Vol. 6 Núm. 2 Oct-Dic 2013 by ammr

REVISTA MEXICANA DE MEDICINA DE LA

Asociaci贸n Mexicana de Medicina de la Reproducci贸n, A.C.

Volumen 6, n煤mero 2, octubre-diciembre, 2013

REVISTA MEXICANA DE MEDICINA DE LA

Mesa Directiva enero-diciembre 2013 Dr. Julio Francisco De la Jara Díaz Presidente

Dr. Sergio Villalobos Acosta Tesorero

Dr. Alfonso Orta García Vicepresidente

Dra. Ana Paola Sánchez Serrano Protesorero

Dr. Álvaro Santibáñez Morales Secretario

Dra. Araceli Montaño Román Dr. Julián Ruíz Anguas Dr. José Luis Ruvalcaba Alfaro Dr. Alberto Vielma Valdez Vocales

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Comité Editorial para la Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción 2012-2014 Editor Dr. Gerardo Velázquez Cornejo Co-Editores Dr. Julio Francisco De la Jara Díaz Dr. Carlos G. Salazar López Ortiz Dr. Héctor Rogelio Santana García Dr. Guillermo Santibáñez Moreno MVZ. Esperanza Carballo Mondragón

Comité Editorial 2012-2014 Distrito Federal Dr. Luis Ignacio Aviña Cueto Dr. Aquiles Ayala Ruiz Dr. Luis Miguel Bedia Sánchez Dr. José Luis Castro López Dr. Roberto Cervera Aguilar Dr. Silvio Cuneo Pareto Dra. Mirna Gpe. Echavarría Sánchez Dra. Lorena Patricia Ferrer Arreola Dr. Ranferi Gaona Arreola Dr. Fernando Gaviño Gaviño Dra. Rocio Guerrero Bustos Dr. Marcelino Hernández Valencia Dr. Juan Carlos Hinojosa Cruz Dr. Jesús Estuardo Lujan Irastorza Dra. Rosa Martha Luna Rojas Dr. Alberto Kably Ambe Dra. Olivia Marín Romero Dr. Carlos Guillermo Maquita Nakano Dr. Manuel Mario Matute González Dr. Héctor Mondragón Alcocer Dr. Jesús Daniel Moreno García M. en C. Paloma del Carmen Neri Vidaurri Dr. Raymundo Preciado Ruíz D. en C. Francisco Rocha Cárdenas Dr. Álvaro Santibáñez Morales Dr. Claudio Serviere Zaragoza Dr. Jorge Jaroslav Stern Colín y Nunés

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Dra. Rosario Tapia Serrano Dr. Sergio Téllez Velasco Dr. Rubén Tlapanco Barba Dr. René Toro Calzada Dr. Emilio Valerio Castro Biol. Eva Vega Hernández Dr. Sergio Villalobos Acosta Dr. Victor Saúl Vital Reyes Otras sedes Dr. Víctor Alfonso Batiza Reséndiz Dra. Oceanía Minerva Bautista Ordóñez Dr. Luis Delgado Salazar Dr. Carlos Félix Arce Dra. Bertha Franco Tostado Dr. Oscar Javier León Martínez Dr. Jose María Mojarra Estrada Biol. Ma. Del Rocio Martínez Armas Dr. Henry Aristóteles Mateo Sánez Dr. Adán Oliveros Ceballos Biol. Antonio Vidal Pascual Rodríguez Dr. Jaime Paz Ávila Dr. Efraín Pérez Peña Dr. Rafael Alfonso Sánchez Usabiaga Dr. Roberto Santos Haliscak Dr. Álvaro Sevilla y Ruiz Dr. Luis Arturo Ruvalcaba Castellón

(Monterrey, NL) (Cuernavaca, Mor.) (Cuernavaca, Mor.) (Monterrey, NL) (Guadalajara, Jal.) (Tijuana, BC) (Sonora, Sonora) (Guadalajara, Jal.) (Ensenada, BC) (Acapulco, Gro.) (Zapopan, Jalisco) (Tampico,Tamaulipas) (Zapopan, Jalisco) (Querétaro, Qro.) (Monterrey, NL) (Puebla, Puebla) (Zapopan, Jalisco)

REVISTA MEXICANA DE MEDICINA DE LA

Volumen 6, núm. 2, octubre-diciembre, 2013

CONTENIDO 81

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128

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EDITORIAL La evolución del biólogo en el campo de la medicina reproductiva. “La realidad” Claudio F Serviere Zaragoza ARTÍCULO DE REVISIÓN Estudio prenatal no invasivo para la detección de aneuploidías mediante ADN fetal libre en sangre materna: descripción de tres metodologías Rafael Alfonso Sánchez Usabiaga, Anaid Batista Espinoza, Sergio Romero Tovar ARTÍCULOS ORIGINALES Efecto del índice de masa corporal en la tasa de recién nacidos vivos en embarazos logrados por fertilización in vitro Eva Bonifacio León, Enrique Reyes Muñoz, Erika Basulto Montalvo, Julio Francisco de la Jara Díaz, Juan Carlos Barros Delgadillo, Álvaro Santibáñez Morales, Víctor Sánchez Solís Determinación del efecto de la temperatura en la reacción acrosomal espontánea en muestras seminales previas a procedimientos de reproducción asistida Paloma Neri Vidaurri, Víctor Torres Flores, Alberto Vielma Valdez, Ranferi Gaona Arreola TÓPICOS DE INTERÉS Laboratorio de reproducción asistida Neri Vidaurri Paloma, Esperanza Carballo Mondragón, Francisco Rocha Cárdenas, Genaro García Villafaña, María del Carmen Acuña González, Conrado Emilio Uria Gómez CASO CLÍNICO Tumor virilizante de ovario Johnatan Torres Torres, Rocío Guerrero Bustos, Luz María Malanco Hernández HOMENAJE Centenario del nacimiento del doctor Alfonso Álvarez Bravo Guillermo Santibáñez Moreno

Contents 81

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EDITORIAL Evolution of the Biologist in the Field of Reproductive Medicine. “The Reality” Claudio F Serviere Zaragoza REVIEW ARTICLE Non-Invasive Prenatal Study for Detecting Aneuploidies by Free Fetal DNA in Maternal Blood: Description of Three Methodologies Rafael Alfonso Sánchez Usabiaga, Anaid Batista Espinoza, Sergio Romero Tovar ORIGINAL ARTICLES Effect of Body Mass Index on Alive Newborns Rate in Pregnancies Achieved by in Vitro Fertilization Eva Bonifacio León, Enrique Reyes Muñoz, Erika Basulto Montalvo, Julio Francisco de la Jara Díaz, Juan Carlos Barros Delgadillo, Álvaro Santibáñez Morales, Víctor Sánchez Solís Determination of the Effect of Temperature on Spontaneous Acrosomal Reaction in Seminal Samples Before Assisted Reproduction Procedures Paloma Neri Vidaurri, Víctor Torres Flores, Alberto Vielma Valdez, Ranferi Gaona Arreola THEMES OF INTEREST Assisted Reproduction Laboratory Neri Vidaurri Paloma, Esperanza Carballo Mondragón, Francisco Rocha Cárdenas, Genaro García Villafaña, María del Carmen Acuña González, Conrado Emilio Uria Gómez CLINICAL CASE Ovarian Virilizing Tumor Johnatan Torres Torres, Rocío Guerrero Bustos, Luz María Malanco Hernández HOMAGE Centenary of the Doctor Alfonso Alvarez Bravo Birthday Guillermo Santibáñez Moreno

La Revista REPRODUCCIÓN es el Órgano Oficial de la Asociación Mexicana de Medicina de la Reproducción, A.C. Revista trimestral. Editor responsable: Gerardo Velázquez Cornejo. Registro de Reserva de Título de la Dirección General del Derecho de Autor (SEP) número 04-2008063018255800-102. Certificado de Licitud de Título en trámite. Certificado de Licitud de Contenido en trámite. Autorización como Publicación Periódica por Sepomex en trámite. Publicación realizada, comercializada y distribuida por EDICIÓN Y FARMACIA, SA de CV, José Martí 55, colonia Escandón, CP 11800, México, DF. Tel.: 5678-2811, fax: 5678-4947. Correo electrónico: articulos@nietoeditores.com.mx Los artículos y fotografías son responsabilidad exclusiva de los autores. La reproducción parcial o total de este número sólo podrá hacerse previa autorización de los editores. Toda correspondencia relacionada con el contenido y suscripciones deberá dirigirse al editor en jefe: WTC Montecito 38, piso 15, oficina 29, colonia Nápoles, CP 03810, México, DF. Tel.: 9000-2863. E-mail: ammr@ wtcmexico.com.mx. Revista REPRODUCCIÓN. Impresa por Computipo Scanner Editorial S.A. Azafrán 313 y 315, Colonia Granjas México, Delegación Iztacalco, CP 08400. México, DF.

Reproducción 2013;6:81-82

Editorial

La evolución del biólogo en el campo de la medicina reproductiva. “La realidad”

l nacimiento del primer bebé en el mundo por fertilización in vitro, en julio de 1978, por supuesto que no fue un evento fortuito. Ciertamente, después de muchos años de investigación, una concepción por medio de fertilización in vitro representó la culminación de un sinfín de acontecimientos que gracias a ellos actualmente casi todas las causas de infertilidad pueden ser tratadas debido a la innovación, creación y fusión de técnicas de reproducción asistida, que son responsables del nacimiento de más de dos millones de niños en todo el mundo. El entendimiento de cómo la unión de un hombre y una mujer daba origen a un nuevo ser comenzó desde el siglo V aC con los razonamientos de los filósofos griegos, cuyas ideas acerca de la reproducción humana perduraron con fuerza hasta la Edad Media, donde el crecimiento de la ciencia se dio a pasos lentos, ya que se entremezclaba con profundas ideas religiosas. La medicina evolucionó poco y se basaba principalmente en los clásicos escritos griegos, que al momento de traducirlos a otros idiomas, en ocasiones el problema se extendía y creaba más errores anatómicos y fisiológicos que los que ya se arrastraban. Comenzaron a surgir entonces estudios de embriólogos como William Harvey (1578-1657), quien trabajó con embriones de pollo; posteriormente surgió la primera observación de espermatozoides por el biólogo Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723). En 1827, el biólogo Karl

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Ernst von Baer (1792-1876) identificó el óvulo o célula germinadora femenina en folículos ováricos de un canino, lo que significó que la fecundación podía empezar a comprenderse. En 1880 se realizó el primer intento de fertilización in vitro en conejos de Indias. En 1890 el científico británico Walter Heape (1855-1929), asistido por el cirujano Samuel Buckley (1847-1910), practicó con éxito una fertilización in vitro y transferencia de un embrión de una coneja a otra. A principios del siglo XX surgió una gran inquietud en todo el mundo por conocer aún más acerca de la reproducción humana y de cómo podían solucionarse los problemas de infertilidad. En 1951, el joven biólogo Robert Edwards ingresó al Instituto de Genética Animal, en donde aprendió a preparar y manejar espermatozoides, a realizar inseminación artificial en ratones, recoger y estudiar embriones en clivaje y blastocisto y comprender la estructura de los cromosomas. En 1958, Edwards obtuvo su doctorado y sus nuevos objetivos fueron el estudio de la infertilidad y genética en humanos, por lo que en él se despertó el interés de lograr en humanos lo que, hasta ese tiempo, sólo era posible en animales. Sus investigaciones llegaron al grado de hablar ya de fertilización in vitro, criopreservación, diagnóstico genético y preimplantación en humanos, con lo que despertó un gran interés por la reproducción asistida en todo el mundo. Sus investigaciones y trabajos conjuntos comenzaron con transferencias de embriones desde 1971 y sus intentos se mantuvieron hasta que después de ocho años y 32 transferencias embrionarias se logró el primer na-

Editorial

cimiento de un bebé concebido in vitro, el 25 de julio de 1978 (Louise Brown). Las bases y el entusiasmo científico que dejaron éstos y muchos más investigadores en el campo de la reproducción humana han continuado y mejorado el conocimiento de la biología de la reproducción, así como el desarrollo de nuevas tecnologías que permiten la evaluación y, en su caso, el tratamiento de algunos trastornos reproductivos. Las mejoras en los medios y sistemas de cultivo, la selección del mejor espermatozoide, la selección embrionaria, la nueva tecnología de los laboratorios de fertilización in vitro, la criopreservación, la preservación de la fertilidad, el desarrollo de la receptividad endometrial, el diagnóstico genético preimplantación por medio de técnicas moleculares y el desarrollo de las técnicas ómicas permiten, si bien no lograr un embarazo, sí el diagnóstico por el que una pareja no puede lograr este anhelo. Por ello, el editorial de este número está enfocado a los biólogos del laboratorio de reproducción asistida, personal muy importante y piedra angular en los centros de reproducción. El personal del laboratorio debe ser un científico altamente calificado, con experiencia y educación médica continua, misma que se recomienda para todo el personal involucrado. El personal de laboratorio debe ser responsable, obsesivo con todos los cuidados que debe tener dentro del laboratorio, observador, disciplinado y, sobre todo, requiere muchas habilidades individuales para solucionar cualquier problema que se genere. En un laboratorio de fertilización in vitro, los embriólogos están implicados en importantes tareas relacionadas con el manejo general del paciente, como

el esquema de la causa de la esterilidad, la edad, el esquema de la inducción de ovulación, el comportamiento endocrino de la mujer, el comportamiento seminal, etcétera; pero su principal responsabilidad es realizar el manejo de gametos, embriones y los procesos de cultivo. El segundo aspecto, igualmente importante, es que los embriólogos deben mantener una conciencia total de los estándares del control de calidad, realizando revisiones y pruebas diarias, así como el mantenimiento y prevención de accidentes. Y, por supuesto, tener las bases científicas de los procedimientos de laboratorio y estar continuamente actualizados en las nuevas tecnologías de los laboratorios de reproducción mencionadas. Sin embargo, un aspecto de vital importancia es la comunicación estrecha entre el clínico y el biólogo, con el objetivo de dar a la pareja la mejor atención posible, de acuerdo con sus necesidades. De esta manera existirá la satisfacción en la pareja de haber tenido una oportunidad de seguir un tratamiento y la satisfacción del personal médico de haberle ofrecido todo lo que existe hoy en día en relación con el tema. “Nunca olvidaré el día en que me incliné al microscopio y vi algo divertido en los cultivos. Lo que vi al inclinarme fue un blastocisto mirándome desde abajo. En ese momento pensé: ‘Lo logramos’” Robert Edwards

Dr. Claudio F Serviere Zaragoza Ginecobstetra especialista en Medicina de la Reproducción, Hospital Ángeles México. Agrarismo 208, consultorio 651, Torre B, colonia Escandón, CP 11800, México, DF

Reproducción

Reproducción 2013;6:83-89

Artículo de revisión

Estudio prenatal no invasivo para la detección de aneuploidías mediante ADN fetal libre en sangre materna: descripción de tres metodologías Rafael Alfonso Sánchez Usabiaga,1 Anaid Batista Espinoza,2 Sergio Romero Tovar2

RESUMEN

ABSTRACT

Después de décadas de investigación, el estudio prenatal no invasivo para la detección de aneuploidías mediante ADN fetal libre de células en sangre materna es una realidad. Diferentes metodologías de secuenciación masiva ya se utilizan en la práctica clínica. En este artículo se describen tres metodologías capaces de identificar alteraciones cromosómicas fetales mediante la secuenciación masiva y análisis del ADN fetal libre de células en sangre materna. La secuenciación masiva en paralelo, el análisis digital de regiones seleccionadas y la metodología de Parental Support® son métodos precisos y confiables para la detección de las aneuploidías cromosómicas más frecuentes, como la trisomía 21 (T21), trisomía 18 (T18), trisomía 13 (T13), monosomía X0 (síndrome de Turner) y síndrome de Klinefelter (XXY), mediante el análisis de ADN fetal libre en sangre materna. La metodología Parental Support® otorga grandes ventajas para lograr alta precisión al identificar las anomalías cromosómicas más frecuentes (T21, T18, T13, X0 y XXY). La implementación de tecnologías de secuenciación de nueva generación en el diagnóstico prenatal no invasivo promete ser una herramienta de tamizaje de aneuploidías fetales y puede integrarse a los algoritmos existentes en la atención prenatal.

After decades of research, the noninvasive study of prenatal detection of aneuploidy using cell-free DNA in maternal blood is a reality. Different mass sequencing methodologies are already used in clinical practice. This paper describes three methodologies able to identify fetal chromosomal abnormalities by massive sequencing and analysis of cell-free DNA in maternal blood. Massively parallel sequencing, digital analysis and technology selected regions of Parental SupportTM (PS) are accurate and reliable methods for detecting the most common chromosomal aneuploid cells, such as trisomy 21 (T21), trisomy 18 (T18), trisomy 13 (T13), monosomy X0 (Turner syndrome) and Klinefelter syndrome (XXY) by analysis of free fetal DNA in maternal blood. Parental SupportTM methodology provides great advantages to achieve high accuracy in identifying frequent chromosomal abnormalities (T21, T18, T13, X0 and XXY). The implementation of technologies of next-generation sequencing in the noninvasive prenatal diagnosis promises to be a screening tool for fetal aneuploidy and can be integrated into existing algorithms in prenatal care.

Palabras clave: diagnóstico prenatal no invasivo, aneuploidías, ADN fetal libre en sangre materna, trisomía 21, síndrome de Turner.

Key words: non-invasive prenatal diagnosis, aneuploidy, maternal blood free fetal DNA, trisomy 21, Turner syndrome.

1 2

Director General de Médica Fértil. Médica Fértil, Querétaro.

Correspondencia: Dr. Rafael Sánchez U. Médica Fértil. Prolongación Constituyentes 218, El Jacal, CP 76180, Querétaro, Qro. Recibido: agosto 2013. Aceptado: octubre 2013. Este artículo debe citarse como: Sánchez-Usabiaga RA, BatistaEspinoza A, Romero-Tovar S. Estudio prenatal no invasivo para la detección de aneuploidías mediante ADN fetal libre en sangre materna: descripción de tres metodologías. Reproducción (México) 2013;6:83-89. www.nietoeditores.com.mx

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asta hace poco tiempo, las mujeres embarazadas con deseo de conocer el estado cromosómico fetal tenían como opciones no invasivas los marcadores bioquímicos maternos y ultrasonográficos fetales. El tamizaje prenatal para aneuploidías fetales inició en la década de 1960 y la edad materna se usaba como parámetro de detección. En la Obstetricia moderna, el tamizaje prenatal y el diagnóstico de aneuploidías fetales, como la trisomía 21 (T21), están bien establecidos en la práctica clínica cotidiana.

Sánchez Usabiaga RA y col.

masiva en paralelo, al incluir la amplificación de pasos específicos.17-19 Una tercera metodología, denominada Parental Support®, combina la secuenciación con un análisis bioinformático extenso y detecta T13, T21, T18, 45,X, además de trisomías de cromosomas sexuales, como 47,XXY (síndrome de Klinefelter), con adecuada precisión.20-25 Estas metodologías evitan en la práctica incluso 98% de los estudios diagnósticos invasivos.26 Este documento describe una visión general de las tres metodologías para la detección prenatal de aneuploidías fetales y considera sus ventajas e inconvenientes al aplicarlas en la práctica clínica. Factores importantes a considerar en el estudio prenatal no invasivo

La prevalencia de las siete causas más comunes de aneuploidías se muestran en la Figura 1.27-30 Los siguientes tres factores son importantes al evaluar los métodos de 1.0 0.9 0.8 0.7 Prevalencia (%)

El tradicional tamizaje no invasivo se considera seguro; sin embargo, es poco preciso. El tamizaje sérico de marcadores bioquímicos tiene un intervalo de falsos negativos de 12 a 23% y falsos positivos de 1.9 a 5.2%.1-3 El tamizaje ultrasonográfico de aneuploidías depende de la edad gestacional y sólo 35% de las alteraciones anatómicas se detectaron en 15,000 mujeres estudiadas por ultrasonido; en 17% de éstas se pudieron detectar antes de la semana 24 de gestación,4 precisando un gran número de procedimientos diagnósticos invasivos (biopsia de vellosidades coriales o amniocentesis). Décadas de investigación del estudio prenatal no invasivo con base en ADN fetal libre de células para identificar alteraciones cromosómicas finalmente comienzan a dar frutos. El desarrollo de las denominadas tecnologías de secuenciación masiva actualmente permite obtener millones de secuencias de ADN a una velocidad sin precedentes y a menor costo. Los avances tecnológicos han conducido al desarrollo de la secuenciación de nueva generación, también conocida como secuenciación masiva en paralelo; tecnologías que permiten logros clínicos trascendentales con potencial en su aplicación y que están revolucionando el diagnóstico prenatal no invasivo. Los estudios iniciales de investigación se dirigieron al aislamiento del ADN en células fetales en sangre materna. Dada la relación ~ 1:1,000,000 de células materno-fetales en la circulación fue difícil obtener resultados satisfactorios. Estudios recientes se centraron en el análisis del ADN libre en sangre materna, porque contiene cantidades apreciables de ADN fetal, presumiblemente de origen placentario.5-7 Hoy en día, se han reportado por tres metodologías datos clínicos del estudio prenatal no invasivo; estas técnicas implican detección directa de las diferencias observadas en el perfil del ADN fetal libre en sangre materna. La técnica más sencilla, secuenciación masiva en paralelo, detecta con precisión las trisomías 21 (síndrome de Down), 18 (síndrome de Edwards) y 13 (síndrome de Patau), así como la monosomía X (síndrome de Turner), con menor precisión.8-16 Un enfoque cuantitativo, denominado análisis digital de regiones selectivas, demostró mayor precisión para la detección de la T18 y T21 que la secuenciación

0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0

Al nacer

Segundo trimestre

47,XYY

47,XXY

Trisomía 13

47,XXX

45,X

Trisomía 18 Trisomía 21

Figura 1. Prevalencia de anormalidades cromosómicas.

Reproducción

Detección de aneuploidías mediante ADN fetal libre en sangre materna

estudio penatal no invasivo para la detección de aneuploidías: alcance, precisión y costo. Alcance

La mayor parte de los métodos de estudio prenatal no invasivo se centran en detectar trisomías autosómicas (T21, T18, T13), ya que son más fáciles de detectar por ser fenotípicamente más severas. Sin embargo, estas trisomías representan aproximadamente sólo la mitad de las anormalidades cromosómicas al nacimiento y, más aún, sólo una pequeña fracción durante el segundo trimestre de embarazo, que es cuando se realizan las pruebas de tamizaje de aneuploidías. El alcance más amplio de los métodos de estudio prenatal no invasivo se logrará cuando revelen las diferentes anomalías cromosómicas diagnosticadas mediante los métodos invasivos. Precisión

La precisión se evalúa típicamente como la especificidad, que es la medida de evitar falsos positivos, y la sensibilidad, que es la manera de evitar falsos negativos. Los estudios con alta especificidad son óptimos para evitar seguimientos innecesarios mediante procedimientos invasivos, mientras que los estudios con alta sensibilidad son mejores para evitar nacimientos con alteraciones cromosómicas. Los estudios tradicionales miden con precisión global basada en datos de grandes ensayos clínicos; mientras más avanzada es la prueba, puede calcular con mayor exactitud el estudio específico. Dado que la detección de aneuploidías mediante ADN depende de la posibilidad de medir el ADN fetal, existe una estrecha correlación entre la fracción de ADN fetal en el plasma materno y la exactitud del diagnóstico. Al tiempo de que se realiza la mayor parte de tamizaje prenatal, el promedio de la fracción fetal es entre 10 y 15%; sin embargo, en cualquier edad gestacional, la fracción fetal varía de paciente a paciente, aproximadamente en orden de magnitud, por tanto, la edad gestacional en sí es un mal sustituto para la exactitud. (Note que los diferentes métodos de medición proporcionan diferentes, pero autoconsistentes, números para la fracción fetal; por ejemplo, entre 2 y 20% o entre 4 y 40%). Mediciones directas de la fracción fetal pueden proporcionar mayor precisión al estimar la exactitud Volumen 6, núm. 2, octubre-diciembre, 2013

de cada prueba individual; si la fracción fetal es menor, mayor es la probabilidad de tener resultados erróneos. Entre mayor sea la precisión en la estimación individual de las pruebas, mejores serán la especificidad y sensibilidad del estudio, ya que los resultados de baja calidad por baja fracción fetal pueden ser marcados como “no call” y requerirán una nueva toma de sangre materna para su resultado definitivo.8,12 Costo

El costo del estudio prenatal no invasivo está determinado en función de diferentes variables, que incluyen la logística de la toma de muestras y su envío, los detalles en las técnicas de biología molecular, necesarias para la preparación de la muestra, y la medición e interpretación. Muchos de estos factores no varían significativamente entre diferentes metodologías. Actualmente, el principal factor diferenciador entre los diversos métodos se debe al número de secuencias necesarias para determinar la copia del número de cromosomas de interés; sin embargo, conforme el costo de la secuenciación se reduce, la relevancia de esta diferencia disminuirá. Secuenciación de nueva generación en el diagnóstico prenatal

El uso de esta tecnología en el diagnóstico prenatal, hasta el momento, es eficaz en la detección de aneuploidías a partir de ADN fetal presente en la sangre materna (Figura 2). Secuenciación masiva en paralelo

La secuenciación masiva en paralelo de ADN libre en sangre materna es un método preciso y confiable para la detección de aneuploidías cromosómicas fetales a partir de la semana 10 de gestación.8,14,16,31 Esta tecnología funciona al detectar mayores cantidades de ADN en el plasma materno del cromosoma fetal triploide, en comparación con los cromosomas de referencia. Un feto con trisomía tiene 50% más de material genético del cromosoma triploide, lo que resulta en aumento de 1 a 10% de la cantidad de ADN libre del cromosoma afectado en plasma materno. El ADN libre es amplificado y secuenciado, las lecturas de las secuencias son identificadas en un mapa genómico y se calcula mediante una puntuación Z, que

Sánchez Usabiaga RA y col.

ADN libre en plasma

Extracción de ADN y preparación de librería

Secuenciación de nueva generación

ATG, TTA, CAT, ATT, TCA, TAG

Conteo de secuencias por cromosoma

4 5 Comparación con grupo de muestras de referencias para determinar número de copias

+ + + C

+ 4

Figura 2. Esquema de la detección de aneuploidías fetales usando secuenciación de nueva generación. En este procedimiento se aíslan los fragmentos de ADN fetal libres en el plasma materno y se produce una librería de secuencias especiales; la librería se somete a secuenciación para determinar la secuencia de cada fragmento; las secuencias se alinean con el genoma de referencia y se identifica su localización cromosómica mediante métodos bioinformáticos; la comparación de estos datos con un banco de muestras de referencia y el uso de valores prefijados de corte (puntuación Z) permite determinar la dotación cromosómica. Adaptada de Hahn y colaboradores.32

representa el número de desviaciones estándar de la medición por encima de la media. La puntuación Z, por encima de cierto valor, típicamente entre 2.5 y 4, se reporta como positiva para la trisomía. Una ventaja de este método es que la secuenciación masiva en paralelo es sencilla de aplicar, tanto para la técnica de biología molecular, como la metodología estadística sencilla.

