Специальный выпуск Обзор микотоксинов Публикация Romer Labs®
Эта небольшая проба может рассказать о многом
Результаты последнего Глобального исследования BIOMIN по микотоксинам Оценка риска по множеству микотоксинов Вне рамок стандартов
Photo: dusanpetkovic
Содержание
4-7
Результаты исследования BIOMIN по микотоксинам, 2018 год Результаты и тенденции, выявленные при наиболее полном на сегодня исследовании.
Авторы: Александро Маркьоро, менеджер по продукции, связанной с микотоксинами, компания BIOMIN
Spot On — издание Romer Labs Division Holding GmbH, распространяется бесплатно. ISSN: 2414-2042
Редакторы: Джошуа Дэвис, Кристиан Илеа
Авторы: Мартина Беллазио, Александро Маркьоро, Ён Ви Ляу Графика: GraphX Erber AG Исследования: Курт Бруннер
Публикация: Romer Labs Division Holding GmbH Erber Campus 1 3131 Getzersdorf, Austria Tel: +43 2782 803 0 www.romerlabs.com
©Авторское право 2019, Romer Labs® Все права защищены. Запрещается полное или частичное воспроизведение настоящего издания в любой материальной форме для коммерческих целей без письменного разрешения владельца авторских прав. Все фотографии в журнале являются собственностью Romer Labs, либо используются по лицензии.
8-11 Оценка риска микотоксинов: никаких секретов Из примерно 400 существующих микотоксинов только для 6 установлены стандарты. Как получить полное представление о распространенности новых и скрытых микотоксинов, а также «главных подозреваемых»? Автор Ён Ви Ляу, управляющий директор, Romer Labs Asia
Romer Labs входит в состав ERBER Group
2
Специальный выпуск Spot On, посвященный микотоксинам
От редактора
Эта небольшая проба может рассказать о многом Каждый год эксперты нашего близкого партнера — компании BIOMIN — публикуют результаты своего Глобального исследования по микотоксинам. Представители кормовой промышленности и животноводства высоко ценят его, и это неудивительно: это исследование, в котором проанализировано более чем 80 000 проб примерно в 80 странах, является первым в отрасли по выявлению закономерностей контаминации микотоксинами сырьевых материалов и кормов. Оно сыграло немалую роль в повышении информированности о множестве путей воздействия микотоксинов на свиней, птицу, жвачных и других животных. В условиях нестабильности рынка и стремительного изменения климата, это исследование проясняет распространенность включенных и не включенных в стандарты микотоксинов. Оно также является полезным инструментом для сотрудников лабораторий. В прошлогоднем выпуске Spot On, посвященном исследованию, я отметила важность наличия надежных методов выявления микотоксинов на местах до создания программы контроля микотоксинов: Нельзя контролировать то, что не измерено. В этом году результаты исследования стали чуть сложнее; по данным наших друзей из компании BIOMIN, мы становимся свидетелями роста распространенности совместного присутствия нескольких микотоксинов. Иными словами, растет вероятность того, что в средней пробе зерна или корма мы увидим измеримые количества более чем одного микотоксина. Проблемы, которые может вызвать такое совместное присутствие, предугадать сложно. Однако мы наблюдали синергизм определенных микотоксинов. «Синергизм» означает, что совместный эффект двух исследуемых микотоксинов больше, чем простая сумма отдельных эффектов. Более того, это относится к разным видам микотоксинов, а не только распространенным типа деоксиниваленола и афлатоксина. Чем больше мы знаем об опасностях совместной контаминации, тем важнее иметь валидированные методы анализа, позволяющие выявить несколько микотоксинов в одной пробе. В этом выпуске Spot On мой коллега из компании BIOMIN Александро Маркьоро рассматривает некоторые результаты Глобального исследования BIOMIN по микотоксинам и анализирует частоту обнаружения микотоксинов в разных регионах мира. Моя коллега из Romer Labs Asia Ён Ви Ляу рассказывает о новых и скрытых микотоксинах, а также приводит примеры влияния совместной контаминации микотоксинами. Она также представляет методы анализа проб зерна и корма на несколько микотоксинов одновременно. Мы любим повторять: эта небольшая проба может рассказать о многом. Анализ на множественную контаминацию может пролить свет на эту историю. Надеюсь, что этот выпуск Spot On доставит вам удовольствие.
