Выпуск 12
Издание Romer Labs®
Референтные Материалы Микотоксинов:
Как Вы Выполняете Свои Измерения?
7 вещей, которые Вам нужно знать о Референтных Материалах Математика лежащая в основе Стандартизированных Контрольных Образцов микотоксинов, Сертифицированныx Референтные Материалы и Сертификаты
Фото: Medioimages/Photodisc
Содержит
4-7
7 вещей, которые Вам нужно знать о референтных материалах микотоксинов Контрольные Референнтные материалы являются необходимым условием успешной качественной и количественной оценки в аналитической химии. Но как они сделаны? Как вы можете быть уверены, что они соответствуют стандартам качества, необходимым вашей лаборатории? Хельмут Рост из Romer Labs отвечает на эти распространенные вопросы и многое другое. Автор: Хельмут Рост, Ведущий Директор Аналитического Сервиса, Romer Labs
Spot On публикация Romer Labs Division Holding GmbH, распространяется бесплатно. ISSN: 2414-2042
Редакторы: Джошуа Дэвис, Кристиан Илеа Составитель: Ли Жуан Чин, Хельмут Рост, Мартина Беласио
Фото: Мартина Баррауда
Графика: GraphX Erber AG Исследование: Курт Брюннер
Издатель: Romer Labs Division Holding GmbH Эрбер Кампус 1 3131 Герцерсдорф, Австрия Tel: +43 2782 803 0 www.romerlabs.com ©Copyright 2020, Romer Labs® Все права защищены. Никакая часть настоящей публикации не может быть воспроизведена в любой материальной форме в коммерческих целях без письменного разрешения правообладателя.
Все фотографии в настоящем документе, являются собственностью Romer Labs, либо используются с лицензией.
2
8-11
Определяемые неопределенности: математика, лежащая в основе Стандартизированных Контрольных Образцов микотоксинов, и как их использовать. Основы расчета измерения неопределенности и как количественно оценить ее в QCMs, тремя простыми математическими формулами. Автор: Мартина Белласио
Издание Spot On 12
От Редактора Ваши результаты должны быть достоверными Работая в аналитической лаборатории, можно почувствовать себя детективом: даже когда ты не на работе, ты постоянно прокручиваешь в голове ту или иную проблему, волнуешься. В чем причина? Многое зависит от работы, которую мы выполняем в наших аналитических лабораториях по микотоксинам, в том числе здесь, в Центре Решений Romer Labs APAC в Сингапуре, где я работаю руководителем лаборатории. Производители зерна, зернотрейдеры и производители кормов-все они зависят от полученных нами результатов, на которые они могут положиться. Эти результаты имеют реальные последствия для всех цепочек поставок продуктов питания и кормов, и они должны быть отправлены клиентам быстро, чтобы они могли принять решение, а мы перейти к следующим партиям для тестирования и анализа. Существует множество других факторов, которые могут увеличить давление, таких как соблюдение требований национальных и международных регулирующих органов по аккредитации и обеспечение четкой прослеживаемости и документации. Однако в этом выпуске Spot On мы фокусируемся на чём-то более основном, что делает возможным нашу повседневную работу по диагностике микотоксинов: Референтные Материалы. Хотя правда, что результаты так же точны, как и приборы, которые мы используем для их измерения, это только часть истории. Как Вы определяете погрешность измерений, поступающих, например, с жидкостной хроматографии/ масс-спектрометрии? Как вы можете быть уверены, что компенсируете матричные эффекты, чтобы знать истинный уровень концентрации микотоксина? Чтобы дать нам некоторое практическое понимание этих вопросов, мы пригласили пару наших экспертов по микотоксинам поделиться своими мыслями. Наш Ведущий Директор Аналитического Сервиса Хельмут Рост, привнесёт свой значительный опыт в области анализа микотоксинов, чтобы обсудить семь наиболее важных аспектов Референтных Материалов Микотоксинов, начиная с того, как они создаются, и заканчивая тем, как интерпретировать сертификат, который поставляется с самым точным стандартизованным инструментом в этой области - Сертифицированными Референтными Материалами. Мартина Белласио, менеджер по продуктам Romer Labs, углубится в математику, лежащую в основе этих справочных материалов, и подчеркнёт преимущества количественного подхода к измерению неопределенности. Так что присоединяйтесь ко мне и моим коллегам - детективам по микотоксинам в этом выпуске Spot On. Надеюсь, Вам понравится.
