (p no significativa).

Conclusiones: con base en los resultados preliminares de este trabajo, se concluye que el soporte de la fase lútea con progesterona y valerianato de estradiol como coadyuvante no ofrece mejores resultados en un programa de FIV-ICSI con TE que la administración de progesterona sola.

Palabras clave: suplementación de la fase lútea, valerianato de estradiol, progesterona, programa de reproducción asistida.

ABSTRACT Objective: To investigate if the addition of estradiol to progesterone scheme during luteal phase in fresh cycles of assisted reproduction improves outcomes of a program of assisted reproduction.

Patients and method: This study was conducted at the Institute for the Study of Human Conception, in Monterrey, Nuevo Leon, Mexico. Cycles of in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection with embryo transfer were included from January to December 2009. Patients were divided into two groups according to supplementation of the luteal phase: group I (n = 24), with estradiol valerianate and progesterone, group II (n = 92), only with progesterone supplementation. We analyzed the pregnancy and implantation rates by comparison of means to establish a significant difference in the different groups, and the categorical variables with c2 test; continuous variables were analyzed with Student’s t-test comparison of means.

Results: The pregnancy rate in group I was 41.6% and in group was 40.2% (p non significant), and the implantation rate was 14.2% for group I and 16.9% for group II (p non significant).

Conclusions: Preliminary results of this study indicated that supplemental progesterone and estradiol during luteal phase do not provide better results than progesterone alone in a program of in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection with embryo transfer.

Key words: supplementation of the luteal phase, valerianate of estradiol, progesterone, assisted reproduction program. *

Profesor adjunto de la Subespecialidad en Biología de la Reproducción, Unidad Médica de Alta Especialidad núm.

23, IMSS, Monterrey, NL. ** Codirector. *** Coordinador de Enseñanza e Investigación. *** Coordinadora de Quirófano.

Centro de Fertilidad IECH, Monterrey, NL. 1

Biólogo de la Reproducción.

Correspondencia: Dr. Israel Carmona R. Av. Constitución 1881 Pte., 1er piso, consultorio 108, colonia Obispado, CP 64060,

182

Monterrey, Nuevo León.

Recibido: marzo, 2011. Aceptado: abril, 2011.

Este artículo debe citarse como: Carmona-Ruiz IO, SantosHaliscak R, Galache-Vega P, Hernández-Ayup S y col. El valor de la suplementación de la fase lútea con valerianato de estradiol y progesterona en un programa de reproducción asistida. Rev Mex Reprod 2011;3(4):182-187. www.nietoeditores.com.mx

Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción Volumen 3, núm. 4, abril-junio, 2011

El valor de la suplementación de la fase lútea con valerianato de estradiol y progesterona

P

ara la implantación del blastocisto y el mantenimiento del embarazo se requiere un endometrio receptor.1 El desarrollo del endometrio receptor se alcanza cuando el útero se expone a los esteroides ováricos en tiempo y cantidad suficientes y adecuados. El papel del estrógeno durante la fase folicular del ciclo menstrual en el desarrollo del endometrio está bien establecido; sin embargo, su función en la implantación y mantenimiento del embarazo en la fase lútea sigue siendo motivo de controversia.2,3 Es común que en la práctica clínica, en casos en los que la función ovárica está ausente (como en las pacientes receptoras de los programas de donación ovular), el soporte de la fase lútea se lleve a cabo con progesterona y estradiol, con lo que se obtienen altos porcentajes de implantación y de nacidos vivos.4 Si se lleva a cabo la suplementación de la fase lútea con estradiol y progesterona, aun con función ovárica, es posible que mejore la receptibilidad endometrial.

En un estudio piloto, conducido por el Dr. Galache y colaboradores (comunicación oral) en el Instituto para el Estudio de la Concepción Humana de Monterrey, se llevó a cabo la suplementación de la fase lútea con valerianato de estradiol y progesterona en pacientes que buscaban técnicas de reproducción asistida de baja complejidad; el resultado fue un porcentaje de embarazo superior (con significado estadístico) que el alcanzado en las que únicamente recibieron progesterona (datos no publicados). Con esta justificación, se diseñó un estudio con la hipótesis de que las pacientes infértiles que requieren entrar a un programa de reproducción asistida de alta complejidad tienen menor exposición del endometrio al estradiol durante la fase lútea y, por tanto, menor receptibilidad. La suplementación de la fase lútea con estradiol y progesterona debe aumentar los porcentajes de implantación y embarazo clínico en dichos casos.

JUSTIFICACIÓN El propósito del estudio fue evaluar el efecto del valerianato de estradiol como coadyuvante en el soporte de la fase lútea de ciclos de un protocolo de fertilización in vitro-inyección intracitoplasmática de espermatozoides (FIV-ICSI) con transferencia de embriones.

El beneficio esperado es el de ofrecer una mayor probabilidad de éxito mediante un método seguro, sencillo y económico.

OBJETIVO Investigar si la adición de valerianato de estradiol al esquema de progesterona como soporte de la fase lútea de ciclos de FIV-ICSI con transferencia de embriones mejora los resultados.

Objetivos específicos

Investigar si la administración de estradiol como suplemento de la fase lútea aumenta el índice de embarazo bioquímico.

Investigar si la administración de estradiol como suplemento de la fase lútea incrementa el índice de implantación.

HIPÓTESIS La adición del valerianato de estradiol al soporte de fase lútea con progesterona vaginal en ciclos de FIV-ICSI con transferencia de embriones incrementa los índices de embarazo bioquímico e implantación, en comparación con los regímenes con progesterona sola. pacientes Y MÉTODO Se hizo un estudio experimental, prospectivo, comparativo, no aleatorio, probabilístico, en el Instituto para el Estudio de la Concepción Humana, en la ciudad de Monterrey, Nuevo León. Se incluyeron ciclos del programa de FIV-ICSI con transferencia de embriones entre enero y diciembre de 2009, que reunieron los criterios de inclusión y exclusión enumerados en los Cuadros 1 y 2.

En el Cuadro 3 se enlistan los criterios de cancelación.

Se formaron dos grupos, el de casos (ciclos en los que se administraron estrógeno y progesterona en la fase lútea) y el de controles (ciclos con administración exclusiva de progesterona), y se compararon los índices de embarazo y de implantación. Los resultados se analizaron mediante una comparación de medias con el fin de establecer una diferencia significativa en los distintos grupos de ciclos.

Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción Volumen 3, núm. 4, abril-junio, 2011

183

Carmona Ruiz IO y col.

Cuadro 1. Criterios de inclusión •

Pacientes que entraron a un ciclo de FIV-ICSI con transferencia de embriones Edad de 18 a 39 años IMC de 18 a 30 Tener ambos ovarios Perfil hormonal basal Estradiol entre 30 y 80 pg/mL FSH entre 2 y 10 UI/L LH entre 2 y 10 UI/L* Prolactina ≤ 25 ng/mL Uso de agonista de GnRH en protocolo de fase lútea tardía

• • • •

•

* Un 30-70% del valor de la FSH representa el valor de LH. Cuadro 2. Criterios de exclusión • • •

Donación de óvulos Perfil hormonal basal diferente al descrito previamente No transferencia embrionaria

Cuadro 3. Criterios de cancelación • •

Rechazo de la paciente en cualquier etapa del protocolo Aparición del síndrome de hiperestimulación ovárica severa

Fórmula para calcular el tamaño de la muestra: 2* (Zα+Zβ)2* s2 418.2025 N = __________ _____________________ d2

N: número de sujetos necesarios en cada uno de los grupos.

Zα: valor de Z correspondiente al riesgo α fijado.

Zβ: valor de Z correspondiente al riesgo β fijado. s2: variancia de la distribución de la variable cuantitativa que se supone que existe en el grupo de referencia. d2: valor mínimo de la diferencia que se desea detectar.

Si se fija un riesgo α de 5% y un riesgo β de 20%, el número necesario de sujetos por cada grupo sería de 328.

La metodología para cada grupo fue la siguiente: Grupo I (casos, n = 24): se suplementó la fase lútea con valerianato de estradiol y progesterona. El estradiol se administró en tabletas de 2 mg (Primogyn®) por vía oral tres veces al día; es decir, una dosis de 6 mg diarios iniciando el día de la aspiración ovular. La

184

progesterona se indicó en dos óvulos de 200 mg por las noches por vía vaginal, comenzando el día de la aspiración folicular.

Grupo II (controles, n = 92): ciclos con administración exclusiva de progesterona. La progesterona se aplicó en dosis de dos óvulos por las noches por vía vaginal, comenzando el día de la aspiración folicular.

Se analizaron los porcentajes de embarazo y de implantación mediante una comparación de medias con el fin de determinar si existe diferencia significativa en los distintos grupos de ciclos. Las variables categóricas se evaluaron con prueba de ji al cuadrado, y en variables continuas se aplicó la prueba t de Student para la comparación de medias. Se consideró que un valor de p < 0.05 tenía significado estadístico.

La recolección, la presentación y la caracterización de los datos de la población se realizaron mediante estadística descriptiva.

En el Cuadro 4 se definen las variables independientes y dependientes de los grupos de estudio.

Recursos físicos y financieros

Sólo se utilizaron recursos físicos y financieros del Instituto para el Estudio de la Concepción Humana de Monterrey.

RESULTADOS Los datos generales de cada ciclo se exponen en el Cuadro 5. El Cuadro 6 muestra las características de la hiperestimulación ovárica: número de ampolletas de gonadotropinas y menotropinas, y la respuesta a dicha estimulación medida el día 10 a través del número de folículos mayores de 15 mm, la cifra de estradiol sérico y el grosor endometrial. Se enumeran, además, la cantidad de ovocitos inyectados-inseminados y fertilizados por ciclo, el índice de fertilización y el número de embriones transferidos por cada ciclo.

En el Cuadro 7 se observan los resultados del procedimiento.

