Spot On - Микотоксины: Что Вы ожидаете от экспресс методики?

13 Номер

Издание Romer Labs®

Микотоксины: Что Вы ожидаете от экспресс методики?

4 типа клиентов, делающих тесты на микотоксины. Размер частиц: Простой способ улучшить Ваше решение для извлечения и получения результатов.

ppm

pm

Photo: Sebastian LeeschEyeEm

p

Оглавление

4-7

Фотографии: Себастиан ЛишАйЕм Каким методом Вы тестируете Микотоксины?

4 типа клиентов, делающих тесты на микотоксины и их ожидания от экспресс методики Экономические потери, риски для здоровья людей и животных, все более сложная нормативно-правовая база: многообразие причин по которым производителям зерна, продуктов питания и кормов для животных необходимо проводить тестирование на микотоксины. Менеджер по коммуникациям Romer Labs Джошуа Дэвис и менеджер по работе с ключевыми клиентами Эрвин Тани рассмотрят несколько распространенных ситуаций, в которых могут помочь экспресс-тесты.

Автор: Джошуа Дэвис, менеджер по коммуникациям, Romer Labs, и Эрвин Тани, Менеджер по работе с ключевыми клиентами, Romer Labs

Spot On является Изданием Romer Labs Division Holding GmbH, распространяется бесплатно.

ISSN: 2414-2042

Редакторы: Джошуа Дэвис, Кристиан Илеа

Составители: Джошуа Дэвис, Генриетта Хоббс, Нора Когельник, Эрвин Тани Иследование: Курт Брюннер

Издатель: Romer Labs Division Holding GmbH Erber Campus 1 3131 Getzersdorf, Austria Tel: +43 2782 803 0 www.romerlabs.com

©Copyright 2021, Romer Labs® Все права защищены. Никакая часть этой публикации не может быть воспроизведена в любой материальной форме в коммерческих целях без письменного разрешения владельца авторских прав. Все фотографии, представленные здесь, являются собственностью Romer Labs или используются по лицензии.

Romer Labs является частью DSM.

2

Photo: BJI

Графика: GraphX ERBER AG

8-15

Чем меньше, тем лучше: Улучшите результаты анализа микотоксинов за счет уменьшения размера частиц Последние исследования показывают, что размер частиц в образце оказывает значительное влияние на точность методов анализа микотоксинов. Эксперты по микотоксинам Генриетта Хоббс и Нора Когельник оценивают проблему и дают несколько рекомендаций, чтобы Ваши исследования по тестированию микотоксинов были точными и надежными. Автор: Нора Когельник, менеджер по продуктам, и Генриетта Хоббс, старший научный сотрудник

Spot On Номер 13

От Редактора Быстрый, точный и удобный в использовании:

Реагирование на потребности клиентов, выполняющих тестирование на микотоксины уже 39 лет, с продолжением. С момента нашего основания в 1982 году мы в Romer Labs сделали анализ микотоксинов центральным элементом нашего бизнеса. Этот длительный период, дал нам беспрецедентное понимание не только тонкостей аналитики, но и разнообразных потребностей рынка. Недостаточно просто разработать продукт или услугу, которые работают. Они должны работать в направлении выполнения конкретных требований заказчика. Или, говоря по-другому: точность не должна быть достигнута за счет удобства использования. Когда мы начали работать над системой AgraStrip® PRO WATEX® мы обратились к тем, кто ежедневно пользуется нашими продуктами: к нашим сервисным лабораториям, нашим группам технической поддержки и, конечно же, к нашим клиентам. Мы спросили их: “Для чего Вам нужен экспресс-тест на месте? С какими проблемами Вы сталкиваетесь ежедневно?” От испытаний в таких разнообразных условиях, как зерновые элеваторы в Бразилии, заводы по производству кукурузного крахмала в Европе и производители кормов для домашних животных в США, мы постоянно слышали один ответ: “Почему тестирование на микотоксины не может быть более удобным для пользователя?” Таким образом, гарантируя, что мы улучшили стандарты чувствительности и скорость, мы посвятили свои усилия оптимизации процесса и решению проблем, которые беспокоят тестирующих на микотоксины клиентов. Каков результат? ИХА с низким уровнем Предела Определения и новым прибором AgraVision™ PRO, который выполняет большую часть работы, которую раньше выполняли лаборанты, контролируя время, температуру и скорость потока тестируемого образца. Благодаря 7-дюймовому сенсорному экрану и 4-м независимо работающим тестовым слотам прибор AgraVision™ PRO - это наш способ обеспечить для тестирующих микотоксины клиентов, высокую производительность, а также уверенность в полученных результатах. В этом выпуске Spot On мы освещаем некоторые проблемы, которые позволяют беспокоится нашим тестирующим на микотоксины клиентам за полученный результат. Наш менеджер по работе с ключевыми клиентами Эрвин Тани используя свой многолетний опыт, определит четыре типа Клиентов, тестирующих на Микотоксины и их ожидания от Экспресс методики. Менеджер по продуктам Нора Когельник затем объединившись со старшим научным сотрудником Генриеттой Хоббс, рассмотрит конкретную проблему, связанную с подготовкой образцов: влияние размера зерна образцов на извлечение и выявление микотоксинов. Они прольют новый свет на эту часто упускаемую из виду тему и покажут как всего несколько корректировок могут повысить точность тестирования. Я надеюсь, что вам понравится этот выпуск Spot On.