Ли Жуан Чин Руководитель Лаборатории Romer Labs® APAC Центра Решений
A уm П б лa и g кa аz ц i nиeи oRf oRmoemr eLr aLbasb®s ®
3
4
Издание Spot On 12
7
вещей,
которые Вам
необходимо знать о
Референтных Материалах Микотоксинов
Качественные Референтные Материалы являются необходимым условием успешной качественной и количественной оценки в аналитической химии. Но как их производят? Как Вы можете быть уверены, что они соответствуют стандартам качества, необходимым вашей лаборатории? Что такое сертифицированные референтные материалы? Как Вы понимаете смысл Сертификата? Хельмут Рост из Romer Labs отвечает на эти и многие другие распространенные вопросы. Автор Хельмут Рост, Ведущий Директор Аналитического Сервиса, Romer Labs
П у б л и к а ц и и R o m e r L a b s ®
5
Представьте, что
❶ Зачем нам нужны Референтные Материалы?
меченые изотопами референтные материалы - это "супер референтные материалы" для массспектрометрии.
Короткий ответ заключается в том, что регулирующие и сертифицирующие органы требуют или рекомендуют лабораториям использовать их. Например, Соединенные Штаты и Европейский Союз регулируют ряд микотоксинов, устанавливая максимальные уровни этих загрязняющих веществ в кормах и пищевых продуктах. Кроме того, лаборатории, аккредитованные в соответствии с ISO 17025, должны использовать аттестованные и надёжные референтные материалы для соответствия своей аккредитации. Несколько более длинный ответ заключается в том, что лаборатории используют референтные материалы для повышения надежности своих результатов. В последние десятилетия анализ загрязняющих веществ, таких как микотоксины, становится все более важным для характеристики и оценки образцов пищевых продуктов и кормов. Референтными материалами являются вещества с определенными свойствами, такие как афлатоксин В1, растворенный в ацетонитриле в концентрации 2 мкг/мл. Специфические свойства референтного материала и, что немаловажно, его относительная чистота-служат эталоном, с помощью которого лаборанты могут подтвердить точность полученных собственных результатов.
❷ Как определяется референтный материал?
Референтный материал является достаточно однородным и стабильным по заданному свойству; например, он имеет определенный процент чистоты микотоксина или микотоксинов в твердом виде, или определенную концентрацию в жидком стандарте. Эти качества обеспечивают их пригодность для использования в процессе измерения. Производители референтных материалов, выполняющие требования стандарта ISO 17034:2016 (”Общие требования к компетенции производителей референтных образцов”), считаются компетентными. Текст в норме ИСО перечисляет соответствующие требования на нескольких десятках страниц вместе с дополнительной литературой. Таким образом, материал-кандидат должен быть хорошо охарактеризован с точки зрения идентичности и чистоты, прежде чем его можно будет использовать в качестве основы для любого эталонного марериалa. Производственный план обеспечивает правильную документацию для всех выпускаемых партий. Длительные и кратковременные испытания на стабильность при различных темпеi
6
EC No. 1881/2006.
ратурах должны доказать, что материал стабилен до указанного срока годности. Проверка однородности каждой партии подтверждает, что материал равномерно распределен по всем производимым ёмкостям. Все анализы должны соответствовать требованиям стандарта ISO 17025; аккредитация по стандарту ISO 17034 означает, что лаборатория аккредитована в соответствии со стандартом ISO 17025 со своими аналитическими методами.
❸ Как производятся референтные материалы для анализа микотоксинов?
