Numer 13
Publikacja Romer Labs®
Mykotoksyny: Czego oczekujesz od szybkich testów 4 typy testerów Wielkość ziaren: Prosty sposób, aby poprawić technikę pozyskiwania próbek i wiarygodność wyników?
ppm
pm
Photo: Sebastian LeeschEyeEm
p
Spis treści
4-7
Jakiego typu testerem mykotoksyn jesteś? 4 typy testerów oraz ich oczekiwania wobec szybkich testów Straty ekonomiczne, ryzyko dla zdrowia ludzi i zwierząt oraz coraz więcej skomplikowanych przepisów: jest bardzo wiele powodów dla których producenci zbóż, żywności i paszy dla zwierząt muszą testować produkty pod kątem mykotoksyn. Kierownik ds. komunikacji Romer Labs, Joshua Davis, oraz kierownik ds. kluczowych klientów, Ervin Tanyi, przeanalizowali kilka powszechnych sytuacji, w których szybkie testy stanowią rozwiązanie. Autorzy: Joshua Davis, kierownik ds. komunikacji, Romer Labs, oraz Ervin Tanyi, kierownik ds. kluczowych klientów, Romer Labs
Spot On to darmowa publikacja Romer Labs Division Holding GmbH. ISSN: 2414-2042
Redaktorzy: Joshua Davis, Cristian Ilea
Osoby współpracujące: Joshua Davis, Henriette Hobbs, Nora Kogelnik, Ervin Tanyi Badania: Kurt Brunner
Wydawca: Romer Labs Division Holding GmbH Erber Campus 1 3131 Getzersdorf, Austria Tel: +43 2782 803 0 www.romerlabs.com
©Prawa autorskie 2021, Romer Labs® Wszelkie prawa zastrzeżone. Obowiązuje zakaz reprodukowania całości oraz fragmentów niniejszej publikacji do celów handlowych bez pisemnej zgody właściciela praw autorskich.
Wszystkie zdjęcia zawarte w niniejszej publikacji należą do Romer Labs lub są wykorzystywane na licencji.
Photo: BJI
Grafika: GraphX ERBER AG
8-15
Im mniejsze, tym lepsze: Popraw wyniki analiz mykotoksyn poprzez zmniejszenie rozmiaru analizowanych cząstek Najnowsze badania naukowe pokazują, że rozmiar cząstek w próbce ma znaczący wpływ na dokładność metod analizy mykotoksyn. Ekspertki ds. mykotoksyn, Henriette Hobbs i Nora Kogelnik, prezentują to zagadnienie i proponują kilka sposobów, jak zwiększyć dokładność i rzetelność testów na obecność mykotoksyn.
Autorzy: Nora Kogelnik, kierowniczka produktu oraz Henriette Hobbs, starsza specjalistka, Romer Labs
Romer Labs jest częścią DSM.
2
Spot On Numer 13
Artykuł redakcyjny Szybko i dokładnie oraz wygodnie dla użytkownika:
odpowiedź na potrzeby testerów mykotoksyn Już od 39 lat. Od początku istnienia, czyli 1982 roku, Romer Labs stawia badania mykotoksyn w centrum swoich zainteresowań. To wieloletnie doświadczenie zapewnia nam bezkonkurencyjną wiedzę nie tylko na temat różnorodnych analiz, ale również potrzeb rynku. Nie wystarczy po prostu opracować produkt lub usługę, która dobrze działa. Trzeba jeszcze popracować nad spełnieniem konkretnych wymagań klienta. Albo inaczej mówiąc, zadbać, aby precyzja nie została uzyskana kosztem wygody użycia. Kiedy zaczęliśmy pracować nad systemem AgraStrip® Pro WATEX®, zwróciliśmy się do osób, które używają naszych produktów na co dzień: naszych laboratoriów usługowych, zespołów pomocy technicznej i oczywiście naszych klientów. Zapytaliśmy ich: „Jaki powinien być szybki test, aby spełniał Wasze potrzeby? Z jakimi trudnościami borykacie się na co dzień?” Mimo ogromnej różnorodności warunków, w jakich używano naszych produktów – począwszy od silosów zbożowych w Brazylii, poprzez fabryki skrobi kukurydzianej w Europie aż po producentów karmy dla zwierząt w USA, wszędzie powtarzała się jedna odpowiedź: „Czy nie da rady zrobić testów na obecność mykotoksyn, które będą bardziej wygodne dla użytkownika?” Dlatego oprócz zadbania o lepsze standardy czułości i szybsze tempo pracy, poświęciliśmy również wiele czasu na optymalizację procesu testowania i zadbaliśmy o problemy zgłaszane przez testerów mykotoksyn. Efekt? LFD z niskimi LOD oraz nowy czytnik AgraVision™ Pro, który wykonuje dużą część pracy, która wcześniej spoczywała na testerze, np. kontrolowanie czasu, temperatury i przepływu. Mając 7-calowy ekran dotykowy oraz 4 niezależnie działające wejścia na testy, czytnik AgraVision™ Pro to nasz sposób na zapewnienie testerom mykotoksyn doskonałych efektów oraz ogromnej wygody. W tym wydaniu Spot On rozprawimy się z kilkoma kwestiami, które leżą na sercu testerom mykotoksyn. Bazując na wieloletnim doświadczeniu, nasz kierownik ds. kluczowych klientów, Ervin Tanyi, przygotował podsumowanie na temat czterech typów łowców mykotoksyn, trudności, z którymi się borykają oraz właściwości, których oczekują od szybkich testów. Kierowniczka produktu, Nora Kogelnik, wspólnie ze starszą specjalistką Henriette Hobbs przyjrzała się konkretnym problemom związanym z przygotowaniem próbek: rozmiarom ziaren oraz wpływem tego parametru na pozyskiwanie próbek i odzysk mykotoksyn. Rzucają nowe światło na ten często pomijany problem i pokazują, jak kilka zmian może poprawić precyzję testowania. Mam nadzieję, że spodoba Wam się to wydanie Spot On.
