Journal of osseointegration by Ariesdue srl

OSSEOINTEGRATION

Poste Italiane Spa - Spedizione in abbonamento postale - D.L. 353/2003 (conv. In. L. 27/02/2004, n.46) art. 1 comma 1, DCB Milano Taxe perรงue - ISSN 2036-413X

vol.

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Sommario ORIGINAL

PAPERS

Impianti dentali ottenuti dalla fusione di microparticelle di titanio tramite laser: dalla ricerca alla clinica Carlo Mangano, Jamil Awad Shibli, Francesco Mangano, Rachel Sammons, Aldo Macchi

pag. 9

Valutazione SEM-EDS e biomeccanica di impianti con differenti trattamenti si superficie Hewerson Santos Tavares, Rafael Silveira Faeda, Antônio Carlos Guastaldi, Fernando Pozzi Semeghini Guastaldi, Nilson T.C. Oliveira, Élcio Marcantônio Jr pag. 25

Riassorbimento di un sostituto osseo di derivazione porcina Vittoria Perrotti, Brian M. Nicholls

pag. 33

Analisi istologica ed istomorfometrica di osso bovino inorganico (ABB) prelevato 7 anni dopo rialzo di seno mascellare Marco Degidi, Adriano Piattelli, Vittoria Perrotti, Giovanna Iezzi pag. 41

CASE

REPORT

Rimozione, dopo 7 anni, di un impianto spostato nel seno mascellare. Descrizione clinica e istologica di un caso clinico Antonio Scarano, Maurizio Piattelli, Francesco Carinci

pag. 47

PRODOTTI - A ZIENDE - E VENTI

pag. 55

AGENDA

pag. 58

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Editorial board EDITOR IN CHIEF

ISSN (Print): 2036-413X

Adriano Piattelli Dean and Director of Studies and Research Dental School, University of Chieti-Pescara (Italy) a.piattelli@journalofosseointegration.eu

ASSISTANT EDITORS Vittoria Perrotti Department of Dentistry and Oral Science, Dental School, University of Chieti-Pescara v.perrotti@journalofosseointegration.eu Nilson T. C. Oliveira Biomaterials Group “IQ” UNESP Araraquara, SP (Brazil) n.oliveira@journalofosseointegration.eu

BOARD OF REVIEWERS Roberto Abundo, Italy Sebastiano Andreana, USA David Anson, USA Carlos Araujo, Brasil Luciano Artese, Italy Bartolomeo Assenza, Italy Daniele Botticelli, Italy Ezio Bruna, Italy Luigi Califano, Italy Giuseppe Cantatore, Italy Hector Cantoni, Argentina Sergio Caputi, Italy Paulo G. Coelho, USA Vincenzo De Dominicis, Italy Massimo Del Fabbro, Italy Ana Claudia de Mello, Brasil Yvonne de Paiva Buischi, Brasil Marco Degidi, Italy Glecio Vas dos Campos, Brasil Stefano Fanali, Italy Magda Feres, Brasil Massimo Frosecchi, Italy Enrico Gherlone, Italy Luciano Giardino, Italy German Gómez-Román, Germany Fabio Gorni, Italy Carlos Roberto Grandini, Brasil Luigi Guida, Italy Giovanna Iezzi, Italy

Fouad Khoury, Germany Singkuk Kim, USA Giulio Leghissa, Italy Mario Leonardo, Brasil Martin Lorenzoni, Austria Giuseppe Luongo, Italy Francesco Maggiore, Germany Carlo Mangano, Italy Carlo Maiorana, Italy Glenn Mascarenhas, India Georg-H. Nentwig, Germany Emeka Nkenke, Germany Gabriele Edoardo Pecora, Italy Roberto Pistilli, Italy Ana Emilia Pontes, Brasil Mario Raspanti, Italy Lorenzo Ravera, Italy Gilberto Sammartino, Italy Ludovico Sbordone, Italy Antonio Scarano, Italy Jamil Shibli, Brasil David Simmons, USA John Sottosanti, USA Rita Strocchi, Italy Heverson Tavares, Brasil Tiziano Testori, Italy Pascal Valentini, France Paul Weigl, Germany

ISSN (Online): 2036-412 www.journalofosseointegration.eu Vol. 1, Issue 1 - April 2009, fourmonthly ©2009 Ariesdue Srl Reproduction, in whole or in part, of the articles of the Journal of Osseointegration is not permitted without the previous written consent of the publisher Non è permessa la riproduzione di articoli della rivista senza l’autorizzazione scritta dell’editore All the articles published in the Journal of Osseointegration are the responsibility of the author concerned Tutti gli articoli pubblicati sulla rivista sono redatti sotto la responsibilità dell’autore La rivista Journal of Osseointegration è spedita in abbonamento: l’indirizzo in nostro possesso verrà utilizzato per l’invio di questa e di altre pubblicazioni o per l’inoltro di proposte di abbonamento. Ai sensi della legge 675/96 sulla tutela della privacy, è nel diritto del ricevente richiedere la cessazione dell’invio e/o l’aggiornamento dei dati. Registrazione del Tribunale di Como n. 12-08 del 14.4.2008 Direttore responsabile: Dino Sergio Porro Publisher: Ariesdue Srl

Direzione e redazione: Via Airoldi, 11 - 22060 Carimate (Co) Tel. +39(0)31792135 Fax +39(0)31790743 www.ariesdue.it e-mail: info@ariesdue.it Redazione: Angela Battaglia (a.battaglia@ariesdue.it) Cristina Calchera (farma@ariesdue.it) Simona Marelli (doctoros@ariesdue.it Marketing e pubblicità: Barbara Bono (b.bono@ariesdue.it) Paola Cappelletti (p.cappelletti@ariesdue.it) Franco De Fazio (f.defazio@ariesdue.it) Stampa: SATE Srl - Zingonia Verdellino (Bg)

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OSSEOINTEGRATION Manuscript preparation • Manuscript length

Papers submitted to the Journal of Osseointegration must be typed in a 12point font and double-spaced; they should not exceed 20 typescript pages (including title page), plus a typical number of figures (about 10 to 15). Italian authors must also supply an Italian translation of the full text.

• Title page

Provide the following data on the title page (in the order given): title, author names, titles and affiliations (where the work was actually done), corresponding author (telephone and fax numbers, with country and area code, e-mail and complete postal address).

• Abstract

Abstracts must not exceed 250 words and should be structured as follows: Aim, Materials and methods, Results, and Conclusions.

• Keywords

Authors should list 4 to 6 keywords that appropriately represent the contents of the work.

• Headings

The component parts of the main text of a manuscript will normally be Introduction, Materials and methods, Results, and Discussion. Other parts of the manuscript will normally include a list of references, tables, figure legends, and figures.

• Studies involving animals or humans

When data from animal or human subjects are reported, approval of the protocol by an institutional committee is required and a statement should be included in the "Materials and methods" section of the text. For human subject data, an informed consent of the subjects should be also provided.

• References

References should be listed according to the Vancouver style of referencing, that is numbered in sequence as they are

cited in the text. They should be also included on a separate page in the manuscript. Examples for arranging the reference list. Journals

Mangano C, Scarano A, Perrotti V, Iezzi G, Piattelli A. Maxillary sinus augmentation with a porous synthetic hydroxyapatite and bovine-derived hydroxyapatite: a comparative clinical and histologic study. Int J Oral Maxillofac Implants 2007;22:980-6. Monographs

Matthews DE, Farewell VT. Using and understanding medical statistics. Basel: Karger; 1985. Edited books

Piattelli A, Misch CE, Farias Pontes AE, Iezzi G, Scarano A, Degidi M. Dental Implant surfaces: a review. In: Carl E. Misch. Contemporary Implant Dentistry. Third edition. Mosby Elsevier 2008:599620. Authors will be responsible for the accuracy of the references both within the main text and the reference list.

• Tables and figures

Each table should be typed on a separate page at the end of the manuscript, and numbered consecutively. Be sparing in the use of tables and ensure that the data presented in tables do not duplicate results described elsewhere in the article. Figures, charts, and graphs should be professionally drawn. Text should be large enough to be read after reduction. Resolution must be at least 300 dpi when the image is 3 inches wide. Files saved in TIFF or JPEG format are preferred. Please do not send images embedded in word processing programs (eg, Word) or “office suite” programs (Excel, PowerPoint, etc). Figure legends should be typed as a group on a separate page at the end of the manuscript. There should be an individual legend for each illustration. Detailed captions are encouraged. For microphotographs, specify original magnification and stain.

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CARLO MANGANO1, JAMIL AWAD SHIBLI2, FRANCESCO MANGANO3, RACHEL SAMMONS4, ALDO MACCHI1 1 2 3 4 5

Università dell’Insubria, Varese Università di Guarulhos, San Paolo, Brasile Libero Professionista, Gravedona (Como) Università di Birmingham, Birmingham, Gran Bretagna Università G. d’Annunzio, Chieti

Impianti dentali ottenuti dalla fusione di microparticelle di titanio tramite laser: dalla ricerca alla clinica ABSTRACT Gli impianti dentali sono comunemente realizzati attraverso la fresatura di barrette di titanio, seguita da trattamenti o rivestimenti della superficie atti ad accelerare i processi di guarigione ossea. Il progresso nel campo delle metodiche di prototipazione rapida permette di modulare le proprietà elastiche degli impianti a quelle dell’osso circostante. La fabbricazione diretta tramite laser consiste nella realizzazione di strutture, anche a geometria complessa, a partire da microparticelle di polvere di titanio, che in strati successivi di 20 µ sono fuse insieme da un raggio laser, secondo un disegno tridimensionale realizzato al computer. Nel caso degli impianti, la fabbricazione avviene per un processo di fusione attraverso il quale il raggio laser, guidato dal computer, fonde insieme le particelle di metallo, realizzando così, strato dopo strato, l’oggetto tridimensionale desiderato. Il nostro gruppo di ricerca, primo al mondo, ha messo a punto una metodica per la produzione di impianti dentali in titanio fuso tramite laser. Grazie a questa metodica è possibile ottenere, modificando le impostazioni dei diversi strati, impianti con porosità graduata e controllata, accentuata a livello della superficie e progressivamente ridotta verso la parte centrale. Da un lato, questa porosità graduata può permettere un miglior adattamento e distribuzione del carico; dall’altro, la nuova superficie porosa stimola attivamente la guarigione ossea. I nuovi impianti in titanio microfuso presentano una superficie ricca di concavità ripetute, che si continuano negli spazi porosi sottostanti. Questo tipo di geometria ricca di porosità interconnesse ha dimostrato in precedenti lavori una buona risposta biologica in vitro. Scopo di questo lavoro è stato testare il comportamento biologico in vivo, nell’uomo, dei nuovi impianti in titanio microfuso (TixOs, LeaderNovaxa, Milano) nelle prime fasi di guarigione clinica, in assenza di carico.

Keywords Impianti dentali, fabbricazione diretta tramite laser, impianti di microparticelle di titanio fuse tramite laser, porosità graduata e controllata, concavità.

INTRODUZIONE Gli impianti dentali presenti attualmentesul mercato sono realizzati in titanio commercialmente puro o in lega di titanio Ti6Al-4V (90% titanio, 6% alluminio, 4% vanadio). Essi vengono comunemente prodotti attraverso fresatura di barrette di titanio, seguita da trattamenti o rivestimenti della superficie, atti ad accelerare i processi di guarigione ossea e favorire l’osteointegrazione (1). Sebbene la lega di titanio possieda superiori proprietà fisiche e meccaniche, il titanio commercialmente puro è da sempre considerato il materiale di prima scelta, perché dotato di eccellente duttilità, resistenza alla corrosione e biocompatibilità (1, 2). Tuttavia, le proprietà elastiche degli impianti dentali tradizionali differiscono da quelle dell’osso circostante (1, 3-6). La rigidezza di un impianto dentale dipende intrinsecamente dal modulo elastico (definito modulo di Young) del materiale da cui è costituito, oltre che dalle caratteristiche geometriche dell’oggetto. Il modulo elastico del titanio commercialmente puro (112 GPa) e quello della lega di titanio Ti-6Al-4V (115 GPa) sono considerevolmente superiori a quello dell’osso corticale (10-26 GPa). Tale note-

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vole differenza può comportare problematiche nel trasferimento del carico, con conseguente rischio di riassorbimento osseo (1, 37). Questo problema, spesso trascurato, è di primaria importanza nella moderna implantologia, laddove le esigenze cliniche si orientano sempre più su protocolli di carico anticipato ed immediato (4-7). Tuttavia, lo straordinario progresso evidenziato negli ultimi anni nel campo delle metodiche di prototipazione rapida (RP: rapid prototyping) permette di modulare le proprietà elastiche degli impianti in lega di titanio a quelle dell’osso circostante. La fabbricazione diretta tramite laser (DLF: direct laser forming) consiste nella realizzazione di strutture, anche a geometria complessa, a partire da microparticelle di polvere, fuse insieme strato dopo strato da un raggio laser, secondo un disegno tridimensionale realizzato al computer (811). Nel caso degli impianti in lega di titanio, la fabbricazione avviene attraverso un processo di microfusione (DLMF “direct metal laser forming”) per il quale il raggio laser, guidato dal computer, fonde insieme le particelle di metallo, realizzando così, strato dopo strato, l’oggetto tridimensionale desiderato. Il nostro gruppo di Ricerca ha messo a punto una metodica per la produzione di impianti dentali in titanio microfuso tramite laser (1, 9, 11). Grazie a questa metodica è possibile, semplicemente modificando le caratteristiche dei diversi strati in funzione delle dimensioni delle particelle di polvere iniziale, ottenere impianti con porosità graduata e controllata, accentuata a livello della superficie e progressivamente ridotta verso la parte centrale. Questo tipo di impostazione permette da un lato un più graduale adattamento meccanico dell’osso all’impianto (7-10) con potenziali benefici riflessi nel trasferimento del carico; dall’altro favorisce l’integrazione dell’impianto stesso nella struttura ossea, grazie all’interconnessione meccanica determinata dalla crescita dell’os-