Большинство микотоксинов вырабатывается тремя родами грибов: Aspergillus, Penicillium и Fusarium. Материал-носитель инокулируют грибковой суспензией и инкубируют в течение нескольких недель. Образцы отбираются в процессе ферментации, чтобы подтвердить создание целевого микотоксина. Типичные выходы производственного процесса составляют несколько граммов исходного микотоксина на кг материала-носителя и могут значительно варьироваться в зависимости от микотоксина и рассматриваемого процесса ферментации. Как только инкубация завершена, начинается настоящая работа: инженер лаборатории очищает очень грубый «черновой» экстракт. Процесс начинается с фильтрации и жидкостно-жидкостной экстракции, чтобы уменьшить вес и объем экстракта и удалить основные примеси. Ключевой процесс очистки состоит из (полу)препаративных стадий хроматографической очистки, на которых примеси и побочные продукты отделяются от основного продукта за счет различного адсорбционного поведения в хроматографической колонке. Эта работа требует высокой степени мастерства и опыта, так как каждый микотоксин имеет свои собственные свойства и режим удержания. Очистка завершается высушиванием продукта, его взвешиванием и повторной проверкой качества. Одним из конкретных видов использования референтных материалов является использование матричных эталонных материалов (или Материалов Контроля Качества), которые состоят в основном из пищевой или кормовой матрицы, загрязненной природными микотоксинами. Одним из примеров является кукуруза с дезоксиниваленолом. Эти материалы могут использоваться для проверки качества, при анализе конкретных образцов пищевых продуктов и кормов.
❹ Почему имеет смысл использовать изотопно-меченые референтные материалы для микотоксинов?
Аналитики, использующие масс-спектрометрию, придают большое значение Изотопно-Меченым Издание Spot On 12
Сертифицированные референтные материалы - это самый высокий уровень стандартизации.
референтным материалам – и вполне обоснованно. Представьте, что это "супер референтные материалы" для масс-спектрометрии. Они могут делать тоже, что и материалы, не меченные изотопами и даже больше. Например, они компенсируют нежелательные эффекты, такие как снижение эффективности экстракции, низкое извлечение или поведение матрицы при анализе аналитов; следовательно, они необходимы при настройке любой аналитической процедуры. Изотопно-меченые референтные материалы производятся, как описано выше, с одним важным отличием: атомы 12С заменяются атомами 13С. Поэтому продукты, меченные изотопами, имеют те же физические и химические свойства, что и немеченые материалы. Они добавляются перед анализом и проходят ту же процедуру, но компенсируют любое завышение или недооценку немеченых референтных материалов.
❺ Как вы проверяете качество референтных материалов?
Чистота, то есть качество продукта, имеет первостепенное значение и должна быть как можно выше или превышать 95%. В то время как повторяющиеся продукты можно сравнить с предыдущими партиями для проверки их качества, новый продукт должен быть подвергнут гораздо более полному исследованию. Этот вид исследования твердых материалов может включать в себя несколько высокоселективных и чувствительных методов: определение структуры с помощью масс-спектрометрии, инфракрасной спектроскопии или спектроскопии ядерного магнитного резонанса, которые могут сообщить нам о любых возможных присутствующих примесях. В любом случае чистота должна быть определена максимально аккуратно и точно. Наличие сертифицированного референтного материала может быть огромным преимуществом, так как позволяет непосредственно отслеживать собственный референтный материал (см. номер 6 ниже). Сегодня стандартным методом определения количества жидких эталонных материалов микотоксинов (твердых материалов, растворенных в растворителе) является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), подключенная к соответствующему детектору, такому как УФ (ультрафиолет) или ФЛД (флуоресцентная детекция). Этот метод имеет почти универсальную применимость, так как большинство микотоксинов чувствительны к УФ/ФЛД. В веществах, меченных изотопами, соотношение 13С к 12С (также известное как изотопная картина) может быть определено с помощью сканирования с повышенным разрешением с помощью масс-спектрометра; изотопная чистота 13С должна быть больше 98%. Лаборатории, определяющие свойства эталонП у б л и к а ц и и R o m e r L a b s ®
ного материала, должны быть аккредитованы в соответствии с ISO 17025 ("общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий") Поскольку лаборатории, сертифицированные по стандарту ISO 17025, выполняют требование метрологической прослеживаемости, их результаты могут быть использованы для определения сертифицированного эталонного материала.
❻ Что такое сертифицированный референтный материал?
