Spot On - Micotossine: che cosa ti aspetti da un test rapido? by BIOMIN

Numero 13

Una pubblicazione Romer Labs®

Micotossine: che cosa ti aspetti da un test rapido? Le 4 tipologie di tester Granulometria: un modo semplice per migliorare l'estrazione e i risultati in un test analitico?

ppm

Foto: Sebastian LeeschEyeEm

Indice

4-7

Che tipo di tester delle micotossine sei? Le 4 tipologie di tester e ció che si aspettano da un test rapido Perdite economiche, rischi per la salute dell'uomo e dell'animale, quadri normativi sempre più complessi: le ragioni per cui i produttori di granaglie, alimenti e foraggi hanno bisogno di testare le micotossine sono molteplici. Il manager per le comunicazioni di Romer Labs, Joshua Davis, e il key account manager Ervin Tanyi propongono alcune situazioni consuete nelle quali possono servire i test rapidi. Di Joshua Davis, manager comunicazioni, Romer Labs, ed Ervin Tanyi, key account manager, Romer Labs

Spot On è una pubblicazione della Romer Labs Division Holding GmbH, distribuita gratuitamente. ISSN: 2414-2042

Redazione: Joshua Davis, Cristian Ilea

Co-autori: Joshua Davis, Henriette Hobbs, Nora Kogelnik, Ervin Tanyi Ricerca: Kurt Brunner

Editore: Romer Labs Division Holding GmbH Erber Campus 1 3131 Getzersdorf, Austria Tel: +43 2782 803 0 www.romerlabs.com

©Copyright 2021, Romer Labs® Tutti i diritti sono riservati. La riproduzione della presente pubblicazione, in ogni sua parte, per finalità commerciali, è vietata, in qualsiasi forma materiale, senza il previo consenso scritto da parte del titolare dei diritti d %'autore.

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Foto: BJI

Grafica: GraphX ERBER AG

8-15

Piú piccolo è meglio é: migliora i risultati delle analisi delle micotossine riducendo le dimensioni delle particelle di campione Le ultime ricerche stanno dimostrando che le dimensioni delle particelle di un campione hanno un impatto considerevole sull'accuratezza dei metodi di analisi delle micotossine. Le esperte di micotossine Henriette Hobbs e Nora Kogelnik affrontano il problema e offrono alcune raccomandazioni per fare in modo che le vostre operazioni d´analisi delle micotossine siano accurate e affidabili. Di Nora Kogelnik, product manager, ed Henriette Hobbs, senior scientist

Spot On numero 13

Editoriale Rapido, accurato e di facile utilizzo:

rispondiamo alle esigenze dei tester delle micotossine 39 anni si sentono. Dalla nostra fondazione avvenuta nel 1982, noi di Romer Labs abbiamo messo l'analisi delle micotossine al centro della nostra attività. Questa longevità da record ci ha fornito una conoscenza senza uguali, non solo sui dettagli di analisi, ma anche sulle svariate esigenze del mercato. Non basta sviluppare un prodotto o un servizio che funzioni, deve funzionare soddisfacendo i requisiti specifici del cliente. In altre parole: la precisione non deve penalizzarne la fruibilitá. Quando abbiamo cominciato a lavorare al sistema AgraStrip® Pro WATEX®, ci siamo rivolti a coloro che usano i nostri prodotti quotidianamente: i nostri laboratori di servizio, i nostri team di assistenza tecnica, e, ovviamente, i nostri clienti. Abbiamo domandato loro: “Che cosa vi serve che faccia un test rapido in situ? Quali sono le sfide che vi trovate ad affrontare quotidianamente?” Situazioni di test diversissime tra loro quali i silos di graniglie in Brasile, le fabbriche di amido di mais in Europa e i produttori di pet food negli USA, erano accomunate tutte da una risposta: “Perché i test per le micotossine non possono essere più facili da usare?” Perciò, senza nulla togliere al miglioramento degli standard di sensibilità e rapidità, ci siamo dedicati a ottimizzare il processo e a rispondere alle esigenze segnalate dai tester di micotossine. Il risultato? LFD con bassi LOD e il nuovo lettore AgraVision™ Pro che svolge molto del lavoro che prima facevano gli operatori, controllando i tempi di incubazione, la temperatura e il flusso del test. Con un touchscreen da 7 pollici e 4 alloggiamenti di prova operanti indipendentemente, il lettore AgraVision™ Pro è il nostro modo per dare ai tester delle micotossine prestazioni elevate e affidabilitá. In questo numero di Spot On affronteremo alcuni temi che turbano il sonno dei tester delle micotossine. Il nostro key account manager Ervin Tanyi ha individuato, grazie alla sua pluriennale esperienza, quattro diverse tipologie di “cacciatori di micotossine”, le sfide che affrontano e che cosa si aspettano da un test rapido. La product manager Nora Kogelnik fa, quindi, squadra con la senior scientist Henriette Hobbs per trattare un problema specifico relativo alla preparazione del campione: la granulometria e il suo impatto sull'estrazione del campione e la rilevazione della micotossina. Esse fanno luce su questo argomento, spesso trascurato, e mostrano come bastino pochi accorgimenti per migliorare la precisione della vostra analisi. Vi auguro una piacevole lettura di questo numero di Spot On.