Klaus Hasler A um P b laigkaazcijnaeRoofmReormLearb L s ®a b s ®
Dyrektor zarządzający, Romer Labs Diagnostic GmbH
3
m p p 4
Spot On Numer 13
Jakiego typu testerem mykotoksyn jesteś?
4 typy testerów oraz ich oczekiwania wobec szybkich testów Straty ekonomiczne, ryzyko dla zdrowia ludzi i zwierząt, coraz więcej skomplikowanych przepisów: jest bardzo wiele powodów dla których producenci zbóż, żywności i paszy dla zwierząt muszą testować produkty pod kątem mykotoksyn. Kierownik ds. komunikacji Romer Labs, Joshua Davis, oraz kierownik ds. kluczowych klientów, Ervin Tanyi, przeanalizowali kilka powszechnych sytuacji, w których szybkie testy stanowią rozwiązanie. Autorzy Joshua Davis, kierownik ds. komunikacji, Romer Labs, oraz Ervin Tanyi, kierownik ds. kluczowych klientów, Romer Labs
Publikacja Romer Labs®
5
Technologia LFD (przepływu lateralnego) okazała się być wystarczająco uniwersalna oraz wydajna, aby można ją zastosować w terenie oraz w wielu przypadkach na tyle dokładna, aby zastąpić metody laboratoryjne.
Mykotoksyny: rosnące zagrożenie Szkody finansowe, jakie można ponieść z powodu obecności mykotoksyn są coraz większe: FAO szacuje, że 25% światowej produkcji rolnej jest skażonej mykotoksynami. Te toksyczne związki chemiczne mogą spowodować problemy zdrowotne u ludzi i zwierząt, począwszy od nowotworów aż po choroby wątroby, nerek, układu nerwowego, układu hormonalnego i wiele innych. Mówi się, że niektóre mykotoksyny mają nawet zdolność do upośledzania układu odpornościowego. Wraz ze wzrostem naszej wiedzy na temat mykotoksyn, rosną również ograniczenia ustawowe dotyczące surowców, paszy dla zwierząt i żywności. Z kolei te ograniczenia powodują potrzebę tworzenia szeregu strategii i produktów przeznaczonych do wykrywania mykotoksyn i zapobiegania szkodom wyrządzanym przez nie zdrowiu oraz portfelowi przedsiębiorców. Wśród dostępnych nam narzędzi znajdują się roztwory do szybkiego wykrywania mykotoksyn bazujące na technologii LFD (przepływu lateralnego), która okazała się być wystarczająco uniwersalna oraz wydajna, aby można ją zastosować w terenie, oraz w wielu przypadkach na tyle dokładna, aby zastąpić metody laboratoryjne. Od wielu lat współpracujemy z producentami i sprzedawcami zbóż i paszy dla zwierząt na całym świecie, pomagając im stosować narzędzia do wykrywania mykotoksyn w punktach skupu lub odbioru surowców, silosach zbożowych, młynach paszowych i innych lokalizacjach, gdzie trzeba wykonać szybki i dokładny test na obecność mykotoksyn. W niniejszym artykule zajmiemy się czterema typami testerów, którzy potrzebują szybkich rozwiązań testujących z powiązanych, ale jednak różnych powodów. Mamy nadzieję, że osoby czytające ten artykuł rozpoznają siebie wśród jednego z tych typów i dowiedzą się nieco więcej, jak szybkie rozwiązania testujące mogą pomóc im wykrywać mykotoksyny.
Nr 1: Kowboj zbożowy (przyjmowanie surowców)
Jednym z najważniejszych i krytycznych punktów testowania w łańcuchu żywieniowym jest odbiór surowca – zdecydowaliśmy się nazwać osoby zajmujące się tym ważnym zadaniem terminem „kowbojów zbożowych”. Kowboj zbożowy decyduje, czy przyjąć, odrzucić lub ewentualnie posegregować surowiec, najczęściej ziarna zbóż, na podstawie poziomu zawartości mykotoksyn. Kowboje zbożowi potrzebują metod testowych, które spełniają bardzo konkretne, lokalne wymagania. Dla kowboja zbożowego czas upływający pomiędzy rozpoczęciem testu a uzyskaniem wyniku ma krytyczne znaczenie, gdyż każdy w łańcuchu dostaw czeka na jego decyzję. W ciągu kilku minut kierowcy pojazdów
6
ciężarowych lub operatorzy transportu kolejowego muszą wiedzieć, czy mogą rozładować surowiec, a jeśli tak – to gdzie? Podmioty na dalszym etapie łańcucha, np. przechowujące surowiec lub poddające go przetworzeniu, również polegają na ocenie naszego kowboja zbożowego, aby móc podjąć szybką i dokładną decyzję. Dlatego metoda testowania powinna być również prosta, tak aby kowboje zbożowi mogli łatwo poznać wynik oraz działać z dużym poczuciem pewności. Ta prostota jest niezbędna, gdyż kowboje mają już ręce pełne roboty, zajmując się innymi parametrami wymagającymi pomiaru, które też trzeba – podobnie jak obecność mykotoksyn – zbadać jak najszybciej: mowa tutaj na przykład o wilgotności, czystości czy zawartości białka. Odbiór surowców nakłada też na sprzęt i stosowane testy o wiele wyższe wymagania wytrzymałościowe. Odbiór zbóż oraz proces mielenia przebiegają w warunkach generujących o wiele więcej pyłu niż w laboratorium. Ponadto temperatura otoczenia może być bardzo różna, w zależności od pogody w okresie zbiorów. Sprzęt testujący musi być zatem również odporny na takie trudne warunki pogodowe. Uwzględniając wszystkie te trudności, nic dziwnego, że kowboj zbożowy oczekuje wygodnego sposobu uzyskiwania wyników. Kiedyś wystarczało odczytanie wyniku z testu paskowego lub wyświetlacza czytnika i odnotowanie go ręcznie. Współcześnie łączność jest koniecznością: musi istnieć możliwość łatwego transferu wyników do systemów komputerowych, m.in. na platformy LIMS i ERP.
