Spot On - Mykotoxine: Was erwarten Sie von einem Schnelltest? by BIOMIN

Ausgabe 13

Eine Veröffentlichung von Labs®

Mykotoxine: Was erwarten Sie von einem Schnelltest? Die 4 Testertypen Teilchengröße: Ein einfacher Weg zur Verbesserung Ihrer Extraktion und Ergebnisse

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Foto: Sebastian LeeschEyeEm

Inhalt

4-7

Was für ein Mykotoxintester sind Sie? 4 Testertypen und was sie von einem Schnelltest erwarten Wirtschaftliche Verluste, Risiken für die Gesundheit von Mensch und Tier, immer komplexere rechtliche Rahmenbedingungen: Die Gründe, warum Hersteller von Getreide, Lebens- und Futtermitteln auf Mykotoxine testen müssen, sind vielfältig. Joshua Davis, Kommunikationsmanager bei Romer Labs, und Ervin Tanyi, Key Account Manager bei Romer Labs, präsentieren häufige Situationen, in denen Schnelltests nützlich sein können. Von Joshua Davis, Kommunikationsmanager bei Romer Labs, und Ervin Tanyi, Key Account Manager bei Romer Labs

Spot On ist eine kostenlose Veröffentlichung der Romer Labs Division Holding GmbH. ISSN: 2414-2042

Redaktion: Joshua Davis, Cristian Ilea

Mitwirkende: Joshua Davis, Henriette Hobbs, Nora Kogelnik, Ervin Tanyi Forschung: Kurt Brunner

Herausgeber: Romer Labs Division Holding GmbH Erber Campus 1 3131 Getzersdorf, Austria Tel: +43 2782 803 0 www.romerlabs.com ©Copyright 2021, Romer Labs® Alle Rechte vorbehalten. Kein Teil dieser Publikation darf ohne schriftliche Genehmigung des Urhebers in irgendeiner Form für kommerzielle Zwecke vervielfältigt werden. Alle hierin enthaltenen Fotos sind Eigentum von Romer Labs oder werden mit Lizenz verwendet.

Foto: BJI

Grafik: GraphX ERBER AG

8-15

Kleiner ist besser: Verbesserung der Ergebnisse der Mykotoxinanalyse durch Reduktion der Partikelgröße Die neueste Forschung hat gezeigt, dass die Partikelgröße einer Probe sich wesentlich auf die Genauigkeit der Mykotoxinanalyseverfahren auswirkt. Die Mykotoxinexperten Henriette Hobbs und Nora Kogelnik thematisieren das Problem und geben einige Empfehlungen, mit denen sie sicherstellen können, dass ihre Mykotoxintestvorgänge zu präzisen und zuverlässigen Ergebnissen führen. Von Nora Kogelnik, Produktmanagerin, und Henriette Hobbs, Wissenschaftlerin bei Romer Labs

Romer Labs ist Teil von DSM.

Spot On Ausgabe 13

Editorial Schnell und genau – und benutzerfreundlich:

Antworten auf die Bedürfnisse von Mykotoxintestern Seit 39 Jahren. Seit unserer Gründung im Jahr 1982 ist bei Romer Labs die Analyse von Mykotoxinen ein zentraler Geschäftsbestandteil. Dank dieser langjährigen Erfahrung kennen wir nicht nur die Besonderheiten der Analytik, sondern auch die unterschiedlichen Bedürfnisse des Marktes. Es reicht nicht aus, einfach nur Produkte oder Dienstleistungen zu entwickeln, die funktionieren. Die Produkte bzw. Dienstleistungen müssen auch die spezifischen Anforderungen unserer Kunden erfüllen. Das heißt: Präzision darf nicht auf Kosten der Benutzerfreundlichkeit gehen. Als wir mit der Arbeit am AgraStrip® Pro WATEX® System begannen, sprachen wir mit den Menschen, die unsere Produkte täglich nutzen: den Mitarbeitern in Servicelaboren, in unseren technischen Support-Teams und natürlich unseren Kunden. Wir haben sie gefragt: „Was muss ein Schnelltest vor Ort können? Mit welchen Herausforderungen sind sie täglich konfrontiert?“ Von so unterschiedlichen Testumgebungen wie Getreidesilos in Brasilien, Maisstärkefabriken in Europa und Tierfutterherstellern in den USA hörten wir immer wieder eine Antwort: „Warum können Mykotoxintests nicht benutzerfreundlicher sein?“ Während wir also die Standards für Empfindlichkeit und Geschwindigkeit verbesserten, widmeten wir uns auch der Optimierung des Prozesses und der Lösung der Probleme von Mykotoxintestern. Das Ergebnis: LFDs mit niedrigen LODs und das neue AgraVision™ Pro Lesegerät, das den Testern einen Großteil der Arbeit abnimmt: die Kontrolle von Zeit, Temperatur und Testablauf. Mit seinem 7-Zoll-Touchscreen und 4 unabhängig voneinander arbeitenden Testschlitzen bietet das AgraVision™ Pro Lesegerät Mykotoxintestern hohe Leistung und Sicherheit. In dieser Ausgabe von Spot On befassen wir uns mit einigen Problemen, die Mykotoxintester beschäftigen. Unser Key Account Manager Ervin Tanyi schöpft aus seiner langjährigen Erfahrung, um vier verschiedene Arten von Mykotoxinjägern, ihre Herausforderungen und ihre Erwartungen an einen Schnelltest darzustellen. Produktmanagerin Nora Kogelnik befasst sich anschließend gemeinsam mit der leitenden Wissenschaftlerin Henriette Hobbs mit einem spezifischen Problem der Probenvorbereitung: der Korngröße und ihren Auswirkungen auf die Probenextraktion und die Mykotoxinausbeute. Sie werfen ein neues Licht auf dieses oft übersehene Thema und zeigen, wie Sie mit nur wenigen Anpassungen die Präzision Ihrer Tests verbessern können. Viel Spaß mit dieser Ausgabe von Spot On.