Klaus Hasler Managing Director, Romer Labs Diagnostic GmbH

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Spot On numero 13

Che tipo di tester delle micotossine sei?

Le 4 tipologie di tester e che cosa si aspettano da una soluzione rapida Perdite economiche, rischi per la salute dell'uomo e dell'animale, quadri normativi sempre più complessi: le ragioni per cui i produttori di granaglie, alimenti e foraggi, hanno bisogno di testare le micotossine, sono molteplici. Il manager per le comunicazioni di Romer Labs, Joshua Davis, e il key account manager Ervin Tanyi propongono alcune situazioni consuete nelle quali possono servire i test rapidi. Di Joshua Davis, manager comunicazioni, Romer Labs, ed Ervin Tanyi, key account manager, Romer Labs

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La tecnologia con dispositivo a flusso laterale (LFD) si è dimostrata in molti casi versatile e robusta a sufficienza per essere usata in situ e sufficientemente accurata per sopperire all'esigenza di metodi di laboratorio.

Micotossine: una minaccia crescente Il danno economico imputabile alle micotossine è in aumento: la FAO stima che il 25 % della produzione agricola globale sia contaminata da micotossine. Questi composti tossici possono scatenare problemi di salute per l'uomo e l'animale, che vanno dai tumori a patologie epatiche, renali, a carico del sistema nervoso ed endocrino e molto altro. Si è scoperto che alcune micotossine hanno addirittura un effetto immunosoppressore. Con l'aumentare delle nostre conoscenze sulle micotossine aumentano anche le relative restrizioni previste dalle norme nelle materie prime, nel foraggio e negli alimenti. Dette restrizioni hanno a loro volta generato tutta una serie di strategie e prodotti creati per rilevare le micotossine e prevenire i danni che esse provocano sulla salute e sulle attività economiche. Tra gli strumenti a nostra disposizione, le soluzioni di rilevazione delle micotossine che si basano sulla tecnologia con dispositivo a flusso laterale (LFD) si sono dimostrate versatili e robuste a sufficienza per essere usate sul posto e sufficientemente accurate, in molti casi, per sopperire all'esigenza di metodi di laboratorio. Lavoriamo ormai da molti anni con produttori e commercianti di granaglie e alimenti in tutto il mondo, aiutandoli a implementare strumenti di rilevazione delle micotossine nei loro punti di ricevimento delle materie prime, silos di granaglie, mulini alimentari e altri luoghi dove servano risultati sulle micotossine che siano veloci e precisi. In questo articolo esamineremo quattro diverse tipologie di tester che hanno bisogno di soluzioni rapide di test per ragioni correlate ma diverse. Speriamo che quanti di voi lo leggeranno e si riconosceranno in uno di questi quattro ruoli possano trarre insegnamento su come le soluzioni rapide di test possano esservi d'aiuto nel vostro programma di rilevazione delle micotossine.

1.: l commercianti di granaglie (materie prime in arrivo)

Uno dei punti critici di test più significativo all'interno della filiera alimentare è il ricevimento delle materie prime; ci piace pensare a coloro che svolgono questo ruolo cruciale come ai “commercianti di granaglie”. Il commerciante di granaglie decide se accettare, rifiutare o separare gli ingredienti, il più delle volte cereali grezzi, in base ai loro livelli di contaminazione da micotossine. Ai commercianti di granaglie servono metodi di test che soddisfino requisiti molto specifici e locali. Per il commerciante di granaglie è di importanza cruciale il tempo necessario per ottenere il risultato, perché tutte le parti coinvolte nella catena di rifornimento sono in attesa della sua decisione. Nel giro di pochi minuti, i camionisti o gli operatori ferroviari

hanno bisogno di sapere se possono scaricare le loro consegne e, se sì, dove queste vadano scaricate. Chi si situa più in basso nella catena di rifornimento, come chi aspetta di immagazzinare o di mettere in lavorazione i materiali, fa altresì affidamento su una decisione rapida e accurata da parte del commerciante di granaglie. Il metodo di test dovrebbe pertanto essere semplice, in modo che i commercianti di granaglie possano imparare con facilità e usarlo con disinvoltura. Questa semplicità è fondamentale, perché sono già oberati di altri parametri da misurare: umidità, pulizia, tenore proteico sono solo alcuni parametri oltre alle micotossine che essi devono misurare in un breve lasso di tempo. Il ricevimento delle materie prime richiede dunque una struttura robusta per quanto concerne i test e le attrezzature. Il ricevimento delle granaglie e la macinatura che segue generano molta più polvere rispetto a un ambiente di laboratorio standard. Inoltre, la temperatura ambiente può variare ampiamente in base alle condizioni meteorologiche al momento del raccolto. I dispositivi di test devono essere opportunamente resistenti a queste condizioni ostili. Nell'affrontare tutte queste sfide, il commerciante di granaglie ha bisogno di un metodo pratico per gestire i risultati. Un tempo bastava leggere i risultati da strisce reagenti o sul display di un lettore e registrarli manualmente. Oggigiorno la connettività è indispensabile: i risultati devono essere facilmente trasferibili a sistemi informatici, incluse piattaforme LIM ed ERP.