Клаус Хаслер Управляющий директор, Romer Labs Diagnostic GmbH

A om R maegra Lz ianbes ®o fПR у бo лmиeкrа ц La и bи s ®

3

m p p 4

Spot On Issue 13

Каким методом Вы тестируете Микотоксины?

4 типа Клиентов, тестирующих на Микотоксины и их ожидания от Экспресс методики. Экономические потери, риски для здоровья людей и животных, все более сложная нормативноправовая база: многообразие причин, по которым производителям зерна, продуктов питания и кормов для животных необходимо проводить тестирование на микотоксины. Джошуа Дэвис, менеджер по коммуникациям, Romer Labs, и Эрвин Тани, Менеджер по работе с ключевыми клиентами, Romer Labs

Romer Labs® Публикации

5

Технология тест полосок (ИХА) оказалась универсальной и достаточно надежной для использования на месте и достаточно точной, во многих случаях, чтобы заменить необходимость в лабораторных методах.

Микотоксины: растущая угроза

Экономический ущерб, который можно отнести к микотоксинам, растет: по оценкам ФАО, 25 % мирового сельскохозяйственного производства загрязнено микотоксинами. Эти токсичные соединения могут вызывать проблемы со здоровьем как у людей, так и у животных, начиная от рака и заканчивая заболеваниями печени, почек, нервной системы, гормональной системы и многого другого. Известно даже, что некоторые микотоксины подавляют иммунную систему. По мере расширения наших знаний о микотоксинах растут и нормативные ограничения на их содержание в сырье, кормах для животных и продуктах питания. Эти ограничения, в свою очередь, привели к появлению множества методик и продуктов, предназначенных для обнаружения микотоксинов и предотвращения ущерба, который они наносят здоровью и бизнесу. Из имеющихся в нашем распоряжении инструментов решения для быстрого обнаружения микотоксинов, основанные на технологии тест полосок (ИХА), зарекомендовали себя как универсальные и достаточно надежные для использования на месте и во многих случаях достаточно точные, чтобы заменить необходимость в лабораторных методах. На протяжении многих лет мы работаем с производителями и компаниями, торгующими зерном и кормами по всему миру, помогая им внедрять инструменты обнаружения микотоксинов в пунктах приема сырья, зернохранилищах, комбикормовых заводах и других местах, где им нужны быстрые и точные результаты определения микотоксинов. В этой статье мы обсудим компании четырёх различных направлений, которым нужны решения для быстрого тестирования по смежным, но разным причинам. Мы надеемся, что те из Вас, кто прочитает эту статью и узнает себя в одной из этих четырех ролей, смогут немного узнать о том, как решения для быстрого тестирования могут помочь Вам в Вашей программе обнаружения микотоксинов.

#1: Продавец зерна (поступающее сырье)

Одной из наиболее важных критических точек тестирования в пищевой цепочке является приемка сырья; нам нравится думать о тех, кто играет эту важную роль, как о “Продавцах зерна”. Продавец зерна решает, принимать, отклонять или каким иным образом разделять партии, чаще всего сырого зерна, на основе их уровня загрязнения микотоксинами. Продавцы Зерна нуждаются в методах тестирования, которые отвечают их очень специфическим требованиям. Для продавца зерна решающее значение имеет время получения результата, поскольку каждый участник цепочки поставок ждет этого решения. В течение нескольких минут водители грузовиков или железнодорожные операторы должны знать, могут ли они выгружать свои грузы, и если да, то где они должны быть выгружены. Те, кто находится дальше по линии поставок, например, те, кто ожидает хранения или дальнейшей обработки зерна, также полагаются на продавца зерна, чтобы принять быстрое и точное решение. Метод тестирования также должен быть простым, чтобы зерновики могли легко обучиться

6

и уверенно работать. Эта простота необходима, так как у них уже есть много других параметров, которые необходимо измерить: влажность, чистота и содержание белка - это всего лишь несколько примеров, помимо микотоксинов, которые им необходимо измерить в течение короткого периода времени. Прием сырья также требует надежности системы - от методики до оборудования. Прием зерна и очистка, которые происходят на приёмке, производит гораздо больше пыли по сравнению со стандартной лабораторной обстановкой. Кроме того, температура окружающей среды может сильно варьироваться в зависимости от погодных условий во время уборки зерна. Оборудование для тестирования должно быть соответственно устойчивым к этим суровым условиям. Столкнувшись со всеми этими проблемами, продавцам зерна необходим удобный способ получения результатов. Раньше было достаточно считывать результаты с тест-полосок или дисплея прибора и записывать их вручную в журнал. В наши дни, подключения и перенос данных является обязательным условием: результаты должны быть легко переносимыми в компьютерные системы, включая платформы LIMS и ERP.