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so all’interno della struttura porosa (8-11). L’integrazione dell’impianto nella struttura ossea è un aspetto biologico importante, e la ricerca di nuove geometrie per le superfici implantari rappresenta da molti anni a questa parte uno dei temi principali della moderna implantologia. Inizialmente l’interesse dei ricercatori si è concentrato sul concetto di rugosità superficiale (12-16) e su come una superficie implantare rugosa possa promuovere una più ampia e rapida apposizione ossea rispetto a una liscia (12-16). Da uno studio su 12 tipi di microtopografie superficiali implantari, Thomas e Cook (12) hanno evidenziato come la microrugosità superficiale sia un aspetto chiave nel determinare la guarigione ossea. Wong (13) e Carlsson (14) hanno riferito come una superficie con rugosità (Ra) compresa tra 1 e 10 µ sia ottimale nella promozione dell’apposizione di nuovo osso, stimolando la differenziazione di cellule mesenchimali in osteoblasti. Wennenberg (15) e Boyan (16), infine, hanno dimostrato come la produzione di matrice e segnali solubili (TGFbeta-1, PGE-2 e molti altri) sia strettamente legata alla rugosità della superficie. Oggi sappiamo come idrossilazione ed idratazione, adsorbimento di cationi, anioni (calcio e fosfato) e biomolecole (proteine, glicoproteine, glicolipidi, proteoglicani e polisaccaridi) con contemporanea formazione di un network di fibrina in grado di dare un coagulo stabile, rappresentino i primissimi eventi che si verificano all’interfaccia tra superficie implantare e osso (17-18). Tutti questi eventi sono mediati dalla formazione sulla superficie dell’impianto di uno strato stabile di ossidi, che garantisce con le sue proprietà (bassa concentrazione di ioni nei prodotti di dissoluzione, costante dielettrica simile a quella dell’acqua e carica moderatamente negativa a pH fisiologico) l’ideale interazione con i fluidi biologici (17-20). Una superficie rugosa, grazie alla maggiore area superficiale, ener-

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gia libera e bagnabilità, determina maggiore adsorbimento di biomolecole funzionali (1920), proteine in grado di mediare l’adesione cellulare alla superficie. L’adesione cellulare è quindi mediata da uno strato amorfo (20-21) e non omogeneo, di spessore variabile (da 50 a 600 nanometri) e ricco di proteoglicani, glicoproteine, sialoproteine ossee (BSP: bone sialoproteins) e osteopontina (OPN: osteopontin). In particolare, le sialoproteine ossee sono in grado di favorire la differenziazione delle cellule mesenchimali indifferenziate in osteoblasti, mentre l’osteopontina (22) è protagonista dell’adesione cellulare, attraverso una specifica sequenza RGD, responsabile del meccanismo dell’adesione focale (23). Quest’ultima, come vedremo, scatena una sequenza di eventi che portano alla neoformazione ossea sulla superficie dell’impianto (23-24). La superficie ottenuta originariamente dal processo di microfusione tramite laser (DLMF: direct laser metal forming) presenta, come precedentemente dimostrato (1, 9, 11) un gran numero di microsfere e particelle granulari debolmente adese. La presenza di queste è caratteristica naturale del processo di microfusione (8-11), tuttavia, dopo una semplice procedura di trattamento della superficie con miscela di acidi organici (Leader-Novaxa, Milano), allo scopo di rimuovere appunto le particelle meno aderenti, la superficie dell’impianto appare completamente diversa, con una geometria superficiale omogenea, ricca di concavità. Queste cavità, di diametro variabile (100-200 µ) si estendono al di sotto della superficie, continuandosi con gli spazi porosi interni di cui la porzione più superficiale dell’impianto è ricca; le porosità interne sono comunicanti ed interconnesse per mezzo di canali e tunnel di interconnessione. Questo tipo di geometria, assolutamente peculiare, è ottenibile soltanto attraverso procedura di microfusione tramite laser (1, 9, 11). La superficie così ottenu-

ta non è più semplicemente rugosa: è una superficie porosa, come rivelato da caratterizzazione morfologica con microscopia elettronica a scansione supportata da ricostruzioni tridimensionali con software applicativi (11). Il nostro gruppo di Ricerca ha inizialmente sperimentato la risposta biologica a questo tipo di superficie porosa con prove in vitro studiando la formazione e organizzazione del coagulo di fibrina umana e il comportamento di osteoblasti (1, 9, 11). Al contatto con sangue umano per 5 min, e successiva analisi al microscopio a scansione elettronica, la superficie mostrava chiaramente la capacità di creare un network di fibrina organizzato tridimensionalmente e diffuso su tutta la superficie (9, 11). Gli studi condotti con coltura di osteoblasti mostravano, invece, densità cellulare maggiore all’interno delle cavità, con le cellule allungate e protruse all’interno ed al di sopra di esse (11). Le cellule si disponevano “a ponte” sulle cavità più piccole, penetrando in quelle più grandi, presentando prolungamenti citoplasmatici estesi, a partire dalle pareti delle stesse. Si evidenziavano primi nuclei di deposizione di matrice ossea (11). Il passo successivo consisteva nel valutare la risposta biologica a questa nuova superficie in vivo. Scopo del presente lavoro è verificare il comportamento biologico in vivo dei nuovi impianti in titanio microfuso tramite laser nell’uomo nelle prime fasi di guarigione (TixOs, Leader-Novaxa, Milano), in assenza di carico. Era nostra intenzione valutare la quantità e qualità dell’apposizione ossea sulla nuova superficie degli impianti in titanio microfuso (DMLF) attraverso uno studio istologico ed istomorfometrico con microscopia ottica. La superficie dell’impianto in titanio microfuso era confrontata con quelle di due impianti convenzionali in commercio (Conexao Implants, San Paolo, Brasile), uno a superficie

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liscia (CpTi) e uno sabbiato e acidificato (SAE), impiegati come controlli. Inoltre, la superficie in titanio microfuso (DMLF) era valutata con microscopia elettronica a scansione e spettrometria dispersiva a raggi X.

MATERIALI E METODI Selezione dei pazienti Trenta pazienti (20 donne e 10 uomini) di età media 51.3 +-3.0 anni, sono stati selezionati per questo studio presso il Dipartimento di Parodontologia dell’Università di Guarulhos, San Paolo (Brasile). I criteri di inclusione prevedevano la presenza di edentulia total e la necessità di riabilitazione completa con protesi fissa supportata da impianti. I criteri di esclusione prevedevano la presenza di malattie sistemiche che potessero interferire con la guarigione ossea, lo stato di maternità o allattamento e una forte abitudine al fumo (più di 15 sigarette al giorno). Tutti i pazienti hanno accettato di prendere parte allo studio, firmando un apposito consenso informato. Lo studio è stato approvato dal comitato etico della’Università di Guarulhos (CEP-UnG n. 201). Preparazione e analisi morfologica degli impianti test Dieci mini-impianti dentali in lega di titanio (Ti-6Al-4V) sono stati creati con metodica DLMF (Leader-Novaxa, Milano) a partire da microparticelle di polvere di dimensioni di 25-45 µ. Le dimensioni degli impianti erano 2,0 mm in diametro e 8,0 mm in lunghezza. La costruzione degli impianti avveniva in atmosfera di argon con l’impiego di un potente sistema laser in fibra drogata di Itterbio (Yb+) (EOS GmbH Monaco, Germania), con la capacità di creare un volume di 250x250x215 mm, lunghezza d’onda di 1054 nanometri, potenza

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continua di 200 W e frequenza di scansione di 7 m/s. L’ampiezza del fascio laser era di 0,1 mm. Allo scopo di rimuovere le particelle residue ottenute dal processo di fusione, gli impianti sono sttai trattati con ultrasuoni in acqua distillata per 5 minuti, a 25°, immersi quindi in NaOH (20 g/L) e perossido di idrogeno (20 g/L) alla temperatura di 80° per 30 minuti, quindi nuovamente sottoposti a ultrasuoni per 5 minuti in acqua distillata. Il trattamento superficiale (Leader-Novaxa, Milano) prevedeva l’immersione in miscela di acidi organici (acido ossalico e acido maleico) alla temperatura di 80° per 45 minuti, con successivo lavaggio in bagno ultrasonico di acqua distillata per 5 minuti. Preparazione degli impianti controllo Venti mini-impianti (Conexao Implants, San Paolo, Brasile), ottenuti per normale tornitura e fresatura di barrette di titanio, sono stati impiegati come controllo. Gli impianti, aventi diametro di 2,5 mm e lunghezza 6,0 mm, erano costituiti da titanio di grado 4. Dieci di essi presentavano una superficie liscia (cpTi) oriva trattamento superficiale; gli altri dieci presentavano una superficie sabbiata e acidificata (SAE). Dopo sabbiatura con particelle di TiO2 di dimensioni comprese tra 25-100 micron, gli impianti SAE sono stati trattati in ultrasuoni con soluzione alcalina, lavati con acqua distillata ed acidificati con una miscela di HNO3 e HF (Conexao Implants, San Paolo, Brasile). Procedura chirurgica Per lo studio sono stati utilizzati 30 miniimpianti (10 impianti di studio in titanio microfuso tramite DLMF e 20 impianti di controllo in titanio convenzionale, di cui 10 con superficie liscia cpTi e 10 con superficie sabbiata e acidificata SAE). Ogni paziente ha ricevuto soltanto un sin-

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golo mini-impianto, inserito nella regione posteriore del mascellare superiore. I mini-impianti sono stati inseriti allo scopo di essere carotati e rimossi, a distanza di 2 mesi, per la valutazione microscopica; essi sono stati posizionati nel contesto dell’inserimento degli impianti di dimensioni standard impiegati per la riabilitazione protesica dei pazienti partecipanti allo studio. Dopo incisione crestale, veniva sollevato un lembo a spessore totale e, terminato l’inserimento degli impianti di dimensioni standard, veniva inserito il mini-impianto oggetto dello studio, distalmente all’ultimo e più distale impianto standard inserito per la riabilitazione protesica. Il sito del mini-impianto era preparato in osso di bassa densità (tipo V) con fresa dal diametro di 1,8 mm e sotto costante irrigazione. Nel caso il miniimpianto presentasse scarsa stabilità primaria, un nuovo sito distale al precedente veniva preparato con fresa di diametro inferiore. I lembi venivano riposizionati a completa copertura degli impianti e suturati. Ai pazienti veniva somministrata una copertura antibiotica: amoxicillina e acido clavulanico 2 g/die per 6 giorni complessivi (Augmentin, Glaxo-Smithkline Beecham, Brentford, Gran Bretagna) per scongiurare eventuali infezioni postoperatorie; il dolore era controllato con nimesulide 100 g da assumersi ogni 12 ore (Aulin, Roche Pharmaceutical, Basilea, Svizzera) per 2 giorni; venivano inoltre prescritti sciacqui con clorexidina 0,12%, 2 volte al giorno per 1 settimana (Chlorexidine, OralB, Boston, MA, USA). Periodo di guarigione e rimozione dei mini-impianti Le suture venivano rimosse dopo dieci giorni. Dopo un periodo di guarigione sommersa di circa 2 mesi, nel contesto della procedura di scopertura degli impianti di dimensioni standard utilizzati per la riabilitazione protesica, i mini-impianti oggetto dello

studio e una porzione di tessuto osseo circostante venivano carotati con fresa trephine da 4,0 mm (Trephine Bur, Hu-Friedy International, Chicago, IL, USA), e immediatamente immersi in formalina al 4%. Analisi istologica e istomorfometrica con microscopia ottica I campioni bioptici sono stati processati allo scopo di ottenere sottili sezioni deidratate in una sequenza ascendente di alcol e quindi inserite in resina (Technovit 7200 VLC, Kulzer, Wehrheim, Germania). Dopo la polimerizzazione, i campioni sono stati sezionati lungo l’asse maggiore dell’impianto usando un disco diamantato a elevata precisione, ottenendo sezioni di circa 150 µ di spessore, portate poi a 30 µ con microabrasione (Precise 1 Automated System, Assing, Roma, Italia). Per ciascun mini-impianto sono state ottenute da una a due sezioni, colorate con fucsina basica e blu di toluidina. Per l’analisi istologica e istomorfometrica è stato impiegato un microscopio ottico a luce trasmessa (Laborlux S, Leitz, Wetzlar, Germania) collegato a personal computer AMD 1800 Mz, interfacciato con scheda digitalizzatrice a colori reali con ingresso RGB (Matrix Vision GmbH, Milano), videocamera con alta risoluzione (3CCD, JVC KYF55B, Milano) e apposito software applicativo (Image Pro-Plus 4.5, Media Cybernetics Inc, Immagini e Computer Snc, Milano). Questo sistema permetteva l’esatta quantificazione delle percentuali di titanio, tessuto osseo e spazi midollari presenti nei campioni analizzati. In particolare, venivano prese in considerazione tre variabili istomorfometriche: - la percentuale di contatto tra osso e impianto (BIC: bone to implant contact), definita come la quantità di osso mineralizzato direttamente a contatto con la superficie dell’impianto lungo tutta la superficie dello stesso;

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- la densità ossea nell’area delle spire (BDTA: bone density in the threaded area”), definita come la frazione di osso mineralizzato misurata nella sola area compresa all’interno delle spire dell’impianto; - la densità ossea generale (BD: bone density), definita come la frazione di osso mineralizzato misurata su un’area estesa per 300 µ, laterale all’impianto. Per ogni impianto e per ciascun gruppo di impianti sono state calcolate la media e la deviazione standard delle tre variabili istomorfometriche prese in esame nello studio. Allo scopo di confrontare i risultati istomorfometrici ottenuti in ciascun gruppo di impianti, è stato eseguito uno specifico test statistico (Kruskall- Wallis test, P<0.05). Analisi con microscopia elettronica a scansione e spettrometria dispersiva a raggi X Due campioni di impianti DMLF sono sttai inviati in laboratorio già escissi e fissati, dove sono stati effettuati i trattamenti standard di preparazione all’osservazione del campione mediante microscopia elettronica a scansione: lavaggio in soluzione tampone di sodio cacodilato (pH 7.4), deidratazione in sequenza di etanoli a concentrazione crescente, trattamento in esametildisilazano (Sigma-Aldrich Inc., SaintLouis, MO, USA), rivestimento con oro puro in atmosfera di argon in un apparecchio Emitech K550 (Quorum Technologies, Hailsham, Gran Bretagna) e montaggio su apposita matrice con adesivi conduttivi al carbone. Per l’osservazione è stato impiegato il microscopio a scansione FEI Philips XL30 FEG ESEM (Philips, Amsterdam, Paesi Bassi) operante in rivelazione di elettroni secondari ed elettroni retrodiffusi (backscattered) a un voltaggio di 7-15 kilo-V. Le microfotografie sono state acquisite direttamente in modalità digitale TIFF a 1424 x 968 pixel. La spettrografia a raggi X è stata realizzata con lo stesso microscopio a scan14

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sione adattato con un sistema EDAX Sirion 200/400 operante a 15 kilo-V. Le immagini digitali della distribuzione dei distinti elementi erano ottenute in formato digitale come figure BMP RGB 512x512. Queste immagini sono state successivamente sovrapposte e combinate con le rispettive immagini SEM all’interno del software Adobe Photoshop (Adobe, San Jose, CA, USA).