DISCUSIÓN Aunque no se encontró diferencia estadística en cuanto a edad, tiempo de infertilidad, perfil hormonal basal y

Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción Volumen 3, núm. 4, abril-junio, 2011

El valor de la suplementación de la fase lútea con valerianato de estradiol y progesterona

Cuadro 4. Definición de variables independientes y dependientes Definición Variables independientes Edad mujer (años)

Edad cronológica, variable cuantitativa

Tiempo de infertilidad (años)

Tiempo diagnosticado de infertilidad, variable cuantitativa

FSH (d3) UI/L

Concentración sérica de FSH en el día 3 del ciclo, variable cuantitativa

LH (d3) UI/L

Concentración sérica de LH en el día 3 del ciclo, variable cuantitativa

E2 (d3) pg/mL

Concentración sérica de estradiol en el día 3 del ciclo, variable cuantitativa

Prolactina ng/mL

Concentración sérica de prolactina, variable cuantitativa

Factor masculino

Alteración en parámetros seminales acorde con los valores de la OMS, variable categórica

Factor tubario

Alteración en una o dos salpinges diagnosticada por HSG, LPSC (o ambas), variable categórica

Factor ovárico

Alteración en el perfil hormonal o sonográficamente (SOP), variable categórica

Factor uterino

Alteración en la cavidad uterina diagnosticada por USG, HSG, HSC (o las tres), variable categórica

Número de ampolletas de FSHr

Número de ampolletas de FSHr de 75 UI utilizadas en la estimulación ovárica, variable cuantitativa

Número de ampolletas de hMG

Número de ampolletas de hMG de 75 UI utilizadas en la estimulación ovárica, variable cuantitativa

Folículos >15 mm (d10)

Número de folículos mayores de 15 mm en diámetro mayor en el día 10 del ciclo estimulado medidos por USG TV, variable cuantitativa Concentración sérica de estradiol en el día 10 del ciclo estimulado, variable cuantitativa

E2 (d10) pg/mL Grosor endometrial (d10) Inyec/insem

Grosor endometrial en mm en el día 10 del ciclo estimulado medido por USG TV, variable cuantitativa Número de ovocitos inyectados o inseminados por ciclo, variable cuantitativa

Ovocitos fertilizados

Número de ovocitos fertilizados por cada ciclo, variable cuantitativa

Índice de fertilización

Relación entre el número de ovocitos fertilizados y el número de ovocitos inyectados/inseminados por ciclo, variable cuantitativa Número de embriones transferidos Media del número de embriones transferidos por ciclo, por grupo; variable cuantitativa Variables dependientes Índice de embarazo bioquímico Índice de implantación

Relación entre el número de pruebas séricas positivas de embarazo entre el total de pacientes que efectuaron dicha prueba Relación entre el número de embriones transferidos y el número de sacos visibles por USG TV a las cuatro semanas de la transferencia, variable cuantitativa

Cuadro 5. Características generales de los pacientes por grupo de estudio Factor Edad mujer (años) Tiempo de infertilidad (años) FSH (d3) UI/L LH (d3) UI/L E2 (d3) pg/mL Prolactina Factor masculino (%) Factor tubario (%) Factor ovárico (%) Factor uterino (%) Factor inexplicable (%)

Grupo 1

Grupo 2

p

34.9 5.5 6.7 4.8 39.3 21.5 41 29.1 25 16.6 4.1

33.5 4.3 6.2 3.9 42.4 18.5 61.9 32.6 9.7 21.7 0

NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS

Cuadro 6. Características de cada ciclo por grupo de estudio Factor

Grupo 1 Grupo 2

Número de ampolletas de FSHr 24.5 Número de ampolletas de hMG 14.2 Folículos >15 mm (d10) 6.4 E2 (d10) pg/mL 1724.5 Grosor endometrial (d10) 8.7 Inyec/insem 7.9 Ovocitos fertilizados 4.5 Índice de fertilización 58.9 Número de embriones transferidos 2.5

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32.9 9.5 7.7 1875 9.3 8.4 4.4 52.5 2.3

p S S NS NS NS NS NS NS NS

185

Carmona Ruiz IO y col.

Cuadro 7. Resultados del procedimiento Factor Índice de embarazo bioquímico Índice de implantación

Grupo 1

Grupo 2

p

41.6 14.2

40.2 16.9

NS NS

causa más frecuente de infertilidad de las pacientes, se puede apreciar que las del grupo 1 eran mayores que las del grupo 2 (34.9 vs 33.5 años), lo cual concuerda con el perfil hormonal promedio (Cuadro 5), en el que la FSH y la LH fueron superiores en el grupo 1, con estradiol sérico basal menor para el grupo 1 que para el grupo 2 y mayor tiempo de infertilidad para el primer grupo. La explicación de la falta de diferencia estadística puede recaer en el número de casos por cada grupo.

En cuanto a la estimulación ovárica, se encontró diferencia estadística en el número de ámpulas utilizadas de FSHr y de hMG (Cuadro 6). Esto tiene dos componentes: primero, los diferentes esquemas de estimulación ovárica de cada médico que participó en el trabajo, y segundo, las variables edad y perfil hormonal basal, las cuales, al individualizar cada caso, afectan el esquema de estimulación en cuanto al número de ámpulas utilizadas para cada medicamento en particular. La respuesta a la estimulación ovárica dada por el número de folículos mayor de 15 mm, la concentración de estradiol sérico y el grosor endometrial, estimados el día 10 del ciclo, no mostraron diferencias significativas al comparar los grupos (Cuadro 6). A su vez, el número de ovocitos inyectados/inseminados, el índice de fertilización y el número de embriones transferidos por grupo fue similar; aunque esto puede ser un punto a favor de la homogeneidad de ambos grupos de estudio, se aprecian diferencias que pueden estar relacionadas con la edad y el perfil hormonal basal, como concentraciones de estradiol más bajas en el grupo 1 que en el grupo 2 (1,724.5 vs 1,875 pg/mL, respectivamente), grosor endometrial de 8.7 mm del grupo 1 comparado con 9.3 mm del grupo 2, y menor número de ovocitos en ciclos del grupo 1 que en los del grupo 2 (7.9 vs 8.4, respectivamente). Si bien el factor masculino es el más frecuente para ambos grupos, la diferencia con la que se presenta en cada uno de ellos (41 vs 61.9% para el 1 y el 2, respectivamente) puede afectar el índice de fertilización de los grupos (58.9 vs 52.5% para el 1 y el 2, respectivamente).

186

No hubo diferencia significativa en el porcentaje de embarazo bioquímico de cada grupo de estudio (41.6 vs 40.2% para el grupo 1 y el 2, respectivamente). Esto coincide con los resultados obtenidos por Fatemi y colaboradores, quienes reportaron porcentajes de embarazo de 29.7% para el grupo de soporte de la fase lútea con estradiol y progesterona, contra 26% del grupo de progesterona solamente.5 La diferencia más importante entre este trabajo y el mencionado es el protocolo de supresión; en éste se eligió la supresión con agonista de la GnRH en fase lútea tardía, y en el de Fatemi y colaboradores, la supresión con antagonista de la GnRH.5 En la revisión sistemática y metanálisis publicados por Gelbaya y colaboradores en 2008, se registraron porcentajes de embarazo de 38.9% para pacientes con soporte de fase lútea con estradiol y progesterona, y de 32% para mujeres con progesterona únicamente. No hay diferencia significativa entre dichos esquemas de tratamiento, lo cual es similar a los resultados que se obtuvieron en este estudio.6 De acuerdo con Fatemi, la heterogeneidad en los estudios es una de las principales limitantes para llegar a conclusiones definitivas, algo en lo que los autores de este estudio están de acuerdo y que se considera que afecta y limita este trabajo.

El índice de implantación obtenido fue similar en ambos grupos, de 14.2% para el grupo 1 y de 16.9% para el grupo 2, sin diferencias estadísticas. Esto difiere del metanálisis de Pritts y Atwood, quienes destacaron que la variable que refleja las ventajas de añadir estradiol al soporte de fase lútea con progesterona es el porcentaje de implantación; esto, en ciclos con supresión hipofisaria mediante agonista de la GnRH en fase lútea tardía, como en este estudio;7 sin embargo, en el metanálisis más reciente de Gelbaya y colaboradores se comunicaron índices de implantación de 23.7 y 22.1% para los grupos de estradiol+progesterona y progesterona, respectivamente, sin diferencias significativas. Nuevamente, la heterogeneidad de los estudios incluidos en este último metanálisis no permite establecer una conclusión final.6 Entre los aspectos que limitan los resultados de este trabajo se encuentran: el hecho de ser un estudio de cohorte; no hay distribución al azar de los ciclos; el número de casos incluidos por cada grupo de estudio, lo cual a su vez podría revelar diferencias estadísticas en las características generales de las pacientes, para lo

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El valor de la suplementación de la fase lútea con valerianato de estradiol y progesterona

cual tendrían que ajustarse los grupos; y las diferencias en los esquemas de estimulación, que son el producto de la participación de varios médicos y de la individualización del manejo de cada paciente.

Es posible que sólo sea un subgrupo de pacientes en los programas de reproducción asistida el que desarrolle un defecto en la impregnación con estradiol o que requiera estradiol adicional. Tales grupos podrían estar constituidos por mujeres con concentraciones bajas basales de estradiol, de LH, o de ambas. Sólo ellas serían las beneficiadas con la adición de valerianato de estradiol durante la fase lútea. Dadas las características del programa de reproducción asistida del Instituto para el Estudio de la Concepción Humana y el tiempo con que se contaba para llevar a cabo este estudio, fue necesario limitar la investigación a un grupo de pacientes con perfil hormonal basal normal.

Este trabajo muestra resultados preliminares, por tanto, es necesario reunir muestras mayores para poder definir mejor grupos y subgrupos y dar, así, conclusiones definitivas.

progesterona y valerianato de estradiol como coadyuvante no ofrece mejores resultados en un programa de fertilización in vitro-inyección intracitoplasmática de espermatozoides con transferencia de embriones en comparación con la progesterona sola.

REFERENCIAS 1.

2.

3.

4.

5.

6.

CONCLUSIONES Con base en los resultados preliminares de este trabajo, se determina que el soporte de la fase lútea con

7.

Maslar IA. The progestational endometrium. Semin Reprod Endocrinol 1988;6:115-128.

Ghosh D, Sengupta J. Luteal phase ovarian oestrogen is not essential for implantation and maintenance of pregnancy from surrogate embryo transfer in the rhesus monkey. Hum Reprod 1994;9:639-637.

De Ziegler D. Hormonal control of endometrial receptivity.

Hum Reprod 1995;10:4-6.

Kaider AS, Coulam C. Luteal estrogen supplementation in pregnancies associated with low serum estradiol concentrations. Early Pregnancy 2000;4:191-199.

Fatemi HM, Kolibianakis EM, Camus M, Tournaye H, et al. Addition of estradiol to progesterone for luteal supplementation in patients stimulated with GnRH antagonist/ rFSH for IVF: a randomized controlled trial. Hum Reprod 2006;21:2628-2632.