Como se observa en el Cuadro 1, la metodología de secuenciación masiva en paralelo muestra una precisión satisfactoria para detectar T21 y T18 debido a las concentraciones adecuadas de ADN fetal; sin embargo, la capacidad para detectar T13 y 45X es limitada.12,15,16 Esto se debe a la gran variabilidad de las secuencias en algunos cromosomas, lo que limita el alcance para reconocer con precisión las anomalías cromosómicas mediante los métodos cuantitativos. Esta limitación se agrava en las muestras extraídas en etapas gestacionales tempranas, ya que la cantidad de la fracción fetal de ADN libre es baja. Los casos de fracción de ADN fetal bajo generalmente resultarán no afectados, sesgando el resultado hacia falsos negativos y no hacia falsos positivos. Como se realiza la secuenciación masiva en paralelo, no utiliza un método para determinar la precisión específica de la prueba, que podría disminuir esta limitante. Además, esta metodología amplifica universalmente el ADN total de manera indiscriminada, a pesar de que los cromosomas 13, 18, 21, X y Y representan aproximadamente 14% del genoma. Dado que sólo un pequeño porcentaje de lectura de secuencias son relevantes para la detección de aneuploidías de los cromosomas de interés, se requieren entre 20 y 30 millones de lecturas para lograr el objetivo de precisión y es mayor a los requeridos en el análisis digital de regiones selectivas o en Parental Support®. Análisis digital de regiones seleccionadas

Este método es cualitativo y selectivamente se dirige sólo a los cromosomas de interés e incluye una amplificación específica, dirigida aproximadamente a 400 locus por cromosoma. La amplificación dirigida resulta en aumento significativo de la eficiencia de la secuenciación, requiriendo entre 100,000 y 300,000 lecturas por cromosoma en el estudio. El análisis digital de regiones seleccionadas recientemente demostró en la práctica clínica detectar con adecuada precisión T21 y T18.19 Sin embargo, como todos los métodos puramente cuantitativos, el enfoque depende de los cromosomas que tienen baja variabilidad en la amplificación, lo que limita su utilidad diagnóstica para algunos cromosomas (Cuadro 1). Reproducción

Detección de aneuploidías mediante ADN fetal libre en sangre materna

Cuadro 1. Sensibilidad y especificidad de los métodos de estudio prenatal no invasivo para detectar diversas anormalidades cromosómicas Sensibilidad Trisomía Trisomía Trisomía 13 18 21 Secuenciación ma- 91.7% siva en paralelo12,15 (11/12)

100% 98.6% (59/59) (209/212)

Secuenciación ma- 78.6% (11/14) siva en paralelo16 Análisis digital de regiones selectivas19 Parental Support®25 100% (2/2)

97.2% (35/36) 98% (49/50) 100% (3/3)

100% (89/89) 100% (50/50) 100% (12/12)

45X

Especificidad 47,XXY Trisomía 13 Trisomía 18 Trisomía 21

47,XXY

99.03% 99.70% 99.80% (1,672/1,688) (1,683/1,688) (1,468/1,471) 93.8% (15/16)

100% (1/1)

99.39% (485/488)

100% (2/2)

Parental Support®

La metodología Parental Support®, también referida como NATUS (por sus siglas en inglés de pruebas de aneuploidia de última generación con polimorfismos de nucleótido simple), es más compleja, ya que combina una amplificación selectiva multiplex, dirigida aproximadamente a 20,000 locus en cada cromosoma evaluado, aunado a un análisis estadístico avanzado. A diferencia de los métodos cuantitativos, Parental Support® se centra en la medición de polimorfismos de nucleótido único. Mediante la medición de locus polimórficos, esta metodología es capaz de extraer múltiples piezas de información –el número e identidad de cada alelo– en cada una de las secuencias leídas, por lo que Parental Support® incorpora información altamente confiable de alelos paternos y su frecuencia de entrecruzamiento de datos suficientes para establecer un modelo de hipótesis (por ejemplo, monosomías, disomías o trisomías), cada una correspondiente a los diferentes patrones de herencia genética relativos a los sitios de entrecruzamiento para cada número de copias posible. Se utiliza estadística bayesiana para asignar una probabilidad de cada hipótesis y una máxima estimación de la posibilidad para seleccionar la hipótesis más probable y calcular que la probabilidad de la hipótesis sea la correcta (Figura 3). El análisis de Parental Support® se basa en el patrón de distribución de alelos, a diferencia de los métodos cuantitativos, y compara la especificidad cromosómica con las cuentas leídas; por tanto, no sucede variabilidad en la amplificación cromosómica. Como resultado, esta Volumen 6, núm. 2, octubre-diciembre, 2013

45X

100% (135/135)

99.78% (460/461) 100% (297/297) 100% (135/135)

100% (404/404) 100% (297/297) 100% (135/135)

99.76% (416/417)

100% 100% (135/135) (135/135)

metodología es capaz de determinar el número de copias de los cromosomas fetales 13, 18, 21, X y Y, con precisión similarmente alta. Parental Support® es capaz de detectar T13, T18, T21,45X y d7 XXY sin errores; sin embargo, estos datos partieron de un estudio clínico ciego. Debido a la falta de especificidad cromosómica y a que esta metodología no requiere cromosoma de referencia, detecta trisomías de cromosomas sexuales como 47XXX y 47XYY, disomías uniparentales y triploidías.25 CONCLUSIONES La demanda creciente de técnicas de secuenciación a bajo costo condujo al desarrollo de tecnologías de secuenciación que producen miles de millones de secuencias de manera simultánea. Esta nueva tecnología pone a disposición de la medicina perinatal un excelente recurso para el diagnóstico genético antenatal, con la gran ventaja de ser no invasivo y de una elevada seguridad diagnóstica. Tres diferentes metodologías aplicadas en la práctica clínica demuestran ser precisas, confiables y capaces de detectar anomalías cromosómicas mediante la secuenciación y análisis del ADN fetal libre de células en sangre materna. Sin embargo, una de las limitantes de los métodos cuantitativos (secuenciación masiva en paralelo-análisis digital de regiones seleccionadas) es la gran variabilidad de secuencias de ciertos cromosomas, lo que limita su precisión en los resultados. La metodología Parental Support® otorga grandes ventajas para lograr una alta precisión al identificar las anomalías cromosómicas más frecuentes. La alta sensibilidad y es-

Sánchez Usabiaga RA y col.

Secuencia SNP Genotipo materno + Fetal

Plasma = ADN materno + ADN fetal

Genotipo fetal

Sangre materna Secuencia SNP Capa leucocitaria = ADN materno

Genotipo materno

Figura 3. Detección de aneuploidías mediante PS. En esta metodología la muestra de sangre materna se separa en capas mediante centrifugación; las capas están compuestas por el plasma, la capa leucocítica y los glóbulos rojos; posteriormente, la muestra se amplifica y analiza con un equipo de secuenciación que mide las variaciones genéticas de los polimorfismos de nucleótido simple (SNP) entre los genomas materno y fetal; a continuación, los datos de la secuenciación se analizan con un algoritmo específico que distingue la señal de ADN fetal, genera un informe de los cromosomas e incluye los puntajes de riesgo que incorporan exactitudes calculadas para cada cromosoma específico.

pecificidad en la detección de las trisomías 21, 18 y 13 y la monosomía X sugieren que la secuenciación masiva de ADN se puede incorporar a los algoritmos actuales para la detección de aneuploidías y de esta manera reducir los innecesarios procedimientos invasivos. REFERENCIAS 1.

Wald NJ, Rodeck C, Hackshaw AK, Walters J, et al. First and second trimester antenatal screening for Down’s syndrome: the results of the serum, urine and ultrasound screening study (SURUSS). J Med Screen 2003;10:56-104. Malone FD, Canick JA, Ball RH, Nyberg DA, et al. Firsttrimester or second-trimester screening, or both, for Downs syndrome. N Engl J Med 2005;353:2001-2011. Wald NJ, Kennard A, Hackshaw A, McGuire A. Antenatal screening for Downs syndrome. J Med Screen 1997;4:181246. Ewigman BG, Crane JP, Frigoletto FD, LeFevre ML, et al. Effect of prenatal ultrasound screening on perinatal outcome. RADIUS Study Group. N Engl J Med 1993;329:821-827. Evans MI, et al. Fetal gender and aneuploidy detection using fetal cells in maternal blood: analysis of NIFTY I data. National Institute of Child Health and Development Fetal Cell Isolation Study. Prenat Diagn 2002;22:609-615. Guetta E, Simchen MJ, Mammon-Daviko K, Gordon D, et al. Analysis of fetal blood cells in the maternal circulation:

7. 8.

10.

11.

12.

13.

14.

challenges, ongoing efforts, and potential solutions. Stem Cells Dev 2004;13:93-99. Lo YM, Chiu RW. Prenatal diagnosis: progress through plasma nucleic acids. Nat Rev Genet 2007;8:71-77. Fan HC, Blumenfeld YJ, Chitkara U, Hudgins L, et al. Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood. Proc Natl Acad Sci USA 2008;105:16266-16271. Chiu RW, Chan KC, Gao Y, Lau VY, et al. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma. Proc Natl Acad Sci USA 2008;105:20458-20463. Ehrich M, Deciu C, Zwiefelhofer T, Tynan JA, et al. Noninvasive detection of fetal trisomy 21 by sequencing of DNA in maternal blood: a study in a clinical setting. Am J Obstet Gynecol 2011;204:205-211. Liao GJ, Lun FM, Zheng YW, Chan KC, et al. Targeted massively parallel sequencing of maternal plasma DNA permits efficient and unbiased detection of fetal alleles. Clin Chem 2011;57:92-101. Palomaki GE, Kloza EM, Lambert-Messerlian GM, Haddow JE, et al. DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: an international clinical validation study. Genet Med 2011;13:913 -920. Chen EZ, Chiu RWK, Sun H, Akolekar R, et al. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal trisomy 18 and trisomy 13 by maternal plasma DNA sequencing. PLoS One 2011;6:21791. Sehnert AJ, Rhees B, Comstock D, de Feo E, et al. Optimal detection of fetal chromosomal abnormalities by massively

Reproducción

Detección de aneuploidías mediante ADN fetal libre en sangre materna

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parallel DNA sequencing of cell-free fetal DNA from maternal blood. Clin Chem 2011;57:1042-1049. Palomaki GE, Deciu C, Kloza EM, Lambert-Messerlian GM, et al. DNA sequencing of maternal plasma reliably identifies trisomy 18 and trisomy 13 as well as Down syndrome: an international collaborative study. Genet Med 2012;14:296-305. Bianchi DW, Platt LD, Goldberg JD, Abuhamad AZ, et al. Genome-wide fetal aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing. Obstet Gynecol 2012;119:890-901. Sparks AB, Wang ET, Struble CA, Barrett W, Stokowski R, McBride C, et al. Selective analysis of cell-free DNA in maternal blood for evaluation of fetal trisomy. Prenat Diagn 2012;32:3-9. Sparks AB, Struble CA, Wang ET, Song K, et al. Noninvasive prenatal detection and selective analysis of cell-free DNA obtained from maternal blood: evaluation for trisomy 21 and trisomy 18. Am J Obstet Gynecol 2012;206:319. Ashoor G, Syngelaki A, Wagner M, Birdir C, et al. Chromosome-selective sequencing of maternal plasma cell-free DNA for first-trimester detection of trisomy 21 and trisomy 18. Am J Obstet Gynecol 2012;206:322. Rabinowitz M, Banjevic M, Demko Z, Johnson DS. System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals. US patent application 2007/0184467, 2007. Rabinowitz M, Banjevic M, Demko Z, Johnson DS, et al. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number. U.S. patent application US2008/0243398, 2008. Johnson DS, Gemelos G, Baner J, Ryan A, et al. Preclinical validation of a microarray method for full molecular karyotyping of blastomeres in a 24-h protocol. Hum Reprod 2010;25:1066-1075. Rabinowitz M, Gemelos G, Banjevic M, Ryan A, Sweetkind- Singer J. Methods for allele calling and ploidy calling.

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24.

25.

26.

27.

28.

29.

30.

31.

32.

World Intellectual Property Organization Patent application, WO/2010/017214, 2010. Rabinowitz M, Gemelos G, Banjevic M, Ryan A, Demko Z, Hill M, et al. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling. World Intellectual Property Organization Patent application WO/2011/146632, 2011. Rabinowitz M, Gemelos G, Banjevic M, Zimmermann B, et al. First trimester non-invasive detection of fetal aneuploidy 13, 18, 21, and X by targeted sequencing. Presentation at ACMG Annual Clinical Genetics meeting, 2012. Chiu RW, Akolekar R, Zheng YW, Leung TY, et al. Noninvasive prenatal assessment of trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA sequencing: large scale validity study. BMJ 2011;342:7401. Jones KL. Smiths recognizable patters of human malformation. 6th ed. Philadelphia: Saunders an imprint of Elsevier Science, 2006. Simpson JL, Elias S. Genetics in obstetrics and gynecology. 3rd ed. Philadelphia: Saunders an imprint of Elsevier Science, 2003. Hook EB, Topol BB, Cross PK. The natural history of cytogenetically abnormal fetuses detected at midtrimester amniocentesis which are not terminated electively: new data and estimates of the excess and relative risk of late fetal death associated with 47,+21 and some other abnormal karyotypes. Am J Hum Genet 1989;45:855-861. Cockwell A, MacKenzie M, Youings S, Jacobs PA. Cytogenetic and molecular study of a series of 45,X fetuses and their parents. J Med Genet 1991;28:151-155. Wellesley D, Dolk H, Boyd PA, et al. Rare chromosome abnormalities, prevalence and prenatal diagnosis rates from population-based congenital anomaly registers in Europe. Eur J Human Gen 2012;20:521-526. Hahn S, Lapaire O, Tercanli S, Kolla V, et al. Determination of fetal chromomosome aberrations from fetal DNA in maternal blood: has the challenge finally been met? Expert Rev Mol Med 2011;13:16.

Reproducción 2013;6:90-96

Artículo original

Efecto del índice de masa corporal en la tasa de recién nacidos vivos en embarazos logrados por fertilización in vitro Eva Bonifacio León,1 Enrique Reyes Muñoz,2 Erika Basulto Montalvo,1 Julio Francisco de la Jara Díaz,1 Juan Carlos Barros Delgadillo,1 Álvaro Santibáñez Morales,1 Víctor Sánchez Solís1

RESUMEN

ABSTRACT

Antecedentes: en México se ha incrementado el porcentaje de parejas infértiles y, aunado a ello, el de mujeres infértiles con sobrepeso y obesidad que logran embarazos por fertilización in vitro. El sobrepeso y la obesidad se asocian con un riesgo significativamente mayor de complicaciones, como preeclampsia, diabetes mellitus gestacional, parto pretérmino, cesárea, distocia de hombros y complicaciones posparto. Objetivo: conocer la repercusión del índice de masa corporal >25 kg/m2 en la incidencia de recién nacidos vivos y los resultados perinatales adversos de mujeres con embarazos logrados por fertilización in vitro. Pacientes y método: estudio de cohorte histórica, en el que se incluyeron 156 mujeres con embarazo logrado por fertilización in vitro, que se corroboró 16 a 20 horas después con la identificación de dos pronúcleos, con control prenatal y término del embarazo en nuestra institución de enero de 2006 a diciembre de 2010. Se integraron dos grupos: grupo 1, con mujeres con índice de masa corporal < 25, y grupo 2, con mujeres con índice de masa corporal ≥ 25 al inicio del ciclo de fertilización in vitro. Resultados: se analizaron 156 mujeres que lograron el embarazo por fertilización in vitro; 77 mujeres tenían sobrepeso (índice de masa corporal 25-29.9 kg/m2) y sólo 12 mujeres tenían obesidad. Se observó una ligera tendencia de mayor proporción de aborto en el grupo 2 (20.2 vs 16.4%) y mayor incidencia de recién nacidos vivos en el grupo 1 (64.2 vs 58.4%), sin diferencia estadísticamente significativa. Conclusiones: el índice de masa corporal ≥ 25 kg/m2 no afecta la incidencia de recién nacidos vivos ni de abortos, pero sí se asocia con mayor riesgo de preeclampsia y mayor tendencia de diabetes mellitus gestacional en mujeres mexicanas que logran el embarazo por fertilización in vitro.

Background: In Mexico there has been an increased percentage of infertile couples and, besides, an increased number of infertile women with overweight and obesity reaching pregnancies by in vitro fertilization. Overweight and obesity are related to a significantly higher risk of complications, such as preeclampsia, gestational diabetes mellitus, preterm birth, cesarean section, shoulder dystocia and postpartum complications. Objective: To know the effect of body mass index ≥ 25 kg/m2 on the incidence of alive newborns and the adverse perinatal results of women with pregnancies obtained by in vitro fertilization. Patients and method: Historic cohort study including 156 women with pregnancy obtained by in vitro fertilization, and corroborated 16 to 20 hours later by identifying two pronuclei, with prenatal control and pregnancy resolution at our Institution from January 2006 to December 2010. Two groups were conformed: group 1, with women with body mass index < 25, and group 2, with women with body mass index ≥ 25 at the beginning of the in vitro fertilization cycle. Results: One hundred fifty-six women who obtained pregnancy by in vitro fertilization were included; 77 women had overweight (body mass index 25-29.9 kg/m2) and only 12 women had obesity. A mild tendency of higher proportion of abortion was observed in the group 2 (20.2% vs 16.4%) as well as a higher incidence of alive newborns in the group 1 (64.2% vs 58.4%), without statistically significant difference. Conclusions: Body mass index ≥ 25 kg/m2 does not affect incidence of alive newborns, nor incidence of abortion, but it is related to a higher risk of preeclampsia and a higher trend to gestational diabetes mellitus in Mexican women achieving pregnancy by in vitro fertilization.

Palabras clave: índice de masa corporal, recién nacidos vivos, fertilización in vitro.

Key words: body mass index, alive newborns, in vitro fertilization.

Reproducción

Efecto del índice de masa corporal en la tasa de recién nacidos vivos

a obesidad es un problema de salud pública mundial.1 En México, de acuerdo con la Encuesta Nacional de Salud y Nutrición, 70% de las mujeres en edad reproductiva tienen sobrepeso u obesidad;2 de igual manera, se ha incrementado el porcentaje de parejas infértiles y, aunado a ello, el de mujeres infértiles3 con sobrepeso y obesidad que logran embarazos por fertilización in vitro. La evidencia acerca de si el índice de masa corporal tiene un efecto adverso significativo en las tasas de embarazo y aborto espontáneo en mujeres que tratan de concebir de manera natural y por técnicas de reproducción asistida es abundante, aunque inconsistente, entre los diversos autores.4,5 La situación es menos clara entre las mujeres que se someten a fertilización in vitro.6 Una serie de publicaciones señala que el aumento en el índice de masa corporal se asocia con un periodo más largo para lograr el embarazo y más riesgo de aborto espontáneo en mujeres que se someten a fertilización in vitro.5,7 El exceso de peso se asocia con desarrollo folicular insuficiente, menor número de ovocitos capturados, aumento de los requerimientos de gonadotropinas, menor tasa de implantación y de embarazo.3,4,7,8 La repercusión del sobrepeso y la obesidad se estudia ampliamente en mujeres que logran el embarazo de manera espontánea y se asocia con un riesgo significativamente mayor de complicaciones, como preeclampsia,

Subdirección de investigación en salud reproductiva. Médico investigador adscrito a la Coordinación de Endocri nología. Instituto Nacional de Perinatología Isidro Espinosa de los Reyes, México, Distrito Federal.

1 2

Correspondencia: Dra. Eva Bonifacio León. Instituto Nacional de Perinatología Isidro Espinosa de los Reyes, Área de Biología de la Reproducción. Montes Urales 800, colonia Lomas Virreyes, CP 11000, México, DF. Recibido: junio 2013. Aceptado: septiembre 2013. Este artículo debe citarse como: Bonifacio-León E, ReyesMuñoz E, Basulto-Montalvo E, De la Jara-Díaz JF y col. Efecto del índice de masa corporal en la tasa de recién nacidos vivos en embarazos logrados por fertilización in vitro. Reproducción (México) 2013;6:90-96. www.nietoeditores.com.mx

Volumen 6, núm. 2, octubre-diciembre, 2013

diabetes mellitus gestacional, parto pretérmino, cesárea, distocia de hombros y complicaciones posparto.9,10 Existen pocos reportes en la bibliografía acerca de la repercusión del índice de masa corporal en los resultados perinatales de mujeres con embarazos logrados por fertilización in vitro y la información en mujeres mexicanas es casi nula. PACIENTES Y MÉTODO Estudio de cohorte histórica, en el que se incluyeron 156 mujeres con embarazo logrado por fertilización in vitro (fertilización in vitro y trasferencia embrionaria o microinyección intracitoplasmática) con control prenatal y término del embarazo en nuestra institución, de enero de 2006 a diciembre de 2010. Se incluyeron mujeres con fracción beta de hormona gonadotropina coriónica (hGC) positiva >20 mUI/mL, dos semanas después de la transferencia de embriones, y se integraron dos grupos basados en el índice de masa corporal: grupo 1, mujeres con índice de masa corporal < 25, y grupo 2, mujeres con índice de masa corporal ≥ 25 al inicio del ciclo de fertilización in vitro. El procedimiento de fertilización in vitro en el instituto se describió previamente:11 se administran anovulatorios orales durante 21 o más días, se usa protocolo largo de agonistas (acetato de leuprolide) o antagonistas de hormona liberadora de gonadotropina en esquema flexible (cetrorelix), se realiza ultrasonido transvaginal basal el día 2-3 del ciclo y a partir del día 7-8, seguimiento folicular cada 24-48 horas, hasta el día del disparo con hGC, que se realiza cuando se observan tres o más folículos ≥ 18 mm de diámetro y determinación de estradiol > 500 pg/mL; se administran 10,000 UI de hGC urinaria o 250 μg de hGC recombinante, los ovocitos se recuperan por vía transvaginal, guiada por ultrasonido, después de 34 a 36 horas de la aplicación de hGC. La fertilización in vitro se realiza de manera convencional o por microinyección intracitoplasmática y se corrobora 16 a 20 horas después con la identificación de dos pronúcleos. Cuando se comprueba la fertilización, se hace el cultivo de los preembriones y se valora la segmentación cada 24 horas, hasta la transferencia de los mismos, que se realiza 72 horas después de la recuperación. El soporte de la fase lútea se inicia a partir del día de recuperación de los ovocitos, con la administración

Bonifacio León E y col.

de progesterona vaginal o intramuscular; dos semanas posteriores a la transferencia se realiza la determinación de la fracción beta de la hCG; si es positiva, se considera embarazo bioquímico, y dos semanas después de la determinación de hGC positiva se realiza ultrasonido endovaginal para determinar si existe embarazo clínico (presencia de saco gestacional con o sin embrión). Todas las mujeres con embarazo clínico se remiten al departamento de Obstetricia para control prenatal, con valoración cada cuatro semanas, hasta las 32 semanas de embarazo; posteriormente, cada dos semanas, hasta las 36 semanas, y luego cada semana, hasta el término del embarazo, de acuerdo con las normas institucionales. A su ingreso a control prenatal, a todas las mujeres se les realizaron los exámenes prenatales básicos: biometría hemática completa, glucosa, urea, creatinina, ácido úrico, examen general de orina, grupo sanguíneo y fenotipo Rh, VDRL y al menos un ultrasonido obstétrico por cada trimestre de embarazo. En cada consulta se documentó el peso, la presión arterial, la vitalidad, la actividad uterina, los datos clínicos de amenaza de parto pretérmino, preeclampsia, infecciones genitourinarias, rotura prematura de membranas u otras complicaciones perinatales. La edad de cada paciente se tomó como los años cumplidos al momento de la fertilización in vitro. El índice de masa corporal se calcula al dividir el peso en kilogramos entre la talla en metros cuadrados, usando los datos registrados al momento del inicio del ciclo de fertilización in vitro. Variables de desenlace

Como desenlace primario se consideró la incidencia de recién nacidos vivos y como secundario se analizaron la incidencia de embarazo bioquímico (fracción beta de hCG positiva, sin desarrollo posterior de saco gestacional), incidencia de abortos (presencia de saco gestacional con o sin embrión y término antes de las 20 semanas de gestación), embarazos ectópicos, amenaza de aborto, rotura prematura de membranas, nacimiento pretérmino, insuficiencia ístmico-cervical, diabetes mellitus gestacional, preeclampsia, hemorragia obstétrica, vía de término del embarazo y peso de los recién nacidos; todo esto definido de acuerdo con la norma institucional.12

Tamaño de la muestra

Para encontrar una diferencia de 25% en la incidencia de recién nacidos vivos entre los grupos 1 y 2, con alfa de 0.05 y beta de 0.20, se estimó un tamaño de muestra de 62 mujeres por grupo, por lo que se decidió analizar a todas las embarazadas en el periodo de estudio. Análisis estadístico

Se realizó un análisis descriptivo con las medidas de tendencia central y de dispersión para variables continuas y frecuencias con porcentajes para variables cualitativas. Las variables cuantitativas se compararon con la prueba t de Student o U de Mann-Whitney para muestras independientes, de acuerdo con la distribución de cada variable. Las variables cualitativas se compararon con la prueba c2 o exacta de Fisher cuando el resultado esperado por episodio fue menor de cinco casos. Se consideró significativo un valor de p ≤ 0.05. El análisis se realizó con el programa SPSS, versión 15. RESULTADOS Se analizaron 156 mujeres que lograron el embarazo por fertilización in vitro; grupo 1 (n=67) y grupo 2 (n=89); de este último grupo, 77 mujeres (86.5%) tenían sobrepeso (índice de masa corporal 25-29.9 kg/m2) y sólo 12 mujeres (13.5%) tenían obesidad. En el Cuadro 1 se muestran las características basales de ambos grupos; el índice de masa corporal promedio fue significativamente mayor en el grupo 2 (27.6 ± 1.9) vs el grupo 1 (22.9 ± 1.6, p=0.0001). No hubo diferencias significativas entre ambos grupos en cuanto a edad, tiempo y tipo de infertilidad, fertilización in vitro y transferencia embrionaria, microinyección intracitoplasmática, indicaciones de fertilización in vitro y morbilidad asociada. En el Cuadro 2 se exponen las características bioquímicas con la hormona folículo-estimulante, hormona luteinizante, estradiol basal y al momento del disparo de hCG, número de folículos >18 mm y número de ovocitos recuperados, así como el día del disparo, mismas que fueron similares en ambos grupos. De 156 embarazos bioquímicos iniciales hubo 133 embarazos clínicos, 58 en el grupo 1 y 75 en el grupo 2. En relación con el número de productos, en el grupo 1 fueron 38 embriones únicos (65.5%), 12 gemelares Reproducción

Efecto del índice de masa corporal en la tasa de recién nacidos vivos

Cuadro 1. Características clínicas al inicio del ciclo de fertilización in vitro en ambos grupos de estudio

Característica

Edad (años) Índice de masa corporal Tiempo de infertilidad (años) Infertilidad primaria Infertilidad secundaria Fertilización in vitro y transferencia embrionaria Microinyección intracitoplasmática Indicación de fertilización in vitro Factor tuboperitoneal Factor masculino Inseminaciones sin éxito Otras Morbilidad asociada Edad materna de riesgo (≥35) Endometriosis Síndrome de ovarios poliquísticos Hipotiroidismo Hiperprolactinemia Miomatosis uterina

Grupo 1 IMC <25, n=67

Grupo 2 IMC ≥25, n=89

33.04 ± 3.38 22.9 ± 1.6 7.07 ± 3.39 41 (61.2) 26 (38.8) 46 (68.7) 21 (31.3)

33.7 ± 4.07 27.6 ± 1.9 7.4 ± 3.42 49 (55.1) 40 (44.9) 68 (76.4) 21 (23.6)

0.25 0.0001 0.46 0.44 0.44 0.28 0.28

34 (50.7) 16 (23.9) 12 (17.9)

52 (58.4) 15 (16.9) 9 (10.1)

0.42 0.37 0.24

5 (7.5)

13 (14.6)

0.25

25 (37.5) 10 (15.9) 10 (15.9) 9 (14.3) 13 (19.4) 2 (3)

40 (44.9) 15 (17.2) 15 (17.2) 16 (18.4) 9 (10.1) 3 (3.4)

0.33 0.82 0.69 0.50 0.07 1

Valores expresados en media ± desviación estándar o frecuencia y porcentaje. *T de student, c2 o prueba exacta de Fisher.

