Vol. 4 Núm. 3 Ene-Mar 2012

REVISTA MEXICANA DE MEDICINA DE LA

Asociaci贸n Mexicana de Medicina de la Reproducci贸n, A.C.

Volumen 4, n煤mero 3, enero-marzo 2012

REVISTA MEXICANA DE MEDICINA DE LA

Mesa Directiva enero-diciembre 2012 Dr. Carlos Gerardo Salazar López Ortiz Presidente

Dr. Raymundo Preciado Ruiz Tesorero

Dr. Julio Francisco de la Jara Díaz Vicepresidente

Dr. Sergio Villalobos Acosta Protesorero

Dr. Víctor Saúl Vital Reyes Secretario

Dr. José Luis Castro López Dr. Oliver Paúl Cruz Orozco Dr. Ignacio Pedro Flores Sánchez Dra. Rosa Martha Luna Rojas Vocales

Dr. Álvaro Santibáñez Morales Prosecretario

Comité Editorial para la Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción 2012-2014 Editor Dr. Gerardo Velázquez Cornejo Co-Editores Dr. Julio Francisco De la Jara Díaz Dr. Carlos G. Salazar López Ortiz Dr. Héctor Rogelio Santana García Dr. Guillermo Santibáñez Moreno MVZ. Esperanza Carballo Mondragón

Comité Editorial 2012-2014 Distrito Federal Dr. Luis Ignacio Aviña Cueto Dr. Aquiles Ayala Ruiz Dr. Luis Miguel Bedia Sánchez Dr. José Luis Castro López Dr. Roberto Cervera Aguilar Dr. Silvio Cuneo Pareto Dra. Mirna Gpe. Echavarría Sánchez Dra. Lorena Patricia Ferrer Arreola Dr. Ranferi Gaona Arreola Dr. Fernando Gaviño Gaviño Dra. Rocio Guerrero Bustos Dr. Marcelino Hernández Valencia Dr. Juan Carlos Hinojosa Cruz Dr. Jesús Estuardo Lujan Irastorza Dra. Rosa Martha Luna Rojas Dr. Alberto Kably Ambe Dra. Olivia Marín Romero Dr. Carlos Guillermo Maquita Nakano Dr. Manuel Mario Matute González Dr. Héctor Mondragón Alcocer Dr. Jesús Daniel Moreno García M. en C. Paloma del Carmen Neri Vidaurri Dr. Raymundo Preciado Ruíz D. en C. Francisco Rocha Cárdenas Dr. Álvaro Santibáñez Morales Dr. Claudio Serviere Zaragoza Dr. Jorge Jaroslav Stern Colín y Nunés

Volumen 4, núm. 3, enero-marzo, 2012

Dra. Rosario Tapia Serrano Dr. Sergio Téllez Velasco Dr. Rubén Tlapanco Barba Dr. René Toro Calzada Dr. Emilio Valerio Castro Biol. Eva Vega Hernández Dr. Sergio Villalobos Acosta Dr. Victor Saúl Vital Reyes Otras sedes Dr. Víctor Alfonso Batiza Reséndiz Dr. Luis Delgado Salazar Dr. Carlos Félix Arce Dra. Bertha Franco Tostado Dr. Oscar Javier León Martínez Dr. Jose María Mojarra Estrada Biol. Ma. Del Rocio Martínez Armas Dr. Adán Oliveros Ceballos Biol. Antonio Vidal Pascual Rodríguez Dr. Jaime Paz Ávila Dr. Efraín Pérez Peña Dr. Rafael Alfonso Sánchez Usabiaga Dr. Roberto Santos Haliscak Dr. Álvaro Sevilla y Ruiz Dr. Luis Arturo Ruvalcaba Castellón

(Monterrey) (Cuernavaca) (Monterrey) (Guadalajara) (Tijuana) (Sonora) (Guadalajara) (Acapulco) (Jalisco) (Tampico) (Jalisco) (Querétaro) (Monterrey) (Puebla) (Jalisco)

REVISTA MEXICANA DE MEDICINA DE LA

Volumen 4, núm. 3, enero-marzo, 2012

CONTENIDO

Contents

EDITORIAL 101

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Marcelino Hernández Valencia ARTÍCULO DE REVISIÓN Una visión actual de la infertilidad masculina Rosario Tapia Serrano

EDITORIAL 101

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ARTÍCULOS ORIGINALES 110

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Análisis del NPY hipotalámico inducido por complicaciones nutricionales en la reproducción Leticia Manuel Apolinar, Erika García Díaz, Miriam Ruiz Albarrán, Leticia Damasio Santana, Marcelino Hernández-Valencia Eclosión asistida en pacientes mayores de 34 años. Experiencia del Centro Médico Nacional 20 de Noviembre, ISSSTE Jesús Daniel Moreno García, Juan Enrique González Becerra, Miguel Ángel Regalado Hernández Experiencia en la realización de coasting (inhibición de gonadotropinas) para inseminación intrauterina Álvaro Santibáñez Morales, Paula Jimena Sakar Almirante, Eva Vega Hernández, Juan Carlos Regalado Hernández, Ana Paola Sánchez Serrano Resultados de un programa de FIV con transferencia de embriones en un día 3 vs día 5 Jorge Castillo Baso, Pablo Díaz Spíndola, Roberto Santos Haliscak, Pedro Galache Vega, Samuel Hernández Ayup, Genaro García Villafaña BIOTECNOLOGIA

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El regreso del ovocito: de la olvidada transferencia citoplasmática a la actual transferencia del huso meiótico Raúl Eduardo Piña-Aguilar

Marcelino Hernández Valencia REVIEW ARTICLE A current view of male infertility Rosario Tapia Serrano ORIGINAL ARTICLES

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Analysis of NPY-induced hypothalamic nutritional complications in reproduction Leticia Manuel Apolinar, Erika García Díaz, Miriam Ruiz Albarrán, Leticia Damasio Santana, Marcelino Hernández-Valencia Assisted hatching in patients over 34 years.

Experience Centro Médico Nacional 20 de Noviembre, ISSSTE Jesús Daniel Moreno García, Juan Enrique González Becerra, Miguel Ángel Regalado Hernández Experience in the embodiment of coasting for intrauterine insemination Álvaro Santibáñez Morales, Paula Jimena Sakar Almirante, Eva Vega Hernández, Juan Carlos Regalado Hernández, Ana Paola Sánchez Serrano Results of a program of IVF with embryo transfer in a day 3 vs day 5 Jorge Castillo Baso, Pablo Díaz Spíndola, Roberto Santos Haliscak, Pedro Galache Vega, Samuel Hernández Ayup, Genaro García Villafaña biotechnology

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The return of the oocyte: the forgotten cytoplasmic transfer to the actual transfer of the meiotic spindle Raúl Eduardo Piña-Aguilar

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Rev Mex Reprod 2012;4(3):101

Editorial

Grupo de interés de endocrinología reproductiva

L

a endocrinología es la ciencia que estudia las glándulas, las sustancias que liberan (hormonas), y la interacción químico-orgánica con sus receptores y el mecanismo de acción. La reproducción está regulada por un mecanismo neurohormonal en ambos sexos, que debe estar sincronizado pues se inicia con cambios químicos en varias partes del cuerpo.

Con estos preceptos se establece que las hormonas secretadas por las glándulas endocrinas regulan el crecimiento, el desarrollo y las funciones de muchos tejidos y coordinan los procesos metabólicos del organismo.

Por eso siempre ha existido la necesidad de atender en forma coordinada la interacción entre los aspectos ginecoobstétricos y endocrinológicos en las diferentes etapas de la vida de la mujer, porque existe un periodo que involucra la edad reproductiva, donde existen muchos trastornos endocrinológicos que pueden afectar la fertilidad de una pareja, lo que ha generado la necesidad de abordar estos trastornos en forma integral.

Así, surgió lo que actualmente se conoce como “Endocrinología de la Reproducción”, misma que inició su desarrollo en varios países de Europa, donde han sobresalido desde tiempos remotos Hipócrates como creador de la medicina, Soranus que hizo la primera descripción de anatomía y Galeano autoridad en fisiología. Leonardo da Vinci describió la anatomía del útero, Andreas Vasalius describió el cuerpo lúteo, Fallopius las salpinges, Fabricius que registró las estructuras del ovario, de Graaf reconoció los folículos ováricos, Leeuwenhock descubrió los espermatozoides. En Estados

Unidos, con presencia internacional a través de Fuller Albright, destacado investigador clínico que describió múltiples síndromes ginecológicos relacionados con la reproducción y, después, Robert Benjamin Greenblatt, experto en acción de las hormonas sexuales, quien tuvo destacados alumnos en Augusta, Georgia, como los doctores: Arturo Zárate, Irma Pico, Samuel Hernández Ayoup, Carlos Félix Arce y Efraín Vázquez Benítez. En México no se ha cultivado científicamente esta parte de la medicina porque se ha ejercido en forma aislada por prohombres que han cimentado las bases para su desarrollo, pero es hasta este año que se instituye de forma organizada y con reconocimiento por la Asociación Mexicana de Medicina de la Reproducción, como una sección de interés que iniciará actividades a partir de enero del 2012 y que tiene como objetivo agrupar a los especialistas dedicados a esta parte de la ginecología, para darle direccionalidad y presencia nacional e internacional a través del desarrollo académico.

Es así como se reconoce a la “Endocrinología de la Reproducción” como uno de los pilares de la medicina de la reproducción humana y como una de las bases en la fundación de nuestra sociedad médica que, además, se ha visto sustentado, en gran parte, por la subespecialidad de nuestros miembros. Por esto se hace un llamado a todos los especialistas en estas áreas (endocrinólogos y ginecólogos) para integrarse a este grupo en favor de la medicina mexicana. Por la grandeza que tiene nuestra sociedad, en hora buena.

Marcelino Hernández Valencia

www.nietoeditores.com.mx

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Rev Mex Reprod 2012;4(3):103-109

Artículo de revisión Una visión actual de la infertilidad masculina Rosario Tapia Serrano* RESUMEN La infertilidad masculina participa en casi 50% de los casos como factor de infertilidad en la pareja. El abordaje clínico y de laboratorio, en especial el análisis de semen, aporta una base para integrar un estudio complementario y llegar a un diagnóstico etiológico preciso que permitirá tratar a los pacientes exitosamente. En la actualidad, en los pacientes infértiles se diagnostica la causa en casi 90% y en 70% son tratados exitosamente recuperando su fertilidad. Los métodos de reproducción asistida deben ser una alternativa terapéutica final, nunca se debe plantear como tratamiento inicial y único. En las clínicas de medicina reproductiva debe participar un médico especializado en andrología, y si la clínica considera que no es necesario, aplica el proverbio: “Los ojos no pueden ver lo que la mente no conoce”.

Palabras clave: infertilidad masculina, infertilidad en la pareja, abordaje clínico, abordaje de laboratorio.

ABSTRACT Male infertility is involved in almost 50% of cases as a factor in infertility in couples. The clinical and laboratory approach, especially semen analysis provides a basis for integrating a complementary study and arrives at a precise aetiological diagnosis that will successfully treat patients. Currently, patients diagnosed infertile because almost 90% and 70% are successfully treated recovered fertility. The methods of assisted reproduction should be a therapeutic end, never as initial therapy should be considered unique. In reproductive medicine clinics should involve a doctor specializing in andrology, and if the clinic does not consider it necessary, apply the proverb: “The eyes can not see what the mind does not know.”

Key words: male infertility, infertility in couples, clinical management, laboratory approach.

L

a tasa de embarazo por relación sexual en una pareja normal es aproximadamente de 20- 25% por mes, 75% por seis meses y 90% a un año. El 15% de las parejas en quienes se desconoce su estatus de fertilidad y que durante un año tienen relaciones sexuales no protegidas tendrán dificultades para concebir. En aproximadamente 30% de estas parejas la infertilidad sólo se debe a factor masculino y en 20% a una combinación de ambos: femeninimo-masculino; esto significa que el factor masculino está involucrado en alrededor de 50% de las parejas infértiles.1,2

*

Instituto de Medicina Reproductiva y Andrología (IMRA).

México, DF.

Correspondencia: Dra. Rosario Tapia Serrano.

Correo electrónico: tapiase@prodigy.net.mx Recibido: enero 2012. Aceptado: febrero 2012.

Este artículo debe citarse como: Tapia-Serrano R. Una visión actual de la infertilidad masculina. Rev Med Reprod 2012;4(3):103-109. www.nietoeidtores.com.mx

Volumen 4, núm. 3, enero-marzo, 2012

En las últimas décadas se ha insistido en la evaluación simultánea de la pareja infértil, por eso se han creado guías de estudio basadas en evidencias o en la opinión de expertos. La American Urological Association y la American Society for Reproductive Medicine han publicado guías que incluyen varios aspectos de la evaluación y tratamiento del hombre infértil.

En México, a partir del decenio de 1980, se inició la creación de clínicas especializadas en andrología, como parte de los servicios de ginecología endocrina, medicina reproductiva y urología del Instituto Mexicano del Seguro Social que valoran al hombre infértil. A fines de esa década se iniciaron los diplomados en andrología clínica para médicos especialistas en urología, medicina reproductiva, internistas y endocrinólogos.

La infertilidad masculina es una condición difícil y estresante para los clínicos y los pacientes. Para la pareja, la posibilidad de ser infértil reduce su autoestima.

El clínico, por su parte, debe estar familiarizado con la etiología, la manera de encarar el problema, los estudios diagnósticos y su interpretación porque necesita desarrollar un plan de atención racional y efectiva.

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Tapia Serrano R

La amplia información existente en la internet es accesible e inmediata para los pacientes, aunque con pobre calidad científica y, a veces, con la promoción de estudios y tratamientos que crean falsas expectativas.

Por esto es importante que los clínicos, en general, y los interesados en el área tengan un amplio conocimiento de las bases de la evaluación de la infertilidad masculina.

Estudio integral del varón infértil

La evaluación del varón con infertilidad tiene como metas identificar: 1. Las condiciones etiológicas que pueden ser revertidas y que mejoran el estatus de fertilidad del varón.

2. Las enfermedades concomitantes que afectan la fertilidad del varón.

3. Las condiciones etiológicas irreversibles que pueden ser tratadas mediante técnicas de reproducción asistida, como la inseminación intrauterina (IIU), fertilización in vitro (FIV) e inyección intracitoplasmática del espermatozoide (ICSI), entre otras.

4. Las condiciones etiológicas irreversibles en las que no se puede pasar a técnicas de reproducción asistida pero puede ofrecerse inseminación intrauterina con semen de donador o pasar a un programa de adopción.

5. La causa genética que puede tener implicaciones para el paciente y su descendencia.

Evaluación clínica

La historia clínica completa debe insistir en los antecedentes familiares, personales patológicos y no patológicos que se relacionan con los problemas de fertilidad en el varón, por ejemplo: la infertilidad familiar, enfermedades de origen genético en familiares directos, enfermedades eruptivas de la infancia, como la parotiditis y su complicación con orquitis, enfermedades de trasmisión sexual, enfermedades sistémicas como síndrome metabólico, diabetes mellitus, esclerosis múltiple, antecedentes quirúrgicos como orquiectomía, hernioplastias, cirugía retroperitoneal, etc. también hay que investigar la profesión, exposición a tóxicos del medio ambiente, estilo de vida, estrés, consumo de café, tabaquismo o drogas (marihuana, cocaína etc.) o anabólicos.

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En la historia clínica se crea un inciso especial con los antecedentes andrológicos que recaba la historia de desarrollo puberal, historia sexual y reproductiva.

Ahí debe resumirse la edad al descenso testicular, edad a la aparición de los caracteres sexuales secundarios, edad a la que inició la vida sexual, si tiene o no deseo sexual, erección y calidad de ésta y de la eyaculación, frecuencia de las erecciones matutinas, antecedentes de masturbaciones y eyaculaciones nocturnas durante la adolescencia y actuales. En cuanto a los antecedentes maritales número de matrimonios, tiempo del matrimonio actual, edad de la pareja, métodos anticonceptivos y duración de los mismos, antecedentes de hijos de matrimonios previos o de la pareja.