2.: Il tester artigiano (Controllo qualità per prodotti altamente raffinati)

Come i commercianti di granaglie, chi fa i controlli di qualità su prodotti altamente raffinati come acido citrico, amido, sciroppo di mais ad alto contenuto di fruttosio e altri ingredienti biodegradabili di origine naturale ha bisogno di soluzioni rapide e affidabili per i test delle micotossine. Eppure le loro situazioni di partenza non potrebbero essere più diverse: tipicamente, chi controlla la qualità non è sotto pressione come accade per i camion che aspettano di scaricare le merci nei punti di ricevimento e hanno spesso il vantaggio di un ambiente di laboratorio e di personale formato. Preoccupati principalmente dai requisiti severi della produzione di ingredienti, tengono molto alla precisione; noi li chiamiamo “tester artigiani.” Sebbene sia possibile che abbiano accesso a metodi di analisi quali HPLC o spettrometria di massa, i tester artigiani prediligono spesso un test rapido delle micotossine per la sua semplicità e la sua flessibilità. Spot On numero 13

Aumentare il volume di campioni analizzati con i kit rapidi libera apparecchiature più complesse e tempo in laboratorio per altre attività di laboratorio necessarie.

3.: Il poliziotto delle micotossine (ottemperanza alle norme e ai valori limite)

Sia i commercianti di granaglie, sia i tester artigiani esercitano tipicamente la loro attività, commerciando materie prime o producendo beni da dette materie prime. Le persone che collochiamo nel nostro terzo ruolo non prestano attenzione alla base del business; loro si assicurano che le regole vengano rispettate a dovere. Spesso dipendenti di enti certificatori o agenzie normative, il loro lavoro consiste nel far attuare i valori limite delle micotossine e nella certificazione delle spedizioni su rotaia o su gomma. A noi piace chiamare le persone che svolgono questo ruolo fondamentale “i poliziotti delle micotossine”. I poliziotti delle micotossine lavorano il più delle volte lontano da un tradizionale ambiente di laboratorio; semmai, il loro laboratorio è limitato a ciò che può contenere il bagagliaio della loro auto. Forniscono assistenza a treni destinati a località remote al fine di garantire l'ottemperanza alle norme. Lavorano spesso lontano da centri di commercio, la connessione a Internet è un lusso che non sempre hanno a disposizione. Spesso non hanno l'attrezzatura per macinare di cui dispongono i commercianti di granaglie e devono affidarsi a macinini da caffè per ottenere i campioni di prova. Disporre di complesse attrezzature da laboratorio è invece scontato per il poliziotto delle micotossine; non fa al caso loro qualunque soluzione rapida di test. A parte i requisiti di base di sensibilità, accuratezza e facilitá d´impiego, le strisce reagenti e i lettori devono essere in grado di mantenere prestazioni di qualità pur essendo sempre in movimento. La mobilità è una questione fondamentale, con attrezzature speciali come adattatori di corrente e batterie che consentano ai poliziotti delle micotossine di andare dove c'è più bisogno di loro.

4.: Il custodi di animali (programma di gestione del rischio di micotossine)

Per chi svolge quest'ultimo ruolo, nei test rapidi di cui parliamo, il criterio principale è la salute degli animali che accudisce. I “custodi di animali” appurano che il cibo che i loro animali ricevono sia sano ed entro limiti di legge accettabili per la concentrazione di Una pubblicazione Romer Labs®

micotossine. Le norme però sono solamente una parte della storia; le raccomandazioni dei veterinari possono portare spesso a limiti molto più severi di quelli ufficiali. Il custode di animali sa che, per gestire il rischio di micotossine nel cibo che somministra, dovrà prima misurare quel rischio. La concentrazione di micotossine di uno specifico lotto di alimento, o di ingredienti di esso, fornirà informazioni utili circa le specie animali per le quali può essere utilizzato, o dirà se si possa utilizzare o no. Nella nostra esperienza, il custode di animali non può sempre aspettare che arrivino i risultati delle micotossine da un laboratorio prima di decidere come usare un lotto o se sia indicato un additivo come un “disattivatore” di micotossine. I test rapidi aiutano il custode di animali a mantenere il bestiame in sicurezza dagli effetti nocivi delle micotossine, garantendo che le esigenze nutrizionali del bestiame siano soddisfatte in maniera puntuale.

Che cosa rende facile da usare un sistema di test rapido? Un 'interfaccia utente ampia e strutturata in maniera intuitiva sul lettore è utilissima.