П у б л и к а ц и я R o m e r L a b s ®
Мартина Беллазио, PhD
Менеджер по продукции, связанной с микотоксинами
3
Photo: eclipse_images
Глобальное исследование BIOMIN по микотоксинам, 2018
4
Специальный выпуск Spot On, посвященный микотоксинам
В последнем издании ежегодного исследования, включающего данные анализа 18 424 пробы сельскохозяйственного сырья из 79 стран и более 81 900 анализов, подчеркиваются основные опасности наличия наиболее важных микотоксинов в важнейших кормах и их потенциальный риск для животноводческого производства. Автор Александро Маркьоро Менеджер по продукции, связанной с микотоксинами, BIOMIN
Р
езультаты Глобального исследования BIOMIN по микотоксинам включают данные по частоте контаминации основных компонентов кормов афлатоксинами (АФЛ), зеараленоном (ЗЕН), деоксиниваленолом (ДОН), Т-2 токсином (Т-2), фумонизинами (ФУМ) и охратоксином (ОХР). К этим основнымм компонентам относятся в числе прочего кукуруза (маис), пшеница, ячмень, рис, соевая мука, кукурузно-глютеновая мука, сухая барда и силос.
Уровни риска В связи с высокой чувствительностью современных аналитических инструментов уже недостаточно говорить просто о наличии микотоксинов; необходимо также учитывать концентрации. Соответственно, в последних результатах вы найдете карту риска поражения микотоксинами, основанную как на присутствии микотоксинов, так и на их потенциальном вреде для скота в зависимости от концентраций, связанных с известными рисками для здоровья. На Рисунке 1 показаны данные по частоте обнаружения микотоксинов для каждого региона в процентах от общего числа исследованных проб. Общий уровень риска для конкретного региона определяется процентом микотоксинов выше порогового уровня риска для скота. Пороговые уровни риска основаны на мировом практическом опыте полевых и научных исследований, которые максимально точно отражают практические ситуации; также принимается во внимание наиболее Продолжение статьи см. на стр. 8. П у б л и к а ц и я R o m e r L a b s ®
5
АФЛ 15% ЗЕН 56% ДОН 64% T-2 44% ФУМ 47% ОХР 16%
Северная Европа Общий риск 56%
Центральная Европа Общий риск 46%
АФЛ 1% ЗЕН 42% ДОН 66% T-2 49% ФУМ 44% ОХР 10%
АФЛ 21% ЗЕН 67% ДОН 58% T-2 24% ФУМ 84% ОХР 31%
Ближний Восток Общий риск 60%
АФЛ 8% ЗЕН 34% ДОН 67% T-2 3% ФУМ 44% ОХР 3%
Южная Европа Общий риск 61%
Северная Америка Общий риск 73%
Рисунок 1. Глобальная карта частоты обнаружения микотоксинов и риска в различных регионах. Квадратами отмечен процент исследованных проб, пораж риска в соответствии с условными обозначениями.
АФЛ 15% ЗЕН 71% ДОН 65% T-2 15% ФУМ 87% ОХР 15%
ДОН и ФУМ пред-
ным животным в
Южная Америка Общий риск 72%
Северной Америке.