La mayoría de los varones en estudio de infertilidad cursan asintomáticos y son referidos porque en el estudio del semen se encontró alguna alteración. Sin embargo, al interrogatorio dirigido refieren: dolor escrotal, ansiedad, síntomas de disfunción sexual como deseo hipoactivo, disfunción eréctil parcial o global y cambios en el volumen del eyaculado.

Exploración física

La exploración física debe integrar los signos vitales completos, el índice de masa corporal (IMC), circunferencia de la cintura, distribución del vello corporal y especificar si es androide, si tiene ginecomastia, la distribución de la grasa abdominal y si hay visceromegalia.

En cuanto a la exploración escrotal es muy importante medir los testículos y obtener su volumen, consistencia, explorar detenidamente los conductos excretores, epidídimos y deferentes, buscar en posición de pie y por la maniobra de Valsalva varicocele y el grado de severidad del mismo. En la exploración del pene se busca la hiperemia en el meato uretral u otros signos en la piel, curvatura del pene o la existencia en los cuerpos cavernosos de placas induradas.

Si se sospecha alguna alteración de la próstata se completa la evaluación con un tacto rectal.

La evaluación clínica es la base para los diagnósticos clínicos y, sobre todo, orienta hacia los estudios de laboratorio y gabinete que debemos realizar.

Es importante tomar en cuenta la edad de la pareja del paciente porque a mayor edad el pronóstico de fertilidad es menos favorable; por lo tanto, el estudio y tratamiento Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción

Una visión actual de la infertilidad masculina

se deben pensar en cuanto al tiempo de resolución, para determinar si pasa a un ciclo largo de tratamiento o se decide combinar métodos de reproducción asistida a corto plazo.

Estudios de laboratorio y gabinete

El estudio inicial en la evaluación del varón infértil es el análisis del semen para valorar la integridad funcional del eje hipotálamo-hipófisis-testículo y la integridad anatómica y funcional de los conductos excretores y glándulas accesorias (vesículas seminales, próstata, glándulas bulbouretrales).

El análisis de semen debe practicarse e interpretarse como se señala en los lineamientos del Manual de laboratorio de la Organización Mundial de la Salud (5ª ed, 2010) para el examen y procesamiento del semen humano.3 Este manual no sólo proporciona los lineamientos para el análisis del semen, sino para todos los estudios que hoy se realizan para evaluar la función espermática, integridad de las membranas, determinación de anticuerpos anti-espermatozoides y de especies oxigeno-reactivas o fragmentación del ADN, entre otros.

El manual debe de ser una guía para los clínicos, biólogos, químicos y enfermeras de las clínicas de fertilidad o de reproducción asistida. Cuadro 1 La morfología es un índice importante del estado del epitelio germinal y tiene un valor predictivo en el

proceso de fertilización, por lo que se creó un criterio estricto para su valoración, enunciado por Kruger.4 Los otros índices, como la aglutinación, células epiteliales, leucocitos, bacterias, eritrocitos y detritus, pueden estar asociados con alguna afección.

Los índices de normalidad del Manual de la OMS (2010) se tomaron de un estudio de varones de parejas que lograron el embarazo en el lapso de un año; consideraron el percentil 5 como el rango normal bajo. Esto merece una consideración porque si lo aplican como escrutinio en las clínicas sin una valoración clínica, dejarían fuera a 37% de los pacientes sin diagnóstico y tratamiento, como se demuestra en un estudio comparativo en 401 pacientes infértiles.5 Figura 1 Las alteraciones en el análisis se definen en la nomenclatura que se muestra en el Cuadro 2.

La frecuencia de las alteraciones en el análisis del semen se agrupa con el propósito de tener una sospecha diagnóstica y elaborar un plan de estudio y tratamiento.6 1. Oligoastenotetarozoospermia (OAT)

- Astenoteratozoospermia severa (AT-S) 2. Oligozoospermia severa y azoospermia (OS y AZ) 3. Hipospermia con o sin oligozoospermia y azoospermia (H-O, A) La frecuencia de las alteraciones en el análisis del semen de hombres infértiles en un laboratorio especializado en andrología se muestran en la Figura 2.

Cuadro 1. Límites de referencia bajos (percentil 5 y con intervalos de confianza del 95%) para las características del semen.3 Parametros Volumen del semen (ml) Concentración total de espermatozoides (106 / ejaculado) Concentración de espermatozoides (106/ ml.

Motilidad total (PR + NP, %) Motilidad Progresiva (PR %) Vitalidad (espermatozoides vivos %) Morfología espermática (formas normales %) pH Consenso de otro valores limites Peroxidasa-positiva para leucocitos (106/ ml) MAR test (espermatozoides móviles con partículas unidas %) Inmunobead test ( espermatozoides móviles con bead unidos % Zinc seminal (mol/eyaculado) Fructosa seminal ( mol/eyaculado) Glucosidasa neutral seminal (mU/eyaculado)

Volumen 4, núm. 3, enero-marzo, 2012

Límites de referencia bajos 1.5 (1.4 – 1.7) 39 (33 – 46) 15 (12 – 16) 40 (38 – 42) 32 (31 - 34) 58 (55 - 63) 4 (3.0 – 4.0) ≥7.2 <1.0 <50 <50 ≥2.4 ≥13 ≥20

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Tapia Serrano R

Alteraciones en el semen 60 50

23%

40 %

30 20 10 0

59% 13% Normoz

Oligoz

Astenoz

Teratoz

Hipos

IMRA 2010-2011 5%

Figura 1. Estudio comparativo del análisis de semen según los criterios de la OMS de 1999 y 2010 en pacientes infértiles (n = 410).

Cuadro 2. Nomenclatura de las características del análisis de semen

Grupo I: O, A, T, OAT, OA, OT, AT

Normozoospermia

Eyaculado normal en todos los índices

Grupo II: HN, H y/o OAT, HAZ

Oligozoospermia Astenozoospermia Teratozoospermia Azoospermia Hipospermia Aspermia

< 15 mill. de espermatozoides por ml. < 32% de motilidad progresiva < 4% de formas normales * Ausencia de espermatozoides < 1.5 ml. del volumen del eyaculado No eyaculado

Grupo III: N

*Criterios estrictos de Kruguer para fertilización in vitro. El 14% se relaciona con el potencial de fertilidad del varón.4

Grupo IV: AZ, O severa IMRA / Mayo 2011

Figura 2. Porcentaje de alteraciones del análisis de semen en pacientes infértiles (n = 3,446).

Oligoastenoteratozoospermia

Las alteraciones en la concentración, motilidad y morfología pueden ser leves o moderadas y orientan a la búsqueda de las siguientes alteraciones patológicas: Procesos inflamatorios e infecciosos o testiculares y, con menor frecuencia, prostatitis.

1. Las infecciones más frecuentes son secundarias a bacterias grampositivas y gramnegativas, como: Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum y Chlamydia trachomatis.

Las infecciones virales por herpes virus simple (HVS) tipo 2 y el virus del papiloma humano (VPH) pueden inducir alteraciones en el semen en sus periodos de actividad. Con base en estos, los estudios que deben

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realizarse en el semen, la secreción uretral o por toma directa del meato uretral, así como en el suero sanguíneo son: 7 • Espermocultivos generales para determinar la existencia de bacterias grampositivas y en especial gramnegativas.

• Entre los cultivos especiales están: el cultivo para Mycoplasma y la determinación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para Ureaplasma urealyticum.

• La detección de Chlamydia trachomatis se consigue mediante la determinación en suero de anticuerpos IgG para Chlamydia trachomatis, o por el método Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción

Una visión actual de la infertilidad masculina

de PCR para Chlamydia trachomatis para el diagnóstico definitivo.

• En cuanto a las infecciones virales, se detectan anticuerpos IgG o IgM para HVS 2; para la investigación del virus del papiloma humano puede ser por PCR para determinar los subtipos de bajo, mediano y alto riesgo frecuentes en la población mexicana.

Las alteraciones en la morfología de los espermatozoides son importantes. Por ejemplo, en las infecciones por Ureaplasma urealyticum con frecuencia pueden observarse alteraciones, como: colas cortas, delgadas, irregulares o rígidas. También se han descrito alteraciones ultraestructurales en la cola.8 2. Varicocele unilateral o bilateral que puede estar asociado con un proceso inflamatorio crónico. El diagnóstico es clínico: sin embargo, se confirma con un estudio de ultrasonido escrotal simple o Doppler.

3. Las alteraciones endocrinas más frecuentes son la hiperprolactinemia y el hiperestrogenismo, que se asocian, sobre todo, con las alteraciones de la movilidad y la forma de los espermatozoides. En la hiperprolactinemia se deben descartar algunos tumores hipofisiarios o tiroidopatías y en hiperestrogenismo y enfermedad hepática.

4. En la actualidad, el síndrome metabólico es una de las causas de infertilidad que se ha incrementado en la población joven mexicana y del mundo, que condiciona hipoandrogenisno e hiperestrogenismo con manifestaciones clínicas de disfunción sexual como deseo hipoactico y disfunción eréctil, disminución del volumen testicular y alteraciones en la calidad del semen.

Se deben realizar determinaciones hormonales de prolactina, estradiol, hormona estimulante de la tiroides (TSH) y testosterona total o testosterona libre en suero.

Astenoteratozoospermia severa

Se denomina astenoteratozoospermia severa cuando la motilidad progresiva de los espermatozoides es menor de 20% y teratozoospermia severa cuando la morfología normal es menor de 4%, con base en los criterios de Kruger.3 Al descartar todas las causas mencionadas se debe pensar en un síndrome de cilio inmóvil, el cual es secundario a alteraciones ultraestructurales del cilio, Volumen 4, núm. 3, enero-marzo, 2012

pieza intermedia o cabeza;9,10 por ejemplo, síndrome de Kartagener, Young, etc.

También la astenozoospermia severa puede ser secundaria a la presencia de anticuerpos antiesperma, los que pueden ser inmovilizantes o aglutinantes. Hay factores que los inducen, como la presencia y cronicidad de los cuadros infecciosos de los epidídimos o la vasectomía, a veces los factores inmunológicos están en la pareja.11,12 La determinación de los anticuerpos IgA e IgG más utilizada es la prueba de mixed antiglobulin test (MAR test), que está descrita en el Manual de la OMS3.

Oligozoospermia severa y azoospermia

Se considera oligozoospermia severa cuando el concentrado de espermatozoides es menor de 5 millones de espermatozoides por mililitro y azoospermia la ausencia de espermatozoides en el eyaculado. En cuanto a la etiología pueden ser algunas de las causas mencionadas; sin embargo, como son poco frecuentes habrá que pensar en alteraciones endocrinas del eje H-H-T o falla testicular primaria o secundaria.

Las determinaciones hormonales séricas basales son: foliculoestimulante (FSH), luteinizante (LH), prolactina (PRL), testosterona total (Tt) y estradiol E2). Con base en esos estudios se encuentran los siguientes patrones: 1. Hipogonadotrópico: FSH, LH y T disminuidas; FSH disminuida con LH y T normal; FSH normal con LH y T disminuida.

En este grupo hay que descartar afecciones hipotálamo-hipofisiarias porque puede ser secundaria a una deficiencia parcial o total de GnRH, tumores hipotalámicos e hipofisiarios, etc.

Los estudios complementarios que deben realizarse son:

a) Prueba de estimulación con hormona gonadotropina coriónica (HGC) 5000 UI, que evalúa la reserva endocrina testicular.13 b) Estudios radiológicos: tomografía axial computada (TAC) de cráneo o resonancia magnética (RM) de cráneo.

2. Hipergonadotrófico: FSH, LH elevadas y T disminuida; FSH elevada y LH y T normales y FSH normal con LH, T y E2 elevados.

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Tapia Serrano R

En este grupo hay que descartar insuficiencia testicular primaria; por ejemplo, síndrome de Klinefelter, varón XX, varón XYY, síndrome de células de Sertoli, criptorquidia, o secundaria a exposición a gonadotóxicos, traumatismo testicular, orquiepididimitis severa, con secuelas de atrofia testicular, etc.

Entre los estudios complementarios que pueden realizarse están los siguientes:

Hipospermia con o sin oligozoospermia o azoospermia

1. Cariotipo y determinación de micropérdidas del cromosoma Y, y en AZF a, b y c, así como en algunos estudios especiales se determinan el DAZ y el d mediante PCR.14

2. Obstrucción de los conductos eyaculadores secundarios a hipertrofia, calcificaciones o quiste en verum montanum.

2. Biopsia de testículo: evalúa desde el punto de vista microscópico la estructura del testículo, que comprende los túbulos seminíferos con sus dos componentes: las células de Sertoli y el epitelio germinal.

Además, en el espacio intersticial se evalúan las células de Leydig y la distribución del tejido conectivo.

En la actualidad, desde el punto de vista de la fertilidad, se aplican algunos criterios que tienen valor diagnóstico y pronóstico, como el índice de espermátides tardías, sobre todo para la extracción de espermatozoides para pasar a un proceso de reproducción asistida por inyección intracitoplasmática.15,16 En el estudio efectuado por el grupo de Regadera y Nistal17 se cuantificaron todas las células y se obtuvo una correlación con las determinaciones hormonales.

3. Normogonadotrópico: si se encuentran en los límites normales indica que la función del eje H-H-T está íntegra; sin embargo, no descarta un daño testicular evolutivo. También debe descartarse la obstrucción de los conductos deferentes, epidídimos, conductos eferentes o rete testis. Las causas pueden ser un proceso infeccioso e inflamatorio crónico o secuelas del mismo, obstrucción quirúrgica posvasectomía o hernioplastia inguinal, en especial en la infancia, o malformaciones en la rete testis.

Debe practicarse la exploración escrotal, con biopsia de testículo bilateral y deferentografía (que se describirá más adelante).

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En este grupo, el índice principal es la hipospermia, que indica que las alteraciones están en las ámpulas de deferentes, conductos eyaculadores o glándulas accesorias (vesículas seminales y próstata). Entre la etiología tenemos: 1. Eyaculación retrógrada secundaria a la neuropatía diabética o eventos quirúrgicos en el retroperitoneo.

3. Malformaciones congénitas, como: agenesia o atresia de conductos deferentes, agenesia o hipoplasia de las vesículas seminales.

Los estudios que deben practicarse son los siguientes: 1. Búsqueda de espermatozoides en orina postmasturbación: la muestra es positiva cuando hay más de 60 espermatozoides por campo en orina centrifugada.

Este estudio se realiza cuando hay sospecha de eyaculación retrógrada.

2. El estudio de imagen específico es el ultrasonido transrectal (USTR) y ultrasonido escrotal.18 3. También se realizan determinaciones hormonales basales.

Otros estudios

En el campo de la infertilidad, el estrés oxidativo es una resultante de las diferentes causas de la infertilidad masculina y repercute en el potencial de fertilidad, por el daño en la membrana celular, incremento de la apoptosis pero, sobre todo, la fragmentación del ADN porque se han observado bajos resultados en programas de reproducción asistida o en la frecuencia de abortos. También se especula si podría haber algún problema en la descendencia.20,21 Los estudios que se realizan son: medir la capacidad antioxidante total (TAC, determinación de los niveles de ROS por quimioluminiscencia o determinación de fragmentación del ADN por citometría de flujo SCSA o TUNEL).

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Una visión actual de la infertilidad masculina

Métodos de reproducción asistida

Las técnicas de reproducción asistida son algunos de los grandes avances en la terapia de la infertilidad masculina que modificó en forma radical su pronóstico. La técnica mejor aplicada es la inyección intracitoplasmática del espermatozoide (ICSI), aunque el tratamiento con PICSI ha mejorado las tasas de embarazo.

La obtención de los espermatozoides se realiza por punción epididimaria abierta o cerrada, por punción o biopsia testicular; ésta última puede realizarse con auxilio del microscopio para determinar las áreas donde se encuentren los túbulos seminíferos dilatados.15 Las indicaciones son en pacientes con oligozoospermia severa, azoospermia obstructiva congénita o adquirida; azoospermia no obstructiva con insuficiencia testicular evolutiva e hipoespermatogénesis, en donde no se demuestren micropérdidas del cromosoma Y, causas inmunológicas, síndrome de cilio inmóvil e infertilidad idiopática.