Cuadro 2. Características bioquímicas del ciclo de fertilización in vitro Característica

Hormona folículo-estimulante basal Hormona luteinizante basal Estradiol basal Estradiol el día del disparo Folículos mayores de 18 mm Ovocitos recuperados Día del disparo

Grupo 1 IMC <25, n=67

Grupo 2 IMC ≥25, n=89

6.30 ± 2.75 3.68 ± 2.31 32.28 ± 17.21 2,401.43 ± 1,405 18.32 ± 11.29 13.56 ± 7.58 12.13 ± 1.16

6.03 ± 2.55 3.37 ± 1.97 34.14 ± 20.67 2,195 ± 1,392 20.42 ± 36.97 13.03 ± 7.68 12.05 ± 1.17

0.51 0.36 0.55 0.35 0.65 0.66 0.68

Valores expresados en media ± desviación estándar. *prueba T de student o U de Mann Withney.

(20.7%), siete triples (12.1%) y uno cuádruple (1.7%). En el grupo 2 hubo 54 embarazos únicos (72%), 16 gemelares (21.3%), cuatro triples (5.3%) y uno cuádruple (1.3%), sin diferencias significativas entre ambos grupos.

Volumen 6, núm. 2, octubre-diciembre, 2013

En el Cuadro 3 se resume el desenlace del embarazo; se observa una ligera tendencia de mayor proporción de aborto en el grupo 2 (20.2 vs 16.4%) y mayor incidencia de recién nacidos vivos en el grupo 1 (64.2 vs 58.4%), sin diferencia estadísticamente significativa. Las inci-

Bonifacio León E y col.

Cuadro 3. Desenlace de embarazos logrados por fertilización in vitro en mujeres mexicanas de acuerdo con el índice de masa corporal Desenlace

Embarazo bioquímico Embarazo clínico Aborto Ectópico Óbito Recién nacido vivo

Grupo 1 IMC <25, n=67

Grupo 2 IMC ≥25, n=89

9 (13.4) 58 (86.6) 11 (16.4) 3 (4.5) 1 (1.5) 43 (64.2)

14 (15.7) 75 (84.3) 18 (20.2) 4 (4.5) 1 (1.2) 52 (58.4)

0.68 0.86 0.54 1 0.94 0.46

Valores expresados en frecuencia y porcentaje. *c2 o prueba exacta de Fisher.

dencias de embarazo bioquímico y embarazo ectópico fueron similares en los dos grupos. En el Cuadro 4 se muestran las complicaciones perinatales en ambos grupos de estudio. Únicamente se analizaron 40 mujeres en el grupo 1 y 50 mujeres en el grupo 2, se excluyeron las pacientes con término del embarazo antes de la semana 20 (embarazos bioquímicos, ectópicos y abortos) y siete pérdidas de seguimiento, cuatro en el grupo 1 y tres en el grupo 2. Llama la atención la alta frecuencia de diabetes mellitus gestacional: 17.5 y 34% para los grupos 1 y 2, respectivamente, con tendencia a ser mayor en el grupo 2, pero sin diferencia estadísticamente significativa. La incidencia de preeclampsia fue significativamente mayor en el grupo 2 vs Cuadro 4. Resultados perinatales en embarazos logrados con fertilización in vitro y término mayor a 20 semanas de gestación Resultado

Diabetes mellitus gestacional Preeclampsia Hemorragia obstétrica Nacimiento pretérmino Parto inmaduro Incompetencia ístmico-cervical Rotura prematura de membranas Hiperestimulación ovárica

Grupo 1 Grupo 2 IMC <25, IMC ≥25, n=40 n=50 7 (17.5) 4 (10) 0 14 (35) 2 (5) 2 (5) 6 (15) 3 (7.5)

Valores expresados en frecuencia y porcentaje. *c2 o prueba exacta de Fisher.

17(34) 14 (28) 2 (4) 19 (38) 1 (2) 6 (12) 2 (4) 0

0.07 0.03 0.50 0.88 0.84 0.45 0.13 0.08

el grupo 1 (p=0.03). No hubo diferencias en el resto de los resultados perinatales. DISCUSIÓN El índice de masa corporal ≥ 25 kg/m2 no afectó la incidencia de recién nacidos vivos; si bien se reportó una frecuencia de 5.8% mayor de recién nacidos vivos en el grupo de mujeres con peso normal, de conservarse esta diferencia, para que fuera significativa, sería necesario evaluar a 850 mujeres en cada grupo, lo que es dificil de reunir en nuestra institución, debido a que la mayoría de las pacientes que se someten a técnicas de fertilización in vitro deben tener un índice de masa corporal cercano al normal. Nuestros hallazgos son similares a lo reportado en un estudio reciente que incluyó 1,721 mujeres que no encontró diferencias en la tasa de embarazo clínico y recién nacidos vivos al comparar mujeres con peso normal contra mujeres con sobrepeso (índice de masa corporal 25-29.9 kg/m2) u obesidad grado I (índice de masa corporal 30-34.9 kg/m2); sin embargo, se reportó menor número de ovocitos fertilizados y menor concentración de estradiol al momento del disparo en mujeres con obesidad grado II (índice de masa corporal 35-39.9 kg/m2) y obesidad grado III (índice de masa corporal: ≥40 kg/m2). Ademas, se reportó reducción significativa de embarazos clínicos (OR 0.50, IC 95% 0.31-0.82) y menor tasa de recién nacidos vivos (OR 0.51, IC 95% 0.29-0.87) en mujeres con obesidad grado III.13 La incidencia de embarazos bioquímicos y ectópicos fue similar en ambos grupos; asimismo, no se observó diferencia entre los grupos en cuanto a los días de estimulación y ovocitos recuperados, similar a lo reportado por Vilarino y colaboradores14 y contrario a lo reportado por Dechaud y su grupo15 y Zhang y colaboradores.16 En este estudio no se encontró evidencia de mayores probabilidades de aborto en mujeres con índice de masa corporal ≥ 25 kg/m2 que lograron el embarazo por fertilización in vitro, lo que parece indicar que el índice de masa corporal no tiene efecto en la receptividad uterina y coincide con lo reportado por otros autores.15,17,18 La información disponible en la bibliografía es inconsistente respecto al mecanismo por el que la obesidad podría afectar la reproducción; algunas revisiones reReproducción

Efecto del índice de masa corporal en la tasa de recién nacidos vivos

cientes sugieren que el efecto de la obesidad es mediado por mecanismos moleculares que actúan a múltiples niveles del proceso reproductivo, incluyendo el ovocito, el embrión y el endometrio.19,20 Respecto a los resultados perinatales adversos, el índice de masa corporal ≥ 25 kg/m2 se asoció con mayor incidencia de diabetes mellitus gestacional y preeclampsia, en comparación con las mujeres de peso normal, similar a lo reportado en embarazos logrados de manera espontánea.11,21 La obesidad y el sobrepeso son factores independientes de preeclampsia y de diabetes mellitus gestacional,3 los defectos metabólicos subyacentes relacionados se atribuyen a la disminución en la sensibilidad a la insulina, junto con una respuesta deficiente de la misma; se reporta que durante el embarazo existe disminución de 50 a 60% en la sensibilidad a la insulina, que es aún mayor en mujeres con sobrepeso u obesidad.22 En cuanto a la preeclampsia, las mujeres obesas tienen prevalencia de 10 a 15% en la poblacion general y se observa una estrecha relación con la globulina transportadora de hormonas sexuales y la adiponectina como marcadores de resistencia a la insulina y predisposicion a preeclampsia.22 Sin embargo, en este estudio se encontró una frecuencia mucho mayor (28%), que podría explicarse por la comorbilidad propia de mujeres con infertilidad; entre ellas, edad o ser primigestas, aunado a un índice de masa corporal ≥ 25 kg/m2. Respecto a la diabetes mellitus gestacional, se observa una alta incidencia en ambos grupos, muy por encima del 5% reportado en mujeres mexicanas con peso normal y mayor a 8 y 19.5% en mujeres mexicanas sin infertilidad, con sobrepeso y obesidad, respectivamente.23 La alta incidencia de diabetes mellitus gestacional podría estar relacionada no sólo con el índice de masa corporal ≥ 25 kg/m2, sino también con otros factores, como resistencia a la insulina, edad, grupo étnico, tamizaje universal para detectar diabetes mellitus gestacional y que no todas las pacientes recibieron alguna intervención para disminuir el riesgo en nuestra población de estudio. Estudios recientes demuestran que el índice de masa corporal pregestacional se asocia con diabetes mellitus gestacional, más que la ganancia de peso durante el embarazo.24,25 No observamos diferencias entre los grupos en otras complicaciones, como nacimiento Volumen 6, núm. 2, octubre-diciembre, 2013

pretérmino, parto inmaduro, hemorragia obstétrica y rotura prematura de membranas. Nuestro estudio tuvo ciertas limitaciones, como el diseño, el carácter retrospectivo y el tamaño de la muestra, relativamente limitado. Sin embargo, aportó datos importantes acerca de los posibles riesgos y complicaciones asociados con iniciar un embarazo logrado por fertilización in vitro con un índice de masa corporal ≥ 25 kg/m2 en la población mexicana. Debido a que el sobrepeso y la obesidad son problemas de salud pública en México, es importante que los médicos dedicados a la reproducción den información apropiada a las parejas con sobrepeso u obesidad que desean un embarazo acerca de los posibles riesgos durante el mismo a fin de que idealmente se sometan a una técnica de fertilización in vitro con un índice de masa corporal más cercano al normal. CONCLUSIONES El índice de masa corporal ≥25kg/m 2 no afecta la incidencia de recién nacidos vivos ni de abortos; sin embargo, sí se asocia con mayor riesgo de preeclampsia y mayor tendencia de diabetes mellitus gestacional en mujeres mexicanas que logran el embarazo por fertilización in vitro. Por ello, es necesaria la adecuada evaluación y tratamiento multidisciplinario para que las mujeres infértiles que se someten a procedimientos de fertilización in vitro lo hagan con un índice de masa corporal cercano al normal.

REFERENCIAS 1.

3. 4.

Arellano S, Bastarrachea R, Bourges H. La obesidad en México, posición de la Sociedad Mexicana de Nutrición y Endocrinología. Rev Endocrinol Nutr 2010;12:80-87. Olaiz-Fernández G, Rivera-Dommarco J, Shamah-Levy T, Rojas R, et al. Encuesta Nacional de Salud y Nutrición 2006. Cuernavaca: Instituto Nacional de Salud Pública, 2006. Maheshwari A. Overweight and obesity in infertility: cost and consequences. Human Reprod Update 2010;16:229-230. Norman RJ, Chura LR, Robker RL. Effects of obesity on assisted reproductive technology outcomes. Fertil Steril 2008;89:1611-1612. Orvieto R, Meltcer S, Nahum R, Rabinson J, et al. The influence of body mass index on in vitro fertilization outcome. Int J Gynecol Obstet 2009;104:53-55.

Bonifacio León E y col.

9. 10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

Martinuzzi K, Ryan S, Luna M, Copperman A. Elevated body mass index (BMI) does not adversely affect in vitro fertilization outcome in young women. J Assist Reprod Genet 2008;25:169-175. Bellver J, Melo M, Bosch E, Serra V, et al. Obesity and poor reproductive outcome: the potential role of the endometrium. Fertil Steril 2007;88:446-451. Kupka MS, Gnoth C, Buehler K, Dahncke W, et al. Impact of female and male obesity on IVF/ICSI: results of 700,000 ARTcycles in Germany. Gynecol Endocrinol 2011;27:144-149. Yogev Y, Catalano P. Pregnancy and obesity. Obstet Gynecol Clin N Am 2009;36:285-300. American College Obstetrics and Gynecology. Committee opinion. Obesity in pregnancy. Obstet Gynecol 2005;106:671-675. Barros JC, Alvarado L, Gorbea C, Villalobos S, et al. Resultados perinatales de embarazos por fertilización in vitro con transferencia de embriones (FIVTE): un estudio de casos y controles. Ginecol Obstet Mex 2006;74:626-639. Instituto Nacional de Perinatología. Normas y procedimientos de ginecología y obstetricia. Ed. Marketing y Publicidad de México, 2003. Shah D, Missmer S, Berry K, Racowsky C, et al. Effect of Obesity on Oocyte and Embryo Quality in Women Undergoing In Vitro Fertilization. Obstet Gynecol 2011;118:63-70. Vilarino FL, Blanco B, Christofolini DM, Barbosa CP. Impact of body mass index on in vitro fertilization outcomes. Rev Bras Ginecol Obstet 2010;32:536-540. Dechaud H, Anahory T, Reyftmann L, Loup V, et al. Obesity does not adversely affect results in patients who are undergoing in vitro fertilization and embryo transfer. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2006;127:88-93. Zhang D, Zhu Y, Gao H. Overweight and obesity negatively affect the outcomes of ovarian stimulation and in vitro fer-

17.

18.

19.

20.

21.

22. 23.

24.

25.

tilization: a cohort study of 2628 Chinese women. Gynecol Endocrinol 2010;26:325-332. Metwally M, Ong KJ, Ledger WL, Phil D, et al. Does high body mass index increase the risk of miscarriage after spontaneous and assisted conception? A meta-analysis of the evidence. Fertil Steril 2008;90:714-726. Li Y, Yang D, Zhang Q. Impact of overweight and underweight on IVF treatment in Chinese women. Gynecol Endocrinol 2010;26:416-422. Michalakis KG, Segars JH. The role of adiponectin in reproduction: from polycystic ovary syndrome to assisted reproduction. Fertil Steril 2010;94:1949-1957. Jungheim ES, Moley KH. Current knowledge of obesity’s effects in the pre- and periconceptional periods and avenues for future research. Am J Obstet Gynecol 2010;203:525-530. Weiss JL, Malone FD, Emig D, Ball RH, et al. Obesity, obstetric complications and cesarean delivery rate -a population-based screening study. Am J Obstet Gynecol 2004;190:1091-1097. Catalano P. Obesity, insulin resistance, and pregnancy outcome. Reproduction 2010;140:365-371. Reyes E, Martínez N, Parra A, Castillo-Mora A, OrtegaGonzález C. Early intensive obstetric and medical nutrition care is associated with decreased prepregnancy obesity impact on perinatal outcomes. Gynecol Obstet Invest 2011 DOI:10.1159/000329899. Herring SJ, Oken E, Rifas-Shiman SL, Rich-Edwards JW, et al. Weight gain in pregnancy and risk of maternal hyperglycemia. Am J Obstet Gynecol 2009;201:61. Saldana TM, Siega-Riz AM, Adair LS, Suchindran C. The relationship between pregnancy weight gain and glucose tolerance status among black and white women in central North Carolina. Am J Obstet Gynecol 2006;195:1629-1635.

Reproducción

Reproducción 2013;6:97-103

Artículo original Determinación del efecto de la temperatura en la reacción acrosomal espontánea en muestras seminales previas a procedimientos de reproducción asistida Paloma Neri Vidaurri,1 Víctor Torres Flores,2 Alberto Vielma Valdez,1 Ranferi Gaona Arreola1

RESUMEN

ABSTRACT

Antecedentes: la capacitación espermática es un proceso dependiente del calcio y se relaciona con una cascada de cambios bioquímicos. El espermatozoide, ya capacitado, puede responder a los receptores de la zona pelúcida e incrementar aún más la concentración de calcio intracelular y con altas concentraciones de progesterona en el aparato genital femenino se induce la reacción acrosomal. Objetivo: determinar el efecto de la temperatura de incubación en la reacción acrosomal espontánea en muestras seminales capacitadas previas a procedimientos de reproducción asistida. Material y método: estudio prospectivo con muestras de semen obtenidas de 10 pacientes normoespérmicos con tres a seis días de abstinencia sexual; se usó el marcador óptico fluorescente fura ff-AM que permite detectar el incremento de calcio intracelular. Cada muestra se dividió en dos fracciones iguales: muestras capacitadas incubadas a temperatura ambiente (25°C) y muestras capacitadas incubadas a 37°C. Resultados: no hubo diferencia significativa en la tasa de reacción acrosomal espontánea entre muestras seminales capacitadas mantenidas a temperatura ambiente y las incubadas a 37°C, aun después de cuatro horas de la capacitación; sin embargo, la reacción acrosomal espontánea tendió levemente a ser mayor en muestras incubadas a 37°C, porque después de la adición de progesterona, el influjo de calcio fue menor. Conclusiones: si bien la temperatura es importante para la capacitación espermática, no lo es para la reacción acrosomal, de manera que los espermatozoides mantenidos a 25°C tienen la misma probabilidad de realizar una reacción acrosomal que los incubados a 37°C.

Background: Sperm capacitation is a calcium dependentprocess and is related to a cascade of biochemical changes. Capacitated sperm may respond to receptors of zona pellucida and increase even more the intracellular calcium level and with high levels of progesterone in the female genital tract acrosomal reaction is induced. Objective: To determine the effect of incubation temperature on the spontaneous acrosomal reaction in capacitated seminal samples before assisted reproduction procedures. Material and method: A prospective study was done with semen samples obtained from 10 normosperm patients with three to six days of sexual abstinence; fura ff-AM fluorescent optical marker was used, which is able to detect the increased intracellular calcium. Each sample was divided into two equal fractions: capacitated samples incubated at environment temperature (25ºC) and capacitated samples incubated at 37ºC. Results: There was no significant difference in the spontaneous acrosomal reaction rate between capacitated seminal samples maintained at environment temperature and those incubated at 37ºC, even after four hours of capacitation; however, spontaneous acrosomal reaction tended slightly to be higher in samples incubated at 37ºC, because after progesterone addition, calcium influx was lower. Conclusions: Even though temperature is important for sperm capacitation, it is not for acrosomal reaction; thus sperm maintained at 25ºC have the same probability to do an acrosomal reaction that those incubated at 37ºC.

Palabras clave: reacción acrosomal espontánea, temperatura, muestras seminales, reproducción asistida.

Key words: spontaneous acrosomal reaction, temperature, seminal samples, assisted reproduction.

Centro Especializado en Esterilidad y Reproducción Humana, Hospital Ángeles México, México, DF. Departamento de Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México, Ciudad Universitaria, México, DF.

Correspondencia: Centro de Reproducción CEERH. Agrarismo 208, primer piso, Torre A, colonia Escandón, CP 11800, México, DF. Correo electrónico: aemm50@ceerh.com.mx

Volumen 6, núm. 2, octubre-diciembre, 2013

Recibido: junio 2013. Aceptado: agosto 2013. Este artículo debe citarse como: Neri-Vidaurri P, Torres-Flores V, Vielma-Valdez A, Gaona-Arreola R. Determinación del efecto de la temperatura en la reacción acrosomal espontánea en muestras seminales previas a procedimientos de reproducción asistida. Reproducción (México) 2013;6:97-103. www.nietoeditores.com.mx

Neri Vidaurri P y col.

n el espermatozoide humano, la modulación de la concentración del calcio intracelular ([Ca2+]i) es fundamental para entender los mecanismos implicados en la fisiología del espermatozoide, como la capacitación espermática y la reacción acrosomal.1 La capacitación espermática es un proceso dependiente del calcio y está relacionado con una cascada de cambios bioquímicos: incremento en el contenido de AMPc (adenosin-monofosfato-cíclico), consecuente activación de la proteína cinasa A (PKA) e incremento de la actividad de la proteína tirosina cinasa (PTK). Durante el proceso también hay una pequeña, pero consistente alcalinización del pH intracelular de ~0.14 unidades y elevación de la concentración de calcio intracelular (Figura 1).2,3 Una vez capacitado el espermatozoide, es capaz de responder a los receptores de la ZP3 (zona pelúcida) e incrementar aún más la concentración de calcio intracelular y con altas concentraciones de progesterona en el aparato genital femenino, consecuentemente se induce la reacción acrosomal; proceso que permite al espermatozoide cruzar la zona pelúcida, fusionarse con el oolema del ovocito y liberar su contenido al citoplasma; las mitocondrias y el flagelo serán degradados, mientras que el resto de los componentes tendrán una importante función en la concepción (Figura 2).2,4 La capacitación espermática se realiza in vitro, bajo protocolos establecidos, que incluyen la incubación de los espermatozoides capacitados a temperatura corporal, previa a los procedimientos de reproducción asistida. Diferentes estudios demuestran que la temperatura de incubación en muestras capacitadas tiene un efecto modulador en la movilidad espermática y en la reacción acrosomal espontánea,6-10 que ocurre en el hámster entre 30 y 60%, en ratones en 30 a 35%10,11 y en 20 a 25% en humanos.12 Una reacción acrosomal prematura en espermatozoides capacitados compromete su capacidad para reconocer la zona pelúcida con pérdida de su movilidad y viabilidad y, por tanto, de fertilización. Sin embargo, el efecto de la temperatura de incubación en la reacción acrosomal espontánea en espermatozoides humanos capacitados está poco estudiado desde el punto de vista de la modulación de la concentración del calcio intracelular.

Se sabe que en los mecanismos de entrada de calcio (Ca2+) inducidos por la zona pelúcida se produce un flujo iónico que provoca una despolarización y un pico de calcio en milisegundos en espermatozoides capacitados y, consecuentemente, en la apertura de canales de calcio dependientes de voltaje tipo T (CCDV-T).12-14 Estos canales se detectaron en espermatozoides incubados con el marcador óptico fura 2, en los que se observó un incremento en el calcio intracelular inducido por la despolarización con potasio.15 Estos canales se inactivan en 90 segundos en un medio sin calcio,15 se estimulan al alcalinizar el pH intracelular16 y durante la capacitación espermática.17 MATERIAL Y MÉTODO Estudio prospectivo con muestras de semen de 10 pacientes normoespérmicos con tres a seis días de abstinencia sexual, obtenidas, bajo consentimiento informado, en el Centro Especializado en Esterilidad y Reproducción Humana del Hospital Ángeles en la Ciudad de México. Se utilizó el marcador óptico fluorescente fura ff-AM, que permite detectar el incremento de calcio intracelular y reactivos de Sigma-Aldrich; se usó un medio para esperma humano con buffer de Hepes (H-HSM), diseñado por Suárez y colaboradores.4 Purificación de las muestras, carga con el marcador fluorescente y capacitación

La obtención de espermatozoides se realizó por medio de la técnica de Percoll (75/50% en 150 mM NaCl+10 mM Hepes pH 7.4, H-HSM), de acuerdo con Suárez y colaboradores,4 con algunas modificaciones establecidas en el laboratorio de biomembranas del Departamento de Farmacología de la Facultad de Medicina de la UNAM.18,19 Cada muestra se dividió en dos fracciones iguales: a) muestras capacitadas incubadas a temperatura ambiente (25°C) y b) muestras capacitadas incubadas a 37°C. Para cada grupo se realizaron tres mediciones: basal (control), dos horas poscapacitación y cuatro horas poscapacitación. Para las mediciones del calcio intracelular, las muestras se incubaron con 5 mM de fura ff en 1 mL de medio H-HSM, a temperatura ambiente y a 37°C durante 40 Reproducción

Efecto de la temperatura en la reacción acrosomal espontánea en muestras seminales

Figura 1. En la capacitación espermática inicialmente existe un eflujo de colesterol de la membrana plasmática en presencia de albúmina que permite la entrada de calcio y HCO3, que estimula la adelinato ciclasa soluble elevando las concentraciones de ATP, mismas que por medio de fosfodiesterasas aumentan las concentraciones de AMP cíclico que a su vez estimulan a una proteína cinasa A, y ésta, a una proteína tirosina cinasa. Modificada de la referencia 2.

minutos. Las muestras se lavaron por centrifugación y el botón celular se resuspendió con 3 mL de medio HHSM, a temperatura ambiente y a 37°C para cada grupo, respectivamente. Para medir el pH intracelular, los espermatozoides ya cargados con fura ff también se cargaron con 1 mM BCECF-AM durante 30 minutos, adicionado junto con fura ff-AM 10 minutos antes de terminar el tiempo de incubación. Estudio del influjo de calcio dependiente del voltaje Las muestras incubadas con fura ff se colocaron en una celdilla óptica, en donde las condiciones de temperatura se mantuvieron de la misma manera: a temperatura ambiente Volumen 6, núm. 2, octubre-diciembre, 2013

y a 37°C. Bajo constante agitación magnética y un minuto después de iniciado el registro de fluorescencia, 4 µM de progesterona, concentración similar a la encontrada en las células del cúmulo, fueron adicionados y el registro se observó durante más de un minuto; esto se realizó en ambas condiciones de temperatura, excepto el control. La fluorescencia se midió en un fluorómetro PTI (Photon Technology International), con un filtro de interferencia óptica de 488 nm, excitándose alternativamente a 340 y 380 nm. La diferencia de estos intervalos se convirtió a concentración de calcio intracelular, usando la ecuación de Grynkievicz,20 con una Kd=5.5 μM. Asimismo, la fluorescencia de los espermatozoides cargados con BCECF se detectó a 550 nm, excitándose

Neri Vidaurri P y col.

5 μM Ca (mag-fura) 2+

IP3

SOC

PLC

CCDV

SOC

ZP3

∆Vm Ca2+ (LVA)

Ca2+

IP3R

Ca2+ (LVA) Ca2+ IP3

Ca2+

Ca2+ acrosoma

RA Señal de apertura

Figura 2. Modelo de los mecanismos de movilización de calcio que se propone dispara la zona pelúcida durante la reacción acrosomal. La zona pelúcida produce un incremento de calcio debido a dos fenómenos en paralelo: uno rápido, que activa un receptor que produce la despolarización de la membrana (DVm), que abre los canales de calcio dependientes de voltaje tipo T (Ca2+ LVA), elevando transitoriamente la concentración de calcio intracelular. Al mismo tiempo, la zona pelúcida se une a un receptor acoplado a la proteína Gq, vía PLC, produciendo inositol trifosfato. Éste, junto con el calcio elevado, producto de la activación del canal T, activan los receptores a inositol trifosfato (IP3R) de la membrana del acrosoma, vaciando su contenido de calcio al citosol. Consecuentemente, se activan los canales operados por depósitos intracelulares de calcio en la membrana plasmática, produciendo una entrada secundaria y sostenida de calcio intracelular, con lo que realiza la reacción acrosomal Modificada de la referencia 5.

alternadamente entre 500 y 439 nm. Los radios 500/439 se analizaron con el programa Felix del PTI para convertir los valores obtenidos a valores de pH.

a 25 y 37°C, a cero, dos y cuatro horas, estimulados con 4 µM de progesterona se muestra en la Figura 3. Los espermatozoides poscapacitados incubados a 25°C tuvieron un ligero aumento, aunque estadísticamente no significativo, en el influjo de la concentración de calcio intracelular, en comparación con los espermatozoides incubados a 37°C; esta condición se mantuvo en los registros realizados a las dos horas (1.02 ± 0.9 vs 1.15 ± 0.88) y a las cuatro horas (1.5 ± 1.1 vs 1.6 ± 0.85) poscapacitación. Sólo se realizó un registro inicial (control) para ambas condiciones. Debido a que los canales de calcio son muy sensibles al pH intracelular durante la reacción acrosomal, éste se valoró en cada condición. Se observó (Figura 4) que la adición de progesterona eleva el pH intracelular en

Figura 3. Incremento de calcio inducido con progesterona en espermatozoides humanos. Los espermatozoides se incubaron durante dos y cuatro horas poscapacitación a temperatura ambiente (25°C) y a 37°C. Los registros son representativos de 10 muestras diferentes de semen.