Nr 2: Tester-rzemieślnik (kontrola jakości rafinowanych produktów)
Podobnie jak kowboje zbożowi, osoby przeprowadzające kontrole jakości rafinowanych produktów, np. kwasu cytrynowego, skrobi, syropu kukurydzianego o wysokiej zawartości fruktozy czy innych biodegradowalnych składników pochodzenia naturalnego, potrzebują rzetelnych i szybkich rozwiązań do wykrywania obecności mykotoksyn. Jednak ich wyjściowa sytuacja jest skrajnie różna: zwykle nie pracują pod presją wywieraną przez kierowców ciężarówek oczekujących na rozładunek w punkcie skupu i często mogą skorzystać ze sprzętu laboratoryjnego oraz pomocy wykwalifikowanego personelu. Ze względu na główny przedmiot ich zainteresowania, jakim jest spełnienie wysokich wymagań jakościowych produkowanych surowców, zwracają uwagę przede wszystkim na dokładność i dlatego określamy ich mianem testerów-rzemieślników. Chociaż mogą mieć dostęp do metod analitycznych, takich jak HPLC czy spektrometria mas, testerzy
Spot On Numer 13
rzemieślnicy zwykle wybierają szybkie testy na obecność mykotoksyn ze względu na łatwość wykonania i elastyczność użycia. Szybkie testy oferują coraz więcej możliwości, po pierwsze zapewniają wiarygodność wyników typową dla zaawansowanego sprzętu laboratoryjnego, a po drugie pozwalają zaoszczędzić czas pracownikom laboratorium.
Nr 3: Mykotoksynowy gliniarz (zgodność z przepisami oraz wymaganiami progowymi)
Zwykle kowboj zbożowy, jak i tester-rzemieślnik wykonują swoje zadania, pracując dla przedsiębiorstwa handlującego surowcami czy produkującego towary z tych surowców. Natomiast nasz trzeci typ testera najczęściej nie bierze pod uwagę względów biznesowych – jego rolą jest zadbanie o zgodność z przepisami. Są to często osoby zatrudniane przez firmy certyfikujące lub jednostki regulacyjne, a ich zadaniem jest wyegzekwowanie stosowania się do limitów zawartości mykotoksyn oraz certyfikacja transportów kolejowych lub drogowych. Postanowiliśmy nazwać ich mianem „mykotoksynowych gliniarzy” ze względu na nadzorujący charakter ich pracy. Mykotoksynowi gliniarze prawie zawsze pracują w warunkach skrajnie różnych od środowiska laboratoryjnego – a jeśli mają do dyspozycji coś, co przypomina laboratorium, zwykle musi się to zmieścić w bagażniku ich samochodu. Kontrolują pociągi z transportami dalekobieżnymi, dbając o pełną zgodność z przepisami. Często pracują daleko od ośrodków handlowych, a dostęp do Internetu to luksus, o którym czasami mogą jedynie pomarzyć. Zwykle nie mają na podorędziu sprzętu mielącego, którym może posiłkować się kowboj zbożowy, a do zmielenia swoich próbek nierzadko wykorzystują po prostu młynek do kawy. Mimo że zaawansowany sprzęt laboratoryjny jest poza zasięgiem mykotoksynowego gliniarza, nie oznacza to, że może on polegać na jakimkolwiek szybkim teście, gdyż oprócz podstawowych wymagań w zakresie wrażliwości, dokładności i użyteczności, testy paskowe i czytniki muszą być w stanie utrzymać jakość wyników bez względu na ich użycie w terenie. Mykotoksynowy gliniarz jest nieustannie w trasie, stąd podwyższona potrzeba niezawodności takich urządzeń, jak zasilacze i akumulatory – bez nich nie może pracować.
Nr 4: Obrońca zwierząt (program zarządzania ryzykiem wynikającym z obecności mykotoksyn)
Publikacja Romer Labs®
Czwarty i ostatni typ osób posługujących się szybkimi testami ma za zadanie przede wszystkim chronić zdrowie zwierząt. „Obrońcy zwierząt” dbają, aby podawana im pasza była zawsze pełnoziarnista i nie wykraczała poza dozwolone limity stężenia mykotoksyn. Jednak osoby te nie tylko muszą zwracać uwagę na wymagania ustawowe – często zobowiązani są także przestrzegać zaleceń weterynaryjnych, nierzadko surowszych od oficjalnych rozporządzeń. Obrońca zwierząt wie, że aby zarządzać ryzykiem wynikającym z obecności mykotoksyn w paszy, musi najpierw wiedzieć, jak jest duże. Stężenie mykotoksyn w konkretnej partii paszy czy składnikach paszy zapewnia przydatne informacje na temat gatunku zwierząt, którym można ją podać, lub czy w ogóle można nią karmić zwierzęta. Z naszego doświadczenia wiemy, że obrońca zwierząt nie zawsze może czekać na wyniki badań na obecność mykotoksyn przed podjęciem decyzji, co zrobić z daną partią paszy i czy dodawać do niej jakieś dodatki, np. dezaktywator mykotoksyn. Szybkie testy pomagają obrońcom zwierząt chronić stada przed szkodliwym wpływem mykotoksyn.