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Rev Mex Reprod 2012;4(3):110-115

Artículo original Análisis del NPY hipotalámico inducido por complicaciones nutricionales en la reproducción Leticia Manuel Apolinar, Erika García Díaz, Miriam Ruiz Albarrán, Leticia Damasio Santana, Marcelino Hernández-Valencia

RESUMEN Antecedentes: la desregulación en la disponibilidad de sustratos energéticos en la vida prenatal o posnatal predispone a la aparición de procesos de adaptación metabólica y hormonal que persisten a lo largo de la vida. Así, en la etapa de reproducción, el estado de desnutrición materna desencadena bajo peso del feto al nacimiento e induce cambios en el hipotálamo, donde se integran las señales nutricionales y el equilibrio energético mediante sistemas hormonales, como la leptina y el neuropéptido Y (NPY).

Objetivo: analizar el efecto de la desnutrición fetal en la expresión del receptor de NPY1 hipotalámico.

Método: se utilizaron ratas Sprague Dawley con restricción de alimento al 50% y se obtuvieron crías de bajo peso al nacimiento (grupo BPN). Al destete se alimentaron con dieta hipercalórica. A las 2 y 12 semanas de edad se analizó con RT-PCR la expresión del receptor de NPY1 en el hipotálamo.

Resultados: en el grupo de bajo peso fetal, el peso corporal al nacimiento fue menor que el de los controles (C), (p<0.001); sin embargo, de las 2 hasta las 12 semanas aumentaron de peso (p<0.001). A las dos semanas, la expresión del receptor de NPY1 en el hipotálamo fue mayor en el grupo de bajo peso fetal al nacimiento que en el control, con una p<0.05.

Conclusión: los resultados sugieren que la desnutrición intrauterina puede asociarse con alteraciones desde la etapa fetal que inducen cambios para optimizar el equilibrio energético, donde participa el NPY mediante aumento de la expresión del receptor NPY1 en el hipotálamo, que genera hiperfagia cuando hay disposición de alimento a libre demanda, quizá debido a las adaptaciones de la recuperación del crecimiento.

Palabras clave: desnutrición fetal, hipotálamo, cerebro, neuropéptido Y

ABSTRACT Background: Deregulation in the availability of food in prenatal and postnatal life, predisposes to the development of processes of metabolic and hormonal adaptation that persist throughout life. Thus, in reproducing a state of malnutrition triggers a low birth weight (LBW). Considering that induces changes in the brain, the hypothalamus integrates nutritional signals also participate in the energy balance through hormonal systems such as leptin and neuropeptide Y (NPY).

Objective: Analyze the effect of fetal undernutrition in the expression of NPY1 hypothalamic receptor.

Methods: Sprague Dawley rats were used with food restriction to 50% in pregnancy compared control group (C); was obtained in offspring a low birth weight (LBW group), after weaning were fed high-calorie diet, at 2 and 12 weeks-old with the hypothalamus by RT-PCR was analyzed receptor expression NPY1.

Results: Body weight at birth was lower in the LBW vs control group (p <0.001), but at 2 to 12 weeks increased (p <0.001), the expression in the hypothalamus NPY1 receptor was higher in group LBW vs C at 2 weeks p <0.05.

Conclusions: These results suggest that in the reproduction with presence of malnutrition induced changes to optimize their energy balance, with an increase in expression in hypothalamic NPY1 receptor, generating a hyperphagia when food is available. Possibly secondary to adaptations of catch up growth.

Key words: fetal undernutrition, hypothalamus, brain, neuropeptide Y

Unidad de Investigación Médica en Enfermedades Endocrinas, Hospital de Especialidades, Centro Médico Nacional Siglo XXI, IMSS. México, DF.

Correspondencia: Dra. Leticia Manuel Apolinar. Unidad de Investigación Médica en Enfermedades Endocrinas, Hospital de Especialidades, CMN-IMSS. Av. Cuauhtémoc 330, colonia Doctores.

México 06720, DF. Correo electrónico: letymanu@yahoo.com.mx

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Recibido: diciembre 2011. Aceptado: enero 2012 Este artículo debe citarse como: Manuel-Apolinar L, García-Díaz E, Ruiz-Albarrán M, Damasio-Santana L, Hernández-Valencia M. Análisis del NPY hipotalámico inducido por complicaciones nutricionales en la reproducción. Rev Mex Reprod 2012;4(3):110-115. www.nietoeditores.com.mx

Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción

NPY hipotalámico inducido por complicaciones nutricionales

E

n las últimas décadas, diversas áreas de investigación en la reproducción han sugerido que los eventos implicados en el desarrollo fetal tienen efectos a largo plazo e influyen en la salud durante la vida adulta.1 En la actualidad se conocen los factores que interactúan con la expresión de genes in utero y establecen patrones fisiológicos y estructurales relacionados con la supervivencia del individuo. La programación de la obesidad puede darse por medio de alteraciones permanentes de una o más vías relevantes durante el desarrollo embrionario y perinatal. Algunas no sólo influyen en el sujeto sino que también producen efectos que alteran la programación de generaciones futuras.2 Así, una de las variables biológicas que mayor repercusión tiene en la salud a largo plazo, luego de la desnutrición intrauterina, es el crecimiento. El crecimiento de un individuo está condicionado por la interacción entre el potencial genético y el ambiente; a su vez, la capacidad de recuperación que tenga un desnutrido depende de la magnitud del crecimiento recuperado o “catch up growth”.3 Así, un aspecto importante del proceso de desarrollo de nuevos tratamientos farmacológicos para la obesidad se basa en el entendimiento de los efectos de la programación fetal en el sistema neuroendocrino y su relación con las alteraciones en los procesos fisiológicos y psicológicos que controlan el apetito y la regulación del peso corporal.

La leptina es una hormona producto del gen ob, un péptido con peso molecular de 16 kDa, producida por los adipocitos, que informa al cerebro del estado de los depósitos corporales de energía y, por tanto, funciona como un sensor del equilibrio energético. La leptina también se ha relacionado con los cambios periféricos de la regulación energética, como la resistencia a la insulina.4 En consecuencia, su acción central está mediada por péptidos, entre los que destaca el neuropéptido Y. Así, la leptina regula el consumo de alimentos y el gasto de energía.

El neuropéptido Y es un péptido orexigénico que se sintetiza en las neuronas del núcleo arcuato (ARC).5 La administración intracerebrovascular (ICV) del NPY da como resultado hiperfagia y aumento del peso corporal;6 también disminuye el gasto de energía, estimula episodios de alimentación y aumenta la ingestión de alimento, la duración y la frecuencia de la misma.7 El NPY es un Volumen 4, núm. 3, enero-marzo, 2012

regulador importante del equilibrio energético.8 En la actualidad se han descrito cinco subtipos distintos de receptores del NPY (Y1, Y2, Y4, Y5, Y6). De éstos, el receptor Y1 tiene un papel importante en la regulación del consumo de alimento,8,9 mientras que el receptor Y5 no sólo media la respuesta al alimento (Hwa et al, 1999), sino que también contribuye a la homeostasis de regulación de la energía.10 Por esto se propone que el NPY es más importante en el estímulo de la ingestión cuando las reservas energéticas están gravemente afectadas. Por lo anterior, el objetivo de este estudio fue: determinar desde etapas tempranas de la gestación el efecto de la desnutrición fetal en la expresión del receptor de NPY1 hipotalámico asociado con el bajo peso fetal al nacimiento y con la recuperación del peso posnatal.

MATERIAL Y METODO Estudio x en el que se utilizaron ratas de la cepa Sprague Dawley: 20 machos y 20 hembras nulíparas de tres meses de edad, con peso de 200-250 g. Los animales permanecieron en el bioterio del Centro Médico Nacional del Instituto Mexicano del Seguro Social (CMN S-XXI, IMSS). El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética Nacional del CMN Siglo XXI, IMSS. Los animales se utilizaron de acuerdo con lo señalado en la Norma Oficial Mexicana (5.1.3.1, NOM-062-ZOO-1999): se mantuvieron en condiciones convencionales de bioterio. Con base en el modelo experimental utilizado en el laboratorio,11 se cruzaron y con la identificación del tapón vaginal se consideró el día 1 de la gestación. Al comienzo de la segunda semana de gestación al grupo experimental se le restringió el alimento al 50% respecto del grupo control (C). La ingestión de agua fue ad libitum. Al nacimiento de las crías, las madres del grupo con restricción de alimento fueron alimentadas de manera normal. Las crías se pesaron y seleccionaron por sexo.

Se homogeneizaron en camadas de 8-9 machos en cajas separadas por camada y se alimentaron por lactancia hasta los 21 días de edad posnatal. Después del destete, las crías del grupo C se alimentaron con la dieta control y las crías del grupo con restricción de la dieta materna con bajo peso al nacimiento se alimentaron con la dieta hipercalórica (60% de lípidos) HL, grupo bajo peso fetal al nacimiento+HL.

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Apolinar LM y col.

Peso corporal. Enseguida del nacimiento, las crías del grupo C y las de bajo peso fetal al nacimiento nacieron. El peso se registró hasta las 12 semanas de edad posnatal.

estándar. La diferencia estadística se consideró para una p<0.001 entre el grupo (C) y el grupo de bajo peso fetal al nacimiento. El análisis intergrupo fue mediante prueba t de Student.

Prueba RT-PCR para la expresión del mARN de los receptores NPY1 en el hipotálamo

RESULTADOS

La extracción del ARN total fue mediante el método de trizol. Para evidenciar la integridad del ARN se realizó una electroforesis con gel de agarosa al 2%, con bromuro de etidio. Posteriormente se obtuvo una cadena complementaria de ADN (cDNA) a partir de mARN de muestras de tejido hipotalámico, que fueron sometidas a la acción de una enzima transcriptasa reversa. Una vez con el cADN y con los primers específicos de los genes se realizó la reacción de PCR (Cuadro 1). Para determinar la expresión del gen del receptor del neuropéptido Y 1 (Npy1r, NPY1), así como para el gen constitutivo y de normalización tubulina (Tub β3), se utilizó la técnica de RT-PCR. Cuadro 1. Cebadores usados para la determinación de la expresión de receptores hipotalámicos Gen

Secuencia

Producto de PCR (pb)

Npy1r

F 5´-TCTTCTCTGCCCTTCGTGATCR 5´-TGAACGCCGCAAGTGATACA-

73

Tubb3

F 5´-TCAGCGTGGTGCCCTCACR 5´-GTGAGCTCAGGCACCGCT-

370

La PCR se realizó con el equipo Pyrostart (Fermentas). Las condiciones de PCR se sometieron a desnaturalización a 95 ºC durante cinco minutos. Se realizaron 35 ciclos designados para la reacción con las siguientes condiciones: 95 ºC durante 1 minuto (desnaturalización), 60 ºC durante un minuto (alineamiento), 72 ºC durante un minuto (elongación); con elongación final de 72 ºC durante siete minutos se utilizó un termociclador Eppehdorf, Epgradient S. El producto de PCR se evidenció mediante electroforesis al 2% de agarosa y bromuro de etidio; la determinación de la densitometría fue en un Gel Logic.

Análisis estadísticos. Los datos obtenidos se analizaron con estadística simple con promedio ± desviación

112

El peso corporal de las madres durante la gestación se obtuvo de la desnutrición materna de los últimos nueve días de gestación. La restricción al 50% del alimento redujo, al final de la gestación, el peso corporal de las madres del grupo con restricción de 10.5% con respecto al grupo C. Es así como se demuestra que la restricción de alimento durante los 12-21 días de gestación reduce el peso corporal de las madres; de esta manera se confirma el estado inducido de desnutrición materna.

Peso corporal en crías de madres con restricción de alimento durante la gestación

Las crías de madres alimentadas con restricción de alimentos durante la reproducción se afectaron porque tuvieron bajo peso fetal al nacimiento vs los controles (p<0.001). Sin embargo, a partir de la vida posnatal las madres en lactancia de estas crías se alimentaron a libre demanda.

El peso corporal de los grupos de estudio se registró desde el nacimiento hasta las 12 semanas de edad. El peso de las crías producto de la desnutrición materna al nacimiento (grupo bajo peso fetal al nacimiento) se redujo 17.9% con respecto al control, con diferencias significativas (p<0.001). Estas diferencias de peso entre los grupos desaparecieron en la segunda semana porque el peso se incrementó 12.5% en el grupo de bajo peso fetal al nacimiento (p<0.05), lo que indica recuperación del crecimiento. El peso del grupo con bajo peso fetal al nacimiento a las 12 semanas de edad, cuando ya lo estaban alimentado con la dieta HL, permaneció por arriba, con incremento de 22.8% (p<0.001). Figura 1 Ingestión de dieta hiperlipídica después de bajo peso al nacimiento A los 21 días después del destete, el grupo control se alimentó con una dieta control y el grupo con bajo peso fetal al nacimiento con una dieta HL. A partir de la cuarta semana y hasta las 12 semanas de edad las ratas alimentadas con la dieta HL consumieron más Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción

NPY hipotalámico inducido por complicaciones nutricionales

Curva de crecimiento

***

500 450 400 350 Peso corporal (gramos)

300 40

*

30

***

20 10 8

***

6 4 2 0

Edad Nacimiento C

1 semana C

2 semana C

12 semana C

Nacimiento BPN

1 semana BPN

2 semana BPN

12 semana BPN + HL

Figura 1. Peso corporal de ratas controles y obesas. Efecto de la restricción de alimento en la gestación y la dieta hipercalórica en el grupo de bajo peso fetal al nacimiento comparado con el grupo C. Los pesos considerados fueron: al nacimiento, 1, 2 y 12 semanas de edad. Los datos se presentan como promedio ± desviación estándar. La diferencia estadística fue de *p<0.05; ***p<0.001 entre el grupo (C) y el grupo de bajo peso fetal al nacimiento. La comparación entre grupos fue con prueba t Student.

alimento en comparación con el control. Las diferencias en el consumo de alimento por gramo se consideraron estadísticamente significativas con una p<0.05.

Expresión de NPY1 en el hipotálamo

Por lo que se refiere a los niveles de expresión del mARN del receptor Y1 en el hipotálamo, fue mayor en 25% en el grupo de bajo peso fetal al nacimiento vs el grupo C a las dos semanas, con una p<0.05. Estas diferencias no permanecen cuando los animales se alimentan con la dieta HL a las 12 semanas de edad, porque disminuyen.

Si bien los niveles de expresión del mARN del receptor Y1 tienden a disminuir con la edad y con la dieta, estas diferencias no son significativas comparadas con el control de la misma edad (Figura 2).

Volumen 4, núm. 3, enero-marzo, 2012

DISCUSIÓN En este estudio se observó que la restricción de calorías durante la gestación resulta en bajo peso al nacimiento; sin embargo, en la vida posnatal inmediata en las ratas con alimento a libre demanda se encontró hiperfagia.

El aumento en la ingestión de alimento condujo a la recuperación del crecimiento a las dos semanas de edad, sin que se hubiera modificado el tipo de alimento. La aceleración en la recuperación del crecimiento quizá fue benéfica a corto plazo, porque permitió a las ratas supervivir hasta la edad reproductiva. Sin embargo, con el consumo de una dieta HL después del destete ocurren adaptaciones que resultan perjudiciales para la salud.

Algunos estudios experimentales previos sugieren que

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Apolinar LM y col.

0.8

*

Y1 mRNA Y1/ ßTub

0.6

A 0.4

0.2

2

12 Semanas

Control

BPN

BPN+HL

Semanas de edad posnatal

B Pool Y1 ß tub

2 semanas Control 1 2 3

12 semanas

BPN 1

2

Control 1 2 3

BPN+HL 1 2 3

28 semanas Control 1 2 3

BPN+HL 1 2 3

Figura 2. Comparación de la expresión del receptor NPY1 en las diferentes edades de estudio. Los datos se presentan como promedio ± desviación estándar. La diferencia significativa es de *p<0.01. Prueba t de Student.

el tipo de manipulación de la dieta materna durante la gestación puede dar como resultado diferentes fenotipos: hipofágico o hiperfágico. Cuando las hembras gestantes se alimentan con una dieta baja en proteínas tienen crías con hipofagia.12 Sin embargo, las crías de madres con desnutrición gestacional severa (restricción de 70% de la ingestión normal de alimento) tienen hiperfagia hasta la vida adulta cuando se alimentan con una dieta HL.13 Los resultados de este estudio confirman la recuperación del crecimiento observado en otros estudios en

114

modelos animales,14,15 lo que indica que la restricción de nutrientes in utero tiene un efecto importante en el crecimiento postnatal. Los estudios realizados por Ozanne y Hales,14 así como por Desai y su grupo16 muestran que la programación in utero da origen a la obesidad, pero no a diabetes mellitus tipo 2.