#2: Высококлассные специалисты по тестированию (Контроль качества для продуктов высокой степени очистки)

Как и продавцы зерна, тем, кто осуществляет контроль качества продуктов высокой очистки, таких как лимонная кислота, крахмал, кукурузный сироп с высоким содержанием фруктозы и другие биоразлагаемые ингредиенты природного происхождения, нужны надежные и быстрые методики для тестирования на наличие микотоксинов. И все же, их требования не могут значительно отличаться: у них, как правило, нет нехватки времени, которое возникает, когда грузовики ожидают разгрузки продукции в пунктах приема, и они часто пользуются преимуществами лабораторных возможностей и обученного персонала. В основном это связано с высокими требованиями к производству ингредиентов, они следят за точностью; мы условно называем их “профессионалами в тестировании". Хотя они могут иметь возможность использовать аналитические методы, такие как ВЭЖХ или масс-спектрометрия, профессионалы часто предпочитают экспресс-тест на микотоксины изза его простоты и универсальности. Увеличение объема проводимых тестов с помощью наборов для экспресс-анализов, освобождает более сложное оборудование и рабочее время для других необходимых лабораторных работ.

#3: Полицейский по микотоксинам (соблюдение правил и пороговых значений)

Оба типа, продавцы зерна и профессионалы по тестированию, как правило, занимаются своей работой в бизнесе, торговле сырьем или производством товаров из этого сырья. Те, кто играет нашу третью роль, как правило, не обращают Spot On Номер 13

внимания на конечную цель бизнеса; они следят за тем, чтобы правила соблюдались должным образом. Часто нанимаемые сертификационными компаниями или регулирующими органами, их работа заключается в обеспечении соблюдения пороговых значений микотоксинов и сертификации перевозок железнодорожным или автомобильным транспортом. Условно назовём тех, кто играет эту важную роль, “микотоксиновыми полицейскими”. Полицейские по микотоксинам почти всегда работают вдали от традиционной лабораторной среды; во всяком случае, их лаборатория ограничена тем, что они могут поместить в багажник своей машины. Они обслуживают поезда, направляющиеся в отдаленные районы, чтобы обеспечить соблюдение нормативов. Часто работая вдали от коммерческих центров, подключение к Интернету порой является роскошью, не всегда доступной для них. Им часто не хватает оборудования для измельчения, доступного для продавцов зерна, и им приходится полагаться на кофемолки, чтобы получить образцы для тестирования. Хотя сложное лабораторное оборудование не подходит для анализа Микотоксиновых Полицейских, подойдет и не любая экспресс методика для тестирования. Помимо основных требований к чувствительности, точности и удобству использования, тест-полоски и приборы должны быть в состоянии поддерживать качество работы, несмотря на постоянное нахождение в движении. Мобильность является главной проблемой, поскольку специальное оборудование, такое как адаптеры питания и аккумуляторы, позволяют Микотоксиновым Полицейским перемещаться туда, где они больше всего необходимы.

#4: Защитник животных (программа управления рисками микотоксинов)

Для тех, кто играет эту последнюю обсуждаемую роль в экспресс-тестировании, здоровье животных, находящихся на их попечении, имеет первостепенное значение. “Защитники животных” следят за тем, чтобы корм, который получают их животные, был полезным и находился в пределах допустимых нормативных пороговых значений концентрации микотоксинов. Тем не менее, правила-это только часть истории; рекомендации ветеринаров часто могут привести к гораздо более строгим пороговым значениям, чем официальные. «Защитник животных» знает, что для управления риском микотоксинов в корме он или она сначала должны измерить этот риск. Концентрация микотоксина в определенной партии корма или кормовых ингредиентов даст полезную информацию о видах животных, для которых он может быть использован—или может ли он быть использован вообще. По нашему опыту «Защитник животных» не всегда может дождаться результатов из лаборатории по микотоксинам, прежде чем принимать решение о том, как много использовать или следует ли использовать – кормовую добавку, такую как дезактиватор микотоксинов. Экспресс-тесты помогают «Защитнику животных» защитить домашний скот от вредного воздействия микотоксинов, обеспечивая при этом своевременное удовлетворение потребностей Romer Labs® Публикации

домашнего скота в питании.

Вывод: Универсальная потребность в скорости (и чувствительности, и в удобстве пользования, и точности)