Conclusione: un universale bisogno di velocità (e sensibilità e fruibilità e precisione)

Il commerciante di granaglie, il tester artigiano, il poliziotto delle micotossine, il custode di animali: tutti questi tipi di cacciatori di micotossine condividono alcune aspettative di base nei confronti di un test rapido per micotossine. LA VELOCITÀ. I tester non hanno tempo da perdere. Può darsi che voi siate il commerciante di granaglie con i camion che aspettano di sapere da voi se possono scaricare e dove o magari siete il poliziotto freelance delle micotossine che deve testare, certificare (o no) e correre nel posto successivo. Tutti quanti voi avete bisogno di un sistema che metta il “turbo” nei test rapidi. IN DEFINITIVA, indipendentemente dal ruolo che posiamo avere nel rilevare le micotossine, siamo guidati da un unico imperativo: mantenere i nostri cibi e alimenti per animali entro livelli accettabili. Le soluzioni di test rapido delle micotossine continueranno a essere strumenti indispensabili nel compiere questa missione. PRATICITA'. Cosa rende un sistema di test rapido facile da usare? I clienti continuano a menzionare una cosa che rende pratico un kit: un flusso di lavoro semplificato. Quando consideri i bisogni, diciamo, del guardiano degli animali, che deve destreggiarsi tra diversi tipi di compiti, un flusso di lavoro con il minor numero di passaggi possibile è un must. Vorremmo solo aggiungere che il flusso di lavoro è solo una parte della storia: un'interfaccia utente larga, costruita in modo intuitivo anche sul lettore, fa molto per rendere la vita più facile a tutti i tester. PRECISIONE. Per ovvie ragioni, nessuno in nessuno di questi ruoli puó accettare un sistema di test rapido che offra risultati inaffidabili. Ad esempio, il lavoro altamente specializzato che va nella produzione di materiali raffinati.

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Piú piccolo è meglio é:

migliora i risultati

delle analisi delle micotossine riducendo le dimensioni

delle particelle di campione Le ricerche più recenti stanno dimostrando che le dimensioni delle particelle di un campione

hanno un impatto considerevole sull'accuratezza

dei metodi di analisi delle micotossine. Le esperte di micotossine Henriette Hobbs e Nora

Kogelnik affrontano il problema e offrono alcune raccomandazioni per fare in modo che le vostre

operazioni di test delle micotossine siano accurate e affidabili.

Photo: BJI

Di Henriette Hobbs, Ph.D., Senior Scientist, e Nora Kogelnik, Ph.D., Product Manager

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Campionatura e preparazione dei campioni sono procedure complesse e piene di insidie; ogni fase della procedura di preparazione del campione introduce un livello di variabilità che contribuisce alla variabilità totale all'interno di un singolo risultato analitico.

ella comunità di analisi delle micotossine lavoriamo in genere con tre fasi operative principali per quanto riguarda beni agricoli come mais, frumento e orzo: campionatura, preparazione del campione e analisi. Per determinare la concentrazione di micotossine presenti in una partita sfusa, dobbiamo analizzare una porzione più piccola ma comunque rappresentativa della partita; ciò significa che sono impossibili risultati affidabili senza un piano adeguato di campionatura che includa il prelievo di campioni incrementali della partita per combinarli in un sottocampione (detto anche campione globale). Questo costituisce la base che assicura che il campione da testare sia davvero rappresentativo della partita. Da qui si procede alla preparazione del campione. Per i prodotti a base di cereali, la preparazione del campione si articola in due fasi importanti: macinatura e sottocampionatura. 1) si usa un macinino o un altro attrezzo per macinare il cereale della partita sfusa, al fine di ridurre la granulometria e garantire uniformità; 2) da questo campione otteniamo un sottocampione rappresentativo dell'intera partita, quindi lo analizziamo. Il campione di prova viene quindi preparato per l'estrazione seguendo un protocollo predefinito [10]. La campionatura e la preparazione del campione sono procedure complesse e piene di insidie; ogni fase del processo di preparazione del campione introduce un livello di variabilità che contribuisce alla variabilità totale all'interno del singolo risultato analitico [2, 5]. Numerosi studi hanno dimostrato che due terzi della variabilità osservata derivano dal metodo di campionatura, e un terzo è imputabile al modo in cui

Figura 1. Varianza osservata durante la campionatura (61 %), preparazione del campione (36 %) e analisi (3 %) per un campione contaminato con 20 ppb di AFLA. Adattato Total variation observed for da [2].

3+36+61 a 20 ppb AFLA corn sample

Analisi Analysis 33% %

CampioSampling 61% natura 61 %

Preparazione del Sample campione preparation 3636% %

viene preparato il campione. Una percentuale molto minore di variabilità è riferita al metodo di analisi che viene applicato (figura 1). Di conseguenza, risultati accurati dipendono dal nostro grado di attenzione verso questi tre fattori. Mentre numerosi studi trattano l'importanza dei metodi di campionatura e dei solventi di analisi sull'effetto della rilevazione di micotossine [1, 2, 4] per esempi rilevanti, il presente articolo prenderà in considerazione l'importanza della preparazione del campione, ossia della macinatura e della quantità del campione, e, riassumendo le ricerche recenti in materia, discuterà l'effetto che la preparazione del campione ha su un'analisi accurata delle micotossine e sulla varianza del campione [10].