Análisis estadístico

Los resultados se expresaron como promedio ± error estándar y se analizaron con prueba t de Student. Valores de p ≤ 0.05 se consideraron estadísticamente significativos. RESULTADOS El efecto de la temperatura en la concentración de calcio intracelular a través de los canales de calcio dependientes de voltaje en espermatozoides poscapacitados incubados

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Figura 4. Efecto de la temperatura en el pH intracelular en espermatozoides humanos. Los espermatozoides humanos se incubaron a 25 y a 37°C, dos y cuatro horas poscapacitación y después de dos minutos de iniciado el registro se estimularon con 4 µM de progesterona.

Reproducción

Efecto de la temperatura en la reacción acrosomal espontánea en muestras seminales

muestras poscapacitadas incubadas dos horas a 25°C, de 6.85 a 6.90, y a las cuatro horas, de 7.9 a 7.13. A 37°C de 6.93 a 6.99 a dos horas y a cuatro horas de 7.9 a 7.24. Si bien las diferencias tampoco son estadísticamente significativas, señalan que conforme aumenta el tiempo, mayor es el valor del pH intracelular obtenido, ya sea a 25 o a 37°C. Es decir, al incrementarse el tiempo de incubación, cada vez más espermatozoides podrían realizar reacción acrosomal espontánea, por lo que se alcaliniza más el medio, pero no en el control. En términos estadísticos, al normalizar el control, la incubación a temperatura ambiente (25°C) promueve de manera eficiente los mecanismos celulares implicados en la capacitación espermática y en la concentración de calcio intracelular, con similitud a los espermatozoides incubados a 37°C (8.3 ± 0.4 vs 8.4 ± 0.0.5); esto es, cuatro horas poscapacitación (Figura 5). Si estos tratamientos se comparan con el control, esto es, el registro inmediatamente al salir la muestra de capacitar, sí se observan diferencias significativas en la concentración de calcio intracelular, lo que confirma que a medida que aumenta el tiempo de incubación de una muestra poscapacitada, independientemente de la temperatura a la que se mantenga, habrá un influjo mayor de calcio.

Cambio fraccional [Ca2+]i

25ºC Tratamiento

37ºC

8 6 4 2 0

CNT

Figura 5. Cambio fraccional de la concentración de calcio intracelular [Ca2+]i inducido con progesterona en espermatozoides humanos. Espermatozoides no capacitados (CNT) y capacitados durante cuatro horas a temperatura ambiente (25°C) y a 37°C, donde el valor del control es de 0.81 µM=1. Podemos observar que el incremento en los incubados a 25°C, en comparación con el control, fue de 8.4 veces, mientras que en los incubados a 37°C fue de 8.3 veces. *p 0.05, n=10.

Volumen 6, núm. 2, octubre-diciembre, 2013

DISCUSIÓN La movilidad espermática en muestras capacitadas es significativamente dependiente de la temperatura de incubación. Con el sistema CASA se encontró que los espermatozoides incubados cuatro horas a 20°C fueron incapaces de tener hiperactivación y mostraron diferentes parámetros de movilidad cuando se compararon con espermatozoides capacitados a 37°C;21 sin embargo, hay que recordar que la capacitación espermática es un proceso reversible que se realiza durante un periodo largo (una a cuatro horas), en donde las muestras pueden ser lavadas con medio de cultivo nuevo o simplemente incrementar la temperatura de incubación para aumentar la movilidad nuevamente. Por el contrario, la reacción acrosomal es un proceso irreversible y rápido (segundos), en el que el espermatozoide puede perder totalmente su movilidad y viabilidad. De lo anterior surge la inquietud de hacer este estudio, porque hay veces que por cuestiones ajenas, en procedimientos de reproducción asistida (por ejemplo, inseminación intrauterina), ésta se retrasa y se realiza incluso cinco horas después de la capacitación, lo que hace cuestionarnos si la incubación de la muestra seminal a 37°C aumenta o no la tasa de reacción acrosomal espontánea reduciendo con ello la posibilidad de la unión óvulo-espermatozoide. En la bibliografía existen muy pocos estudios que describen el efecto de la temperatura en la reacción acrosomal espontánea medida desde el punto de vista de la modulación de las concentraciones de calcio intracelular.22 Los resultados comunicados en este estudio muestran que no existe diferencia significativa en la tasa de reacción acrosomal espontánea entre muestras seminales capacitadas mantenidas a temperatura ambiente y muestras capacitadas incubadas a 37°C, aun después de cuatro horas poscapacitación. Sin embargo, hay una ligera tendencia a ser mayor en muestras incubadas a 37°C, porque después de la adición de progesterona, el influjo de calcio es menor; es decir, hubo una población de espermatozoides que llevaron a cabo la reacción acrosomal espontánea y los restantes la realizaron después de la inducción con esta hormona.

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Neri Vidaurri P y col.

Lo anterior se ejemplifica muy bien en el efecto en el pH intracelular, porque los espermatozoides capacitados incubados a 37°C registraron mayor alcalinización –dada por la liberación de calcio intracelular por la reacción acrosomal espontánea– que los espermatozoides mantenidos a temperatura ambiente. Tocanne y colaboradores23 en 1989 mencionaron que se requiere la temperatura de incubación adecuada para la expresión de la capacidad de fertilización de los espermatozoides humanos in vitro; sin embargo, al estudiar de manera indirecta la reacción acrosomal espontánea por inducción de progesterona, demostramos que a 25°C hay un influjo de calcio similar al que se observa cuando se capacitan los espermatozoides a 36°C (Figura 1). Lo anterior nos lleva a discutir que si bien la temperatura es importante para la capacitación espermática, no lo es para la reacción acrosomal, de manera que los espermatozoides mantenidos a 25°C tendrán la misma probabilidad de realizar una reacción acrosomal que los incubados a 37°C. Sin embargo, Green24 demostró en 1999 una diferencia significativa de reacción acrosomal espontánea entre espermatozoides hiperactivados y espermatozoides no hiperactivados sugiriendo que los espermatozoides hiperactivados son más propensos a realizar reacción acrosomal espontánea que los no hiperactivados. De acuerdo con nuestros resultados, si tenemos en cuenta que los espermatozoides incubados a 37°C tienen mayor movilidad que los mantenidos a 25°C, los hallazgos fueron similares, pero nosotros no encontramos diferencia significativa. Los hallazgos de este estudio también son similares a los reportados por Marín-Briggiler y su grupo,21 quienes reportaron que a 20°C los espermatozoides tenían bajos porcentajes de reacción acrosomal espontánea. De manera que las muestras podrían ser transportadas y mantenidas a esta temperatura en inseminaciones retrasadas, así como en reinseminaciones. Asimismo, sugieren que esta incubación a 20°C también puede beneficiar a los pacientes con factores capacitantes rápidos, cuyos espermatozoides se distinguen por capacitarse rápidamente. Harper,22 al estudiar el proceso de exocitosis in vivo, propuso que la reacción acrosomal espontánea se asocia con muerte celular o es un mecanismo selectivo en los espermatozoides humanos para quitar los de mala calidad.

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Por tanto, en los humanos, el proceso de fertilización es exclusivo de los espermatozoides que alcanzan el ovocito con su acrosoma intacto para realizar la reacción acrosomal en la superficie de la zona pelúcida. CONCLUSIÓN Las muestras poscapacitadas pueden mantenerse a temperatura ambiente (25°C) o a 37°C. REFERENCIAS 1. Darszon A, Nishigaki T, Wood C, Trevino CL, et al. Calcium channels and Ca2+ fluctuations in sperm physiology. Int Rev Cytol 2005;243:79-172. 2. Baldi E, Luconi M, Bonaccorsi L, Forti G. Signal transduction pathways in human spermatozoa. J Reprod Immunol 2002;53:121-131. 3. Cross NL, Razy-Faulkner P. Control of human sperm intracellular pH by cholesterol and its relationship to the response of the acrosome to progesterone. Biol Reprod 1997;56:1169-1174. 4. Suarez SS, Wolf DP, Meizel S. Induction of the acrosome reaction in human spermatozoa by a fraction of human follicular fluid. Gamete Res 1986;14:107-121. 5. O’Toole CM, Arnoult C, Darszon A, Steinhardt RA, et al. Ca(2+) entry through store-operated channels in mouse sperm is initiated by egg ZP3 and drives the acrosome reaction. Mol Biol Cell 200;11:1571-1584. 6. Mahi CA, Yanagimachi R. The effect of temperature, osmolarity and hydrogen ion concentration on the activation and the acrosome reaction of Golden hamster spermatozoa. J Reprod Fertil 1973;35:55-66. 7. Lenz RW, Ball GD, Leibfried ML, Ax RL, et al. In vitro maturation and fertilization of bovine oocytes are temperaturedependent processes. Biol Reprod 1983,29:173-179. 8. Fleming AD, Kuehl TJ. Effects of temperature upon capacitation of guinea pig spermatozoa. J Exp Zool 1985;233:405411. 9. Si Y. Temperature-dependent hyperactivated movement of hamster spermatozoa. Biol Reprod 1997;57:1407-1412. 10. White DR, Phillips DM, Bedford JM. Factors affecting the acrosome reaction in human spermatozoa. J Reprod Fertil 1990;90:71-80. 11. Yanagimachi R. In vitro acrosome reaction and capacitation of Golden hamster sperm by bovine follicular fluid and its fractions. J Exp Zool 1969;170:269-280. 12. Mortimer D, Curtis EF, Camenzind AR, Tanaka S. The spontaneous acrosome reaction of human spermatozoa incubated in vitro. Hum Reprod 1989;4:57-62. 13. Santi CM, Darszon A, Hernández-Cruz A. A dihydropyridinesensitive T-type Ca2+ current is the main Ca2+ current carrier in mouse primary spermatocytes. Am J Physiol 1996; 271:1583-1593.

Reproducción

Efecto de la temperatura en la reacción acrosomal espontánea en muestras seminales

14. Arnoult C, Cardullo RA, Lemos JR, Florman HM. Activation of mouse sperm T-type Ca2+ channels by adhesion to the egg zona pellucida. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:1300413009. 15. Arnoult C, Kazam IG, Visconti PE, Kopf GS, et al. Control of the low voltage-activated calcium channel of mouse sperm by egg ZP3 and by membrane hyperpolarization during capacitation. Proc Natl Acad Sci USA 1999;96:6757-6762. 16. Linares-Hernández L, Guzmán-Grenfell AM, Hicks-Gómez JJ, González-Martínez MT. Voltage dependent calcium influx in human sperm assessed by simultaneous detection of intracellular calcium and membrane potential. Biochim Biophys Acta 1998;1372:1-12. 17. Fraire-Zamora JJ, González-Martínez MT. Effect of intracellular pH on the depolarization-evoked calcium influx in human sperm. Am J Physiol 2004;287:1688-1696. 18. Torres-Flores V, Picazo-Juárez G, Hernández-Rueda Y, Darszon A, et al. Sodium influx induced by external calcium chelation decreases human sperm motility. Hum Reprod 2011;26:2626-2635.

Volumen 6, núm. 2, octubre-diciembre, 2013

19. González-Martínez MT, Bonilla-Hernández MA, GuzmánGrenfell AM. Stimulation of voltage dependent calcium channels during capacitation and by progesterone in human sperm. Arch Biochem Biophys 2002;408:205-210. 20. Grynkievicz G, Poenie M, Tsien RY. A new generation of calcium indicators with greatly improved fluorescent properties. J. Biol. Chem. 1985. 260:3440-3450. 21. Marín-Briggiler CI, Tezón JG, Miranda PV, Vázquez-Levin MH. Effect of incubating human sperm at room temperature on capacitation-related events. Fertil Steril 2002;77:252259. 22. Harper C, Cummerson JA, White MRH, Publicover S, et al. Dynamic resolution of acrosomal exocytosis in human sperm. J Cell Sci 2008;121:2130-2135. 23. Tocanne JF, Dupou-Cézanne L, López A, Tournier JF. Lipid lateral diffusion and membrane organization. FEBS Lett 1989;257:10-16. 24. Green S, Fishel S, Rowe P. The incidence of spontaneous acrosome reaction in homogeneous populations of hyperactived human spermatozoa. Hum Reprod 1999;7:1819-1822.

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Reproducción 2013;6:104-127

Tópicos de interés

Laboratorio de reproducción asistida Paloma Neri Vidaurri,1 Esperanza Carballo Mondragón,2 Francisco Rocha Cárdenas,3 Genaro García Villafaña,4 María del Carmen Acuña González,3,5 Conrado Emilio Uria Gómez3,6

n los últimos años, los laboratorios de reproducción asistida experimentaron notables cambios: desde su entorno como parte importante de una clínica de reproducción asistida hasta los mínimos detalles que los componen y la disciplina con la que los embriólogos se deben conducir en ellos. Los laboratorios deben adaptarse a una serie de requisitos o normas, cambios de metodología en el trabajo y equipos modernos, en donde cualquier cambio o propuesta (incorporación de equipos nuevos, control de las condiciones ambientales, metodologías de trabajo,

Centro Especializado en Esterilidad y Reproducción Humana, México, DF. Centro Mexicano de Fertilidad Dr. Alberto Kably, Estado de México, México. Embriología y Genética Humana, Biogenrep, Centro Especializado en Genética Reproductiva SC, México, DF. Instituto para el Estudio de la Concepción Humana, Monterrey, Nuevo León, México. Biotecnología y Biomedicina Molecular, Subdirección de Investigación en Intervenciones Comunitarias, Instituto Nacional de Perinatología Isidro Espinosa de los Reyes, México, DF. Citogenética Humana, Laboratorio de Genética Humana, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma del Estado de México.

Correspondencia: Dra. Paloma Neri Vidaurri. Centro Especializado en Esterilidad y Reproducción Humana. Agrarismo 208, primer piso, Torre A, colonia Escandón, CP 11800, México, DF. Correo electrónico: palnevi@ceerh.com.mx Recibido: septiembre 2013. Aceptado: octubre 2013. Este artículo debe citarse como: Neri-Vidaurri P, CarballoMondragón E, Rocha-Cárdenas F, García-Villafaña G y col. Laboratorio de reproducción asistida. Reproducción (México) 2013;6:104-127. www.nietoeditores.com.mx

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medios de cultivo, certificaciones de calidad) tiene que ser documentado; todo con el objetivo de mejorar el servicio y los resultados. Todos coincidimos en que el diseño y el funcionamiento del laboratorio de reproducción asistida deben innovarse. Hace unos años, el laboratorio de reproducción asistida se concebía dentro de los laboratorios de análisis generales como un apéndice de éstos, donde se tendía a cubrir todo el campo de la reproducción asistida en un solo espacio. Para esos cambios se consideraba que con algunas pequeñas modificaciones se podía aumentar su eficacia y mejorar los resultados. Sin embargo, estos pequeños laboratorios, ya sea por un reducido volumen de trabajo o por motivos puramente físicos, a menudo tuvieron el problema de no incorporar nuevos equipos para ofrecer mejores resultados; algo sustancial para afrontar el presente y, aún más, el futuro en la reproducción asistida y que se debe tener muy en cuenta al montar un laboratorio de reproducción asistida, pensar a futuro en más personal, más equipo, etcétera.1 Se hace hincapié en que el éxito de una clínica de reproducción asistida específicamente depende del nivel de experiencia del personal médico y de laboratorio. Particularmente, para el personal de laboratorio es necesario el adiestramiento práctico, la educación médica continua en los campos que involucran a la reproducción asistida, la actualización de procedimientos y la implementación de nuevas técnicas, con la participación o asistencia obligada al menos una vez al año a congresos nacionales e internacionales. Todo esto con el único fin de dar a los pacientes todas las alternativas de tratamiento disponibles en el laboratorio de gametos para la obtención de los mejores embriones para transferir.1,2 Reproducción

Laboratorio de reproducción asistida

El trabajo de un embriólogo en un laboratorio de reproducción asistida incluye labores de embriología y andrología; aunque también deben estar implicados en otros aspectos importantes de la clínica, como el tratamiento de los pacientes, el seguimiento folicular, el consejo genético, entre otros. Un embriólogo debe ser responsable, obsesivo en todos los cuidados que debe tener dentro del laboratorio, observador, disciplinado y, sobre todo, requiere muchas habilidades individuales para solucionar cualquier problema que se le presente, su labor más importante es el manejo de gametos y embriones. Por ello, en este equipo generalmente se debe tener mayor consideración en cuanto a su elección, ya que de esto puede depender el éxito del laboratorio. Aunque el equipo del laboratorio de gametos debe estar integrado por un director, supervisor, embriólogo, asistente de embriólogo y técnico, el número del personal actual depende de la cantidad de procedimientos hechos al año.2,3 Las labores del embriólogo, además de incluir todas las tareas posibles, debe mantener un registro total de los estándares del control de calidad, anotando la verificación diaria, pruebas, análisis, así como también llevar un calendario de mantenimiento y limpieza de los equipos y un manual de prevención de accidentes y contingencias dentro del laboratorio. Actualmente es de vital importancia que un laboratorio de reproducción asistida esté avalado o certificado por una autoridad o sociedad científica, ya sea nacional o internacional, para cerciorarse que se cumplan con los estándares necesarios para un buen funcionamiento del laboratorio. Se han establecido políticas y procedimientos que permiten evaluar la calidad del laboratorio. Anualmente se debe hacer una estadística, en la que se determinen los mínimos estándares que deben mantenerse continuamente, lo que habla de la calidad del laboratorio. Gardner3 propone una serie de valores mínimos en los que se debe mantener un laboratorio de reproducción asistida (Cuadro 1). Cuando un laboratorio obtiene una tasa de embarazo <15%, o realiza mal el control de calidad por parte del laboratorio y no se detectan los posibles errores en el equipo, o la parte clínica hace una mala selección de los pacientes para la fertilización in vitro. Volumen 6, núm. 2, octubre-diciembre, 2013

Cuadro 1. Estándares mínimos para evaluar la eficiencia de un laboratorio de reproducción asistida Parámetros analizados

Mínimos estándares

Tasa normal de fertilización >60% Tasa de poliespermia <10% Tasa de degeneración por ICSI <15% Tasa de división embrionaria >80% Tasa de supervivencia posdescongelación >50% Tasa de embarazo viable >40% Tasa de implantación >20% Concentración espermática ± 10% del promedio Morfología espermática ± 2% del promedio Motilidad espermática ± 10% de promedio

Obviamente, si las condiciones que encuentran los gametos al entrar al laboratorio son adversas, el producto final será de mala calidad. Por ello, debe considerarse al laboratorio un sistema con módulos conectados, a los que es necesario controlar y mejorar. Cualquier laboratorio puede producir embriones que sobrevivirán a las condiciones imperantes, dada su elasticidad intrínseca. Pero sólo el laboratorio que haya optimizado todos los aspectos implicados en la producción in vitro logrará obtener embriones de buena calidad asegurando un alto potencial de implantación para desarrollar embarazos viables. El concepto de optimización de las condiciones del laboratorio de in vitro incluye: • Diseño del laboratorio, ubicación, disposición, tamaño, instalación y materiales. • Ubicación geográfica. • Limpieza, orden y distribución de las tareas. • Material descartable. • Medios de cultivo. • Controles de calidad. Actualmente, entre las evaluaciones para un buen funcionamiento del laboratorio de reproducción asistida se debe considerar la estadística anual de los siguientes datos: • Grado de madurez ovocitaria. • Tasa de fertilidad por fecundación in vitro. • Tasa de fertilidad por microinyección intracitoplasmática de espermatozoides. • Tasa de fallas de fecundación. • Tasas de embriones pronucleares.

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• • • • • • •

Tasas de división el día 2 o 3. Calidad embrionaria por incubadora. Tasas de blastocistos obtenidos. Tasas de supervivencia y embarazos. Tasas de fecundación. Tasas de embarazos por edades, técnicas, afecciones, etc. Tasas de implantación.

Decir cómo será la reproducción asistida en el futuro desde el punto de vista del laboratorio no es fácil, aunque en los últimos años los avances más importantes en este campo han sido exactamente en el laboratorio. Posiblemente, el futuro está en la aplicación de una manera más sistemática del diagnóstico genético preimplantacional, apoyando el cultivo de los embriones con medios realmente eficaces, capaces de suministrar todo lo que en verdad necesita el embrión y sin aportar sustancias nocivas para éste. La vitrificación se consolidará como la técnica de congelación más rápida y eficaz, con una metodología que garantice muy buena supervivencia de los embriones y buena tasa de implantación y embarazo, teniendo a los embriones protegidos de las posibles contaminaciones del nitrógeno líquido. En cuanto a los sistemas de cultivo embrionario, la maduración in vitro de ovocitos se debe desarrollar como una de las mejores técnicas, porque desde el punto de vista clínico existen grandes beneficios, como: no hay estimulación ovárica, no hay riesgo de hiperestimulación, la monitorización es más sencilla y el costo es más bajo que el de la fecundación in vitro convencional. Puede usarse en casos de ovarios poliquísticos, cuando hay antecedentes de síndrome de hiperestimulación ovárica y como alternativa para las mujeres que no quieren someterse a una estimulación ovárica por algún proceso oncológico, ya que actualmente los resultados son escasos, pues las tasas de implantación y embarazo son bajas y, en cambio, las de aborto son más altas. Además de que en casos muy contados se obtienen embriones para congelar. Después de todo, el laboratorio de reproducción asistida debe ser el lugar ideal para que un embriólogo aplique todos los conocimientos posibles y haga uso de las mejores técnicas para seleccionar los mejores gametos y para el desarrollo de los mejores embriones, además de trabajar en un ambiente agradable y de ca-

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maradería con el área clínica, ya que la comunicación entre ambas partes debe ser vital para la elección del mejor tratamiento. ¿Quién no, como embriólogo de un centro de reproducción asistida, pasó más horas trabajando en el laboratorio que en su casa?, ¿quién no soñó con embriones?, ¿quién no fue al laboratorio en fines de semana y días festivos, ya sea para trabajar o sólo para revisar los embriones? Éste es el perfil y la disciplina de un embriólogo en un laboratorio de reproducción asistida, porque, más que trabajar, ayudamos a generar una nueva vida y nos aseguramos de que todas las parejas reciban el mejor tratamiento posible, de acuerdo con sus necesidades médicas. De manera particular, agradezco a la Asociación Mexicana de Medicina de la Reproducción el reconocimiento a los embriólogos como parte importante y esencial de una clínica de reproducción asistida, al permitirnos participar en los Tópicos de interés de la Revista Reproducción. Los siguiente subtemas se eligieron con el fin de actualizar a los lectores acerca de los nuevos criterios que se han establecido con base en la evaluación embrionaria gracias a las nuevas técnicas y equipos de observación; acerca del efecto del factor masculino en el desarrollo embrionario, que cada vez está más comprometido no sólo por la morfología sino por la fisiología y la genética del espermatozoide; acerca de los factores genéticos que pueden afectar al desarrollo embrionario hoy en día, cuando se observa una gama de causas multifactoriales por las que una pareja no puede concebir un hijo y, finalmente, de la aplicación de las técnicas ómicas en reproducción asistida, mismas que, aunque algunos investigadores las consideran aún experimentales, permiten importantes hallazgos, sobre todo en la investigación, que ayudan a comprender, por ejemplo, el porqué de muchas fallas de implantación de embriones que transferimos y consideramos potenciales. REFERENCIAS 1. 2. 3.

Alper M, Brinsden P, Fischer R, Wikland M. Is your IVF programme good? Hum Reprod 2002;17:8-10. Gianaroli L, Plachot M, Van Kooij R, Al-Hasani S, et al. ESHRE guidelines for good practice in IVF laboratories. Gardner D, Weissman A, Howles C, Shoham Z, et al. Textbook of assisted reproductive techniques. Laboratory and clinical perspectives. Edit. London. Cap. 1-2.

Reproducción

Laboratorio de reproducción asistida

Consenso de selección embrionaria en un programa de fertilización in vitro

Genaro García Villafaña Instituto para el Estudio de la Concepción Humana. Av. Hidalgo 1842 Pte., 3er. piso, colonia Obispado, CP 64060, Monterrey, NL, México. Correo electrónico: ggarciav67@hotmail.com

Ya pasaron 35 años desde el primer nacimiento por medio de fertilización in vitro y durante este tiempo aparecieron infinidad de avances en los tratamientos de reproducción asistida,1 el principal objetivo era establecer un embarazo viable, con el nacimiento de un bebé único sano. Los resultados de tratamientos de reproducción asistida dependen de la eficiencia de cada uno de los pasos del procedimiento. Los conocimientos actuales, en lo que respecta a la estimulación ovárica, la captura ovular y las condiciones de cultivo, así como el mejoramiento de los laboratorios de fecundación in vitro, aseguran una tasa de fertilización exitosa y la posibilidad de tener embriones de buena calidad para su transferencia y su criopreservación.1 Existen numerosos trabajos que demuestran que en un grupo completo de ovocitos obtenidos de una mujer, sólo algunos de ellos son capaces de lograr un embarazo a término. Por esta razón es necesario establecer métodos simples de clasificación que ayuden a seleccionar a los mejores para su transferencia. Aunque el advenimiento de la genómica, proteómica y metabólica (ómics), tecnología basada en eventos moleculares, puede mejorar la evaluación no invasiva de embriones humanos in vitro, todavía no hay evidencia total de que sean técnicas aplicables de manera rutinaria o que haya dispositivos analíticos disponibles para ello; otro punto importante es que el costo de esta tecnología es bastante alto por ahora y, por tanto, los centros de reproducción asistida en todo el mundo eligen embriones para la transferencia en función de su tasa de desarrollo y rasgos morfológicos, evaluados por microscopia de luz. Sin embargo, las diferencias en los criterios de clasifica-

Volumen 6, núm. 2, octubre-diciembre, 2013

ción de embriones aplicados por centros de reproducción asistida hacen que las comparaciones entre éstas sean desde extremadamente difíciles hasta imposibles.1 Aunque existen esquemas del consenso nacional en algunos países (por ejemplo, España y el Reino Unido), son relativamente escasos. De manera que el proyecto de formar un consenso internacional de la evaluación de los embriones surge con el propósito de unificar y validar la utilidad de la morfología embrionaria como un punto final en los ensayos clínicos y otros estudios para evaluar nuevas tecnologías para la fecundación in vitro. Entre las sesiones de interés del grupo de biólogos de la reproducción en México es de gran interés conformar un consenso nacional mexicano de la evaluación embrionaria que ayudaría a mejorar los resultados y, sobre todo, a reducir el número de embriones para transferir; con esto disminuirían los embarazos múltiples asegurando la efectividad de los procedimientos en reproducción asistida. La sociedad Alfa y el Grupo Especial de Interés ESHRE de Embriología, en respuesta a sugerencias y requisitos de los miembros de ambas sociedades internacionales que conciernen la necesidad del consenso internacional en la evaluación morfológica de embriones, realizaron un taller de dos días, impartido el 26 y 27 de febrero de 2011, en Estambul, Turquía. El objetivo del taller fue establecer criterios comunes y terminologías para clasificar ovocitos, cigotos y embriones que serían manejables para aplicarlos en la rutina de cualquier laboratorio de fecundación in vitro, sugiriendo que si los puntos más importantes basados en la calidad de embrión podrían ser definidos y validados, puede ser posible desarrollar y registrar nuevas tecnologías más fácilmente. Como principal objetivo y justificación del proyecto se reconoció a la Embriología como el punto central de referencia para todos los grupos de intereses especiales y grupos de acción ESHRE y, por tanto, que es necesario realizar un consenso para determinar la manera en la que los embriones deben evaluarse y describirse.