Co powoduje, że system szybkich testów jest przyjazny dla użytkownika? Duży, intuicyjnie zbudowany interfejs w czytniku może zdziałać cuda.
Wniosek: Praktycznie każdemu się spieszy (i każdy oczekuje wysokiej wrażliwości, użyteczności oraz dokładności)
Kow b o j zb oż ow y, te s te r- r z e m i e ś l n i k , mykotoksynowy gliniarz czy obrońca zwierząt: wszyscy ci łowcy mykotoksyn mają kilka jednakowych podstawowych oczekiwań wobec szybkiego testu na obecność mykotoksyn. PRĘDKOŚĆ. Być może jesteś kowbojem zbożowym zestresowanym niecierpliwymi kierowcami ciężarówek czekającymi na instrukcje, gdzie wyładować surowiec, a może pracujesz jako niezależny mykotoksynowy gliniarz, który musi przebadać, przyznać (lub nie) certyfikat produktom i zaraz pędzić w inne miejsce. Każdy boryka się z tym samym problemem – musi mieć system, w którym parametr „prędkość” jest stawiany na pierwszym miejscu. WRAŻLIWOŚĆ. Wszyscy testerzy potrzebują systemu, który jest w stanie zapewnić wyniki na odpowiednio niskim poziomie stężenia narzucanym ustawowo. UŻYTECZNOŚĆ. Co sprawia, że system szybkich testów jest przyjazny dla użytkownika? Duży i intuicyjnie zbudowany interfejs ma kolosalne znaczenie w pracy praktycznie każdego testera, jak również przepływ pracy uwzględniający jak najmniej etapów. PRECYZJA. Z oczywistych względów żaden typ testera nie jest w stanie zaakceptować szybkich testów, które przynoszą nierzetelne wyniki. Na przykład wysoko wyspecjalizowany produkt wykorzystywany do produkcji rafinowanych materiałów takich jak DDGS nie może być skażony mykotoksynami na nieakceptowalnym poziomie.
7
8
Spot On Numer 13
Im mniejsze, tym lepsze:
Popraw wyniki analiz mykotoksyn poprzez zmniejszenie
rozmiaru analizowanych cząstek Najnowsze badania naukowe pokazują, że rozmiar cząstek w próbce ma znaczący wpływ na dokładność metod analizy mykotoksyn. Ekspertki ds. mykotoksyn, Henriette Hobbs i Nora Kogelnik, prezentują to zagadnienie i proponują kilka sposobów, jak zwiększyć dokładność i rzetelność testów na obecność mykotoksyn.
Photo: BJI
Autorzy: dr Henriette Hobbs, starsza specjalistka, oraz dr Nora Kogelnik, kierowniczka produktu
Publikacja Romer Labs®
9
Pobieranie próbek i ich przygotowywanie to złożone procesy, naszpikowane licznymi pułapkami, gdzie każdy etap wprowadza szereg zmiennych przekładających się na łączną zmienną z jednym wynikiem analitycznym.
W
społeczności analityków mykotoksyn generalnie posługujemy się trzema głównymi etapami proceduralnymi w przypadku takich produktów rolnych jak kukurydza, pszenica i jęczmień: pobranie próbki, przygotowanie próbki i analiza. Aby ocenić stężenie mykotoksyn obecnych w danej partii surowca, musimy przeanalizować mniejszą, ale nadal reprezentatywną część partii; oznacza to, że nie można mówić o rzetelnych wynikach bez odpowiedniego planu pobierania próbek, który uwzględnia pobranie próbek przyrostowych z partii i połączenie ich w jedną podpróbkę (również określaną mianem próbki reprezentatywnej dla całej partii materiału). Dzięki temu mamy pewność, że przebadana próbka zapewni wynik reprezentatywny dla całej partii. Teraz przechodzimy do kolejnego etapu – przygotowanie próbki. W przypadku produktów zbożowych przygotowanie próbki składa się z dwóch ważnych kroków – mielenia oraz przygotowania podpróbki: 1) używa się młynka lub innego urządzenia do zmielenia ziaren w próbce reprezentatywnej, aby zmniejszyć rozmiar cząstek i zapewnić jednorodność; 2) z tej próbki uzyskujemy podpróbkę reprezentatywną dla całej partii, którą następnie testujemy. Ta próbka testowa jest następnie przygotowywana do ekstrakcji zgodnie ze zdefiniowanym protokołem [10]. Mimo wszystko pobieranie próbek oraz ich przygotowywanie to złożone procesy, naszpikowane licznymi pułapkami, gdzie każdy etap w ramach przygotowania próbek wprowadza szereg zmiennych przekładających się na całkowitą zmienną z jednym wynikiem analitycznym [2, 5]. Wiele badań pokazało, że dwie trzecie zaobserwowanych niespójności wyników brało się z metody próbkowania,
Rys. 1. Zmienność zaobserwowana podczas pobierania próbek (61 %), przygotowywania próbek (36 %) i analizy (3 %) w przypadku próbki skażonej AFLA 20 ppb. ZaadaptowanoTotal z [2]. variation observed for
3+36+61 a 20 ppb AFLA corn sample
Analiza Analysis 33% %
10
PobiSampling 61% eranie próbek 61 %
Przygotowanie Sample próbek preparation 3636% %
a jedną trzecią przypisywano sposobowi przygotowania próbki. Dużo mniejszy odsetek niespójności wyników był powodowany użyciem odmiennej metody analitycznej (rys. 1). W związku z powyższym dokładność wyników uzależniona jest od stopnia, w jakim uwzględnimy te trzy czynniki. Mimo że wiele badań wskazuje na wpływ metod próbkowania oraz rozpuszczalników analitycznych na wynik testu na obecność mykotoksyn (patrz [1, 2, 4] gdzie znajdują się ewidentne przykłady), w tym artykule skupimy się na znaczeniu przygotowania próbki, tj. zmielenia jej, i rozmiaru cząstek oraz podsumowaniu najnowszych badań w tej kwestii; omówimy wpływ przygotowania próbki na dokładność analizy mykotoksyn oraz niespójność próbek [10].