Здесь мы приходим к высочайшему уровню стандартизации. Сертифицированный эталонный материал характеризуется метрологически обоснованной процедурой определения его свойств (например, % чистоты или концентрации) и сопровождается сертификатом, который предоставляет сертифицированное значение вместе с расчетной погрешностью этого значения. Это означает, что существуют различия между референтными материалами и сертифицированными референтными материалами с точки зрения прослеживаемости и неопределенности. В повседневной работе лаборатории обычно используются референтные материалы. Если референтный материал нуждается в прослеживаемости, то в качестве эталона может быть использован сертифицированный референтный материал с его метрологической прослеживаемостью. Однако сертифицированные референтные материалы в настоящее время существуют только для некоторых микотоксинов.
Чистота референтных материалов должна определяться максимально аккуратно и точно. Наличие сертифицированного референтного материала является огромным преимуществом.
❼ Как Вы читаете сертификат?
Квалификационный сертификат предоставляет необходимую информацию о референтном материале. Обычно он включает описание продукта с номером партии и датой истечения срока годности, поставщика с адресом, уведомление об опасности, назначение, инструкции по правильному использованию, условия хранения и, самое главное, референтные значения. Срок годности применяется к неоткрытому продукту при указанных условиях хранения. Для сертифицированных эталонных материалов сертификат документирует еще несколько характеристик: сертифицированные значения, размер неопределенности и описание метрологической прослеживаемости. Неопределенность рассчитывается на основе таких факторов, как чистота и производство продукта и – если не пренебрежимо малы – его стабильность и однородность (подробнее о расчете и использовании значений неопределенности см. статью “Определяемые неопределенности”). Сертифицированное значение подтверждается анализом, в котором калибровка проводится по независимо подготовленной эталонной партии целевого аналита.
7
Определяемые Неопределённости:
Математика, лежащая в основе Контрольных Образцов микото
8
Издание Spot On 12
Стандартизированных оксинов, и как её использовать. Стандартизированные Контрольные Образцы (QCMs) представляют собой образцы с известной концентрацией интересующего аналита. В условиях сервисной лаборатории они обычно анализируются в тех же условиях, что и образцы клиентов. Анализируя QCMs можно получать данные, которые лаборатории могут использовать для проверки эффективности недавно разработанного метода, устранения любых проблем с анализом и создания графиков контроля качества. В этой статье Мартина Белласио познакомит вас с основами расчета измерения неопределенности и с тем, как количественно оценить ее в QCMs. Автор Мартина Белласио
П у б л и к а ц и и R o m e r L a b s ®
П
ри выполнении валидационных процедур измерения, специалисты сравнивают значения, полученные при каждом измерении QCM, с сертифицированным значением, указанным в его сертификате. Неофициально, некоторые описывают это сравнение качественным образом с такими утверждениями, как: "измеренная величина хорошо согласуется с сертифицированным значением Стандартизированного Контрольного Образца.” Однако количественный подход может сравнить эти два значения математически, тем самым исключив субъективность и предоставив инструмент для прослеживания результатов с течением времени. Все измерения имеют неопределенности. Следовательно, неопределенность является ключевым фактором в интерпретации научных данных, поскольку она дает нам информацию о том, насколько точным считается полученное значение.
Почему количественный подход предпочтительнее при измерении неопределенности в QCM?
Количественный подход рассматривает значение, измеренное в практическом применении, значение, сертифицированное производителем QCM,вместе с их соответствующими неопределенностями. Давайте сначала кратко обсудим понятие неопределенности измерения, и почему его важно учитывать. Все измерения подвержены неопределенности: ни одно измерение не является точным. Следовательно, неопределенность является ключевым фактором в интерпретации научных данных, поскольку она дает нам информацию о том, насколько точным считается полученное значение. Количественно оценивая неопределенность, связанную со значением, можно получить более полную картину результатов, что делает их более точными. ”Руководство ИСО по выражению неопределенности в измерениях (GUM)“ и руководство Eurachem/CITAC ”Количественная оценка неопределенности в аналитических измерениях" являются широко используемыми справочными материалами для расчёта неопределенности. Как уже упоминалось ранее, сравнение измеренного значения(значений) с сертифицированным
Все измерения подвержены неопределенности: ни одно измерение не является точным. Следовательно, неопределенность является ключевым фактором в интерпретации данных, поскольку она дает нам информацию о том, насколько точным можно считать полученное значение.