RISULTATI Osservazioni cliniche Quattro impianti (2 con superficie lavorata, 1 con superficie sabbiata ed acidificata e 1 in titanio microfuso tramite laser) apparivano poco stabili al momento dell’osteointegrazione. Questi mini-impianti erano pertanto esclusi dalla valutazione microscopica (ottica ed elettronica). I restanti 26 miniimpianti, invece, erano stabili, non presentavano evidenza di riassorbimento osseo né di infezione dei tessuti circostanti. Erano pertanto utilizzati per lo studio e, trattati come descritto sopra, valutati attraverso microscopia ottica (analisi istologica e istomorfometrica). Due campioni contenenti impianti DMLF, infine, erano destinati a valutazione per microscopia elettronica (analisi morfologica e per spettrografia a raggi X). Risultati istologici e istomorfometrici Complessivamente, il tessuto osseo circostante le tre superfici (cpTi, SAE e DMLF) appariva sano. Tutti i campioni esaminati mostravano infatti la presenza di regolare attività metabolica e sostanziale rimodellamento a carico dell’osso circostante le superfici dei mini-impianti. In tutti i campioni si potevano distinguere nitidamente l’osso preesistente e maturo, chiaramente trabecolato e ricco di lacune osteocitarie, dall’osso neoformato, ancora parzialmente immaturo. L’osso neoformato era separato dall’osso preesistente da linee cementanti; • 2009 Apr;1(1):

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erano evidenti in questo contesto gli osteoblasti, che dimostravano attività e deposizione di nuovo osso. Tuttavia, una sostanziale differenza era evidenziabile tra le diverse superfici in esame. Sulle superfici SAE (Fig. 1a-b) e DMLF (Fig. 2a-b) l’osso neoformato era direttamente ed intimamente in contatto con la superficie implantare e presentava in molte aree un livello di maturazione precoce, con chiari segni di rimodellamento; vere e proprie trabecole neoformate si interponevano tra l’osso preesistente e la superficie dell’impianto (Fig. 2c). Negli impianti cpTi, invece, il tessuto osseo neoformato appariva ancora immaturo e in alcune aree le trabecole ossee preesistenti erano separate dalla superficie da una sottile striscia di tessuto connettivo (Fig. 3a-b). Il dato istomorfometrico confermava questi rilievi (Tab. 1). Le percentuali di BIC e BDTA erano significativamente inferiori (p<0.05) negli impianti in cpTi. I valori di BIC per la superficie cpTi erano compresi tra 8,3% e 18,1%, con media

13,0%, mentre i valori per le superfici SAE e DMLF erano compresi tra 18,4% e 27,6%, con medie rispettivamente del 21,8% e 23,2%. La BDTA media nell’area delle spire per i cpTi era di 17,9% in un range di 11,1 e 30,0%; i valori di BDTA per SAE e DMLF erano compresi invece tra 22,4% e 40,0%, con medie rispettivamente di 30,3% e 33,3%. La densità ossea in una zona di 300 micron laterale all’impianto (BD), infine, era analoga per tutte le superfici con valori medi intorno al 15,0%. Risultati da microscopia elettronica a scansione e spettrometria a raggi X L’analisi con microscopia a scansione per i soli campioni con superficie DLMF mostrava diffusa e stretta compenetrazione della matrice ossea neoformata con le irregolarità della superficie implantare. La matrice appariva diffusamente mineralizzata (Fig. 4a). Essa era deposta nelle cavità e nelle irregolarità della superficie, in intimo contatto con la stessa (Fig. 4b), e non era staccata neppure in quelle

Fig. 1 Superficie SAE. a Overview. Osso neoformato in avanzato stato di maturazione e rimodellamento. L’osso è a contatto con la superficie implantare (fucsina basica e blu di toluidina, x12) b Maggiore ingrandimento della porzione selezionata nell’immagine precedente. Le frecce indicano gli osteoblasti che depongono osso, in alcune zone anche a contatto con la superficie implantare (fucsina basica e blu di toluidina, x200).

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Fig. 2 Superficie DMLF. a Overview. L’impianto è circondato da tessuto osseo compatto, con piccoli spazi midollari b A maggiore ingrandimento, osso compatto con piccoli spazi midollari a contatto con la superficie implantare. Non ci sono gap all’interfaccia, non si osserva risposta infiammatoria c Ad ulteriore ingrandimento, trabecola ossea neoformata direttamente sulla superficie implantare.

Fig. 3 Superficie cpTi. a Overview. Si nota subito la mancanza di contatto tra le trabecole ossee neoformate e la superficie dell’impianto (fucsina basica e blu di toluidina, x12) b Ingrandimento della porzione selezionata nell’immagine precedente. L’osso neoformato non mostra un contatto diretto con la superficie implantare (fucsina basica e blu di toluidina, x200). Le frecce evidenziano la separazione tra l’osso neoformato e l’osso pre-esistente.

aree segnate dal passaggio, certamente traumatico, della fresa per il carotaggio (Fig. 4cd). Le cellule osteoblastiche mostravano un 16

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aspetto stellato con numerosi prolungamenti citoplasmatici. La spettrometria dispersiva a raggi X permetteva di approfondire l’analisi • 2009 Apr;1(1):

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BIC% BDTA% BD%

CPTI MEDIA ± DS RANGE

SAE MEDIA ± DS RANGE

DLMF MEDIA ± DS RANGE

P-VALUE

CI 95%

13.06±5.74 8.34 – 18 17.95±11.72 11.12 – 30 14.88 ±7.69 10.3 – 26.7

21.81±3.72 18.8 – 25.26 30.38±6.93 27.3 – 40 15.37±6.22 2.31 – 22.8

23.29+2.91 18.4 – 27.6 33.36±5.90 22.4 – 38.5 15.37±5.66 2.1 – 20.22

0.0002 0.0052 0.999

8.65 to 25.17 8.58 to 39.66 8.96 to 20.70

Tab.1 Media e deviazione standard (DS) per i valori percentuali di contatto impianto-osso (BIC%), densità ossea nell’area delle spire (BDTA%) e densità ossea in un’area ampia 300 micron lateralmente all’impianto (BD%), in impianti con superficie machined (cpTi), sabbiati ed acidificati (SAE) e prodotti tramite laser (DLMF) posizionati nella maxilla posteriore e carotati a 2 mesi dall’inserimento. Kruskall-Wallis Test (p<0.05).

Fig. 4 Superficie DMLF. A Microfotografia elettronica della matrice ossea mineralizzata sulla superficie dell’impianto. B A maggior ingrandimento, la matrice ossea è fortemente adesa alla superficie implantare. C La matrice ossea compenetra gli spazi porosi della superficie implantare. D La stessa sezione ottenuta con elettroni backscattered. Questa tecnica permette di distinguere facilmente il tessuto osseo (più scuro) dalla superficie metallica (più chiara) E Spettrometria a raggi X. Il calcio (verde) il fosforo (rosso) ed il titanio (blu) evidenziano la presenza della matrice mineralizzata, diffusa ed uniforme sulla superficie dell’impianto. Nel riquadro in basso a sinistra, in verde la matrice mineralizzata, in blu la superficie del titanio.

del grado di mineralizzazione raggiunto dalla matrice ossea neoformata, mappando sulle immagini i singoli elementi in esame: nello

stesso campo visivo erano evidenziate la distribuzione del calcio (verde), del fosforo (rosso) e del titanio (blu). Era evidente la dif-

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fusa collocazione di calcio e fosforo, indicativa di stato di mineralizzazione. La sovrapposizione e combinazione delle immagini da microscopia a scansione con quelle ottenute con spettrometria dispersiva rafforzava il concetto di una matrice ben organizzata, ampiamente mineralizzata e a stretto contatto con la superficie dell’impianto (Fig. 4e).

DISCUSSIONE In questo studio istologico e istomorfometrico sull’uomo la nuova superficie degli impianti in titanio microfuso tramite laser (DMLF) ha dimostrato un buon grado di integrazione, con ampia osteogenesi direttamente sulla superficie (25) a soli due mesi dall’inserimento degli impianti. I valori di BIC per la superficie DMLF erano infatti compresi tra 18,4% e 27,6%, con media di 23,2%, leggermente superiori a quelli ottenuti con superficie sabbiata e acidificata convenzionale (BIC compresa tra 18,8% e 25,2%, con media 21,8%); i risultati di queste due superfici erano statisticamente superiori a quelli ottenuti dagli impianti cpTi (BIC compresa tra 8,3% e 18,1%, con media 13,0%). La buona integrazione ossea della superficie DMLF era inoltre confermata dal dato relativo alla densità ossea nell’area delle spire (compresa tra il 22,4% ed il 38,5%, con media 33,3%) leggermente superiore a quanto trovato per la superficie SAE (BDTA compresa tra 27,3% e 40,0%, con media 30,3%) e notevolmente superiore a quanto reperito per le superfici cpTi (intervallo 11,1% e 30,0%, media 17,1%). In particolare, il tessuto osseo neoformato era direttamente ed intimamente in contatto con la superficie DMLF, e presentava in molte aree una precoce maturazione e mineralizzazione, con chiari segni di rimodellamento; in molte aree, infatti, vere e proprie trabecole neoformate erano visibili, in diretto contatto con la superficie implantare. Questi risultati erano confermati dall’analisi 18

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dei campioni di superfici DMLF con microscopia a scansione elettronica e spettrometria a raggi X, laddove era evidente come la matrice neoformata ricoprisse gran parte della superficie implantare, mostrando anche un avanzato grado di mineralizzazione. Ma quali sono i fattori in grado di determinare una precoce neoformazione ossea? È ormai noto come il reclutamento di cellule osteogeniche sia fondamentale per la deposizione di nuovo osso sulla superficie implantare (25) ed è stato dimostrato come queste cellule utilizzino il network di fibrina stabilizzato intorno all’impianto per raggiungere la superficie implantare. Studi precedenti hanno ampiamente dimostrato come la rugosità superficiale stimoli la formazione di un coagulo e di un network di fibrina (26-27). Come abbiamo visto, un nostro precedente lavoro in vitro ha ampiamente dimostrato la capacità della nuova superficie DMLF di supportare e strutturare intorno a sé la formazione di una matrice tridimensionale o network di fibrina stabile (9,11). D’altra parte, la geometria superficiale e la struttura porosa aperta e interconnessa dell’impianto in titanio microfuso sembrano rappresentare un ambiente ideale per le cellule osteogeniche (28-30). In un recente lavoro in vitro con osteoblasti umani coltivati su superfici di dischi di titanio fuso tramite laser, Xue ha studiato il comportamento di cellule osteogeniche in cavità e pori di diverse dimensioni, da 100 a 800 µ (28). In questo lavoro, le cellule penetravano nei pori di diametro superiore a 200 µ e si disponevano al di sopra di pori di diametro tra 100 e 200 µ, ma non penetravano e non si rapportavano con cavità di diametro inferiore a 100 µ. Si tratta di un dato interessante, perchè ove possibile le cellule migrano all’interno dei pori o si stabiliscono al di sopra di essi, con effetto “ponte”, aderiscono, assumono una caratteristica morfologia “stirata”, cessano di proliferare e si differenziano in osteoblasti. In entrambi i casi, • 2009 Apr;1(1):

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Xue ha evidenziato l’espressione di marker specifici dell’espressione genica, quali la fosfatasi alcalina, e la precoce produzione di matrice (28). Il lavoro di Xue conferma la nostra precedente esperienza (9-11) in vitro con coltura di osteoblasti su superficie porosa di titanio microfuso tramite laser, laddove il comportamento cellulare era assolutamente analogo e comparabile, con evidenza precoce di produzione di matrice ossea. È ormai noto come le proprietà strutturali e geometriche della superficie possano influenzare forma e dimensioni delle cellule, con riflessi sull’espressione genica (31-34). I primi ricercatori a sottolineare come i problemi biologici non potessero essere risolti concentrandosi unicamente su aspetti genetici e biochimici, ma richiedessero un’attenta analisi delle problematiche meccaniche, strutturali ed architetturali delle cellule, furono Folkman (31) e Ingber (32). Dopo quindici anni di ricerca, i meccanismi che relazionano la forma delle cellule alla loro funzione sono stati in parte rivelati (33). È noto infatti come le cellule si rapportino con il proprio substrato attraverso specifiche proteine di legame, le integrine (2224, 33-35). Queste ultime si trovano sulla superficie della membrana cellulare, e sono responsabili dell’adesione focale (23, 33-35). Al tempo stesso, però, le integrine, attraverso il proprio dominio citoplasmatico e proteine di legame come alfa-actinina, talina, vinculina, paxilina e tensina, sono connesse in modo funzionale con il citoscheletro (2325, 28, 33-36). Quest’ultimo rappresenta l’impalcatura interna della cellula, ed è un network complesso di microfilamenti (actina) filamenti intermedi (vicentina, desmina) e microtubuli (tubulina) tutti interconnessi in senso funzionale, e dotato di una propria attività contrattile, generata dalla contrazione dei microfilamenti di actina (33-36). Dal momento che il citoscheletro è funzionalmente connesso al nucleo cellulare, è chiaro come, attraverso il meccanismo del-

l’adesione focale, forze meccaniche impartite dal substrato possano essere trasformate in segnali biochimici dalla cellula (34-38). In sostanza, le integrine, le caderine e i meccanorecettori cellulari, connessi con il citoscheletro in determinati punti della membrana, se attivati spazialmente e in un certo numero a opera della geometria del substrato, potrebbero “accendere” meccanismi di trasduzione, per i quali l’espressione genica sia modulata dalle forze meccaniche applicate sulla cellula (33-38). La concavità sembra rappresentare un ambiente ideale per l’espressione del fenotipo osteogenico (34, 39). Essa è probabilmente in grado di determinare un sistema di compressioni e tensioni ottimali sui meccanorecettori cellulari, che attivano cascate di chinasi e segnali intracellulari, e determinano l’attivazione di riflesso di gruppi di geni importanti, e l’espressione del fenotipo osteogenico (34, 39). Il citoscheletro integra quindi diversi segnali, essendo uno scaffold meccanico chimico con la peculiarità di essere simultaneamente struttura e catalizzatore: è in grado di tradurre globalmente una forza meccanica applicata sulla cellula in segnali chimici, ma anche di modularla perché è sistema attivo con una peculiare attività contrattile, controbilanciata appunto dagli stimoli meccanici impartiti dal substrato (3338). In questo senso, la struttura detta la funzione (31-34). Modificazioni conformazionali e riarrangiamenti a livello del citoscheletro possono determinare direttamente l’espressione di un dato fenotipo cellulare, in questo caso quello osteogenico (34). E ciò accade anche in natura, laddove nelle concavità scavate dagli osteoclasti gli osteoblasti trovano l’ambiente ideale per deporre nuovo osso (24, 39). Dunque, le cellule rispondono in maniera peculiare a differenti geometrie superficiali, e la microfusione tramite laser ci permette di controllare magnificamente parametri fondamentali come grado di porosità, forma e dimensione dei pori, loro distribuzione (28-30) . E’ intui-

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tivo come la porosità debba essere aperta ed interconnessa: questo permette la penetrazione capillare e profonda non solo delle cellule, ma anche dei fluidi, dei nutrienti e dell’ossigeno (contenuti nel sangue) in grado di sostenere la crescita e la differenziazione cellulare (28-30,40); allo stesso tempo, questa architettura garantisce lo smaltimento dei prodotti di scarto del metabolismo cellulare (41). La microfusione del titanio tramite laser permette oggi di creare superfici in grado di modulare specifiche risposte biologiche e biomeccaniche.