Wybór próbki reprezentatywnej Kiedy towar jest skażony naturalnie mykotoksynami, źródła skażenia są zwykle nierównomiernie rozłożone w całej partii; takie skupiska źródeł skażenia określa się „miejscami promieniowania”. Aby zapewnić dokładny wgląd w stopień skażenia partii, plan próbkowania musi uwzględniać przypadkowy rozkład takich miejsc promieniowania. Robi się to poprzez pobranie dużej liczby małych, przyrostowych próbek z różnych miejsc rozłożonych w całej partii, tak aby uzyskać próbkę reprezentatywną (rys. 2) [8]. Pobranie wielu próbek przyrostowych z partii ma krytyczne znaczenie w kontekście zagwarantowania, że każde ziarno ma szansę trafić do próbki, co redukuje ryzyko błędu [10]. Rys. 2. Procedura doboru próbek w celu uzyskania próbki reprezentatywnej dla partii, gdzie próbka reprezentatywna składa się z wielu mniejszych próbek przyrostowych pobieranych w różnych miejscach. „Przegroda” dzieli próbkę reprezentatywną na mniejsze próbki testowe [10].
Partia Przyrosty Próbka reprezentatywna Przegroda Próbka testu Spot On Numer 13
Mielenie w celu zapewnienia jednakowej wielkości cząstek Pleśnie produkujące mykotoksyny mają wiele różnych dróg skażenia, co powoduje, że mykotoksyny mogą znaleźć się zarówno wewnątrz, jak i na powierzchni ziaren. Droga zakażenia zależy od mykotoksyny oraz ziarna. Wiadomo, że niektóre grzyby produkujące mykotoksyny, np. Fusarium, są obecne wewnątrz ziarna, natomiast inne, np. Aspergillus, bytują na powierzchni. Zmielenie próbki rozwiązuje ten problem poprzez rozdrobnienie skażonych ziaren i jednolitą dystrybucję cząstek. W efekcie działanie to poprawia stopień wykrywania skażonych cząstek [3].
Jednolita dystrybucja potencjalnych mykotoksyn poprzez przesianie ziaren przez sito i wymieszanie ich Po wybraniu próbki reprezentatywnej dla całej partii i zmielenie jej, aby zagwarantować jednorodny rozmiar cząstek, trzeba ją ujednolicić poprzez dokładne wymieszanie; to również powoduje, że próbka staje się bardziej reprezentatywna dla całej partii [3]. Standardowo ziarna sortuje się według rozmiaru, zmniejszając stopień, w jakim próbka jest reprezentatywna, co prowadzi do błędnych wyników analiz. Z tego powodu przed wymieszaniem potwierdzamy, że stopień zmielenia jest wystarczający, aby przesiać zmieloną próbkę przez sito. Celem nie jest odfiltrowanie większych cząstek, ponieważ one mogą również zawierać mykotoksyny – wręcz przeciwnie, duże cząstki muszą stanowić element próbki. W tym procesie dbamy o jednorodność mielenia, sprawdzając, czy określony procent cząstek da radę przejść przez sito. Np. USDA-FGIS przygotowała specyfikacje dotyczące rozmiaru próbki, mielenia próbki oraz podpróbkowania do badania pod kątem obecności aflatoksyny, womitoksyny, fumonizyny,
ochratoksyny i zearalenonu [9]. USDA-FGIS zaleca, aby próbka została tak zmielona, by 60 – 75 % cząstek przechodziło przez sito nr 20 i aby do ekstrakcji mykotoksyn użyć 50 g próbki testowej (uwzględniając cząstki, które nie przechodzą przez oczka sita).
Mały rozmiar ziaren, duża wielkość próbki i dokładne wyniki testów na mykotoksyny – o to musisz zadbać W całym artykule używamy terminów „dokładność” i „precyzja”, zatem warto je szybko zdefiniować: dokładność i precyzja odnoszą się do niepewności powiązanych z analizą stosowaną w związku z pierwotną metodą przygotowania próbki lub planem. Dokładność definiuje się jako bliskość zmierzonej wartości do wartości prawdziwej, natomiast precyzję jako bliskość zmierzonych wartości do siebie. Ostatecznym celem jest wdrożenie procesu, który zapewnia zarówno dokładność, jak i precyzję [10]. Badania pokazują, że dokładność metody wykrywania mykotoksyn i wynikająca z niej zmienność wyników zależy w dużej mierze od rozmiaru cząstek w próbce. Aby pokazać niespójność pomiarów powiązaną z rozmiarem cząstek w próbce oraz rozmiarem samej próbki poddanej analizie, nawiązujemy do szeregu badań naukowych, w których to wykonano (rys. 3 i 4). W pierwszym badaniu przeprowadzonym przez Whitakera i in. (rys. 3) dokonano analizy próbek kukurydzy naturalnie skażonych aflatoksyną. Przez sito nr 20 przesiano kolejno próbki zawierające różnej wielkości ziarna. 1) gruby przemiał (60 % cząstek przeszło przez oka sita), 2) drobny przemiał (99 % cząstek przeszło przez oka sita) i 3) proszek (uzyskany w młynku młotkowym). Następnie przeanalizowano osiem próbek z każdego rodzaju przy użyciu zmodyfikowanej metody referencyjnej HPLC, aby pokazać niespójności wewnątrz próbek w ramach jednego stopnia zmielenia [9].
