Número 13
Una publicación de Romer Labs®
Micotoxinas: ¿Qué espera de una prueba rápida? Los 4 tipos de analistas Granulometría: Una forma sencilla de mejorar su extracción y sus resultados
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Contenido
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¿Qué tipo de analista de micotoxinas es usted? 4 tipos de analistas y lo que esperan de una solución rápida Pérdidas económicas, riesgos para la salud de las personas y los animales, marcos normativos cada vez más complejos: las razones por las que los productores de cereales, alimentos y piensos necesitan realizar ensayos de micotoxinas son múltiples. El Director de Comunicaciones de Romer Labs, Joshua Davis, y el Director de Cuentas Clave, Ervin Tanyi, examinan algunas situaciones comunes en las que los ensayos rápidos pueden ayudar.
Autores: Joshua Davis, Director de Comunicaciones de Romer Labs, y Ervin Tanyi, Director de Cuentas Clave de Romer Labs
Spot On es una publicación de Romer Labs Division Holding GmbH, de distribución gratuita. ISSN: 2414-2042
Directores: Joshua Davis, Cristian Ilea
Graficación: GraphX ERBER AG Investigación: Kurt Brunner
Editor: Romer Labs Division Holding GmbH Erber Campus 1 3131 Getzersdorf, Austria Tel: +43 2782 803 0 www.romerlabs.com
©Copyright 2021, Romer Labs® Todos los derechos reservados. Queda prohibida la reproducción total o parcial de esta publicación por cualquier medio con fines comerciales sin la autorización escrita del titular de los derechos de autor. Todas las fotos son propiedad de Romer Labs o se utilizan con licencia. Romer Labs is part of DSM.
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Foto: BJI
Colaboradores: Joshua Davis, Henriette Hobbs, Nora Kogelnik, Ervin Tanyi
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Cuanto más pequeño, mejor: Mejorar los resultados del análisis de micotoxinas reduciendo el tamaño de partícula Las últimas investigaciones demuestran que el tamaño de partícula de una muestra tiene un efecto considerable en la exactitud de los métodos de análisis de micotoxinas. Las expertas en micotoxinas Henriette Hobbs y Nora Kogelnik analizan el problema y ofrecen algunas recomendaciones para que sus operaciones de análisis de micotoxinas sean exactas y fiables. Autores: Nora Kogelnik, Gerente de Producto de Romer Labs, y Henriette Hobbs, Científica Senior de Romer Labs
Spot On número 13
Editorial Rápido, exacto y fácil de usar:
Respuesta a las necesidades de los analistas de micotoxinas 39 años y contando. Desde nuestra fundación en 1982, en Romer Labs hemos convertido el análisis de micotoxinas en un elemento central de nuestra actividad. Esta larga trayectoria nos ha proporcionado un conocimiento inigualable no solo de los pormenores de la analítica, sino también de las diversas necesidades del mercado. No basta con desarrollar un producto o servicio que funcione. Tiene que funcionar para cumplir los requisitos específicos del cliente. O, dicho de otro modo: la precisión no debe ir en detrimento de la facilidad de uso. Cuando empezamos a trabajar en el sistema AgraStrip® Pro WATEX®, nos dirigimos a quienes utilizan nuestros productos a diario: nuestros laboratorios de servicio, nuestros equipos de asistencia técnica y, por supuesto, nuestros clientes. Les preguntamos: “¿Para qué necesitan una prueba rápida in situ? ¿Cuáles son los retos a los que se enfrenta a diario?” De los ensayos realizados en circunstancias tan diversas como los silos de granos en Brasil, las fábricas de almidón de maíz en Europa y los productores de alimentos para mascotas en Estados Unidos, había una respuesta que seguíamos escuchando: “¿Por qué las pruebas de micotoxinas no pueden ser más fáciles de usar?” Por lo que, al tiempo que nos asegurábamos de mejorar los estándares de sensibilidad y velocidad, nos dedicamos a optimizar el proceso y a abordar los problemas que preocupan a los analistas de los ensayos de micotoxinas. ¿El resultado? Dispositivos de flujo lateral (LFD) con límites de detección (LOD) bajos y el nuevo lector AgraVision™ Pro que realiza mucho del trabajo que solían hacer los analistas: el control del tiempo, la temperatura y el flujo del ensayo. Con una pantalla táctil de 7 pulgadas y 4 ranuras de ensayo que funcionan de forma independiente, el lector AgraVision™ Pro es nuestra forma de ofrecer a los analistas de micotoxinas un alto rendimiento, así como tranquilidad. En este número de Spot On,confrontamos algunas de las cuestiones que quitan el sueño a los analistas de micotoxinas. Nuestro gestor de cuentas clave, Ervin Tanyi, recurre a sus años de experiencia para señalar cuatro tipos diferentes de cazadores de micotoxinas, los retos a los que se enfrentan y lo que esperan de una solución de ensayo rápido. A continuación, la directora de producto Nora Kogelnik se une a la científica experta Henriette Hobbs para estudiar un problema específico relacionado con la preparación de las muestras: la granulometría y su efecto en la extracción de las muestras y la recuperación de las micotoxinas. Arrojan una nueva luz sobre este tema que a menudo se pasa por alto y muestran cómo unos pocos ajustes pueden mejorar la precisión de los ensayos. Espero que disfrute de este número de Spot On.