El NPY se ha identificado como un potente agente orexigénico sintetizado por las neuronas del núcleo arcuato hipotalámico. La concentración plasmática del NPY en humanos varía desde límites de 0.25 hasta 129 pM.17 De forma similar, la medición de la concentración del NPY en ratas varía en la bibliografía desde 25 hasta 3000 pM. Esto podría deberse a que el NPY no sólo ejerce su efecto en el hipotálamo, sino también en el sistema nervioso periférico, debido a sus diversas acciones biológicas, en las que se incluye la regulación cardiovascular, cognición, estrés, modulación del sistema neuroendocrino y regulación del apetito, por lo que podría modular diversas acciones biológicas a través de sus diferentes receptores. Existen estudios en los que no se han encontrado diferencias significativas en las concentraciones del NPY en plasma de ratas alimentadas con dieta HL comparadas con controles.18 Esto sugiere que las concentraciones del NPY en el plasma a nivel periférico no son sensibles a los cambios nutricionales ni a la ingestión de alimento. También se ha reportado que las dietas HL altas en grasas saturadas producen sobreregulación en la expresión del NPY en comparación con dietas HL altas en grasas insaturadas, o bien, con dietas equilibradas.19 En este trabajo la expresión del receptor Y1 fue mayor a la edad de dos semanas, momento en el que se manifiesta la recuperación del peso corporal sin influencia de la dieta HL. Por el contrario, se encontró que los niveles de expresión del mARN del receptor Y1 disminuyen significativamente a las 12 semanas en el grupo de bajo peso fetal al nacimiento+HL. Esta disminución podría ser el resultado de una regulación negativa en caso de que las concentraciones de NPY se encontraran elevadas a las 12 semanas de edad. Esto sugeriría que la programación temprana de la ganancia de peso corporal y de la hiperfagia es consecuencia de la regulación alterada de la ingestión de alimentos. Estas alteraciones pueden atribuirse a cambios en los niveles de expresión del receptor Y1 hipotalámico involucrado en la regulación del gasto energético, potenciado por la Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción

NPY hipotalámico inducido por complicaciones nutricionales

dieta HL observada en la edad adulta, lo que podría significar que la disminución en la expresión del receptor Y1 está asociada con la inducción de obesidad y diabetes. En conclusión, estos resultados sugieren que la desnutrición intrauterina determina una programación en la vida fetal que estimula una sobrealimentación compensatoria en la vida posnatal, con recuperación nutricional a la edad de dos semanas y se manifiesta con aumento en la expresión del receptor de NPY1 en el hipotálamo, quizá debido a una adaptación del gasto energético en respuesta a la desnutrición fetal.

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Artículo original Eclosión asistida en pacientes mayores de 34 años. Experiencia del Centro Médico Nacional 20 de Noviembre, ISSSTE Jesús Daniel Moreno García,* Juan Enrique González Becerra,** Miguel Ángel Regalado Hernández*** RESUMEN Antecedentes: la eclosión asistida es un procedimiento que se dio a conocer en 1989 y que intenta adelgazar o perforar la zona pelúcida. Los reportes iniciales mostraron una mejoría importante en las tasas de implantación.

Objetivo: determinar la eclosión asistida es un procedimiento que se dio a conocer en 1989 y que intenta adelgazar o perforar la zona pelúcida. Los reportes iniciales mostraron una mejoría importante en las tasas de implantación. La tasa de embarazo con eclosión asistida bioquímica en pacientes mayores de 34 años de edad.

Pacientes y método: estudio retrospectivo y descriptivo al que se incluyeron 34 pacientes del servicio de Reproducción Humana del Centro Médico Nacional 20 de Noviembre, ISSSTE, mayores de 34 años de edad, que aceptaron la eclosión asistida con ácido tyrode a embriones en el día tres del desarrollo.

Resultados: se incluyeron 34 pacientes de 38.6 ± 4.7 años de edad. Las concentraciones de hormona folículo estimulante al inicio del ciclo de estimulación fueron de 9.2 ± 5 UI/L y de folículos antrales de 6.7 ± 5.1. Se realizó transferencia embrionaria a las 34 pacientes y la tasa de embarazo fue de 32.4% (11 de 34 pacientes).

Conclusiones: el estudio reportó una tasa de embarazo de 32.4%. Se requieren aún más ensayos clínicos controlados con asignación al azar para determinar la eficacia de la técnica.

Palabras clave: eclosión asistida, ácido tyrode, embrión, zona pelúcida.

ABSTRACT Background: Objective: To determine the pregnancy rate with assisted biochemical hatching in patients older than age 34 years.

Patients and method: Case report. Human Reproduction Service of the Centro Médico Nacional 20 de Noviembre, ISSSTE. Patients older than 34 years who agreed to assisted hatching with acidic Tyrode’s solution. Assisted hatching with acidic Tyrode’s solution to embryos on their 3rd day of development.

Results: We included 34 patients aged 38.6 ± 4.7 years, follicle stimulating hormone to initiate the cycle of stimulation of 9.2 ± 5 IU / L, antral follicles 6.7 ± 5.1. Embryo transfer was performed on 34 patients, presenting a pregnancy rate of 32.4% (11 of 34 patients).

Conclusions: The study showed a pregnancy rate of 32.4%. It requires a randomized controlled trial to determine efficacy of this technique.

Key words: assisted hatching, acidic Tyrode’s solution, embryo, pellucid zone. *

Médico ginecoobstetra, biólogo de la reproducción. Jefe de servicio de Reproducción Humana. ** Médico ginecoobstetra, biólogo de la reproducción. Estu diante de la Maestría en Ciencias Médicas. *** Biólogo-embriólogo. Laboratorio de Gametos

Centro Medico Nacional 20 De Noviembre, ISSSTE. Correspondencia: Dr. Jesús Daniel Moreno García. Servicio de Reproducción Humana. Av. Félix Cuevas 540, colonia Del Valle, México 03229, DF. Correo electrónico: morenoda@prodigy.net.mx Recibido: noviembre 2011. Aceptado: enero 2012.

Este artículo debe citarse como: Moreno-García JD, GonzálezBecerra JE, Regalado-Hernández MA. Eclosión asistida en pacientes mayores de 34 años. Experiencia del Centro Médico Nacional 20 de Noviembre, ISSSTE. Rev Mex Reprod 2012;4(3):116-119. www.nietoeditores.com.mx

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a transferencia de embriones fertilizados al útero sigue siendo un paso fundamental para el éxito de las técnicas de reproducción asistida. Se cree que el cultivo in vitro de embriones puede endurecer las glicoproteínas que componen la zona pelúcida, impidiendo la eclosión del embrión y, en consecuencia, la implantación.

La eclosión asistida es un procedimiento que se dio a conocer en 1989 y que intenta adelgazar o perforar la zona pelúcida. Los reportes iniciales mostraron una mejoría importante en las tasas de implantación.1 Desde la perspectiva fisiológica, la eclosión asistida puede incrementar la comunicación entre el embrión y el endometrio, circunstancia que se traduce en mejor Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción

Eclosión asistida en pacientes mayores de 34 años

capacidad de implantación, con mejoría de las tasas de embarazo. Al parecer, la falla de la eclosión del embrión puede ser una de las razones que disminuyen la eficacia de un ciclo de reproducción asistida.2,3 En múltiples investigaciones se ha propuesto que la eclosión asistida incrementa las tasas de embarazo.1,4-7 Incluso, una revisión sistemática demostró que la tasa de embarazo pasó de 29 a 49%.8 El objetivo de este estudio es comunicar la experiencia del Centro Médico Nacional 20 de Noviembre en la eclosión asistida en pacientes mayores de 34 años de edad.

PACIENTES Y METODO Estudio retrospectivo y descriptivo al que se incluyeron 34 pacientes que cumplieron con los siguientes criterios de selección: a) Inclusión: pacientes aptas para recibir técnicas de reproducción asistida, como fertilización in vitro o inyección intracitoplasmática de espermatozoides, de 35 o más años de edad. b) Exclusión: rechazo a la eclosión asistida, pacientes que al momento de la eclosión asistida se cancele la transferencia de embriones por pobre desarrollo endometrial.

ácido tyrode contenido en la micropipeta de eclosión asistida (Humagen); de manera simultánea se presiona levemente en la zona pelúcida. Cuando se rompe por completo la parte interna de la zona pelúcida (20µm aproximadamente), se comienza a aspirar el medio para retirar la mayor parte del ácido. Enseguida de la eclosión asistida se lava el embrión con HTF Hepes y, posteriormente, se coloca en un medio de cultivo para su posterior transferencia. (Figura 1) Al favorecer la rotura de la zona pelúcida se favorece la extrusión del embrión. (Figura 2) El análisis descriptivo se efectuó con medidas de tendencia central, con media y desviación estándar, mediana, mínimos y máximos, según el tipo de distribución de las variables normales o anormales.

Técnica de eclosión asistida bioquímica

Se realizó en el día tres del desarrollo embrionario mediante la siguiente técnica: en una caja de Petri de 60 mm se colocó una gota de 20 µL de ácido de tyrode, lo suficientemente alejada de ellas se colocaron dos gotas de HTF Hepes (in vitro care) en el que se dispusieron los embriones; posteriormente, la caja se cubrió con 10 mL de parafina líquida (Vitrolife). El proceso se realiza en un microscopio invertido Olympus modelo IX71 a 40 aumentos, que tiene acoplado un sistema de micromanipulación (Narishige, Japón).

El microscopio está equipado con una placa térmica (Tokai-Hit, Japón) para evitar cambios en la temperatura durante el procedimiento. Cuando el embrión ya está en la caja, bajo el microscopio, con la ayuda de un micromanipulador se introduce la pipeta de AHA en la microgota de ácido tyrode y se aspira. El embrión se sujeta con una pipeta de Holding (Humagen), y para la realización del orificio en la zona pelúcida se expulsa el Volumen 4, núm. 3, enero-marzo, 2012

Figura 1. Fijación del embrión para aplicación del ácido tyrode.

Figura 2. Extrusión del embrión de la zona pelúcida.

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Moreno García JD y col.

RESULTADOS En el Cuadro 1 se resumen las características basales de las pacientes y la edad de sus parejas. Se incluyeron 34 pacientes, todas con al menos un factor de riesgo para pobre respuesta: edad mayor de 34 años, FSH mayor de 10 (UI/L), estradiol menor de 25 o mayor de 75 ng/dL. La eclosión asistida se realizó en el día 3 del desarrollo embrionario y se contó, al menos, con un embrión no arrestado para realizar el procedimiento. En el Cuadro 2 se observa la respuesta a la estimulación ovárica.

La tasa de embarazo en este grupo de pacientes fue de 32.4% (11 de 34 pacientes).

DISCUSIÓN En los programas de reproducción asistida se propone a la eclosión asistida como algo benéfico, sobre todo en caso de embriones con zona pelúcida gruesa o densa. Una zona pelúcida con esas características puede asociarse con edad materna avanzada3 o pobre calidad embrionaria.9 Huai L. Feng10 reportó una tasa de embarazo de 46% (23 de 50 pacientes) en pacientes de 35 ± 2.1 años de edad. Nosotros obtuvimos menor tasa de embarazo

(32.4%) pero la media de edad de las pacientes fue mayor (38.56 ± 4.7). Yao-Yuan y su grupo11 también realizaron eclosión asistida con ácido tyrode en pacientes de 39.9 ± 1.2 años de edad y reportaron una tasa de embarazo de 16.1% (9 de 56 pacientes).

Magli y su grupo efectuaron un estudio en mujeres mayores de 38 años de edad o con tres o más ciclos fallidos, o ambas situaciones, e hizo eclosión con ácido tyrode; la tasa de embarazo conseguida fue de 33%.12 Una de las complicaciones publicadas es el riesgo de tener gemelos monocigotos.13 En nuestra serie de casos no hubo ningún embarazo gemelar.

Otro riesgo relacionado con la eclosión asistida es el incremento en la incidencia de embarazo ectópico.14 Quizá debido a que se trató de una seria pequeña de casos no se registró ningúnx embarazo ectópico.

En nuestro servicio, la tasa de embarazo mediante fertilización in vitro en mujeres mayores de 34 años es de 15% sin eclosión asistida. Este estudio fue útil para determinar el tamaño de muestra si se desea realizar un ensayo clínico controlado y aleatorio. Al utilizar la fórmula de comparación de dos proporciones se obtuvo un tamaño muestral de 65 pacientes en el grupo de intervención (eclosión asistida) y 65 pacientes en el grupo control (sin eclosión asistida) para obtener significación de 0.05 y un poder de .8.

Cuadro 1. Características al inicio de la estimulación ovárica Variable

Número de pacientes

Media

Mínimo

Máximo

Desviación estándar

34 34 34 34 34 34 34

37.7 38.6 6.7 9.2 3.4 46.8 12.55

35 35 1 2 1 20 1

43 49 21 23 11 122 24

2.3 4.7 5.1 5 2.1 25.4 5.5

Número de pacientes

Media

Mínimo

Máximo

Desviación estándar

34 34 34

4.4 3 1.9

1 1 1

15 10 4

3.3 2.1 .9

Edad del hombre (años) Edad de la mujer (años) Folículos antrales basales FSH basal (UI/L) LH basal (UI/L) E2 basal (ng/dl) Prolactina basal (ng/dl)

Cuadro 2. Respuesta a la estimulación ovárica Variable Ovocitos capturados Ovocitos fertilizados Embriones transferidos

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Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción

Eclosión asistida en pacientes mayores de 34 años

CONCLUSIONES En esta serie de casos la tasa de embarazo fue de 32.4%.

Hace falta realizar un ensayo clínico para evaluar la eficacia y llegar a conclusiones sólidas.

REFERENCIAS 1. Cohen J. Assisted hatching of human embryos. J In Vitro Fert Embryo Transf 1991;8:179-190.

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4. Liu HC, Cohen J, Alikani M, Noyes N, Rosenvaks Z. Assisted hatching facilities earlier implantation. Fertil Steril 1993;60:871-875 5. Osagi E, Hooper L, Seif M. The impact of assisted hatching on live birth rates and outcomes of assisted conception: a systematic review. Human Reprod 2003;18:1828-1835.

6. Magli MC, Gianaroli L, Ferraretti AP, Fortini D, et al. Rescae of implantation potential in embryos with poor prognosis by assisted zona hatching. Hum Reprod 1998;13:1331-1335.

Volumen 4, núm. 3, enero-marzo, 2012

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12. Magli MC, Gianaroli L, Ferraretti AP, et al. Rescae of implantation potential in embryos with poor prognosis by assisted zona hatching. Human Reprod 1998;13:1331-1335.

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Rev Mex Reprod 2012;4(3):120-125

Artículo original Experiencia en la realización de coasting (inhibición de gonadotropinas) para inseminación intrauterina Álvaro Santibáñez Morales, Paula Jimena Sakar Almirante, Eva Vega Hernández, Juan Carlos Regalado Hernández, Ana Paola Sánchez Serrano RESUMEN Antecedentes: el embarazo múltiple, la cancelación de los ciclos y el síndrome de hiperestimulación ovárica son los tres mayores riesgos de la administración exógena de gonadotropinas durante la estimulación ovárica controlada para inseminación intrauterina.

Objetivo: con base en el coasting que se realiza para fertilización in vitro se buscó establecer la tasa de embarazo clínico en ciclos de inseminación intrauterina, conocer la totalidad de ciclos en ese periodo y saber cuántas pacientes finalizaron la estimulación y cuántas se cancelaron, cuántos folículos y qué dimensiones tenían en el momento del coasting y en el de la aplicación de hCG. Material y método: estudio retrospectivo efectuado con base en la información de los expedientes clínicos de las pacientes que recibieron coasting en el Instituto Nacional de Perinatología entre enero de 2008 y mayo de 2011.