Продавец Зерна, Высококлассный специалист по тестированию, Микотоксиновый полицейский, Защитник животных: все эти виды «охотников» за микотоксинами имеют несколько основных требований к решению по экспресс тестированию микотоксинов. С КО Р О С Т Ь. Проверяющим нельзя терять времени. Может быть, Вы Продавец зерна с грузовиками, ожидающими, когда Вы скажете им, разгружать их и где, или, может быть, Вы фрилансер-микотоксиновый полицейский, который должен протестировать, сертифицировать (или нет) и спешить в следующее место. Все равно Вам необходима тест система, которая позволяет провести “Быстрое” экспресс-тестирование. ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ. Всем Проверяющим нужна тест система, которая может выдавать результаты вплоть до низких уровней концентрации, требуемых регулирующими органами. Некоторые проверяющие могут иметь дело с внутренними пороговыми значениями, более жесткими, чем у регулирующих органов. Если это касается Вас, то Вам необходимо убедиться, что любая тест система, которую Вы рассматриваете, имеет Предел Определения, соответствующий Вашим требованиям, и проверена на соответствие матрице или матрицам, которые Вам нужно протестировать. УДОБСТВО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ. Что делает систему экспресс тестирования удобной для пользователя? Все клиенты постоянно упоминают одно главное требование, которое делает методику пригодной для использования: упрощенный рабочий процесс. Когда Вы учитываете потребности, скажем, Защитника животных, которому приходится решать несколько различных задач, рабочий процесс с минимальным количеством операций является обязательным. Мы бы только добавили, что рабочий процессэто только часть истории: большой и интуитивно понятный пользовательский интерфейс на приборе также значительно облегчает жизнь всем проверяющим. ТОЧНОСТЬ. По очевидным причинам никто ни в одной из этих групп не может согласиться с использованием системы экспресс тестирования, которая дает ненадежные результаты. Например, узкоспециализированная работа, связанная с производством рафинированных продуктов, таких как DDGS(высушенная барда), не может позволить себе испортиться из-за неприемлемого уровня микотоксинов. В конечном счете, независимо от роли, которую мы могли бы сыграть в обнаружении микотоксинов, мы руководствуемся одним императивом: поддерживать наши продукты питания и корма на приемлемом уровне. Решения для быстрого тестирования микотоксинов по-прежнему будут незаменимыми инструментами для выполнения этой задачи.

Что делает систему экспресс тестирования удобной для пользователя? Большой и интуитивно понятный пользовательский интерфейс на приборе имеет большое значение.

7

8

Spot On Номер 13

Чем Мельче, тем Лучше:

Улучшение Результатов

Анализа Микотоксинов за счет Уменьшения

Размера Частиц Последние

исследования

показывают,

что размер частиц в образце оказывает

значительное влияние на точность методов анализа

микотоксинов.

Эксперты

по

микотоксинам Генриетта Хоббс и Нора Когельник оценивают проблему и предлагают несколько рекомендаций, чтобы Ваши операции по тестированию на микотоксины были точными и надежными.

Генриетта Хоббс, Доктор Химии, старший научный сотрудник, и

Photo: BJI

Нора Когельник, Доктор Химии, Менеджер по продуктам

Romer Labs® Публикации

9

Отбор проб и подготовка пробсложные процессы, изобилующие потенциальными подводными камнями; каждый этап процесса подготовки проб вносит уровень отклонения, который способствует общему отклонению значения в рамках одного аналитического результата.

В

аналитическом сообществе микотоксинов мы обычно работаем с тремя основными процедурными этапами, когда речь заходит о сельскохозяйственных продуктах, таких как кукуруза, пшеница и ячмень: отбор проб, подготовка проб и анализ. Чтобы определить концентрацию микотоксина, присутствующего в объемной партии, мы должны проанализировать меньшую, но все же репрезентативную часть этой партии; это означает, что надежные результаты невозможны без надлежащего плана отбора проб, который включает в себя отбор дополнительных образцов партии и объединение их в подвыборку (также известную как массовая выборка). Это формирует основу, которая гарантирует, что образец, подлежащий тестированию, действительно является репрезентативным для всей партии. Отсюда наше внимание обращаем к подготовке образцов. Для продуктов на основе зерна подготовка образца состоит из двух важных этапов, измельчения образца и подвыборки: 1) мельница или другое устройство используется для измельчения зерна в объемной пробе для уменьшения размера частиц и обеспечения однородности; 2) из этого образца мы получаем подвыборку, представляющую всю партию, которую затем тестируем. Этот тестовый образец впоследствии подготавливается для извлечения в соответствии с определенным протоколом [10]. Тем не менее отбор проб и подготовка образцов являются сложными процессами, изобилующими потенциальными ловушками; каждый шаг в процессе подготовки образца вводит уровень отклонения, который способствует общему отклонению в рамках одного аналитического

Рисунок 1. Отклонения, наблюдаемые во время отбора проб (61 %), подготовки пробы (36 %) и тестирования (3 %) для образца, загрязненного variation for 20 ppb AFLA. Total Адаптировано из observed [2].

3+36+61

Выборка Sampling 6161% %

10

Сделайте репрезентативную выборку Когда продукт естественным образом загрязнен микотоксинами, загрязненные зёрна, как правило, неравномерно распределяются по определенной партии; эти группы загрязненных зёрен известны как “горячие точки”. Чтобы обеспечить точное представление о степени загрязнения в партии, план отбора проб должен учитывать случайное распределение таких горячих точек. Это делается путем взятия большого количества небольших поэтапных образцов из различных мест, распределенных по всей партии, чтобы получить Рисунок 2: Процедура отбора образцов для получения репрезентативной тестовой пробы из партии большого объёма, где масса пробы представляет собой собранное множество более мелких проб, взятых из разных мест. “Разделитель” дополнительно разделяет образец большого объема на отдельные тестовые образцы [10].