АФЛ 27% ЗЕН 48% ДОН 67% T-2 25% ФУМ 72% ОХР 7%
АФЛ 26% ЗЕН 81% ДОН 77% T-2 10% ФУМ 71% OTA 6%
Южная Африка Общий риск 67%
сельскохозяйствен-
АФЛ 14% ЗЕН 10% ДОН 70% T-2 0% ФУМ 84% ОХР 3%
Африка Общий риск 65%
большую угрозу
Центральная Америка Общий риск 70%
ставляли наи-
АФЛ 7% ЗЕН 72% ДОН 72% T-2 1% ФУМ 74% ОХР 6%
Условные обозначения Умеренный риск
6
Крайне высокий риск
n n n n
Умеренный риск: 0–25% проб выше порогового уровня риска Высокий риск: 26–50% проб выше порогового уровня риска Очень высокий риск: 51–75% проб выше порогового уровня риска Крайне высокий риск: 76–100% проб выше порогового уровня риска Специальный выпуск Spot On, посвященный микотоксинам
АФЛ 28% ЗЕН 77% ДОН 90% T-2 1% ФУМ 87% ОХР 7%
Океания Общий риск 17%
АФЛ 87% ЗЕН 22% ДОН 33% T-2 0% ФУМ 86% ОХР 73%
АФЛ 10% ЗЕН 55% ДОН 82% T-2 2% ФУМ 72% ОХР 14%
18 424
81 936
79
Проб
Анализов
Стран
Совместная контаминация 70%
Юго-Восточная Азия Общий риск 70%
Китай и Тайвань Общий риск 85%
Восточная Азия Общий риск 60%
АФЛ 3% ЗЕН 53% ДОН 66% T-2 54% ФУМ 37% ОХР 35%
Южная Азия Общий риск 86%
Восточная Европа Общий риск 36%
енных соответствующими микотоксинами в регионе. Цветами отмечены разные уровни
АФЛ 54% ЗЕН 51% ДОН 68% T-2 1% ФУМ 81% ОХР 30%
20%
10%
ниже предела обнаружения
1 микотоксин
более 1 микотоксина
Количество микотоксинов на пробу при расчете на основании проб, исследованных на 3 микотоксина или более.
Уровень риска
АФЛ 4% ЗЕН 19% ДОН 47% T-2 0% ФУМ 27% ОХР 5%
Уровень риска — процент проб, в которых концентрация как минимум одного микотоксина выше порогового уровня в частях на миллиард (мкг/кг). Очень высокий уровень риска означает, что >50% проб могут представлять риск для продуктивности или повысить восприимчивость к заболеваниям. Рекомендованный пороговый уровень риска основных микотоксинов в мкг/кг АФЛ
ЗЕН
ДОН
T-2
ФУМ
ОХР
2
50
150
50
500
10
©Авторское право BIOMIN Holding GmbH, 2019. Используется с разрешения.
П у б л и к а ц и я R o m e r L a b s ®
7
Южная Азия и регион Китай/ Тайвань сталкиваются с наиболее серьезным риском для скота, связанным с микотоксинами.
Региональные различия
Продолжение см. со стр. 5. чувствительный вид для каждого микотоксина. Средние уровни риска, которые берутся за основу, не исключают возможности отдельных тяжелых случаев местной контаминации микотоксинами на фермах или в полях и не отражают отрицательные последствия присутствия нескольких микотоксинов. Карта риска контаминации микотоксинами основана на распространенности одного вида микотоксинов. При этом может недооцениваться угроза, которую представляют микотоксины для животных при синергизме (наличие нескольких микотоксинов является причиной потенциального вреда), и субклинические эффекты (даже небольшая контаминация микотоксинами может отрицательно сказаться на здоровье и продуктивности животных).
Южная Азия и регион Китай/Тайвань сталкиваются с наиболее серьезными рисками для скота в связи с микотоксинами. Оба региона — зона крайне высокого риска, поскольку более чем в 85% проб был обнаружен уровень контаминации выше порогового уровня риска. В Таблице 1 приведены сводные данные по количеству исследованных проб, частоте обнаружения, средним уровням и максимальным значениям контаминации. В целом по миру главной угрозой были фумонизины и деоксиниваленол, причем в нескольких образцах оба эти микотоксина встречались одновременно.