Klaus Hasler Director general, Romer Labs Diagnostic GmbH
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¿Qué tipo de analista de micotoxinas es usted?
4 tipos de analistas y lo que esperan de una solución rápida Pérdidas económicas, riesgos para la salud de las personas y los animales, marcos normativos cada vez más complejos: las razones por las que los productores de cereales, alimentos y piensos necesitan realizar ensayos de micotoxinas son múltiples. El Director de Comunicaciones de Romer Labs, Joshua Davis, y el Director de Cuentas Clave, Ervin Tanyi, examinan algunas situaciones comunes en las que los ensayos rápidos pueden ayudar. Autores: Joshua Davis, Director de Comunicaciones de Romer Labs, y Ervin Tanyi, Director de Cuentas Clave de Romer Labs
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La tecnología de dispositivos de flujo lateral (LFD) ha demostrado ser lo suficientemente versátil y robusta para ser utilizada in situ y lo suficientemente exacta, en muchos casos, para suplir la necesidad de métodos de laboratorio.
Micotoxinas: una amenaza creciente Los daños económicos que pueden atribuirse a las micotoxinas son cada vez mayores: la FAO calcula que el 25 % de la producción agrícola mundial está contaminada con micotoxinas. Estos compuestos tóxicos pueden desencadenar problemas de salud tanto en los seres humanos como en los animales, que van desde el cáncer hasta las enfermedades del hígado, del riñón, del sistema nervioso y del sistema hormonal, entre otras. Incluso se sabe que algunas micotoxinas suprimen el sistema inmunitario. A medida que aumentan nuestros conocimientos sobre las micotoxinas, también lo hacen las restricciones reglamentarias sobre ellas en las materias primas, los piensos y los alimentos. Estas restricciones han desencadenado a su vez una multitud de estrategias y productos diseñados para detectar las micotoxinas y prevenir los daños que causan a la salud y a las empresas. Entre las herramientas de que disponemos, las soluciones de detección rápida de micotoxinas basadas en la tecnología de dispositivos de flujo lateral (LFD) ha demostrado ser lo suficientemente versátil y robusta para ser utilizada in situ y lo suficientemente exacta, en muchos casos, para suplir la necesidad de métodos de laboratorio. Llevamos años trabajando con productores y comerciantes de cereales y piensos de todo el mundo, ayudándoles a implantar herramientas de detección de micotoxinas en sus puntos de recepción de materias primas, silos de granos, fábricas de piensos y otros lugares donde se necesita que los resultados de micotoxinas sean rápidos y exactos. En este artículo, hablamos de cuatro tipos diferentes de analistas que necesitan soluciones de ensayos rápidos por razones relacionadas, pero distintas. Esperamos que aquellos que lean esto y se reconozcan en uno de estos cuatro roles puedan aprender un poco sobre cómo las soluciones de ensayos rápidos pueden ayudarle en su programa de detección de micotoxinas.
N.º 1: El comerciante de granos (materias primas entrantes)
Uno de los puntos de comprobación críticos más importantes dentro de la cadena alimentaria es la recepción de la materia prima; nos gusta pensar que quienes desempeñan este papel crucial son los “comerciantes de granos”. El comerciante de granos decide si acepta, rechaza o segrega los ingredientes, en su mayoría granos crudos, en función de sus niveles de contaminación por micotoxinas. Los comerciantes de granos necesitan métodos analíticos que cumplan requisitos locales muy específicos. Para el comerciante de granos, el tiempo de obtención de resultados es de vital importancia, ya que todos los integrantes de la cadena de suministro están esperando su decisión. En cuestión de minutos, los camioneros o los operadores ferroviarios necesitan saber si pueden descargar sus envíos y, en caso afirmativo, dónde deben hacerlo. Los que se encuentran más adelante en la cadena
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de suministro, como los que esperan para almacenar o seguir procesando los materiales, también confían en que el comerciante de granos tome una decisión rápida y exacta. El método analítico también debe ser sencillo, para que los comerciantes de granos puedan aprender fácilmente y actuar con confianza. Esta simplicidad es esencial, puesto que ya tienen las manos llenas con otros parámetros que necesitan medirse: la humedad, la limpieza y el contenido de proteínas son solo algunos, aparte de las micotoxinas, que necesitan medirse en un corto período de tiempo. La recepción de materias primas también exige un diseño robusto, desde los ensayos hasta los equipos. La recepción de granos y la molienda que allí se realiza generan mucho más polvo en comparación con el entorno de un laboratorio convencional. Además, la temperatura ambiente puede variar mucho en función de las condiciones meteorológicas en el momento de la cosecha del grano. Es necesario que los equipos analíticos correspondientes sean resistentes a estas duras condiciones. Frente a todos estos retos, el comerciante de granos necesita una forma cómoda de gestionar los resultados. Antes bastaba con leer los resultados de las tiras reactivas o de la pantalla de un lector y registrarlos manualmente. Hoy en día, la conectividad es imprescindible: los resultados deben poder transferirse fácilmente a los sistemas informáticos, incluidas las plataformas LIMS y ERP.