Resultados: se analizaron los expedientes de 15 pacientes a quienes se realizó coasting para inseminación intrauterina. Se inicio coasting en cualquier dia del ciclo si habia 6 o más folículos mayores de 14 mm. Ninguna logro embarazo, a nueve pacientes se les canceló el ciclo y seis cumplieron los criterios para la aplicación de hCG. La duración del coasting fue de un día en siete pacientes, dos días en tres pacientes, tres días en dos pacientes; cuatro, cinco y siete días en una paciente respectivamente. En una paciente las dimensiones de los folículos pre y poscoasting quedaron igual. En dos pacientes disminuyeron los folículos inmaduros y continuaron su crecimiento los maduros. En tres pacientes los folículos inmaduros y los maduros disminuyeron. De las 15 pacientes analizadas, a nueve se les canceló el ciclo y las seis restantes completaron la estimulación.

Conclusiones: el coasting es un método seguro y efectivo para ciclos de fertilización in vitro cuando estos se encuentran sobreestimulados y una alternativa razonable para evitar la cancelación del ciclo. Los folículos maduros toleran breves periodos de supresión de gonadotropinas, sin afectar la fertilización o la implantación. No es una herramienta útil para ciclos de inseminación intrauterina.

Se requieren más estudios prospectivos para implementar esta técnica.

Palabras clave: coasting, inhibición de gonadotropinas, hCG, inseminación intrauterina.

ABSTRACT Background: Ovarian stimulation during IVF is a common practice, it conveys risks such as ovarian hyperstimulation syndrome, multiple pregnancies, among others. Coasting is used to lower risk of hyperstimulation syndrome in patients at risk.

Objective: We reviewed 15 files of patients who were at risk of hyperestimulation syndrome during intrauterine insemination in which coasting was performed, and determine pregnancy rates, duration of ovarian stimulation, days of coasting, outcome of follicles.

Material and Methods: retrospective study from January 2008 to may 2011 where 15 files were identified at the Instituto Nacional de Perinatologia Isidro Espinosa de los Reyes.

Results: 15 patients were identified, Coasting was performed on any day of stimulating if 6 or more follicles measured 14 mm. None got pregnant, 9 of the cycles were cancelled for low response, 6 applied hCG, coasting was used for 1 day in 7 cycles, 2 days in 3 cycles, 3 days in 2 cycles, and 7 days in 1 cycle. Follicle size diminished in all but one cycle.

Conclusion: Coasting is a good tool for IVF for preventing ovarian hyperestimulation syndrome, in intrauterine insemination cycles we could observe follicles diminished size, but we could not prove its efficacy, observing no pregnancies. We need more patients and a prospective randomized protocol for results to be valid.

Key words: coasting, inhibition of gonadotrophins, hCG, intrauterine insemination.

*

Tesis de posgrado para obtener el título de especialista en Biología de la Reproducción Humana. Instituto Nacional de Perinatología Isidro Espinosa de los Reyes. Universidad Nacional Autónoma de México. División de Estudios de Posgrado e Investigación. Facultad de Medicina.

Correspondencia: Dr. Álvaro Santibáñez Morales. Correo electrónico: alvaro2304@hotmail.com

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Recibido:noviembre 2011. Aceptado:enero 2012.

Este artículo debe citarse como: Santibañez MA, Sakar PJ, Vega HE, Regalado, Sanchez AP. Experiencia en la realización de coasting (inhibición de gonadotropinas) para inseminación intrauterina. Rev Mex Reprod 2012;4(3):120-125. www.nietoeditores.com.mx

Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción

Inhibición de gonadotropinas para inseminación intrauterina

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os mayores riesgos de la administración exógena de gonadotropinas son el embarazo múltiple y el síndrome de hiperestimulación ovárica.1 El mecanismo preciso de este síndrome sigue sin conocerse; sin embargo, se cree que está relacionado con la cantidad de folículos reclutados, las concentraciones de estradiol y la administración de gonadotropina coriónica humana para desencadenar la ovulación.2 El síndrome de hiperestimulación ovárica leve se manifiesta en 33% de los ciclos para fertilización in vitro y el moderado y severo de 3.1 a 8%, respectivamente.3 El síndrome de hiperestimulación severa se ha calculado, incluso, en 80% de los ciclos cuando las concentraciones de estradiol exceden los 6,000 pg/mL o existen más de 30 folículos.2 Las estrategias para prevenir el síndrome de hiperestimulación incluyen: reducción de folículos reclutados, aspiración de algunos folículos preovulatorios para disminuir el número restante por ovular, la administración de agonistas de la hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH) en vez de la administración de gonadotropina coriónica humana, la cancelación del ciclo y, de unos años a la fecha, agonistas de la dopamina y, de ellos, la cabergolina, que disminuye la permeabilidad vascular al desfosforilar el receptor del factor de crecimiento endotelial.3 También se ha descrito la conversión de un ciclo para inseminación a uno para fertilización in vitro, cuando se observa con una respuesta exagerada durante la estimulación.1-4 La finalidad de controlar el número de folículos estimulados es conseguir la disminución de la cantidad de células de la granulosa cuando se realiza la captura folicular, con la consiguiente disminución de las concentraciones de estradiol, aunque esto no descarta la probabilidad de síndrome de hiperestimulación ovárica.5 Existen otras estrategias para prevenir el síndrome de hiperestimulación ovárica, como: la administración profiláctica de albúmina después de la captura folicular, evitar la transferencia de embriones al criopreservarlos, y la aspiración folicular.3,5 A pesar de los intentos por disminuir el síndrome de hiperestilmulación ovárica, el método más utilizado es la cancelación del ciclo, aunque tomar esta decisión Volumen 4, núm. 3, enero-marzo, 2012

implica repercusiones económicas en la pareja y un resultado emocional negativo.1,4,6 Posponer la transferencia de embriones y reemplazar la gonadotropina coriónica humana por un agonista de la GnRH también son otras opciones para reducir la probabilidad de síndrome de hiperestimulación ovárica, aunque tienen el inconveniente de disminuir la probabilidad de embarazo.2 Otra técnica para reducir el riesgo de síndrome de hiperestimulación ovárica es el “coasting” que consiste en suspender la administración de gonadotropinas, con lo que las concentraciones de estradiol disminuyen, pero el crecimiento y la maduración ovocitaria continúan.

Esta técnica fue descrita en ciclos sobrestimulados de fertilización in vitro a finales del decenio de 1980 y a principios del de 1990 (Rabinovivi et al., 1987, Urman et al 1992) y, posteriormente, fue aplicado en ciclos de FIV.3,8 Diversos reportes de series de casos han descrito que en los ciclos de FIV generalmente se encuentran con la administración de agonistas de GnRH, por lo que al suspender la administración de gonadotropinas, disminuyen precipitadamente las de estradiol. Esto es resultado de una secreción de gonadotropinas nula o poca, secundaria a la inhibición causada por los análogos de la GnRH, como para sostener el crecimiento folicular.1,2,5,9,10 El coasting se basa en que los folículos tienen diferente sensibilidad a las gonadotropinas. El de mayor tamaño tiene menor dependencia a la hormona folículo estimulante (FSH). El principio básico del coasting es la suspensión de las gonadotropinas, mientras continúa la administración de análogos de la GnRH, hasta que las concentraciones de estradiol disminuyen a niveles séricos seguros (por lo menos 25% del valor inicial), como para reiniciar la estimulación o, en su caso, la aplicación de gonadotropina coriónica humana.9,10 La disminución en la prevalencia del síndrome de hiperestimulación ovárica hace suponer que las células de la granulosa en folículos inmaduros son más susceptibles a la suspensión de las gonadotropinas, que la de los folículos maduros que continúan el desarrollo y crecimiento ovocitario, a pesar de que se suspende el estímulo exógeno.11,12 En modelos bovinos se ha observado que uno de los primeros signos de atresia folicular es la degeneración de

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Santibáñez Morales A y col.

las células de la granulosa; sin embargo, a pesar de esto, la calidad ovocitaria y la maduración no se ven afectados, con la consiguiente posibilidad de fertilización.12 La duración del coasting o suspensión de gonadotropinas, en ciclos de FIV suele ser de 3.7±1 día. Algunos reportes han demostrado, incluso, cuatro días; sin embargo, al tener un coasting prolongado la calidad ovocitaria y la receptividad endometrial se ven afectados, lo que hace que disminuya la probabilidad de implantación y de embarazo. El coasting corto (1-2 días) provoca una rápida disminución del estradiol sérico al retirar las gonadotropinas.1,3,7 El coasting puede realizarse en ciclos para inseminación intrauterina y para ciclos de alta complejidad, como el FIV y la inyección intracitoplasmática (ICSI).

En el primero se realiza cuando las concentraciones de estradiol exceden los 1800 pg/mL y los criterios para la administración de gonadotropina coriónica humana no se cumplen (3 o más folículos mayores de 18 mm). El seguimiento ultrasonográfico debe realizarse cada 24 a 48 horas, hasta encontrar, por lo menos, tres folículos de 18 mm en el diámetro mayor o cuando las concentraciones de estradiol han disminuido 25%, que corresponde a menos de 1,600 pg/mL. Posteriormente deben aplicarse 10,000 UI de gonadotropina coriónica humana subcutánea o 250 mcg de r-hCG y realizar la inseminación intrauterina a las 24 horas o tener relaciones sexuales todos los días durante 2 a 3 días.1,3,7 El coasting puede realizarse en dos periodos. El primero, conocido como coasting temprano, se efectúa cuando los folículos tienen un tamaño intermedio (12-15 mm). Cuando las concentraciones de estradiol disminuyen, se reinicia la estimulación hasta obtener folículos maduros y, posteriormente, se administra la gonadotropina coriónica humana.7,8 Este tipo de coasting no es frecuente porque el criterio para su inicio aún no está debidamente establecido y los posibles efectos de la esteroidogénesis en los folículos no se conocen con exactitud.11 La mayor tendencia es la realización del coasting cuando los folículos están maduros (16 mm) y las concentraciones séricas de estradiol se encuentran elevadas.

A esto se le llama “coasting tardío”, que se realiza cuando las concentraciones de estradiol exceden los 3000 pg/mL y, posteriormente, cuando las concentra-

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ciones de estradiol han disminuido por lo menos 25% se administran 10,000 UI hCG y la captura folicular se realiza a las 34 horas del disparo con gonadotropina coriónica humana.1,3,7 Otro criterio de coasting en ciclos de FIV, es cuando existen entre 15 y 20 folículos, con un diámetro mayor de 16 mm, detectados por ultrasonido transvaginal y las concentraciones de estradiol son mayores de 4500 pg/ mL, se espera a que estas disminuyan un 25% y posteriormente se efectúa la administración de gonadotropina coriónica humana.5,9 Los factores más importantes para el éxito del coasting se relacionan con el inicio, la duración y terminación de éste, así como del momento de la administración de la gonadotropina coriónica humana.13 Diversos estudios han utilizado diferentes criterios de inicio y terminación del coasting, y han demostrado variación en los resultados para la prevención del síndrome de hiperestimulación ovárica y de la tasa de embarazo.

En un consenso de coasting prolongado (cuatro días) se demostró que este periodo de tiempo de suspensión de la estimulación, afecta la implantación, la tasa de embarazo y la calidad ovocitaria, por lo que no es recomendable.6,7 La duración del coasting se relaciona positivamente con las concentraciones de estradiol y con el diámetro de los folículos. Mientras más elevadas sean las concentraciones de estradiol y de mayor tamaño sean los folículos, la duración del coasting deberá ser más prolongada para disminuir a concentraciones séricas recomendables el estradiol.14 Conforme progresa el coasting, las concentraciones séricas de gonadotropinas van disminuyendo progresivamente, pero el crecimiento de los folículos antrales continúa, independientemente de la interrupción de la administración de gonadotropinas, a diferencia de los folículos de menor tamaño que comienzan a tener atresia.8,11,13,14 En un estudio realizado por Sher y colaboradores se demostró que el crecimiento folicular continuaba durante tres días de coasting pero no un tiempo mayor.3 Cuando el coasting reduce la cantidad de células de la granulosa, disminuyen las concentraciones de estradiol circulantes, lo mismo que diferentes mediadores químicos, como la angiotensina II (derivada del ovario) y el factor de crecimiento endotelial.15 Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción

Inhibición de gonadotropinas para inseminación intrauterina

Al no haber estimulación de la FSH sobre las células de la granulosa, éstas no continúan su proliferación y reducen la cantidad de células capaces para la luteinización. 10,15 La apoptosis de éstas también se incrementa y da como resultado la disminución de los mediadores y precursores de la extravasación celular.15,16 Diferentes estudios han demostrado que la disminución o la omisión de la administración diaria de gonadoptropinas puede reducir la estimulación ovárica, y por consiguiente disminuir las concentraciones de estradiol, y la posibilidad de síndrome de hiperestimulación ovárica.1,3,9,10,12 Conforme mayor sea el tamaño del folículo menor será la dependencia de la FSH. Los folículos preovulatorios maduros toleran algunos días sin la administración de gonadotropinas y permiten que los folículos inmaduros entren en atresia, mientras que los folículos maduros continúan su crecimiento, para posteriormente realizar la captura de éstos por vía transvaginal.11 En diversos estudios se ha observado que el coasting en ciclos de estimulación ovárica controlada para inseminación intrauterina no es una técnica efectiva para la reducción de folículos preovulatorios, como lo son la cancelación del ciclo, la conversión a FIV y la aspiración de folículos preovulatorios.2,3 Hipótesis

El coasting es una técnica adecuada para rescatar ciclos de Inseminación Intrauterina que tienen criterios de cancelación por respuesta aumentada Justificación

Se desconoce si en el Instituto Nacional de Perinatología el coasting para inseminación intrauterina tiene ventajas sobre la cancelación del ciclo.

Objetivos

Establecer la tasa de embarazo clínico en ciclos de inseminación intrauterina a los que se les realizó coasting en el INPER. Conocer la totalidad de ciclos a los que se les efectuó coasting en ese periodo.

Determinar cuántas pacientes finalizaron la estimulación y cuántas se cancelaron.

Volumen 4, núm. 3, enero-marzo, 2012

Conocer cuántos folículos y qué dimensiones tenían en el momento del coasting, así como, en el momento de la aplicación de la gonadotropina coriónica humana.

MATERIAL Y MÉTODO Estudio retrospectivo efectuado con base en la información de los expedientes clínicos de las pacientes en ciclo de inseminación intrauterina que recibieron coasting en el Instituto Nacional de Perinatología entre enero de 2008 y mayo de 2011.

RESULTADOS Se analizaron los expedientes de 15 pacientes a quienes se realizó coasting para inseminación intrauterina. A nueve pacientes se les canceló el ciclo y seis cumplieron los criterios para la aplicación de gonadotropina coriónica humana. La duración del coasting fue de un día en siete pacientes, dos días en tres pacientes, tres días en dos pacientes; cuatro, cinco y siete días en una paciente respectivamente. En una paciente las dimensiones de los folículos pre y poscoasting quedaron igual. En dos pacientes disminuyeron los folículos inmaduros y continuaron su crecimiento los maduros. En tres pacientes los folículos inmaduros y los maduros disminuyeron. De las 15 pacientes analizadas, a nueve se les canceló el ciclo y de las seis restantes que completaron la estimulación, ninguna se embarazó.

DISCUSIÓN La estimulación ovárica excesiva en los ciclos de FIV implica un riesgo elevado de síndrome de hiperestimulación ovárica.1,4,8,9,15 Diversos estudios han demostrado que la reducción u omisión de gonadotropinas disminuye la estimulación ovárica y las concentraciones de estradiol, y con ello la posibilidad de síndrome de hiperestimulación ovárica.16 La finalidad del coasting es evitar el síndrome de hiperestimulación ovárica durante los ciclos de FIV, al suspender la administración de gonadotropinas y, por consiguiente, disminuir las concentraciones de estradiol.7,17

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Santibáñez Morales A y col.