Klaus Hasler Managing Director, Romer Labs Diagnostic GmbH ® Ain E mea gV ae zr ö i nf e f e on ft lR i cohmuenrg Lvaobns R omer Labs®

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Spot On Ausgabe 13

Was für ein Mykotoxintester sind Sie?

4 Testertypen und was sie von einem Schnelltest erwarten Wirtschaftliche Verluste, Risiken für die Gesundheit von Mensch und Tier, immer komplexere rechtliche Rahmenbedingungen: Die Gründe, warum Hersteller von Getreide, Lebens- und Futtermitteln auf Mykotoxine testen müssen, sind vielfältig. Joshua Davis, Kommunikationsmanager bei Romer Labs, und Ervin Tanyi, Key Account Manager bei Romer Labs, präsentieren häufige Situationen, in denen Schnelltests nützlich sein können. Von Joshua Davis, Kommunikationsmanager bei Romer Labs, und Ervin Tanyi, Key Account Manager bei Romer Labs

E i n e Ve rö f fe n t l i c h u n g vo n Ro m e r L a b s ®

Die Lateral Flow Device-Technologie (LFD) hat sich als vielseitig und robust genug erwiesen, um vor Ort eingesetzt zu werden, und als genau genug, um in vielen Fällen Labormethoden überflüssig zu machen.

Mykotoxine: eine wachsende Bedrohung Der wirtschaftliche Schaden durch Mykotoxine wächst: Die FAO schätzt, dass 25 % der weltweiten landwirtschaftlichen Produktion mit Mykotoxinen kontaminiert sind. Diese giftigen Substanzen können bei Mensch und Tier Gesundheitsprobleme von Krebs, über Erkrankungen der Leber und der Nieren bis hin zu Erkrankungen des Nervensystems, des Hormonsystems und vielem mehr auslösen. Bei einigen Mykotoxinen ist sogar bekannt, dass sie das Immunsystem unterdrücken. In dem Maße, indem unser Wissen über Mykotoxine zunimmt, nehmen auch die gesetzlichen Beschränkungen für ihre Verwendung in Rohstoffen, Tierfutter und Lebensmitteln zu. Diese Beschränkungen haben wiederum eine Vielzahl von Strategien und Produkten hervorgebracht, um Mykotoxine nachzuweisen und die von ihnen verursachten Schäden für Gesundheit und Wirtschaft zu verhindern. Von den zur Verfügung stehenden Instrumenten haben sich Mykotoxin-Schnelltests auf der Grundlage der Lateral Flow Device-Technologie (LFD) als vielseitig und robust genug erwiesen, um vor Ort eingesetzt zu werden, und als genau genug, um in vielen Fällen Labormethoden überflüssig zu machen. Wir arbeiten seit Jahren mit Getreide- und Futtermittelherstellern und -händlern auf der ganzen Welt zusammen und unterstützen sie bei der Implementierung von Geräten zum Mykotoxinnachweis an ihren Rohwarenannahmestellen, Getreidesilos, Futtermühlen und anderen Orten, an denen sie schnelle und genaue Mykotoxinergebnisse benötigen. In diesem Artikel präsentieren wir vier verschiedene Testerarten, die aus ähnlichen, aber unterschiedlichen Gründen Schnelltestlösungen benötigen. Wir hoffen, dass diejenigen unter Ihnen, die sich in einer dieser vier Rollen wiedererkennen, ein wenig darüber lernen, wie Schnelltestlösungen Ihren Mykotoxinnachweis unterstützen können.

Nr. 1: Der Getreidesammler (eingehende Rohmaterialien)

Einer der wichtigsten Prüfpunkte in der Lebensmittelkette ist die Annahme von Rohstoffen – wir bezeichnen diejenigen, die diese entscheidende Aufgabe ausüben, gerne als „Getreidesammler“. Der Getreidesammler entscheidet auf der Grundlage ihres Mykotoxingehalts über die Annahme, Ablehnung oder anderweitige Aussonderung von Rohstoffen, zumeist Rohgetreide. Getreidesammler benötigen Testmethoden, die sehr spezifische, lokale Anforderungen erfüllen. Für den Getreidesammler ist die Zeit bis zum Vorliegen eines Ergebnisses von entscheidender Bedeutung, da alle Beteiligten der Lieferkette auf seine Entscheidung warten. Innerhalb von Minuten müssen Lkw-Fahrer oder Bahnbetreiber wissen, ob sie ihre

Sendung entladen können und wenn ja, wo. Wer weiter unten in der Lieferkette steht, z. B. diejenigen, die die Materialien lagern oder weiterverarbeiten, verlassen sich ebenfalls darauf, dass der Getreidesammler eine schnelle und genaue Entscheidung trifft. Die Testmethode sollte außerdem einfach sein, damit der Getreidesammler sie leicht erlernen und sicher durchführen kann. Diese Einfachheit ist von entscheidender Bedeutung, da er bereits mit anderen zu messenden Parametern schwer beschäftigt ist: Neben Mykotoxinen sind unter anderem auch Feuchtigkeit, Sauberkeit und Proteingehalt in kurzer Zeit zu messen. Darüber hinaus muss die Rohwarenannahme robust gestaltet sein – sowohl hinsichtlich der Tests als auch der Ausrüstung. Bei der Getreideannahme und Vermahlung entsteht weit mehr Staub als in einer normalen Laborumgebung. Außerdem kann die Umgebungstemperatur je nach den Wetterbedingungen bei der Getreideernte stark schwanken. Die Testgeräte müssen entsprechend widerstandsfähig gegen diese rauen Bedingungen sein. Angesichts all dieser Herausforderungen braucht der Getreidesammler eine praktische Möglichkeit, die Ergebnisse zu verwalten. Früher reichte es aus, die Ergebnisse von den Teststreifen oder dem Display eines Lesegeräts abzulesen und manuell zu dokumentieren. Heutzutage ist Konnektivität ein Muss: Die Ergebnisse müssen leicht auf Computersysteme, einschließlich LIMS- und ERP-Plattformen, übertragen werden können.