N.º 2: El analista experto (control de calidad para productos altamente refinados)
Al igual que los comerciantes de granos, quienes realizan el control de calidad de productos altamente refinados, como el ácido cítrico, el almidón, el jarabe de maíz de alta fructosa y otros ingredientes biodegradables de origen natural, necesitan soluciones fiables y rápidas para analizar la presencia de micotoxinas. Sin embargo, su situación inicial no podría ser más distinta: normalmente no tienen la presión de tiempo que supone la espera de los camiones para descargar sus mercancías en los puntos de recepción, y a menudo cuentan con la ventaja de un entorno de laboratorio y de personal formado. Preocupados principalmente por las exigentes demandas de la producción de ingredientes, tienen un ojo para la precisión; los denominamos “analistas expertos”. Aunque pueden tener acceso a métodos analíticos como la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) o la espectrometría de masas, los analistas expertos suelen preferir una prueba rápida de micotoxinas por su sencillez y su flexibilidad. El aumento del volumen de ensayos con los kits de pruebas rápidas libera equipos más complejos y tiempo de trabajo para otros trabajos de laboratorio necesarios.
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N.º 3: El policía de micotoxinas (cumplimiento de la normativa y los umbrales)
Tanto el comerciante de granos como el analista experto suelen ejercer su profesión para una empresa que comercia con materias primas o produce bienes a partir de ellas. Los que desempeñan nuestro tercer papel no suelen prestar atención a la cuenta de resultados de una empresa, sino que se aseguran de que la normativa se cumpla como es debido. Empleados a menudo por empresas de certificación o agencias reguladoras, su trabajo consiste en el cumplimiento de los umbrales de micotoxinas y la certificación de los envíos por tren o camión. Preferimos denominar a los que desempeñan este papel fundamental “policías de micotoxinas”. Los policías de micotoxinas trabajan casi siempre lejos de un entorno de laboratorio tradicional; en todo caso, su laboratorio se limita a lo que puede caber en el maletero de su coche. Prestan servicio a los trenes con destino a lugares remotos para garantizar el cumplimiento de la normativa. Al trabajar a menudo lejos de los centros comerciales, la conexión a Internet es un lujo del que no siempre disponen. A menudo carecen de los equipos de molienda de los que dispone el comerciante y tienen que recurrir a los molinillos de café para obtener sus muestras de ensayo. Si bien los complejos equipos de laboratorio no son una opción para el policía de micotoxinas, no sirve cualquier solución de ensayo rápido. Además de los requisitos básicos de sensibilidad, exactitud y facilidad de uso, las tiras reactivas y los lectores deben ser capaces de mantener un rendimiento de calidad a pesar de estar siempre en movimiento. La movilidad es una de las principales preocupaciones, con equipos especiales, como adaptadores de corriente y baterías, que permiten a los policías especializados en micotoxinas acudir allí donde más se les necesita.
N.º 4: El protector de animales (programa de gestión de riesgos de micotoxinas)
Para los que desempeñan esta última función de ensayo rápido dentro de la discusión, la salud de los animales a su cargo es primordial. Los “protectores de animales” se aseguran de que los alimentos que reciben sus animales sean sanos y estén dentro de los umbrales normativos aceptables de concentración de micotoxinas. Sin embargo, la normativa es solo una parte de la historia; las recomendaciones de los veterinarios pueden dar lugar a menudo a umbrales mucho más estrictos que los oficiales. El protector de animales sabe que, para gestionar el riesgo de micotoxinas en los piensos, primero tiene que medir ese riesgo. La concentración de micotoxinas de un lote específico de piensos o ingredientes de piensos Una publicación de Romer Labs®
proporcionará información útil sobre la especie animal para la que puede utilizarse, o si puede utilizarse de algún modo. Según nuestra experiencia, el protector de animales no siempre puede esperar a que lleguen los resultados de las micotoxinas para decidir cómo utilizar un lote o si está indicado un aditivo para piensos, como un desactivador de micotoxinas. Las pruebas rápidas ayudan al protector de animales a mantener el ganado a salvo de los efectos nocivos de las micotoxinas, a la vez que garantizan que las necesidades nutricionales del ganado se satisfagan a tiempo.
Conclusión: Una necesidad universal de velocidad (y la sensibilidad, la facilidad de uso y la precisión)
¿Qué hace que un sistema de ensayo rápido sea fácil de usar? Una interfaz de usuario amplia e intuitiva en el lector es de gran ayuda.