Gelbaya T, Kyrgiou M, Tsoumpou I, Nardo L. The use of estradiol for luteal phase support in in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection cycles: A systematic review and meta-analysis. Fertil Steril 2008;90(6):2116-2125.

Pritts EA, Atwood AK. Luteal phase support in infertility treatment: a meta-analysis of the randomized trials. Hum Reprod 2002;17:2287-2299.

FE DE ERRATAS

En la fotografía de la portada del número 3, volumen 3 (enero-marzo, 2011) debieron aparecer los siguientes nombres: Dr. Robert Geoffrey Edwards, Bióloga Kay Elder, Louise Brown (niña) y Dr. Patrick Steptoe.

Asimismo, el último párrafo del editorial (volumen 3, número 3, página 100) debió decir así: Ojalá nos pudiéramos sentir culpables de que nos convirtamos en un personaje como Nobel cuando esta innovación reproductiva en casos que no cumplamos con el objetivo para el cual fue creada: solucionar la infertilidad de parejas infértiles de acuerdo a los límites de nuestra sociedad.

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Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción 2011;3(4):188-192

Artículo original

Incidencia de embarazo múltiple en el Hospital Ángeles Lomas y su relación con las técnicas de reproducción asistida Alberto Kably Ambe,* Jorge Alberto Campos Cañas,* Heidy Ortiz Reyes,* Jaime Ignacio Cevallos Bustillos,* Diana Elena Monzalbo Núñez** Resumen Antecedentes: el embarazo de alto orden fetal, como producto del uso de técnicas de reproducción asistida, supone un mayor riesgo en comparación con los embarazos únicos. Por el frecuente uso de estas técnicas se observó a partir de 1980 un notable aumento en la incidencia de este tipo de embarazos. Los embarazos de alto orden fetal constituyen solamente 3% del total de nacimientos y son responsables de morbilidad y mortalidad materno-fetales altas.

Objetivo: exponer el resultado y desenlace perinatales de los embarazos de alto orden fetal atendidos en el Hospital Ángeles Lomas y su relación con las técnicas de reproducción asistida.

Material y métodos: estudio retrospectivo en el que se analizaron todos los embarazos múltiples que en el Hospital Ángeles Lomas fueron atendidos de enero de 2005 a mayo de 2010. Como variables de salida se consideraron el diagnóstico y tiempo de infertilidad, la edad y la técnica de reproducción utilizada. Se realizó el examen de Apgar al minuto y a los cinco minutos y se analizaron la edad gestacional al nacimiento, el peso, el desenlace del recién nacido y las complicaciones obstétricas.

Resultados: se encontraron 35 embarazos múltiples (un embarazo cuádruple y 34 embarazos triples) atendidos en el periodo indicado. Los embarazos fueron obtenidos así: 22.8% (n = 8) por inducción de la ovulación, 5.7% (n = 2) por hiperestimulación ovárica controlada, 8.5% (n = 3) por inseminación artificial homóloga, 28.5% (n = 10) por fertilización in vitro con transferencia de embriones (FIV-TE) e inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI por sus siglas en inglés) y 2.8% (n = 1) de manera espontánea. La edad promedio fue de 30.6 años (DE 4.27). En FIV-TE se observó un promedio de 3.75 embriones transferidos, con calidad promedio de 1.05 (escala de 1 a 6 según la cantidad de blastómeros y el grado de fragmentación). Respecto a la resolución, todos los recién nacidos fueron obtenidos por cesárea; la edad gestacional promedio fue de 31.6 (DE 2.76); la calificación de Apgar fue: al minuto de 7.9 (DE 1.15) y a los cinco minutos de 8.7 (DE 0.57); el peso promedio fue de 1,422 g (DE 422.65). Se observaron tres defunciones (8.5%). Las principales complicaciones obstétricas fueron: preeclampsia (11.4%, n = 4), restricción del crecimiento intrauterino (8.5%, n = 3) y diabetes gestacional/rotura prematura de membranas (5.7%, n = 2).

Conclusiones: en los procedimientos de baja complejidad (inseminación artificial homóloga) [1.9%] y en los de alta complejidad (3.7%) se observó una tasa baja de embarazos múltiples. En nuestro estudio la tasa de complicaciones no fue mayor a la reportada en la bibliografía y el desenlace de los recién nacidos fue bueno en general, con una mortalidad de 8.5%.

Palabras clave: embarazo múltiple, alto orden fetal, nacimientos múltiples, reproducción asistida.

Abstract Background: High order pregnancies are more probable than singleton pregnancies in the use of assisted reproductive techniques.

Since the 1980s there have been a higher number of multiple pregnancies. High order pregnancies are about 3% of all births, and are responsible for a high mortality rates in the mother and the fetuses.

Objective: To explain the outcome and perinatal outcome of pregnancies of high fetal order treated at the Angeles Lomas Hospital and its relationship with assisted reproductive techniques.

Material and methods: This is a retrospective study, analyzing all multiple pregnancies that took place in Angeles Lomas Hospital in Mexico throughout January 2005 to January 2010. Variables were diagnosis and time of infertility, age and the reproductive technique that was used. We analyzed gestational age at the moment of birth, Apgar scores in the first minute and five minutes, weight, newborns outcome and the obstetrical complications.

Results: We found a total of 35 multiple pregnancies that took place in the period of time studied. 22.8% were obtained by ovulation induction (n = 8), 5.7% by controlled ovarian hyperstimulation (n = 2), 8.57% by homologous artificial insemination (n = 3), 28.5%

by IVF-ET/ICSI (n = 10), and 2.85% (n = 1) by a spontaneous pregnancy. The age range was 30.6 years (SD 4.27). In patients with IVF we observed an average of 3.75 transferred embryos, with a quality of 1.05. 100% of the newborns where delivered by cesarean section, the gestational age average was 31.6 weeks (SD 2.76), Apgar scores 7.9 (SD 1.15)/8.79 (SD 0.57), and average weight was 1,442 g (SD 422.65). We observed 3 deaths (8.57%). The main obstetrical complications were preeclampsia (11.42%, n = 4), fetal growth restriction (8.57%, n = 3), and gestational diabetes/premature rupture of membranes (5.71%, n = 2).

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Incidencia de embarazo múltiple en el Hospital Ángeles Lomas y su relación con las técnicas de reproducción asistida

Conclusions: We observed a low rate of multiple birth in low complexity procedures (1.94%, homologous artificial insemination), and in high complexity procedures (3.75%). In our study the complication rate was not higher than what is reported in the literature, the new born outcome was generally good, with an 8.5% of mortality rate.

Key words: multiple pregnancy, high order pregnancy, multiple births, assisted reproduction.

L

os embarazos de alto orden fetal se han convertido actualmente en uno de los mayores retos que enfrentan los centros de reproducción asistida.1 Es bien sabido que estos nacimientos representan 2 a 3% del total de los mismos y 11 a 14% de las muertes fetales.1,2 Entre 1980 y 1999 la tasa de embarazos múltiples aumentó en más de 59%.3 En el año 2000 se reportó en Estados Unidos que 0.9% de todos los nacimientos fue resultado de alguna técnica de reproducción asistida.1,3 En el año 2000 se reportó en Europa una tasa total de embarazos triples de 2%, tasa que fue menor a la tasa (3.7%) reportada en 19974,5 y que contrastaba con la tasa de embarazos triples (4.3%) reportada ese mismo año en Estados Unidos.3 La razón principal de las tasas bajas que se han reportado en Europa, en comparación con las de Estados Unidos, es la reducción de embriones transferidos por ciclo; en los países europeos la tendencia es transferir un solo embrión. En ese año en Europa sólo 6.7% de las transferencias fue de más de tres embriones;4,5 en contraste, en Estados Unidos una tercera parte de las transferencias fue de más de tres embriones. Sin embargo, el número promedio de embriones transferidos a mujeres menores de 35 años disminuyó de 3.8 por transferencia en 1996 a 2.9 en 2000, con la correspondiente disminución (de 6.5 a 4.3%) de la tasa de nacimientos triples.1,3,6

* Centro Especializado para la Atención de la Mujer. ** Residente de cuarto año de Ginecología y Obstetricia

Hospital Ángeles Lomas.

Correspondencia: Dr. Jorge Alberto Campos Cañas; jcampos@hotmail.com Recibido: diciembre, 2010. Aceptado: febrero, 2011.

Este artículo debe citarse como: Kably-Ambe A, Campos-Cañas JA, Ortiz-Reyes H, Cevallos-Bustillos JI, Monzalbo-Núñez DE. Incidencia de embarazo múltiple en el Hospital Ángeles Lomas y su relación con las técnicas de reproducción asistida. Rev Mex Reprod 2011;3(4):188-192. www.nietoeditores.com.mx

En México, en comparación con otros países, no se cuenta con datos estadísticos completos referentes a embarazos múltiples por año y a la relación de éstos con técnicas de reproducción asistida. Sin embargo, un estudio realizado en el norte de México reportó que en los últimos 35 años ha habido 208 nacimientos de alto orden fetal, que corresponden a una tasa de 0.72 por cada 1,000 nacimientos; sin embargo, el estudio no especifica cuántos de los nacimientos fueron logrados por métodos de reproducción asistida.7 El embarazo de alto orden fetal conlleva muchas complicaciones bien conocidas, como mayor morbilidad –incluido en ésta el riesgo de sufrir hipertensión (RM 2.0-3.0)–, hemorragia posparto (RM 4.0), muerte materna (RM 2.0-3.0), polihidramnios y amenaza de parto pretérmino, así como un aumento en la tasa de cesárea.1,2 Hay mayor riesgo de diabetes gestacional (RM 1.6) y de placenta de inserción baja (RM 2.0).1,2 Respecto a las complicaciones para los neonatos, el riesgo de prematurez es significativamente más elevado en los nacidos de embarazos de alto orden fetal; al nacer los recién nacidos triples pesan –en promedio– entre 1,700 y 1,800 gramos, según los reportes de Estados Unidos y del Reino Unido, respectivamente, y la resolución del embarazo en Estados Unidos y en el Reino Unido ocurre a las 32.5 y 34 semanas, respectivamente.1,2,4,5 La tasa de parálisis cerebral en nacimientos triples es de 26.7 por cada 1,000 nacidos vivos, tasa que contrasta con la de 1.6 por cada 1,000 nacidos vivos de embarazos únicos.