Nr. 2: Der Präzisionstester (QC für hochveredelte Produkte)

Ähnlich wie der Getreidesammler benötigt auch derjenige, der Qualitätskontrollen für hochveredelte Produkte wie Zitronensäure, Stärke, Maissirup mit hohem Fruchtzuckergehalt und andere biologisch abbaubare Zutaten natürlichen Ursprungs durchführt, zuverlässige und schnelle Lösungen für die Prüfung auf Mykotoxine. Ihre Ausgangssituation könnte jedoch kaum unterschiedlicher sein: Der Präzisionstester steht in der Regel nicht unter dem Zeitdruck von auf die Entladung ihrer Waren wartender Lastwagen an den Annahmestellen und hat oft den Vorteil einer Laborumgebung und geschulter Mitarbeiter. Er ist vor allem mit den hohen Anforderungen der Inhaltsstoffproduktion beschäftigt und hat ein Auge für Präzision. Wir nennen ihn den „Präzisionstester“. Obwohl er Zugang zu Analysemethoden wie HPLC oder Massenspektrometrie hat, bevorzugt der Präzisionstester wegen seiner Einfachheit und Flexibilität oft einen Mykotoxinschnelltest. Dank der Erhöhung des Testvolumens mit Schnelltestkits werden komplexere Geräte und Arbeitszeit für andere notwendige Laborarbeiten frei. Spot On Ausgabe 13

Der Mykotoxin-Polizist (Einhaltung von Vorschriften und Grenzwerten)

Sowohl der Getreidesammler als auch der Präzisionstester arbeiten in der Regel für ein Unternehmen, das mit Rohstoffen handelt oder Waren aus diesen Rohstoffen herstellt. Der Mykotoxin-Polizist interessiert sich in der Regel nicht für das Endergebnis eines Unternehmens, sondern stellt sicher, dass die Vorschriften eingehalten werden. Er ist häufig bei Zertifizierungsunternehmen oder Aufsichtsbehörden angestellt und überwacht die Einhaltung von Mykotoxingrenzwerten und die Zertifizierung von Bahnoder LKW-Transporten. Aus diesem Grund bezeichnen wir diejenigen, die diese wichtige Rolle spielen, gerne als Mykotoxin-Polizisten. Mykotoxin-Polizisten arbeiten fast immer weit entfernt von einer herkömmlichen Laborumgebung – wenn überhaupt, dann ist ihr Labor auf das beschränkt, was in den Kofferraum ihres Autos passt. Sie untersuchen Züge, die an entlegene Orte fahren, um die Einhaltung von Vorschriften zu gewährleisten. Da sie oft weit von den Handelszentren entfernt arbeiten, ist eine Internetverbindung ein Luxus, der ihnen nicht immer zur Verfügung steht. Sie verfügen oft nicht über die Mahlgeräte, die dem Getreidesammler zur Verfügung stehen, und müssen sich auf Kaffeemühlen verlassen, um ihre Proben zu erhalten. Genau wie komplexe Laborausrüstungen für den Mykotoxin-Polizisten nicht in Frage kommen, ist auch nicht jede Schnelltestlösung geeignet. Abgesehen von den grundlegenden Anforderungen an Empfindlichkeit, Genauigkeit und Benutzerfreundlichkeit müssen die Teststreifen und Lesegeräte trotz ständiger Mobilität eine hohe Qualität gewährleisten. Mobilität ist das Hauptaugenmerk und spezielle Ausrüstungen wie Netzadapter und Batterien ermöglichen es den Mykotoxin-Polizisten, dorthin zu gehen, wo sie am meisten gebraucht werden.

Nr. 4: Der Tierschützer (Mykotoxin-Risikomanagementprogramm)

Für diejenigen, die die letzte hier vorgestellte Rolle spielen, ist die Gesundheit der ihnen anvertrauten Tiere von größter Bedeutung. Der Tierschützer stellt sicher, dass das Futter seiner Tiere gesund ist und innerhalb der zulässigen Grenzwerte für die Mykotoxinkonzentration liegt. Die Vorschriften sind jedoch nur ein Teil: Empfehlungen von Tierärzten können oft zu weit strengeren Grenzwerten führen als die offiziellen. Der Tierschützer weiß, dass er das Mykotoxinrisiko in Futtermitteln erst einmal messen muss, um es zu beherrschen. Die Mykotoxinkonzentration einer bestimmten Charge von Futtermitteln oder in Futtermittelzutaten gibt Aufschluss darüber, für E i n e Ve rö f fe n t l i c h u n g vo n Ro m e r L a b s ®

welche Tierart es verwendet werden kann bzw. ob es überhaupt verwendet werden kann. Unserer Erfahrung nach kann der Tierschützer nicht immer warten, bis die Mykotoxinergebnisse vorliegen, bevor er über die Verwendung einer Charge oder das Einsetzen eines Futtermittelzusatzstoffs, wie zum Beispiel eines Mykotoxin-Inaktivators, entscheidet. Schnelltests helfen dem Tierschützer, seine Tiere vor den schädlichen Auswirkungen von Mykotoxinen zu schützen und gleichzeitig sicherzustellen, dass der Nährstoffbedarf seiner Tiere gedeckt wird.

Schlussfolgerung: Ein allgemeines Bedürfnis nach Schnelligkeit (und Empfindlichkeit, Benutzerfreundlichkeit und Präzision)

Was macht einen Schnelltest benutzerfreundlich? Eine große und intuitiv aufgebaute Benutzeroberfläche auf dem Lesegerät trägt viel dazu bei.