CONCLUSIONI In questo lavoro comparativo sull’uomo, è stato evidenziato come la superficie di un nuovo impianto in titanio microfuso tramite laser (DMLF) (TixOs, Leader-Novaxa, Milano, Italia) sia in grado di stimolare e supportare l’apposizione di nuovo osso, a distanza di due mesi dall’inserimento ed in assenza di carico. Il risultato istologico ed istomorfometrico è superiore a quello ottenuto con impianti con superficie sabbiata e acidificata tradizionali (SAE) e con impianti a superficie machined (cpTi). Il dato ultrastrutturale ottenuto dall’analisi al microscopio a scansione elettronica e dalla spettrografia dispersiva a raggi X conferma un precoce grado di maturazione e mineralizzazione per l’osso neoformato sulla superficie DMLF. La microfusione tramite laser permette la creazione di impianti con porosità graduata e controllata, più marcata in prossimità della superficie e progressivamente ridotta verso l’interno. Questo tipo di struttura ha caratteristiche di elasticità modulate sul tessuto osseo circostante, e pertanto è potenzialmente capace di una migliore trasmissione del carico. Inoltre, la presenza di una serie di concavità ripetute sulla superficie, che si continuano in un sottostante e ricco network di pori di dimensioni costanti, sembra essere in grado di favorire determinare spe20

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cifiche risposte biologiche, quale l’apposizione di nuovo osso. Si è aperta, nella moderna implantologia dentale, una nuova era: l’era del titanio microfuso tramite laser.

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È con la forza dell’esperienza che diamo forma al futuro.

Via G. Di Vittorio, 10/12 20020 Misinto (MI) - T.: +39 02 96720218 – 0296720174 – 0209720178 F.: +39 02 96721269 info@dental-tech.it - www.dental-tech.it

HEWERSON SANTOS TAVARES1, RAFAEL SILVEIRA FAEDA2, ANTÔNIO CARLOS GUASTALDI3, FERNANDO POZZI SEMEGHINI GUASTALDI4, NILSON T.C. OLIVEIRA5*, ÉLCIO MARCANTÔNIO JR6 Unesp, Araraquara, SP, Brasile 1 Doctoral student in Biotechnology, Biomaterials Group 2 Doctoral student in Periodontics 3 Associate Professor of Physical Chemistry, Biomaterials Group 4 Surgeon Dentistry, Biomaterials Group 5 PhD in Chemistry, Biomaterials Group 6 Associate Professor of Periodontics

Valutazione SEM-EDS e biomeccanica di impianti con differenti trattamenti di superficie Keywords Osso, laser, SEM, superficie impiantare, titanio. ABSTRACT

INTRODUZIONE

Scopo Modificazioni nella composizione chimica e nella topografia delle superfici implantari possono avere degli effetti sulla formazione di osso peri-implantare e sui tempi di guarigione. Scopo di questo studio è stato valutare al microscopio elettronico a scansione (SEM)/spettroscopia a dispersione d’energia (EDS) e biomeccanicamente impianti con differenti trattamenti di superficie. Materiali e metodi Sono state analizzate 4 superfici implantari: impianti commerciali con superficie macchinata (TU); impianti commerciali con superficie porosa, sabbiati con particelle di Al O e mordenzati (TJA); impianti con superficie trattata al laser (Laser) e infine, impianti con superficie trattata al Laser e rivestiti di idrossiapatite (HA). Un campione di ogni superficie è stato valutato al SEM/EDS prima dell’intervento di chirurgia. Trentadue impianti (8 per ogni superficie) sono stati inseriti nella tibia di 4 conigli. Dopo 8 settimane gli animali sono stati sacrificati e gli impianti sono stati rimossi con removal torque e trattati per la valutazione postchirurgica al SEM/EDS. Risultati Gli impianti HA presentavano valori di removal torque più alti rispetto agli impianti laser, TJA e TU. L’analisi al SEM effettuata dopo la chirurgia mostrava chiaramente la formazione di osso su tutte le superficie studiate; in particolare le superficie TJA, laser e HA erano completamente circondate da osso neoformato. L’analisi EDS mostra che la concentrazione di Ca e P aumenta rispettivamente dalle superfici TU alle TJA, Laser e HA, confermando così i risultati del SEM e i valori di removal torque. Conclusioni Gli impianti con superficie trattata al laser ricoperti di idrossiapatite si sono mostrati i più promettenti.

Recentemente sono state proposte numerose e differenti superfici implantari al fine di favorire la formazione di osso periimplantare e ridurre i tempi di guarigione (1). Le proprietà più importanti di una superficie implantare sono: topografia, chimica, energia di superficie e bagnabilità (2). La microtopografia di superficie è considerata importante per il processo di formazione di osso: le superfici rugose mostrano elevate percentuali di contatto tra osso e impianto (3). In uno studio sui conigli Albrektsson e Wennerberg (4) hanno osservato che, dopo 4 settimane di guarigione, il volume di osso intorno agli impianti con superficie rugosa era maggiore rispetto a quelli con superfici lisce, e che ciò era dovuto a una migliore attività di rimodellamento all’interfaccia osso-impianti. Risultati simili sono stati descritti da Zechner et al. (5) dopo 6, 8 e 12 settimane di guarigione a contatto fra la superficie e l’osso. Cho e Jung (6) hanno valutato l’importanza di differenti microtopografie in impianti con superficie liscia e modificata con laser nella tibia di coniglio. Dopo un 8 settimane gli impianti trattati con laser mostravano un valore di removal torque di 62.57 N.cm, mentre le superfici

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H. Santos Tavares et al.

liscie soltanto 23.58 N.cm. Gli autori (6) hanno quindi concluso che i valori di removal torque, e perciò la fissazione dell’impianto nel tessuto osseo, sono risultati migliori nei casi con trattamento al laser della superficie. Suzuki et al. (7) hanno osservato dopo 42 settimane dal posizionamento implantare un volume di osso maggiore negli impianti rugosi rispetto a quelli macchinati; risultati simili sono stati descritti da Grizon et al. (8) dopo un periodo di 12 e 18 mesi di guarigione. Anche la chimica di superficie ha un ruolo rilevante sulla formazione di osso periimplantare. Morra et al. (9) hanno trovato una relazione chiara fra la composizione e la topografia di superficie, che può essere facilmente spiegata con gli effetti chimici del trattamento di superficie effettuato. Infatti, è stato descritto un aumento dell’assorbimento di ioni Ca e P, proteine, lipoproteine e peptidi sulle superfici più idrofile (3, 10); questo fatto, a sua volta, potrebbe influenzare l’adesione e lo spreading cellulare (10) e perciò potenzialmente migliorare la formazione ossea. È stato dimostrato che materiali di fosfato di calcio sono bioattivi, e formano un legame diretto e una interfaccia molto solida con il tessuto osseo (11). Le alterazioni della topografia della superficie implantare sono state proposte da molti autori (12-14) al fine di migliorare il contatto all’interfaccia osso-impianto e promuovere le interazioni fisicochimiche che portano a una maggiore o più veloce formazione di tessuto osseo (15). L’obiettivo del presente studio è la valutazione comparativa al microscopio elettronico a scansione (SEM)/spettroscopia a dispersione d’energia (EDS) e biomeccanica di impianti con differenti trattamenti di superficie.

MATERIALI E METODI In seguito all’approvazione del comitato

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etico della UNESP per la sperimentazione su animali, sono stati utilizzati in questo studio 4 conigli bianchi New Zealand, di 10 mesi (peso 3-3,5 kg). Sono stati inseriti un totale di 32 impianti cilindrici (3,75 x 10,0 mm): 8 impianti commerciali con superficie liscia (TU); 8 impianti commerciali con superficie porosa sabbiata con particelle di Al O e mordenzata (TJA); 8 impianti con superficie trattata con laser (Laser) e 8 impianti con superficie trattata con laser e rivestiti di idrossiapatite (HA). I trattamenti di superficie con laser per i gruppi Laser e HA sono stati condotti con il Digilaser DML 100–Violin 10–Nd:YVO4 equipment (ADITEC Ltda, Cravinhos, SP, Brasile) in atmosfera normale usando i seguenti parametri: potenza 100%, velocità di scansione 100 mm/s; frequenza di ripetizione 35 KHz; potenza di picco 14,5 KW (16). Dopo il trattamento con laser gli impianti del gruppo HA sono stati rivestiti di idrossiapatite utilizzando il metodo biomimetico (17, 18). Un campione di ogni superficie è stato studiato con SEM/EDS prima dell’intervento chirurgico. Gli impianti sono stati puliti con ultrasuoni in acqua deionizzata per 10 min e successivamente con acetone per altri 10 min; in questa fase non è stato effettuato un coating in Au, in modo da mantenere le proprietà di superficie intatte. Gli esperimenti sono stati effettuati utilizzando un microscopio SEM (LEO 440, LEO Electron Microscopy Ltd, Cambridge, UK), collegato a un analizzatore elementare (LEO 760 Si(Li), INCA Energy 200, INCA Crystal) con risoluzione di 133 eV. 2

Procedura chirurgica Gli animali sono stati anestetizzati con una combinazione di chetamine (0,35mg/kg) e xilazina (0,5mg/kg). È stata effettuata una rasatura per esporre la cute, seguita dall’ap-

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Analysis of implant surface treatments

plicazione di una soluzione antisettica. Attraverso una incisione di circa 3 cm in direzione prossimale-distale sono state esposte le metafisi tibiali in modo da poter inserire 2 impianti in ogni tibia. Ogni coniglio ha ricevuto 4 impianti, 2 nella tibia sinistra e 2 in quella destra. La preparazione del letto osseo è stata condotta utilizzando delle frese sotto abbondante irrigazione con soluzione salina. L’inserzione degli impianti è avvenuta rispettando un protocollo con una sequenza progressiva di frese alla velocità di 20 rpm. Dopo l’inserzione degli impianti sono state posizionate le viti di guarigione ed è stata effettuata la sutura dei tessuti molli; dopo la chirurgia è stata somministrata una dose singola di antibiotico (0,25 g Cefazolin, IM). Dopo 8 settimane di guarigione, gli animali sono stati sacrificati con una overdose di anestetico. Per rimuovere gli impianti è stato condotto un test biomeccanico con un dinamometro manuale (15-BTG, Tonich, Giappone) tramite un movimento in senso antiorario. È stato registrato il torque massimo necessario per la rimozione di ogni impianto. In seguito, gli impianti sono stati trattati per le analisi al SEM/EDS postchirurgiche, seguendo la procedura descritta sopra ma con rivestimento di Au (Emitech K 550, Emitech Ltd, Ashford, Kent, UK). I risultati vengono presentati come medie ± deviazione standard (SD).

RISULTATI

superficie. Il gruppo TU mostra una superficie lisica (Fig. 1a), mentre le irregolarità di superficie aumentano dal gruppo TJA al

Fig. 1 Immagini al SEM (ingrandimento 1000x) e analisi EDS prechirurgica. a Impianti commerciali macchinati (TU) mostrano superficie liscia. b All’EDS è stato trovato solo titanio nel gruppo TU. c Sugli impianti commerciali con superficie porosa, sabbiati con particelle di Al O e mordenzati (TJA), sono state riscontrate alcune irregolarità di superficie dovuto alla procedura di sabbiatura. d All’EDS è stato trovato un picco di Al sulla superficie TJA, che indica la presenza di residui di Al dopo la sabbiatura e mordenzatura. e Impianti con superficie trattata al Laser (Laser) presentano la superficie con depressioni di più grande dimensione. f All’EDS un picco di O è stato trovato nel gruppo Laser. g Impianti trattati con Laser e con rivestimento di idrossiapatite (HA) presentano una deposizione uniforme di HA. h All’EDS si osservano picchi di Ca e P. 2

Caratterizzazione prechirurgica delle superfici implantari Le figure 1 e 3 mostrano le immagini al SEM e le analisi EDS ottenute prima e dopo l’intervento chirurgico per tutti i gruppi sperimentali. Analizzando al SEM le diversi superfici prima dell’intervento è possibile osservare differenze nella topografia di

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H. Santos Tavares et al.

