40 IZOLACJA DNA Z WARZYW PRZY UŻYCIU POWSZECHNIE DOSTĘPNYCH ŚRODKÓW SPOŻYWCZYCH I DETERGENTÓW Autorzy: Ewa Śliwka, Małgorzata Syrek, Maciej Kurcz, Patryk Ciszek, Maciej Kluz Opiekun: mgr Maciej Kluz SKN Technologów Żywności „Ferment” Sekcja Biotechnologii i Mikrobiologii Uniwersytet Rzeszowski, Wydział Biologiczno-Rolniczy Ul. Ćwiklińskiej 2, 35-601 Rzeszów e-mail: ewkaa2@o2.pl, gonia1989@op.pl, mkurcz88@gmail.com, patrykciszek@wp.pl, mkluz@univ.rzeszow.pl Słowa kluczowe: warzywa, DNA, izolacja
Wstęp Proces izolowania DNA z komórki jest pierwszym krokiem dla wielu procedur laboratoryjnych w dziedzinie biotechnologii. Naukowiec musi mieć możliwość oddzielenia DNA z niechcianych substancji z komórki na tyle delikatnie, aby
DNA
nie
zostało
uszkodzone lub rozdrobnione. Kwas (DNA) jest naturalnym elementem naszej codziennej diety. Dziennie spożywamy 2 g materiału genetycznego - pełne genomy z warzyw, owoców, zbóż
i
różnych
gatunków
zwierząt [2]. Kwas DNA to wielkocząsteczkowy organiczny związek chemiczny należący do grupy kwasów nukleinowych. Występuje w chromosomach i pełni rolę nośnika informacji genetycznej
organizmów
żywych. DNA jest liniowym, nierozgałęzionym, biopolimerem, monomerem
dla są
którego
Rys. 1. Podwójna helisa DNA
nukleotydy.
Nukleotydy zbudowane są z: pięciowęglowego cukru deoksyrybozy, którego grupa hydroksylowa znajdująca się przy ostatnim atomie węgla jest zestryfikowana resztą fosforanową, a pierwszy atom węgla połączony jest wiązaniem N-glikozydowym z jedną
41 z czterech zasad azotowych: adeniną i guaniną oraz cytozyną i tyminą. Zasady są cyklicznymi związkami aromatycznymi zbudowanymi z atomów węgla i azotu. Adenina i guanina są związkami dwupierścieniowymi i są określane jako puryny (stanowią pochodne puryny). Cytozyna i tymina są jednopierścieniowymi pirymidynami. Zasady łączą się z cukrem wiązaniem między węglem 1’ cukru a azotem 9 puryn lub azotem 1 pirymidyn. Związek cukru z zasadą nazywa się nukleozydem. Po przyłączeniu grupy fosforanowej (PO4) nukleozyd staje się
nukleotydem.
Powszechnie
spotykaną
modyfikacją
DNA
jest
występowanie
5-metylocytozyny (m5C) w wyniku metylacji cytozyny. W skład cząsteczki DNA zwykle wchodzą dwa łańcuchy (DNA dwuniciowe), które biegną antyrównolegle (tzn. koniec jednego jest dokładnie naprzeciw początku drugiego). Łańcuchy owijają się wokół wspólnej osi i tworzą tzw. prawoskrętną podwójną helisę. Reszty cukrowe i fosforowe, połączone ze sobą wiązaniem fosfodiestrowym, znajdują się na zewnątrz helisy, natomiast zasady skierowane są do wnętrza i tworzą pary zasad. Tak więc tymina zawsze oddziaływuje z adeniną, a guanina z cytozyną. Pomiędzy zasadami tworzą się wiązania wodorowe, stabilizujące te oddziaływania. Między A-T powstają dwa wiązania wodorowe, a miedzy G-C trzy. Dlatego wiązania G-C są silniejsze niż A-T. Sposób, w jaki zasady dwóch nici DNA łączą się w pary jest określony jako komplementarne parowanie zasad i ma podstawowe znaczenie dla struktury i funkcji DNA. Inne kombinacje zasad niż A-T lub G-C nie tworzą się, gdyż takie pary byłyby zbyt duże lub zbyt małe by mogły dobrze pomieścić się wewnątrz helisy. Sekwencja jednej nici DNA musi być komplementarna do sekwencji drugiej. Oznacza to, że jedna nić może zostać wykorzystana do replikacji drugiej. Stanowi to podstawowy mechanizm zachowania informacji genetycznej i jej przekazywania komórkom potomnym przez dzielące się komórki macierzyste [1,2]. Cząsteczki DNA mogą być bardzo długie. U Homo sapiens ich długość (po "rozkręceniu chromosomów") dochodzi w sumie do 2 m gdzie najdłuższa cząsteczka ma 23 cm. W ścisłym skręceniu DNA do postaci chromosomu biorą udział białka histonowe lub niehistonowe [2].