Getreidesammler, Präzisionstester, MykotoxinPolizisten, Tierschützer: Sie alle haben unterschiedliche Erwartungen an eine Mykotoxin-Schnelltestlösung. GESCHWINDIGKEIT. Die Tester haben keine Zeit zu verlieren. Vielleicht sind Sie der Getreidesammler, der den im Hof stehenden Lastwagen sagen muss, ob oder wo sie abladen sollen, oder vielleicht sind Sie der freiberufliche Mykotoxin-Polizist, der testen, zertifizieren (oder auch nicht) und zum nächsten Standort eilen muss. Wie dem auch sei, Sie brauchen ein System, das das „schnell“ in Schnelltests umsetzt. EMPFINDLICHKEIT. Alle Tester brauchen ein System, das die Ergebnisse bis hinunter zu den von den Behörden geforderten niedrigen Konzentrationen liefern kann. Manche Tester haben es mit internen Grenzwerten zu tun, die strenger sind als die der Aufsichtsbehörden. Wenn dies auf Sie zutrifft, müssen Sie sicherstellen, dass jedes System, das Sie in Betracht ziehen, einen LOD hat, der Ihren Anforderungen entspricht und für die zu testenden Produkte validiert ist. BENUTZERFREUNDLICHKEIT. Was macht einen Schnelltest benutzerfreundlich? Unsere Kunden nennen immer wieder eine Sache, die ein Kit benutzerfreundlich macht: einen gestrafften Arbeitsablauf. Wenn man beispielsweise die Bedürfnisse eines Tierschützers berücksichtigt, der mit verschiedenen Aufgaben jonglieren muss, ist ein Arbeitsablauf mit so wenigen Schritten wie möglich ein Muss. Wir möchten jedoch ergänzen, dass der Arbeitsablauf nur ein Teil des Ganzen ist: eine große und intuitiv aufgebaute Benutzeroberfläche auf dem Lesegerät trägt ebenfalls dazu bei, allen Testern das Leben zu erleichtern. PRÄZISION. Aus offensichtlichen Gründen kann niemand in einer dieser Rollen ein Schnelltestsystem akzeptieren, das unzuverlässige Ergebnisse liefert. Die hochspezialisierte Arbeit, die in die Produktion von veredelten Materialien wie Trockenschlempe einfließt, darf zum Beispiel nicht durch inakzeptable Mykotoxinwerte beeinträchtigt werden. Unabhängig von der Rolle, die wir selbst beim Nachweis von Mykotoxinen spielen, werden wir letztlich von einem Gebot geleitet: unsere Lebens- und Futtermittel innerhalb akzeptabler Werte zu halten. Mykotoxinschnelltests werden auch in Zukunft ein unverzichtbares Instrument sein, um die Anforderungen des Marktes zu erfüllen.

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Kleiner ist besser:

Verbesserung der Ergebnisse

der Mykotoxinanalyse durch die Reduktion der Partikelgröße Die neueste Forschung hat gezeigt, dass die Partikelgröße einer Probe sich wesentlich auf die Genauigkeit der Mykotoxinanalyseverfahren auswirkt. Die Mykotoxinexperten Henriette Hobbs und Nora Kogelnik schätzen das Problem ein und geben einige Empfehlungen, mit denen Sie sicherstellen können dass Ihre Mykotoxintestvorgänge zu präsiszen und zuverlässigen Ergebnissen führen .

Foto: BJI

Von Dr. Henriette Hobbs, leitende Wissenschaftlerin, und Dr. Nora Kogelnik, Produktmanagerin

E i n e Ve rö f fe n t l i c h u n g vo n Ro m e r L a b s ®

Dennoch sind Probenahme und Probenvorbereitung komplexe Verfahren, die viele mögliche Risiken bergen. Jeder Schritt innerhalb des Probenvorbereitungsverfahrens führt ein Variabilitätslevel ein, das zur Gesamtvariabilität innerhalb eines einzelnen Analyseergebnisses beiträgt.

ykotoxinanalytikern arbeiten im Allgemeinen in drei Hauptschritten, wenn es um die Mykotoxinanalyse von landwirtschaftlichen Rohstoffen wie Mais, Weizen und Gerste geht: Probenahme, Probenvorbereitung und Analyse. Um die Mykotoxinkonzentration in einer Chargenprobe zu bestimmen, müssen wir einen kleineren, aber dennoch repräsentativen Teil der Charge analysieren. Das bedeutet, dass zuverlässige Ergebnisse ohne einen geeigneten Stichprobenplan nicht möglich sind. Dieser umfasst die Entnahme von Einzelproben der Charge und deren Zusammenfassung zu einer Teilprobe (auch als Chargenprobe bezeichnet). Auf diese Weise wird sichergestellt, dass die zu prüfende Probe wirklich repräsentativ für die gesamte Charge ist. Von hier aus richtet sich unser Augenmerk auf die Probenvorbereitung. Bei Produkten auf Getreidebasis besteht die Probenvorbereitung aus zwei wichtigen Schritten: Mahlen der Probe und Teilprobenahme: 1) Eine Mühle oder eine andere Vorrichtung wird verwendet, um das Korn der Chargenprobe zu mahlen, um die Partikelgröße zu verringern und eine einheitliche Größe sicherzustellen. 2) Aus dieser Probe ziehen wir eine Teilprobe, die für die gesamte Charge repräsentativ ist und für die Analyse verwendet wird. Die Teilprobe wird anschließend nach einem festgelegten Protokoll für die Extraktion vorbereitet [10]. Probenahme und Probenvorbereitung sind jedoch komplexe Verfahren, die viele Risiken bergen. Jeder Schritt innerhalb des Probenvorbereitungsverfahrens führt ein Variabilitätslevel ein, das zur Gesamtvariabilität innerhalb eines einzelnen Analyseergebniss-

Abbildung 1. Beobachtete Varianz während der Probenahme (61%), Probevorbereitung (36%) und Analyse (3%) für eine mit 20 ppb AFLA kontaminierte Total observed for Probe. Adaptiert aus variation [2].