Fig. 2 Risultati del test di removal torque degli impianti commerciali macchinato (TU); impianti commerciali con superficie porosa, sabbiati con particele di Al2O3 e mordenzati (TJA); impianti con superficie trattata con Laser (Laser) e impianti con superficie trattata con Laser e con coating di idrossiapatite (HA).

gruppo Laser e HA. Attraverso l’analisi EDS, nel gruppo TU è stato riscontrata solo la presenza di titanio (Fig. 1b). Sui campioni TJA sono state osservate alcune irregolarità di superficie prodotte dalla sabbiatura (Fig. 1c) e la persistenza dei materiali (residui di particelle di Al O ) sulla superficie è stata confermata da un picco di Al riscontrato all’analisi EDS (Fig. 1d). I gruppi TU, Laser e HA sono risultati esenti da contaminanti. Gli impianti Laser mostravano cavità di forma irregolare sulla superficie e una macro/micro struttura tipica con grandi depressioni (Fig. 1e). Il picco di ossigeno è stato rilevato solo nei gruppi Laser (Fig. 1f) e HA (Fig. 1h) ed è risultato totalmente assente nei gruppi TU e TJA. Ciò può essere spiegato con il fatto che le superfici Laser e HA sono state prodotte con la fusione di Ti in atmosfera ambiente (cioè in presenza di O ). La superficie HA presenta un deposito uniforme (Fig. 1g). Picchi di Ca e P sono stati osservati anche dopo la mordenzatura, come indicato dall’EDS (Fig. 1h). La concentrazione di Ti è risultata inferiore nei gruppi Laser e HA rispetto ai gruppi TU e TJA. 2

Test biomeccanici Il valore medio di removal torque di tutte le

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Fig. 3 : Immagini al SEM (ingrandimento 5000x) e analisi EDS postchirurgica. a Negli impianti commerciali macchinato (TU) il tessuto osseo non ricopre uniformemente la superficie. b All’EDS l’intensità dei picchi Ca e P è risultata bassa nei TU. c Sugli impianti commerciali con superficie porosa, sabbiato con particele di Al O e mordenzato (TJA), l’osso neoformato può essere osservato al SEM. d All’EDS si riscontra un’alta intensità di Ca e P nel gruppo TJA. e Nelle immagini al SEM degli impianti con superficie trattata con Laser (Laser) può essere osservata una grande quantità di osso che ricopre le irregolarità di superficie. f All’EDS la presenza di osso può essere anche confermata dagli intensi picchi di Ca e P (EDS) sulla superficie Laser. g Impianti con superficie trattata con Laser e ricoperti di idrossiapatite (HA) presentano tessuto osseo a stretto contato con la superficie. h all’EDS il gruppo HA mostra la più alta intensità di Ca e P. 2

superfici è risultato 41,17 Ncm (Fig. 2). Gli impianti HA hanno mostrato i valori più

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Analysis of implant surface treatments

alti, mentre gli impianti TU i più bassi. Caratterizzazione postchirurgica della superficie La caratterizzazione postchirurgica al SEM mostra chiaramente la formazione di tessuto osseo su tutte le superfici studiate; questi dati sono avvalorati dall’EDS che indica chiaramente picchi di Ca e P, e quindi la presenza di tessuto osseo sulle superfici (Fig. 3). Nel gruppo TU il tessuto osseo era presente solo in alcune porzioni della superficie (Fig. 3a), mentre negli altri gruppi le superfici ne erano totalmente ricoperte. L’intensità dei picchi di Ca e P è risultata più bassa per il gruppo TU (Fig. 3b). Sulle superfici del gruppo TJA al SEM si osserva osso neoformato (Fig. 3c); inoltre, Ca e P mostrano un’intensità più elevata rispetto al gruppo TU in tutte le aree analizzate degli impianti. L’Al è ancora presente dopo l’intervento chirurgico sugli impianti del gruppo TJA (Fig. 3d). Al SEM nel gruppo laser (Fig. 3e) si osserva una grande quantità di osso che ricopre tutte le irregolarità di superficie; la presenza di tessuto osseo può essere anche confermata dall’alta intensità dei picchi di Ca e P (Fig. 3f). Il gruppo HA mostra osteogenesi da contatto; inoltre si osserva una frattura, avvenuta durante la rimozione dell’impianto con removal torque, all’interfaccia osso/osso (Fig. 3g); questa è dovuta al fatto che fra lo strato di HA e il tessuto osseo l’interazione è più forte che tra osso e osso. Inoltre questo gruppo presenta la più alta intensità di Ca e P in confronto a tutte le altre superfici esaminate.

DISCUSSIONE La microtopografia di superficie è in grado di influenzare sia la fissazione biologica che

l’ancoraggio meccanico degli impianti al tessuto osseo (20). Anche l’assenza di contaminazioni degli impianti dentali di titanio viene considerata una condizione importante per avere l’osseointegrazione; infatti, è stato ipotizzato che la presenza di contaminanti possa portare al fallimento implantare (21). Particelle di Al sono ampiamente utilizzate per la sabbiatura degli impianti di titanio, ma questo materiale può rimanere sulla superficie e perciò ostacolare il processo di osseointegrazione. La presenza di picchi di Al prima e dopo lintervento è stata verificata con l’EDS sulle superfici TJA, e ciò indica una contaminazione della superficie commerciale TJA (22). Al contrario, l’irradiazione laser può essere considerata un processo “pulito” (16, 23). Benché la superficie TJA sembra supportare una buona osseointegrazione, la concentrazione di Ca e P è più bassa su questa superficie rispetto a quelle Laser e HA. Infatti, dal confronto di differenti superfici implantari ottenute tramite procedure meccaniche (liscia e sabbiata), chimiche (mordenzatura e ossidazione), termiche (plasma-spray) e laser (irradiazione), si è osservato che le superfici ottenute con irradiazione laser presentavano le stesse caratteristiche delle altre ma l’assenza di contaminazione. Inoltre, l’irradiazione laser si è dimostrata un processo riproducibile che permette un ottimo controllo dei parametri necessari per ottenere la topografia desiderata (16), e che presenta vantaggi per quanto riguarda la standardizzazione e la facilità del trattamento di superficie, nonché un costo basso in confronto agli altri metodi (16, 24). L’analisi biomeccanica degli impianti con removal torque è stata inizialmente introdotta come misura della forza necessaria per rompere l’interfaccia tra osso e impianto e perciò è stata considerata una misura indiretta dell’osseointegrazione (12). Nel presen-

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te studio le superfici TU e TJA presentano valori di removal torque simili a quelli descritti in letteratura (4-6, 22, 25, 26), e in ogni caso inferiori rispetto ai gruppi Laser e HA. Confrontando i risultati EDS postchirurgici fra le superfici trattate con laser (con o senza HA) e il gruppo TJA, si osserva una presenza quantitativamente più alta di Ca e P per i gruppi Laser e HA; questo fatto è correlato alla maggiore formazione di osso riscontrata su tali impianti. Sugli impianti dei gruppi TJA, Laser e HA si osserva formazione ossea; in particolare, non vi sono differenze fra i gruppi TJA e Laser nel test biomeccanico; risultati simili sono stati descritti da Cho e Jung (6) in studi sui conigli. Gli impianti HA mostrano valori di removal torque più alti rispetto a tutti i gruppi esaminati: questi dati sono supportati dalle analisi EDS, che mostrano notevoli differenze nella quantità di Ca e P sulle superfici HA prima e dopo interventi di chirurgia. Inoltre, la superficie rivestita di HA presenta tessuto osseo a stretto contatto e, tramite SEM, si è riscontrato che lo strato di osso rimane attaccato sulla superficie HA dopo la frattura dell’interfaccia osso/osso. In conclusione, nel presente studio è stata valutata l’osseointegrazione di 4 superfici implantari sul coniglio. I risultati ottenuti indicano che, se confrontata con le altre, la superficie trattata con Laser e con rivestimento di HA presenta una quantità maggiore di tessuto osseo e quindi una migliore osseointegrazione in conseguenza delle modificazioni morfologiche e fisicochimiche della superficie. Ulteriori esperimenti verranno condotti per dimostrare se la maggiore neoapposizione di tessuto osseo osservata nel presente studio verrà confermata a tempi di guarigione più brevi.

RINGRAZIAMENTI Aditek (Cravinhos-SP, Brasile): per le modi30

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ficazioni di superficie con irradiazione Laser. Titanium Fix (Sao Paulo-SP, Brasile): per la fornitura di impianti commerciali. Capes: per le borse di studio e i fondi di ricerca.

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Analysis of implant surface treatments

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Progetto1

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VITTORIA PERROTTI*, BRIAN M. NICHOLLS** *Università degli Studi di Chieti-Pescara, Scuola di Odontoiatria **BSc, PhD student, The Royal Veterinary College, London, UK

Riassorbimento di un sostituto osseo di derivazione porcina Keywords Sostituti ossei; microscopio confocale laser; osso porcino; osteoclasti; riassorbimento. ABSTRACT

INTRODUZIONE Scopo del lavoro I tempi e le modalità di riassorbimento di un materiale da innesto potrebbero essere delle caratteristiche importanti per aiutare il chirurgo a selezionare il materiale che meglio possa soddisfare le necessità di una determinata situazione clinica. Lo scopo del presente studio è di valutare in vitro formazione, adesione e morfologia di osteoclasti umani (OCLs) generati su un sostituto osseo di derivazione porcina (OsteoBiol Apatos Sp-Block, Tecnoss, Coazze-TO). Materiali e metodi Sono state utilizzate delle cellule mononucleate del sangue periferico prelevate da volontari sani per generare in vitro OCLs in presenza del fattore stimolante colonie di macrofagi (M-CSF) e del recettore dell’attivatore dell’NF-kB (RANKL) su campioni di osso bovino (controllo positivo) e di osso di porcino. Sono state quindi condotte delle analisi morfologiche e biochimiche per valutare la formazione e l’attività degli OCLs. Risultati Le cellule generate dopo 21 giorni di coltura su sostituto osseo di derivazione porcina hanno rivelato delle caratteristiche morfologiche simili a quelle del controllo positivo ed esprimevano marker tipici degli OCL. Questi risultati indicano che il biomateriale di derivazione porcina supporta la formazione di OCL umani. Per quanto riguarda il riassorbimento, sui campioni di osso di porcino è stata riscontrata la presenza di piccole lacune discontinue. Conclusione Questo studio dimostra che il sostituto osseo di derivazione porcina presenta un processo di riassorbimento cellulo-mediato.

I tempi e le modalità di riassorbimento di un materiale da innesto potrebbero essere delle caratteristiche importanti per aiutare il chirurgo a selezionare il materiale che meglio possa soddisfare le necessità di una determinata situazione clinica. Tuttavia, mentre le caratteristiche degli innesti ossei rilevanti per la neoformazione ossea sono state approfonditamente studiate, il bioriassorbimento è un argomento molto meno conosciuto (1-5). La cascata di riassorbimento osseo consiste di una serie di step, che portano alla rimozione della fase minerale e organica dalla matrice ossea per mezzo degli osteoclasti (OCLs), che lavorano in associazione agli osteoblasti (OBLs). Il compito degli OCL come cellule principali deputate al riassorbimeto, e loro struttura e proprietà biochimiche sono state ben caratterizzate (6). Il primo stadio della cascata di riassorbimento consiste nel reclutamento dei precursori degli OCLs che giungono nelle vicinanze del tessuto osseo. I precursori degli OCL originano dalle cellule emopoietiche (7) della linea monolito-macrofagica (8). I progenitori sono reclutatI dai tessuti ematopoietici,

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V. Perrotti and V.M. Nichols

come gli spazi midollari o il tessuto splenico, e vengono condotti al tessuto osseo tramite la circolazione sanguigna. Una volta giunti, proliferano e si differenziano in OCLs con un meccanismo basato sull’interazione cellula-cellula con gli OBLs (9). La fase successiva consiste nella rimozione dello strato di matrice osteoide non mineralizzata, e nella produzione di una serie di enzimi proteolitici, tra cui metalloproteinasi, collagenasi e gelatinasi (10). Questo processo promuove l’adesione di OCL all’osso sottostante mineralizzato, che avviene attraverso la superfamiglia dei recettori di adesione integrinici; in particolare, un importante compito nel riassorbimento osseo viene svolto dalla subunità α β del recettore della vitronectina (11,12). I processi successivi consistono nella formazione dell’orletto striato e della zona chiara, e infine, nell’attivazione degli OCL sulla superficie dell’osso mineralizzato. La cascata di riassorbimento fisiologico osseo viene riprodotta abbastanza fedelmente dai materiali da innesto che presentano un processo di riassorbimento cellulomediato (13). Numerosi innesti ossei vengono attualmente utilizzati per la ricostruzione dei difetti ossei (1,14-17). Infatti, questi ultimi possono facilitare la guarigione delle strutture danneggiate e aiutare a ristabilire le loro funzioni. Possono essere utilizzati sia in terapie cellulari, dove fungono da carrier per il trasporto di cellule trapiantate o da matrice che inducono la morfogenesi di tessuti bioingegnerizzati e costruiti ex vivo, sia in terapie acellulari, dove i materiali inducono la crescita e la differenziazione di cellule provenienti dai tessuti disfunzionali residui. Questi materiali dovrebbero fornire un meccanismo di supporto tridimensionale (3D) per interagire biomolecolarmente con le cellule e controllare le loro funzioni, guidando spazialmente e temporalmente il v

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complesso processo multicellulare di formazione e rigenerazione del tessuto danneggiato (18). Teoricamente, questi sostituti ossei dovrebbero andare incontro a degradazione lentamente dopo l’impianto nel paziente e venire sostituiti da tessuto osseo neoformato (3, 19). Fra i biomateriali, gli xenoinnesti sono molto popolari (20, 21), specialmente per le procedure di rialzo del seno mascellare. Infatti, questi materiali mostrano buone proprietà di osseoconduttività per le loro caratteristiche fisico-chimiche simili a quelle dell’osso umano (22, 23). La fonte da cui più comunemente derivano gli xenoinnesti è rappresentata dall’osso bovino; in alternativa, si possono utilizzare materiali di origine porcina (24,25). Tuttavia ci sono pochi studi sul bioriassorbimento in vitro degli xenoinnesti (4). Si sa soltanto che questi materiali vanno incontro a un riassorbimento molto lento, perché la loro presenza si riscontra molti anni dopo l’impianto in siti sottoposti a procedure di chirurgia rigenerativa (23, 26). Tuttavia, se da un lato le caratteristiche dei materiali da innesto osseo importanti per l’osteoconduzione e formazione ossea sono state approfonditamente studiate, il loro bioriassorbimento non è molto conosciuto (1-5). Gli xenoinnesti vengono utilizzati in quanto fungono da supporto strutturale temporale, si integrano con l’osso circondante, vanno incontro a bioriassorbimento e sostituzione con osso vitale. Una migliore comprensione della degradazione di un sostituto osseo potrebbe aiutare a chiarire l’interazione cellula-substrato e il processo di biorimodellamento dovuto alla combinazione dell’attività di osteoclasti e osteoblasti (2, 27). Lo scopo del presente studio è stato valutare la formazione, l’adesione, la morfologia e l’attività di riassorbimento di OCL umani generati su un materiale di nuova generazione di origine porcina.