Selezione di un campione rappresentativo Quando un bene è naturalmente contaminato da micotossine, i grani contaminati sono distribuiti, in generale, in modo disomogeneo all'interno di una determinata partita; questi raggruppamenti di semi contaminati sono detti “hot spot”. Per fornire una panoramica accurata del grado di contaminazione di una partita, un piano di campionatura deve tenere in considerazione la distribuzione casuale di tali hot spot. Ciò avviene prendendo un grande numero di piccoli campioni incrementali da vari punti distribuiti nella partita, al fine di ottenere un campione rappresentativo (figura 2) [8]. La selezione di campioni incrementali da una partita sfusa è determinante per dare a tutti i grani la pari opportunità di essere selezionati, riducendo così la parzialitá [10]. Figura 2. la procedura di selezione del campione per ottenere un campione di prova rappresentativo da una partita sfusa, dove il campione globale è la somma di tante piccole porzioni incrementali prese da luoghi diversi. Il “divisore” segmenta ulteriormente il campione globale in singoli campioni di prova [10].

Lotto Incrementi Campione globale Divisore Campione di prova Spot On numero 13

Macinatura per garantire una granulometria uniforme Le muffe che producono micotossine hanno molte vie diverse per contaminare; ne consegue che le micotossine si possono trovare sia all'interno dei grani, sia in superficie. La via di infezione dipende dalla micotossina e dalla granaglia in questione. È risaputo che certi funghi che producono micotossine, come il Fusarium, sono presenti all'interno del grano o del seme, mentre altri, come l'Aspergillus, sono presenti in superficie. Macinare uniformemente un campione risolve questo problema frantumando i semi contaminati e permettendo una distribuzione omogenea delle particelle. In definitiva, questo migliora la rilevazione delle particelle contaminate [3].

Omogeneizzazione della potenziale distribuzione delle micotossine setacciando i grani attraverso un filtro a maglia e mescolandoli Dopo aver selezionato il campione in modo tale che sia rappresentativo della partita e dopo averlo macinato per garantire una granulometria uniforme, occorre omogeneizzare il campione mescolandolo a fondo; questo aiuta a renderlo anche rappresentativo del campione globale [3]. I grani si separano in base alle dimensioni, riducendo il grado di rappresentatività del campione e portando a un risultato analitico non accurato. Per questo motivo, prima di mescolare, confermiamo che l'uniformità del grano sia adeguata facendo passare il campione macinato attraverso un filtro a maglia o un setaccio. Lo scopo non è setacciare le particelle più grandi, perché anch'esse potrebbero contenere micotossine: anzi, queste particelle più grandi devono essere incluse nel campione. Piuttosto, appuriamo l'uniformità

di macinatura, controllando che una determinata percentuale riesca a passare attraverso il filtro. L'USDA-FGIS, ad esempio, ha fissato delle specifiche di quantità del campione, macinatura del campione e sottocampionatura per aflatossine, deossinivalenolo, fumonisine, ocratossina e zearalenone [9]. L'USDAFGIS raccomanda che il campione venga macinato in modo tale che il 60 – 75 % delle particelle passi attraverso un setaccio N° 20 e che vengano usati 50 g del campione di prova (comprese le particelle che non passano attraverso il setaccio) per l'estrazione della micotossina.

Mantenere bassa la granulometria, alta la quantità di campione e accurati i risultati sulle micotossine Usiamo i termini “accuratezza” e “precisione” in questo articolo, perciò è opportuna una breve definizione di questi termini: accuratezza e precisione significano incertezze correlate all'analisi che possono derivare dal metodo o dal piano di preparazione iniziale del campione. Si definisce accuratezza la prossimità di un valore misurato al valore reale; si definisce invece precisione la prossimità reciproca dei valori misurati. La finalità ultima dovrebbe essere quella di attuare una procedura che assicuri sia elevata accuratezza, sia elevata precisione [10]. Gli studi dimostrano che la precisione del metodo di rilevazione delle micotossine, quindi la varianza dei risultati, dipende in larga misura dalla dimensione delle particelle del campione. Per dimostrare la variabilità di misurazione associata alla granulometria del campione e alla quantità del campione preso in esame, facciamo riferimento a numerosi studi che la valutano (figura 3 e figura 4). Nel primo studio condotto da Whitaker et al. (mostrato nella figura 3), sono stati caratterizzati i campioni di granaglie contaminati da aflatossine.

Tabella 3. l'effetto della granulometria e della quantità di campione sui livelli di aflatossina in campioni di masi naturalmente contaminati [9]. Campione Numero a martello 1

60 % campione filtro 20 50 g

10 g

50 g

10 g

151

140

149

160

167

136

135

151

222

217

5 6 7 8

Media (ppb) SD (ppb)

RSD ( %)

135 95 86

108

140 56

Una pubblicazione Romer Labs®

125 110 123 139 111 115

126 15

154 138 155 141 147 167

147 11 7

148 144 151 140 148 149

145 5

passare un campione macinato attraverso un filtro a rete non è setacciare le particelle più grandi, perché anch 'esse potrebbero contenere micotossine: anzi, queste particelle più grandi devono essere incluse nel campione.