Европа Европа оказалась регионом с уровнем риска от умеренного до очень высокого: более половины
Таблица 1. Подробные результаты частоты обнаружения микотоксинов по регионам
Европа
Азия
Северная Америка
Южная Америка
Ближний Восток
Африка
Количество проб Положительные (%) Средний уровень в положительных (мкг/кг) Максимум (мкг/кг) Количество проб Положительные (%) Средний уровень в положительных (мкг/кг) Максимум (мкг/кг) Количество проб Положительные (%) Средний уровень в положительных (мкг/кг) Максимум (мкг/кг) Количество проб Положительные (%) Средний уровень в положительных (мкг/кг) Максимум (мкг/кг) Количество проб Положительные (%) Средний уровень в положительных (мкг/кг) Максимум (мкг/кг) Количество проб Положительные (%) Средний уровень в положительных (мкг/кг) Максимум (мкг/кг)
АФЛ 2831 12% 5
ДОН 4311 63% 601
T-2 3208 41% 61
53796 1597 67% 735
176 3360 33% 44
248000 3371 65% 139
40700 3371 80% 602
280 6023 27% 8
10790 5276 48% 130
13641 5107 67% 1008
4890 1705 8% 17
402 161 15% 3 15 556 8% 12
105
Источник: Обзор компании BIOMIN по микотоксинам, 2018
8
ЗЕН 4080 56% 154
10256 1772 34% 362
5020 165 71% 48 926 552 72% 67
4336
24880 173 65% 316 2021 552 72% 736
12220
ФУМ 2983 57% 664
ОХР 2878 26% 15
181 1596 3% 461
123444 1749 44% 3001
126 1773 3% 13
583 165 15% 15
72100 174 87% 1074
75 158 15% 2
9373
27
6062 3212 1% 34
1143 2188 25% 43
37 552 2% 15 34
26204 3345 82% 1833
130724 5465 72% 2184
14427 552 74% 422
5912 3212 15% 7
317 835 7% 10
5 552 6% 5
Специальный выпуск Spot On, посвященный микотоксинам
Фото: Dr. Microbe 69
проб показали концентрации выше порогового уровня риска; примечательным исключением стала Центральная Европа, где пороговый уровень риска составил 45%. В пробах из Южной Европы отмечалась большая распространенность ФУМ — в среднем 84% и 1 031 мкг/кг. Уровень ДОН в Центральной и Северной Европе в 2018 г. вырос: в Центральной Европе также обнаружена высокая распространенность — 64% при среднем уровне контаминации 776 мкг/кг. В Северной Европе уровень ДОН был сходным: распространенность 66%, средний уровень контаминации 724 мкг/кг. Особенно высока была концентрация ДОН в таких злаковых, как пшеница, ячмень и др. — 912 мкг/кг.
Азия В этом году наиболее высокий уровень риска отмечался в Азии. В Китае преобладают ФУМ и ДОН, особенно в кукурузе. 96% всех проб были контаминированы этими двумя микотоксинами. Средний уровень контаминации ФУМ составил 3 438 мкг/ кг, ДОН — 540 мкг/кг. Южная Азия отличалась от остальных регионов наличием других проблем, помимо ФУМ и ДОН. Афлатоксин был обнаружен в 44% всех проб из Южной Азии. Более того, 87% проб содержали афлатоксины, которые по большей части обнаруживались в пробах готовых кормов. Наиболее высокий уровень контаминации афлатоксинами в регионе составил 697 мкг/кг, а ФУМ — 47 285 мкг/кг. Хотя последняя цифра высока, это менее трети от максимального уровня контаминации ФУМ в прошлом году. ЗЕН был третьим по частоте обнаружения микотоксином в пробах из Азии — 65% исследованных проб.