En el primer artículo publicado de coasting en FIV por Rabinovici y sus colaboradores no se consiguió ningún embarazo en las nueve pacientes en quienes sí disminuyeron las concentraciones de estradiol; sin embargo; sí se obtuvieron tres embarazos en tres pacientes en quienes el tamaño folicular y las concentraciones de estradiol continuaron aumentando, a pesar de la suspensión de gonadotropinas. En un reporte de Urman y su grupo se describieron los límites aceptables de embarazo (22 y 25% por ciclo, respectivamente) tomando en cuenta el decremento en las concentraciones de estrógenos durante los ciclos de estimulación ovárica.18 A pesar de la evidente disminución de las concentraciones de estradiol, los rangos de embarazo con el coasting son comparables con los reportados en la bibliografía para el tratamiento de la sobreestimulación ovárica. En cambio, los embarazos múltiples y el síndrome de hiperestimulación ovárica son menores que lo esperado en este grupo de población en riesgo.18 Existe poca información acerca de su efectividad en ciclos de inseminación.15,16 En nuestro estudio se observó que en 15 pacientes a quienes se les realizó coasting, nueve se cancelaron y a seis se les aplicó gonadotropina coriónica humana.

La duración del coasting fue de un día, principalmente. Las dimensiones precoasting de los folículos no tuvieron relación con las de los folículos postcoasting, se esperó que disminuyeran las dimensiones de los folículos inmaduros y que continuaran su crecimiento los folículos maduros. En nueve pacientes se canceló el ciclo porque después del coasting no disminuyó el número, ni las dimensiones de los folículos, hubo más de seis folículos de 16-18 mm. En seis pacientes que continuaron la estimulación ovárica posterior al coasting, la medida de los folículos pre y postcoasting no fue concluyente. En una paciente no hubo cambios en las medidas, en dos pacientes disminuyeron los folículos inmaduros y continuaron su crecimiento los maduros y en tres pacientes los folículos inmaduros e maduros también disminuyeron.

La cuantificación de estradiol no se realizó porque en el Instituto Nacional de Perinatología no se solicita en ciclos de estimulación ovárica para inseminación, a diferencia de lo que se hace en ciclos para FIV.

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CONCLUSIONES El coasting es un método seguro y efectivo para ciclos de FIV cuando estos se encuentran sobreestimulados y una alternativa razonable para evitar la cancelación del ciclo.2,4,8,20 Los folículos maduros toleran breves periodos de supresión de gonadotropinas, sin afectar la fertilización o la implantación. Al parecer, las células de la granulosa en los folículos más pequeños toleran menos el coasting.5,9,18 Esta disminución en el tamaño y en las concentraciones de estradiol reduce la aparición del síndrome de hiperestimulación, pero no la elimina por completo.19 El coasting no debe sustituir la monitorización continua en pacientes que están recibiendo estimulación ovárica controlada en ciclos de baja o alta complejidad.12 Este estudio demostró que en inseminación intrauterina el coasting no es de utilidad. Es necesario efectuar más estudios con una muestra mayor donde la medición ultrasonográfica la realice la misma persona en toda la estimulación; esto porque las medidas ultrasonográficas no coinciden con lo esperado y ello podría ser resultado de la diferencia que existe interobservador. Es necesario que la cuantificación de estradiol se efectúe en diferentes momentos de la estimulación, sobre todo en el momento del coasting, como en el momento de la aplicación de la gonadotropina coriónica humana. Además, valorar el efecto del coasting en el grosor endometrial y número de vasos periendometriales.

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Rev Mex Reprod 2012;4(3):126-131

Artículo original Resultados de un programa de FIV con transferencia de embriones en un día 3 vs día 51 Jorge Castillo Baso,* Pablo Díaz Spíndola,** Roberto Santos Haliscak,*** Pedro Galache Vega,*** Samuel Hernández Ayup,*** Genaro García Villafaña**** RESUMEN Antecedentes: existen controversias en cuanto a los beneficios de la transferencia en día 5 cuando se dispone de embriones de buena calidad en día 3.

Objetivo: comparar los resultados reproductivos de los embriones transferidos en día 3 vs en día 5 en pacientes menores de 35 años de edad.

Pacientes y método: estudio prospectivo, sin asignación al azar, efectuado en 242 ciclos consecutivos de embriones transferidos en fresco a pacientes menores de 35 años. A 132 pacientes se les realizaron transferencias en día 3 y a 110 en día 5. En el caso de las transferencias en día 3, todas las pacientes cumplieron los criterios de por lo menos ocho células en la mañana del día 3, y menos de 10% de fragmentación (clase I embrionaria).

Resultados: las características demográficas entre los grupos (día 3 vs día 5) no fueron estadísticamente significativas al evaluar: edad (30.4 vs 29.1), tiempo de infertilidad (4.94 vs 4.61 años); FSH en día 3: (6.78 vs 7.12UI/L), dosis total de FSHr (2422.5 vs 2220.0 UI). No se encontraron diferencias significativas en los resultados del tratamiento de reproducción en las pacientes a quienes se realizó la transferencia embrionaria en día 3 vs día 5 en cuanto a porcentaje de embarazo (47 vs 46%) y nacido vivo (32 vs 29%) Conclusión: transferir en día 5 no muestra diferencias estadísticas en la tasa de embarazo y recién nacidos vivos que en las que se transfieren en día 3 en pacientes menores de 35 años de edad.

Palabras clave: transferencia embrionaria, estadio de clivaje; blastocisto, pronóstico reproductivo.

ABSTRACT Background: Whether blastocyst-stage transfer offers any real benefit to infertile couples remains controversial .

Objective: To compare de pregnancy rates of day 3 cleavage versus day 5 blastocyst fresh non donor embryo transfers in patients under 35 years old.

Material and methods: A prospective non-ramdomized study. A total of 242 consecutive treatment cycles with fresh non donor embryos in patients younger than 35 years old were reviewed. In 132 patients the transfer occurred on day 3 and in 110 patients on day 5. Day 3 transfers fulfilled embryo quality criteria at least 8 cells on the morning of day 3, less than 10% of anucleate fragments).

Results: Demographics and stimulation features between the two groups (day 3 vs day 5) were not significantly different when evaluated: Age (30.4 vs 29.1) ; time of infertility (4.94 vs 4.61 years) or type of infertility; total doses of FSHr (2422.5 vs 2220.0 IU).

There were no significance difference between clinical pregnancy rate (47% vs 46%) and live birth rate (32% vs 29%) between day 3 group and in blastocyst day 5 embryo transfers .

Conclusion: In the group of patients under 35 years old, blastocyst stage do not offer better chance of achieving a live delivery than with cleavage-stage.

Key words: embrionary transference, estadio de clivaje; blastocite, reproductive prognostic.

1

14th World Congress on Controversies in Obstetrics, Gynecology & Infertility (COGI) Paris, Francia 17-20 de Noviembre del 2011. * Médico ginecoobstetra especialista en Biología de la Re producción, Instituto para el Estudio de la Concepción

Humana, Monterrey, NL. ** Coordinador de docencia del Instituto para el Estudio de

la Concepción Humana, Universidad de Baja California. *** Médico especialista en Biología de la Reproducción y co director del Instituto para el Estudio de la Concepción Humana. **** Biólogo especialista en Embriología humana, Director del

laboratorio de Embriología humana del Instituto para el

Estudio de la Concepción Humana, Monterrey, NL.

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Correspondencia: Dr. Jorge Castillo Baso. Correo electrónico: castillobaso@hotmail.com Recibido: enero 2012. Aceptado: febrero 2012.

Este artículo debe citarse como: Castillo-Baso J, Díaz-Spíndola P, Santos-Haliscak R, Galache-Vega P, Hernández-Ayup S, García-Villafaña G. Resultados de un programa de FIV con transferencia de embriones en un día 3 vs día 5. Med Reprod Mex 2012;4(3):126-131. www.nietoeditores.com.mx

Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción

Resultados de un programa de FIV con transferencia de embriones en un día 3 vs día 5

El momento de la transferencia embrionaria es decisivo en el pronóstico de cualquier tratamiento de reproducción. Al respecto se han generado una serie de criterios técnicos. Uno de estos ha sido por mucho tiempo la definición del mejor día para la transferencia.

Quienes argumentan que la transferencia debe realizarse en un día 5 argumentan que ésta permite seleccionar embriones en un estadio de desarrollo tardío en donde se favorece la activación del genoma embrionario.1 Así, pueden transferirse los embriones de una cohorte con un criterio más objetivo de selección natural. Esta posición es reforzada por las amplias limitaciones encontradas al utilizar criterios morfológicos para seleccionar embriones en estadios de división celular y el porcentaje elevado de embriones en estadio de división celular en día 3 , en los que a pesar de tener apariencia morfológica normal hay alteraciones cromosómicas.2 En contraposición está el argumento que sustenta que debe realizarse la transferencia en día 3, parte de la premisa de que existen carencias en los requerimientos y necesidades nutricionales y bioquímicas de los embriones. Estas necesidades se incrementan en los estadios iniciales de desarrollo embrionario y han conducido a la creación de medios secuenciales de cultivo. A pesar de esto siguen existiendo pacientes en las que sus embriones no llegan a estadio de blastocito y que tienen información cromosómica normal. Estos embriones son desprovistos de la oportunidad de llegar a una transferencia o a un embarazo; y quizá con las condiciones in vitro no se cumplieron sus requerimientos energético-bioquímicos.3 Se sugiere que en las condiciones in vitro no se genera el ambiente ideal para todos los embriones y que, ciertamente, no son mejores que las condiciones intrauterinas.4 Estos argumentos han motivado en los centros disyuntivas en cuanto al camino correcto que debe tomarse en los casos en los que se tienen más de cuatro embriones en estadio de división embrionaria Grado I en día 3.5 Otro de los aspectos a considerar es que al someter a los embriones a más días de desarrollo embrionario se incrementa significativamente el costo de manejo de laboratorio de FIV, por la cantidad de medios y recursos destinados para el consumo.6 Volumen 4, núm. 3, enero-marzo, 2012

El objetivo de este estudio es determinar, en los casos en que se obtienen más de cuatro embriones en estadio de 8 células Grado I al tercer día de desarrollo si existen diferencias en los resultados reproductivos al llevar los mismos al estadio de blastocisto día 5 vs realizar la transferencia en estadio de división celular en día 3.

MATERIAL Y MÉTODO Estudio prospectivo, sin asignación al azar, efectuado en 242 ciclos consecutivos de embriones transferidos en fresco a pacientes menores de 35 años. El estudio se efectuó entre enero de 2008 y septiembre del 2010.

Se evaluaron las pacientes admitidas para tratamiento de reproducción de alta complejidad FIV-ICSI en el Instituto para el Estudio la Concepción Humana (IECH- Monterrey) y que cumplieran con los siguientes criterios de inclusión: edad menor de 35 años, menos de tres intentos de reproducción asistida, FSH en día 3 <10 UI/mL, espermas obtenidos de eyaculados, FIVICSI y más de cuatro embriones grado 1 en día 3 (<10% de fragmentación con un mínimo de 8 blastómeras en día en la mañana del día 3 de desarrollo embrionario).

Se excluyeron las pacientes de ciclos de donación, eyaculado no espermático y tratamientos con gametos o embriones vitrificados.

Las pacientes se incluyeron al estudio sólo una vez y luego de establecer los criterios en día 3 se realizó una asignación prospectiva no aleatorizada de los dos grupos. En el primero se transfirieron en el día 3 y en el segundo se dejaron evolucionar para transferir en día 5. Posteriormente se analizaron las principales variables de estudio: número de ovocitos en metafase II (MII); número de embriones fertilizados; número células en división celular; porcentaje de embarazo, número de sacos gestacionales, porcentaje de implantación y nacidos vivos.

La asignación en cada uno de los grupos se realizó según criterio personal del médico tratante. (Figura 1) Estimulación ovárica controlada

Las pacientes que recibieron tratamientos de reproducción fueron objeto de diferentes protocolos de estimulación según las características clínicas del caso.

127

Castillo Baso J y col.

Pacientes admitidas al programa de FIV-ICISI (2008-2010) n = 598

Pacientes con > 4 embriones en Grado I en día 3: n = 350

Se excluyeron por: • Edad >35 n = 36 • Eyaculado no espermático n = 17 • >3 intentos de FIV-ICSI n = 55

Pacientes admitidas al estudio: n = 242 ciclos.

Transferencia en blastocisto día 5. n = 110

Transferencia Grado I en día 3. n = 132

Figura 1. Asignación de los grupos.

Los esquemas utilizados fueron: Agonista de la GnRH en fase lútea tardía: se administró acetato de leuprolide (Lucrin®kit, Abbott de México) a la dosis de 10 UI al día por vía subcutánea a partir del día 21 del ciclo previo hasta el inicio de la menstruación, posteriormente a partir del primer día de menstruación se administraron diariamente sólo 5 UI por vía subcutánea hasta la fecha en que se administró la gonadotropina coriónica humana (hCG) (Choriomon®, Corne de México).

Se aplicaron las dosis de FSH-rec (Gonal-F®, Serono de México) a partir del segundo día del ciclo. Posteriormente se determinó el estradiol sérico y se hizo un ultrasonido en el día 7 del ciclo y, a partir de esa fecha, se individualizó la dosis administrada de gonadotropina recombinante y se agregaron, o no, menotropinas urinarias (Merional®, Corne de México) a la dosis de 75-150 UI por vía intramuscular al día, hasta alcanzar el criterio de aplicación de la hCG a dosis de 10,000 UI dosis única por vía intramuscular que se consideró al alcanzar dos o más folículos de 18 mm diámetro. La aspiración folicular transvaginal se efectuó con una guía ultrasonográfica y se realizó a las 34-36 h posteriores a la aplicación de la hCG.

riormente, de acuerdo con la evaluación ecográfica y el desarrollo folicular (más de dos folículos mayores de 14 mm) se aplicaron 0.25 mg de Cetrotide®, Serono de México. Se utilizaron los criterios de desarrollo folicular antes expuestos y se programó la aspiración folicular consecuente.

Cultivo embrionario y selección para la transferencia

Los embriones se cultivaron en medios Vitrolife Sweden AB, Kungsbacka, Sweden, (GII or GIII series). En la mañana del día 3 se transfirieron de medio de clivaje y, posteriormente, a medio de blastocisto. La fertilización se confirmó a las 19 horas posteriores a la inyección o inseminación y se confirmó con la existencia de dos pronúcleos (2 pn) y dos cuerpos polares distintos o fragmentados.

La calidad embrionaria se evaluó según el número de blastómeras, porcentaje de fragmentación, multinucleación de las blastómeras y compactación.

Se consideraron embriones Grado I cuando tenían, por lo menos, ocho células en día 3 con menos de 10% de fragmentos, tamaño regular y ausencia de multinucleación.

Soporte de fase lútea

Protocolo antagonista

Se aplicaron dosis de FSH recombinante (Gonal-F , Serono de México) a partir del día 2 del ciclo y, poste®

128

Todas las pacientes recibieron suplementación de fase lútea de acuerdo con el protocolo a base de óvulos de progesterona de 400 mg diarios por 14 días.

Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción

Resultados de un programa de FIV con transferencia de embriones en un día 3 vs día 5

Análisis estadístico

Las diferencias entre los grupos de estudio se establecieron mediante análisis de varianza (ANOVA) y la significación estadística con la p <0.05, y para la ejecución del mismo se utilizaron los programa Windows SPSS, software versión 14.0 (SPSS, Inc, Chicago, IL) y Windows Excel.

RESULTADOS Se analizaron 242 ciclos homólogos frescos de pacientes en protocolos de reproducción asistida de alta complejidad, a quienes se realizó estimulación ovárica controlada con protocolos de agonista y antagonista. En 132 pacientes la transferencia se realizó en día 3 y en 110 en estadio de blastocisto el día 5.

Al evaluar las características demográficas de la población no se encontraron diferencias significativas en el grupo de día 3 versus día 5 en relación con la edad de las pacientes (30.4 vs 29.1 años), tipo de infertilidad primaria o secundaria, tiempo de infertilidad 4.94 vs 4.61 años, perfil hormonal en día 3: FSH día 3 : 6.78 vs 7.12UI, protocolo de estimulación y dosis promedio de FSH recombinante y HMG. (Cuadro 1) No se encontraron diferencias en los grupos evaluados en cuanto a grosor endometrial (9.95 vs 10.01 mm) y día de la aspiración folicular (12.69 y 12.9 ) en la que se realizó el procedimiento; sin embargo, al comparar ambos grupos en cuanto a las características de la estimulación se encontró que el grupo de transferencia en el día 3 tuvo menor cantidad de folículos con más de 15 mm en día 10 ( 9.55 vs 12.11), número de ovocitos aspirados (13.83 vs 17.63) y, consecuentemente, ovocitos en MII (11.08 vs 14.73).