3+36+61 a 20 ppb AFLA corn sample

Analyse Analysis 3 3% %

Probennahme Sampling 6161% %

ProbenvorbereitSample ung 36 % preparation 36%

es beiträgt [2, 5]. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass zwei Drittel der beobachteten Variabilität auf die Probenahme zurückzuführen ist, wobei ein Drittel auf die Art und Weise der Probenvorbereitung entfällt. Nur ein viel geringerer Prozentsatz der Variabilität ist mit der angewandten Analysemethode (Abbildung 1) verbunden. Dementsprechend hängen genaue Ergebnisse davon ab, inwieweit wir diese drei Faktoren berücksichtigen. Zahlreiche Studien erötern den Einfluss des Verfahrens der Probenahme sowie die Verwendung verschiedenster analytischen Lösungsmittel auf die Genauigkeit des Mykotoxinnachweises [1, 2, 4] In diesem Artikel wird jedoch der Einfluss der Probenvorbereitung, d. h. das Mahlen und die Probenmenge, auf die Präsezsion des Testergebnisses erörtert. Jüngsten Forschungsarbeiten zu dem Thema des Einflusses der Probenvorbereitung auf die Genauigkeit der Mykotoxinanalyse und die Probenvarianz wurden zusammengefasst und erörtert [10].

Eine repräsentative Probe wählen Wenn eine Ware von Natur aus mit Mykotoxinen belastet ist, sind kontaminierte Körner im Allgemeinen ungleichmäßig über eine bestimmte Menge verteilt. Diese Gruppierungen kontaminierter Kerne werden als „Hot Spots“ bezeichnet. Um einen genauen Überblick über den Verschmutzungsgrad einer Charge zu erhalten, muss ein Stichprobenplan die zufällige Verteilung solcher Hot Spots berücksichtigen. Dies geschieht durch Entnahme vieler kleiner Einzelproben an verschiedenen, über die gesamte Charge verteilten Abbildung 2. Probenauswahlverfahren zum Erhalten einer repräsentativen Testprobe aus einer Chargenprobe, wobei die Chargenprobe die Ansammlung vieler kleinerer inkrementeller Teile ist, die von verschiedenen Orten entnommen wurden. Der „Teiler“ segmentiert die Chargenprobe weiter in einzelne Testproben [10].

Charge Inkremente Chargenprobe Teiler Testprobe Spot On Ausgabe 13

Stellen, um eine repräsentative Probe zu erhalten (Abbildung 2) [8]. Die Auswahl inkrementeller Proben aus einer großen Menge ist entscheidend, damit alle Körner die gleiche Chance haben, ausgewählt zu werden, wodurch die Verzerrung verringert wird [10].

Mahlen, um eine gleichmäßige Partikelgröße zu gewährleisten Die Schimmelpilze, die Mykotoxine produzieren, weisen verschiedene Kontaminationswege auf. Infolgedessen können Mykotoxine sowohl innerhalb der Körner als auch auf deren Oberfläche gefunden werden. Der Infektionsweg hängt vom Mykotoxin und dem betreffenden Getreide ab. Es ist bekannt, dass bestimmte Mykotoxin-produzierende Pilze wie Fusarium im Korn oder Kern vorhanden sind, während sich andere wie Aspergillus auf der Oberfläche befinden. Das gleichmäßige Mahlen einer Probe löst dieses Problem, indem kontaminierte Körner aufgebrochen werden und eine gleichmäßige Verteilung der Partikel ermöglicht wird. Dies verbessert letztlich den Nachweis von kontaminierten Partikeln [3].

Homogenisieren der potenziellen Mykotoxinverteilung, durch das Sieben und Mischen des Korns mithilfe eines Netzes Nachdem die Probe als repräsentativ für die Charge ausgewählt und gemahlen wurde, um eine gleichmäßige Partikelgröße sicherzustellen, muss die Probe durch gründliches Mischen homogenisiert werden, damit sie repräsentativ für die gesamte Charge ist [3]. Die Körner trennen sich beim Mischen nach Größe, wodurch der Grad der Repräsentativität der Probe verringert wird und ein ungenaues Analyseergebnis erzielt wird. Aus diesem Grund überprüfen vorher die Gleichmäßigkeit der Vermahlung, indem wir die gemahlene Probe durch ein Netz oder ein Sieb geben. Dabei geht es nicht darum, größere Partikel herauszufiltern, da diese ebenfalls Mykotoxine

enthalten könnten – im Gegenteil: Diese größeren Partikel müssen in der Probe enthalten sein. Vielmehr stellen wir die Gleichmäßigkeit des Mahlguts sicher, indem wir prüfen, ob ein bestimmter Prozentsatz der Partikel durchgelassen wird. Das USDA-FGIS hat beispielsweise Spezifikationen für Probengröße, Probenmahlung und Teilprobenahme für Af latoxin, Deoxynivalenol, Fumonisin, Ochratoxin und Zearalenon festgelegt [9]. Die USDA-FGIS empfiehlt, eine Probe so zu mahlen, dass 60 – 75 % der Partikel ein Sieb der Größe 20 durchlaufen und dass 50 g der Testprobe zur Extraktion des Mykotoxins verwendet werden (einschließlich der Partikel, die nicht durch das Sieb passen).