Северная Америка ДОН и ФУМ представляли наибольшую угрозу для сельскохозяйственных животных в Северной Америке. Контаминация ДОН в злаковых выросла с 65% в 2017 г. до 86% в 2018 году со средним значением 1 853 мкг/кг. Фумонизины присутствовали в 70% исследованных проб кукурузы с высоким средним уровнем контаминации 3 497 мкг/кг. Средняя концентрация ФУМ была достаточно высокой для данного региона (3 001 мкг/кг). Важный побочный продукт обработки кукурузы, сухая барда, был особенно подвержен контаминации ДОН: при частоте 98% средний уровень контаминации составил 1 420 мкг/кг. ЗЕН, АФЛ и ОХР были выявлены в 34%, 8% и 3% проб при среднем уровне контаминации 362 мкг/кг, 17 мкг/кг и 13 мкг/кг, соответственно. Наиболее высокая концентрация ФУМ была обнаружена в
П у б л и к а ц и я R o m e r L a b s ®
Северной Америке (130 724 мкг/кг).
Южная и Центральная Америка В этих регионах риск был в основном высоким. В Центральной Америке уровень риска составил 70%, а в Южной был еще выше — 72%. В Южной Америке ДОН присутствовал в 88% проб злаковых при высоких средних концентрациях (1 949 мкг/кг). Более того, максимальная концентрация составила 24 880 мкг/кг. ФУМ был наиболее распространенным микотоксином в данном регионе. Он поражает 86% проб кукурузы, 100% проб сухой барды и 89% проб готовых кормов. Концентрации ФУМ достигали 72 100 мкг/кг. Очагом особенно высокой контаминации ФУМ была Аргентина: там средний уровень контаминации составил 4 762 мкг/кг. В Бразилии был наиболее распространен ФУМ с частотой обнаружения 73% и средним уровнем контаминации 2 144 мкг/кг. Второй по распространенности микотоксин — ДОН (70%, 1 073 мкг/кг). В кукурузе чаще всего обнаруживался ФУМ — 86% и в среднем 2 605 мкг/кг.
В целом по миру главной угрозой были фумонизины и деоксиниваленол, причем в нескольких образцах оба эти микотоксина присутствовали одновременно.
Ближний Восток На Ближнем Востоке был выявлен высокий уровень риска с общим пороговым уровнем 60%. В частности, здесь растет распространенность ФУМ, ДОН и ЗЕН при уровне контаминации 87%, 65% и 71%, соответственно. Для проб зерна цифры еще менее отрадные: 100% поражение проб ФУМ при среднем уровне контаминации 3 101 мкг/кг.
Африка Как и в 2017 г., наиболее распространенным микотоксином в Африке был ДОН, который выявлялся в 77% всех исследованных проб; средняя концентрация составила 736 мкг/кг. ФУМ определялся в 77%, а ЗЕН — в 72% всех проб. Общий уровень риска только в Южной Африке (67%) был выше, чем по всему континенту (65%).
Выводы Анализ 18 424 проб в рамках настоящего исследования вновь показал важность постоянного контроля и измерения контаминации зерна и кормов микотоксинами . Только при наличии достоверных данных по контаминации микотоксинами специалисты кормовой промышленности смогут обеспечить защиту в виде эффективной программы управления риском и тем самым защитить животных от отрицательного влияния микотоксинов на здоровье и продуктивность.
9
10
Специальный выпуск Spot On, посвященный микотоксинам
Оценка риска микотоксинов:
никаких секретов Результаты исследования однозначны: производителям продуктов питания и кормов необходимо учитывать эффекты одновременной контаминации несколькими микотоксинами. Но как заставить пробу раскрыть все секреты? В качестве метода анализа на множественную контаминацию уже хорошо себя зарекомендовала ЖХ/МС-МС. Автор Ён Ви Ляу, управляющий директор, Romer Labs Asia
П у б л и к а ц и я R o m e r L a b s ®
11
Зачастую растениехозяин далее модифицирует соединения, которые вырабатывает гриб. Такая химическая модификация «скрывает» истинную природу микотоксина.