Campione macinato con macina

10 g

2 3

99 % campione filtro 20

Lo scopo di far

154 155 156 153 162 171

158 7

Gli studi dimostrano che la precisione del metodo di rilevazione delle micotossine e quindi la varianza dei risultati dipende in larga misura dalla dimensione delle particelle del campione.

I campioni di grani di diverse granulometrie sono quindi stati passati attraverso un setaccio N° 20: 1) macinatura grossolana (passaggio del 60 % delle particelle), 2) macinatura fine (passaggio del 99 % delle particelle) e 3) polverizzazione (con un mulino a martello). Sono stati quindi analizzati otto campioni di ciascun intervallo utilizzando un metodo di riferimento HPLC, modificato per dimostrare la varianza tra campioni all 'interno di un singolo stato di macinatura [9]. Come si vede nella tabella 3, c'è variazione nei risultati di analisi in base sia alla quantità di campione, sia alla granulometria. Come possiamo però quantificare questa variazione in modo che ci torni utile? La deviazione standard relativa (RSD) o coefficiente di variabilitá (CV) sono spesso utilizzati per determinare quanto siano dissimili i risultati in un particolare set di dati. L'RSD è spesso dichiarato come percentuale ed è definito dal rapporto tra la deviazione standard e la media. Quanto minore è la deviazione standard, tanto minore sarà la variazione all'interno del set di dati e tanto più affidabile sarà il risultato. Nei dati dello studio raffigurato nella tabella

3, è stata osservata una variabilità significativa tra campioni da 10 g di diverse granulometrie. I campioni da 10 g a macinatura grossolana mostrano al 40 % l'RSD più alto rispetto al campione a macinatura fine (99 % del campione con filtro a maglia 20), con un RSD calcolato del 7 %. L'RSD più basso è stato ottenuto con campioni polverizzati con mulino a martello. Anche se un mulino a martello potrebbe non essere, tipicamente, fruibile finanziariamente per il tester medio, lo studio di Whitaker et al. dimostra che il modo migliore per evitare la varianza derivante dalla preparazione del campione è macinare finemente e usare un filtro a maglia per garantire una granulometria uniforme [9]. A ulteriore dimostrazione dell'impatto della granulometria (macinatura) e della quantità di campione sulla variabilità analitica tra diverse micotossine, Brunkhorst et al. hanno analizzato campioni di mais naturalmente contaminati sia da aflatossine totali (somma di B1, B2, G1 e G2), sia da fumonisine totali (somma di B1, B2 e B3) o zearelenone (figura 4). Per questo studio, sono stati macinati con granulometrie diverse 10 campioni di mais per ciascuna micotossina

Figure 4. l'effetto della granulometria (macinatura) e della quantità di campione (1 g, 5 g, 10 g, 25 g) sulla variabilità analitica. Singoli estratti (n=10) di diverse combinazioni di filtro e quantità di campione sono stati analizzati per rilevare l'aflatossina totale (A, B), la fumonisina totale (C, D), e lo zearalenone (E, F) nel mais naturalmente contaminato. Per la caratterizzazione del campione sono stati usati metodi di riferimento. È stata calcolata la media dei risultati, è stata calcolata la deviazione standard e rappresentata nel grafico A, C ed E. Inoltre, è stato determinato il CV in % e rappresentato come grafico a linee nella figura B, D e F. (Adattato con concessione degli autori di [2, 7, 12].)

Aflatossina totale

A Concentrazione di aflatossina totale [in ppb]

400

n 1 grammo n 5 grammi n 10 grammi n 25 grammi

350 300 250 200 150 100 50 0

il 51.3 % passa attraverso filtro 20

il 97.1 % passa attraverso filtro 20

Coefficiente di variabilitá (CV)

CV [in %] per aflatossina totale

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

il 52.8 % passa attraverso filtro 10

il 100 % passa attraverso filtro 30

filtro 10 il 52.8 % passa attraverso filtro 20 il 51.3 % passa attraverso filtro 20 il 97.1 % passa attraverso filtro 30 il 100 % passa attraverso

1 grammo

5 grammi

10 grammi

GRAMMI di CAMPIONE usati per ESTRAZIONE

25 grammi

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Quanto minore

Fumonisina totale 9

Concentrazione di fumonisina totale [in ppm]

n 1 grammo n 5 grammi n 10 grammi n 25 grammi

8 7

è lo scostamento dallo standard, tanto minore è la

6 5

variazione

all'interno della

stringa di dati e

2 1

tanto più affidabile è

il 50 % passa attraverso filtro 10

il 50 % passa attraverso filtro 20

il 95 % passa attraverso filtro 20

il 95 % passa attraverso filtro 30

il risultato.