Aproximadamente 90% de los nacimientos triples son pretérmino; por eso, el riesgo de morir de cada recién nacido es 20 veces mayor en el primer mes de vida.4 Respecto a las consecuencias económicas, en Estados Unidos el costo promedio de un nacimiento de embarazo único se estima en 9,845 dólares; en contraste, el costo de un nacimiento triple es de 109,765 dólares. Esto sin considerar el costo del tratamiento durante los ciclos de FIV-TE.8 También debe ponerse especial atención al aspecto psicosocial relacionado con el embarazo múltiple que

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189

Kably Ambe A y col.

MATERIAL Y MÉTODO

70 60

40 30 20 10 0

No

p

es

do

ica

if ec

M

no

uli

c as

ino

er Ut

E

no

cri

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b Tu

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Figura 1. Causas de infertilidad.

Se realizó un estudio retrospectivo, transversal, descriptivo y observacional. Se revisaron todos los expedientes clínicos de las mujeres que entre enero de 2005 y mayo de 2010 cursaron con embarazo de alto orden fetal en el servicio de Ginecología y Obstetricia del Hospital Ángeles Lomas; el propósito de la revisión fue evaluar la incidencia y prevalencia de los embarazos múltiples relacionados con las técnicas de reproducción asistida –como inducción de la ovulación, hiperestimulación ovárica controlada + coito programado, inseminación artificial homóloga, FIV-TE e ICSI–, las complicaciones durante el embarazo y el desenlace perinatal. El embarazo con tres o más fetos se definió como embarazo de alto orden fetal. Se excluyeron los embarazos gemelares.

Respecto a las técnicas de reproducción asistida utilizadas para lograr el embarazo, se encontró que en 62.8% (n = 22) de los casos no se especificaba si hubo alguna técnica de reproducción implicada; en 22.8% (n = 8) el embarazo se logró únicamente con inducción de la ovulación; en 20% (n = 7), por FIV-TE; en 8.5% (n = 3), por inseminación artificial homóloga; en 8.5% (n = 3), por ICSI, y en 5.7% (n = 2), por hiperestimulación ovárica controlada + coito programado (Figura 2).

Respecto a los resultados perinatales, la edad gestacional promedio a la resolución del embarazo fue de 31.6 semanas de gestación (SDG) [DE 2.76 semanas].

La calificación de Apgar que se obtuvo al minuto fue

RESULTADOS

70 60 Porcentaje

Se evaluaron 35 expedientes de pacientes con embarazo de alto orden fetal atendidas de enero de 2005 a mayo de 2010. Se encontró que 97.1% de los embarazos fueron secundarios a técnicas de reproducción asistida (n = 34) y que 2.8% (n = 1) ocurrió de manera espontánea.

En 97.1% (n = 34) de las pacientes se estableció diagnóstico de infertilidad primaria, y en 2.8% (n = 1), diagnóstico de infertilidad secundaria. El tiempo de infertilidad de las pacientes fue de 1.4 años (DE 0.72 años).

Las causas de infertilidad fueron: en 62.8% (n = 22) un factor no especificado, en 14.2% (n = 5) un factor masculino, en 14.2% (n = 5) un factor endocrino, en 5.7% (n = 2) un factor tuboperitoneal y en 2.8% (n = 1) un factor uterino (Figura 1).

190

50

Porcentaje

resulta de técnicas de reproducción asistida. Al respecto, Ellison y col. realizaron un estudio en 2005 para conocer la calidad de vida de las familias sometidas a técnicas de reproducción asistida y con embarazos múltiples; en dicho estudio ellos encontraron baja calidad de vida, mayor riesgo de estigmatización social, depresión materna e insatisfacción marital.9 El propósito de nuestro estudio es exponer el resultado y desenlace perinatales de los embarazos de alto orden fetal atendidos en el Hospital Ángeles Lomas y su relación con las técnicas de reproducción asistida.

50 40 30 20 10 0

IO H

+ OC

CP

IAH

-TE FIV

I

No cado cifi pe

ICS

es

Figura 2. Técnicas de reproducción utilizadas. IO: inducción de la ovulación; HOC + CP: hiperestimulación ovárica controlada + coito programado; IAH: inseminación artificial homóloga; FIVTE: fertilización in vitro con transferencia de embriones; ICSI: inyección intracitoplasmática de espermatozoides.

Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción Volumen 3, núm. 4, abril-junio, 2011

Incidencia de embarazo múltiple en el Hospital Ángeles Lomas y su relación con las técnicas de reproducción asistida

de 7.9 (DE 1.15) y la que se obtuvo a los cinco minutos fue de 8.7 (DE 0.57). El peso promedio al nacimiento fue de 1,422 g (DE 422.65).

La complicación obstétrica que se encontró con más frecuencia fue restricción del crecimiento intrauterino (8.5%, n = 3); otras complicaciones encontradas fueron: preeclampsia leve, diabetes gestacional, rotura prematura de membranas pretérmino (RPMP), luxación por cerclaje (5.7%, n = 2), preeclampsia severa y síndrome HELLP (2.8%, n = 1) [Figura 3].

9 8

Porcentaje

7 6

CONCLUSIONES

5 4 3 2 1 0 Preeclampsia Diabetes gestacional

g [DE 422.65 g])fue muy semejante al peso reportado (1,687 g) por algunos autores.

Respecto a las complicaciones obstétricas, el porcentaje de preeclampsia (8.5%) fue muy similar al porcentaje mencionado en la bibliografía. Respecto a los porcentajes de las demás complicaciones que se encontraron en el estudio –como restricción del crecimiento intrauterino, diabetes gestacional, rotura prematura de membranas pretérmino y luxación por cerclaje (cada una de las tres últimas con porcentaje de 5.7%)–, tales porcentajes fueron más bajos que los reportados en la bibliografía, lo cual posiblemente se debe a un control de embarazo más riguroso.

RCIU

Cerclaje luxado

RPMP

Síndrome HELLP

Figura 3. Complicaciones obstétricas encontradas. RCIU: restricción del crecimiento intrauterino; RPMP: rotura prematura de membranas pretérmino.

DISCUSIÓN En un periodo de cinco años se atendieron en el Hospital Ángeles Lomas 35 embarazos múltiples; de éstos, 97.1% se logró por técnicas de reproducción asistida; dicho porcentaje fue similar al reportado en la bibliografía.

El promedio de edad de las pacientes fue de 30.6 años y el periodo de infertilidad fue de 1.4 años, por lo que se acotan estas dos características como factores de riesgo de un embarazo múltiple, ya que no son las características típicas que en una clínica de reproducción se hallan en las pacientes con infertilidad. Es importante resaltar que la edad de las pacientes y el tiempo de infertilidad que cursaron son menores que los que se han reportado en la bibliografía.

La edad gestacional a la resolución del embarazo fue de 31.6 semanas de gestación (DE 2.76), edad muy similar a la reportada (32.2) en la bibliografía. De la misma manera, el peso promedio de los neonatos (1,422

En los procedimientos de baja complejidad (inseminación artificial homóloga) [1.9%] y en los de alta complejidad (3.7%) se observó una tasa baja de embarazos múltiples. Llama la atención que una proporción importante de embarazos múltiples se obtuvo por inducción de la ovulación; esto probablemente fue secundario a la falta de un control estricto en este tipo de ciclos, por lo que se sugiere realizar un control ultrasonográfico más riguroso de los mismos. Como hallazgos asociados con la posibilidad de tener un embarazo múltiple, podemos señalar la edad de la paciente (30.6 años en promedio) y el tiempo de infertilidad (1.4 años en promedio). En nuestro estudio la tasa de complicaciones no fue mayor a la reportada en la bibliografía y el desenlace de los recién nacidos fue bueno en general, con mortalidad de 8.5%.

No hay duda de que los nacimientos de alto orden fetal implican mayores complicaciones y costos para los neonatos, madres, familias y sociedad y de que la meta de cualquier técnica de reproducción asistida es un embarazo único sin desenlaces adversos. En cualquier país la tasa de nacimientos de alto orden fetal es vista como un problema serio; actualmente se intentan desarrollar soluciones sistemáticas y basadas en evidencias.

Es imposible eliminar por completo los embarazos y nacimientos múltiples, aun con la transferencia de un solo embrión; mientras alguna técnica de reproducción asistida esté implicada, existirá el riesgo de embarazos gemelares o, incluso, triples. Ciertamente, tampoco es razonable argumentar que las técnicas de reproducción

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asistida deban dejar de usarse para evitar un embarazo de alto orden fetal. Por tanto, los daños que conlleva un embarazo múltiple deben ser sopesados con los beneficios de lograr, finalmente, un embarazo.

6.

REFERENCIAS 1.

2.

3.

4.

192

5.

Adamson D, Baker V. Multiple births from assisted reproductive technologies: a challenge that must be met. Fertil Steril 2004;81:517-522.

ACOG Practice Bulletin No. 56. Multiple gestation: complicated twin, triplet and high-order multifetal pregnancy.

2004;104(4):869-886.

Russel RB, Petrini JR, Damus K, Mattison DR, Schwarz R. The changing epidemiology of multiple births in the United States. Obstet Gynecol 2003;101:129-135.

Statistics on multiple births in the UK. Office of National Statistics, General Registry Office Scotland and GRO Nor-

7.

8.

9.

thern Ireland. Human Fertilisation and Embriology Authority (HFEA).

Engmann L, Maconochie N, Lin Tan S, Bekir J. Trends in the incidence of births and multiple births and the factors that determine the probability of multiple birth after IVF treatment.

Hum Reprod 2001;16:2598-2605.

Reynolds MA, Schieve LA, Martin JA, Jeng G, Macaluso M. Trends in multiple births conceived using assisted reproductive technology, United States, 1997-2000. Pediatrics 2003;111:1159-1162.

Hernández HR, Ochoa TM, Flores SR, Cortés FR. Prevalencia de embarazos múltiples: incremento en la última década.

Ginecol Obstet Mex 2008;76(9):507-511.

Callahan TL, Hall JE, Ettner SL, Christiansen CL. The economic impact of multiple-gestation pregnancies and the contribution of assisted-reproduction techniques to their incidence. N Engl J Med 1994;331:244-249.

Ellison MA, Hotamisligil S, Lee H, Rich-Edwards JW, et al.

Psychosocial risks associated with multiple births resulting from assisted reproduction. Fertil Steril 2005;83:1422-1428.