Партия

a 20 ppb AFLA corn sample

Тестирование Analysis 3%3 %

результата [2, 5]. Многочисленные исследования показали, что две трети наблюдаемых отклонений являются результатом метода отбора проб, причем одна треть связана с тем, как подготавливается образец. Гораздо меньший процент отклонений связан с применяемым аналитическим методом (рисунок 1). Соответственно, достоверность результата зависит от того, в какой степени мы учитываем эти три фактора. В то время как многочисленные исследования описывают важность методов отбора проб и аналитических растворителей и их влияние на обнаружение микотоксинов (см.

[1, 2, 4] для показательных примеров), в этой статье будет рассмотрена важность подготовки образцов, т. е. измельчения и размера образца, и, обобщая последние исследования по этому вопросу, обсудим влияние подготовки образцов на точность анализа микотоксинов и расхождения образцов [10].

Подготовка пробы Sample 36 % preparation 36%

Дополнение Крупный Образец Делитель Тестовый Образец Spot On Номер 13

репрезентативную выборку (рисунок 2) [8]. Отбор поэтапных образцов из насыпной партии имеет решающее значение для того, чтобы дать всем зернам равные шансы на отбор, тем самым уменьшая систематическую погрешность [10].

Измельчите, чтобы обеспечить равномерный размер частиц Плесень, вырабатывающая микотоксины, имеет несколько различных путей заражения; в результате микотоксины могут быть обнаружены как внутри зерен, так и на поверхности. Путь заражения зависит от микотоксина и рассматриваемого зерна. Хорошо известно, что некоторые грибы, продуцирующие микотоксины, такие как фузариоз, присутствуют внутри зерна или ядра, в то время как другие, такие как аспергилл, присутствуют на поверхности. Равномерное измельчение образца решает эту проблему, измельчая зараженные ядра и обеспечивая равномерное распределение частиц. Это в конечном счете улучшает обнаружение зараженных частиц [3].

Гомогенизируйте потенциальное распределение микотоксинов, пропуская зерно через сито и перемешивая После выбора образца, который должен представлять частички из всей тестируемой партии, и его измельчения, для обеспечения однородного размера частиц, образец необходимо гомогенизировать путем тщательного перемешивания; это также помогает сделать его репрезентативным для всей массы образца [3]. Зерна разделяются по размеру, что снижает степень репрезентативности образца и приводит к неточному аналитическому результату. По этой причине перед смешиванием частей образца (прошедших и не прошедших через сито)

мы подтверждаем, что однородность помола достаточна, пропуская образец помола через сетку или сито. Цель состоит не в том, чтобы отфильтровать более крупные частицы, поскольку они также могут содержать микотоксины; напротив, эти более крупные частицы должны быть включены в образец. Скорее, мы обеспечиваем равномерность помола, проверяя, что определенный процент частиц способен проходить через него. Министерство сельского хозяйства США-FGIS, например, установило технические требования к размеру образца, размолу образца и подвыборке для афлатоксина, дезоксиниваленола, фумонизина, охратоксина и зеараленона [9]. USDA-FGIS рекомендует измельчить образец таким образом, чтобы 60 – 75 % частиц проходили через сито № 20, и чтобы для извлечения микотоксина использовался тестовый образец массой 50 г (включая частицы, которые не проходят через сито).

Цель прохождения

Сохраняйте размер зерна небольшим, размер выборки большим, а результаты по микотоксинам точными

микотоксины;

Мы используем термины “достоверность” и “воспроизводимость” на протяжении всей этой статьи, поэтому здесь уместно краткое определение этих терминов: достоверность и воспроизводимость означают неопределенности, связанные с анализом, которые могут быть введены в результате первоначального способа подготовки исходного образца или плана его подготовки к тестированию. Достоверность определяется, как близость полученного значения к истинному значению, в то время как воспроизводимость определяется как близость полученных значений друг к другу. В этом случае, конечной целью должно быть внедрение процесса, обеспечивающего как высокую достоверность, так и высокую воспроизводимость [10]. Исследования показывают, что воспроизводимость

более крупные

перемолотого образца через сетку состоит не в том, чтобы убрать из тестирования более крупные частицы, поскольку они также могут содержать

напротив, эти

частицы должны быть включены в пробу.

Таблица 3: Влияние размера частиц и образца на уровни афлатоксина в естественно загрязненных образцах кукурузы [9]. Номер образца 1

60 % размер сита № 20 50 г

10 г

50 г

10 г

91

151

140

149

160

167

136

136

135

151

222

4

217

5 6

7

8

Образец из молотковой мельницы

10 г

2 3

99 % размер сита № 20

135 95

86

108

125 110 123 139

111

115

154 138 155 141

147 167

148 144 151

140 148

149

154 155 156 153

162 171

Среднее значение (ppb)

140

126

147

145

158

RSD (%)

40

12

7

4

4

SD (ppb)

56

Romer Labs® Публикации

15

11

5

7

11

Исследования показывают, что точность метода обнаружения микотоксинов и, следовательно, разброс результатов в значительной степени зависят от размера частиц в образце.