El comerciante de granos, el analista experto, el policía de micotoxinas y protector de animales: todos estos tipos de cazadores de micotoxinas comparten algunas expectativas básicas de una solución de ensayo rápido de micotoxinas. VELOCIDAD. Los analistas no tienen tiempo que perder. Tal vez sea usted el comerciante de granos con camiones que esperan que les diga si deben descargar o dónde, o tal vez sea usted el policía autónomo de micotoxinas que tiene que analizar, certificar (o no) y apresurarse a la siguiente ubicación. De todas formas, se necesita un sistema que ponga la “celeridad” en el ensayo rápido. SENSIBILIDAD. Todos los analistas necesitan un sistema que pueda ofrecer resultados hasta los bajos niveles de concentración exigidos por los supervisores de la normativa. Algunos analistas pueden tratar con umbrales internos más estrictos que los de los supervisores de la normativa. Si esto le describe, tendrá que asegurarse de que cualquier sistema que esté considerando tenga un LOD que satisfaga sus necesidades y esté validado para la matriz o matrices que necesite evaluar. FACILIDAD DE USO. ¿Qué hace que un sistema de ensayo rápido sea fácil de usar? Los clientes siguen mencionando una cosa que hace que un kit sea utilizable: un flujo de trabajo racionalizado. Cuando se tienen en cuenta las necesidades, p. ej., del protector de animales que tiene que hacer malabarismos con varios tipos de tareas diferentes, es imprescindible un flujo de trabajo con el menor número de pasos posible. Únicamente añadiríamos que el flujo de trabajo es solo una parte de la historia: una interfaz de usuario amplia e intuitiva en el lector también contribuye en gran medida a facilitar la vida de todos los analistas. PRECISIÓN. Por razones obvias, nadie en ninguna de estas funciones puede aceptar un sistema de ensayo rápido que ofrezca resultados poco fiables. P. ej., el trabajo altamente especializado que conlleva la producción de materiales refinados como los granos secos de destilería con solubles (DDGS) no puede darse el lujo de echarse a perder por niveles inaceptables de micotoxinas. En última instancia, independientemente del papel que podamos desempeñar en la detección de micotoxinas, nos guía un imperativo: mantener nuestros alimentos y piensos dentro de niveles aceptables. Las soluciones de ensayos rápidos de micotoxinas seguirán siendo herramientas indispensables para cumplir esta misión.
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Cuanto más pequeño, mejor:
Mejorar
los resultados del análisis
de micotoxinas reduciendo el tamaño de partícula Las últimas investigaciones demuestran que el tamaño de partícula de una muestra tiene un efecto considerable en la exactitud de los métodos de análisis de micotoxinas. Las expertas en micotoxinas Henriette Hobbs y Nora Kogelnik analizan el problema y ofrecen algunas recomendaciones para que sus operaciones de análisis de micotoxinas sean exactas y fiables. Autores: Dr. Henriette Hobbs, Científica Senior, y Dr. Nora Kogelnik, Gerente de Producto.
Photo: BJI
Autores: Henriette Hobbs, Científica Senior, y Nora Kogelnik, Gerente de Producto
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El muestreo y la preparación de las muestras son procesos complejos, plagados de posibles escollos; cada paso del proceso de preparación de las muestras introduce un nivel de variabilidad que contribuye a la variabilidad total dentro de un único resultado analítico.
E
n la comunidad de analistas de micotoxinas, generalmente realizamos tres pasos principales de procedimiento cuando se trata de productos agrícolas como el maíz, el trigo y la cebada: el muestreo, la preparación de las muestras y el análisis. Para determinar la concentración de micotoxinas presente en un lote a granel, debemos analizar una porción más pequeña, pero aún representativa del lote; esto significa que es imposible obtener resultados fiables sin un plan de muestreo adecuado, que incluya la toma de muestras incrementales del lote y su combinación en una submuestra (también conocida como muestra agregada). Esto constituye una base que garantiza que la muestra que se va a analizar sea realmente representativa del lote. A partir de aquí, nos centramos en la preparación de las muestras. En el caso de los productos a base de granos, la preparación de las muestras consta de dos pasos importantes: la molienda de las muestras y el submuestreo: 1) Se utiliza un molino u otro dispositivo para moler el grano de muestra agregada con el fin de reducir el tamaño de partícula y garantizar la uniformidad. 2) A partir de esta muestra, obtenemos una submuestra representativa de todo el lote, que luego analizamos. Esta muestra de ensayo se prepara posteriormente para la extracción según un protocolo definido [10]. Sin embargo, el muestreo y la preparación de las muestras son procesos complejos, plagados de posibles escollos; cada paso del proceso de preparación de las muestras introduce un nivel de variabilidad que contribuye a la variabilidad total de un único resultado analítico [2, 5]. Numerosos estudios han demostrado que dos tercios de la variabilidad observada se deben Figura 1. Variación observada durante el muestreo (61 %), la preparación de la muestra (36 %) y el análisis (3 %) de una muestra contaminada con 20 ppb de AFLA. Total variation observed for Adaptado de [2].