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Para trabajar en este consenso se revisaron atlas de Embriología, se usaron imágenes de los ovocitos y del desarrollo embrionario. El siguiente paso del proyecto fue diseñar un sistema de puntuación de embriones. Una vez logrado esto se revisó el atlas para proporcionar ilustraciones fotográficas para cada uno de los puntos. De esta manera, el sistema de puntuación sería una referencia práctica para todos los embriólogos. Puntos del consenso

Este trabajo se creó como una primera serie de recomendaciones del consenso para la evaluación de los ovocitos y embriones. Además, debe entenderse que los puntos del consenso designados a evaluar representan las normas mínimas para la clasificación de ovocitos y embriones; de tal manera que no limitan que los laboratorios deban realizar observaciones adicionales por sí mismos. Las observaciones más frecuentes o prolongadas de ovocitos y embriones conllevan el riesgo (aunque pequeño) de repercusión en su potencial de desarrollo. Por tanto, los embriólogos deben considerar el costo-beneficio de realizar observaciones adicionales, al tiempo que garanticen que éstas se realicen de manera que no se ponga en riesgo el desarrollo del embrión.

al momento de la inseminación (Cuadro 1). De manera uniforme, la evaluación se realizará de acuerdo con el tiempo transcurrido después de ésta o como horas posinseminación.1 Se observó que hay una inherente variabilidad en la sincronización de todo el proceso biológico y que los tiempos indicados reflejan los tiempos en los que estos procesos se producen en la mayor parte de los casos. Para los embriones se acordó que cada observación tiene dos partes: 1) el número de células y 2) la etapa y grado de desarrollo. Éstos deben ser informados por separado, en asociación con el tiempo, después de la inseminación.2 Clasificación de ovocitos

Fue opinión general del consenso que la óptima morfología de los ovocitos es la de una estructura esférica, cerrada por una zona pelúcida uniforme, con un citoplasma uniforme translúcido, libre de inclusiones, y un cuerpo polar de tamaño apropiado. Se discutió, además, que los ovocitos se someten a la maduración nuclear y citoplasmática y que estos procesos no son los mismos y no necesariamente deben suceder sincronizadamente.1 Clasificación del complejo ovocito-cúmulo-corona

Tiempo y reporte de observación de ovocitos fertilizados y embriones

Se acordó que estandarizar el tiempo de las observaciones es fundamental para la comparación de resultados entre diferentes laboratorios y que esto debe ser relativo

Fue opinión general del consenso que, a pesar de que en la actualidad hay poca evidencia de una correlación del desarrollo embrionario con el complejo ovocito-cúmulocorona, es una herramienta importante para la decisión en cuanto a qué técnica utilizar. La manera de realizar

Cuadro 1. Tiempo de observación de ovocitos fertilizados, embriones y el estadio de desarrollo esperado en cada evaluación Tiempo de observación

Fertilización Singamia División temprana Valoración embrionaria el día 2 Valoración embrionaria el día 3 Valoración embrionaria el día 4 Valoración embrionaria el día 5

Tiempo (horas posinseminación)

Estadio de desarrollo esperado

17 ± 1 23 ± 1

Pronúcleos Esperar que 50% estará en singamia y más de 20% quizás en dos células Dos células

26 ± 1 post ICSI 28 ± 1 post FIV 48 ± 1 72 ± 1 68 ± 1 116 ± 1

Cuatro células Ocho células Mórula Blastocisto

Modificado de la referencia 1.

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Reproducción

Laboratorio de reproducción asistida

esta evaluación se propone sea un resultado binario; es decir, 0 o 1, en donde 1 es un complejo ovocito-cúmulocorona bueno, y se define como un cúmulo expandido y una corona radiante bien formada.1 Clasificación de la zona pelúcida

El consenso no encontró beneficio específico en medir el espesor de la zona pelúcida, ya que se acordó que no hay pruebas suficientes para ningún efecto en el desarrollo embrionario. Sin embargo, se observó que podría haber casos específicos de la paciente, por lo que no se debe descartar una observación sobre todo del color y el grosor de la zona pelúcida.1 Espacio perivitelino

La presencia de inclusiones en el espacio perivitelino es anómala. Sin embargo, no hay pruebas suficientes en la bibliografía para apoyar cualquier pronóstico específico asociado con esta observación, por lo que el consenso acordó que la observación de inclusiones debe señalarse sin ningún requisito de contarlos o medirlos. Se acordó, además, que una nota del espacio perivitelino sólo debe hacerse si es excepcionalmente grande.1 Clasificación del cuerpo polar

La presencia o ausencia del primer cuerpo polar debe tenerse en cuenta al visualizarlo en el ovocito siempre que sea posible (teniendo en cuenta que esto es difícil en los ovocitos que son inseminados por fecundación in vitro). El tamaño del cuerpo polar sólo se debe tomar en cuenta si es excepcionalmente grande y se sugiere que estos ovocitos no deben ser inseminados, debido al riesgo de aneuploidías en el ovocito.1 Clasificación del citoplasma

El citoplasma debe ser homogéneo y el que no lo sea puede considerarse de importancia biológica desconocida, ya que la evidencia actual sólo indica que representa una variabilidad entre los ovocitos y no debe considerarse un tipo de dimorfismo que afecte el desarrollo embrionario.1 El citoplasma puede estar mal definido y es muy diferente de la agrupación de organelos. El citoplasma se puede observar por cualquier forma de microscopia; mientras que la granularidad a menudo se observa por la modulación de contraste de fase y la agrupación de Volumen 6, núm. 2, octubre-diciembre, 2013

organelos sí se asocia con menor potencial de implantación.1,2 También se acordó que en ocasiones se observan con forma de discos (muy diferentes de las vacuolas) en el citoplasma del ovocito; estos discos demostraron ser un retículo endoplasmático liso y se asocian con riesgo de resultado significativamente anormal.1,2 Los ovocitos con estas características no deben ser inseminados.3 Vacuolización

Se acordó que es poco probable que algunas vacuolas pequeñas (5-10 mm de diámetro) sean una consecuencia biológica o de mal pronóstico. Por el contrario, las vacuolas grandes (>14 mm de diámetro) sí se asocian con falla en la fertilización. En ovocitos que son fertilizados con vacuolas se ha observado que éstas persisten aun después de la singamia y pueden interferir con el desarrollo embrionario, lo que resulta en una tasa inferior de recuperación del blastocisto.1 Revisión de la fertilización

El ovocito fecundado óptimo debe ser esférico y tener dos cuerpos polares, con dos pronúcleos centrales yuxtapuestos, que pueden ser de diferente tamaño, incluso con membranas distintas. Los pronúcleos deben tener número y tamaño equivalentes de cuerpos precursores nucleares, idealmente ecuatoriales y alineados en las membranas yuxtapuestas.1 Se acordó que el tamaño y la ubicación pronuclear deben evaluarse en el registro de fertilización (Cuadro 2). Además, las siguientes características deben considerarse severamente atípicas: 1) pronúcleos ampliamente separados y 2) burdamente de tamaño diferentes. Como parte de la verificación de la fertilización (si se llevó a cabo la fecundación in vitro, en lugar de la microinyección intracitoplasmática de espermatozoides), se debe evaluar la presencia de los discos retículos endoplasmáticos lisos. Normalmente los ovocitos fecundados en los que se observan los discos retículos endoplasmáticos lisos no deben transferirse. También, en la evaluación de la fertilización en ocasiones se observa una translucidez citoplasmática periférica en el ovocito fecundado (un halo); aunque en la actualidad, no hay pruebas suficientes para apoyar un valor pronóstico de su presencia.1 La decisión de realizar una segunda evaluación el día 1 se encuentra en el margen de la apreciación del

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laboratorio, con lo que se puede evaluar la singamia o evaluación de la segmentación temprana (Cuadro 2).1,4 El propósito de la segunda evaluación puede ser para control de calidad (singamia) o por razones pronósticas (segmentación temprana), que definirá el tiempo de evaluación seleccionada. Calificación pronuclear

Se acordó que la calificación pronuclear es de importante valor, ya que puede proporcionar información adicional a la comprobación de fertilización; ambos deben realizarse al mismo tiempo.1 Se propone que en la calificación pronuclear debe haber tres categorías: simétrica, asimétrica y anormal (Cuadro 2); en esta última se incluyen los pronúcleos anormales sin cuerpos precursores nucleares (pronúcleos fantasma) y los que tienen un pronúcleo.1 Cuadro 2. Sistema de clasificación de pronúcleos Calificación

Categoría

Descripción

1 2

Simétrico No simétrico

Anormal

Equivalente Z1 y Z2 Otras disposiciones, es particular CPN localizados en la periferia Pronúcleos con 0 o 1 CPN

CPN: cuerpos precursores nucleares; Z: Z-score (Scott, 2003). Modificado de la referencia 1.

División embrionaria Evaluación del número de células

En el consenso se acordaron las etapas importantes a evaluar en el desarrollo embrionario después de la inseminación (Cuadro 1). Al realizar a tiempo todas las evaluaciones se observó que, en promedio, los embriones que mostraron un desarrollo lento tienen un potencial de implantación reducido y que los embriones que se desarrollaron más rápido, lo más probable es que sean anormales y también tengan un potencial de implantación reducido. Lo esperado para el desarrollo del embrión es cuatro células en el día 2 y ocho células en el día 3, en función del tiempo transcurrido después de la inseminación. Sin embargo, esto puede cambiar en el futuro, dependiendo de los medios de cultivo que se utilizarán.1

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Fragmentación

Un fragmento se define como una estructura citoplásmica extracelular unida a la membrana; es decir, <45 mm de diámetro en el día 2 y <40 mm de diámetro en un embrión de día 3. Los grados de fragmentación se definieron como: leve (10%), moderada (10-25%) y grave (>25%). Los valores de porcentaje se basan en los equivalentes celulares, por lo que para un embrión de cuatro células, 25% de fragmentación equivaldría a una de las células en volumen.5 Como tal, no existe una definición del efecto de la localización de la fragmentación, ya que esto puede ser un fenómeno dinámico; es decir, los fragmentos pueden moverse dentro del embrión e incluso, desaparecer.1,5 Multinucleación

Se definió como la presencia de más de un núcleo en una blastómera e incluye micronúcleos. El consenso fue que la multinucleación se asocia con disminución del potencial de implantación y que los embriones multinucleados se asocian con mayor nivel de anomalías cromosómicas y, como consecuencia, con aumento del riesgo de aborto espontáneo.1,6 Se acordó que la evaluación de la multinucleación se debe realizar en el día 2 (es decir, 44 horas + 1 hora después de la inseminación) y que la observación de la multinucleación en una sola célula es suficiente para que el embrión sea considerado multinucleado. Los laboratorios deben registrar la incidencia de multinucleación de cada embrión e idealmente el estado de nucleación de cada blastómero en cada embrión en el día 2. Asimismo, se acordó que la evaluación de la multinucleación en el día 3 sería complicada por el tamaño de las células, que son mucho más pequeñas y, por tanto, sería menos fiable. El esquema de clasificación para la multinucleación debe ser binaria y tomar nota de su presencia o ausencia.1 Tamaño de las células

El sistema de clasificación del tamaño de las células o blastómeras debe ser binario y anotar si todos los tamaños de las células son iguales en cada etapa. Otras características morfológicas, como granularidad citoplasmática, la apariencia de la membrana y la presencia de vacuolas, también pueden determinarse como parte Reproducción

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de la evaluación morfológica de los días 2 y 3. Es importante entender que estas características pueden variar entre los embriones de un paciente a otro.1 Se discutió si los embriones con aparente desorganización espacial, es decir, los que no tienen la disposición tridimensional esperada de blastómeros, son anormales, pero no hay evidencia concluyente de que así sea.1 Sistema de calificación de los embriones

Durante el consenso se discutió que el embrión óptimo en el día + 2 (44 ± 1 hora posinseminación) debe tener cuatro células simétricas (del mismo tamaño), mononucleadas, con disposición tetraédrica tridimensional, con <10% de fragmentación y el embrión óptimo en el día +3 debe tener ocho células simétricas (del mismo tamaño), mononucleadas, con <10% de fragmentación (Cuadro 3). El formato de puntuación sería el número de células, el grado y la razón para el grado.1

Grado

Categoría Descripción

Bueno

Regular

Malo

Entró en la cuarta etapa de división Evidencia de compactación que involucra a todo el volumen del embrión Entró en la cuarta etapa de división Compactación que involucra a la mayor parte del volumen del embrión Desproporcionada, compactación que involucra a menos de la mitad del embrión, con dos o tres células que permanecen como blastómeros discretos

Modificado de la referencia 1. Cuadro 5. Consenso del sistema de calificación de blastocitos Grado

Categoría

Etapa de desarrollo

1 2 3 4

MCI

Bueno

<10% de fragmentación Simetría celular Sin multinucleación

Regular

10-25% de fragmentación Simetría en la mayor parte de las células Sin evidencia de multinucleación

Malo

Bueno

Regular

Malo

Cuadro 3. Consenso del sistema de clasificación para embriones en etapa de división Grado

Cuadro 4. Consenso del sistema de calificación de embriones para el día 4

Temprano Blastocisto Expandido Eclosióneclosionado

Categoría Descripción Bueno

Regular

Malo

Severa fragmentación (<25%) Sin simetría celular Evidencia de multinucleación

Modificado de la referencia 1.

Evaluación del día + 4 (etapa de mórula)

Un embrión óptimo en día 4 o en estadio de mórula (92 + 2 horas, Cuadro 4) es aquel que puede compactarse y ya entró en la cuarta etapa de división celular. La compactación debe incluir prácticamente todo el volumen del embrión.1 Evaluación del día +5 (etapa de blastocisto)

Un embrión óptimo en la etapa de desarrollo a blastocisto (116 + 2 horas, Cuadro 5) es aquel que esté totalmente expandido, con una masa celular interna que debe ser prominente, fácilmente visible, que conste de muchas Volumen 6, núm. 2, octubre-diciembre, 2013

Descripción

Prominente, fácil de identificar, con muchas células compactas y estrechamente adheridas entre sí Fácil de identificar, con muchas células que están libremente agrupadas Difícil de identificar, con pocas células Muchas células que forman epitelio cohesivo Pocas células que forman un epitelio malo Muy pocas células

Modificado de la referencia 1.

células compactadas, fuertemente adheridas entre sí, y con un trofoblasto que esté conformado por muchas células que formen un epitelio cohesivo. Se acordó que, si bien la masa celular interna tiene un alto valor pronóstico para la implantación y el desarrollo fetal, también el trofoblasto es esencial en el momento de la clasificación embrionaria.1,7 Es común encontrar variantes en la morfología de los embriones, se incluye la existencia de células que se unen por diferentes cadenas citoplasmáticas y tipos

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de células y estructuras celulares o acelulares dentro del espacio perivitelino o la cavidad blastocele.1,7 En la evaluación del embrión en estadio de blastocisto se concluyó que el sistema de puntuación debe ser una combinación de la etapa de desarrollo y la calificación final (Cuadro 5). Se acordó también que la eclosión no puede evaluarse con certeza en embriones con eclosión asistida (con excepción de la brecha abierta durante la microinyección intracitoplasmática de espermatozoides). Para cada etapa de desarrollo se acordó que la masa celular interna y el trofoblasto deben ser clasificados en relación con la escala de Gardner A-C;1 pero debe determinarse una calificación de 1 a 3 (en lugar de A-C). La razón de este cambio es para apoyar la entrada de las puntuaciones en bases de datos numéricos y facilitar así el análisis estadístico.1,8 Se observó que si un blastocisto está contraído en el momento de la evaluación, no puede ser clasificado; en este caso debe ser reevaluado una a dos horas más tarde, ya que los ciclos regulares de reexpansión del blastocisto son normales.1

que es un marcador no invasivo que no interfiere en el desarrollo embrionario y esto puede proporcionar en el futuro indicadores de pronóstico. Sin embargo, el uso de un conjunto de datos mínimos comunes establecidos por el sistema de calificación descriptiva, junto con trabajos multicéntricos, nos dará información para mejorar los resultados en nuestra práctica diaria.1,9 REFERENCIAS 1.

Definición de un embrión no viable

Fue la opinión de consenso que un embrión no viable es un embrión en el que el desarrollo fue arrestado por lo menos 24 horas; o en los que todas las células se degeneraron o fueron lisadas.1

CONCLUSIÓN Se espera que los puntos discutidos en el consenso realizado en Estambul formen un lenguaje común para los embriólogos al describir la morfología de los ovocitos y embriones. Los laboratorios deben analizar otras facetas de la morfología de los ovocitos y embriones, ya

The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting Alpha Scientists in reproductive medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryology Human Reproduction, 2011;26:1270-1283. Karsu C, Caglar G, Vicdan K, Sozen E, et al. Smooth endoplasmic reticulum aggregations in all retrieved oocytes causing recurrent multiple anomalies: case report. Fertil Steril 2009;92:1496-1498. Balakier H, Bouman D, Sojecki A, Librach C, et al. Morphological and cytogenetic analysis of human giant oocytes and giant embryos. Hum Reprod 2002;17:2394-2401. Balaban B, Urman B, Isiklar A, Alatas C, et al. The effect of pronuclear morphology on embryo quality parameters and blastocyst transfer outcome. Hum Reprod 2001;16:2357-2361. Antczak M, van Blerkom J. Temporal and spatial aspects of fragmentation in early human embryos: possible effects on developmental competence and association with the differential elimination of regulatory proteins from polarized domains. Hum Reprod 1999;14:429-447. Balakier H, Cadesky K. The frequency and developmental capability of human embryos containing multinucleated blastomeres. Hum Reprod 1997;12:800-804. Balaban B, Yakin K, Urman B. Randomized comparison of two different blastocyst grading systems. Fertil Steril 2006;85:559-563. Braude P, Bolton V, Moore S. Human gene expression first occurs between the four -and eight- cell stages of preimplantation development. Nature 1988;333:459-461. Cutting R, Morroll D, Roberts SA, Pickering S, et al. Elective single embryo transfer: guidelines for practice British Fertility Society and Association of Clinical Embryologists. Hum Fertil 2008;11:131-146.

Efecto del factor masculino en el desarrollo embrionario Esperanza Carballo Mondragón Centro Mexicano de Fertilidad Dr. Alberto Kably. Vialidad de la Barranca s/n, consultorio 240. Hospital Ángeles Lomas, Estado de México, México. Correo electrónico: perita_1@yahoo.com

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Durante mucho tiempo se pensó que el espermatozoide sólo aportaba el genoma. Actualmente está demostrado que uno de los primeros procesos que ocurre durante la fecundación es el incremento de la concentración

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de calcio intracelular, que puede variar durante horas después de la fusión ovocito-espermatozoide. Esta elevación del calcio causa una exocitosis de los gránulos corticales que se localizan en toda la región cortical del ovocito, por debajo de la zona plasmática; estos gránulos contienen enzimas que se esparcen en el espacio perivitelino, modificando su estructura para evitar que otro espermatozoide penetre en la zona (prevención de la poliespermia) formando la membrana de fertilización. La entrada del espermatozoide también reactiva el ciclo celular del ovocito bloqueado en MII para que concluya la meiosis II, marcando la entrada a la división celular por mitosis. Después de la activación se degrada la proteína MAP cinasa, que mantenía la cromatina condensada del ovocito durante su transición de MI a MII, previniendo la formación de la envoltura nuclear. Los mayores cambios en el patrón de síntesis de proteínas ocurren durante la activación del ovocito; hay reclutamiento del ARN mensajero materno presente en el citoplasma del ovocito y modificaciones transcripcionales, esenciales para la fertilización y el desarrollo embrionario.1 La contribución genética que aporta el espermatozoide es de vital importancia para la embriogénesis; pero ésta puede dañarse cuando hay daño al ADN.2 Un daño excesivo al ADN puede, a su vez, dañar la fertilidad del hombre, disminuyendo la capacidad de fertilización, además de tener un efecto negativo en el embrión, lo que predispone a enfermedades genéticas, defectos en el nacimiento y niños con cáncer.2-4 Además, una de las principales preocupaciones es la posibilidad del aumento de malformaciones con el uso de técnicas de reproducción asistida. En un estudio efectuado en Australia, se encontró una tasa de malformaciones de 6 a 8% en técnicas de reproducción asistida, comparada con la población general, en la que fue de 2 a 3% y mostró mayor asociación con la microinyección intracitoplasmática de espermatozoides que con la fertilización in vitro convencional, lo que es de esperarse, porque con la microinyección intracitoplasmática de espermatozoides, las muestras seminales tienen mayores alteraciones, encontrándose en varios estudios una asociación entre las malformaciones y la subfertilidad. Asimismo, existen estudios que sugieren aumento en la incidencia de trastornos de impronta genómica que Volumen 6, núm. 2, octubre-diciembre, 2013

incluyen el síndrome de Beckwith-Wiedemann y el de Angelman, que son los más asociados con técnicas de reproducción asistida de alta complejidad.2,5 Debido a que los ovocitos son capaces de reparar cierto daño del ADN del espermatozoide, existe cierta confusión en los estudios al tratar de conocer qué tanto aporta el factor masculino al desarrollo embrionario. Si bien no todo se puede corregir, hoy en día hay alternativas de tratamiento para mejorar los resultados y prevenir problemas en las generaciones futuras.6,7 Actualmente, el análisis seminal provee datos básicos, pero muy importantes, para tomar decisiones en cuanto a la capacidad de fertilidad del varón y la posibilidad de tratamiento. Debido a la necesidad de unificación de criterios, en 2010 se presentó el manual de la Organización Mundial de la Salud8 relativo a la evaluación seminal, el cual es un instrumento de guía para el mejor conocimiento de las características espermáticas. El análisis de rutina incluye la determinación de características como licuefacción, viscosidad, pH, además de los valores microscópicos, como concentración, movilidad y morfología. Es importante tomar en cuenta el resultado completo; por ejemplo, un volumen bajo, acompañado de ausencia de espermatozoides con un pH bajo, puede indicar ausencia de conductos deferentes. También se debe tomar en cuenta que el resultado completo proporciona mejor información para tomar decisiones terapéuticas. A pesar de que el análisis seminal básico aporta evidencias importantes, está demostrado que no es suficiente para tener factores de predicción precisos; por lo mismo, es necesario recurrir a estudios alternos que puedan indicar alteraciones que afecten la fertilidad.7,8 Se ha descrito un gran número de mecanismos y moléculas asociados con la función espermática que son útiles para evaluar la capacidad reproductiva, especialmente en lo relativo a la integridad del ADN, el estado de maduración del espermatozoide y la apoptosis. Además, se han encontrado factores de crecimiento y ARN mensajero que pueden dar un nuevo enfoque a la enfermedad y a las opciones de tratamiento. Si bien muchos de estos estudios aún están en investigación, existen algunas pruebas bien establecidas que sirven como estudios alternos para determinar alteraciones específicas.7

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Otro aspecto importante a considerar siempre, además del análisis seminal, es tener una historia clínica que pueda ser complementada con los estudios básicos y que incluya el estado físico general del varón, índice de masa corporal, edad, estudios hormonales básicos, tabaquismo, antecedentes familiares, hereditarios y personales.9 Algo tan simple como el índice de masa corporal proporciona datos importantes en el campo de la reproducción asistida. Aunque el aumento en el IMC en el varón no se ha estudiado de manera extensa, se sabe que conlleva un riesgo de enfermedades metabólicas e hipertensión, así como alteraciones hormonales, disminución de la testosterona, aumento de los estrógenos y alteraciones de las gonadotropinas y de la inhibina B, que es un marcador de la función de las células de Sertoli y, por tanto, de la espermatogénesis. Al mismo tiempo, la cuenta espermática se correlaciona de manera inversa con aumento en el IMC y este efecto es más evidente en casos de obesidad (>35 kg/m2) que en casos de sobrepeso.9 Por otra parte, se creía que el potencial fértil del hombre se preservaba bien con la edad; sin embargo, las evidencias recientes apoyan el hecho de que con el tiempo hay un aumento en la necrosis, daño en el ADN por apoptosis, disminución de la movilidad progresiva y en la morfología. Con el tiempo, también se afecta la actividad testicular, ya que disminuye la función de las células de Leydig, que lleva a la disminución de la testosterona y al número de espermatogonias tipo A.1,10 Este hecho no sólo afecta la fertilidad, sino también aumenta las aneuploidías y el riesgo es igual para hombres de 40 años como para mujeres mayores de 35 años.11 A mayor edad aumenta el tiempo de concepción y la tasa de abortos. Hay estudios que demostraron que el riesgo de muerte fetal es el doble en hombres de 45 años, comparado con hombres de 30 años. Esto tiene sentido, ya que está comprobado que puede haber una disminución de al menos 10% en la fertilización cuando se usan muestras seminales de hombres de más de 39 años, así como reducción en la formación de blastocistos cuando se utilizan muestras seminales de varones mayores de 50 años.3 En nuestra experiencia en inseminación intrauterina, el embarazo disminuye de manera significativa después de los 50 años. En general, varios autores establecieron un punto de alerta a los 40 años.1,12

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En la historia clínica puede surgir la necesidad de realizar estudios genéticos. A pesar de que la mayoría de los niños nacidos por técnicas de reproducción asistida son sanos, hay un ligero aumento por microinyección intracitoplasmática de espermatozoides en la prevalencia de aneuplodías en cromosomas sexuales (0.2 a 0.6%) y en anormalidades cromosómicas autosomales (0.04 a 0.07%). La técnica por sí misma no causa estas alteraciones, sino que se deben a que mediante la microinyección intracitoplasmática de espermatozoides se trata la mayoría de casos con infertilidad masculina. Estudios genéticos demostraron que durante las fases I y II de la meiosis masculina puede ocurrir la no disyunción, lo que resulta en un complemento cromosómico anormal. El entrecruzamiento en la meiosis es importante porque contribuye a la variabilidad genética y provee la conexión física para la apropiada segregación de los cromosomas. Cada cromosoma bivalente debe contener al menos un sitio de recombinación. En ausencia de entrecruzamiento puede ocurrir una no disyunción. Los cromosomas más pequeños, como el 21 y el 22, tienen mayor frecuencia de aneuploidías. En pacientes subfértiles hay aumento de aneuploidías en los espermatozoides; aparte de que en pacientes con oligozoospermia severa se incrementa la tasa de disomías.1,6,13 Cuando se compararon sondas tradicionales (13, 18, 21, 22, X y Y) se encontró 4% de anormalidades en hombres subfértiles con parámetros seminales anormales, comparado con 1.2% en donadores, y aunque no parece ser muy significativo, el incremento es importante porque las anormalidades cromosómicas son causa de abortos.6 Hay que tener especial atención en los pacientes con azoospermia no obstructiva, ya que son quienes tienen mayor incidencia de aneuploidías, especialmente de cromosomas sexuales. Se estableció que aunque las tasas de fertilización pueden ser iguales con azoospermia no obstructiva y azoospermia obstructiva, hay mayores tasas de embarazo y menor tasa de abortos con esta última.1,13,14 A pesar de que existen muy buenos resultados con las técnicas de reproducción asistida en pacientes con azoospermia, en azoospermia no obstructiva existe mayor riesgo de trasmitir un número anormal de cromosomas a la descendencia, por lo que se sugiere que, de cualquier manera, se realice el diagnóstico genético preimplantacional en estos casos.13 Reproducción