Al evaluar los resultados reproductivos de la transferencia en día 3 vs blastocisto día 5, no se encontraron diferencias significativas en cuanto a tasa de embarazo, tasa de implantación y de nacido vivo (Cuadro 2 y Figura 2) DISCUSIÓN Los resultados son discrepantes con los estudios reportados previamente en los que después de realizar ensayos clínicos prospectivos y evaluar si existen diferencias en

Volumen 4, núm. 3, enero-marzo, 2012

50 45 40 35 %

30 25 20 15 10 5 0

Embarazo

Implantación Día 3

Nacido vivo

Día 5

Figura 2. Resultados reproductivos de transferencia día 3 vs día 5.

el resultados reproductivo al transferir embriones grado I en día 3 vs día 5 se encontraron diferencias en las tasas de embarazo (27 vs 51%) y tasa de nacido vivo (25 vs 47%), respectivamente.7 Una de las explicaciones más probables a este hecho es la que está alrededor de los hallazgos reportados por Santiago Munne, quien al realizar la técnica de PGD (diagnóstico genético preimplantatorio) de evaluación embrionaria pudo determinar que 59% de los embriones en estadio embrionario de día 3 tienen alguna alteración cromosómica vs 35% en estadio de blastocisto.2,8 Sin embargo, no somos los únicos que hemos reportado esos hallazgos porque aunque con el estadio de blastocisto se han generado altas tasas de implantación y de embarazo, al compararlo con estadio de división embrionaria grado I en día 3, diversos autores han encontrado resultados discrepantes al estratificarlos por edad. Si se asume que existe mayor predisposición a aneuploidías en la medida que se incrementan los grupos etarios, consecuentemente se ha visto que la transferencia en estadio de blastocisto incrementa la tasa de embarazo en pacientes mayores de 37 años de edad,

129

Castillo Baso J y col.

Cuadro 1. Características demográficas y de estimulación

Edad (años) Tipo de infertilidad % primaria % secundaria Tiempo de infertilidad (años) FSH día 3 (IU/l) LH día 3 (IU/l) E2 día 3 ( pg/ml) Protocolo de estimulación % Agonista % Antagonista Total rFSH IU administrada Total hMG IU administrada

D3 grupo n = 132

D5 grupo n = 110

Significación estadística

30.4

29.1

89/132 67% 43/132 32% 4.94 6.78 4.84 50.23

69/110 63% 41/110 37% 4.61 7.12 5.72 58.65

0.271 0.538

67%(90) 33%(42) 2422.5 603.75

60% (66) 40%(44) 2220.0 555.0

0.508 0.486 0.172 0.435 0.135 0.185 0.643

Cuadro 2. Resultados de tratamientos de reproducción

Folículos>15 D10 Estradiol D10 (pg/ml) Grosor endometrial D10 (mm) Día de aspiración Ovocitos aspirados Ovocitos en MII aspirados Embriones fertilizados (medias) División celular a las 48 h División celular a las 72 h Número de embriones transferidos Embarazos Sacos gestacionales Embarazos múltiples Tasa de implantación Nacimiento %

D3 grupo n = 132

D5 grupo n = 110

Significación estadística

9.55 2553.41 9.95 12.69 13.83 11.08 6.78 6.50 5.79 2.44 63/132 47% 62/132 46% 16/132 12% 24.87 43/132 32%

12.11 3360.38 10.1 12.19 17.63 14.73 9.32 9.05 8.52 2.13 50.6/110 46% 44/110 40% 11/110 10% 26.68 18/62 29%

0.001 0.003 0.823 0.456 0.001 0.001 0.001 0.0001 0.0001 0.234 0.753 0.251 0.067 0.674 0.109

pero no en grupos etarios menores.9 Se han reportado tasas de embarazo de día 3 vs día 5 (45 vs 32%) y de implantación (31 vs 29%). De hecho, un metanálisis al respecto que incluye 11 estudios y 555 pacientes, no reporta resultados contundentes en relación con este tema.6 Otro aspecto importante es el porcentaje de implantación y tasa de embarazo múltiple. En este sentido, a pesar de no encontrar diferencias estadísticas, se ve una tendencia a mayor porcentaje en día 3 vs día 5 en

130

nuestra población. Por esto consideramos que es muy probable que el número de embriones transferidos influye en esta tendencia porque se transfirió mayor número de embriones en día 3.

Es importante enunciar el hecho de las múltiples limitaciones existentes alrededor de la única utilización de criterios morfológicos para escoger los embriones apropiados. Por fortuna, se están desarrollando nuevas alternativas de evaluación no invasora de los embriones, Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción

Resultados de un programa de FIV con transferencia de embriones en un día 3 vs día 5

como el Comparative Cromosome Screening (CCS)10,11 y la evaluación de desarrollo embrionario mediante el EmbryoScpope,®12,13 que en el futuro permitirán escoger los embriones adecuados para el día de la transferencia y hacer cambios en el número de embriones transferidos sin que haya repercusión en las respectivas tasas de embarazo y de nacidos vivos.

CONCLUSIÓN Todo parece indicar que invertir en llevar los embriones en estadio de división embrionaria a estadio de blastocisto no debe ser siempre una regla. Debe considerarse la edad de las pacientes como un factor preponderante en la toma de la decisión.

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Biotecnología

El regreso del ovocito: de la olvidada transferencia citoplasmática a la actual transferencia del huso meiótico Raúl Eduardo Piña-Aguilar*

RESUMEN El ovocito es la célula fundamental gestora del desarrollo embrionario; por tanto, es materia de intensa investigación. El ovocito humano se ha utilizado en diversas técnicas de micromanipulación que tratan de funcionar como terapias que mejoren el desarrollo embrionario. La aparición reciente de una nueva técnica de micromanipulación, la transferencia del huso meiótico en primates, promete revitalizar la importancia del ovocito. En esta revisión se analizan brevemente las técnicas de micromanipulación propuestas previamente como “terapias” ovocitarias y el potencial clínico de la transferencia del huso meiótico.

Palabras clave: ovocito, transferencia cromosómica, transferencia citoplasmática, transferencia nuclear.

ABSTRACT The oocyte is the fundamental and controlling cell of the embryo development, consequently it is matter of intense research. The oocyte has been used in diverse micromanipulation techniques that try to work as therapies to improve the embryo development. Recently the appearing of a new micromanipulation technique, the meiotic spindle transfer in primates, promises to revitalize the importance of oocyte, if it is possible to develop in humans. In this review are briefly analyzed the micromanipulation techniques previously proposed as oocyte “therapies” and the clinical potential of meiotic spindle transfer.

Key words: oocyte, chromosome transfer, cytoplasmic transfer, nuclear transfer.

E

l ovocito es, quizá, la célula más fascinante del cuerpo porque posee cualidades únicas: tamaño, características cromosómicas diferentes a las células somáticas, particularidades de los procesos involucrados en el ciclo celular, tiempo de desarrollo y supervivencia. Sin embargo, su cualidad más importante es ser la célula gestora y pilar del desarrollo embrionario preimplantación. *

Servicio de Genética Médica, Centro Médico Nacional 20 de Noviembre, Instituto de Seguridad y Servicios Sociales de los Trabajadores del Estado (ISSSTE), México DF.

Correspondencia: Dr. Raúl E. Piña-Aguilar. Servicio de Genética Médica, CMN 20 de Noviembre, ISSSTE. San Lorenzo 502, Edificio E, Esq. Coyoacán, colonia Del Valle, México 03100, DF. Correo electrónico: rpina.a@hotmail.com Recibido: junio 2011. Aceptado: enero 2012.

Este artículo debe citarse como: Piña-Aguilar RE. El regreso del ovocito: de la olvidada transferencia citoplasmática a la actual transferencia del huso meiótico. Rev Mex Reprod 2012;4(3):132-138. www.nietoeditores.com.mx

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Con base en el supuesto de que la reproducción asistida es una ciencia pero teniendo también un gran componente de arte, suele suceder que exista un tipo de “moda” en el desarrollo y aplicación de nuevas técnicas. En este sentido, el ovocito ha tenido sus altibajos, desde una perspectiva de investigación el desarrollo de la transferencia somática nuclear y la carrera por la “clonación terapéutica”, lo pusieron en primer plano por varios años. No obstante, recientemente su protagonismo ha sido duramente golpeado por la aparición de las células iPS (induced pluripotent stem),1,2 que no requieren ovocitos para reprogramar a un estado “embrionario” a las células somáticas. Contrariamente, en el campo clínico el ovocito se encuentra en pleno estrellato, gracias al desarrollo de la vitrificación que permite congelar ovocitos con tasas de viabilidad cercanas al 100% y obtener altas tasas de embarazos,3 lo que lo mantiene firme en esta posición.

El ovocito siempre ha sido materia de intensa investigación, porque siempre se le ha considerado el Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción

El regreso del ovocito

componente más importante en el potencial de desarrollo embrionario. Esto se hizo más evidente con el advenimiento de la inyección intracitoplasmática de esperma (ICSI) que permitió solucionar al factor masculino como causa de la falla en el desarrollo embrionario. Por tanto, la mayoría consideramos actualmente que el éxito clínico de las técnicas de reproducción asistida se sustenta en la calidad del ovocito.

El desarrollo de las “terapias” ovocitarias

Por lo que respecta al potencial terapéutico del ovocito, una de las primeras terapias que se propusieron para incrementar el desarrollo embrionario cuando la calidad ovocitaria no era óptima fue la transferencia citoplasmática, también conocida como transferencia ovoplásmica. Esta técnica consiste en transferir una parte del citoplasma de un ovocito “normal” al citoplasma de un ovocito con capacidad de desarrollo disminuida para compensar el déficit de componentes bioquímicos o estructurales dentro del citoplasma. El primer nacimiento con esta técnica fue reportado en 1997.4 Los dos enfoques planteados originalmente para transferir el citoplasma de ovocito donador fueron: la transferencia de citoplastos con electrofusión y la aspiración e inyección citoplasmática directa. La transferencia y electrofusión requieren que el ovocito receptor sea tratado con hialuronidasa y se haga una perforación en la zona pelúcida, mientras que al ovocito donador se le quita el cuerpo polar y se prepara un fragmento de citoplasma (sin ADN) el cual se introduce dentro de la zona pelúcida del ovocito receptor y se electrofusiona para, posteriormente, realizar la fertilización con ICSI. Este enfoque no consiguió embarazos en humanos, mientras que con la inyección sí fue posible obtener implantaciones.

La aspiración e inyección directa es una modificación a la técnica tradicional de ICSI y consiste en aspirar el espermatozoide y, posteriormente, aspirar alrededor de 5 a 15% del citoplasma del ovocito donador del lado contrario al cuerpo polar con la misma pipeta de ICSI que contiene al espermatozoide (incluso se pueden usar varios ovocitos) e inyectarlo al ovocito receptor. Todos los embarazos y los nacimientos obtenidos mediante transferencia citoplasmática se realizaron con esta técnica de inyección directa.5,6 La gran mayoría de los Volumen 4, núm. 3, enero-marzo, 2012

casos reportados fueron en parejas con fallos previos en ciclos de fertilización in vitro. Una de las modificaciones subsecuentes a la técnica original fue el uso de ovocitos congelados como donadores de citoplasma que también permitió el establecimiento de embarazos.7 El grupo de Jacques Cohen, entre 1997 y 2001, en el Saint Barnabas Medical Center’s Institute for Reproductive Medicine and Science en Nueva Jersey, EUA, fue quien más experiencia clínica acumuló con este procedimiento.8 Sin embargo, previo a su aplicación en seres humanos no se obtuvieron estudios preclínicos o ensayos clínicos detallados que apoyaran la seguridad de este procedimiento al aplicarlo en un contexto clínico, por lo que se le ha considerado una técnica controversial. En la experiencia del grupo de Saint Barnabas se reportaron dos embarazos de los 27 casos publicados, donde se realizó la técnica, con alteraciones cromosómicas en los cromosomas sexuales (45,X), mismos que resultaron en un aborto y una reducción selectiva después de un ultrasonido anómalo del otro producto.

Este grupo concursó ante la FDA para la aprobación de un protocolo de aplicación clínica de transferencia ovoplásmica como investigative new drug (IND). Este grupo accedió, voluntariamente, en 2001, a no continuar con esta aplicación. La FDA discutió el tema en 2002 y el proceso de evaluación de este procedimiento concluyó en 2003.8 La experiencia clínica con esta técnica ha sido revisada de manera detallada en otras publicaciones.5,6 Otra interesante aplicación del potencial regenerador del citoplasma ovocitario es la transferencia de vesícula germinal, que consiste en trasferir la vesícula de un ovocito inmaduro a un ovocito en metafase II y con ello recuperar el proceso de maduración y desarrollo embrionario postfertilización.9 Esta técnica se basa en el concepto de que un ovocito maduro posee los factores que pueden hacer que un ovocito en la vesícula germinal o un ovocito envejecido recuperen su capacidad de desarrollo si se transfieren a un ovocito joven o en metafase II. Técnicamente se requiere sacar la versícula germinal del ovocito donador, introducirlo en el espacio perivitelino de un ovocito previamente enucleado e inducir la fusión de las membranas y nuevamente la división celular por electrofusión para finalmente realizar la fertilización por ICSI.. Esta técnica ha sido explorada in vitro con ovocitos humanos.10,11 Incluso esta técnica se

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propusó como herramienta para corregir la aneuploidía propia de los ovocitos envejecidos,12 sin embargo su desarrollo y uso no ha progresado en los últimos años probablemente por las regulaciones vigentes para realizar este tipo de investigación.

Otra técnica ovocitaria relacionada y aun más controversial es la haploidización o semi-clonación,13,14 que consiste en usar la capacidad del ovocito para reprogramar una célula somática y posteriormente que esta célula reprogramada se convierta en una célula haploide (extruyendo la mitad de los cromosomas), la cual finalmente se pueda fertilizar posteriormente con un espermatozoide para formar un embrión. Esta técnica ha sido reportada en un contexto clínico, donde se han obtenido ovocitos fertilizables usando células somáticas de una paciente y ovoplastos donados, los cuales fueron fertilizados y se logró el desarrollo un embrión.13El hecho que esta técnica este directamente relacionado con la transferencia somática nuclear14 hace que sea altamente controversial desde una perspectiva ética y hasta ahora no hay reportes de otros grupos de investigación que hayan conseguido desarrollo embrionario en humanos.

Por tanto su desarrollo se ha visto de igual manera limitado, ya que es difícil separar las implicaciones de esta técnica respecto a la transferencia nuclear con fines reproductivos.

La transferencia del huso meiótico

Después de un largo periodo en que la transferencia citoplasmática y otras técnicas relacionadas se abandonaron, quizá a causa de las dificultades técnicas propias del mismo procedimiento, las regulaciones que limitaron su posible aplicación clínica y la falta de interés en su aplicación en la práctica médica que permitiera que se impulsara su desarrollo. Hace poco, el grupo liderado por Mitalipov, en el Oregon National Primate Research Center, en EUA, desafió en un solo experimento lo imposible en materia de terapias ovocitarias: realizó la transferencia del huso meiótico y cromosomas adyacentes de un ovocito donador a un ovocito receptor y logró obtener crías normales de monos Rhesus transfiriendo embriones producidos por este procedimiento.15 Este hito en la historia de la reproducción asistida seguramente modificará nuestra visión y el futuro de la investigación en “terapias ovocitarias” y técnicas de reproducción asistida.

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Los principios básicos que sustenta este proceso se ilustran en la Figura 1. Para esta técnica se requieren equipos especiales adicionales a los utilizados comúnmente en los laboratorios de micromanipulación embrionaria, como el microscopio de polarización y un láser. El primer paso en los experimentos de transferencia del uso meiótico consistió en que ovocitos en metafase II -donadores de carioplasto- obtenidos in vivo por laparoscopia y estimulación hormonal, se les extrajo el huso y los cromosomas.