Celem przesiania zmielonej próbki przez sito nie jest odfiltrowanie większych cząstek, ponieważ one mogą również zawierać mykotoksyny – wręcz przeciwnie, duże cząstki muszą stanowić element próbki.
Tabela 3: Wpływ wielkości cząstek i masy próbki na poziomy aflatoksyny w naturalnie skażonych próbkach kukurydzy [9]. Próbka 1
Liczba 60 % próbka do sita 20 50 g
10 g
50 g
10 g
91
151
140
149
160
167
136
136
135
151
222
4
217
5 6 7 8
Średnio (ppb) SD (ppb) RSD (%)
młynek młotkowy Zmielona próbka
10 g 2 3
99 % próbka do sita 20
135 95 86
108
140 56 40
Publikacja Romer Labs®
125 110 123 139 111 115
126 15 12
154 138 155 141 147 167
147 11 7
148 144 151 140 148 149
145 5
4
154 155 156 153 162 171 158 7 4
11
Badania pokazują, że dokładność metody wykrywania mykotoksyn i wynikająca z niej zmienność wyników zależy w dużej mierze od rozmiaru cząstek w próbce.
Jak widać w tabeli 3, występują niespójności w wynikach analiz zależne zarówno od wielkości próbki, jak i stopnia zmielenia. Jednak jak możemy określić ilościowo te niespójności w sposób przydatny dla nas? Względne odchylenie standardowe (RDS) lub współczynnik zmienności (CV) są często używane do określenia, jak bardzo niepodobne są wyniki w konkretnym zbiorze danych. RDS zwykle podawany jest jako procent i definiowany jako stosunek standardowego odchylenia do średniej. Im niższe standardowe odchylenie, tym mniejsza zmienność w zbiorze danych i bardziej rzetelny wynik. W danych z badania opisanego w tabeli 3 zaobserwowano znaczącą zmienność pomiędzy próbkami 10 g uwzględniającymi różne rozmiary cząstek. 10-gramowe grubo zmielone próbki wykazują najwyższe RDS 40 % w porównaniu z drobniej zmielonymi próbkami (próbka 99 % sito nr 20), gdzie RDS wyniosło 7 %. Najniższe RDS, na poziomie 4 %, osiągnięto przy próbkach sproszkowanych w młynku młotkowym. Mimo że młynek młotkowy zwykle nie jest narzędziem w zasięgu finansowym przeciętnego testera, jednak badania Whitakera i in. pokazują, że to najlepszy sposób, aby uniknąć
zmienności wyników wynikających z przygotowania próbki drobno zmielonej i przesianej przez sito, aby zapewnić jednorodną wielkość cząstek [9]. Aby pokazać wpływ rozmiaru cząstek (zmielenie) oraz rozmiaru próbki na zmienność analityczną wśród różnych mykotoksyn, Brunkhorst i in. przeprowadzili analizę na próbkach kukurydzy naturalnie skażonej albo aflatoksyną (suma B1, B2, G1 i G2), fumonizyną (suma B1, B2 i B3) lub zearalenonem (rys. 4). Do tego badania dla każdej mykotoksyny w różnym stopniu zmielono 10 próbek kukurydzy, aby móc przesiać je przez sito nr 10, nr 20 lub nr 30. W badaniu również uwzględniono odmienność wielkości poszczególnych próbek (1 g, 5 g, 10 g i 25 g). Próbki aflatoksyny pobrano przy użyciu acetonitrylu/wody (84/16) i przeanalizowano przy użyciu metody AOAC i urządzenia KOBRA cell do bromowania pokolumnowego. Próbki fumonizyny zostały wyekstrahowane przy użyciu metanolu/wody (3/1) i również przeanalizowane zgodnie z metodą AOCA. Próbki zearalenonu zostały również wyekstrahowane przy użyciu acetonitrylu/wody i przeanalizowane przy użyciu LC-MS/MS.
Rys. 4. Wpływ stopnia zmielenia i masy próbki (1 g, 5 g, 10 g, 25 g) na zmienność wyników analiz. Przeanalizowano pojedyncze ekstrakty (n=10) przy różnych kombinacjach rozmiaru sita i masy próbki dla całkowitej aflatoksyny (A, B), całkowitej fumonizyny (C, D) i zearalenonu (E, F) w naturalnie skażonej kukurydzy. Użyto metod referencyjnych do opisania próbki. Wyniki zostały uśrednione, obliczono standardowe odchylenie i zaprezentowano na wykresie A, C i E. Ponadto określono CV w % i zaprezentowano w postaci wykresu liniowego na rys. B, D i F. (zaadaptowano za zgodą autorów [2, 7, 12].)