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En cuanto a las microeliminaciones del cromosoma Y, éstas se asocian más con azoospermia y su prevalencia es de 10 a 15%. Los hombres con este tipo de infertilidad no tienen síntomas obvios, pero el examen físico puede revelar testículos pequeños, criptorquidia o varicocele; incluso existen reportes que sugieren que la deleción AZFc, de la región crítica, puede incrementar el riesgo de cáncer testicular. Es básico considerar las eliminaciones en las técnicas de reproducción asistida, ya que éstas se trasmiten a los hijos y si bien no afectan la fertilización ni el embarazo, se observó que la misma eliminación puede o no causar infertilidad entre los integrantes de una misma familia; de manera que si el padre es portador, los hijos pueden ser infértiles como él.13,14 El acortamiento anormal de los telómeros es otro evento genético que puede aparecer en la infertilidad masculina, pero en la embriogénesis de modelos animales. En ratones se observó que en cada ciclo de división celular, los telómeros reducen su número de copias, lo que resulta en menor tasa de fertilización, aumento de fragmentación embrionaria, mayor apoptosis en las células embrionarias y menor tasa de blastocistos.6 Por otra parte, el estudio del daño del ADN es importante, ya que puede indicar infertilidad inexplicable o idiopática cuando la muestra seminal es normal, en los casos donde no hay evidencia de afección femenina. Se encontró que la falla genómica en el hombre puede deberse a daño en el ADN y que no necesariamente se correlaciona con los parámetros seminales.14 El uso de espermatozoides con un pequeño daño de ADN puede ser compensado por el ovocito, dependiendo también del grado de alteración. Se demostró que un daño puede ser promutagénico y que las mutaciones generadas durante el proceso de fertilización el ovocito las repara antes de la primera división mitótica. Las mutaciones que ocurren en este punto se fijan en la línea germinal y pueden implicar, entre otros ejemplos, riesgos de infertilidad, niños con cáncer y recién nacidos con enfermedades de impronta genética.6,14 El aumento en el índice de fragmentación del ADN en el espermatozoide afecta el desarrollo embrionario en estadios tempranos con arresto en estadios de seis a ocho células, lo que coincide con la completa activación del genoma embrionario; además de disminución en la tasa Volumen 6, núm. 2, octubre-diciembre, 2013

de embarazo, aumento de abortos, falla en la formación de blastocistos y aumento de aneuploidías.1,6,13 No se ha definido un punto de corte en cuanto al porcentaje del índice de fragmentación del ADN debido a la falta de estandarización en las técnicas que se usan actualmente. La probabilidad de embarazo cuando se realiza inseminación intrauterina es de cero cuando hay 30% de daño con ensayo COMETA y 12% con TUNEL; estos niveles también se correlacionan con la falla en la formación de blastocistos cuando se realiza fecundación in vitro convencional y microinyección intracitoplasmática de espermatozoides.1,14 Algunos estudios demostraron que es mejor realizar la microinyección intracitoplasmática de espermatozoides que la fecundación in vitro convencional cuando existe daño del ADN en el espermatozoide. Asimismo, se encontró que el índice de fragmentación del ADN es mayor en parejas con pérdida gestacional recurrente que en controles de donadores y población general, se sugiere que 39% de estos abortos pueden predecirse al usar cualquiera de los ensayos para la detección del índice de fragmentación del ADN. Estudios con niveles de evidencia A y B mostraron que los casos de aumento del índice de fragmentación del ADN se asocian con concentraciones bajas de folato en el plasma seminal. También se demostró que el tratamiento con ácido fólico (5 mg) y fosfato de cinc (66 mg) puede ofrecer una mejoría de, incluso, 74% en la calidad seminal en hombres subfértiles. Por otro lado, se publicó que el tratamiento con 1 g de vitamina C y E al día, durante dos meses, si bien no se ve reflejado en los parámetros seminales básicos, sí trae como consecuencia un aumento en las tasas de embarazo clínico cuando se emplea microinyección intracitoplasmática de espermatozoides, en comparación con placebo.10,14 Además de lo anterior, puede haber un daño al ADN por alteración de las protaminas (P1, P2), esenciales en la maduración espermática, las cuales intervienen en el empaquetamiento de la cromatina. La desproporción entre las protaminas aparece sólo en hombres infértiles, nunca en los fértiles y se asocia con una baja cuenta espermática, disminución de la movilidad, la morfología y aumento del índice de fragmentación del ADN. La insuficiencia de protaminas lleva a mayores niveles de roura del ADN del espermatozoide. Esto causa altera-

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ciones epigenéticas de origen paterno que, se cree, dan la medida de autonomía durante la expresión génica del cigoto y tienen un efecto adverso en los eventos del desarrollo embrionario. Se encontró que una proporción de 0.8 en P1:P2 correlaciona con la disminución de la fertilización y menores tasas de implantación en las técnicas de reproducción asistida. La haploinsuficiencia de P2 en ratones resultó en arresto embrionario después de la microinyección intracitoplasmática de espermatozoides.1,4-6 En el espermatozoide, las protaminas se reemplazan por histonas nucleares (H2A, H2B, H3 y H4), lo que da como resultado una alta condensación y silenciamiento transcripcional durante la maduración del espermatozoide. En las espermátides redondas, la estructura de la cromatina es similar a las células somáticas. Durante la espermiogénesis, las histonas nucleares se hiperacetilan y poco después se desmontan y reemplazan por histonas específicas testiculares, que son las proteínas de transición (TP1 y TP2). Al final de la espermiogénesis se remueven las proteínas de transición y toman su lugar las protaminas. En el espermatozoide maduro se reemplaza 85% de las histonas.15 Las histonas son un factor que contribuye a la trasmisión de información epigenética y marca regiones de control de impronta en el ADN durante la formación del espermatozoide.15 Las histonas son las más aptas para la trasmisión de información epigenética porque tienen influencia en las modificaciones de la estructura de la cromatina, que modula el acceso a la maquinaria de patrones de organización de los genes. La impronta se registra por marcadores diferenciales de las regiones de ADN con modificaciones de histonas, metilación o posiblemente por ambos para ayudar a la copia del gen a permanecer activo. La impronta y la metilación del ADN determinan cuáles son los genes del genoma paterno y materno que se expresarán en el embrión, lo que es crítico para el desarrollo normal. Las regiones de impronta del ADN se anulan en el ciclo reproductivo, lo que permite que una nueva impronta se establezca en las células germinales.1,4-6 Cuando se recurre a las técnicas de reproducción asistida puede haber consecuencias negativas cuando

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se usan espermatozoides inmaduros, en los que su código epigenético no está bien establecido, lo que causa alteraciones de impronta en los hijos. Los patrones de impronta en el espermatozoide se modifican durante el paso por el epidídimo, donde la metilación del ADN global del espermatozoide se reduce para prepararse para la fertilización, vía desmetilación pasiva. Después de la remoción de las protaminas en la fertilización, las copias de genes paternos se modifican por una desmetilación activa y subsecuentemente los genes maternos y paternos van a una desmetilación pasiva hasta el estadio de mórula. Después de la implantación, la metilación del genoma embrionario toma lugar y se establece la hipermetilación en la masa celular interna.1,5,13 Aunque es difícil establecer los efectos de la metilación reducida, se encontró evidencia de que ésta puede afectar la embriogénesis, lo que se demostró en muestras seminales normales con metilación reducida empleando técnicas de reproducción asistida, donde se observó que aunque no se afecta la fertilización, sí se reduce la tasa de embarazo. No se sabe si la expresión génica paterna es regulada por metilación en el desarrollo embrionario temprano, por lo que el siguiente paso es entender el efecto paterno de la impronta en los embriones preimplantación e identificar si hay metilación específica de los genes paternos. Para apoyar esto hay estudios que muestran que en los ratones, una alteración en los patrones de metilación en las células germinales se transfiere, a través de la línea germinal paterna, a las siguientes generaciones.6,16 La alteración de los patrones de metilación puede resultar en expresiones bialélicas o represión de genes y puede causar malformaciones; además, más de la mitad de los casos de síndrome de Beckwith-Wiedemann y 10% de síndrome de Angelman se asocian con defectos epigenéticos, y se encuentran con más frecuencia en los casos donde se usó la microinyección intracitoplasmática de espermatozoides, por lo que se recomienda el uso de secuenciación de microarreglos para analizar los patrones de metilación en hombres infértiles.1,13 Cualquier alteración en las cantidades y composición de los ARN mensajeros del espermatozoide puede indicar anormalidades y se demostró que las huellas de ARN mensajeros son diferentes en los pacientes normoespérmicos que en los teratozoospérmicos. Estos hallazgos Reproducción

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apoyan la idea de que la alteración en la transcripción durante la espermatogénesis tardía puede afectar la embriogénesis si bien éstos pueden identificarse con microarreglos, pero con la reacción en cadena de la polimerasa se requiere más investigación.1,7 El espermatozoide maduro del eyaculado contiene ARN mensajeros que se clasificaron como residuales de la espermatogénesis, pero recientemente se sugirió que su transferencia durante la fertilización puede tener un significado en la embriogénesis al contribuir al desarrollo correcto de las funciones del embrión, al trasmitir la información epigenética. Existe evidencia de que las características fenotípicas del embrión pueden estar influidas por ARN mensajero de contribución paterna. Los ARN mensajeros se relacionan con la singamia, con el desarrollo embrionario y existe evidencia de que son necesarios para el desarrollo del cigoto antes de la activación del genoma embrionario.1,7,13 Hay estudios que muestran una reducción temporal y selectiva de ARN mensajero en el ovocito, que puede tener un papel importante en la preservación de la embriogénesis normal, y aporta evidencia adicional de que los ARN mensajeros del espermatozoide pueden tener efectos benéficos en el desarrollo embrionario; además, el hecho de que algunos ARN mensajeros del espermatozoide se encuentran en el cigoto indica que estos transciptomas pueden ser funcionalmente importantes.1,6 Con respecto al papel del espermatozoide en las primeras fases de la fertilización se encontró que en extractos de espermatozoides de mamíferos hay liberación de calcio (Ca+) debido a un estímulo en la producción de IP3, lo que indica que se involucra una proteína fosfolipasa C (PLC) en los mecanismos de señalización, misma que induce variaciones de calcio prolongadas de manera dosis dependiente, lo que incita la activación de los ovocitos. En cuanto a la activación del ovocito, también se observó que cuando hay un centriolo anormal por parte del espermatozoide, también puede haber falla en la activación, pues el centriolo está implicado en el proceso de fertilización, separación de los cromosomas y en la división celular.6,13,17 Los centrosomas anormales del centriolo pueden estar relacionados con la falla en la unión adecuada de los gametos, lo que causa errores y arresto en el desaVolumen 6, núm. 2, octubre-diciembre, 2013

rrollo embrionario. Cuando los espermatozoides son extraídos del testículo antes de su maduración es posible que tengan un centrosoma disfuncional, lo que puede condicionar problemas de segregación de los cromosomas y resultar en embriones con mosaicismo celular y aneuploidías. Se encontró que cuando el centrosoma es defectuoso, esto puede ser causa de abortos.5,6 Durante la fertilización, los centrosomas dan lugar al áster, que provee la organización de los microtúbulos y coordina la posición nuclear de la primera división mitótica, en la que el áster espermático da lugar al centrosoma somático. Se encontró que puede haber incluso 20% de arresto en estadio de pronúcleo por falla en la formación del áster. La transferencia de centriolos normales a los ovocitos es esencial para una adecuada fertilización, pero si hay malformaciones en el mismo, esto se asocia con fenómenos dañinos no sólo en la fertilización, sino también en la singamia, lo que resulta en arresto de la división. También puede llevar consigo anormalidades cromosómicas, causando mosaicismo y aneuplidía en el embrión.6,18 Por lo anterior, se recomienda que cuando se use la microinyección intracitoplasmática de espermatozoides, se haga una selección del espermatozoide basada también en la morfología de la pieza intermedia. Se demostró que una proporción de >1.5 disminuye la formación del áster, comparada con el control; pero cuando la alteración del centriolo no es tan anormal, los embriones no se arrestan, aunque hay incremento en la tasa de aborto. La globozoospermia es un ejemplo en donde no sólo está afectada la cabeza, sino también tiene esta disfunción del centrosoma.15 El estudio del factor masculino es muy importante y ya no es posible dejarlo a un lado en el estudio integral de la pareja. Para tener mejores resultados es necesario realizar primero una historia clínica completa, donde se incluyan los estudios básicos; pero, si es el caso, se debe recurrir a las pruebas diagnósticas y al tratamiento médico cuando sea necesario. Es obligatorio valorar cada paso en la terapéutica de las parejas para tomar decisiones y recordar que la edad es muy importante. Finalmente, todavía hay mucho por investigar y descubrir en cuanto a diagnóstico y tratamiento, por lo

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que debemos estar informados para ofrecer las mejores oportunidades a los pacientes.

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REFERENCIAS 1. 2. 3.

8. 9.

Nanassy L, Carrell DT. Paternal effects on early embryogenesis. The J Clin Embryol 2008;11:9-28. Editorial. Malformation risk in subfertile couples. Reprod BioMed Online 2012;25,225-226. Frattarelli JL, Miller KA, Miller BT, Elkind-Hirsch K, et al. Male age negatively impacts embryo development and reproductive outcome in donor oocyte assisted reproductive technology cycles. Fertil Steril 2008;90:97-103. Miller D, Brinkworth M, Iles D. Paternal DNA packaging in spermatozoa: more than the sum of its parts? DNA, histones, protamines and epigenetics. Reproduction 2010;139:287301. Kobayashi H, Sato A, Otsu E, Hiura H, et al. Aberrant DNA methylation of imprinted loci in sperm from oligospermic patients. Hum Mol Genet 2007;16:2542-2551. Emery BR, Carrell DT. The effect of epigenetic sperm abnormalities on early embryogenesis. Asian J Androl 2006;8:131-142. Garrido N, García-Herrero S, Meseguer M. Assessment of sperm using ARNm microarray technology. Fertil Steril 2013;99:1008-1022. WHO. Laboratory manual for the examination and processing of human semen. 5a ed. WHO Press, 2010. Chavarro JE, Toth TL, Wright DL, Meeker JD, et al. Body mass index in relation to semen quality, sperm DNA inte-

11.

12.

13.

14. 15.

16. 17.

18.

grity, and serum reproductive hormone levels among men attending an infertility clinic. Fertil Steril 2010;93:2222-2231. De La Rochebrochard E, de Mouzon J, Thépot F, Thonneau P, French National IVF Registry (FIVNAT) association. Fathers over 40 and increased failure to conceive: the lessons of in vitro fertilization in France. Fertil Steril 2006;85:1420-1424. Escudero T, Abdelhadi I, Sandalinas M, Munne S. Predictive value of sperm fluorescence in situ hybridization analysis on the outcome of preimplantation genetic diagnosis for translocations. Fertil Steril 2003;79:1528-1534. Carballo ME, Roque A, Durán-Monterrosas LA, Kably AA. El valor de la edad paterna en los resultados de inseminación intrauterina. Ginecol Obstet Mex 2013;81:329-333. O’Flynn KL, O’Brien BA, Varghese AC, Agarwal A. The genetic causes of male factor infertility: A review. Fertil Steril 2010;93:1-12. Esteves SC, Agarwal A. Novel concepts in male infertility. Inter Braz J Urol 2011;37: 5-15. Holstein AF, Schulze W, Davidoff M. Understanding spermatogenesis is a prerequisite for treatment. Reprod Biol Endocrinol 2003;1:107. Sakkas D, Huszar. Paternal effects on reproductive outcome the clinical embryologist 2006;9:23-26. Saunders CM, Larman MG, Parrington J, Cox LJ, et al. PLC: a sperm-specific trigger of Ca2+ oscillations in eggs and embryo. Development 2002;129:3533-3544. Ugajin T, Terada Y, Hasegawa H, Nabeshima H, et al. The shape of the sperm midpiece in intracytoplasmic morphologically selected sperm injection relates sperm centrosomal function. J Assist Reprod Genet 2010; 27:75-81.

Polimorfismos cromosómicos: ¿realmente debemos considerarlos variantes normales?

Francisco Rocha Cárdenas, María del Carmen Acuña González, Conrado Emilio Uria Gómez Correspondencia: Francisco Rocha Cárdenas. Biogenrep, Centro Especializado en Genética Reproductiva, SC. Adolfo Prieto 1338, colonia Del Valle, CP 03100, México, DF. Correo electrónico: frocha@biogenrep.com

Cromatina y niveles de compactación del ADN

La integración del conocimiento generado a través de innumerables observaciones microscópicas referentes a la actividad y división celular en eucariontes,1,2 de la descripción de la estructura del ácido desoxirribonucleico3 y, recientemente, de la secuencia completa del genoma

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humano,4 pemitieron no sólo entender el mecanismo de duplicación del material genético y su organización nuclear, sino que también dio paso al concepto de la regulación de expresión de genes, que se traduce en el encendido o apagado de los mismos en momentos determinados del desarrollo de un organismo o específicos de un tejido.5 Esta regulación genética está mediada a través de complejos multiproteicos que en asociación con el ADN es lo que conocemos como cromatina. La unidad fundamental de la cromatina que confiere un alto grado de compactación al material genético es el nucleosoma, que está constituido por un octámero de histonas (dos

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de cada una de las proteínas denominadas H2A, H2B, H3 y H4) y alrededor de éste interaccionan 147 pares de bases de ADN que conforman una fibra de 10 nm. Con la incorporación de una quinta histona, la histona H1, se pasa al nivel superior de compactación, representado por un grupo de seis nucleosomas, llamado solenoide o fibra de 30 nm. Posteriormente, en su estructura de solenoide se forman asas de cromatina que comprenden decenas de kilobases y que constituyen un cromosoma (Figura 1). Poco se conoce acerca de los aspectos moleculares de compactación entre el solenoide y el nivel superior de compactación, que es el cromosoma en metafase.6 No obstante, la evidencia indica que la compactación del ADN desde cromatina a cromosoma ocurre de manera gradual durante la fase G2 del ciclo celular; mientras que el proceso inverso, la descompactación del ADN, inicia después de la división celular (fase M) y continúa durante la fase G1 hasta alcanzar de nuevo la condición difusa, que permite la replicación (fase S).7 El proceso es dinámico, y por las evidencias bioquímicas y genéticas disponibles, debemos asumir que la estructura de la cromatina, lejos de representar una estructura estática, desempeña un papel bastante dinámico, sobre todo en

lo que se refiere a la transcripción, como veremos a continuación.8,9 Cromatina en interfase: eucromatina y heterocromatina

La fase más larga del ciclo celular, que ocupa casi 90% del ciclo, es la interfase. En este periodo las células, aun cuando permanecen sin dividirse, están en una etapa de alta funcionalidad, puesto que los genes se transcriben y el ADN se replica como preparación para la división. La mayor parte de la cromatina en interfase (alrededor de 90%) se encuentra relativamente sin condensar y distribuida por todo el núcleo (Figura 2). Se le identifica como eucromatina, es la región más rica en genes y al ser más accesible al corte del ADN, por parte de endocucleasas, interactúa con ADN polimerasas, ARN polimerasas y factores de transcripción; en consecuencia, es transcipcionalmente activa.10 Al contrario de la eucromatina, alrededor de 10% de la cromatina en interfase se encuentra en un estado muy condensado y, por ende, transcripcionalmente inactivo.

Figura 2. Distribución de cromatina en núcleos de blastómeras de preembriones humanos. Obsérvense las distintas configuraciones que puede adoptar la cromatina en interfase.

Figura 1. Niveles de compactación del ADN a partir de su estructura de doble hélice, interacción con proteínas para constituir la cromatina y su superenrollamiento hasta alcanzar el grado máximo de compactación, en forma de cromosoma. Modificada de la referencia 41.

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Hablamos de la heterocromatina, que se divide en heterocromatina facultativa, que contiene información de algunos genes que no se expresan o que se expresan en algún momento (como el corpúsculo de Barr), y la heterocromatina constitutiva, formada por secuencias de ADN altamente repetitivas y comprimidas, como secuencias satélite, generalmente escasas de genes.11 Esta heterocromatina es altamente polimórfica, quizá debido a la inestabilidad del ADN satélite, y que puede afectar no solamente al tamaño, sino también a su localización,12

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ya que puede visualizarse en regiones centroméricas y satélite de los cromosomas en metafase. Cromosomas metafásicos y su estudio

El máximo grado de compactación de la cromatina, en donde el ADN se condensa cerca de 10,000 veces, se alcanza cuando las células entran en mitosis, y adquieren entonces el aspecto típico de los cromosomas metafásicos. Esta cromatina altamente condensada no puede ser utilizada como molde para la síntesis de ácido ribonucleico, de tal manera que la transcripción cesa completamente durante la división celular.11 Bajo condiciones de laboratorio relativamente sencillas13,14 es posible obtener preparaciones que permiten observar, a través de microscopia óptica convencional, el alto grado de compactación de la cromatina en metafase (Figura 3). Ello no sólo permitió establecer la dotación cromosómica o cariotipo de distintas especies, incluyendo la humana, sino que además facilitó la detección de poliploidías (tres o más juegos completos de cromosomas) y aneuploidías (ganancia o pérdida de un cromosoma), características de diversas entidades clínicas, como el aborto espontáneo y recurrente, los síndromes de Down, de Edwards, de Patau, de Klinefelter

Figura 3. Cromosomas en metafase obtenidos de cultivo de linfocitos de sangre periférica con patrón de bandas G.

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y de Turner, entre otros.15-19 De manera complementaria, con el uso de diferentes tratamientos (desnaturalización con calor o degradación enzimática de la cromatina) y posterior tinción con colorantes específicos para ADN, es posible obtener patrones característicos de bandas claras y oscuras, también con aplicación clínica, ya que permiten la identificación de anomalías estructurales (translocaciones, inversiones y eliminaciones, entre otras), asociadas con pérdida del embarazo, muerte perinatal, malformaciones y retraso mental.20-22 El bandeo de cromosomas no es consecuencia de agrupamientos casuales, sino que está relacionado con la organización estructural del genoma y refleja variaciones como la composición de bases, grado de condensación cromosómica, conformación de la cromatina, secuencias repetitivas y no transcritas.7 Polimorfismos cromosómicos: frecuencia y repercusión en la reproducción humana

Los patrones de bandeo de cada cromosoma son prácticamente idénticos en células diferentes y en casi todos los tejidos, pero pueden diferir entre individuos. 23 Estas diferencias se conocen como polimorfismos o variantes cromosómicas y se deben al aumento de la heterocromatina constitutiva. Al menos 9 de los 24 cromosomas humanos tienen variantes en la longitud de ciertos segmentos, principalmente en las regiones centroméricas, constricciones secundarias y satélites. Las más frecuentes suelen implicar a los cromosomas 1, 9, 16 y a los cromosomas acrocéntricos (13, 14, 15, 21, 22 e Y).12,24 Figura 4 La incidencia de los polimorfismos cromosómicos se estima en 3.1% en la población general de distintas regiones geográficas;24 desde el punto de vista clínico, aparentemente no tienen un efecto fenotípico. 25 No obstante, se pueden trasmitir a la descendencia y en años recientes se propuso que podrían estar asociados con la aparición de distintas alteraciones reproductivas, entre ellas, la infertilidad, en la que se documentó que su frecuencia alcanza, incluso, 58.6% en varones infértiles y 28.3% en mujeres infértiles.26 En nuestro centro, durante los últimos tres años, de 263 individuos referidos para cariotipo por infertilidad, la incidencia de polimorfismos heterocromáticos en linfocitos de sangre periférica fue de 12.7% en mujeres Reproducción

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Figura 4. Polimorfismos heterocromáticos visualizados en distintos cromosomas. Se muestran cromosomas normales y sus respectivas variantes. El cromosoma 9 es el que, en nuestra experiencia, tiene más variantes.

y de 29.2% en varones; las variantes del cromosoma 9 son las más frecuentes, seguidas por el aumento de tallos en el brazo corto del cromosoma 21 y por el aumento de la heterocromatina en el brazo largo del cromosoma Y. Hallazgos consistentes con otras poblaciones infértiles estudiadas27-29 motivan proponer la realización de estudios prospectivos y multicéntricos con estricto apego a criterios de inclusión/exclusión, tamaños de muestra con amplio poder de prueba estadística, así como valorar el estudio de poblaciones con un mismo origen étnico o geográfico para posteriormente compararlas con otras de distinto origen y de esta manera tener evidencias más contundentes acerca de cómo los polimorfismos cromosómicos pueden repercutir no sólo en la infertilidad, sino también en la aparición de abortos espontáneos y recurrentes, dado que varios estudios también refieren que en estas afecciones, la presencia de variantes cromosómicas en uno o ambos integrantes de la pareja es más frecuente.30-32 Asociación con mala calidad embrionaria e incremento de aneuploidías

Debido a que diversos genes que participan en el desarrollo embrionario se localizan en la heterocromatina,33,34 no es nada ilógico pensar que los polimorfismos puedan afectar el comportamiento de embriones generados Volumen 6, núm. 2, octubre-diciembre, 2013

mediante técnicas de reproducción asistida. Bajo esta premisa existe un estudio precursor que valora la calidad embrionaria de parejas sometidas a inyección intracitoplasmática de espermatozoides, en donde al menos uno de los integrantes tenía una variante cromosómica en el cariotipo, en comparación con parejas sometidas a la misma técnica, pero con cariotipos normales.29 De los ciclos estudiados, y tras realizar una evaluación de acuerdo con una de las directrices de valoración morfológica más eficientes en la actualidad,35 se observó una diferencia estadísticamente significativa de embriones de mala calidad en pacientes portadores de polimorfismos que en embriones de individuos con cariotipo normal. Además, y a pesar de que la tasa de aborto no es significativamente mayor en los ciclos con polimorfismos, sí hay una tendencia a su aparición, en comparación con ciclos con cariotipos normales, lo que acaba por reafirmar su posible participación en la pérdida del embarazo. Finalmente, y complementario a lo anterior, los polimorfismos también pueden incrementar el riesgo de aneuploidías en los gametos y, por ende, en los embriones. Varios estudios demostraron que la existencia de variantes cromosómicas se relaciona con la alteración principalmente de la espermatogénesis, lo que sugiere que podrían tener un efecto en la meiosis.27,36,37 En embriones de parejas con polimorfismos heterocromáticos, a los que se realizó biopsia de blastómeras para diagnóstico genético preimplantacional mediante FISH, se observaron diferencias estadísticamente significativas en el número de embriones aneuploides, al compararse contra un grupo control (cariotipo normal). También se encontró mayor porcentaje de embriones con haploidías y poliploidías.38 De lo referido, debe insistirse en la importancia de solicitar un estudio citogenético no sólo a cualquier pareja apta para someterse a técnicas de reproducción asistida, sino también a los donantes de gametos. Más aún, debemos tener en cuenta proponer a parejas con polimorfismos cromosómicos la utilidad del diagnóstico genético preimplantacional. Perspectivas

El desarrollo de métodos de laboratorio asociados con la identificación de modificaciones en la cromatina (acetilación, metilación) y la incorporación de nuevas

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tecnologías, como la hibridación genómica comparativa en sus diferentes variantes (convencional, arrays, SNPs), permiten el abordaje molecular de los polimorfismos cromosómicos que terminarán, muy probablemente, por demostrar el verdadero papel de los polimorfismos heterocromáticos y su participación en distintas enfermedades, entre ellas las asociadas con la fertilidad humana.39,40 REFERENCIAS 1. 2. 3.