Halten Sie Ihre Korngröße klein, Ihre Probengröße groß und Ihre Mykotoxinergebnisse genau Wir verwenden in diesem Artikel die Begriffe „Genauigkeit“ und „Präzision“. Daher ist eine kurze Definition dieser Begriffe angebracht: Genauigkeit und Präzision stehen für Unsicherheiten im Zusammenhang mit der Analyse, die sich aus der anfänglichen Probenvorbereitungsmethode oder dem ursprünglichen Probenvorbereitungsplan ergeben. Die Genauigkeit ist definiert als die Nähe eines gemessenen Wertes zum wahren Wert, während die Präzision als die Nähe der gemessenen Werte zueinander definiert ist. Das ultimative Ziel sollte darin bestehen, ein Verfahren zu implementieren, das sowohl eine hohe Genauigkeit als auch eine hohe Präzision gewährleistet [10]. Studien zeigen, dass die Präzision einer Mykotoxinnachweismethode und damit die Varianz der Ergebnisse stark von der Größe der Partikel in der Probe abhängen. Um die Messvariabilität zu demonstrieren, die mit der Größe der Partikel in der Probe und der Größe der zu analysierenden Probe verbunden ist, verweisen wir auf mehrere Studien, die ebendies evaluierten (Abbildung 3

Wenn die gemahlene Probe durch ein Sieb geleitet wird, geht es nicht darum größere Partikel herauszufiltern, da diese ebenfalls Mykotoxine enthalten könnten – im Gegenteil: Diese größeren Partikel müssen in der Probe enthalten sein.

Tabelle 3: Der Einfluss von Partikel- und Probengröße auf den Aflatoxinspiegel in natürlich kontaminierten Maisproben [9]. Probennummer 1

50 g

10 g

151

140

149

160

167

136

135

151

217

7 8

Durchschnitt (ppb) SD (ppb)

10 g

4 6

Hammermühlen-Probe

50 g

222

99% 20-Mesh-Probe

10 g

2 3

RSD (%)

60 % 20-Mesh-Probe

135 95 86

108

140 56

125 110 123 139 111 115

126 15

E i n e Ve rö f fe n t l i c h u n g vo n Ro m e r L a b s ®

154 138 155 141 147 167

147 11 7

148 144 151 140 148 149 145 5

154 155 156 153 162 171

158 7

Studien zeigen, dass die Präzision einer Mykotoxinnachweismethode und damit die Varianz der Ergebnisse stark von der Größe der Partikel in der Probe abhängen.

und Abbildung 4). In der ersten Studie von Whitaker et al. (in Abbildung 3 gezeigt), wurden natürlich mit Aflatoxin kontaminierte Maisproben charakterisiert. Die Proben mit unterschiedlicher Korngröße wurden anschließend durch ein Nr. 20 Sieb gesiebt: 1) eine Grobmahlung (60 % der durchgelassenen Partikel), 2) eine Feinmahlung (99 % der durchgelassenen Partikel) und 3) pulverisiert (mit einer Hammermühle). Acht Proben aus jedem Mahlgrad wurden dann unter Verwendung einer modifizierten HPLCReferenzmethode analysiert, um die Varianz zwischen den Proben innerhalb eines einzelnen Grundzustands zu demonstrieren [9]. Wie Sie in Tabelle 3 sehen können, variieren die Analyseergebnisse sowohl in Abhängigkeit von der Probengröße als auch von der Mahlgröße. Doch wie können wir diese Variation auf eine Weise quantifizieren, die für uns nützlich ist? Die relative Standardabweichung (RSD) oder der Variationskoeffizient (CV) werden häufig verwendet, um zu bestimmen, wie unterschiedlich die Ergebnisse in einem bestimmten Datensatz sind. Die RSD wird

häufig als Prozentsatz angegeben und durch das Verhältnis der Standardabweichung zum Mittelwert definiert. Je niedriger die Standardabweichung ist, desto geringer ist die Abweichung innerhalb des Datensatzes und desto zuverlässiger ist das Ergebnis. In den in Tabelle 3 dargestellten Daten aus der Studie wurde eine signifikante Variabilität zwischen 10 g- Proben beobachtet, die aus verschiedenen Partikelgrößen bestanden. Die 10 g grob gemahlenen Proben zeigen bei 40 % die höchste RSD im Vergleich zur fein gemahlenen Probe (99 % Sieb-20-Probe) mit einer berechneten RSD von 7 %. Die niedrigste RSD von 4 % wurde mit pulverförmigen Proben aus der Hammermühle erreicht. Obwohl der Kauf eine Hammermühle für einen durchschnittlichen Tester finanziell normalerweise nicht realisierbar ist, hat die Studie von Whitaker et al. gezeigt, dass der beste Weg, um Abweichungen bei der Probenvorbereitung zu vermeiden, darin besteht, fein zu mahlen und ein Netz zu verwenden, um die Gleichmäßigkeit der Partikelgröße sicherzustellen [9].

Abbildung 4. Der Einfluss der Mahlgröße (Mahlen) und der Probengröße (1 g, 5 g, 10 g, 25 g) auf die analytische Variabilität. IEinzelne Extrakte (n = 10) verschiedener Kombinationen von Maschenweiten und Probengrößen wurden auf Gesamt-Aflatoxin (A, B), Gesamt-Fumonisin (C, D) und Zearalenon (E, F) in natürlich kontaminiertem Mais analysiert. Referenzmethoden wurden zur Probencharakterisierung verwendet. Die Ergebnisse wurden gemittelt, die Standardabweichung berechnet und in den Diagrammen A, C und E dargestellt. Außerdem wurde der CV in % bestimmt und als Liniendiagramm in den Abbildungen B, D und F dargestellt. (Mit Genehmigung der Autoren von [2, 7, 12].)

Gesamt-Aflatoxin

A Gesamt-Aflatoxin-Konzentration [in ppb]

400

n 1 Gram n 5 Gramm n 10 Gramm n 25 Gramm

350 300 250 200 150 100 50 0

51,3 % passen durch 20 Mesh

97,1 % passen durch 20 Mesh

Variationskoeffizient (CV)

100 % passen durch 30 Mesh

Bei 10 Mesh gehen 52,8 % durch Bei 20 Mesh gehen 51,3 % durch Bei 20 Mesh gehen 97,1 % durch Bei 30 Mesh gehen 100 % durch

CV [in %] für Gesamt-Aflatoxin

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

52,8 % passen durch 10 Mesh

1 Gramm

5 Gramm

10 Gramm

PROBENMENGE in GRAMM für die EXTRAKTION

25 Gramm

Spot On Ausgabe 13

Je geringer die

Gesamt-Fumonisin 9

n 1 Gramm n 5 Gramm n 10 Gramm n 25 Gramm

Gesamt-Fumonisin-Konzentration [in ppm]

8 7

Standardabweichung, desto geringer die Schwankungen

6 5

innerhalb des

Datensatzes und

desto zuverlässiger

2 1

das Ergebnis.