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Artículo original

Determinantes en el resultado de inseminación intrauterina: análisis de 1,040 ciclos consecutivos Julio González Cofrades,* Carlos Linder Efter,* Gustavo Aguirre Ramos,*,** Pablo Vilchis Nava,* José Smeke Befeler,*** Carlos Navarro Martínez,*,**** José Antonio Rodríguez Martínez1 RESUMEN Antecedentes: existe una gran variedad de tratamientos contra la infertilidad; sin embargo, la inseminación intrauterina sigue siendo útil al compararla con técnicas más complejas.

Objetivo: determinar los factores que favorecen que las pacientes con diagnóstico de infertilidad tengan éxito reproductivo –valorado con el porcentaje de embarazos con frecuencia cardiaca fetal positiva– después de ser sometidas a inducción de la ovulación e inseminación intrauterina.

Material y método: estudio retrospectivo de 1,040 ciclos consecutivos de inseminación intrauterina realizados entre enero de 1998 y diciembre de 2004. se incluyeron pacientes sometidas a inducción de la ovulación e inseminación intrauterina y se excluyeron pacientes con registros incompletos o que abandonaron el tratamiento.

Resultados: de 1,040 ciclos, en 97 pacientes se logró el embarazo. Se obtuvo un menor éxito reproductivo con el uso de monoterapia como protocolo de inducción de la ovulación. Se obtuvo una proporción significativamente mayor de embarazos con cuatro folículos; otros hallazgos fueron que las cifras totales de espermatozoides móviles poslavados eran mayores en pacientes con éxito reproductivo y que la tasa de embarazo era menor (31.3 vs 68.6%; p < 0.001) en pacientes con endometriosis.

Conclusiones: la inseminación intrauterina es un método útil, con éxito aceptable y accesible. Los factores que favorecen el éxito reproductivo son: inducción con tratamiento combinado, uso de cuatro folículos, un total elevado de espermatozoides móviles e infertilidad no causada por endometriosis.

Palabras clave: técnicas de reproducción asistida, inseminación intrauterina, éxito reproductivo.

ABSTRACT Background: There are a variety of infertility treatments, however, intrauterine insemination (IUI) is still useful, when compared with more complex techniques.

Objective: To determine factors favoring the reproductive success in patients with diagnosis of infertility who underwent ovulation induction and intrauterine insemination, valuing the success with the percentage of pregnancies with fetal heart rate (+).

Material and method: A retrospective study of 1,040 consecutive cycles of IUI, from January 1998 to December 2004. We included patients undergoing ovulation induction and IUI. We excluded those with incomplete records or who discontinued treatment.

Results: Of 1,040 cycles, pregnancy was achieved in 97 patients. The use of monotherapy for ovulation induction had lower reproductive success. With 4 follicles we obtained a significantly higher proportion of pregnancy, another finding was that patients with higher reproductive success had a higher total numbers of motile sperm post-washing, and we found that the patients with endometriosis had a lower pregnancy rate (31.3% vs 68.6%, p < 0.001).

Conclusions: Intrauterine insemination is a useful, acceptable and accessible technique. The factors favoring the reproductive success are: the use of combined therapy for ovulation induction, the use of 4 follicles, a high number of motile sperm and a etiology of the infertility different from endometriosis.

Key words: assisted reproductive techniques, intrauterine insemination, reproductive success.

* Médico adscrito al servicio de Ginecología y Obstetricia. ** Biólogo de la Reproducción. *** Médico residente de cuarto año de Ginecología y Obstetricia. **** Director de la Clínica de Reproducción Asistida.

1 Médico cirujano y monitor de Estudios Clínicos de la Facul tad de Medicina, UNAM.

Centro Médico ABC, Santa Fe, México, DF. Correspondencia: Dr. Julio González Cofrades. Centro Médico ABC, Campus Santa Fe, Torre de consultorios (consultorio 332).

Av. Carlos Graef Fernández 154, colonia Tlaxala Santa Fe, CP 05300, México, DF. Correo electrónico: cofrades72@hotmail.com Recibido: febrero, 2011. Aceptado: marzo, 2011.

Este artículo debe citarse como: González-Cofrades J, LinderEfter C, Aguirre-Ramos G, Vilchis-Nava P y col. Determinantes en el resultado de inseminación intrauterina: análisis de 1,040 ciclos consecutivos. Rev Mex Reprod 2011;3(4):193-198. www.nietoeditores.com.mx

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ctualmente, en parejas con diferentes diagnósticos de infertilidad –por alteraciones masculinas, factores cervicales (incluidos los anticuerpos antiespermatozoides y las infecciones), anovulación u oligoovulación, endometriosis e infertilidad idiopática– se usa una gran variedad de tratamientos.1 Sin embargo, la inseminación intrauterina, asociada con estimulación ovárica controlada, sigue siendo uno de los tratamientos más útiles, ya que es poco costosa, es menos invasiva y sus tasas de embarazo son aceptables,2 comparada con técnicas de reproducción asistida de mayor complejidad.3 En el éxito o fracaso del tratamiento con inseminación intrauterina influyen muchas variables, como la selección de pacientes, el origen, duración y severidad de la infertilidad, la capacitación de la muestra por inseminar, la inducción de la ovulación y el estado de las trompas de falopio, entre otros.4,5 El objetivo de este estudio retrospectivo de 1,040 ciclos consecutivos de inseminación intrauterina es identificar cuáles de estos factores imposibilitan una tasa de embarazo favorable y cuál de ellos puede manipularse con el propósito de maximizar la tasa de éxito reproductivo en pacientes tratadas con inseminación intrauterina.

Así como determinar los factores que favorecen que las pacientes con diagnóstico de infertilidad tengan éxito reproductivo –valorado con el porcentaje de embarazos con frecuencia cardiaca fetal positiva– después de ser sometidas a inducción de la ovulación e inseminación intrauterina.

MATERIAL Y MÉTODO En el Centro de Ginecología y Reproducción Humana, Ciudad de México, se realizó un estudio retrospectivo en el que se analizaron 1,040 ciclos consecutivos de inseminación intrauterina de enero de 1998 a diciembre de 2004; se incluyó a las pacientes que fueron sometidas a inducción de la ovulación e inseminación intrauterina por tener diagnóstico de infertilidad y que tenían expediente completo, consentimiento informado y aprobación del Comité de Ética e Investigación de nuestro hospital; se excluyó a las pacientes que no contaban con las hojas de registro completas y a las pacientes que por cualquier motivo abandonaron el tratamiento.

Las pacientes con endometriosis se sometieron a un

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protocolo de diagnóstico, que consistió en sospecha clínica, exploración física, uso de métodos paraclínicos de diagnóstico y laparoscopia para visualizar en forma directa la lesión.

Estimulación ovárica controlada

Los protocolos usados en la inducción de la ovulación se estandarizaron de acuerdo con los procedimientos descritos en la bibliografía (Cuadro 1). Se administró citrato de clomifeno a dosis de 50 a 100 mg/día (Omifin®, Aventis Pharma, o Serophene®, Serono), gonadotrofina menopáusica humana o la combinación de dichos regímenes; la dosis, que se ajustó a cada paciente, se determinó por seguimiento ecográfico endovaginal, por concentraciones de estradiol en sangre o por ambos métodos.

Control serológico de las muestras de espermatozoides y preparación

Independientemente de si la muestra espermática –para la capacitación espermática– se obtuvo del esposo, compañero o donante, en todos los casos se examinó el perfil de enfermedades infecciosas (virus de la inmunodeficiencia humana 1 y 2, hepatitis A, B y C, y espermocultivo). La preparación de las muestras de espermatozoides, para la inseminación intrauterina, se realizó por medio de gradientes de concentración.

Determinación de la ovulación e inseminación

En 664 ciclos (63.8%) se indujo la ovulación mediante la administración intramuscular de gonadotrofina coriónica humana a dosis de 5,000 a 10,000 UI (Profasi®, Serono); 36 a 38 horas después de la aplicación se programó a las pacientes para la inseminación intrauterina. Además, se instruyó a 200 de las pacientes para que determinaran, en orina, la concentración de LH (mediante OvuQuick®, Corporación NanoRepro).

Inseminación

La muestra de espermatozoides, una vez capacitados, fue cargada en una sonda intrauterina para posteriormente inseminarla. A la paciente, en posición de litotomía, se le colocó un espéculo en la vagina para localizar el cuello uterino, mismo que se limpió con dispositivos de algodón. Después se introdujo la sonda intrauterina en

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Determinantes en el resultado de inseminación intrauterina

Cuadro 1. Comparación de protocolos de inducción de la ovulación (n = 1,040) CC CC + FSH CC + HMG (protocolo 1) (protocolo 2) (protocolo 3)

CC + HMG + FSH (protocolo 4)

aGnRH + FSH + HMG (protocolo 5)

Valor de p 1 vs 2,3,4,5* 2 vs 3,4,5* 3 vs 4,5* 4 vs 5* p > 0.05 (todas las combinaciones)

Ciclos

10 (0.96%)

214 (20.5%)

622 (59.8%)

168 (16.1%)

26 (2.5%)

Edad

32 ± 4.2

33.7 ± 3.8

32.4 ± 4.2

33.5 ± 3.9

31.4 ± 4.4

Número de folículos Número de embarazos (frecuencia cardiaca fetal positiva)

1±1

2.1 ± 1.4

2.3 ± 1.7

2.3 ± 1.5

3.3 ± 3.3

0

20

59

16

2

Porcentaje de embarazos (frecuencia cardiaca fetal positiva)

0%

9.3%

9.4%

9.5%

15.3%

1 vs 2,3,4,5*

1 vs 2,3,4,5

Los valores z de las variables ciclo y porcentaje de embarazos se calcularon para comparar las proporciones, que fueron significativas cuando el valor de p fue menor de 0.05*; en las variables edad y número de folículos se usó la prueba de la t de Student para calcular el significado estadístico.

CC: citrato de clomifeno; FSH: hormona foliculoestimulante; HMG: gonadotrofina menopáusica humana; aGnRH: antagonista de la hormona estimulante de gonadotrofinas.

el canal cervical, hasta aproximadamente 1 a 2 cm del fondo uterino, y lentamente se insufló la muestra de espermatozoides capacitados. Posteriormente, el catéter se retiró pausadamente y la paciente fue colocada en posición supina durante 10 minutos, tiempo después del cual continuó con sus actividades cotidianas. Catorce días después de la inseminación intrauterina se determinó, en sangre, la concentración de gonadotrofina coriónica humana, y a las 48 horas volvió a determinarse la concentración, y en caso de que el resultado fuera positivo, seis semanas después de la inseminación intrauterina se realizaba un ultrasonido endovaginal para determinar la existencia de frecuencia cardiaca fetal.