Esto se consiguió haciendo un orificio en la zona pelúcida mediante un laser (XYClone® RED-i, Hamilton Thorne) y visualizando el huso por microscopia de polarización (Oosight®, CRi) y la extracción utilizando una pipeta con diámetro de 20-25µm, visualizando el huso por microscopia de polarización; mientras que los ovocitos se encontraban en medio de manipulación con una inhibidor de la polimerización de microtúbulos (Citocalasina B) (Figura 2). Posteriormente el carioplasto (conteniendo huso meiótico y cromosomas) fue expuesto al virus Sendai (HVJ-E, Cosmobio), el cual tiene la capacidad de fusionar membranas. El carioplasto ya expuesto al virus se introdujo al ovocito donador de citoplasma (previamente enucleado) en zona contraria al primer cuerpo polar y se posicionó lo más cercano posible al citoplasto para permitir la interacción de membranas. Una vez verificada la fusión de membranas, aproximadamente después de 30 minutos de la inyección, se procedió a la realización de una ICSI de manera convencional con cultivo posterior a blastocisto de los ovocitos fertilizados.

Dos blastocitos obtenidos fueron transferidos quirúrgicamente a hembra Rhesus receptora con ovulaciones naturales, obteniendo tasas de embarazo de 33% (3/9), lo que permitió el nacimiento de dos gemelos: Mito y Tracker (Figura 3). En las crías sanas nacidas por la transferencia cromosómica (tres en total en el reporte original15) se consiguió el remplazo completo del ADN mitocondrial, es decir se puede considerar que eran homoplásmicas para el ADNmt de las donadoras de citoplastos. Tampoco se detectaron secuencias del genoma del virus Sendai en las crías nacidas. Para los interesados en los detalles técnicos completos asociados a esta técnica se tiene un video disponible en línea que demuestra el proceso.16 Además, este grupo de investigación ha publicado un artículo detallado sobre la metodología de la transferencia cromosómica paso a paso.17 Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción

El regreso del ovocito

Figura 1. La técnica de la transferencia del huso meiótico. Reimpresa con autorización de Macmillan Publishers Ltd: [Nature] (461: 354-355.)© 2009.

Trabajando con monos Rhesus, Tachibana et al. removieron la membrana nuclear más el material nuclear (carioplasto) de un ovocito maduro, dejando las mitocondrias (a). Posteriormente transfirieron el carioplasto a un ovocito cuyo núcleo había sido removido (citoplasto) (b). El material nuclear en el carioplasto consiste en los cromosomas condensados adheridos a las fibras del huso (el complejo huso-cromosomas). Los autores fusionaron el carioplasto con el citoplasto y después fertilizaron el ovocito reconstruido (c). El blastocisto en desarrollo (d) fue implantado en una madre subrogada, quien dio nacimiento a una cría sana (e). Esta técnica tiene el potencial de prevenir la transmisión del DNA mitocondrial mutado de la madre al hijo.

Los resultados obtenidos por el grupo de Mitalipov nos hacen pensar inmediatamente en su posible aplicación clínica, en este sentido son muchos los obstáculos para el desarrollo de la transferencia del huso en humanos usando la misma técnica de Mitalipov, como son el uso de virus Sendai, que la electrofusión no fuera efectiva para la fusión de membranas y la capacidad técnica necesaria para los procedimientos de micromanipulación. No obstante, previo a la publicación del trabajo de Mitalipov ya se había propuesto en humanos la posibilidad de la transferencia de cromosomas en ovocitos en metafase II18, con resultados in vitro lamentablemente no tan alentadores. Este grupo que trabajo con ovocitos humanos utilizó originalmente en sus experimentos la microscopia de polarización, pero consideró que era inadecuada para la visualización y la micromanipulación simultánea por lo que cambiaron a un enfoque de localización de los cromosomas usando solamente mi-

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croscopia de Nomarski. Emplearon ovocitos madurado in vitro como donadores de carioplasto y frescos como receptores, la unión de los carioplastos fue realizada por electrofusión, la fertilización por ICSI permitió obtener desarrollo hasta blastocistos.18 Aunque no son directamente comparables por ser especies diferentes, la tasa de desarrollo a blastocisto del grupo de Mitalipov usando fusión con virus Sendai fue de 45%,15 mientras que en este último trabajo con ovocitos humanos fue de 28%,18 es probable que estas diferencias estén relacionadas principalmente con el uso de la electrofusión.

Es necesario considerar que probablemente la técnica desarrollada por el grupo de Mitalipov, la cual ya logró superar los desafíos propios de la transferencia del huso si se modificara para realizarse en un contexto clínico y poder aplicarse a gametos humanos puede hacer factible obtener éxito en la transferencia del huso meiótico en humanos en un futuro cercano.

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Figura 2. Transferencia del complejo huso-cromosomas y análisis meiótico de los ovocitos reconstruidos. Reimpresa con autorización de Macmillan Publishers Ltd: [Nature] (461: 367-372.)© 2009. (a) Microscopia confocal de un ovocito en metafase II teñido con DAPI (azul) para demostrar los cromosomas y con MitoTrakerÆ (rojo) para demostrar las mitocondrias activas. (b) Visualización del huso en MII con el sistema OosightÆ. (c) Aislamiento de carioplastos. (d) Carioplastos y citoplastos aislados. (e) Microscopía confocal de la progresión a anafase II inducida por la electrofusión. (f) Huso en MII después la fusión con virus Sendai. Los husos están teñidos con DAPI (azul) para demostrar los cromosomas y con tubulina α/β (verde) para mostrar los microtúbulos.

Potencial de la transferencia cromosómica en la práctica clínica

¿Cuáles son las posibles aplicaciones clínicas de la transferencia del huso meiótico? La aplicación más obvia es la que generó su desarrollo: la prevención de enfermedades mitocondriales. Para este fin se usaría como donador un ovocito con mitocondrias normales lo que permitiría a una pareja afectada por una enfermedad mitocondrial tener sus propios hijos (desde una perspectiva genética) y no tener que recurrir a la donación de ovocitos con el consiguiente complemento genético diferente. Para más detalles del uso de nuevas técnicas de reproducción asistida para tal aplicación, se sugiere consultar una revisión reciente.19 Sin embargo, la transferencia del huso meiótico también puede tener indicaciones más interesantes como

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seria su uso en el fallo repetido de la fertilización in vitro como fue propuesto originalmente para la transferencia citoplásmica o en la corrección de defectos presentes en ovocitos en metafase I. También se podría usar en el caso de pacientes con baja reserva ovárica u ovocitos de mala calidad, lo que permitiría usar ovocitos donados pero manteniendo el ADN de la paciente. Incluso esto último podría eliminar la reticencia de algunas donadoras de ovocitos que les preocupa el hecho de que sus genes se transmitan y ellas no lo sepan, lo que de alguna manera limita la disponibilidad de donadoras de ovocitos.

A su vez, si en algún momento la maduración ovocitaria in vitro combinada con ciclos no estimulados logrará extenderse y perfeccionarse hasta el punto de que sea utilizada en ciclos de donadoras de ovocitos (como fue reportado por el grupo de reproducción humana de la Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción

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Figura 3. Mito y Tracker, los primeros primates producidos por transferencia del complejo huso-cromosomas a ovocitos enucleados, seguida de fertilización y transferencia embrionaria. Reimpresa con autorización de Macmillan Publishers Ltd: [Nature] (461: 367-372.)© 2009.

El embarazo fue establecido después de la transferencia de dos blastocitos a una receptora. Ambos infantes fueron sanos con crecimiento y desarrollo dentro del rango normal para macacos Rhesus. La foto fue tomada a los 6 días de edad.

Universidad de McGill20) o usando estimulación con una cantidad mínima de hormonas; la inherente necesidad de ovocitos para el desarrollo de esta nueva técnica en un contexto clínico, se podría satisfacer sin un riesgo importante para las donadoras. Esto permitiría en un plazo razonable incorporar esta nueva técnica al arsenal del clínico en el tratamiento de la patología genética y reproductiva en el futuro.

Por lo que respecta al posible costo-beneficio de esta nueva técnica; es claro que en algunos casos de patología ovocitaria o enfermedades mitocondriales la única opción disponible para las pacientes es el uso de ovocitos donados, con la consiguiente pérdida de la posibilidad de transmitir sus genes. Por tanto la transferencia del huso meiótico permitiría que mantengan su ADN y solo representaría un costo adicional para los laboratorio que ofrezcan esta técnica generada por el uso de técnicas más complejas de micromanipulación y la necesidad de equipo especializado como es el microscopio de polarización, ya que incluso el láser se encuentra en la mayoría de los laboratorios de embriología actualmente. No obstante, día a día, es más común que en los laboratorios se estén incorporando nuevos equipos que permiten realizar técnicas no tradicionales en la

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práctica clínica rutinaria, como son los microscopios invertidos con mayores aumentos y/o los equipados con óptica de Nomarski (también conocida como DIC: Differential interference contrast) para realización de la IMSI (Intracytoplasmic Morphologically Selected Sperm Injection). Incluso en algunos centros, la microscopia de polarización ya comienza ser parte de la rutina clínica para evaluación del estado del huso meiótico y el momento optimo de inseminación. Por tanto, aunque la transferencia del huso meiótico significaría equipo especializado y sobre todo capacitación especial a los recursos humanos, los últimos años nos han demostrado que este esfuerzo adicional se justifica perfectamente si los resultados clínicos son alentadores.

CONCLUSIONES Debemos considerar que trabajos como el recientemente publicado por el grupo de Mitalipov, nos deben hacer reflexionar que la medicina, incluida la medicina reproductiva, es un ciencia para la que no existe la respuesta: “es completamente imposible” a ninguno de sus planteamientos, por más desafiantes que parezcan a nuestro entendimiento y a lo que actualmente conocemos como “posible”.

Finalizaré esta contribución recordando la frase expresada por William Harvey: “Ex ovo omnia” (Todo proviene del huevo). Expresada en la portada de su tratado Exercitationes de generatione animalium (publicado en 1651 y que representó el fundamento de la embriología). Esta frase cobra vigencia en estos días, más que nunca y nos hace recordar que desde hace de 400 años, Harvey y la ciencia de aquella época no estaba equivocados, ya que el ovocito es sin lugar a dudas el origen de la vida y por tanto la célula más importante de la naturaleza.

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Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción

Normas para autores 1. Los artículos deben enviarse, preferentemente, mediante correo electrónico (ammr@wtcmexico.com.mx) o entregarse en las oficinas de la revista (WTC Montecito 38, piso 15, oficina 29, colonia Nápoles, CP 03810, México, DF. Tel.: 9000-2863) en original impreso y archivo electrónico en CD marcado con el título del trabajo. Anexar el formato de cesión de los derechos de autor (firmado por todos los autores) y confirmar que se trata de un artículo inédito. Los trabajos no aceptados se devolverán al autor principal. El formato de cesión de derechos puede descargarse de la página www.nietoeditores.com.mx Ningún material publicado en la revista podrá reproducirse sin autorización previa por escrito del editor.

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2.2. Resumen. El resumen es la parte medular del artículo porque es la más leída, por tanto, debe ser la más cuidada. Los artículos originales llevarán resúmenes estructurados en español e inglés, donde las entradas de los párrafos sean análogas a las partes del artículo (Antecedentes, Material y método, etc.). Los resúmenes no deberán exceder 250 palabras. Los resúmenes de los artículos de revisión y de los casos clínicos también deben escribirse en español e inglés.

2.3. Palabras clave, en inglés y en español, basadas en el MeSH (Medical Subject Headings); para obtenerlas consulte la página www.nlm.nih.gov/mesh/MBrowser.htm 2.4. El texto del artículo original está integrado por las siguientes secciones: Antecedentes. Texto breve, no mayor de 50 líneas (de 65 caracteres cada una) que permita al lector ubicarse en el contexto del tema investigado, por qué es relevante estudiarlo, quiénes lo han estudiado y cómo. En el último párrafo de este apartado debe consignarse el Objetivo del estudio que, invariablemente, debe verse reflejado en los Resultados.

Material y método. En la primera oración de este apartado debe indicarse el tipo de estudio (observacional, retrospectivo, doble ciego, aleatorio, etc.), la selección de los sujetos observados o que participaron en los experimentos (pacientes o animales de laboratorio, incluidos los testigos). Enseguida se especifican los aparatos (nombre y ciudad del fabricante entre paréntesis) y procedimientos con detalles suficientes para que otros investigadores puedan reproducir los resultados. Explique brevemente los métodos ya publicados pero que no son bien conocidos, describa los métodos nuevos o sustancialmente modificados, manifestando las razones por las cuales se usaron y evaluando sus limitaciones. Identifique exactamente todos los medicamentos y productos químicos utilizados, con nombres genéricos, dosis y vías de administración. Deben mencionarse los métodos de comprobación utilizados y el porqué de su elección (χ2, T de Student, etc.) así como los programas de cómputo aplicados y su versión.

Resultados. Deben reflejar claramente el objetivo del estudio. La cantidad final de pacientes estudiados y destacar las observaciones más relevantes.

Discusión. Incluye los aspectos nuevos e importantes del estudio, la explicación del significado de los resultados y sus limitaciones, incluidas sus consecuencias para la investigación futura. Debe establecerse el nexo de las conclusiones con los objetivos del estudio y abstenerse de hacer afirmaciones generales y extraer conclusiones que carezcan de respaldo. Proponga nuevas hipótesis cuando haya justificación para ello.

El texto no debe incluir abreviaturas de ninguna especie, a pesar de la abundancia de términos, pues ello implicaría remitir al lector a la parte inicial donde se definieron éstos y ello puede conducir al abandono de la lectura por incomprensión. Los símbolos sí están permitidos (L, kg, g, cm, dL, etc.) pero no las abreviaturas, sobre todo cuando no son internacionales o multilingües. No existen dudas para los acrónimos: ADN, HDL, LDL, VLDL, mmHg, etc.

2.5. Figuras y cuadros. Se utilizará el término figura para citar por igual ilustraciones, esquemas, fotografías y gráficas. Se utilizará el término cuadro para citar por igual los cuadros y las tablas.

Volumen 4, núm. 3, enero-marzo, 2012

2.6. Pueden agregarse anexos con cuestionarios o encuestas utilizados durante la investigación.

2.7. Pueden incluirse agradecimientos.

3. Los cuadros y figuras deben numerarse con caracteres arábigos. Cada uno deberá tener un título breve y mencionarse en el cuerpo del artículo. Los cuadros de datos tabulados que contengan exclusivamente texto deberán elaborarse con la aplicación “Tabla” de Word; los esquemas y diagramas, con Power Point; las gráficas de pastel, barras, dispersión, etcétera, con Excel.

4. Para las fotografías en versión electrónica debe considerarse lo siguiente: Entregar cada una en archivo separado en formato TIFF o JPG (JPEG).

Sólo si el tamaño real de las imágenes resulta excesivo, éstas pueden reducirse a escala; dada la pérdida de resolución, no deben incluirse imágenes que requieran aumento de tamaño.

La resolución mínima aceptable es de 300 dpi. Si las fotografías se obtienen directamente de cámara digital, la indicación debe ser “alta resolución”.

5. Dentro del archivo de texto deben incluirse los cuadros y pies de figura, al final después de las referencias.

6. Cuando los cuadros o figuras se obtengan de otro medio impreso o electrónico, deberá adjuntarse la carta de autorización de la institución donde se publicaron. Excepto los casos que carezcan de derecho de autor.

7. Las siglas o abreviaturas de los cuadros o figuras se especificarán al pie de los mismos.

8. Las referencias deben enumerarse consecutivamente según su orden de aparición en el texto y el número correspondiente debe registrarse utilizando el comando superíndice de Word (nunca deben ponerse entre paréntesis).

Para evitar errores se sugiere utilizar la aplicación “insertar referencia” del menú principal de Word. Deben omitirse comunicaciones personales, en cambio, sí se permite la expresión “en prensa” cuando un trabajo se ha aceptado para publicación en alguna revista, pero cuando la información provenga de textos enviados a una revista que no los haya aceptado aún, deberá citarse como “observaciones no publicadas”. Cuando en una referencia los autores sean más de cinco se consignarán los primeros cuatro y el último seguido de la palabra y col. o et al (si es en inglés).

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