50 % passen durch 10 Mesh

50 % passen durch 20 Mesh

95 % passen durch 20 Mesh

95 % passen durch 30 Mesh

Variationskoeffizient (CV)

CV [in %] für Gesamt-Fumonisin

120

Bei 10 Mesh gehen 50 % durch

100

Bei 20 Mesh gehen 50 % durch

Bei 20 Mesh gehen 95 % durch

Bei 30 Mesh gehen 95 % durch

40 20 0

1 Gramm

5 Gramm

10 Gramm

PROBENMENGE in GRAMM für die EXTRAKTION

25 Gramm

Zearalenon 2500

Zearalenon-Konzentration [in ppb]

n 1 Gramm n 5 Gramm n 10 Gramm n 25 Gramm

2000 1500 1000 500 0

50 % passen durch 10 Mesh

50 % passen durch 20 Mesh

95 % passen durch 20 Mesh

100 % passen durch 30 Mesh

Variationskoeffizient (CV) Bei 10 Mesh gehen 50 % durch Bei 20 Mesh gehen 50 % durch Bei 20 Mesh gehen 95 % durch Bei 30 Mesh gehen 100 % durch

CV [in %] für Zearalenon

50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

1 Gramm

5 Gramm

10 Gramm

PROBENMENGE in GRAMM für die EXTRAKTION

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25 Gramm

Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass die analytische Variabilität verringert werden kann, wenn Proben einen feineren Mahlgrad erreichen.

Um den Einfluss der Partikelgröße (Mahlen) und der Probengröße auf die analytische Variabilität zwischen verschiedenen Mykotoxinen weiter zu demonstrieren, haben Brunkhorst et al. eine Analyse an Maisproben durchgeführt, die auf natürliche Weise entweder mit Gesamt-Aflatoxin (Summe aus B1, B2, G1 und G2), Gesamt-Fumonisin (Summe aus B1, B2 und B3) oder Zearelenon kontaminiert waren (Abbildung 4). Für diese Studie wurden 10 Maisproben je Mykotoxin auf unterschiedliche Partikelgrößen gemahlen, sodass sie entweder durch ein Nr. 10 Sieb, ein Nr. 20 Sieb oder ein Nr. 30 Sieb passten. Die Varianz bei verschiedenen Probengrößen (1 g, 5 g, 10 g und 25 g) für die Extraktion wurde ebenfalls weiter untersucht. Die Aflatoxinproben wurden mit Acetonitril/Wasser (84/16) extrahiert und unter Verwendung eines AOAC-Verfahrens und einer KOBRA-Zelle zur Nachsäulen-Bromierung analysiert. Fumonisinproben wurden mit Methanol/Wasser (3/1) extrahiert und auch nach der AOAC-Methode

analysiert. Zearealenonproben wurden ebenfalls mit Acetonitril/Wasser extrahiert und unter Verwendung des LC-MS/MS-Verfahrens analysiert. Hinweis: Die in den beiden Diagrammen dargestellten Daten sind etwas redundant. Wir halten es jedoch für sinnvoll, den Variationskoeffizienten in einem separaten Diagramm darzustellen. Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass sowohl Mahlgröße als auch Probengröße die Genauigkeit der Analyse beeinflussen. Die Studie legt nahe, dass AFLA und ZON einen höheren Grad an Abhängigkeit (d. h. einen höheren CV) gegenüber Probenvolumen und Mahlgröße aufweisen als FUM. Doch wir zögern, aus diesen einzelnen Studien eine feste Schlussfolgerung zu ziehen. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um unsere Beobachtung zu bestätigen. Bei Probengrößen von 1 g und 5 g war die RSD für AFLA, FUM und ZON höher als bei Probengrößen von 10 g und 25 g. Die Variabilität der mit AFLA

Abbildung 5: Der Einfluss von Mahlgrad und Probengröße auf die analytische Variabilität von Desoxynivalenol in Gerste. Einzelne Extrakte (n = 10) bei verschiedenen Kombinationen von Maschenweite und Probengröße wurden unter Verwendung von LC-MS/MS analysiert. Die gemittelten Ergebnisse der Standardabweichung wurden in der Grafik (A) dargestellt und der CV in % berechnet und als Liniendiagramm (B) dargestellt [6].