Análisis estadístico

Con los datos obtenidos se construyó una base de datos en el programa estadístico SPSS (versión 15.0), con lo cual se obtuvo la estadística descriptiva. Se usó la prueba de la t de Student para comparar las medias y se calcularon los valores z para comparar las proporciones.

RESULTADOS Durante el periodo de estudio el protocolo de inducción de la ovulación más administrado fue el de citrato de clomifeno + gonadotrofina menopáusica humana –en 622 ciclos (58.8%) con tasa de embarazo de 9.4%–, seguido de los protocolos de citrato de clomifeno + FSH –en 214 ciclos (20.5%) con tasa de embarazo de 9.3%– y de citrato de clomifeno + FSH + gonadotrofina menopáusica humana, en 168 ciclos (16.1%) con tasa de embarazo de 9.5%. Sin embargo, el mayor porcentaje de embarazos se logró con el protocolo de antagonistas de la hormona estimulante de gonadotrofinas + FSH + gonadotrofina menopáusica humana, con tasa de embarazo de 15.3%.

De 1,040 ciclos realizados, en 97 pacientes (9.3%) se logró el embarazo. En los diferentes protocolos de inducción de la ovulación no difirió significativamente la edad materna; en contraste, sí existió una diferencia significativa en la proporción de protocolos administrados, ya que el de citrato de clomifeno + gonadotrofina menopáusica humana fue el más administrado, mientras

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que el protocolo menos administrado fue el de citrato de clomifeno en monoterapia; respecto al número de folículos, éste fue significativamente menor –comparado con el de los otros protocolos– cuando se administró el protocolo de citrato de clomifeno, y respecto al éxito reproductivo, el porcentaje de embarazo fue significativamente menor en el protocolo de citrato de clomifeno, mientras que al comparar los otros cuatro esquemas, no se obtuvo una diferencia significativa en el éxito reproductivo (Cuadro 1).

Durante los años de estudio los resultados observados variaron, pues la tasa de embarazo en el año 2000 fue de 5.9% y la tasa en 2003 fue de 13.5%; sin embargo, año tras año no existió una variación significativa en la proporción de embarazos (Cuadro 2).

La edad promedio de nuestras pacientes fue de 32 ± 3.7 años, sin diferencia entre el grupo de pacientes que lograron embarazo (31.2 ± 3.3 años) y el grupo de las que no lo lograron (32.9 ± 4.1 años); igualmente, la cantidad de folículos de ambos grupos fue similar (2.3 ± 1.8 vs 2.8 ± 1.6). Sí se encontró significado estadístico

en la tasa de embarazo de las pacientes cuyo total de espermatozoides móviles fue menor, ya sean prelavados (40.4 millones vs 123.9 millones) o poslavados (17.2 millones vs 38.9 millones), con valor de p menor de 0.001 en ambas modalidades. La tasa de embarazo de las pacientes con endometriosis fue menor que la de las pacientes sin endometriosis (31.3 vs 68.6%, p < 0.001) [Cuadro 3]. Un hallazgo importante fue que 9% de los embarazos fueron embarazos gemelares.

Al cotejar la tasa de embarazo con el número de folículos (> 16 mm), medidos por ultrasonido endovaginal al momento de administrar la gonadotrofina coriónica humana, se observó que las tasas mayores de embarazos (10.5, 14.8 y 16.6%) se obtuvieron con tres, cuatro y cinco folículos, respectivamente. En dos pacientes (5%) en que no se visualizó ningún folículo mayor de 16 mm se obtuvo una prueba de embarazo positiva, y al ver que la proporción de éxito reproductivo de las pacientes con tres, cuatro o cinco folículos era significativamente mayor que la de las pacientes sin ningún folículo, se observó que la tasa de embarazo aumentó

Cuadro 2. Porcentaje de embarazos por año de estudio Año

Número de ciclos

Embarazos totales (frecuencia cardiaca fetal positiva)

Porcentaje de embarazos (frecuencia cardiaca fetal positiva)

1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 Total

170 160 220 120 70 148 152 1,040

15 12 13 14 6 20 17 97

8.8% 7.5% 5.9% 11.6% 8.5% 13.5% 11.1% 9.5%

Valor de p

1999 vs 1998 (p = 0.66) 2000 vs 1999 (p = 0.54) 2001 vs 2000 (p = 0.08) 2002 vs 2001 (p = 0.48) 2003 vs 2002 (p = 0.63) 2004 vs 2003 (p = 0.76)

Los valores z se calcularon para determinar el significado estadístico del año en curso vs el año anterior.

Cuadro 3. Comparación entre las pacientes con embarazo vs las pacientes sin embarazo

Edad Número de folículos Total de espermatozoides móviles prelavados Total de espermatozoides móviles poslavados Pacientes con endometriosis Pacientes sin endometriosis

Sin embarazo

Con embarazo

Valor de p

32.9 ± 4.1 2.3 ± 1.8 40.4 millones 17.2 millones 55.5% 44.6%

31.2 ± 3.3 2.8 ± 1.6 123.9 millones 38.9 millones 31.5% 68.6%

> 0.05 > 0.05 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001

Se usó la prueba de la t de student para comparar las variables edad y número de folículos. También se calcularon los valores z de las demás variables para comparar sus proporciones.

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Determinantes en el resultado de inseminación intrauterina

significativamente sólo en el caso de las pacientes con cuatro folículos (Cuadro 4).

DISCUSIÓN Los protocolos de estimulación ovárica deben individualizarse de acuerdo con la edad, el diagnóstico y la respuesta al tratamiento. Afortunadamente, los medicamentos efectivos y seguros cada vez son más.6 En este campo se ha evolucionado porque se ha administrado desde citrato de clomifeno y gonadotrofinas urinarias y recombinantes hasta antagonistas de la hormona estimulante de gonadotrofinas. En este estudio retrospectivo, 59.8% de las pacientes fue estimulada con citrato de clomifeno + gonadotrofina menopáusica humana y la tasa de embarazo fue de 9.4%; 20.5% de las pacientes fue estimulada con citrato de clomifeno + FSH recombinante y 16.1% fue estimulada con citrato de clomifeno + FSH recombinante + gonadotrofina menopáusica humana y las tasas de embarazo fueron de 9.3 y 9.5%, respectivamente; en ninguno de los protocolos en que se administró un tratamiento combinado se obtuvo una diferencia significativa; además, el éxito reproductivo disminuye significativamente cuando únicamente se administra un medicamento.7 Pensamos que la administración de estos costosos medicamentos sigue siendo motivo de controvertsia debido a que las tasas de embarazo no difieren significativamente; quizá, la única ventaja que nos ofrecen estos medicamentos costosos

es una menor respuesta antigénica. La edad de la mujer está relacionada directamente con la calidad ovular; sin embargo, en este estudio no observamos una diferencia significativa relacionada con la edad de las pacientes de los diferentes protocolos.

Las características de la muestra espermática desempeñan una función decisiva en el éxito de la inseminación intrauterina;8 sin embargo, nosotros le conferimos un valor primordial al total de espermatozoides móviles, ya sean prelavados o poslavados, debido a que la diferencia estadística fue significativa en las pacientes que no lograron embarazarse.

Independientemente del grado de endometriosis, sabemos que el grado de afección en la fertilidad femenina es muy importante;9 por eso, hay que recordar que en este tipo de pacientes es necesario realizar un diagnóstico temprano y adecuado para poder mejorar las tasas de embarazo, ya sea mediante inseminación intrauterina u otras técnicas. Sólo la tercera parte del grupo de pacientes con endometriosis logró embarazarse; las restantes requirieron técnicas de reproducción asistida más complejas y más costosas.

Acorde con el número de folículos mayores de 16 mm, las tasas de embarazo más altas se lograron con cuatro y cinco folículos (14.8 y 16.6%, respectivamente), y de estas tasas, sólo fue significativa la tasa de embarazo de las pacientes con cuatro folículos; por tanto, podemos determinar que cuatro folículos es la cantidad ideal para la obtención de éxito reproductivo.

Cuadro 4. Resultados de pacientes con éxito reproductivo basado en el número de folículos (> 16 mm) medidos por ultrasonido endovaginal al momento del disparo Número de folículos

Prueba de embarazo negativa

Prueba de embarazo positiva

Número de pacientes

Porcentaje de embarazos

Valor de p (0 vs 1,2,3,4,5,6,7,8,9)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

38 314 225 194 92 40 12 4 2 1

2 25 18 23 16 8 1 0 0 0

40 339 243 217 108 48 12 4 2 1

5% 7.3% 7.4% 10.5% 14.8% 16.6% 8.3% 0% 0% 0%

p = 0.53 p = 0.53 p = 0.17 p = 0.04* p = 0.06 p = 0.33 p = 0.14 p = 0.14 p = 0.14

Se calcularon los valores z para obtener significado estadístico (p < 0.05*).

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González Cofrades J y col.

En nuestra población estudiada la tasa global de embarazo fue de 9.5%, muy similar a la tasa (8 a 13%) reportada en la bibliografía internacional. La gran cantidad de variables que influyen el resultado exitoso de la inseminación intrauterina10 limita el análisis estadístico. recomendamos que las pacientes sometidas a este tratamiento se estudien cuidadosamente para descartar padecimientos –como endometriosis–, que limitarían el resultado de la inseminación intrauterina; también recomendamos realizar un seguimiento sonográfico estrecho, así como revisar las concentraciones sanguíneas de estradiol para mejorar las probabilidades de éxito. El número de ciclos es limitado cuando se usa la técnica de inseminación intrauterina; por eso, después de ese número la probabilidad de embarazo es prácticamente nula; es permisible realizar –como máximo– un total de tres a cuatro ciclos de inseminación intrauterina, antes de pensar en la necesidad de aplicar técnicas de reproducción asistida de mayor complejidad.