Materiał i metody Do izolacji DNA użyto następujących warzyw: papryka czerwona, pomidor, cebula, groszek zielony, ogórek. Odczynniki: 10ml nie skoncentrowanego płynu do naczyń, 4g soli kuchennej, 90ml wody,10ml 96 % alkoholu etylowego z zamrażalnika, sączki bibułowe, nóż + deseczka do krojenia warzyw, zlewki szklane, mikser, probówki [3,4,5] Izolacja DNA z warzyw: 1. Sporządzono roztwór soli kuchennej oraz płynu do mycia naczyń (jako detergent), który ma za zadanie spowodować rozpad błon komórkowych, otoczki jądrowej, błon organelli oraz innych błon wewnątrz komórkowych;
42 2. Warzywa pokrojono w kostkę a następnie włożono do pojemników i zalano roztworem soli kuchennej i płynu do mycia naczyń; 3. Pojemnik z otrzymanym roztworem inkubowano w temperaturze 600C przez 10-15 minut. Miało to na celu przyspieszenie procesu rozpadu błon, oraz denaturacje DNAaz, które mogłyby szybko strawić DNA; 4. Po oziębieniu substancji w pojemniku z lodem, całą mieszaninę zmiksowano ok. 5 sek., przefiltrowano przez sączek z uwagą na to aby piana z detergentu w mieszaninie nie dostała się do przesączu. Miksowanie prowadzi do mechanicznego zniszczenia ścian komórkowych i uwolnienia zawartości komórek do mieszaniny. Czas miksowania również ma znaczenie gdyż za długie rozdrabnianie może zniszczyć DNA; 5. Następnie do przesączu dodano szczyptę soli do zmiękczania mięsa i pozostawiono na 5 minut. Sól ta zawiera proteazy, które trawią białka znajdujące się w przefiltrowanej mieszaninie; 6. Przesącz przelano do kilku probówek, a następnie bardzo ostrożnie i powoli dodano taka samą objętość zimnego etanolu tak, aby alkohol utworzył nad nim warstwę. Stężony etanol powoduje wytrącenie DNA z roztworu wodnego w postaci cienkich, długich, galaretowatych nitek z przyczepionymi bąbelkami powietrza; 7. Powstaje osad, w którym można zaobserwować DNA wyizolowane z roztworu, zawiera on jednak nadal białka i RNA. Otrzymany materiał genetyczny można wykorzystać do dalszych badań [3,4,5].
Wyniki W wyniku zastosowania metody izolacji DNA wg protokołów Warszawskiego Festiwalu Nauki otrzymano genomowe DNA z komórek papryki czerwonej i pomidora
DNA wyizolowany z pomidora
Rys. 2. DNA wyizolowane z komórek pomidora
43 Wnioski 1. Izolacja DNA w warunkach domowych z warzyw jest możliwa 2. Izolacja DNA najlepiej powiodła się u warzyw takich jak pomidor i cebula, ponieważ ich ściana komórkowa jest stosunkowo miękka w porównaniu do pozostałych warzyw 3. Izolacja DNA w warunkach domowych nie pozwala na wyizolowanie czystego materiału genetycznego
Literatura 1. Winter P.C., Hickey G.I., Fletcher H.L.. 2008. Krótkie wykłady. Genetyka. Wyd. PWN Warszawa. 2. Brown T. A. 2001. Genomy. Wyd. PWN, Warszawa 3. Marmur J. 1961. A procedure for the isolation of DNA from microorganisms. J. Mol. Biol., 3(2): 208-218. 4. Madden D. 1995. Investigating plant DNA. National Centre for Biotechnology Education The Univeristy of Reading. 5. Millar R. 1996. DNA from bacteria cells, SSERC Buletin, 198: 6-8. THE PROCESS OF ISOLATION DNA FROM VEGETABLES BY USING GENERALLY ACCESSIBLE FOODSTUFF AND DETERGENTS Summary Deoxyribonucleic acid (DNA) is a highmolecular organic compound which belongs to nucleic acids. It occurs in chromosomes and acts as a genetic information carrier of living organisms. The process of isolation of DNA is aimed at obtaining DNA biologically active , chemically stable and RNA and protein free. Genetic material from vegetables may be obtained in domestic conditions by using generally accessible foodstuff and detergents. Genetic material obtained in a domestic method contains RNA and proteins apart from DNA. Key words: vegetables, DNA, isolation