метода обнаружения микотоксинов и, следовательно, разброс результатов в значительной степени зависят от размера частиц в образце. Чтобы продемонстрировать отклонение измерений, связанные с размером частиц в образце и размером анализируемого образца, мы ссылаемся на несколько исследований, в которых это оценивалось (рис. 3 и рис. 4). В первом исследовании, проведенном Уитакером и др. (показано на рисунке 3) были охарактеризованы образцы кукурузы, естественно загрязненные афлатоксином. Образцы зерен разного размера впоследствии пропускали через № 20 сито: 1). грубого помола (60 % прошедших через сито частиц), 2). мелкого помола (99 % прошедших через сито частиц) и 3). порошкообразное (после молотковой мельницы). Затем восемь образцов из каждого интервала помола были проанализированы с использованием модифицированного эталонного метода ВЭЖХ, чтобы продемонстрировать межпробное отклонение образца в пределах одного основного состояния [9]. Как Вы можете видеть в таблице 3, существуют различия в результатах анализа в зависимости как от размера образца, так и от размера помола. Тем не менее, как мы можем количественно оценить эти

отклонения таким образом, чтобы это было полезно для нас? Относительное стандартное отклонение (RSD) или коэффициент вариации (CV) часто используются для определения того, насколько различны результаты в конкретном наборе данных.

RSD часто объявляется в процентах и определяется отношением стандартного отклонения к среднему значению. Чем ниже стандартное отклонение, тем меньше отклонений в наборе данных и тем точнее результат. В данных исследованиях представленных в таблице 3, наблюдалась значительное отклонение между образцами по 10 г, состоящими из частиц разного размера. 10 г образцов грубого помола показывают на 40 % самый высокий RSD по сравнению с образцом более мелкого помола (99 % прохождения образца, через сито №20), при расчетном RSD 7 %. Самый низкий RSD, 4 %, был достигнут с порошкообразными образцами из молотковой мельницы. Хотя молотковая мельница, как правило, не может браться в расчёт для среднего класса лаборатории, исследование Уитакера и др. демонстрирует, что лучший способ избежать отклонений, возникающих при подготовке образца, - это мелкий помол и использование сетки для

Рисунок 4: Влияние размера помола (измельчения) и размера образца (1 г, 5г , 10 г, 25 г) на аналитическое отклонение. Отдельные экстракты (n=10) различных комбинаций размера сита и размера образца были проанализированы на содержание общего афлатоксина (A, B), общего фумонизина (C, D) и зеараленона (E, F) в естественно зараженной кукурузе. Для характеристики образцов использовались эталонные методы. Результаты были усреднены, было рассчитано стандартное отклонение и представлено на графиках A, C и E. Кроме того, было определено CV в % и представлено в виде линейного графика на рисунках B, D и F. (Адаптировано с разрешения авторов [2, 7, 12].)

Общий Афлатоксин

A Концентрация Общего Афлатоксина [в ppb]

400

n 1 грамм n 5 грамм n 10 грамм n 25 грамм

350 300 250 200 150 100 50 0

B CV [в%] для общего Афлатоксина

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

12

52.8 % прошло через ячейку 10

51.3 % прошло через ячейку 20

97.1 % прошло через ячейку 20

Коэффициент Вариации (CV)

100 % прошло через ячейку 30

Ячейка 10 прошло 52.8 % Ячейка 20 прошло 51.3 % Ячейка 20 прошло 97.1 % Ячейка 30 прошло 100 %

1 грамм

5 грамм

10 грамм

Граммов образца использованных для Экстракции

25 грамм

Spot On Номер 13

Чем ниже

Общий Фумонизин 9

Концентрация Общего Фумонизина [в ppm]

C

n 1 грамм n 5 грамм n 10 грамм n 25 грамм

8 7

стандартное отклонение, тем меньше

6 5

отклонений

4

в получаемых

3

данных и тем

2 1

надежнее

0

50 % прошло через ячейку 10

D

50 % прошло через ячейку 20

95 % прошло через ячейку 20

95 % прошло через ячейку 30

результат.

Коэффициент Вариации (CV)

CV [в %] для Общего Фумонизина

120

Ячейка 10 прошло 50 %

100

Ячейка 20 прошло 50 %

80

Ячейка 20 прошло 95 %

60

Ячейка 30 прошло 95 %

40 20 0

1 грамм

5 грамм

10 грамм

Граммов Образца использованных для Экстракции

25 грамм

Зеараленон 2500

Концентрация Зеараленона [в ppb]

E

n 1 грамм n 5 грамм n 10 грамм n 25 грамм

2000 1500 1000 500 0

50 % прошло через ячейку 10

F

50 % прошло через ячейку 20

95 % прошло через ячейку 20

100 % прошло через ячейку 30

Коэффициент Вариации (CV) Ячейка 10 прошло 50 % Ячейка 20 прошло 50 % Ячейка 20 прошло 95 % Ячейка 30 прошло 100 %

CV [в %] для Зеараленона

50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

1 грамм

Romer Labs® Публикации

5 грамм

10 грамм

ГРАММ образца использованных для экстракции

25 грамм

13

Результаты ясно демонстрируют, что аналитический разброс может быть уменьшен, когда образцы измельчаются для прохождения через более мелкую сетку.