La inseminación intrauterina sigue siendo uno de los métodos de tratamiento más útil, su éxito depende de la selección estricta de los pacientes y de determinar el origen de la infertilidad, lo que nos da la pauta para someter a una pareja a este tipo de tratamiento. Es importante reconocer cuándo las pacientes requieren técnicas de reproducción asistida de mayor complejidad, como FIV o ICSI, para lograr un embarazo. Con base en nuestros resultados, podemos concluir que la administración de monoterapia –como terapia de inducción– disminuye significativamente el éxito reproductivo, por lo que se recomienda administrar un tratamiento combinado; no se obtuvo algún resultado que favoreciera a un protocolo en particular, pues los porcentajes de éxito reproductivo de los cuatro protocolos combinados no fueron significativamente diferentes. Durante los años de estudio analizados no varió significativamente la tasa de éxito reproductivo en nuestro centro médico. Otra de las conclusiones fundamentales es que para obtener éxito reproductivo la cantidad ideal de folículos es cuatro y que la tasa de fracaso reproductivo de las pacientes con endometriosis es significativamente mayor que la de las

198

pacientes sin esta afección. Otro aspecto fundamental fue el total de espermatozoides móviles poslavados, pues el total fue significativamente mayor en las pacientes con éxito reproductivo. Si tomamos en cuenta los factores mencionados, podremos lograr que las mujeres con infertilidad eleven su tasa de éxito reproductivo.

REFERENCIAS 1. Carranza-Lira S. Fundamentos de Endocrinología Ginecológica y Reproductiva. México: Masson; 2003:252-253.

2. Edwards G, Brody S. Principles and Practice of Assisted Human Reproduction. Philadelphia: WB Saunders Co.; 1995:109-110.

3. Aranda JE, Alvarez L, Barrón J, Kably Ambe A. Efficacy of a program of insemination with cryopreserved semen as treatment of the male factor. Ginecol Obstet Mex 1997;65:520-522.

4. Farhi J, Ben A, Lande Y, Fisch B. Role of treatment with ovarian stimulation and intrauterine insemination in women with unilateral tubal occlusion diagnosed by hysterosalpingography. Fertil Steril 2007;88(2):396-400.

5. Nyboe A, Goossens V, Bhattacharya S, Ferraretti AP, et al.

Assisted reproductive technology and intrauterine inseminations in Europe, 2005: results generated from European registers by ESHRE: ESHRE. The European FIV Monitoring Programme (EIM), for the European Society of Human Reproduction and Embryology (ESHRE). Hum Reprod 2009;24(6):1267-1287.

6. Cantineau AE, Cohlen BJ, Heineman MJ. Ovarian stimulation protocols (anti-oestrogens, gonadotrophins with and without GnRH agonists/antagonists) for intrauterine insemination (IUI) in women with subfertility. Cochrane Database Syst Rev 2007;18(2):CD005356. Review.

7. Zeyneloglu HB, Arici A, Olive DL, Duleba AJ. Comparison of intrauterine insemination with timed intercourse in superovulated cycles with gonadotropins: a meta-analysis. Fertil Steril 1998;69(3):486-491.

8. Saucedo de la Llata E, Moraga MR, Batiza V, Galache P, et al. Influence of sperm morphology on results of intrauterine insemination. Ginecol Obstet Mex 2003;71:455-459.

9. Barroso G, Karchmer S, Castelazo E, Carballo E, Kably A. A prospective randomized trial of the impact of misoprostol (PgE1) on pregnancy rate after intrauterine insemination (IUI) therapy: a preliminary report. Ginecol Obstet Mex 2001;69:346-350.

10. Kably A, Meza E, Di Castro P, Villanueva C, et al. Multifactorial analysis of patients with endometriosis in an institutional program of assisted reproduction. Ginecol Obstet Mex 1991;59:151-157.

Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción Volumen 3, núm. 4, abril-junio, 2011

Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción 2011;3(4):199-200

Índice de materias del volumen 3

47 Reunión anual 10 57,481,307 mujeres mexicanas 139 Gerardo Velázquez Cornejo Análisis endocrino y metabólico de los fenotipos del síndrome de ovarios poliquísticos 118 Rene Jaime Toro Calzada, María de Lourdes Estrada Soria, Mara Guadalupe Cárdenas Navidad Asociación entre el resultado de la prueba de SimsHuhner y el logro de embarazo de pacientes infértiles atendidas en un hospital urbano de alta especialidad 69 Maytreli López Negrete, Araceli Vázquez Flores, Rosa Alicia Ramos García, Juan Carlos Hinojosa Cruz, Víctor Saúl Vital Reyes Características que optimizan la selección de donantes de óvulos 176 Laura Fabiola Guadarrama García, Heidi Trejo Castañeda, Zarela Lizbeth Chinolla Arellano, Jeimy Pedraza Cepeda, Felipe Caldiño Soto, Sandra Cubillos García, Silvio Cuneo Pareto Determinantes en el resultado de inseminación intrauterina: análisis de 1,040 ciclos consecutivos 193 Julio González Cofrades, Carlos Linder Efter, Gustavo Aguirre Ramos, Pablo Vilchis Nava, José Smeke Befeler, Carlos Navarro Martínez, José Antonio Rodríguez Martínez Efectividad diagnóstica de la histerosalpingografía y la histerosonografía en la evaluación de la cavidad uterina en pacientes con problemas reproductivos 78 Gerardo Velázquez Cornejo, Marlene Lizbeth Zamora Ramírez, José Luis Castro López, Héctor Luis Mondragón Alcocer, Carlos Salazar López Ortiz, Sergio Téllez Velazco Efecto de la quimioterapia y el cáncer testicular avanzado o el linfoma de Hodgkin en la integridad del ácido desoxirribonucleico del esperma 123

Cristian O’Flaherty, Barbara F Hales, Peter Chan, Bernard Robaire El papel de la proteómica en la definición del secretoma embrionario humano 150 MG Katz Jaffe, S McReynolds, DK Gardner, WB Schoolcraft El Premio Nobel, el Dr. Robert Geoffrey Edwards y la reproducción 99 Guillermo Santibáñez Moreno El valor de la suplementación de la fase lútea con valerianato de estradiol y progesterona en un programa de reproducción asistida 182 Israel Obed Carmona Ruiz, Roberto Santos Haliscak, Pedro Galache Vega, Samuel Hernández Ayup, Víctor Alfonso Batiza Reséndiz, Pablo Díaz Spíndola, María Lidia Arenas Montezco Embarazo ectópico abdominal primario 133 Héctor Luis Mondragón Alcocér, Gerardo Velázquez Cornejo, Marlene Lizbeth Zamora Ramírez Estimulación ovárica controlada. Tiempo de reevaluar 1 Efraín Pérez Peña, Antonio Gutiérrez Gutiérrez, Ernesto Pérez Luna, Francisco Rojas Romero Fragmentación del ADN del espermatozoide y su influencia en la fertilidad de la pareja 105 Alfredo Góngora Rodríguez, Sergio Sánchez González, Sandra Cubillos García, Silvio Cuneo Pareto Fragmentación del ADN espermático: mecanismos de origen, repercusión en los resultados reproductivos y análisis 160 Denny Sakkas, Juan G Álvarez Frecuencia de endometriosis en mujeres infértiles: características clínicas y laparoscópicas 112 Raymundo Preciado Ruiz, José Alfredo Zúñiga Montiel, María Nayeli Salas Quiroz, Antonio Manuel García Luna González Rubio, Jorge Arturo Torres Calleja, Gerardo Velázquez Cornejo

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199

Índice de materias

Hallazgos histeroscópicos en 70 procedimientos realizados en un curso de histeroscopia de consultorio 73 Carlos Gerardo Salazar López Ortiz, Alfredo Saad Ganem, José Alanís Fuentes, Jorge Gálvez Muñoz Incidencia de embarazo múltiple en el Hospital Ángeles Lomas y su relación con técnicas de reproducción asistida 188 Alberto Kably Ambe, Jorge Alberto Campos Cañas, Heidy Ortiz Reyes, Jaime Ignacio Cevallos Bustillos, Diana Elena Monzalbo Núñez Inhibidores de la aromatasa. Aplicaciones potenciales en medicina de la reproducción 63

200

Juan Carlos Hinojosa Cruz, Rosa Alicia Ramos García, Víctor Saúl Vital Reyes Mecanismos patogénicos de la infertilidad asociada con endometriosis 83 Sajal Gupta, Jeffrey M Goldberg, Nabil Aziz, Eric Goldberg, Natalie Krajcir, Ashok Agarwal Tendencias de la reproducción femenina y riesgos asociados con el embarazo 101 Marcelino Hernández Valencia Vitrificación de ovocitos y embriones 143 Martha Isolina García Amador, Rocío Martínez Armas, Luis Arturo Ruvalcaba Castellón

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Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción 2011;3(4):201-204

Índice onomástico del volumen 3

Acosta Rodríguez Ernesto 55, 56 Agarwal Ashok 83 Aguilar Acosta Loida Ruth 51 Aguilar Melgar Ashanti 25 Aguinaga Ríos Mónica 61 Aguirre Ramos Gustavo 35, 37, 40, 45, 193 Alanís Fuentes José 73 Alba Jasso Gerardo Andrés 50 Almanza Blix Claudia 47 Alvarado Gay Francisco Javier 18 Álvarez Juan G 160 Anaya Torres Francisco Javier 61 Angulo Torres Lizbeth Citlalli 26 Anuar Tamez Garza David 11 Aparicio González Hipólito 28, 41 Arenas Montezco María Lidia 25, 35, 182 Arroyo Méndez Francisco Alfredo 38, 47, 61 Ávila Lombardo Rosaura 58 Aziz Nabil 83 Báez Reyes Rocío 61 Bagnarello González Fiorella 14 Balcázar Vázquez Ricardo 50 Barros Delgadillo Juan Carlos 13, 14 Barroso Villa Gerardo 48, 58 Basulto Montalvo Erika María 31 Batiza Reséndiz Víctor Alfonso 20, 182 Bedia Sánchez Luis Miguel 50 Benavides Salazar María del Socorro 27, 55 Bermúdez Rodríguez Alexandra 42 Bracho Ugarte Marco Antonio 53 Briones Vega Carlos G 12, 13, 15, 16, 23, 24, 29, 31 Caldiño Soto Felipe 17, 20, 21, 28, 29, 34, 38, 39, 41, 43, 44, 45, 47, 49, 57, 176 Camargo Díaz Felipe A 12, 13, 15, 16, 23, 24, 29, 31 Campos Cañas Jorge Alberto 188