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Resorption of a porcine bone substitute

MATERIALI E METODI

Institute, Cambridge, MA) per i primi 3 giorni in 5,0% CO , 95% aria a 37°C. Le colture sono state mantenute sostituendo ogni 3-4 giorni metà del mezzo di coltura con uno nuovo contenente M-CSF e 30ng/100µl del recettore dell’attivatore dell’NF-kB (sRAN-KL) (Amigen, CA, USA); la metà del mezzo che veniva rimossa è stata raccolta per l’analisi ELISA. Al ventunesimo giorno di coltura, le cellule sono state fissate e preparate per le analisi al microscopio confocale laser, a luce trasmessa e riflessa. Tutti gli esperimenti sono stati realizzati in quintuplicato e ripetuti per 4 volte utilizzando cellule prelevate da volontari differenti. L’osso bovino è stato utilizzato come controllo positivo, ed entrambi i substrati, coltivati nelle stesse condizioni senza le cellule, sono stati utilizzati come controllo negativo per monitorare una eventuale degradazione idrolitica non cellulo-mediata. 2

Preparazione di osso bovino e porcino Campioni di osso bovino e porcino (12x12x21 mm) (OsteoBiol Apatos SpBlock, Tecnoss, Coazze-TO) sono tagliati in fette dello spessore di circa 200 µm utilizzando un disco diamantato refrigerato con acqua (Buehler Isomet, Lake Bluff, IL, USA). I pezzi sono tagliati in piccoli quadrati, lavati con acqua distillata (d-H2O), sottoposti a ultrasuoni e in seguito preparati con d-H O e acetone prima della sterilizzazione in etanolo 70%. I substrati sono stati asciugati, contrassegnati, e successivamente risterilizzati con etanolo. 2

Generazione di OCLs umani di cellule mononucleare del sangue periferico (PBMCs) Alcuni volontari adulti in buona salute hanno donato il proprio sangue periferico che è stato depositato in siringhe contenenti 1000 U/ml di eparina. Il sangue è stato diluito 1:1 in soluzione salina tamponata (PBS) (Oxoid Ltd., Basingstoke, UK) contenente 2mM glutammina (G), 100 IU/ml penicillina e 100mg/ml streptomicina (P/S) (Invitrogen, Gibco, Paisley, UK), stratificato delicatamente sul Ficoll (Sigma-Aldrich, Poole, UK) e centrifugato. Le frazioni linfocitarie di cellule mononucleaTe sono state raccolte in tubi contenenti PBS, centrifugati di nuovo e risospesi nel mezzo di coltura (MEME) (Sigma-Aldrich, Poole, UK). In seguito, le cellule sono state seminate a una concentrazione di 3x105 su campioni di osso bovino e porcino inseriti in piastre a 96 pozzetti, incubate per 4h in atmosfera di 5,0% CO , 95% aria a 37°C. Le cellule non attaccate sono state rimosse lavando i substrati in PBS e trasferendoli in una nuova piastra di coltura dove al MEME è stato aggiunto 25ng/ml di fattore stimolante colonie di macrofagi (M-CSF) (Genetic 2

Immunofluorescenza per l’esame microscopico confocale a scansione laser Le cellule coltivte sui substrati di osso bovino e porcino sono state fissate in un mix di 40:60 di MEME con un un tampone di fissazione (3,5% paraformaldeide e 2% saccarosio in PBS), lavate in PBS e successivamente poste in una soluzione di permeabilizzazione (20mM HEPES, 300mM saccarosio, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,5% Triton X-100 e 0,5% sodio azide in PBS), prima di essere lavate di nuovo con PBS. I substrati sono stati incubati con anticorpi monoclonali per la subunità α β del recettore della vitronectina (VNR) (fornito dal professor Michael Horton, UCL, UK). Sono stati poi utilizzati degli anticorpi secondari coniugati a fluorescina isotiocianato (FITC) (Dako, Glostrup, Danimarca). Infine, i substrati sono stati incubati con rodamina-falloidina (Molecular Probes Inc., Eugene, OR) per

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V. Perrotti and V.M. Nichols

colorare l’actina e dopo esaminati con il microscopio confocale a scansione laser Leica TCS NT (Heidelberg, Germany). Sono state acquisite immagini in fluorescenza. Gli OCLs sono stati definiti come cellule multinucleate che esprimono VNR ( α β ) e mostrano anelli o bande di F-actin. Le immagini vengono presentate sul piano XY. v

Colorazione per microscopia a luce riflessa e trasmessa La formazione di OCL è stata valutata dalla presenza di cellule positive alla fosfatasi acida (TRAP). Al giorno 21 i substrati sono stati lavati con d-H O, fissati in formalina tamponata al 10%, lavata di nuovo in dH O prima di essere colorati per la TRAP, seguendo il protocollo del produttore (Sigma-Aldrich, Poole, UK; KIT 387-A). Le cellule positive alla TRAP, contenenti 3 o più nuclei, sono state esaminate e l’immagine acquisita con il microscopio ottico. In seguito i preparati sono stati colorati anche con il blu di toluidina allo 0,1% per analizzare le lacune di riassorbimento utilizzando un microscopio a luce riflessa. 2

Fig. 1 Immagine sul paino xy di un osteoclasta al microscopio confocale a scansione laser. Il verde mostra una colorazione positiva per l’anticorpo monoclonale 23C6 per il complesso ·v‚3 del recettore della vitronectina. Il rosso mostra delle bande e degli anelli di F-actin enriched riscontrati negli osteoclasti attivi. Ingrandimento 630x. Bar = 10µm.

RISULTATI Le cellule generate avevano dimensioni adeguate e mostravano microvilli e filopodi (Fig. 1). Non vi erano differenze particolari fra il test e il controllo riguardo la morfologia e la dimensione di tali cellule, mentre il riassorbimento è risultato lievemente diverso. Sui campioni di osso di porcino è stata prodotta una quantità inferiore di cellule TRAP-positive (Fig. 2); per questa ragione anche l’attività di riassorbimento è apparsa diminuita sui campioni di osso porcino rispetto al gruppo di controllo. Le cellule generate sul controllo hanno prodotto le tipiche tracce di riassorbimento simil-zig-zag (Fig. 3a), mentre

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Fig. 2 Immagine al micorscopio ottico a luce trasmessa di osteoclasti generate da cellule del sangue perifierico sul sotituto osseo porcino al giorno 21 di coltura. Il rosso indica le cellule TRAP+ cell. Ingrandimento x200. Bar = 100µm.

le cellule generate su osso porcino hanno

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Resorption of a porcine bone substitute

Fig. 3 Immagine al micorscopio ottico a luce riflessa di osteoclasti generate da cellule del sangue perifierico sul controllo (A) e sul sostituto di derivazione porcina (B) al giorno 21 di coltura. Le lacune di riassorbimento (frecce bianche) sono presenti su entrambi i substrati, sebbene sull’osso porcino sia evidente un riassorbimento discontinuo, mentre sul controllo si riscontrano delle lacune continuee tipo-tracce. Blue di toluidina. Ingrandimento x200.

formato delle lacune piccole e discontinue (Fig. 3b).

DISCUSSIONE Lo studio della degradazione degli xenoinnesti è un modo per aiutare il clinico a identificare il materiale desiderato che abbia le caratteristiche appropriate per soddisfare necessità cliniche. Tuttavia, le proprietà degli xenoinnesti possono cambiare in base alla loro preparazione. Ciò comporta una difficile interpretazione dei dati ottenuti in differenti studi e spesso in letteratura vengono descritti risultati contraddittori. Per evitare questa confusione è bene analizzare gli xenoinnesti individualmente. Il presente studio mostra chiaramente che l’osso porcino viene riassorbito dagli OCLs. Tuttavia, il riassorbimento non è così esteso come nel controllo positivo. Questo dato già è stato descritto in studi in vitro sul riassorbimento di sostituto osseo da parte degli OCL (4, 13). Taylor et al. (4) hanno esaminato il riassorbimento di OCLs coltivati

su osso corticale bovino e su biomateriali commercialmente disponibili. Gli autori hanno concluso che materiali di derivazione ossea supportavano una maggiore adesione, diffusione e attività di riassorbimento degli OCL rispetto alle idrossiapatiti, (HA) sintetica e HA non sintetica. Inoltre, i campioni deproteinizzati e demineralizzati mostravano una quantità inferiore di cellule e una morfologia meno tipica rispetto al gruppo di controllo. Perrotti et al. (13) hanno investigato il potenziale di riassorbimento in vitro di OCL umani coltivati su uno xenoinnesto di origine bovina (XBM). Utilizzando analisi morfologiche ed esami biochimici, hanno osservato che la formazione di OCL su quel materiale e la positività delle cellule su di esso generate alla maggioranza dei marcatori degli OCLs. Riguardo l’attività degli OCL, sono state riscontrate lacune di riassorbimento sull’XBM sia con microscopio a luce riflessa che con il confocale a scansione laser. Tuttavia, le analisi biochimiche hanno rivelato che la degradazione del collagene era significantemente ridotta nei surnatanti del-

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V. Perrotti and V.M. Nichols

l’XBM rispetto al gruppo controllo, suggerendo che XBM andava incontro a un riassorbimento inferiore o forse solo più lento nel tempo. Nelle nostre condizioni, gli osteoclasti producevano delle lacune di riassorbimento simil-zig-zag, simili a quelle formate originariamente sull’osso, mentre sul substrato porcino le lacune di riassorbimento erano discontinue, facilmente distinguibili dalla superficie non riassorbita, ma comunquedifferenti da quelle naturali. Questo tipo riassorbimento è stato osservato anche in altri materiali di ceramica o di origine animale, come ‚-TCP (2), HA sintetica (4) e XBM (13). Sono stati proposti molti fattori in grado di regolare l’attività osteoclastica direttamente o anche attraverso gli osteoblasti. Particolarmente importante è l’ambiente che si crea all’interfaccia OCL-substrato, poiché la membrana cellulare degli OCL deve essere sigillata al substrato tramite un recettore cellulare di superficie e proteine della famiglia delle integrine (28). Questo meccanismo non è stato danneggiato nel substrato di origine porcina esaminato nel presente studio poiché è stata trovata una espressione positiva del ricettore della vitronectina, un membro della famiglia della integrine con il compito principale di mediare l’adesione degli OCL alla matrice ossea. Perciò, la discontinuità dell’attività di riassorbimento su quel substrato dovrebbe essere dovuta alla sua complessa struttura tridimensionale caratterizzata picchi e depressioni, che rappresentano un ostacolo a un riassorbimento ininterrotto. In conclusione, questo studio rappresenta la prima prova della generazione di OCLs umani su questo sostituto osseo di origine porcina. I presenti risultati mostrano come questo materiale supporti la differenziazione di OCLs umani che, a loro volta, sono in grado di riassorbirlo anche se in misura minore rispetto al controllo. Inoltre, questi risultati possono essere utili per clinici 38

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che possono così modulare l’uso di questo materiale.

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Resorption of a porcine bone substitute

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MARCO DEGIDI1, ADRIANO PIATTELLI2, VITTORIA PERROTTI2, GIOVANNA IEZZI2 Libero professionista, Bologna Clinica Odontoiatrica, Università di Chieti-Pescara

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Analisi istologica ed istomorfometrica di osso bovino inorganico (ABB) prelevato 7 anni dopo rialzo di seno mascellare

Keywords elevazione di seno mascellare, istologia, osso bovino inorganico, studi a lungo termine. ABSTRACT Scopo L’osso bovino inorganico ha proprietà osteoconduttive e non induce reazioni infiammatorie o reazioni avverse. Nonostante questi risultati soddisfacenti, mancano dei dati istologici a lungo temine sull’uomo. Scopo di questo studio è stato valutare un prelievo ottenuto dopo 7 anni da un paziente su cui era stata eseguita una elevazione di seno mascellare con ABB. Materiali e metodi L’esame istologico è stato eseguito su sezioni sottili non decalcificate e sono stati valutati i valori istomorfometrici dell’osso neoformato, degli spazi midollari e delle particelle residue di biomateriale. Lo studio è stato eseguito in microscopia ottica. Risultati Era presente osso trabecolare con molte aree di rimodellamento. Le particelle di materiale innestato erano quasi completamente circondate da osso, ed in alcuni casi erano in contatto con osteomi secondari. Alcune particelle di biomateriale erano unite da trabecole di osso neoformato. In altre zone del preparato, le particelle sembravano essere state completamente riassorbite e sostituite da osso neoformato. Non erano presenti gap all’interfaccia osso-biomateriale. Non era presente infiltrato infiammatorio. L’analisi istomorfometrica mostrava una percentuale di osso del 46% ± 3,8%, le particelle residue di biomateriale rappresentavano il 9% ± 1,2%, mentre gli spazi midollari erano il 45% ± 3,2%. Conclusioni Dopo 7 anni il quadro istologico sembrava composto da particelle residue del materiale innestato in stretto contatto con l’osso neoformato. La matrice mineralizzata dell’osso intorno alle particelle di biomateriale presentava delle fibre collagene orientate in modo casuale e una maggiore quantità di osteociti. Questi risultati hanno dimostrato sia una elevata osteoconduttività sia una caratteristica “biomimetica” del biomateriale nel tempo.

INTRODUZIONE Esistono delle differenti opinioni per quanto riguarda il riassorbimento dell’osso bovino inorganico (ABB): in alcuni studi non si sono osservati osteoclasti sulla superficie del biomateriale (1-6), mentre, al contrario, altri studi hanno messo in evidenza fenomeni di riassorbimento (715). Si ritiene che un biomateriale debba essere riassorbito nel tempo e sostituito da osso neoformato (5). Inoltre, un sostituto osseo dovrebbe essere osteoconduttivo e biocompatible. Il destino ultimo, a lungo termine, dell’ABB non è completamente conosciuto (5). In studi precedenti eseguiti presso il nostro laboratorio valori differenti sono stati trovati per quanto riguarda il biomateriale residuo in prelievi ottenuti dopo elevazione del seno mascellare: 31-39% a 6 mesi, 29% a 20 mesi, 12% a 5 anni, 16% a 9 anni (16-19). Il lento assorbimento dell’ABB potrebbe essere un vantaggio perché potrebbe aiutare nel mantenere le dimensioni del sito aumentato (20), in contrasto con quello che è stato osservato nell’osso autologo quando, in alcuni casi, si aveva un riassorbimento di oltre il 50% del materiale innestato (20). Inoltre, una pre-

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M. Degidi et al.

dicibile osseointegrazione degli impianti è stata ottenuta anche in siti rigenerati in cui l’ABB non era stato completamente riassorbito (18, 21-23). Reperti istologici umani sul comportamento dell’ABB nel lungo termine sono presenti in letteratura, ma sono abbastanza rari. I risultati nel lungo periodo nell’uomo sono importanti per capire se la continua presenza delle particelle del biomateriale possono produrre una interferenza con la prognosi di impianti dentali inseriti in questo “materiale composito” costituito da osso e biomateriale residuo (4). Scopo del presente studio è stata una valutazione istologica e istomorfometrica di un prelievo ottenuto 7 anni dopo una elevazione di seno mascellare con ABB.

MATERIALI E METODI Un paziente di 52 anni era stato sottoposto ad elevazione di seno mascellare per un edentulismo monolaterale del mascellare superiore. L'altezza dell'osso subantrale prima dell'intervento era di 3 mm. Il paziente non fumava e aveva un’anamnesi patologica negativa. Per l'intervento chirurgico è stato utilizzato 100% di ABB. Dopo un periodo di guarigione di 6 mesi erano stati inseriti 3 impianti (XiVE, DNTSPLY-Friadent, Mannheim, Germania). Il restauro protesico era stato caricato e gli impianti si erano osteointegrati con successo. Dopo poco più di 7 anni, uno degli impianti doveva essere sostituito per l'insorgenza di una perimplantite. Durante la rimozione di questo impianto e l'inserimento di uno nuovo si era proceduto a prelevare del materiale dal sito rigenerato. Preparazione dei campioni Il prelievo veniva lavato con soluzione salina, fissato in formalina tamponata al 10%, successivamente disidratato in una scala di

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alcol a concentrazione crescente, quindi incluso in una resina a base di glicolmetacrilato (Technovit 7200, VLC, Kulzer, Werheim, Germania). Dopo la polimerizzazione, il prelievo veniva sezionato, tramite un sistema di taglio con disco diamantato, in modo da ottenere dei preparati di 150 µ di spessore. Le sezioni ottenute venivano portate ad uno spessore di 30 µ mediante un sistema di microabrasione (“Precise 1 Automated System”, Assing Roma), e infine colorate con blu di toluidina e fucsina acida. Istomorfometria L'analisi istomorfometrica delle percentuali dell'osso neoformato, delle particelle di biomateriale residuo e degli spazi midollari è stata eseguita utilizzando un microscopio ottico a luce trasmessa (Leitz Laborlux, Wetzlar, Germania) collegato a una videocamera a colori ad alta risoluzione (3CCD, JVC KYF55B, JVC, Yokohama, Giappone), a un monitor e a un PC (Intel Pentium III 1200 MMX, Intel, Santa Clara, CA, USA). Il sistema ottico era associato con una scheda video digitalizzata (Matrix Vision GmbH, Oppenweiler, Germania) e un software applicativo (Image-Pro Plus 4.5, Media Cybernetics Inc., Immagini e Computer Snc Milano).