Całkowita a�latoksyna
A Całkowite stężenie aflatoksyny [w ppb]
400
n 1 gram n 5 gramów n 10 gramów n 25 gramów
350 300 250 200 150 100 50 0
CV [w %] dla całego stężenia aflatoksyny
B 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
12
52,8 % przechodzi przez sito 10
51,3 % przechodzi przez sito 20
97,1 % przechodzi przez sito 20
Współczynnik zmienności (CV)
100 % przechodzi przez sito 30
Sito 10 przechodzi 52,8 % Sito 20 przechodzi 51,3 % Sito 20 przechodzi 97,1 % Sito 30 przechodzi 100 %
1 gram
5 gramów
10 gramów
GRAMATURA PRÓBEK użytych do EKSTRAKCJI
25 gramów
Spot On Numer 13
Im mniejsze
Całkowita fumonizyna 9
n 1 gram n 5 gramów n 10 gramów n 25 gramów
Całkowite stężenie fumonizyny [w ppm]
C
8 7
odchylenie standardowe, tym mniejsza zmienność
6 5
w zestawie danych
4
i tym bardziej
3
rzetelny wynik.
2 1 0
50 % przechodzi przez sito 10
D
50 % przechodzi przez sito 20
95 % przechodzi przez sito 20
95 % przechodzi przez sito 30
Współczynnik zmienności (CV)
CV [w %] dla całego stężenia fumonizyny
120
Sito 10 przechodzi 50 %
100
Sito 20 przechodzi 50 %
80
Sito 20 przechodzi 95 %
60
Sito 30 przechodzi 95 %
40 20 0
1 gram
5 gramów
10 gramów
GRAMATURA PRÓBEK użytych do EKSTRAKCJI
25 gramów
Zearalenon 2500
Stężenie zearalenonu [w ppb]
E
n 1 gram n 5 gramów n 10 gramów n 25 gramów
2000 1500 1000 500 0
50 % przechodzi przez sito 10
F
50 % przechodzi przez sito 20
95 % przechodzi przez sito 20
100 % przechodzi przez sito 30
Współczynnik zmienności (CV) Sito 10 przechodzi 50 % Sito 20 przechodzi 50 % Sito 20 przechodzi 95 % Sito 30 przechodzi 100 %
CV [w %] zearalenonu
50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
1 gram
Publikacja Romer Labs®
5 gramów
10 gramów
GRAMATURA PRÓBEK użytych do EKSTRAKCJI
25 gramów
13
Wyniki jasno pokazują, że zmienność wyników analizy można ograniczyć, jeśli próbki zostaną zmielone tak, aby przeszły przez mniejszy rozmiar sita.
Uwaga: Dane pokazane na każdej parze wykresów są w pewien sposób nadmiarowe. Jednakże naszym zdaniem przydają się, aby zaprezentować współczynnik zmienności na każdym wykresie. Wyniki wyraźnie pokazują, że stopień zmielenia i rozmiar próbki wpływają na dokładność analizy. Badania sugerują, że AFLA i ZON wykazują wyższy stopień zależności (tj. mają wyższy CV) w przypadku objętości próbki i stopnia zmielenia niż FUM, dlatego nie chcemy wyciągać wniosku na podstawie tych pojedynczych badań i potrzebujemy więcej badań, aby potwierdzić nasze obserwacje. W przypadku próbek o masie 1 g i 5 g wartości RSD dla AFLA, FUM i ZON były wyższe w porównaniu z próbkami o masie 10 g i 25 g. Zmienność zaobserwowana w przypadku próbki kukurydzy o masie 10 g skażonej AFLA spadła z 58,9 % (grubo zmielona) do 9,3 % (drobno zmielona), w przypadku FUM z 39,8 % (grubo zmielona) do 4,6 % (drobno zmielona), a w przypadku ZON z 21 %
(grubo zmielona) do 2 % (drobno zmielona). Te wyniki dalej pokazują wpływ stopnia zmielenia na zmienność wyników analiz oraz dokładność pomiarów względem ekstrahowanej mykotoksyny oraz analizy ziaren. Brunkhorst i in. wyjaśnili również swoje odkrycia i ustalili poziomy womitoksyny w próbkach naturalnie skażonego jęczmienia w ramach tego samego badania. Próbki jęczmienia zostały zmielone tak, aby pasowały do czterech rozmiarów sita i wyekstrahowane (10 pojedynczych ekstraktów przy każdej wielkości sita i masie próbki) przy użyciu aceronitrylu/wody (84/16) oraz przeanalizowane przez LC-MS-MS (rys. 5) [6]. Wyniki jasno pokazują, że zmienność wyników analizy można ograniczyć, jeśli próbki zostaną zmielone tak, aby przeszły przez mniejszy rozmiar sita. Ponadto zwiększanie masy próbki również pomaga zmniejszyć zmienność wyników analizy. Udało się zmniejszyć współczynnik zmienności z 11 % do zaledwie 5 % przy użyciu próbki o masie 10 g i sita nr 10. Próbka o masie 10
Rys. 5. Wpływ stopnia zmielenia i masy próbki na zmienność wyników badań na obecność womitoksyny w jęczmieniu. Przeanalizowano pojedyncze ekstrakty (n=10) w różnych kombinacjach wielkości sita i masy próbki, używając LC-MS/MS. Wyniki zostały uśrednione, obliczono standardowe odchylenie i zaprezentowano na wykresie (A) oraz obliczono CV w % i zaprezentowano w postaci wykresu liniowego (B) [6].