Canavati Ramos Rocío 17 Cancino Villareal Patricia 38, 46, 47 Cárdenas Navidad Mara Guadalupe 118 Carmona Maldonado Marcia 12, 13, 15, 16, 23, 24, 29, 31 Carmona Ruiz Israel Obed 20, 182 Caro Gómez Tannia Paulina 30 Carrasco Hernández Thamara 51, 59 Castillo Baso J 43 Castillo Montes Karen 19 Castrillo Morales Adriana Lucía 14 Castro Hernández Wendy Belén 22, 53, 54 Castro López José Luis 78 Cedillo Díaz Francisco Javier 36, 40 Cerbón Cervantes Marco Antonio 16, 46 Cerrillo Hinojosa Mabel 27, 55 Cevallos Bustillos Jaime Ignacio 188 Chan Peter 123 Charría Realpe Gilberto 28, 41 Chávez Hernández Álvaro 36 Chiang Esteban José Antonio 41 Chinolla Arellano Zarela Lizbeth 17, 20, 21, 29, 38, 39, 42, 43, 44, 47, 176 Colín Licea Omar 13 Colin Valenzuela Alin 13, 58 Cortés Algara Alfredo 32, 33 Cruz Gutiérrez María de Jesús 60 Cubillos García Sandra 17, 20, 21, 28, 29, 34, 38, 39, 41, 42, 43, 44, 45, 47, 49, 57, 105, 176 Cuneo Pareto Silvio 17, 20, 21, 28, 29, 34, 38, 39, 41, 42, 43, 44, 45, 47, 49, 57, 105, 176 Dabbah Mussally Jacobo 42 Dávila Garza Alberto 11 De Alba Cervantes María Guadalupe 22, 53, 54 Díaz P 39, 43 Díaz Spíndola Pablo 11, 17, 19, 20, 25, 34, 35, 182 Dupre Aramburu Guillermina 60

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201

Índice onomástico

Echavarría S Mirna Guadalupe 15, 61, 62 Enríquez Flores Ana Silvia 46, 47 Enríquez Pérez María Magdalena 22 Estrada Soria María de Lourdes 118 Fiszman Amora Rachel 26, 27 Flores E Xochitl 15, 61, 62 Fornelli López Aldo 26 Galache Vega Pedro 11, 19, 25, 34, 39, 182 Galindo López Paulina 32, 33 Gálvez Muñoz Jorge 73 Gamboa Domínguez Armando 16 García Amador Martha Isolina 22, 23, 36, 37, 53, 54, 57, 143 García Genaro 25, 43 García Luna González Rubio Antonio Manuel 112 García Suástegui Wendy 34 García Villafaña Genaro 19, 34, 35 Gardner DK 150 Garza Ríos Loyzaga Corcuera Pablo 26 Gaviño Gaviño Fernando 13, 14, 26, 27 Gaytán Melicoff José 42 Godoy Barahona Paola 17 Goldberg Eric 83 Goldberg Jeffrey M 83 Gómez Calsin Magali 42 Gómez López Nardhy 58 Gómez Piquer Vanessa 12, 13, 15, 16, 23, 24, 29, 31 Góngora Rodríguez Alfredo 32, 33, 105 González Becerra Juan Enrique 10, 36, 40 González Cervantes Marino Miguel 19 González Cofrades Julio 35, 37, 40, 45, 193 González Cortés Carolina 32, 33 González Garza Socorro 12, 13, 15, 16, 23, 24, 29, 31 González González Patricia Elizabeth 54 González O 43 González Ortega Claudia 38, 46, 47, 61 González Sergio Sánchez 17, 20 González Vega Oswaldo Daniel 35 Guadarrama García Laura Fabiola 17, 20, 21, 29, 34, 38, 39, 43, 44, 47, 49, 176 Gupta Sajal 83 Gutiérrez Gutiérrez Antonio Martín 1, 38, 46, 47, 61 Gutiérrez Nájar Alfonso Javier 27, 55

202

Gutiérrez Rueda María Cristina 38, 61 Gutiezzez Antonio 41 Guzmán Rodríguez Raymundo 26 Hales Barbara F 123 Hernández Ayup Samuel 11, 19, 182 Hernández Marín Imelda 18, 49, 50, 51, 52, 59, 60 Hernández S 39 Hernández Valencia Marcelino 101 Hernández Vivar Luis Edmundo 50 Hinojosa Cruz Juan Carlos 16, 49, 50, 63, 69 Huetle Figueroa David Alejandro 19 Iga Canavati Gerardo 17 Isaías Preciado Abril del Carmen 10, 40 Islas Cruz Gaudencio 18 Jacobo Nájera Sara 55, 56 Jiménez Arboleda Janet 42, 45 Juárez Bengoa Armando 13, 14, 31, 54, 58 Kably Ambe Alberto 188 Katz Jaffe MG 150 Kohls Graciela Cristina 61 Krajcir Natalie 83 Krasnova Olga 35, 37, 40, 45 Lara Kferman Oliver 12, 13, 15, 16, 23, 24, 29, 31 Lara Rangel Edali Lizzete 35 Lazcano Flores Otilia 11 Lemus Huerta Ángel 26 Linder Efter Carlos 193 Lira Plascencia Josefina 26, 27 López Duarte Pablo 30, 42 López Negrete Maytreli 69 López Villaseñor Berenice 22 Luna Gallardo Ada Belinda 40 Macedo Torres Esther 55, 56 Madrid Zavala Renata Melina 18, 51, 52, 60 Maldonado Rosas Israel 30, 42 Martínez Armas María del Rocío 22 Martínez Armas Rocío 22, 23, 36, 37, 57, 143 Martínez Juárez Oscar Eugenio 50 Martínez Silvia 15, 61, 62

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Índice onomástico

Mateo Sanez Henry 23, 36, 37, 57 McReynolds S 150 Medina Flores José 23, 36, 37, 57 Mejía Medina Cecilia Berenice 48 Mendoza Baranda Karelia 18 Mendoza Rodríguez Carmen Adriana 46 Meneses Núñez Cizani 27, 55 Mojica Martínez Karlo Alberto 19, 20 Mondragón Alcocer Héctor Luis 78, 133 Monroy Moreno Luis Gabriel 12, 13, 15, 16, 23, 24, 29, 31 Montoya Sarmiento Jorge Eduardo 23, 36, 37, 57 Monzalbo Núñez Diana Elena 188 Morales Sánchez Elizabeth 46 Moreno García Jesus Daniel 10, 36, 40, 48 Munguía Olvera Patricia 35, 37, 40, 45 Muñoz Padilla Susana Daniela 30 Nava Pablo 35 Navarro Martínez Carlos 35, 37, 40, 45, 193 O’Flaherty Cristian 123 Obeso I 39 Ocampo Torres Aide Beatriz 18, 51, 52, 59, 60 Ochoa Flores Juan Gerardo 51, 52, 60 Orizaba Chávez Bernardett 50 Ortiz Reyes Heidy 188 Pascual Rodríguez Antonio Vidal 41 Pashkova Olga 12, 13, 15, 16, 23, 24, 29, 31 Pedraza Cepeda Jeimy 17, 21, 28, 29, 34, 38, 41, 44, 45, 49, 57, 176 Pérez Luna Ernesto 1 Pérez Peña Efraín 1, 41, 46, 47 Pérez Torres Alicia 38, 46 Preciado Ruiz Raymundo 112 Puente Enríquez Silvia Irene 32, 33 Quintana Mónica 61 Quiroz Torres Edgar 22, 23, 36, 37, 57 Ramírez Eugenio Brenda Yareli 22 Ramírez García Patricia 11 Ramírez Rodiles Adriana 13, 58 Ramírez Silva Beatriz Ofelia 49 Ramos García Rosa Alicia 49, 50, 63, 69

Ramos Gordillo Guillermo Martín 18, 52, 60 Regalado Hernández Miguel Ángel 10, 36, 40, 48 Reyes Olivans Juan Pablo 34 Reyes Ramírez Ana Nayeli 42 Reyna Arias María del Pilar 35, 37, 40, 45 Rivera Montes Alfredo Martín 12, 13, 15, 16, 23, 24, 29, 31 Robaire Bernard 123 Robles Murillo Karina 41 Rodríguez Martínez José Antonio 193 Rodríguez Perdomo David Francisco 14 Rodríguez Solís Hafid Rodolfo 49 Rodríguez Villasana Enrique 12, 13, 15, 16, 23, 24, 29, 31 Rojas Romero Francisco 1 Rosales J 39 Ruiz Muñoz Saúl 30, 42 Ruiz O Francisco 15 Ruvalcaba Castellón Luis Arturo 22, 23, 36, 37, 53, 54, 57, 143 Saad Ganem Alfredo 73 Sakkas Denny 160 Salas Quiroz María Nayeli 55, 56, 112 Salazar López Ortiz Carlos Gerardo 73, 78 Sam Soto Selene 26, 27 Sánchez González Sergio 28, 29, 34, 38, 39, 41, 43, 45, 49, 57, 105 Sánchez M Maribel 15, 61, 62 Sánchez Serrano Ana Paola 48 Sánchez Solís Víctor 13, 14 Santibáñez Morales Álvaro 13, 14, 60 Santibáñez Moreno Guillermo 99 Santillana Espinosa Estrella 52, 60 Santos Haliscak Roberto 25, 34, 39, 43, 182 Sauceda González Luciano 36 Schoolcraft WB 150 Sepúlveda González José 11, 19, 20, 25, 35, 43 Serrano Heidi 15, 61, 62 Sierra Jiménez Hugo 12, 13, 15, 16, 23, 24, 29, 31 Silvestri Tomassoni José Roberto 60 Smeke Befeler José 193 Sondon García Zoe Gloria 36 Soriano Cruz José Guadalupe 13 Sosa Reyes Francisco Javier 36, 40 Stern Colin y Nunés Jorge Jaroslav 55, 56

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Índice onomástico

Téllez Velazco Sergio 78 Toro Calzada Rene Jaime 118 Torres Calleja Jorge Arturo 112 Torres Ramírez Jorge Enrique 18, 52 Torres Zapata Roxana J 34 Trejo Castañeda Heidi 17, 20, 21, 38, 39, 43, 44, 47, 49, 57, 176 Valdez Morales Francisco Javier 16 Valdovinos Ramírez Irene Alejandra 42, 45, 57 Vargas Maciel Marcos 38, 46, 47, 61 Vázquez Aguilar Paola 51, 52, 59

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Vázquez de Lara Luis Guillermo 19 Vázquez Flores Araceli 69 Vega Hernández Eva 13 Velázquez Cornejo Gerardo 78, 112, 133, 139 Vilchis Nava Pablo 37, 40, 45, 193 Vital Reyes Victor Saúl 16, 46, 49, 50, 63, 69 Zamora Ramírez Marlene Lizbeth 78, 133 Zavala Ortega Isabel 50 Zúñiga Jiménez Daniel 26 Zúñiga Montiel José Alfredo 112

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