9
Количественная оценка неопределенности имеет большое значение для обеспечения того, чтобы мы могли полагаться на наши методы и получать максимально объективные результаты.
значением Стандартизированного Контрольного Образца требует вычисления разницы между этими двумя значениями и так называемой расширенной неопределенностью. В следующих параграфах мы узнаем, как рассчитать эти значения и как применить их на практическом примере.
Как определить степень отклонения измеряемой величины от сертифицированной
Шаг 1: Определите разницу между сертифицированным значением и средним результатом измеренных значений (∆m). На этом этапе мы вычисляем абсолютную разность (обозначенную символом ∆m), между сертифицированным значением и средним результатом измеренных значений (Формула 1). Мы берем здесь среднее из полученных значений, так как любой образец должен быть измерен более одного раза, чтобы гарантировать точность результата. Формула 1: Δm = │cm − cQCM │ Δm = абсолютная разница между средним результатом измеренных и аттестованных значений cm = Измеренные значения
cQCM = Сертифицированное значениe
Шаг 2: вычислите суммарную неопределённость (u∆). Теперь мы вычисляем суммарную неопределённость (u∆). (Формула 2). Для этого индивидуальные неопределенности (см. ниже) сертифицированного значения и полученных значений должны быть уже известны (см. ниже “поиск индивидуальных неопределенностей"). Формула 2 показывает точные, математические операции. Формула 2: u∆ =
um2 + uQCM2
uΔ = суммарная неопределённость измеренных и сертифицированных значений
um = неопределенность полученных измерений
uQCM = неопределенность сертифицированного значения
Шаг 3: Вычислите расширенную неопределенность (U∆). Здесь мы умножаем суммарную неопределённость на коэфициент охвата, обычно равный 2.
10
Формула 3: U∆ = 2· u∆ ∆ = расширенная неопределенность разницы U между полученными и сертифицированными значениями
uΔ = суммарную неопределённость полученной и сертифицированной величин
Шаг 4: Сравните разницу между сертифицированным значением и полученными значениями (∆m) с расширенной неопределенностью (U∆). Абсолютная разница между средним значением полученных величин и сертифицированным значением (Δm) и расширенная неопределенность (U∆) являются двумя основными параметрами при определении того, значительно ли отклоняется полученное значение от сертифицированного значения. Мы определяем “существенную разницу" следующим образом: если Δm меньше или равно U∆, то существенной разницы между результатом измерения и сертифицированным значением нет. Сравнение абсолютной разности между средним значением измеряемых величин и сертифицированным значением с расширенной неопределенностью позволяет использовать математический подход к сравнению двух величин и поддерживает лаборатории в соответствии с руководством ISO 98-3:2008 (ISO Руководство по выражению неопределенности в измерениях, GUM).
Вывод: Определенная Неопределенность
Хотя понятие неопределенности измерения может быть несколько трудным для понимания на первый взгляд, оно может служить утверждением о степени точности измерительной процедуры по отношению к другим. Количественная оценка этой неопределенности имеет большое значение для обеспечения того, чтобы мы могли полагаться на наши методы и получать результаты, которые являются более объективными и менее зависимыми от качественных утверждений: вместо утверждения, например, что “измеренное значение согласуется с сертифицированным значением”, расчет неопределенности позволяет нам строить графики и документировать отклонения с большей и более реальной точностью. Имея материалы для контроля качества, лаборатории имеют мощный инструмент, который может помочь им постоянно совершенствовать свои методы. Ниже приводится пример, помогающий прояснить эти принципы. Примечание: Большая часть этого текста была Издание Spot On 12
адаптирована из приложения ERM “Cравнение результата измерения с сертифицированным значением” Томаса Линсингера.