Coefficiente di variabilitá (CV)

CV [in %] for fumonisina totale

120

filtro 10 il 50 % passa attraverso

100

filtro 20 il 50 % passa attraverso

filtro 20 il 95 % passa attraverso

filtro 30 il 95 % passa attraverso

40 20 0

1 grammo

5 grammi

10 grammi

GRAMMI di CAMPIONE usati per ESTRAZIONE

25 grammi

Zearalenone 2500

n 1 grammo n 5 grammi n 10 grammi n 25 grammi

Concentrazione di zearalenone [in ppb]

2000 1500 1000 500 0

il 50 % passa attraverso filtro 10

il 50 % passa attraverso filtro 20

il 95 % passa attraverso filtro 20

il 100 % passa attraverso filtro 30

Coefficiente di variazione (CV) filtro 10 il 50 % passa attraverso filtro 20 il 50 % passa attraverso filtro 20 il 95 % passa attraverso filtro 30 il 100 % passa attraverso

CV [in %] per zearalenone

50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

1 grammo

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5 grammi

10 grammi

GRAMMI di CAMPIONE usati per ESTRAZIONE

25 grammi

I risultati dimostrano chiaramente che la variabilità analitica può essere ridotta se i campioni vengono macinati per passare attraverso un filtro a maglia più fine.

per consentirne il passaggio attraverso un setaccio N° 10, un setaccio N° 20 o un setaccio N° 30. Sono stati presi in esame anche la varianza delle diverse quantità di campione (1 g, 5 g, 10 g e 25 g) per estrazione. I campioni di aflatossina sono stati estratti con acetonitrile/acqua (84/16) e analizzati con un metodo AOAC e un KOBRA cell per bromurazione post-colonna. I campioni di fumonisina sono stati estratti con metanolo/acqua (3/1) e analizzati anch'essi con il metodo AOAC. I campioni di zearalenone sono stati estratti anch'essi con acetonitrile/ acqua e analizzati con LC-MS/MS. Nota: I dati mostrati in ciascuna coppia di grafici sono alquanto ripetitivi. Tuttavia, troviamo utile rappresentare il coefficiente di variazione in un grafico separato. I risultati mostrano chiaramente che la granulometria e la quantità di campione incidono sull'accuratezza di analisi. Lo studio suggerisce che AFLA e ZON presentino un grado maggiore di dipendenza (ossia un CV più

alto) sul volume del campione e sulla granulometria rispetto a FUM, sebbene noi siamo esitanti a trarre una conclusione da questi studi individuali; serve più ricerca per confermare la nostra osservazione. Per campioni da 1 g e 5 g, gli RSD di AFLA, FUM e ZON erano maggiori di quelli dei campioni da 10 g e 25 g la variabilità osservata per un campione da 10 g di mais contaminato con AFLA è sceso dal 58.9 % (macinatura grossolana) al 9.3 % (macinatura fine), per FUM da 39.8 % (macinatura grossolana) al 4.6 % (macinatura fine), e per ZON dal 21 % (macinatura grossolana) al 2 % (macinatura fine). Questi risultati confermano ulteriormente l'effetto della granulometria sulla varianza analitica e sull'accuratezza per quanto riguarda l'estrazione di micotossina e l'analisi di granaglie. Infine, Brunkhorst et al. hanno ulteriormente spiegato i loro ritrovati e determinato i livelli di deossinivalenolo

Figura 5. l'effetto della macinatura e della quantità di campione sulla variabilità analitica del deossinivalenolo nell'orzo. Singoli estratti (n= 10) con diverse combinazioni di filtro e quantità di campione sono stati analizzati con LC-MS/MS. È stata calcolata la media dei risultati, è stata determinata la deviazione standard rappresentata nel grafico (A) ed è stato calcolato il CV in % e rappresentato come grafico di linee (B) [6].

Deossinivalenolo

A Concentrazione di deossinivalenolo in ppm

4.50 4.00

n 1 grammo n 5 grammi n 10 grammi n 25 grammi

3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 0.00

il 50 % passa attraverso filtro 10

il 50 % passa attraverso filtro 20

il 95 % passa attraverso filtro 20

il 95 % passa attraverso filtro 30

Coefficiente di variabilitá (CV)

CV [in %] per deossinivalenolo nell %'orzo

50 45

filtro 10 il 50 % passa attraverso filtro 20 il 50 % passa attraverso filtro 20 il 95 % passa attraverso filtro 30 il 100 % passa attraverso