6. 7.

10.

11. 12.

13.

14.

15.

122

Wilson EB. The cell in development and inheritance. 2ª ed. New York: MacMillan, 1900;483. Gilbert SF. Developmental biology. 10ª ed. USA: Sinauer Assoc, 2013;750. Watson JD, Crick FH. Molecular structure of nucleic acids; a structure for deoxyribose nucleic acid. Nature 1953;171:737738. International Human Genome Sequencing Consortium. Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature 2004;431:931-945. Recillas Targa F. La regulación de la cromatina, el switch en el encendido y apagado de genes. Comunicado Academia Mexicana de Ciencias 2013;28 Junio. Disponible en http://www.comunicacion.amc.edu.mx/comunicados/ la-regulacion-de-la-cromatina-el-switch-en-el-encendidoy-apagado-de-genes/ Babbitt GA. Chromatin evolving. American Scientist 2011;99:48-55. Luque J, Herráez A. Texto ilustrado de biología molecular e ingeniería genética. Conceptos, técnicas y aplicaciones en ciencias de la salud. 1ª ed. Madrid: Elsevier, 2006;83-96. Lemon B, Tjian R. Orchestrated response: a symphony of transcription factors for gene control. Genes Dev 2000;14:2551-2569. Recillas Targa F, Zurita Ortega ME. Control de la expresión genética en eucariontes. En: Jiménez LF, Merchant H, editores. Biología celular y molecular. México: Prentice Hall, 2003;63-101. Turner BM. Chromatin and gene regulation: Molecular mechanisms in epigenetics. Great Britain: Blackwell Science, 2001. Cooper GM. La célula. 2ª ed. Madrid: Marbán, 2004;146-154. Mattei MG, Lucini J. Heterochromatin, from chromosome to protein. Atlas of genetics and cytogenetics in oncology and heaematology. January 2003. Disponible en http://atlasgeneticsoncology.org//Deep/HeterochromatineDEEP.html Smith K. Basic cytogenetic techniques: Culturing, slide making and G banding. En: Celis JE, editor. Cell biology. A laboratory handbook. Vol. 3. China: Elsevier Academic Press, 2006;381-386. Contreras Bravo NC, Silva Aldana CT, Mateus Arbelaez HE. Citogenética aplicada a la medicina. Bogotá: Universidad del Rosario, 2009. Warburton D, Kline J, Stein Z. Cytogenetic abnormalities in spontaneous abortions of recognized conceptions. In:

16. 17.

18.

19.

20.

21.

22.

23.

24. 25.

26.

27.

28.

29.

30.

31.

32.

Porter IH, Willey A, editors. Perinatal genetics: diagnosis and treatment. New York: Academic Press, 1986;133. Hassold T, Hunt P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet 2001;2:280-291. Lakovschek IC, Streubel B, Ulm B. Natural outcome of trisomy 13, trisomy 18, and triploidy after prenatal diagnosis. Am J Med Genet A 2011;155A:2626-2633. López P, López R, Noriega L, Sepúlveda S. Diagnóstico genético preimplantacional: Análisis de aneuploidías únicas. An Fac Med 2013;74:11-14. Acevedo-Gallegos S, García M, Benavides-Serralde A, Camargo-Marín L, et al. Association between selected structural defects and chromosomal abnormalities. Rev Invest Clin 2013;65:248-254. Fischer J, Colls P, Escudero T, Munné S. Preimplantation genetic diagnosis (PGD) improves pregnancy outcome for translocation carriers with a history of recurrent losses. Fertil Steril 2010;94:283-289. Rodríguez L, Martínez-Fernández ML, Mansilla E, Mendioroz J, et al. Screening for subtelomeric chromosome alteration in a consecutive series of newborns with congenital defects. Clin Dysmorphol 2008;17:5-12. Martínez-Frías ML, Martínez-Fernández ML. A highly specific coding system for structural chromosomal alterations. Am J Med Genet A 2013;161A:732-736. Brown T, Robertson FW, Dawson BM, Hanlin SJ, et al. Individual variation of centric heterochromatin in man. Hum Genet 1980;55:367-373. Bashin M. Human population cytogenetics: a review. Int J Hum Genet 2005;5:83-152. Gadner RJ, Stuherland GR. Variant chromosomes and abnormalities of no phenotypic consequence. In: Gadner RJ, Stuherland GR, Shaffer, editors. Chromosome abnormalities and genetic counselling. USA: Oxford University Press, 2012;257-268. Minocherhomji S, Athalye AS, Madon PF, Kulkarni D, et al. A case-control study identifying chromosomal polymorphic variations as forms of epigenetic alterations associated with the infertility phenotype. Fertil Steril 2009;92:88-95. Cortés-Gutiérrez EI, Cerda-Flores RM, Dávila-Rodríguez MI, et al. Chromosomal abnormalities and polymorphisms in Mexican infertile men. Arch Andrology 2004;50:261265. Madon PF, Athalye AS, Parikh FR. Polymorphic variants on chromosomes probable play a significant role in infertility. Reprod Biomed Online 2005;11:726-732. Poveda M, Rubio T, Ochando I, Gil L, et al. Las variantes cromosómicas afectan la calidad embrionaria. Rev Asoc Est Biol Rep 2010;15:19-23. Dubey S, Chowdhury M, Prahalad B, et al. Cytogenetic causes for recurrent spontaneous abortion–an experience of 742 couples (1484 cases). Indian J Hum Gen 2005;11:94-98. Iyer P, Wani L, Joshi S, et al. Cytogenetic investigations in couples with repeated miscarriages and malformed children: report of a novel insertion. Reproductive BioMedicine Online 2007;14:314-321. De la Fuente-Cortés BE, Cerda-Flores RM, Dávila-Rodríguez MI, García-Vielma C, et al. Chromosomal abnormalities

Reproducción

Laboratorio de reproducción asistida

33.

34.

35.

36.

and polymorphic variants in couples with repeated miscarriage in Mexico. Reprod Biomed Online 2009;18:543-548. Probst AV, Almouzni G. Pericentric heterochromatin: dynamic organization during early development in mammals. Differentiation 2008;76:15-23. Assou S, Boumela I, Haouzi D, Anahory T, et al. Dynamic changes in gene expression during human early embryo development: from fundamental aspects to clinical applications. Hum Reprod Update 2011;17:272-290. Ardoy M, Calderón G. Criterios ASEBIR de valoración morfológica de oocitos, embriones tempranos y blastocistos humanos. 2ª ed. Madrid: Asociación para el Estudio de la Biología de la Reproducción, 2008. Kayhan Y, Basak B, Bulent U. Is there a posible correlation between chromosomal variants and spermatogenesis? Int J Urol 2005;12:984-989.

37. Rueda J, Moreno JM, Ochando I, Gil L, et al. Chromosome heteromorphisms in infertile copules. Chromosome Res 2007;15:35-36. 38. García-Guixé E, Jiménez-Macedo A, Arjona, Giménez C, et al. Polimorfismos heterocromáticos y riesgo incrementado de aneuploidías en embriones preimplantacionales. Rev Iberoam Fert Rep Hum 2010;27:214. 39. Craig JM, Wong NC. Epigenetics: A referente manual. Great Britain: Caister Academic Press, 2011. 40. Dávila-Rodríguez MI, Cortés Gutiérrez EI, Cerda Flores RM, Pita M, et al. Constitutive heterochromatin polymorphisms in human chromosomes identified by whole comparative genomic hybridization. Eur J Histochem 2011;55:28. 41. Coco R, Arribere R. Nacer Bien. Consideraciones científicas, éticas y legales del inicio de la vida. Buenos Aires: Tiempo editorial, 2005;27.

Técnicas ómicas en reproducción asistida

Paloma Neri Vidaurri Agrarismo 208, 1er piso, torre A, colonia Escandón, CP 08500, México, DF. Correo electrónico: palnevi@ceerh.com.mx

Hasta hace apenas unos años, los criterios de selección embrionaria se basaban solamente en la morfología del embrión al momento de realizar la transferencia, y dependían, además, del juicio del biólogo, en donde los patrones de alineación de los pronúcleos, la simetría y morfometría de las blastómeras y el desarrollo a blastocisto eran los mejores marcadores para seleccionar a los embriones a transferir; sin embargo, muchas veces los embriones con alineación de pronúcleos, con blastómeras simétricas y sin fragmentos no tenían el potencial de formar un blastocisto, o viceversa. Aun si se llevan los embriones a cultivo prolongado, para una selección más estricta, alrededor de 40% de los blastocistos, con un desarrollo aparentemente normal son cromosómicamente anormales.1-3 La introducción específicamente de las técnicas moleculares, como el diagnóstico genético preimplantacional o la reacción en cadena de la polimerasa, a las técnicas de reproducción asistida hicieron posible el estudio de los Volumen 6, núm. 2, octubre-diciembre, 2013

embriones humanos en los primeros días de su desarrollo, antes de la concepción, descubriendo que las aneuploidías son frecuentes en los embriones humanos.2,3 Sin embargo, estas técnicas se consideraban invasivas, con riesgo de la viabilidad de los embriones estudiados; además de que se ponía en tela de juicio la eficiencia de la hibridación de las sondas utilizadas, lo que implicó que algunos embriones analizados se calificaran como no informativos para los cromosomas analizados y, por tanto, no se podían seleccionar para la transferencia. Otra situación a discusión son las señales sobrepuestas o cruzadas, pérdidas de señales, múltiple hibridación de las sondas, etcétera; de manera que podrían obtenerse resultados falsos positivos y desecharíamos embriones sanos.4,5 Actualmente, un objetivo común de la selección embrionaria es evitar al máximo la manipulación de los embriones; esto es, que las técnicas de evaluación sean menos invasivas para la selección del mejor embrión, con las mejores posibilidades de implantación, transfiriendo un número menor de embriones y así reducir la incidencia de embarazos múltiples. Los llamados omics –entre los que están los proteomics y genomics– permiten lograr una mejor selección

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embrionaria no invasiva, además de conocer más acerca de los procesos celulares del embrión.6 La proteómica es el estudio a gran escala de las proteínas, en particular de su estructura y función (Anderson, 1998 y Blackstock, 1999).6 Las proteínas son partes vitales de los organismos vivos, ya que son los componentes principales de las rutas metabólicas de las células. El término proteómica se acuñó en 1997 como una analogía con genómica, el estudio de los genes. La palabra proteoma es la fusión de proteína y genoma y fue acuñada por Marc y Wilkins en 1996, mientras trabajaba en ese concepto como estudiante de doctorado.7 El proteoma es la dotación completa de proteínas, incluidas las modificaciones hechas a un conjunto particular de proteínas producidas por un organismo o sistema. Esto varía con el tiempo y con requisitos diferentes, o debido al estrés que sufre una célula o un organismo. La descripción del proteoma permite tener una imagen dinámica de todas las proteínas expresadas, en un momento dado y bajo determinadas condiciones concretas de tiempo y ambiente. El estudio y comparación sistemáticos del proteoma en diferentes situaciones metabólicas o patológicas permite identificar las proteínas cuya presencia, ausencia o alteración se correlacionan con determinados estadios fisiológicos. Uno de los proyectos globales más desarrollados en este aspecto es el estudio de la maduración ovocitaria in vitro. Este tipo de análisis, en el que un amplio rango de proteínas expresadas son investigadas, es esencial para descubrir el uso de biomarcadores del desarrollo y la viabilidad embrionaria.8,9 La proteómica es una ciencia relativamente reciente, desde el desarrollo de esta técnica es definitivamente importante la aplicación de la espectrometría de masas como técnica adjunta al análisis de moléculas biológicas y al crecimiento exponencial en el número de genes o proteínas relacionadas con el potencial embrionario. Esto, combinado con el uso de potentes métodos de fraccionamiento y separación de péptidos y proteínas, como el 2D-PAGE (electroforesis de poliacrilamida de dos dimensiones), la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y la espectrometría de masas con ionización láser (SELDI TOF-MS), permiten consolidar a la proteómica, desde mediados de la década de 1990 del siglo pasado, como ciencia para el análisis masivo de las proteínas.10

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Los primeros hallazgos de la aplicación de la proteómica en embriones permitieron construir y analizar las bases de datos de proteínas de embriones de ratón en la fase de preimplantación.11,12 Otro campo es el estudio de los ovocitos criopreservados, en donde su estado se compara con el estudio de ovocitos frescos en MII. La comparación de dos técnicas de criopreservación, vitrificación y congelacióin lenta reveló que los ovocitos MII vitrificados se parecen a los ovocitos MII en fresco; mientras que los criopreservados en congelación lenta expresaron diferentes patrones de proteínas en regulación ascendente o descendente y estuvieron más presentes en el paso anterior a la siembra, lo que indicó que la exposición crónica al 1,2-propanediol induce cambios fisiológicos en el ovocito.9 Del mismo modo, y también con la aplicación de la técnica de Western Blot, se identificó la expresión de proteínas o para detectar modificaciones trascripcionales, relacionadas con el desarrollo del embrión.13 Con esta técnica se identificó la proteína MVP (major vault protein), que está expresada en embriones porcinos de baja calidad, que no se desarrollaron normalmente in vitro.14 Además, recientemente se utiliza para generar perfiles proteicos en todos los estadios del desarrollo embrionario en mamíferos, observándose diferencias en los perfiles proteicos entre blastocistos tempranos y expandidos, así como entre blastocistos en desarrollo y embriones degenerados.15,16 Se reveló que incluso en blastocistos con morfologías similares se observan diferentes patrones de expresión proteica.9 Embriones viables, con un proteoma, secretan proteínas al medio de cultivo circundante, contribuyendo potencialmente con el secretoma. En consecuencia, un análisis proteómico no invasivo del secretoma de embriones a lo largo de su desarrollo puede ayudar a revelar los factores secretados que reflejan competencia y vialidad en el desarrollo. Un estudio reveló la liberación del factor PAF (1-o-alquil-2-acetil-sn-glicero-3-fosfocolina), soluble, producido y secretado por embriones de mamífero durante su desarrollo; del mismo modo se demostró la presencia de leptina, un pequeño péptido pleiotrópico, en el medio de cultivo de blastocistos en un modelo in vitro que estudiaba las interacciones entre el embrión y las células epiteliales endometriales. 9 También se Reproducción

Laboratorio de reproducción asistida

demostró que los blastocistos humanos competentes secretaron concentraciones de leptina más altas en el medio circundante que los embriones arrestados. De manera que se planteó la hipótesis de que la leptina secretada por el blastocisto inicia un efecto ligando mediado por receptores de leptina en el endometrio materno, con lo que establece un diálogo molecular durante la ventana de implantación. De igual manera se demostró que la acrogranina, proteína que regula el crecimiento celular epitelial, es secretada en el medio circundante por embriones de ratón preimplantatorios. Un estudio reportó que una vez que la acrogranina es agregada al medio de cultivo, se promueve la formación de blastocistos, de manera que actúa directamente en las células trofoectodérmicas de forma autocrina.17 Gracias a la espectrometría de masas se observaron las características distintivas del secretoma embrionario cada 24 horas, desde el momento de la fertilización hasta el estadio de blastocisto, las cuales podrían identificar de manera única lo que ocurre en cada estadio del desarrollo embrionario, independientemente de la morfología; de esta manera se observaron algunas proteínas a lo largo de varios estadios embrionario, mientras que otras fueron estadio-específicas.18 De manera relevante, al comparar el secretoma de ratón y el humano se reveló que la transición, desde la transcripción hasta las proteínas maternas heredadas, la activación del genoma embrionario y la expresión de proteínas embrionarias clave deben ocurrir para el desarrollo embrionario continuo.19 Asimismo, se observaron proteínas únicas y específicas en el secretoma embrionario después de la activación del genoma del embrión.18 Así, los embriones con un genoma activado correctamente y, por tanto, un proteoma y secretoma embrionario completamente funcional pueden tener mayor potencial de competencia de desarrollo. Otro hallazgo importante fue la participación de la proteína ubiquitina, ya que tiene un papel fundamental y decisivo durante la implantación en mamíferos, mediante el control de las actividades y el recambio de moléculas clave en la señalización.20 La aplicación de las técnicas proteómicas en la reproducción asistida permitió de igual manera realizar una investigación inicial acerca de los embriones

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con anormalidades cromosómicas, los cuales podrían distinguirse de embriones euploides por medio de su respectivo secretoma; de manera que en un estudio se identificó que blastocistos euploides para 10 cromosomas exhibieron mejores perfiles de secretoma y notablemente diferentes que blastocistos aneuploides para los mismos cromosomas.21 Con avances en las técnicas genómicas que permiten un análisis cromosómico exhaustivo de los 23 pares de cromosomas en una célula individual, llegó a ser realista el abordaje ómico integrado. Además de la tecnología de espectrometría de masas, existen otras plataformas proteómicas en investigación que parecen prometedoras para la investigación del secretoma embrionario humano. En particular, los microarreglos proteicos tienen la ventaja de ofrecer información complementaria a los estudios del transcriptoma. Recientemente, un estudio que utilizó microarreglos proteicos comparó el medio de cultivo de blastocistos cultivados en grupo con un medio control y reveló el aumento en la expresión del receptor 1 del factor de necrosis tumoral soluble e interleucina 10, la disminución en la expresión de la proteína estimulante de mocrófagos alfa, factor de células madre, quimiocina (C-X-C motif) ligando 13 (CXCL13), receptor 3 a ligando inductor de apoptosis relacionado con factor de necrosis tumoral soluble (TRAILR3) y proteína inflamatoria de macrófagos I beta.22 Un análisis adicional investigó las diferencias entre el medio de cultivo de los blastocistos cultivados en grupo que sí se implantaron versus el medio de cultivo de los blastocistos agrupados que no se implantaron y se encontró una disminución significativa de las proteínas CSCL13 y GM-CSF; esta ultima se encontró en medio de cultivo de blastocistos humanos y de ratón y se observó que promueve el desarrollo embrionario y la implantación al indicar un mecanismo de retroalimentación autocrino para el desarrollo y mantenimiento del blastocisto y su potencial de implantación.23 Los metabolitos, productos funcionales finales de los procesos biológicos, también se identificaron en investigaciones del secretoma. Se demostró que metabolitos de bajo peso molecular cambian radicalmente para reflejar un estado metabólico y ambiental particular. Se observó que los índices de viabilidad generados a partir

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Neri Vidaurri P y col.

del análisis de medios de cultivos agotados fueron mayores para los embriones humanos que avanzaron para producir embarazos y nacidos vivos, en comparación con los que no se implantaron.24,25 La proteómica y metabolómica son plataformas ómicas complementarias en la investigación del secretoma embrionario humano, prometedoras para el desarrollo de métodos no invasivos de selección de embriones en el campo de la técnicas de reproducción asistida con la capacidad de analizar proteínas y metabolitos en medios de cultivo y de esta manera proponer la viabilidad y potencial implantatorio del embrión. Junto con la evaluación de la morfología, un método cuantitativo no invasivo de selección embrionaria, se pueden optimizar las transferencias exitosas de embriones individuales, reducir las pérdidas tempranas del embarazo y aumentar la cantidad de nacidos vivos sanos. La aplicación de las técnicas ómicas en el campo de la reproducción asistida crecen día a día, cuyas investigaciones descubrieron biomarcadores asociados con la viabilidad del ovocito y del embrión y demostraron tener una aplicación importante en algunos estudios clínicos. Los artículos publicados son estudios prospectivos aleatorizados que reportan tasa de embarazo usando esas técnicas solas o en combinación con criterios morfológicos y las comparan con la evaluación embrionaria morfológica convencional, lo que provocó cierta discusión en el medio, recalcando la necesidad de desarrollar una técnica o la combinación de varias que proporcionen un resultado rápido, de bajo costo, fácil de usar y, sobre todo, no invasivo, que pueda aplicarse a corto plazo en la práctica clínica.

8. 9.

10. 11.

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15.

16.

17. REFERENCIAS 1. 2.

126

Elder K and Cohen J. Human preimplantation embryo selection. Informa Healthcare. Delhanty JD, Griffin DK, Handyside AH, Harper J, et al. Detection of aneuploidy and chromosomal mosaicism in human embryos during preimplantation sex determination by fluorescent in situ hybridisation (FISH). Hum Mol Genet 1993;2:1183-1185. Angell RR, Aitken RJ, van Look PF, Lumsden MA, et al. Chromosome abnormalities in human embryos after in vitro fertilization. Nature 1983;303:336-338.

18.

19.

20.

Kuliev A, Verlinsky Y. Preimplantation diagnosis: a realistic option for assisted reproduction and genetic practice. Curr Opin Obstet Gynecol 2005;2:179-183. Handyside AH, Kontogianni EH, Hardy K, Winston RM. Pregnancies from biopsied human preimplantation embryos sexed by Y-specific DNA amplification. Nature 1990;344:768-770. Anderson NL, Anderson NG. Proteome and proteomics: new technologies, new concepts, and new words. Electrophoresis 1998;19:1853-1861. Wilkins MR, Pasquali C, Appel RD, Ou K, et al. From proteins to proteomes: Large scale protein identification by two-dimensional electrophoresis and arnino acid analysis. Nature Biotechnology 1996;1:61-65. Hanash SM, Pitteri SJ, Faca VM. Mining the plasma proteome for cancer biomarkers. Nature 2008;452:571-579. Katz-Jaffe MG, Gardner DK. Symposium: Innovative techniques in human embryo viability assessment. Can proteomics help to shape the future of human assisted conception? RBM Online 2008;4:497-501. Weiss W, Görg A. High-resolution two-dimensional electrophoresis. Methods Mol Biol 2009;564:13-32. Latham KE, Garrels JI, Chang C, Solter D. Analysis of embryonic mouse development: construction of a highresolution, two-dimensional gel protein database. Appl Theor Electrophor 1992;6:163-170. Shi CZ, Collins HW, Garside WT, Buettger CW, et al. Protein databases for compacted eight-cell and blastocyst-stage mouse embryos. Mol Reprod Dev 1994;1:34-47. Navarrete Santos A, Tonack S, Kirstein M, Kietz S, et al. Two insulin-responsive glucose transporter isoforms and the insulin receptor are developmentally expressed in rabbit preimplantation embryos. Reproduction 2004;128:503-516. Sutovsky P, Manandhar G, Laurincik J, Letko J. Expression and proteomic analysis of mammalian preimplantation embryonic development. Reproduction 2005;129:269282. Katz-Jaffe MG, Linck DW, Schoolcraft WB, Gardner DK. A proteomic analysis of mammalian preimplantation embryonic development. Reproduction 2005;130:899-905. Katz-Jaffe MG, Gardner DK, Schoolcraft WB. Proteomic analysis of individual human embryos to identify novel biomarkers of development and viability. Fert Steril 2006;85:101-107. González RR, Caballero-Campo P, Jasper M, Mercader A, et al. Leptin and leptin receptor are expressed in the human endometrium and endometrial leptin secretion is regulated by human blastocyst. J Clin Endocrinol Metab 2000;85:4883-4888. Díaz-Cueto L, Stein P, Jacobs A, Schultz RM, et al. Modulation of mouse preimplantation embryo development by acrogranin (epithelin/granulin precursor). Dev Biol 2000; 217:406-418. Katz-Jaffe MG, Schoolcraft WB, Gardner DK. Analysis of protein expression (secretome) by human and mouse preimplantation embryos. Fertil Steril 2006;86:678-685. Telford NA, Watson AJ, Schultz GA. Transition from maternal to embryonic control in early mammalian develop-

Reproducción

Laboratorio de reproducción asistida

ment a comparision of several species. Mol Reprod Dev 1990;26:90-100. 21. Wang HM, Zhang X, Qian D, Lin HY, et al. Effect of ubiquitinproteasome pathway on mouse blastocyst implantation and expression of matrix metalloproteinases-2 and -9. Biol Reprod 2004;70:481-487. 22. Katz-Jaffe MG, Stevens J, Kearns WG, Gardner DK, et al. Relationship between embryonic secretome and chromosomal abnormalities in human IVF. Fertil Steril 2006;86:57. 23. Domínguez F, Gadea B, Esteban FJ, Horcajadas JA, et al. Comparative protein-profile analysis of implanted

versus non-implanted human blastocyst. Hum Reprod 2008;23:1993-2000. 24. Robertson SA. GM-CFS regulation of embryo development and pregnancy. Cytokine Grownh Factor Rev 2007;18:287298. 25. Seli E, Sakkas D, Scott R, Kwok SC, et al. Noninvasive metabolomics profiling of embryo culture media using Raman and near-infrared spectroscopy correlates with reproductive potential of embryo in women undergoing in vitro fertilization. Fertil Steril 2007;88:1350-1357.

Conclusiones Optimizar la calidad embrionaria para mejorar los resultados de las técnicas de reproducción asistida es uno de los principales objetivos de los centros de reproducción humana y esto es posible gracias al desarrollo de nuevas tecnologías y metodologías que se pueden aplicar en este rubro. Por ejemplo, la mejora y manejo de los gametos antes de la aplicación de una técnica de reproducción asistida, el manejo meticuloso de los embriones resultantes, la gran cantidad de investigaciones acerca de los sistemas de cultivo embrionario (requerimientos metabólicos de los gametos y embriones) y la medicina basada en la evidencia. Porque en este campo, aunque parece que todo está escrito, aún hay muchas detalles de la reproducción asistida que ignoramos. Una de las principales metas dentro del laboratorio de reproducción asistida es evitar el estrés externo de los gametos y embriones causado por la manipulación, así como el control de factores ambientales e intracelulares influidos por esa manipulación, como el equilibrio osmótico, los cambios de temperatura y fluctuaciones de pH que pueden tener efectos negativos en la calidad embrionaria. El laboratorio de reproducción asistida y el embriólogo encargado de él constituyen piezas básicas y fundamentales, ya que en el laboratorio se dan las principales investigaciones y avances en el campo de la

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infertilidad. Hablar del futuro de la reproducción asistida es tener como objetivo la automatización de los procesos del laboratorio de fecundación in vitro y la aportación creciente de la medicina molecular a la medicina clínica actual, no tanto para aumentar las tasas de embarazo (lo cual se incrementó notablemente en los últimos 15 años), sino para hacer más eficientes los tratamientos y lograr mantener las mismas tasas de implantación al transferir dos o tres embriones que hacerlo con un solo embrión con su correcta implantación por tratamiento de reproducción asistida y, por tanto, obtener un solo bebé. Para ello, la medicina molecular tendrá un papel muy importante, que permitirá estudiar un mayor número de genes, conseguir una mayor calidad embrionaria y de recepción endometrial. Los vertiginosos avances en el campo de la genética, y en general de todos los procesos biológicos implicados en la reproducción humana, permiten la aplicación cada vez más extendida en el diagnóstico y en el tratamiento de la infertilidad. Para el embriólogo, todo lo anterior se convierte en un reto, ya que con la introducción de nuevas técnicas o metodologías se debe tener mayor atención y concentración, con la creación de sistemas más escrupulosos de control de calidad y un programa de capacitación más estricto.