Deoxynivalenol

A 4.50

Deoxynivalenol-Konzentration in ppm

4.00

n 1 Gramm n 5 Gramm n 10 Gramm n 25 Gramm

3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 0.00

50 % passen durch 10 Mesh

50 % passen durch 20 Mesh

95 % passen durch 20 Mesh

95 % passen durch 30 Mesh

Variationskoeffizient (CV) 50

CV [in %] für Deoxynivalenol in Gerste

Bei 10 Mesh gehen 50 % durch

Bei 20 Mesh gehen 50 % durch

Bei 20 Mesh gehen 95 % durch

Bei 30 Mesh gehen 95 % durch

30 25 20 15 10 5 0

1 Gramm

5 Gramm

10 Gramm

PROBENMENGE in GRAMM für die EXTRAKTION

25 Gramm

Spot On Ausgabe 13

kontaminierten 10 g-Maisprobe verringerte sich von 58,9 % (grob gemahlen) auf 9,3 % (fein gemahlen), für FUM von 39,8 % (grob gemahlen) auf 4,6 % (fein gemahlen) und für ZON von 21 % (grob gemahlen) bis 2 % (fein gemahlen). Diese Ergebnisse bestätigen die Auswirkung der Mahlgröße auf die analytische Varianz und Genauigkeit in Bezug auf die Mykotoxinextraktion und -analyse bei Körnern. Brunkhorst et al. haben ihre Ergebnisse verdeutlicht und den Deoxynivalenol-Gehalt in natürlich kontaminierten Gerstenproben bestimmt. Die Gerstenproben wurden mit vier verschiedene Maschengrößen gemahlen, mit Acetonitril/ Wasser (84/16) extrahiert (10 Einzelextrakte bei jeder Maschenweite und Probengröße) und mittels LC-MS-MS analysiert (Abbildung 5). Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass die analytische Variabilität verringert wird, wenn Proben einen feineren Mahlgrad erreichen. Darüber hinaus trägt eine Erhöhung der Probengröße dazu bei, die analytische Variabilität zu verringern. Der Variationskoeffizient konnte bei Verwendung einer 10 g-Probe mit einem Nr. 10 Sieb von 11 % auf nur 5 % reduziert werden. Eine Probengröße von 10 g und 25 g in Kombination mit einem Nr. 20 Sieb (95 %) und Nr. 30 Sieb (95 %) liefern genaue und präzise Ergebnisse und reduzieren den CV auf 5 % bzw. 3 %. Da in dieser Studie Gerste anstelle von Mais verwendet wurde, deutet dies darauf hin, dass der Einfluss der Probengröße und des Mahlens auf die analytische Variabilität von Mykotoxinen nicht matrixabhängig ist. Weitere konnten dies bestätigen [6].

Schlussfolgerung: Sieben, mischen, nach Bedarf wiederholen Die Bedeutung des Mahlens und der Probengröße sowie die deren Auswirkungen auf die Verringerung der Variabilität und die Minimierung von Fehlern während der Mykotoxinanalyse sind offensichtlich. In den oben erwähnten Studien wurden signifikante Unterschiede zwischen grob und fein gemahlenen Proben aus derselben Quelle mit demselben Kontaminationsgrad beobachtet. Über die Beobachtung der Variation hinaus geben die Daten aus diesen Studien erste Hinweise auf den Probenumfang und die Vermahlung. Bei der Probengröße haben sich 10 g als ausreichend erwiesen, während 25 g eine noch größere Genauigkeit bieten können. Bei Verwendung eines Nr. 20 Siebs sollten 95 % der Probe durchgelassen werden. Bei Verwendung eines Nr. 30 Siebs sollten 100 % durchgehen. Das Hauptziel der Mykotoxinanalyse besteht darin, trotz der Schwierigkeiten bei der Probenahme und der Komplexität der Probenvorbereitung für Getreide und Feldfrüchte genaue und zuverlässige Ergebnisse zu erhalten. Doch selbst die beste Technologie, sei es in Form von hochmodernen Schnelltests oder hochpräzisen Massenspektrometriegeräten, nützt nichts, wenn die Probe nicht repräsentativ für die untersuchte Charge ist. Eine repräsentative Stichprobe ist mehr als nur eine Stichprobe. Probenvorbereitung ist der Schlüssel. Wenn Sie die drei Schlüsselfaktoren der Probenvorbereitung (Mahlgröße, Probengröße und Homogenität) einhalten, können Sie Ihre RSD bei <10 % halten und so die Vertrauenswürdigkeit Ihres Analyseergebnisses erhöhen.

Bei der Probengröße haben sich 10 g als ausreichend erwiesen, während 25 g eine noch größere Genauigkeit bieten können.

References 1) E. Pilcher: Sampling for mycotoxins – do we care enough? Romer Labs. 2016, https://www.romerlabs.com/en/ knowledge-center/knowledge-library/articles/news/sampling-for-mycotoxins-do-we-care-enough/ 2) J. Brunkhorst: Effects of particle size and extraction size for effective mycotoxin analysis, Trilogy Analytical Laboratory, presented at AAFCO 2017 Collin L. The effect of grind and extraction size on aflatoxin variability. Trilogy Analytical Laboratory, Washington, MO 63090 3) J. Richard: Sampling and Sample Preparation for Mycotoxin Analysis. . In: Romer Labs Guide to Mycotoxins, 2. 2000 4) T.B. Whitaker ABS, M.B. Doko, B.M. Maestroni, A. Cannavan: Sampling Procedures to Detect Mycotoxins in Agricultural Commodities: Springer; 2011. 5) T.B. Whitaker FED, W. M. Hagler, F. G. Giesbrecht, J. Wu: Variability Associated with Sampling, Sample Preparation, and Chemical Testing for Aflatoxin in Farmers' Stock Peanuts. Journal of AOAC International 1994, 77(1):107 - 116. 6) V. Brunkhorst, C. Maune, J. Brunkhorst, J. Bierbaum, R. Niemeijer: Effect of grind and extraction size on deoxynivalenol result variability, Trilogy Analytical Laboratory 7) V. Brunkhorst, C. Maune, J. Brunkhorst, J. Bierbaum, R. Niemeijer: Effect of grind and extraction size on zearalenone result variability, Trilogy Analytical Laboratory 8) MFood Standards Agency. Mycotoxin sampling guide, 2016. 9) Whitaker, T.B; Slate, A.B; and Johansson, A.S. Sampling feeds for mycotoxin analysis. In: The Mycotoxin Blue Book. D.Durat, ed. Nottingham University Press, Bath, England, 2005] 10) Whitaker T.B;, Sampling Foods for Mycotoxins, Food Additives & Contaminations, 2007. 11) United States Department of Agriculture. Mycotoxin Handbook, 2015 12) Carrie K. Maune, Thomas Maune, Jordan Bierbaum, Julie Brunkhorst, Ronald Niemeijer. The effect of grind and extraction size on Fuinsin Result Variablity. Washington, MO 63090 E i n e Ve rö f fe n t l i c h u n g vo n Ro m e r L a b s ®

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