40 35 30 25 20 15 10 5 0

1 grammo

5 grammi

10 grammi

GRAMMI di CAMPIONE usati per ESTRAZIONE

25 grammi

Spot On numero 13

in campioni di orzo naturalmente contaminati, con lo stesso approccio di studio. I campioni di orzo sono stati macinati per quattro diverse misure di magia del filtro, estratti (10 estratti singoli per ogni maglia e quantità di campione) usando acetonitrile/acqua (84/16) e analizzati con LC-MS-MS (figura 5) [6]. I risultati dimostrano chiaramente che la variabilità analitica può essere ridotta se i campioni vengono macinati per passare attraverso un filtro a maglia più fine. Inoltre, aumentare la quantità di campione giova ulteriormente a ridurre la variabilità analitica. È stato possibile ridurre il coefficiente di variazione dall '11 % al 5 % utilizzando un campione da 10 g con un filtro a maglia N°10. Un campione da 10 g e da 25 g in combinazione con un filtro a maglia N° 20 (95 %) e N° 30 (95 %) fornisce risultati accurati e precisi, riducendo il CV rispettivamente al 5 % e al 3 %. Poiché questo studio è stato fatto su orzo anziché su mais, esso suggerisce che l'effetto della quantità di campione e della macinatura sulla variabilità di micotossine potrebbe non essere dipendente dalla matrice. A conferma di questo servono studi ulteriori [6].

Conclusione: filtrare, miscelare, ripetere come si deve L'importanza della macinatura dei campioni e della loro quantità sull'impatto che questi fattori hanno di ridurre la variabilità e di minimizzare gli errori durante l'analisi delle micotossine, è evidente. Negli studi presentati, è stata osservata una variazione significativa

tra campioni macinati grossolanamente e finemente provenienti dalla stessa fonte e con lo stesso livello di contaminazione. Al di là della semplice osservazione della variazione, i dati di questi studi suggeriscono alcuni approcci iniziali alla quantità di campione e alla macinatura. Per quanto concerne la quantità del campione, 10 g si sono dimostrati sufficienti, mentre 25 g potrebbero fornire una precisione ancora maggiore. Se si usa un filtro a maglia 20, il 95 % del campione dovrebbe attraversarlo. Se si usa un filtro a maglia 30, il 100 % del campione dovrebbe attraversarlo. Lo scopo principale dell'analisi delle micotossine è ottenere risultati accurati e affidabili nonostante le difficoltà di campionare e le complessità di preparazione del campione per le granaglie e i raccolti. Nemmeno la tecnologia migliore, sotto forma di test rapidi all'avanguardia o di apparecchiature ad alta precisione per la spettrometria di massa, potrà essere utile se il vostro campione non sarà rappresentativo della partita presa in esame. Affinché il campione sia rappresentativo non basta la campionatura; la chiave è la preparazione del campione. Rispettando i tre fattori chiave per la preparazione del campione (granulometria, quantità di campione e omogeneità), potrete mantenere il vostro RSD <10 %, aumentando l'attendibilità del Vostro risultato analitico.

Per quanto concerne la quantità del campione, 10 g si sono dimostrati sufficienti, mentre 25 g potrebbero fornire una precisione ancora maggiore.

Riferimenti 1) E. Pilcher: Campionatura per le micotossine: le diamo sufficiente importanza? Romer Labs. 2016, https://www.romerlabs.com/en/knowledge-center/knowledge-library/articles/news/ sampling-for-mycotoxins-do-we-care-enough/ 2) J. Brunkhorst: Effects of particle size and extraction size for effective mycotoxin analysis, Trilogy Analytical Laboratory, presented at AAFCO 2017 Collin L. The effect of grind and extraction size on aflatoxin variability. Trilogy Analytical Laboratory, Washington, MO 63090 3) J. Richard: Sampling and Sample Preparation for Mycotoxin Analysis. . In: Romer Labs Guide to Mycotoxins, 2. 2000 4) T.B. Whitaker ABS, M.B. Doko, B.M. Maestroni, A. Cannavan: Sampling Procedures to Detect Mycotoxins in Agricultural Commodities: Springer; 2011. 5) T.B. Whitaker FED, W. M. Hagler, F. G. Giesbrecht, J. Wu: Variability Associated with Sampling, Sample Preparation, and Chemical Testing for Aflatoxin in Farmers %' Stock Peanuts. Journal of AOAC International 1994, 77(1):107 - 116. 6) V. Brunkhorst, C. Maune, J. Brunkhorst, J. Bierbaum, R. Niemeijer: Effect of grind and extraction size on deoxynivalenol result variability, Trilogy Analytical Laboratory 7) V. Brunkhorst, C. Maune, J. Brunkhorst, J. Bierbaum, R. Niemeijer: Effect of grind and extraction size on zearalenone result variability, Trilogy Analytical Laboratory 8) MFood Standards Agency. Mycotoxin sampling guide, 2016. 9) Whitaker, T.B; Slate, A.B; and Johansson, A.S. Sampling feeds for mycotoxin analysis. In: The Mycotoxin Blue Book. D.Durat, ed. Nottingham University Press, Bath, England, 2005] 10) Whitaker T.B;, Sampling Foods for Mycotoxins, Food Additives & Contaminations, 2007. 11) United States Department of Agriculture. Mycotoxin Handbook, 2015 12) Carrie K. Maune, Thomas Maune, Jordan Bierbaum, Julie Brunkhorst, Ronald Niemeijer. The effect of grind and extraction size on Fuinsin Result Variablity. Washington, MO 63090 Una pubblicazione Romer Labs®

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