RISULTATI A basso ingrandimento, era possibile osservare osso trabecolare con ampi spazi midollari (Fig. 1). Le particelle di ABB erano quasi completamente circondate da osso, e in alcuni casi erano in contatto con osteoni secondari (Fig. 2). L'osso neoformato era cresciuto in contatto diretto con le particelle di ABB che sembravano essere, nella maggior parte dei casi, totalmente incorporate nell'osso senza gap oppure tessuto

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Histologic examination of ABB 7 years after sinus augmentation

Fig. 2 Particella di ABB in stretto contatto con un osteone Fig. 3 Osso neoformato (frecce) Ă¨ cresciuto in diretto secondario. Blu di toluidina-Fucsina acida 200X. contatto con le particelle di ABB senza gaps all'interfaccia osso-biomateriale. Blu di toluidina-Fucsina acida 100X.

Fig. 1 A basso ingrandimento, era presente osso trabecolare con molti spazi midollari. Poche particelle di materiale residuo (asterisco) erano presenti. Blu di toluidina-Fucsina acida 12X

Fig. 4 Ponti ossei univano alcune particelle di ABB. Blu di Fig. 5 Una particella di ABB sembrava essere toluidina-Fucsina acida 100X. parzialmente riassorbita e sostituita da osso neoformato. Blu di toluidina-Fucsina acida 100X.

connettivo, fibroso all'intefaccia osso-biomateriale (Fig. 3). Alcune particelle di biomateriale erano unite da trabecole ossee neoformate (Fig. 4). In altre aree, le particelle sembravano essere parzialmente rias-

sorbite e sostituite da tessuto osseo (Fig. 5). Intorno ad alcune particelle era possibile osservare la presenza di una fila di osteoblasti che stavano attivamente deponendo matrice osteoide (Fig. 6a-b). Non erano visi-

Fig. 6a Particelle di ABB erano circondate e connesse da ponti ossei costituiti da osso maturo e da osso neoformato. Zone di rimodellamento osseo erano presenti. Blu di toluidinaFucsina acida 100 X. Fig. 6b Trabecole di osso neoformato con una fila di osteoblasti attivamente secernenti matrice osteoide tra due particelle di ABB. Blu di toluidina-Fucsina acida 200X.

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M. Degidi et al.

bili osteoclasti. Non era presente tessuto infiammatorio né reazione da corpo estraneo. L'analisi istomorfometrica mostrava che l'osso costituiva il 46% ± 3,8%, le particelle di ABB il 9% ± 1,2%, mentre gli spazi midollari rappresentavano il 45% ± 3,2.

DISCUSSIONE L'ABB è quasi simile all'osso umano da un punto di vista chimico e fisico. L'ABB ha una forza di compressione di 35 Mpa e la sua natura porosa (755 del volume totale) serve ad aumentare notevolmente le sue capacità di biointegrazione. La valutazione istologica del tessuto neoformato dopo le procedure di rialzo del seno mascellare saranno molto utili per comprendere la natura e la quantità di osso neoformato e di biomateriale residuo. Il riassorbimento dell'ABB è ancora fonte di controversie (1) e secondo alcuni autori non ci sono conclusioni definitive, desunte dalla letteratura, sul riassorbimento a lungo termine dell'ABB (5). Lacune di riassorbimento ed osteoclasti erano assenti in prelievi ottenuti 6 e 12 mesi dopo procedure di rialzo del seno mascellare (1). Anche Yildirim e coll. (2) non hanno trovato segni di attività osteoclastica. Ewers e coll. (26) hanno trovato che particelle di ABB erano presenti anche dopo più di 4 anni dal procedimento di innesto, senza segni evidenti di riassorbimento. Risultati differenti sono stati riferiti da altri autori (7-11) che hanno rilevato la presenza di osteoclasti attivi sulla superficie delle particelle di ABB e una diminuzione della densità di ABB con il passare del tempo. In alcuni casi può essere molto vantaggioso usare un materiale, come l'ABB, che mostra una scarsa degradazione. Gli osteoclasti sono regolati da eventi che si svolgono nel microambiente dell'interfaccia osteoclastisubstrato. Gli osteoclasti producono in que-

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sto compartimento sigillato un rilascio di ioni minerali dalla superficie del substrato con un aumento degli ioni Ca2+ in questa zona. L'alta concentrazione di questi ioni determina un aumento del livello del calcio intracellulare con una inibizione del riassorbimento di osso da parte degli osteoclasti con il distacco degli osteoclasti dalla superficie ossea (28). L'incompleto riassorbimento delle particelle di ABB, trovato nel presente caso 7 anni dopo l'inserimento dell'innesto, potrebbe essere spiegato dall'alta concentrazione di calcio presente sulla superficie del biomateriale e che potrebbe inibire il riassorbimento da parte degli osteoclasti. Dopo 7 anni, la maggior parte delle particelle dell'innesto erano state incorporate nell'osso neoformato; si era quindi creata una struttura che potrebbe rinforzare il tessuto osseo, e l'abilità del tessuto osseo di sopportare i carichi potrebbe essere aumentata. Un altro meccanismo che potrebbe spiegare la presenza dopo molto tempo delle particelle del biomateriale potrebbe essere una unione molto forte tra osso e biomateriale che aiuterebbe a mantenere l'integrità biomeccanica di questa struttura composita durante i procesi di rimodellamento/riparazione. In conclusione, i risultati istologici del presente studio confermano l'elevata biocompatibilità ed osteoconduttività dell'ABB: la maggior parte delle particelle innestate si presentavano incluse in osso neoformato il quale, in molti casi, tendeva a unire le particelle di biomateriale. Una risposta tissutale positiva era presente dopo molto tempo intorno alle particelle di ABB senza la presenza di un infiltrato infiammatorio, ed una stabilità a lungo termine dei tesuti sembrava essere stata ottenuta attraverso l'incorporazione delle particelle innestate all'interno dell'osso neoformato. La presenza delle particelle residue di ABB non sembra-

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Histologic examination of ABB 7 years after sinus augmentation

va aver interferito con i processi di guarigione del tessuto osseo.

RINGRAZIAMENTI Questo lavoro è stato supportato in parte dal CNR e dal MIUR, Roma.

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ANTONIO SCARANO*, MAURIZIO PIATTELLI**, FRANCESCO CARINCI*** *Ricercatore di Chirurgia Orale, Clinica Odontoiatrica, Università di Chieti-Pescara **Professore di Chirurgia Orale, Clinica Odontoiatrica, Università di Chieti-Pescara ***Dipartimento di Chirurgia Maxillofacciale, Università di Ferrara

Rimozione, dopo 7 anni, di un impianto spostato nel seno mascellare. Descrizione clinica e istologica di un caso clinico Keywords Complicazione, migrazione implantare, lungo termine, rialzo del seno. ABSTRACT

INTRODUZIONE La migrazione accidentale di un impianto dentario nel seno mascellare rappresenta una complicazione infrequente ma possibile nella pratica clinica odontoiatrica. La causa principale dello spostamento implantare è rappresentata dall’altezza inadeguata dell’osso del mascellare posteriore. Tale evenienza di solito si verifica durante l’intervento chirurgico, più raramente nel periodo postoperatorio e soprattutto mancano follow-up a lungo termine. Nel presente lavoro viene descritto il caso di un impianto migrato all’interno del seno mascellare al momento della connessione con l’abutment e rimosso 7 anni dopo. La guarigione postoperatoria non ha evidenziato nulla di rilevante. Questo caso clinico rappresenta la prima comunicazione relativa alla migrazione di un impianto orale nel seno mascellare rimosso dopo 7 anni.

La riabilitazione del mascellare posteriore parzialmente o totalmente edentulo con protesi supportate da impianti è diventata negli ultimi decenni una pratica terapeutica diffusa, con risultati affidabili a lungo termine (1-5). Vi sono però particolari situazioni cliniche a livello delle creste edentule che possono essere sfavorevoli al posizionamento implantare. In particolare, la mascella posteriore può essere un area difficile da trattare sia a causa di un’insufficiente altezza e ampiezza ossea della cresta alveolare edentula sia a causa della pneumatizzazone del seno mascellare (6). In effetti, in seguito alla perdita degli elementi dentari la forma e la densità ossee si modificano con il venire meno dello stimolo necessario al mantenimento del trofismo di tali tessuti; di conseguenza la cresta alveolare va incontro a un processo di riassorbimento. Gli osteoclasti del periostio adiacente alla membrana sinusale iniziano un processo di riassorbimento osseo di tipo centrifugo che determina la pneumatizzazione del seno mascellare. Perciò questa condizione anatomica, insieme alla bassa densità dell’osso

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mascellare e l’atrofia apicocoronale, rende difficile ottenere una stabilità primaria (7) e può essere responsabile della più alta percentuale di insuccesso che si registra per gli impianti dentali inseriti nel mascellare superiore rispetto alla mandibola (8). Ciò spiegherebbe anche l’elevato rischio di spostamento/migrazione nella mascella, che è stato descritto molto raramente (8-15). Lo spostamento di un impianto nel seno mascellare può verificarsi al momento dell’intervento chirurgico (16, 17) oppure dopo un periodo di funzione; quest’ultima eventualità è però più rara (8). Può essere seguito da complicazioni infettive a causa del contatto dell’impianto con la mucosa dell’interno del seno (18, 20); perciò è indicata la rimozione dell’impianto spostato, immediatamente o a breve termine. Tale procedura può essere effettuata sia attraverso il sito implantare sia creando una finestra sulla parete frontale/laterale del seno mascellare (9, 12, 21), oppure per mezzo di un approccio endoscopico attraverso le vie nasali (13, 15). Sono molto poche le situazioni di effettivo spostamento di impianti in funzione descritte in letteratura e soprattutto casi con follow-up a lungo termine sono davvero rari. Lo scopo del presente articolo è quello di descrivere un caso raro di migrazione di un impianto all’interno del seno mascellare e la sua rimozione 7 anni dopo.

to della connessione del moncone, l’impianto localizzato a fianco del primo molare mascellare di sinistra è stato accidentalmente spinto nel seno. L’impianto non è stato rimosso immediatamente. Un mese dopo il paziente è stato inviato al reparto di Chirurgia Orale della Clinica Odontoiatrica dell’Università di Chieti-Pescara a causa di un lieve dolore localizzato al mascellare posteriore sinistro. L’esame intraorale ha evidenziato la riabilitazione protesica fissa completa supportata da impianti. Il paziente presentava sinusite con una lieve dolenzia alla palpazione. L’ortopantomografia (OPT) ha rivelato che l’impianto e l’abutment si trovavano nel seno mascellare di sinistra (fig. 1). È stata proposta al paziente la rimozione chirurgica dell’impianto dal seno mascellare, ma ha rifiutato l’intervento. Dopo 7 anni i sintomi si sono acuiti e il paziente ha deciso di sottoporsi all’intervento chirurgico. La tomografia assiale computerizzata (TAC) ha rivelato un’opacizzazione del seno mascellare sinistro con aumento dello spessore mucoso e l’impianto dentario migrato nel seno. Procedura chirurgica È stata somministrata una copertura antibiotica con Amoxicillina (1 g due volte al giorno per 5 giorni, a partire da un’ora prima dell’intervento). L’anestesia locale è sta-

DESCRIZIONE DEL CASO Nel settembre del 2001 un paziente di 42 anni con mascellare parzialmente edentulo si è sottoposto ad un intervento per l’inserimento di 5 impianti (4 x 13 mm) (Implant Innovations, West Palm Beach, Florida, USA); 2 impianti sono stati posizionati nel mascellare posteriore di sinistra e 3 in quello di destra. Quattro mesi dopo, al momen-

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Fig. 1 Radiografia panoramica che mostra l’impianto migrato nel seno mascellare.

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Fig. 2 Radiografia successiva alla riabilitazione protesica. L’impianto e l’abutment si trovano nel seno. Fig. 3 LL’impianto recuperato è circondato da tessuto infiammatorio.

ta indotta per infiltrazione con xilocaina/epinefrina, e dopo una incisione crestale è stato sollevato il lembo mucoperiosteo a tutto spessore, esponendo così la parete anteriore laterale della mascella dal canino alla regione molare. Il seno è stato esplorato mediante diafanoscopia per rivelarne i margini inferiore e anteroposteriore e la posizione dell’impianto. Utilizzando una strumentazione ad alta velocità sotto raffreddamento con irrigazione di soluzione fisiologica (4-5°), è stato creato un foro rettangolare nella parete mascellare anterolaterale per assicurare che il margine inferiore fosse 5 mm al di sopra del pavimento del seno. L’impianto è stato rimosso con un aspiratore chirurgico (fig. 3). È stata utilizzata una lamina ossea (Osteobiol, Tecnoss, Giaveno, Torino) per chiudere la finestra laterale del seno, il lembo mucoperiosteo è stato quindi riposizionato e suturato con punti multipli orizzontali a materasso. Sono stati prescritti analgesici per una settimana, da assumere al bisogno. Le suture sono state rimosse 2 settimane dopo l’intervento, il paziente ha seguito una dieta morbida per 4 settimane e ha ricevuto istruzioni di igiene orale. I controlli postchirurgici sono stati stabiliti a intervalli mensili per controllare il processo di guarigione. L’impianto rimosso è stato

sottoposto a esame istologico (fig. 3). Preparazione del campione L’impianto recuperato è stato immediatamente immerso in una soluzione tamponata di formalina per la conservazione e processato per l’esame istologico e istomorfometrico al Laboratorio di Istologia Implantare dell’Università di Chieti-Pescara al fine di ottenere sezioni dallo spessore molto sottile per mezzo del Precise 1 Automated System (Assing, Roma). Il campione è stato disidratato attraverso una serie di sciacqui con soluzione alcolica incrementando ogni volta la percentuale di alcol, sono stai poi inglobati in blocchi di resina glicometacrilato (Tecnovit, 7200 VI C, Kulzer, Wehrheim, Germania). Dopo la polimerizzazione il campione è stato sezionato longitudinalmente rispetto l’asse maggiore utilizzando un disco diamantato ad alta precisione a circa 150 µm e ridotto fino a circa 30 µm di spessore. Sono stati ottenuti tre vetrini che sono state successivamente colorati con fucsina acida e blu di toluidina e, quindi, osservati al microscopio (Leitz Laborlux, Leitz, Wetzlar, Germania) a luce trasmessa. Valutazione istologica A basso ingrandimento è stata osservata intorno all’impianto la presenza di tessuto

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Fig. 4 A basso ingrandimento è possibile osservare la presenza of tessuto connettivo fibroso con degenerazione ialina e un piccolo infiltrato di cellule infiammatorie intorno all’impianto. Fucsina acida e blu di toluidina. 6 X Fig. 5 Si osservano modificazioni iperplastiche e degenerative a livello della mucosa sinusale, che comprendono proliferazione ghiandolare mucosierosa e formazione di pseudocisti. Negli spazi endossei è presente un infiltrato di cellule infiammatorie. Fucsina acida e blu di toluidina 100 X.