обеспечения однородности размера частиц [9]. Чтобы дополнительно продемонстрировать влияние размера частиц (измельчения) и размера образца на аналитическое отклонение между различными микотоксинами, Брункхорст и др. провели анализ образцов кукурузы, естественно загрязненных, либо общим афлатоксином (сумма В1, В2, G1 и G2), либо общим фумонизином (сумма В1, В2 и В3), либо зеареленоном (рисунок 4). Для этого исследования 10 образцов кукурузы для каждого микотоксина были измельчены до различных размеров частиц, чтобы они могли проходить через сито № 10, сито № 20 или сито № 30. Также были дополнительно исследованы отличия различных размеров образцов (1 г, 5 г, 10 г и 25 г) для экстракции. Образцы афлатоксина экстрагировали ацетонитрилом/водой (84/16) и анализировали с использованием метода AOAC и ячейки КОБРЫ для после колоночного бромирования. Образцы фумонизина экстрагировали метанолом/водой (3/1), и также анализировали по методу AOAC. Образцы

зеараленона также экстрагировали ацетонитрилом/ водой и анализировали с помощью LC-MS/MS. Примечание: Данные, показанные на каждой паре графиков, несколько избыточны. Однако мы считаем полезным представить коэффициент вариации (CV) в каждом отдельном графике. Результаты ясно показывают, что размер помола и размер образца влияют на точность анализа. Исследование показывает, что АФЛА и ЗОН демонстрируют более высокую степень зависимости (т. е. более высокий CV) от объема выборки и размера помола, чем FUM, хотя мы не решаемся сделать однозначный вывод из этих отдельных исследований; для подтверждения нашего наблюдения необходимы дополнительные исследования. Для размеров образцов 1 г и 5 г значения RSDS для АФЛА, ФУМ и ЗОН были выше по сравнению с размерами образцов 10 г и 25 г. Отклонения, наблюдаемые для 10-граммового образца кукурузы, загрязненного АФЛА, снизились с 58,9 % (грубого

Рисунок 5: Влияние помола и размера образца на аналитическое отклонение дезоксиниваленола в ячмене. Отдельные экстракты (n= 10) при различных сочетаниях размера сита и размера образца, были проанализированы с использованием LC-MS/MS. Результаты, в которых было определено усредненное стандартное отклонение, представлены на графике (А), а CV в % был рассчитан и представлен в виде линейного графика (Б) [6].

Деоксиниваленол

A Деоксиниваленол Концентрация в ppm

4.50 4.00

n 1 грамм n 5 грамм n 10 грамм n 25 грамм

3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 0.00

50 % прошло через ячейку 10

B

50 % прошло через ячейку 20

95 % прошло через ячейку 20

95 % прошло через ячейку 30

Коэффициент Вариации (CV)

CV [в %] для Деоксиниваленола в Ячмене

50

Ячейка 10 прошло 50 %

45

Ячейка 20 прошло 50 %

40

Ячейка 20 прошло 95 %

35

Ячейка 30 прошло 95 %

30 25 20 15 10 5 0

14

1 грамм

5 грамм

10 грамм

ГРАММ образца использовано для Экстракции

25 грамм

Spot On Номер 13

помола) до 9,3 % (мелкого помола), для ФУМ с 39,8 % (грубого помола) до 4,6 % (мелкого помола) и для ЗОН с 21 % (грубого помола) до 2 % (мелкого помола). Эти результаты еще раз подтверждают влияние размера помола на аналитическую достоверность и воспроизводимость в отношении извлечения и анализа микотоксинов в зерновых матрицах. Наконец, Брункхорст и др. дополнительно разъяснили свои выводы и определили уровни дезоксиниваленола в естественно загрязненных образцах ячменя с тем же планом исследования. Образцы ячменя измельчали до четырех различных размеров ячеек, экстрагировали (10 отдельных экстрактов на каждую ячейку и размер образца) с использованием ацетонитрила/воды (84/16) и анализировали методом LC-MS-MS (рис.5) [6]. Результаты ясно демонстрируют, что аналитическое отклонение может быть уменьшено, когда образцы измельчаются для прохождения через более мелкую ячейку сита. Кроме того, увеличение размера выборки еще больше помогает уменьшить аналитическую погрешность. Коэффициент вариации удалось снизить с 11% до всего лишь 5 % при использовании образца массой 10 г с ячейкой № 10. Размер выборки 10 г и 25 г в сочетании с ситом № 20 (95 %) и ситом № 30 (95 %) обеспечивают достоверность и воспроизводимость результатов, снижая CV до 5 % и 3 % соответственно. Поскольку в этом исследовании использовался ячмень вместо кукурузы, это позволяет предположить, что влияние размера выборки и измельчения на аналитическую погрешность микотоксинов может не зависеть от матрицы. Для подтверждения этого необходимы дальнейшие исследования [6].