3+36+61 a 20 ppb AFLA corn sample
Análisis Analysis del3% 3%
Muestreo Sampling 6161% %
10
Preparación de Sample lapreparation muestra 3636% %
al método de muestreo y un tercio a la forma de preparar las muestras. Un porcentaje mucho menor de variabilidad está relacionado con el método analítico aplicado (figura 1). En consecuencia, la exactitud de los resultados depende del grado en que se tengan en cuenta estos tres factores. Mientras que numerosos estudios discuten la importancia de los métodos de muestreo y los disolventes analíticos en el efecto de la detección de micotoxinas (véase [1, 2, 4] destacados), este artículo considerará la importancia de la preparación de las muestras, es decir, la molienda y el tamaño de la muestra, y, al resumir las investigaciones recientes sobre la materia, discutirá el efecto que tiene la preparación de las muestras en el análisis exacto de las micotoxinas y la varianza de la muestra [10].
Seleccione una muestra representativa Cuando un producto está contaminado naturalmente con micotoxinas, los granos contaminados se distribuyen generalmente de forma desigual en un determinado lote; estos cúmulos de granos contaminados se conocen como “puntos de concentración”. Para proporcionar una visión precisa del grado de contaminación en un lote, un plan de muestreo debe tener en cuenta la distribución aleatoria de estos puntos de concentración. Para ello, se toma un gran número de pequeñas muestras incrementales en varios lugares distribuidos por el lote con el fin de obtener una muestra representativa (figura 2) [8]. Figura 2. Procedimiento de selección de muestras para obtener una muestra de ensayo representativa de un lote a granel, donde la muestra agregada es la acumulación de muchas porciones incrementales más pequeñas tomadas de diferentes lugares. El “divisor” segmenta aún más la muestra a granel en muestras de ensayo individuales [10].
Lote Incrementos Muestra agregada Divisor Muestra de ensayo Spot On número 13
La selección de muestras incrementales de un lote a granel es crucial para dar a todos los granos la misma oportunidad de ser seleccionados, de este modo, se reduce el sesgo [10].
Molienda para garantizar un tamaño de partícula uniforme Los mohos que producen micotoxinas tienen varias vías de contaminación; por ello, las micotoxinas pueden encontrarse tanto en el interior de los granos como en la superficie. La vía de infección depende de la micotoxina y del grano en cuestión. Es bien sabido que algunos hongos productores de micotoxinas, como el Fusarium, están presentes en el interior del grano o la almendra, mientras que otros, como el Aspergillus, están presentes en la superficie. La molienda de una muestra resuelve este problema de manera uniforme, ya que rompe los granos contaminados y permite una distribución uniforme de las partículas. En última instancia, esto mejora la detección de partículas contaminadas [3].
Homogeneizar la posible distribución de micotoxinas pasando el grano por una malla y mezclando Tras seleccionar la muestra para que sea representativa del lote y molerla para garantizar un tamaño de partícula uniforme, es necesario homogeneizar la muestra mezclándola bien; esto también ayuda a que sea representativa de la muestra agregada [3]. Los granos se segregan según el tamaño, lo que reduce el grado de representatividad de la muestra y conduce a un resultado analítico inexacto. Por eso, antes de mezclar, confirmamos que la uniformidad de la molienda es adecuada pasando la muestra molida por una malla o tamiz. El objetivo no es filtrar las partículas
más grandes, ya que estas también pueden contener micotoxinas; al contrario, estas partículas más grandes deben incluirse en la muestra. Más bien, aseguramos la uniformidad de la molienda comprobando que un determinado porcentaje de partículas pueda pasar. El Servicio Federal de Inspección de Granos (FGIS) del Departamento de Agricultura de EE. UU. (USDA) tiene especificaciones establecidas para el tamaño de la muestra, la molienda de las muestras y el submuestreo para la determinación de aflatoxina, deoxinivalenol, fumonisina, ocratoxina y zearalenona [9]. El FGIS del USDA recomienda moler una muestra de forma que el 60 % al 75 % de las partículas pasen por un tamiz n.º 20 y utilizar 50 g de muestra de ensayo (incluidas las partículas que no pasan por el tamiz) para la extracción de micotoxinas.
Mantenga una granulometría pequeña, un tamaño de muestra grande y unos resultados exactos de micotoxinas A lo largo de este artículo utilizamos los términos “exactitud” y “precisión”, por lo que conviene hacer una rápida definición de estos términos: la exactitud y la precisión significan las incertidumbres asociadas al análisis que pueden introducirse a partir del método o plan de preparación inicial de las muestras. La exactitud se define como la proximidad de un valor medido al valor real, mientras que la precisión se define como la proximidad de los valores medidos entre sí. El objetivo final debe ser aplicar un proceso que garantice tanto una gran exactitud como una alta precisión [10]. Los estudios demuestran que la precisión de un método de detección de micotoxinas y, por tanto, la varianza de los resultados depende en gran medida del tamaño de partícula de la muestra. Para demostrar
El objetivo de pasar la muestra molida por una malla no es filtrar las partículas más grandes, ya que estas también pueden contener micotoxinas; al contrario, estas partículas más grandes deben incluirse en la muestra.