Пример
QCM имеет сертифицированное значение 12.9 мкг/кг афлатоксина, при этом оценивается расширенная неопределенность U от ± 0,9 мкг/кг, при коэффициенте охвата K = 2. UQCM, неопределенность сертифицированного значения, может быть рассчитана путем деления UQCM на коэффициент охвата, поэтому uQCM = 0.9/2 мкг/кг= 0.45 мкг/кг. Было проведено 12 лабораторных измерений, которые дали в среднем 14,3 ± 1,8 мкг/кг. Неопределенность измеряемых величин (um) в этом случае будет оцениваться с использованием стандартного отклонения. Стандартное отклонение делится на квадратный корень из числа измерений. um примерно рассчитывается как 1,8/ 6 мкг / кг = 0,74 мкг/кг. Имея как неопределенность сертифицирован-
ной величины, так и неопределенность измереных значений, мы можем теперь оценить, существует ли существенная разница между измеренной и сертифицированной величинами. Во-первых, абсолютная разница между средним значением измеренных величин и сертифицированным значением рассчитывается по Формуле 1 сверху:
Качественные
Δm = │cm − cQCM │ = │14.3-12.9│ мкг/кг = 1.4 мкг/кг
инструмент,
u∆ = um2 + uQCM2 = 0.742 + 0.452 мкг/кг = 0.87 мкг/кг U∆ = 2· u∆ = 2 · 0.87 мкг/кг = 1.7 мкг/кг
помочь им постоянно
Затем суммарная (u∆) и расширенная (U∆) неопределенности вычисляются по формуле 2:
Абсолютная разница между средним значением измеренных величин и аттестованным значением (∆m = 1,4 мкг/кг ) меньше расширенной неопределенности (U∆ = 1,7 мкг/кг). В этом примере нет существенного отклонения между измеренным значением и сертифицированным значением.
Контрольные Образцы дают лабораториям мощный который может совершенствовать свои методы.
Нахождение индивидуальных неопределенностей Здесь показано, как найти индивидуальные неопределенности. Это Вам понадобится для шага 2 рассмотреном выше, “вычислите суммарную неопределенность (u∆)". • Неопределенность сертифицированного значения: Расширенная неопределенность каждого сертифицированного значения (UQCM) обычно указывается в сертификате. Используя это значение, неопределенность сертифицированного значения может быть рассчитана путем деления его на коэффициент охвата, который также указан в сертификате. На рисунке 1 мы видим пример, взятый из сертификата BiopureTM. Здесь указаны как расширенная неопределенность, так и коэффициент охвата. Неопределенность стандарта была получена путем деления расширенной неопределенности на коэффициент охвата (который равен 2). Рис. 1. Расширенная неопределенность и другая информация в сертификате Biopure™ QCM зеараленона в кукурузе.
Смесь
Зеараленон
Зеараленон в Кукурузе Массовая Концентрация а Ориентировочное значение b Неопределённость c 366 мкг/кг ± 33 мкг/кг
a Указано на поставляемом материале b Невзвешенное средне принятое значение c Оценочная расширенная неопределенность U с коэффициентом охвата k = 2
• Неопределенность измеряемых величин: Согласно стандарту ISO/IEC 17025, неопределенности измерений должны быть известны для каждого измерения, выполняемого в лаборатории. Однако лаборатории не всегда знакомы с этими неопределенностями. В таких случаях несколько подходов могут помочь Вам оценить неопределенность измерений. Вот несколько распространенных практик: ➤ Карты контроля качества могут быть использованы для определения приблизительной оценки um. ➤ Можно использовать стандартное отклонение воспроизводимости от других источников (например, от межлабораторного сравнения) при условии наличия доказательств того, что результаты работы лаборатории эквивалентны результатам работы участников данного исследования. ➤ Стандартное отклонение измерений дает очень грубую оценку их неопределенности. Однако есть важная оговорка: эта оценка обычно недооценивает реальную неопределенность.
Источник: Romer Labs
П у б л и к а ц и и R o m e r L a b s ®
11
Ваша Копия Spot On
Золотой стандарт в тестировании микотоксинов Высококачественные референтные материалы необходимы для получения точных и надежных результатов в любой лаборатории. С помощью Biopure™ компания Romer Labs предлагает самый широкий ассортимент высококачественных референтных материалов по микотоксинам, доступных в настоящее время.
Вершина линейки продуктов Biopure™ - это полностью меченые 13C внутренние стандарты. Доступные для всех регулируемых микотоксинов, эти калибранты основаны на запатентованной технологии, гарантирующей высочайший стандарт аналитической точности.
Свяжитесь с нами для получения дополнительной информации: www.romerlabs.com | solutions@romerlabs.com