Вывод: Пропустите через ячейку,

перемешайте, повторите по мере необходимости Важность измельчения образца и размера образца, а также влияние этих факторов на уменьшение отклонений и минимизацию ошибок при анализе микотоксинов, очевидна. В представленных исследованиях наблюдались значительные различия между образцами грубого и тонкого помола из одного и того же источника и с таким же уровнем загрязнения. Помимо простого наблюдения за изменениями, данные этих исследований предполагают некоторые первоначальные подходы к размеру выборки и измельчению. Что касается размера выборки, то 10 г оказалось достаточным, в то время как 25 г могут обеспечить еще большую достоверность. При использовании сита № 20 должно пройти 95 % образца. При использовании сита № 30 должно пройти 100 %. Основной целью анализа микотоксинов является получение достоверных и надежных результатов, несмотря на трудности отбора проб и сложности подготовки проб зерна и сельскохозяйственных культур. Однако даже самые лучшие технологии, будь то в виде передовых экспресс-тестов или высокоточного оборудования для массспектрометрии, не принесут пользы, если Ваш образец не является репрезентативным для исследуемой партии. Репрезентативная выборка-это нечто большее, чем просто отбор проб; подготовка образцов является ключевым фактором. Если Вы придерживаетесь трех ключевых факторов подготовки пробы (размер помола, размер пробы и однородность), Вы можете сохранить свой RSD на уровне <10 %, повышая достоверность вашего аналитического результата.

Что касается размера выборки, то 10 г оказалось достаточным, в то время как 25 г могут обеспечить еще большую точность.

Использованная Литература 1) Э. Пилчер: Отбор проб на микотоксины – достаточно ли нас это волнует? Лаборатории Ромера. 2016, https://www.romerlabs.com/en/knowledge-center/knowledge-library/articles/news/sampling-for-mycotoxinsdo-we-care-enough/ 2) J. Брункхорст: Влияние размера частиц и размера экстракции для эффективного анализа микотоксинов, Аналитическая лаборатория Trilogy, представленная на AAFCO 2017 Collin L. Влияние измельчения и размера экстракции на изменчивость афлатоксина. Аналитическая лаборатория Трилогии, Вашингтон, Миссури, 63090 3) Дж. Ричард: Отбор проб и подготовка проб для анализа микотоксинов. В: Руководство Romer Labs по микотоксинам, 2. 2000 4) Т. Б. Уитакер АБС, М. Б. Доко, Б. М. Маэстрони, А. Каннаван: Процедуры отбора проб для выявления микотоксинов в сельскохозяйственной продукции: Springer; 2011.

5) Т. Б. Уитакер ФЕД, У. М. Хаглер, Ф. Г. Гисбрехт, Дж. Ву: Вариабельность, связанная с отбором проб, подготовкой проб и химическим тестированием на афлатоксин в арахисе фермерского скота. Журнал AOAC International 1994, 77(1):107 - 116.

6) В. Брункхорст, К. Мон, Дж. Брункхорст, Дж. Бирбаум, Р. Нимейер: Влияние размера измельчения и экстракции на изменчивость результатов дезоксиниваленола, Аналитическая лаборатория Трилогии 7) В. Брункхорст, К. Мон, Дж. Брункхорст, Дж. Бирбаум, Р. Нимейер: Влияние размера помола и экстракции на изменчивость результатов зеараленона, Аналитическая лаборатория Трилогии 8) Агентство по стандартам MFood. Руководство по отбору проб микотоксинов, 2016.

9) Уитакер, Т. Б.; Слейт, А. Б.; и Йоханссон, А. С. Отбор проб кормов для анализа микотоксинов. В: Синяя книга Микотоксинов. Д. Дюрат, изд. Издательство Ноттингемского университета, Бат, Англия, 2005] 10) Уитакер Т. Б;, Отбор проб пищевых продуктов на микотоксины, Пищевые добавки и загрязнения, 2007.

11) Министерство сельского хозяйства Соединенных Штатов. Справочник по микотоксинам, 2015 12) Кэрри К. Мон, Томас Мон, Джордан Бирбаум, Джули Бранкхорст, Рональд Нимейер. Влияние измельчения и размера экстракции на изменчивость результата Фуинсина. Вашингтон, Миссури 63090 Romer Labs® Публикации

15

Ваша копия Spot On

Не давайте микотоксинам шанса спрятаться.

Сделайте невидимое видимым с помощью нового AgraStrip® Pro WATEX® и AgraVisionTM Pro. Тест система AgraStrip® Pro WATEX® обеспечивает быстрое и простое количественное определение микотоксинов в различных сельскохозяйственных продуктах на месте. Узнайте больше на romerlabs.com

За дополнительной информацией Вы можете обратиться к нам: www.romerlabs.com | solutions@romerlabs.com

Быст р и про ое с тое тести рова н на м икот ие сины ок.