Tabla 3: Efecto del tamaño de partícula y del tamaño de la muestra en los niveles de aflatoxina en las muestras de maíz contaminadas naturalmente [9]. Número de muestra 1
2
3
4
5
6
7
8
muestra de malla n.º20 60 %
muestra de malla n.º20 99 %
Muestra molida de molino de martillos
10 g
50 g
10 g
50 g
10 g
91
151
140
149
160
222
167
217
135 95
86
108
125
136
110
123
139
111
115
154
136
138
155
141
147
167
148
135
144
151
140
148
149
154
151
155
156
153
162
171
Promedio (ppb)
140
126
147
145
158
DER (%)
40
12
7
4
4
DE (ppb)
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5
7
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Los estudios demuestran que la precisión de un método de detección de micotoxinas y, por tanto, la varianza de los resultados depende en gran medida del tamaño de partícula de la muestra.
la variabilidad de la medición asociada al tamaño de partícula dentro de la muestra y al tamaño de la muestra analizada, nos referimos a varios estudios que la evaluaron (figura 3 y figura 4). En el primer estudio realizado por Whitaker y col. (mostrado en la figura 3), se caracterizaron muestras de maíz contaminadas naturalmente por aflatoxinas. Las muestras de granos de distinta granulometría se pasaron posteriormente por un tamiz n.º 20: 1) una molienda gruesa (60 % de las partículas pasadas), 2) una molienda fina (99 % de las partículas pasadas) y 3) en polvo (con un molino de martillos). A continuación, se analizaron ocho muestras de cada intervalo de molienda utilizando un método de referencia de HPLC modificado para demostrar la varianza entre muestras dentro de un mismo estado básico [9]. Como se puede ver en la tabla 3, hay variaciones en los resultados analíticos dependiendo tanto del tamaño de la muestra como del tamaño de la molienda. Sin embargo, ¿cómo podemos cuantificar esta variación de forma que nos resulte útil? La desviación estándar relativa (DER) o el coeficiente de variación (CV) suelen
utilizarse para determinar el grado de disimilitud de los resultados de un conjunto de datos concreto. La DER suele declararse en porcentaje y se define por la relación entre la desviación estándar y la media. Cuanto menor sea la desviación estándar, menor será la variación dentro del conjunto de datos y más fiable será el resultado. En los datos del estudio representados en la tabla 3, se observó una variabilidad significativa entre las muestras de 10 g compuestas por diferentes tamaños de partícula. Las muestras de 10 g de molido grueso muestran en un 40 % la mayor DER en comparación con la muestra de molido más fino (99 % de la muestra de malla 20), con una DER calculada del 7 %. La DER más baja, el 4 %, se alcanzó con las muestras en polvo del molino de martillos. Aunque un molino de martillos puede no ser económicamente viable para el analista promedio, el estudio de Whitaker y col. demuestra que la mejor manera de evitar la variación proveniente de la preparación de las muestras es moler finamente y utilizar una malla para asegurar la uniformidad del tamaño de partícula [9].
Figure 4. Efecto del tamaño de la molienda (molienda) y del tamaño de la muestra (1 g, 5 g, 10 g y 25 g) en la variabilidad analítica. Se analizaron extractos individuales (n = 10) de diferentes combinaciones de malla y tamaño de muestra para detectar aflatoxina total (A y B), fumonisina total (C y D) y zearalenona (E y F) en maíz contaminado naturalmente. Se utilizaron métodos de referencia para la caracterización de las muestras. Se promediaron los resultados, se calculó la desviación estándar y se representó en las gráficas A, C y E. Además, se determinó el CV en % y se representó como un gráfico de líneas en las figuras B, D y F. (Adaptado con permiso de los autores de [2, 7, 12].)
Aflatoxina total
A Concentración de aflatoxina total [en ppb]
400
n 1 gramo n 5 gramos n 10 gramos n 25 gramos
350 300 250 200 150 100 50 0
B
El 51,3 % pasa por la malla n.º 20
El 97,1 % pasa por la malla n.º 20
12
El 100 % pasa por la malla n.º 30
Coeficiente de variación (CV)
CV [en %] para aflatoxina total
200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
El 52,8 % pasa por la malla n.º 10
El 52,8 % pasa por la malla n.º 10 El 51,3 % pasa por la malla n.º 20 El 97,1 % pasa por la malla n.º 20 El 100 % pasa por la malla n.º 30
1 gramo
5 gramos
10 gramos
GRAMOS de MUESTRA utilizados para la EXTRACCIÓN
25 gramos
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Fumonisina total 9
Cuanto menor sea la n 1 gramo n 5 gramos n 10 gramos n 25 gramos
Concentración de fumonisina total [en ppm]
C
8 7
desviación estándar, menor será la variación
6 5
dentro del conjunto
4
de datos y más fiable
3
será el resultado.