Womitoksyna
A 4,50 4,00
Stężenie womitoksyny w ppm
n 1 gram n 5 gramów n 10 gramów n 25 gramów
3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00
50 % przechodzi przez sito 10
B
50 % przechodzi przez sito 20
95 % przechodzi przez sito 20
95 % przechodzi przez sito 30
Współczynnik zmienności (CV) 50
CV [w %] dla womitoksyny w jęczmieniu
Sito 10 przechodzi 50 %
45
Sito 20 przechodzi 50 %
40
Sito 20 przechodzi 95 %
35
Sito 30 przechodzi 95 %
30 25 20 15 10 5 0
14
1 gram
5 gramów
10 gramów
GRAMATURA PRÓBEK użytych do EKSTRAKCJI
25 gramów
Spot On Numer 13
g i 25 g w połączeniu z sitem nr 20 (95 %) i nr 30 (95 %) zapewnia dokładne i precyzyjne wyniki, redukując CV odpowiednio do 5 % i 3 %. Jako że w tym badaniu użyto jęczmienia zamiast kukurydzy, sugeruje się że wpływ masy próbki i stopnia zmielenia na zmienność wyników analiz na obecność mykotoksyn może nie być zależna macierzowo. Dlatego potrzebne są kolejne badania, aby to potwierdzić [6].
Wniosek: Przesiewaj, mieszaj i powtarzaj w razie potrzeby Znaczenie stopnia rozdrobnienia próbki oraz jej masy, a także wpływ tych czynników na ograniczenie zmienności wyników i marginalizację błędów podczas badań na obecność mykotoksyn jest oczywiste. W zaprezentowanych badaniach zaobserwowano dużą zmienność pomiędzy próbkami grubo i drobno zmielonymi, pochodzącymi z tego samego źródła i skażonymi na tym samym poziomie. Poza samą obserwacją zmienności dane z tych badań sugerują pewne początkowe podejście do kwestii masy próbki i stopnia zmielenia. W kontekście masy próbki
okazuje się, że 10 g wystarczy, ale 25 g może zapewnić jeszcze większą dokładność. Przy użyciu sita nr 20 powinno przejść 95 % próbki. Przy użyciu sita nr 30 powinno przejść 100 % próbki. Głównym celem badań na obecność mykotoksyn jest uzyskanie dokładnego i wiarygodnego wyniku pomimo trudności wynikających z pobierania próbek oraz złożoności procesu przygotowania próbki ziaren i innych płodów rolnych. Mimo stosowania najlepszych technologii w postaci najnowocześniejszych szybkich testów czy bardzo precyzyjnego sprzętu wykorzystującego spektrometrię mas, badanie zda się na nic, jeśli analizowana próbka nie będzie reprezentatywna dla całej partii towaru. Reprezentatywna próbka wymaga czegoś więcej niż tylko odpowiedniego jej pobrania – ważne jest również jej przygotowanie. Jeśli zastosujesz się do tych trzech kluczowych czynników przygotowywania próbek (stopień zmielenia, masa próbki i jednorodność), uda się utrzymać RDS na poziomie < 10 %, co zwiększy wiarygodność wyników analiz.
W kontekście masy próbki okazuje się, że 10 g wystarczy, ale 25 g może zapewnić jeszcze większą dokładność.
Źródła 1) E. Pilcher: Sampling for mycotoxins – do we care enough? Romer Labs. 2016, https://www.romerlabs.com/en/ knowledge-center/knowledge-library/articles/news/sampling-for-mycotoxins-do-we-care-enough/
2) J. Brunkhorst: Effects of particle size and extraction size for effective mycotoxin analysis, Trilogy Analytical Laboratory, presented at AAFCO 2017 Collin L. The effect of grind and extraction size on aflatoxin variability. Trilogy Analytical Laboratory, Washington, MO 63090
3) J. Richard: Sampling and Sample Preparation for Mycotoxin Analysis. . In: Romer Labs Guide to Mycotoxins, 2. 2000
4) T.B. Whitaker ABS, M.B. Doko, B.M. Maestroni, A. Cannavan: Sampling Procedures to Detect Mycotoxins in Agricultural Commodities: Springer; 2011.
5) T.B. Whitaker FED, W. M. Hagler, F. G. Giesbrecht, J. Wu: Variability Associated with Sampling, Sample Preparation, and Chemical Testing for Aflatoxin in Farmers' Stock Peanuts. Journal of AOAC International 1994, 77(1):107 - 116. 6) V. Brunkhorst, C. Maune, J. Brunkhorst, J. Bierbaum, R. Niemeijer: Effect of grind and extraction size on deoxynivalenol result variability, Trilogy Analytical Laboratory
7) V. Brunkhorst, C. Maune, J. Brunkhorst, J. Bierbaum, R. Niemeijer: Effect of grind and extraction size on zearalenone result variability, Trilogy Analytical Laboratory 8) MFood Standards Agency. Mycotoxin sampling guide, 2016.
9) Whitaker, T.B; Slate, A.B; and Johansson, A.S. Sampling feeds for mycotoxin analysis. In: The Mycotoxin Blue Book. D.Durat, ed. Nottingham University Press, Bath, England, 2005] 10) Whitaker T.B;, Sampling Foods for Mycotoxins, Food Additives & Contaminations, 2007. 11) United States Department of Agriculture. Mycotoxin Handbook, 2015
12) Carrie K. Maune, Thomas Maune, Jordan Bierbaum, Julie Brunkhorst, Ronald Niemeijer. The effect of grind and extraction size on Fuinsin Result Variablity. Washington, MO 63090 Publikacja Romer Labs®
15
Twój egzemplarz Spot On
Koniec z ukrytymi mykotoksynami!
Spraw, by niewidzialne stało się widoczne, dzięki nowym AgraStrip® Pro WATEX® i AgraVisionTM Pro. System testów AgraStrip® Pro WATEX® umożliwia przeprowadzanie szybkich i prostych obliczeń stężenia mykotoksyn w terenie w wielu różnych produktach rolnych. Więcej na stronie romerlabs.com.
Skontaktuj się z nami, aby uzyskać więcej informacji: www.romerlabs.com | solutions@romerlabs.com
Szyb kie i prost e tes ty na ob ecno ść myko toksy n.