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Reproducción 2013;6:128-131

Caso clínico

Tumor virilizante de ovario Johnatan Torres Torres,1 Rocío Guerrero Bustos,2 Luz María Malanco Hernández3

RESUMEN

ABSTRACT

Los tumores de ovario se dividen en no funcionantes y funcionantes; dentro de este último grupo existen los que tienen actividad endocrina y producen androgenización. El tumor de células esteroideas sin otra especificación es una neoplasia poco frecuente de los cordones sexuales del ovario, que puede aparecer a cualquier edad y tener diferentes manifestaciones endocrinas por el influjo hormonal de las pacientes que lo padecen. Su potencial de malignidad es de 50%. Comunicamos el caso de una paciente de 28 años de edad, quien tuvo signos de virilización y en un estudio de imagen por ultrasonido se encontró un tumor en el ovario izquierdo, por lo que se decidió la intervención quirúrgica en la que se extrajo un tumor de células lipoideas en el ovario izquierdo.

Ovarian tumors are divided into functioning and non-functioning, within this latter group there are those that present endocrine activity. The tumor of steroid cells without any further specification is a rare neoplasm of the ovarian sex cord, characterized by occuring at any age and produce different endocrine manifestations by the influence of the hormonal patients who suffer from it. Its potential malignancy is 50%. This paper reports the case of a 28-year-old patient, who presented with signs of virilization, finding in a study of image by ultrasound a left ovarian tumor, it was decided to surgical intervention, which gave as a result a steroid cell tumor.

Palabras clave: tumor virilizante de ovario.

Key words: ovarian virilizing tumor.

l tumor de células esteroideas del ovario es poco frecuente, se clasifica en el grupo de tumores del estroma o los cordones sexuales (previamente clasificado como tumor de células lipoideas o lipídicas). Los tumores del estroma o cordón sexual representan 5% de los tumores

ováricos y 2% de los tumores malignos del ovario. La frecuencia de los tumores de células esteroideas es baja y representan menos de 0.1% de las neoplasias de ovario. Estos tumores se subdividen en tres subtipos, según su célula de origen: tumor de células esteroideas sin otra especificación, luteoma estromal y tumor de células de Leydig.1-3 El hirsutismo y la virilización son los hallazgos más comunes y afectan a 56 a 77% de las pacientes.4 Se comunica el caso de una paciente de 28 años de edad, con tumor de células lipoideas, que tuvo signos de virilización. Además, se discuten los aspectos clínicos, diagnósticos y terapéuticos de estos tumores.

Residente de cuarto año de la especialidad de Ginecología y Obstetricia. Médico especialista en Ginecología y Obstetricia, Jefatura de Enseñanza. Médico especialista en Endocrinología. Hospital General de México Dr. Eduardo Liceaga.

Correspondencia: Dra. Rocío Guerrero Bustos. Hospital General de México Eduardo Liceaga, Área de Enseñanza Ginecología y Obstetricia. Dr. Balmis 148, colonia Doctores, CP 06726, México, DF. Recibido: agosto 2013. Aceptado: octubre 2013. Este artículo debe citarse como: Torres-Torres J, Guerrero-Bustos R, Malanco-Hernández LM. Tumor virilizante de ovario. Reproducción (México) 2013;6:128-131. www.nietoeditores.com.mx

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CASO CLÍNICO Paciente femenina 28 años de edad, originaria y residente del Distrito Federal, soltera y con escolaridad preparatoria. Tenía carga genética de diabetes mellitus e hipertensión arterial; refirió tabaquismo de manera ocasional. Antecedentes ginecológicos: menarquia, telarquia y pubarquia a los 12 años, con ciclos menstruales Reproducción

Tumor virilizante de ovario

irregulares con opsomenorrea desde el tercer mes de menstruación; acudió con el médico a los 18 años, quien le diagnosticó síndrome de ovario poliquístico e inició tratamiento con Diane y metformina, mismo que suspendió en marzo de 2012; la fecha de su última menstruación fue el 6 de julio de 2012; inició su vida sexual a los 25 años, tuvo cuatro parejas sexuales con método de planificación familiar con preservativo de manera ocasional; negó haber padecido infecciones de trasmisión sexual y no había tenido ningún embarazo; se le realizó citología cervicouterina en febrero de 2012 con resultado negativo de cáncer. Su padecimiento actual inició en la adolescencia, con hipertricosis, así como obesidad, acné leve y opsomenorrea; recibió tratamiento hormonal por diagnóstico de ovario poliquístico, pero lo suspendió por iniciativa propia y acudió a valoración médica en donde se solicitó ultrasonido pélvico que reportó tumor anexial izquierdo, por lo que se envió a esta institución. A la exploración física tenía adecuado estado de coloración e hidratación de mucosas y tegumentos; la cabeza y el cuello sin alteraciones; estado cardiopulmonar sin daño aparente, abdomen globoso a expensas de panículo adiposo, depresible, no doloroso a la palpación; genitales externos con distribución androide de vello púbico, los labios mayores cubrían a los menores; hipertrofia de clítoris, paredes vaginales de 7 y 9 cm, anterior y posterior, respectivamente; útero en anteversoflexión de 7 x 4 x 2 cm, aproximadamente; anexos no palpables, fondos de saco libres y extremidades normales; escala de Ferriman-Gallwey: 13 puntos (Figura 1). Estudios de laboratorio y gabinete

El ultrasonido pélvico realizado el 30 de marzo de 2012 reportó: útero en anteversoflexión de 8 x 3.7 x 2.2 cm, miometrio heterogéneo, endometrio con grosor de 2.7 mm. El ovario derecho tenía algunos folículos menores de 5 mm y en conjunto midió 22 x 21 x 12 mm. En el anexo izquierdo había una imagen ovoidea, predominantemente hipoecoica, con áreas de mayor y menor ecogenicidad con abundante flujo vascular periférico al aplicar doppler; dimensiones de 53 x 51 x 44 mm, con líquido en el fondo de saco posterior. La TAC de pelvis, efectuada el 28 de abril de 2012, reportó en el sitio anatómico del anexo izquierdo una Volumen 6, núm. 2, octubre-diciembre, 2013

Figura 1. Exploración física de paciente con hipertrofia de clítoris. Escala de Ferriman-Gallway: 13 puntos.

lesión de aspecto tumoral, de morfología redondeada, de bordes regulares y bien definidos, hipodensa en fase simple, de 54 x 52 mm. Hormona luteinizante 2.33 mUI/mL, hormona foliculoestimulante 4.55 mUI/mL, testosterona 1.59 ng/dL, testosterona libre 5.6 pg/mL, progesterona 0.71 ng/mL, prolactina 12.59 ng/mL, estradiol 58 pg/mL, alfa fetoproteína 1.32 ng/mL, antígeno CA-125 5.20 mUI/mL, fracción B de la hCG 0.190 mUI/mL. Con el diagnóstico preoperatorio de tumor anexial izquierdo se realizó laparotomía exploradora y se encontró el útero de aproximadamente 7 x 3 x 3 cm, anexo derecho de 2 x 1 cm, anexo izquierdo aumentado de tamaño de aproximadamente 5 x 5 cm; se realizó ooforectomía izquierda (Figuras 2 y 3). El estudio de anatomía patológica reportó tumor de células lipoideas en el ovario izquierdo; no hubo tumor por fuera de la cápsula; el tumor medía 5.5 cm de diámetro mayor; sin áreas de necrosis, hemorragia, atipia

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Torres Torres J y col.

Figura 4. Microscopia que muestra células tumorales de citoplasma claro lipoideas, núcleo central en nidos delimitados por tejido conectivo muy fino.

Figura 2. Ovario izquierdo con aumento de tamaño (5 x 5 cm).

Figura 3. Ooforectomía izquierda.

nuclear ni mitosis, por lo que se consideró que se trataba de un tumor benigno (Figura 4). DISCUSIÓN Ante un cuadro de síndrome de virilización es imprescindible hacer una evaluación completa que incluya historia clínica y exámenes complementarios encaminados a identificar la fuente productora de andrógenos. El examen realizado a la paciente y el hallazgo ultra-

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sonográfico y por TAC de un tumor ovárico en el caso que comunicamos confirmaron la sospecha clínica de un tumor funcionante de ovario.5,6 En 1979, Scully utilizó el término tumor de células esteroides del ovario. Estos tumores se clasificaron previamente como tumores de células lipoides o lipoideas. El término tumor de células esteroides describe más la estructura morfológica y funcional que las manifestaciones clínicas. Tienen tres subtipos: luteoma estromal, tumor de células de Leydig y tumor de células esteroideas.7,8 El tumor de células esteroideas es el más común y representa 60% de estos tumores. Está compuesto por células que se originan de restos celulares adrenales, células luteínicas estromales o células de Leydig. 7 Habitualmente afectan a personas adultas con edad media de 47 años y son benignos; aunque, a diferencia de los tumores de células de Leydig, más de 20% puede tener comportamiento maligno. Cuando afectan a pacientes menores de 16 años, el comportamiento suele ser benigno.9 El hirsutismo y la virilización son los síntomas más comunes y afectan a 56 a 77% de las pacientes.4 En esta paciente se encontraron signos de virilización: acné, aumentó de vello facial, voz gruesa y clitoromegalia, además, los valores de testosterona estaban Reproducción

Tumor virilizante de ovario

elevados.10,11 Estos hallazgos son sugerentes de un tumor de ovario productor de hormonas virilizantes.12 El tumor de células esteroides generalmente es sólido y bien circunscrito. Al corte puede ser amarillo, por la existencia de células lipídicas ricas en pigmento intracitoplasmático. En este caso, la macroscopia mostró un tumor de color amarillento y marrón oscuro; el estudio microscópico reportó compatibilidad con tumor de células lipoideas.4,13 El tratamiento de estos tumores debe individualizarse de acuerdo con la histología, el estadio quirúrgico y el deseo de fertilidad de la paciente.14

REFERENCIAS 1. Bharadwaj P, Viniker D. Lipoid cell tumour of the ovary: A rare cause of virilisation. Department of Obstetrics and Gynaecology, Harold Wood Hospital, Romford, UK, and Whipps Cross University Hospital, London, UK. J Obstet Gynecol 2011. 2. Zwiesler D, Lewis SR, Choo YC, Martens MG. A case report of an ovarian lipoma. Tulsa: Department Obstetrics and Gynecology, College of Medicine, University of Oklahoma, 2008. 3. Ding DC, Hsu S. Lipid cell tumor in an adolescent girl: a case report. Taiwan: Graduate Institute of Medical Science, School of Medicine, Tzu Chi University 2007. 4. Ramírez, JA, et al. A case report and literature review of steroid cell tumours, not otherwise specified. Revista Colombiana de Obstetricia y Ginecología 2010;61.

Volumen 6, núm. 2, octubre-diciembre, 2013

5. Salomone M, Wapniarsky H, Medina Milanesi R. Virilización por tumor ovárico de Leydig en paciente posmenopáusica tratada con tamoxifeno. Montevideo: Hospital de Clínicas, Facultad de Medicina 2001. 6. Reedy M, Richards W, Ueland F, et al. Ovarian steroid cell tumors, not otherwise specified: A case report and literature review. Gynecol Oncol 1999;75:293-297. 7. Stephens JW, Fielding A, Verdaguer R, Freites O. A steroidcell tumor of the ovary resulting in massive androgen excess early in the gonadol steroidogenic pathway. Gynecol Endocrinol 2008;24:151-153. 8. Luque-Cuba E, García-Ramos F, Rechkemmer-Prieto A, Solís-Villanueva J, et al. Tumor de células esteroideas del ovario: reporte de caso. Rev Med Her 2005;16:80-86. 9. Kim YT, Kim SW, Yoon BS, Kim SH, et al. Ovarian steroid cell tumor causing virilization and ascites. Yonsei Med J 2007;48:142-146. 10. Murugaesu N, Schmid P, Dancey G, et al. Malignant ovarian germ cell tumors: identification of novel prognostic markers and long-term outcome after multimodality treatment. J Clin Oncol 2006;24:4862-4866. 11. Russell P, Robboy SJ, Anderson MC. Sex cord-stromal and steroid cell tumours of the ovaries. In: Robboy SJ, Anderson MC, Russell P, editors. Pathology of the female reproductive tract. Edinburgh: Churchill Livingstone, 2002;607-640. 12. Haji AG, Sharma S, Babu M, Vijaykumar D, et al. Androgen secreting steroid cell tumor of the ovary in a young lactating women with acute onset of severe hyperandrogenism: a case report and review of literature. J Med Case Reports 2007;1:182. 13. Geisler JP, Geisler HE, Manahan KJ, Miller GA, et al. Genetics of steroid cell tumors of the ovary. CME J Gynecol Oncol 2003;8:167-169. 14. Tanaka YO, Saida TS, Minami R, Yagi T, et al. MR findings of ovarian tumors with hormonal activity, with emphasis on tumors other than sex cord-stromal tumors. Eur J Radiol 2007;62:317-327.

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Reproducción 2013;6:132-133

Homenaje

Centenario del nacimiento del doctor Alfonso Álvarez Bravo

l 7 de julio de 1913 nació un niño sano que recibió el nombre de Alfonso; sus apellidos paterno y materno fueron Álvarez y Bravo. En este 2013, la fecha corresponde al centenario del nacimiento de una de las personalidades más reconocidas en el gremio ginecoobstétrico mexicano y del mundo. El profesor emérito y maestro en Ciencias Alfonso Álvarez Bravo estudió la carrera de médico cirujano en la Escuela Nacional de Medicina de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) y obtuvo la licenciatura el 4 de marzo de 1937, a la edad de 24 años. El 1 de enero de 1939, dos años después de su graduación como médico, ingresó por oposición al Hospital General de México como médico interno. Cuatro años le sirvieron para ascender en esa institución a médico adscrito, como cirujano; puesto que conservó de 1943 a 1953. Esos 15 años le dieron una formación de alto nivel académico y una actividad clínica de gran calidad, al tiempo que, siguiendo su vocación de educador, se integró a las labores docentes universitarias. El doctor Álvarez Bravo se formó como cirujano bajo la enseñanza tutelar de los doctores Darío Fernández y Javier Longoria y en el ramo de la Ginecología obtuvo su formación por parte de los doctores Rosendo Amor y Manuel J Castillejos. Este último, cirujano vaginalista de fuerte y atractiva personalidad, fue quien más influencia ejerció en la sólida formación de Álvarez Bravo, quien lo ayudó a operar desde que era estudiante y durante el transcurso de esos 15 años.

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Debido a las facilidades que le otorgara el doctor Gustavo Baz para estudiar en el extranjero, Álvarez Bravo partió a Estados Unidos en 1944, donde obtuvo de primera mano los conocimientos de quienes consideró sus maestros en distintos campos y con quienes, posteriormente, cultivó una sólida amistad: en Ginecología, el doctor Isador C Rubin (Mount Sinai Hospital, Nueva York); en Citología vaginal, el doctor George N Papanicolaou (Cornell University, Nueva York) y en Endocrinología femenina, el doctor Fuller Albrigt (Massachsetts General Hospital, Boston). Son éstas las influencias de los profesores mexicanos y extranjeros que forjaron la extraordinaria personalidad del doctor Alfonso Álvarez Bravo. Su vocación por la educación lo llevó desde muy joven a desempeñarse como profesor de Física médica en la preparatoria del Colegio Francés y destacó su gran interés al escribir un libro de texto de esta materia. Por otra parte, un año después de su recepción profesional, solicitó y obtuvo la posición de ayudante adjunto de la cátedra de Propedéutica quirúrgica y el 27 de marzo de 1941 recibió su primer nombramiento oficial como profesor adjunto de la Clínica de Obstetricia, cuyo profesor titular era el doctor Isidro Espinosa de los Reyes. Asimismo, continuó con su carrera docente y fue nombrado profesor del tercer curso de Clínica Quirúrgica; posición que conservó en el posgrado de esa escuela hasta 1964. En 1953 inició la enseñanza del posgrado en el servicio de Ginecología del Hospital Español, del que ya era jefe, y al recibir la jefatura del servicio de Ginecología y Obstetricia amplió su curso a la división de doctorado. Desde entonces, esos cursos de residencia, maestría y doctorado fueron los principales y más afamados en Reproducción

Homenaje

todos los países de habla hispana y ejemplo de cursos subsecuentes que se establecieron en diferentes instituciones. En la actualidad continúa formándose en ellos una gran cantidad de profesionales éticos y exitosos. Este curso fue el primero de Ginecoobstetricia reconocido por la UNAM y debe destacarse, además de su magnífica programación teórica, la calidad y vocación de su profesorado. Cuenta con materias de sociología, sexualidad y enfermedades psicosomáticas, así como con talleres de metodología para la investigación y de capacitación para los profesores. Cada acto quirúrgico a efectuarse se discute semanalmente ante un pleno de alumnos y profesores y se realizan revisiones bibliográficas mensuales, abiertas a todo el público, que son preparadas por los alumnos de cada grado, con la supervisión de sus tutores. Los alumnos de estos cursos son dignos representantes del espíritu y la filosofía del doctor Álvarez Bravo y sobresalen como los mejores en México, España, Centro y Sudamérica. Ellos están asociados y conforman el actual Colegio de ex alumnos del profesor Álvarez Bravo. Como reconocimiento a su labor, Alfonso Álvarez Bravo fue nombrado jefe de la División de Estudios Superiores de la Facultad de Medicina de la UNAM, donde dejó huella: desde la construcción de un nuevo edificio que hoy alberga a esta División, hasta la actualización de los cursos de todas las residencias de especialidad reconocidas por la Facultad. Durante los años que laboró en el Departamento de Ginecología y Obstetricia, el maestro Álvarez Bravo y su grupo de profesores realizaron investigación científica, que publicaron en diversas revistas nacionales e internacionales; más de 250 de ellas son investigaciones originales. Además, el maestro es autor de cuatro libros de texto y coautor de otros siete y asistió a más de 250 congresos como profesor de cursos o para dictar conferencias especiales en distintas universidades, sociedades y asociaciones médicas de México, Centro y Sudamérica, Europa y Asia.

Volumen 6, núm. 2, octubre-diciembre, 2013

Esta incansable labor de fomento al intercambio de conocimientos a nivel nacional e internacional lo llevó a fundar y presidir todas las instituciones de Ginecología y Obstetricia en México; pero, sobre todo, lo llevó a presidir el máximo organismo de la especialidad: la Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia (FIGO), posición nunca mejor desempeñada por un connacional, donde dio muestra de su genialidad. Durante su presidencia se formó, por primera vez, el Comité de Mortalidad Materna, preocupación mundial hasta la fecha. Fue nombrado miembro honorario de 13 sociedades mexicanas y 19 extranjeras, entre las que destacan: Colegio Americano de Obstetras y Ginecólogos, Sociedad Tocológica Española, Sociedad Argentina para el Estudio de la Esterilidad, Sociedad Ginecotocológica de Uruguay, Sociedad Cubana de Obstetricia y Ginecología y Sociedad Italiana de Obstetricia y Ginecología. Asimismo, la Federación Latinoamericana de Asociaciones de Obstetricia y Ginecología (FLASOG) lo acreditó como maestro de Obstetricia y Ginecología de América Latina. Además de la producción literaria acerca de su especialidad, Álvarez Bravo escribió artículos de historia y filosofía de la medicina. Hoy, a 100 años de su nacimiento, ofrecemos un reconocimiento a esa personalidad de genuina cepa académica que dedicó a la enseñanza su excepcional talento e inventiva con laboriosidad creativa y un infatigable espíritu, en pos de la verdad y la honestidad profesional. El doctor Álvarez Bravo se constituyó en figura casi patriarcal para sus alumnos, de sincera amistad para sus iguales y de maestro para todos. Reciba este justo homenaje por sus logros y por sentar el ejemplo, que atrae y motiva, al haber establecido caminos que muchos estamos orgullosos de seguir. Dr. Guillermo Santibáñez Moreno Ginecobstetra especialista en Medicina de la Reproducción, Médica Sur

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Normas para autores 1. Los artículos deben enviarse, preferentemente, mediante correo electrónico (ammr@wtcmexico.com.mx) o entregarse en las oficinas de la revista (WTC Montecito 38, piso 15, oficina 29, colonia Nápoles, CP 03810, México, DF. Tel.: 9000-2863) en original impreso y archivo electrónico en CD marcado con el título del trabajo. Anexar el formato de cesión de los derechos de autor (firmado por todos los autores) y confirmar que se trata de un artículo inédito. Los trabajos no aceptados se devolverán al autor principal. El formato de cesión de derechos puede descargarse de la página www.nietoeditores.com.mx Ningún material publicado en la revista podrá reproducirse sin autorización previa por escrito del editor. 2. El manuscrito comprende: 2.1. Títulos completos y cortos en español e inglés, nombres y apellidos del o los autores, la adscripción de cada uno (institución, hospital, departamento o servicio) vinculada con el motivo del trabajo (no se aceptan títulos honoríficos o pasados: expresidente, miembro Titular o Emérito de tal cual institución, Academia o Sociedad), dirección postal completa (calle, colonia, delegación o municipio, estado y código postal), teléfono fijo (incluida la clave lada) y correo electrónico del primer autor o del autor al que se dirigirá la correspondencia. 2.2. Resumen. El resumen es la parte medular del artículo porque es la más leída, por tanto, debe ser la más cuidada. Los artículos originales llevarán resúmenes estructurados en español e inglés, donde las entradas de los párrafos sean análogas a las partes del artículo (Antecedentes, Material y método, etc.). Los resúmenes no deberán exceder 250 palabras. Los resúmenes de los artículos de revisión y de los casos clínicos también deben escribirse en español e inglés. 2.3. Palabras clave, en inglés y en español, basadas en el MeSH (Medical Subject Headings); para obtenerlas consulte la página www.nlm. nih.gov/mesh/MBrowser.htm 2.4. El texto del artículo original está integrado por las siguientes secciones: Antecedentes. Texto breve, no mayor de 50 líneas (de 65 caracteres cada una) que permita al lector ubicarse en el contexto del tema investigado, por qué es relevante estudiarlo, quiénes lo han estudiado y cómo. En el último párrafo de este apartado debe consignarse el Objetivo del estudio que, invariablemente, debe verse reflejado en los Resultados. Material y método. En la primera oración de este apartado debe indicarse el tipo de estudio (observacional, retrospectivo, doble ciego, aleatorio, etc.), la selección de los sujetos observados o que participaron en los experimentos (pacientes o animales de laboratorio, incluidos los testigos). Enseguida se especifican los aparatos (nombre y ciudad del fabricante entre paréntesis) y procedimientos con detalles suficientes para que otros investigadores puedan reproducir los resultados. Explique brevemente los métodos ya publicados pero que no son bien conocidos, describa los métodos nuevos o sustancialmente modificados, manifestando las razones por las cuales se usaron y evaluando sus limitaciones. Identifique exactamente todos los medicamentos y productos químicos utilizados, con nombres genéricos, dosis y vías de administración. Deben mencionarse los métodos de comprobación utilizados y el porqué de su elección (χ2, T de Student, etc.) así como los programas de cómputo aplicados y su versión. Resultados. Deben reflejar claramente el objetivo del estudio. La cantidad final de pacientes estudiados y destacar las observaciones más relevantes. Discusión. Incluye los aspectos nuevos e importantes del estudio, la explicación del significado de los resultados y sus limitaciones, incluidas sus consecuencias para la investigación futura. Debe establecerse el nexo de las conclusiones con los objetivos del estudio y abstenerse de hacer afirmaciones generales y extraer conclusiones que carezcan de respaldo. Proponga nuevas hipótesis cuando haya justificación para ello. El texto no debe incluir abreviaturas de ninguna especie, a pesar de la abundancia de términos, pues ello implicaría remitir al lector a la parte inicial donde se definieron éstos y ello puede conducir al abandono de la lectura por incomprensión. Los símbolos sí están permitidos (L, kg, g, cm, dL, etc.) pero no las abreviaturas, sobre todo cuando no son internacionales o multilingües. No existen dudas para los acrónimos: ADN, HDL, LDL, VLDL, mmHg, etc.

2.5. Figuras y cuadros. Se utilizará el término figura para citar por igual ilustraciones, esquemas, fotografías y gráficas. Se utilizará el término cuadro para citar por igual los cuadros y las tablas. 2.6. Pueden agregarse anexos con cuestionarios o encuestas utilizados durante la investigación. 2.7. Pueden incluirse agradecimientos. 3. Los cuadros y figuras deben numerarse con caracteres arábigos. Cada uno deberá tener un título breve y mencionarse en el cuerpo del artículo. Los cuadros de datos tabulados que contengan exclusivamente texto deberán elaborarse con la aplicación “Tabla” de Word; los esquemas y diagramas, con Power Point; las gráficas de pastel, barras, dispersión, etcétera, con Excel. 4. Para las fotografías en versión electrónica debe considerarse lo siguiente: Entregar cada una en archivo separado en formato TIFF o JPG (JPEG). Sólo si el tamaño real de las imágenes resulta excesivo, éstas pueden reducirse a escala; dada la pérdida de resolución, no deben incluirse imágenes que requieran aumento de tamaño. La resolución mínima aceptable es de 300 dpi. Si las fotografías se obtienen directamente de cámara digital, la indicación debe ser “alta resolución”. 5. Dentro del archivo de texto deben incluirse los cuadros y pies de figura, al final después de las referencias. 6. Cuando los cuadros o figuras se obtengan de otro medio impreso o electrónico, deberá adjuntarse la carta de autorización de la institución donde se publicaron. Excepto los casos que carezcan de derecho de autor. 7. Las siglas o abreviaturas de los cuadros o figuras se especificarán al pie de los mismos. 8. Las referencias deben enumerarse consecutivamente según su orden de aparición en el texto y el número correspondiente debe registrarse utilizando el comando superíndice de Word (nunca deben ponerse entre paréntesis). Para evitar errores se sugiere utilizar la aplicación “insertar referencia” del menú principal de Word. Deben omitirse comunicaciones personales, en cambio, sí se permite la expresión “en prensa” cuando un trabajo se ha aceptado para publicación en alguna revista, pero cuando la información provenga de textos enviados a una revista que no los haya aceptado aún, deberá citarse como “observaciones no publicadas”. Cuando en una referencia los autores sean más de cinco se consignarán los primeros cuatro y el último seguido de la palabra y col. o et al (si es en inglés). Ejemplos Publicación periódica You Ch, Lee KY, Chey RY, Menguy R. Electrogastrographic study of patients with unexplained nausea, bloating and vomiting. Gastroenterology 1980;79:311-314. Libro Murray PR, Rosenthal KS, Konbayashi GS, Pfaller MA. Medical microbiology. 4th ed. St Louis: Mosby, 2002;210-221. Capítulo de libro Meltzer PS, Kallioniemi A, Trent JM. Chromosome alterations in human solid tumors. In: Volgestein B, Kinzler KW, editors. The genetic basis of human cancer. New York: McGraw-Hill, 2002;93-113. Base de datos o sistemas de recuperación en internet Online Archive of American Folk Medicine. Los Angeles: Regents of the University of California 1996 (consultado 2007 Feb 1). Disponible en http://www.folkmed.ucla.edu/. Artículos de revistas en internet Kaul S, Diamond GA. Good enough: a primer on the analysis and interpretation of noninferiority trials. Ann Intern 2006;145(1):62-69. Disponible en http://www.annals.org/reprint/145/1/62.pdf Información obtenida en un sitio de internet Hooper JF. Psychiatry and the Law: Forensic Psychiatric Resource page. Tuscaloosa (AL): University of Alabama, Department of Psychiatry and Neurology; 1999 Jan 1 (Actualizado 2006; consultado en 2007 Feb 23). Disponible en http://bama.ua.edu/-jhooper/ 9. Se aconseja que en las referencias bibliográficas se incluyan citas de autores mexicanos o latinoamericanos.

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