2 1 0
El 50 % pasa por la malla n.º 10
El 50 % pasa por la malla n.º 20
D
El 95 % pasa por la malla n.º 20
El 95 % pasa por la malla n.º 30
Coeficiente de variación (CV)
CV [en %] para fumonisina total
120
El 50 % pasa por la malla n.º 10
100
El 50 % pasa por la malla n.º 20
80
El 95 % pasa por la malla n.º 20
60
El 95 % pasa por la malla n.º 30
40 20 0
1 gramo
5 gramos
10 gramos
GRAMOS de MUESTRA utilizados para la EXTRACCIÓN
25 gramos
Zearalenona 2500
Concentración de zearalenona total [en ppb]
E
n 1 gramo n 5 gramos n 10 gramos n 25 gramos
2000 1500 1000 500 0
El 50 % pasa por la malla n.º 10
El 50 % pasa por la malla n.º 20
F
El 95 % pasa por la malla n.º 20
El 100 % pasa por la malla n.º 30
Coeficiente de variación (CV) El 50 % pasa por la malla n.º 10 El 50 % pasa por la malla n.º 20 El 95 % pasa por la malla n.º 20 El 100 % pasa por la malla n.º 30
CV [en %] para zearalenona
50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
1 gramo
5 gramos
10 gramos
GRAMOS de MUESTRA utilizados para la EXTRACCIÓN
Una publicación de Romer Labs®
25 gramos
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Los resultados demuestran claramente que la variabilidad analítica puede reducirse cuando las muestras se muelen para que pasen por un tamaño de malla más fino.
Para demostrar aún más el impacto del tamaño de partícula (molienda) y del tamaño de la muestra en la variabilidad analítica entre las diferentes micotoxinas, Brunkhorst y col. realizaron un análisis de muestras de maíz contaminadas naturalmente con aflatoxina total (suma de B1, B2, G1 y G2), fumonisina total (suma de B1, B2 y B3) o zearelenona (figura 4). Para este estudio, se molieron 10 muestras de maíz para cada micotoxina con diferentes tamaños de partícula para que pasaran por un tamiz n.º 10, 20 o 30. Asimismo, se investigó la varianza de diferentes tamaños de las muestras (1 g, 5 g, 10 g y 25 g) para la extracción. Las muestras de aflatoxinas se extrajeron con acetonitrilo:agua (84:16) y se analizaron utilizando un método de la AOAC y una celda KOBRA para la bromación poscolumna. Las muestras de fumonisina se extrajeron con metanol:agua (3:1) y también se analizaron según el método de la AOAC. Las muestras de zearealenona también se extrajeron con
acetonitrilo:agua y se analizaron mediante LC-MS/MS. Nota: Los datos mostrados en cada par de gráficos son algo redundantes. Sin embargo, nos parece útil representar el coeficiente de variación en un gráfico separado. Los resultados muestran claramente que el tamaño de la molienda y el tamaño de las muestras influyen en la exactitud del análisis. El estudio sugiere que AFLA y ZON presentan un mayor grado de dependencia es decir, un mayor coeficiente de variación, CV del volumen de la muestra y del tamaño de la molienda que FUM, aunque dudamos en sacar una conclusión firme de estos estudios individuales; se necesita más investigación para confirmar nuestra observación. Para los tamaños de muestra de 1 g y 5 g, las DER para AFLA, FUM y ZON fueron mayores en comparación con los tamaños de muestra de 10 g y 25 g. La variabilidad observada para una muestra de 10 g de maíz contaminado
Figura 5. Efecto de la molienda y del tamaño de la muestra en la variabilidad analítica del deoxinivalenol en la cebada. Se analizaron extractos individuales (n = 10) con diferentes combinaciones de tamaño de malla y tamaño de muestra mediante LC-MS/MS. Se promediaron los resultados, se determinó la desviación estándar representada en el gráfico (A) y se calculó el CV en % y se representó como gráfico de líneas (B) [6].
Deoxynivalenol
A Concentración de deoxinivalenol en ppm
4,50 4,00
n 1 gramo n 5 gramos n 10 gramos n 25 gramos
3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00
El 50 % pasa por la malla n.º 10
B
El 50 % pasa por la malla n.º 20
El 95 % pasa por la malla n.º 20
El 95 % pasa por la malla n.º 30
Coeficiente de variación (CV)
CV [en %] para deoxinivalenol en la cebada
50
El 50 % pasa por la malla n.º 10
45
El 50 % pasa por la malla n.º 20
40
El 95 % pasa por la malla n.º 20
35
El 95 % pasa por la malla n.º 30
30 25 20 15 10 5 0
14
1 gramo
5 gramos
10 gramos
GRAMOS de MUESTRA utilizados para la EXTRACCIÓN
25 gramos
Spot On número 13
con AFLA disminuyó del 58,9 % (molido grueso) al 9,3 % (molido fino), para FUM del 39,8 % (molido grueso) al 4,6 % (molido fino) y para ZON del 21 % (molido grueso) al 2 % (molido fino). Estos resultados confirman aún más el efecto del tamaño de la molienda en la varianza y la exactitud analíticas con respecto a la extracción y el análisis de micotoxinas de los granos. Por último, Brunkhorst y col. aclararon aún más sus hallazgos y determinaron los niveles de deoxinivalenol en muestras de cebada contaminadas naturalmente con el mismo esquema de estudio. Las muestras de cebada se molieron en cuatro tamaños de malla diferentes, se extrajeron (10 extractos individuales en cada tamaño de malla y muestra) utilizando acetonitrilo:agua (84:16) y se analizaron por LC-MS-MS (figura 5) [6]. Los resultados demuestran claramente que la variabilidad analítica puede reducirse cuando las muestras se muelen para que pasen por un tamaño de malla más fino. Además, el aumento del tamaño de la muestra contribuye a reducir la variabilidad analítica. El coeficiente de variación pudo reducirse del 11 % a solo el 5 % cuando se utilizó una muestra de 10 g con una malla n.º 10. Un tamaño de muestra de 10 g y 25 g en combinación con una malla n.º 20 (95 %) y n.º 30 (95 %) proporciona resultados exactos y precisos, reduciendo el CV al 5 % y al 3 %, respectivamente. Como en este estudio se utilizó cebada en lugar de maíz, se sugiere que el efecto del tamaño de la muestra y la molienda en la variabilidad analítica de las micotoxinas puede no depender de la matriz. Es necesario realizar más estudios para confirmarlo [6].