Fig. 6 La scansione TAC a 7 mesi dalla rimozione dell’impianto dal seno mascellare mostra un normale ispessimento della mucosa e assenza di opacizzazione al seno mascellare sinistro.

connettivo fibroso con degenerazione ialina e di una lieve infiltrazione di cellule infiammatorie (fig. 4). Non sono stati osservati batteri. Sulla mucosa sinusale rimossa era possibile rilevare un’estesa proliferazione delle strutture ghiandolari con la caratteristica formazione di cisti interstiziali. Le strutture cistiche spesso raggiungevano proporzioni anche piuttosto ampie, causando ampi ispessimento, rigonfiamento e ripiegamento della membrana sinusale. Ulteriori modificazioni patologiche comprendevano degenerazione ialina delle fibre del tessuto connettivo della tunica propria e trombosi (fig. 5). Controllo Sette mesi dopo la rimozione dell’impianto dal seno mascellare l’esame TAC ha mostrato uno spessore mucoso normale e nessuna opacizzazione del seno mascellare sinistro (fig. 6).

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DISCUSSIONE E CONCLUSIONE In tempi recenti il posizionamento di impianti dentali nel mascellare posteriore è diventato una procedura standard, sebbene non sia esente da complicazioni. Tra queste vi è la migrazione implantare all’interno del seno mascellare, che può causare complicazioni infettive in seguito allo stretto contatto dell’impianto con la mucosa sinusale (22, 23), infezioni locali intorno all’impianto ed infine riassorbimento anche esteso dell’osso circostante. Per tale ragione gli impianti posizionati nelle vicinanze del seno mascellare possono costituire un passaggio per le infezioni dalla cavità orale al seno. Generalmente i corpi estranei nei seni paranasali dovrebbero essere rimossi, poiché possono determinare infiammazioni/sinusiti in quanto disturbano o bloccano la clearance mucociliare (11, 19,20). L’edema della mucosa che ricopre il seno

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Removal of an implant displaced into the maxillary sinus after 7 years

ha ripercussioni a livello del complesso ostio-meatale riducendo le dimensioni del setto mascellare. Questa serie di eventi è responsabile di problemi a carico del seno come descritto da Regev et al. (27), Ueda e Kaneda (22) e Quiney et al. (23). Solo in pochi casi il paziente può rimanere asintomatico, come nel presente caso e in quelli riferiti da Lida et al. (9) e Raghoebar e Vissink (11), in cui gli impianti migrati nel seno mascellare non hanno determinato alcuna reazione infiammatoria/infettiva. Le teorie per spiegare la migrazione degli impianti nel seno comprendono: cambiamenti della pressione intrasinusali e nasali che danno luogo ad un effetto di suzione, distruzione ossea in seguito a infezione del sito implantare prima o dopo l’inserzione oppure scorretta distribuzione delle forze occlusali (8). Il trattamento varia in funzione dei sintomi della sinusite mascellare ed è finalizzato al ripristino del drenaggio e della ventilazione dell’antro (28). Iida et al. (9) hanno aperto la parete del seno in anestesia locale e Pagella et al. (29) hanno riferito l’estrazione in endoscopia endorale di un corpo estraneo metallico dal seno mascellare. Rogev et al. (27) hanno utilizzato l’operazione Caldwell-Luc in alcuni casi e talvolta hanno recuperato l’impianto attraverso il sito di preparazione endorale. Pertanto, per il trattamento della sinusite odontogena è generalmente richiesto un approccio combinato medico e chirurgico; l’eliminazione della fonte dell’infezione è necessaria per evitare la recidiva della sinusite. Quando si verifica la migrazione di un impianto nel seno, la rimozione di questo è obbligatoria. In conclusione, la migrazione di un impianto nel seno è una eventualità infrequente ma possibile e perciò è importante valutare accuratamente le caratteristiche specifi-

che del paziente e del sito recettore prima di pianificare una riabilitazione protesica supportata da impianti posti nelle vicinanze di cavità naturali (8). Quello riportato nel presente lavoro rappresenta il primo caso descritto di un impianto migrato nel seno mascellare e rimosso dopo 7 anni.

RINGRAZIAMENTI Il presente lavoro è stato parzialmente sostenuto dal Consiglio Nazionale di Ricerca (CNR) di Roma e dal Ministero dell’Istruzione, università e ricerca scientifica, Roma.

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Impianto Leone: connessione conometrica per una ottimale preservazione dei tessuti Il mantenimento dell’osso peri-implantare nel tempo rappresenta un elemento determinante per il successo a lungo termine dei trattamenti implanto-protesici. Come è noto dalla letteratura, la presenza di

micro-movimenti tra fixture e abutment induce il riassorbimento dell’osso crestale peri-implantare. Il gap tra impianto e abutment è causa di infiltrazione batterica, che suscita una reazione infiam-

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matoria dei tessuti peri-implantari e un conseguente riassorbimento osseo. Solo una connessione ermetica può pertanto prevenire una simile risposta da parte dell’organismo; l’assenza di infiltrato infiammatorio che ne deriva determina, inoltre, un elevato grado di salute nei tessuti molli peri-implantari, con significativo miglioramento dell’estetica gengivale dei restauri protesici. La connessione a cono Morse dell’impianto Exacone™ (Leone – Sesto Fiorentino - FI), non consentendo alcun tipo di micro-movimento, assicura la massima

stabilità tissutale. Inoltre il suo gap all’interfaccia, di dimensioni mediamente inferiori ad 1 Ìm, impedisce il passaggio microbico, costituendo una barriera alla penetrazione di fluidi e batteri. A tali fattori si va ad aggiungere il “Platform Switching” design del sistema, che porta alla formazione di un maggior volume di tessuti molli peri-implantari e, quindi, ad un miglior sigillo dei tessuti stessi, facilitandone l’azione difensiva contro la penetrazione batterica. Tali caratteristiche determinano un buon mantenimento osseo peri-implantare nel tempo; da ciò deriva l’ulteriore possibilità, qualora le necessità cliniche lo richiedano, di un posizionamanto endo-crestale dell’impianto. Risultati estetici duraturi e stabilità nel tempo dei tessuti duri e molli rappresentano importanti obiettivi della moderna implantologia: l’impianto Exacone™, grazie alle sue peculiari caratteristiche, può essere considerato il prodotto più idoneo per il raggiungimento di simili traguardi. Per informazioni Dental Trey S.r.l. LEONE S.P.A. Via P. a Quaracchi, 50 50019 Sesto Fiorentino (Firenze) Tel. 055.30.44.58 - Fax 055.30.44.55 info@leone.it www.leone.it

Implantologia microinvasiva con la sincristallizzatrice La sincristallizzatrice System Argon Control e l’implantologia elettrosaldata per restituire sicurezza e sorriso a chi è rimasto privo di alcuni o tutti i denti. Un modo per attenuare la paura del dolore ed anche per eliminare i tempi di attesa per una soluzione definitiva. A queste esigenze l’implantologia di ultima generazione è in grado di dare una risposta soddisfacente, garantendo ai pazienti una metodica affidabile e, soprattutto, tempi rapidi per riottenere la funzione perduta. Diretta erede della tecnica tradizionale, l’implantologia elettrosaldata ne rappresenta la sua più recente evoluzione. Un’evoluzione frutto del pro-gresso tecnologico e della recente rielaborazio-

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ne di un macchinario che, lanciato sul merca-to da un’azienda nazionale, permette una saldatura perfetta dei vari elementi dell’impianto. Ma la particolarità dell’implantologia elettrosaldata, che assicura una maggiore stabilità nel tempo a tutta la protesi, scaturisce dalla versatilità dell’apparecchiatura, la sincristallizzatri-ce appunto, che, concepita per solidarizzare tra loro gli impianti direttamente nella bocca e, quindi, consentire al paziente di masticare subito dopo l’intervento, utilizza le potenzialità dell’Argon. Questo gas si è infatti dimostrato efficace nell’evitare l’ossidazione del punto di saldatura e, quindi, migliorare il risultato finale. La solidarizzazione è la tappa più im-portante perché il filo di titanio, una volta elettrosaldato, assicura la tenuta del complesso implantare, senza il rischio di perdita

dell’ancoraggio osseo. Insomma, il principio a cui ci si ispira è quello della “unione che fa la forza”. La metodica, per ora praticata solo nelle strutture private, viene insegnata come corso di aggiornamento destinato agli specialisti odontoiatri all’Università degli Studi di Chieti nel-con la cattedra di Odontostomatologia II diretta dal professor Stefano Fanali. Particolare non trascurabile: i costi sono molto contenuti. Per informazioni IMPLAMED www.implamed.it info@implamed.it

Osteology Roma: dalla scienza alla pratica clinica Chi vuole conoscere le ultime novità in tema di rigenerazione dei tessuti, cellule staminali o fattori di crescita e la loro reale applicabilità clinica è invitato a recarsi a Osteology Roma, presso l’Auditorium della Musica di Roma dal 7 al 9 maggio prossimi. L’obiettivo del convegno è infatti quello di fornire al dentista la visione più completa del mondo dell’odontoiatria rigenerativa insieme a una panoramica sulle relative normative e come impostare il dialogo con il paziente per fargli meglio comprendere l’importanza degli interventi chirurgici. Oltre 70 tra i più noti relatori internazionali, sotto la presidenza di Luca Cordaro e Massimo Simion, affronteranno i vari aspetti della gestione dei tessuti molli e duri. Il simposio sarà preceduto giovedì dal forum “Qualità e Ricerca: una garanzia per il paziente” organizzato con le aziende implantari. Il venerdì mattina il pro-

fessor Antonino Zichichi inaugurerà l’evento, aprendo nuove frontiere della scienza. Seguirà una sessione dedicata alle prospettive future della ricerca clinica e di base nel campo della rigenerazione tissutale. A conclusione della mattinata i giornalisti Franco di Mare e Margherita De Bac affonteranno le tecniche più idonee per una corretta ed efficace comunicazione. Nel pomeriggio del venerdì, in due sessioni parallele, verranno discusse le problematiche relative alla ricostruzione delle creste alveolari atrofiche negli edentuli totali e parziali. Il sabato si svolgerà una sessione dedicata alla terapia dei difetti parodontali e mucogengivali, sotto l’egida della SIdP. Contemporaneamente si terrà il forum sulla chirurgia ricostruttiva del seno mascellare in cui verranno sottolineati gli aspetti funzionali, le alternative terapeutiche e le complicanze. Il programma si chiuderà con un forum sui siti postestrattivi. Lo stesso giorno si terrà anche la sessione, coordinata dai professori Giorgio Iannetti e Pier Francesco Nocini, sull’uso dei biomateriali in chirurgia maxillofacciale. Per informazioni OSTEOLOGY ROMA www.osteology-roma.org

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OSSEOINTEGRATION

2009

Agenda

JOURNAL o f Agenda

Milano

La medicina naturale nel miglioramento della salute orale

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Corso teorico pratico di implantologia e implantoprotesi

9 9

Fortaleza (Brasile)

2009

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JOURNAL o f OSSEOINTEGRATION

Corso di parodontologia e implantologia

Relatore: Michele Figliuzzi www.sweden-martina.it Numero verde 800.010789

Relatore: Francesco Vedove Biotec S.r.l. Tel. 0444.361251 Fax 0444.361249 infocorsi@bioteconline.com www.bioteconline.com

GIUGNO

5-6

Brescia

Medical Services Tel. 031.789983 Fax 031.789903 info@medicalecmservices.com

La Fotografia intraorale 6

Relatori: Christian Bacci, Andrea Benetti Dott. Andrea Benetti Cell. 347.2381528 www.unid.it

Relatori: Giovanni B. Bruschi, Ivo Agabiti www.sweden-martina.it Numero verde 800.010789

1st European meeting of the Academy of Laser Dentistry

Roma

Relatore: Salvatore Damante Dott. Nicola Lavalle Cell. 335.233568 - www.unid.it

Dalla piccola chirurgia ambulatoriale alla chirurgia avanzata, con innesti di biomateriali per le rigenerazioni ossee 19-20

Relatori: L. Targetti, M. Guerra, R. Meli, S. Belcastro ISO Tel. 055.304458 Fax 055.304455 iso@leone.it

Corso sul colore e forma in protesi totale Sutri (Vt))

Vibo Valentia

Relatore: Stefano Conti www.sweden-martina.it Numero verde 800.010789

Patologia e Medicina Orale Conegliano (Tv)

Pesaro

Corso operativo d’implantologia con attività clinica su paziente

Nuovi paradigmi in implantoprotesi. Estetica e stabilità dei tessuti, versatilità clinica e successo implantare Bari

Corso di chirurgia e protesi implantare

info@osteology-roma.org www.osteology-roma.org

Promo Leader Service Congressi Tel. 055.2462424 Fax 055.2462223 tommaso.sacchini@promoleader.com

Due Carrare (Pd)

15-16

Simposio Nazionale Osteology Roma

15-16

Roma

2009

16-24

7-9

MAGGIO

Roma

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Relatore: Massimiliano Dell’Aquila DL Medica dlmedica@dlmedica.it www.dlmedica.it Sig. Canella Tel. 02.76275218

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* Come dimostrato da test condotti su animali. I primi risultati delle ricerche sono stati presentati al Congresso EAO di Varsavia nel 2008. Controllate la disponibilità dei prodotti con il distributore del vostro paese. APLIQUIQ® e INICELL® sono marchi registrati di Thommen Medical AG e/o dei suoi affiliati. Tutti i diritti riservati. Per saperne di più: www.inicell.info

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