Conclusión: Tamizar, mezclar y repetir según sea necesario Es evidente la importancia de la molienda y el tamaño de la muestra, así como el impacto que estos factores tienen en la reducción de la variabilidad y la minimización de los errores durante el análisis de micotoxinas. En los estudios presentados, se observó una variación significativa entre las muestras molidas gruesas y finas de la misma fuente y nivel de contaminación. Más allá de la simple observación de la variación, los datos de estos estudios sugieren algunos planteamientos iniciales sobre el tamaño de la muestra y la molienda. En cuanto al tamaño de la muestra, 10 g han demostrado ser suficientes, mientras que 25 g pueden proporcionar una exactitud aún mayor. Si se utiliza una malla n.º 20, debe pasar el 95 % de la muestra. Si se utiliza una malla n.º 30, debe pasar el 100 %. El objetivo principal del análisis de micotoxinas es obtener resultados exactos y fiables a pesar de las dificultades de muestreo y las complejidades de la preparación de las muestras de granos y cultivos. Sin embargo, incluso la mejor tecnología, ya sea en forma de pruebas rápidas de vanguardia o de equipos de espectrometría de masas de gran precisión, no servirá de nada si su muestra no es representativa del lote examinado. En una muestra representativa hay algo más que el mero muestreo; la preparación de las muestras es fundamental. Si se respetan los tres factores clave de la preparación de la muestra (tamaño de la molienda, tamaño de las muestras y homogeneidad), se puede mantener la DER en <10 %, aumentando la fiabilidad del resultado analítico.
En cuanto al tamaño de la muestra, 10 g han demostrado ser suficientes, mientras que 25 g pueden proporcionar una exactitud aún mayor.
Referencias 1) E. Pilcher: Sampling for mycotoxins – do we care enough? Romer Labs. 2016, https://www.romerlabs.com/en/ knowledge-center/knowledge-library/articles/news/sampling-for-mycotoxins-do-we-care-enough/ 2) J. Brunkhorst: Effects of particle size and extraction size for effective mycotoxin analysis, Trilogy Analytical Laboratory, presented at AAFCO 2017 Collin L. The effect of grind and extraction size on aflatoxin variability. Trilogy Analytical Laboratory, Washington, MO 63090 3) J. Richard: Sampling and Sample Preparation for Mycotoxin Analysis. . In: Romer Labs Guide to Mycotoxins, 2. 2000 4) T.B. Whitaker ABS, M.B. Doko, B.M. Maestroni, A. Cannavan: Sampling Procedures to Detect Mycotoxins in Agricultural Commodities: Springer; 2011. 5) T.B. Whitaker FED, W. M. Hagler, F. G. Giesbrecht, J. Wu: Variability Associated with Sampling, Sample Preparation, and Chemical Testing for Aflatoxin in Farmers' Stock Peanuts. Journal of AOAC International 1994, 77(1):107 - 116. 6) V. Brunkhorst, C. Maune, J. Brunkhorst, J. Bierbaum, R. Niemeijer: Effect of grind and extraction size on deoxynivalenol result variability, Trilogy Analytical Laboratory 7) V. Brunkhorst, C. Maune, J. Brunkhorst, J. Bierbaum, R. Niemeijer: Effect of grind and extraction size on zearalenone result variability, Trilogy Analytical Laboratory 8) MFood Standards Agency. Mycotoxin sampling guide, 2016. 9) Whitaker, T.B; Slate, A.B; and Johansson, A.S. Sampling feeds for mycotoxin analysis. In: The Mycotoxin Blue Book. D.Durat, ed. Nottingham University Press, Bath, England, 2005] 10) Whitaker T.B;, Sampling Foods for Mycotoxins, Food Additives & Contaminations, 2007. 11) United States Department of Agriculture. Mycotoxin Handbook, 2015 12) Carrie K. Maune, Thomas Maune, Jordan Bierbaum, Julie Brunkhorst, Ronald Niemeijer. The effect of grind and extraction size on Fuinsin Result Variablity. Washington, MO 63090 Una publicación de Romer Labs®
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