П
римерно 400 низкомолекулярных соединений считаются микотоксинами, и каждое из них обладает своим токсическим действием на животных и человека. Однако в национальных и международных стандартах и рекомендациях обычно рассматривается лишь небольшое количество микотоксинов: афлатоксины B1, B2, G1, G2 и M1; фумонизины B1, B2 и B3; охратоксин A, деоксиниваленол, зеараленон, HT-2 токсин и T-2 токсин. Эти микотоксины хорошо описаны и часто упоминаются в доступной научной литературе. Что же нам известно об остальных, не названных в стандартах, микотоксинах в конкретной пробе? Каковы скрытые риски совместной контаминации? Как заставить пробу раскрыть нам все секреты? В этой статье мы поговорим о микотоксинах, не упомянутых в стандартах, обсудим эффекты совместной контаминации микотоксинами и представим метод анализа проб зерна и кормов на несколько микотоксинов одновременно.
Новые и скрытые микотоксины Новые микотоксины — это потенциальные кандидаты на включение в стандарты в связи с ростом частоты контаминации и токсикологическим составом, т.е. потенциальной способностью нанести вред животным или человеку при их потреблении. Стратегии измерения концентрации и борьбы с микотоксинами находятся в стадии зарождения и в настоящее время развиваются быстрыми темпами. В отдельный подкласс не включенных в стандарты микотоксинов можно выделить «скрытые микотоксины». В ходе инфицирования растения грибы вырабатывают множество метаболитов, в том числе хорошо известные ДОН и ЗЕН. Зачастую растение-хозяин затем модифицирует полученные
от гриба соединения. Такая химическая модификация «скрывает» истинную природу микотоксина. Однако такая маскировка важна для растения-хозяина, являясь одной из основных стратегий детоксикации. Обычно в процессе конъюгации и детоксикации участвует молекула глюкозы или сульфата. Хотя такие скрытые токсины далее не наносят вреда растению, их токсичность для человека и животных может проявиться вновь, когда добавленная «маскирующая» молекула отщепляется в желудочно-кишечном тракте млекопитающих в процессе пищеварения (Рисунок 1). В селекции растущая распространенность и выработка некоторых скрытых микотоксинов может быть связана с появлением новых стойких сортов. К примеру, сообщалось о том, что деоксиниваленол-3-глюкозид связан с устойчивостью к фузариозу. Хотя в устойчивых к фузариозу растениях обнаружен низкий общий уровень ДОН, сообщалось о повышении в таких растениях соотношения ДОН-3-глю/ДОН, что свидетельствует о более высокой выработке этого скрытого микотоксина.
Модифицированные микотоксины и их токсичность «Модифицированный микотоксин» — это еще один термин, обозначающий изменения, которым могут подвергнуться микотоксины. Модифицированные микотоксины могут возникать как при модификации родительской молекулы токсина самим грибом, так и при «маскировке» токсина в тканях растения. Еще один вид модификации происходит в организме млекопитающих, когда афлатоксин В1 потребляется с контаминированным кормом и превращается в афлатоксин М1. Этот афлатоксин М1 мигрирует в молоко лактирующих животных и затем
Рисунок 1. Реакция расщепления деоксиниваленола-3-глюкозида до нативного деоксиниваленола в ходе пищеварения. H
H3C
H
H
H3C
O
H
O
OH
Пищеварение O
O
O HO
OH
CH3
O
HO
O HO
OH
CH3
O OH HO OH Источник: Romer Labs
12
Специальный выпуск Spot On, посвященный микотоксинам
выделяется с молоком. Кроме того, модификации токсинов также могут происходить при обработке пищи, в частности нагревании и ферментации, что увеличивает их распространенность. Эти модифицированные микотоксины могут встречаться в значимых количествах в продуктах питания и кормах. Дезоксинилваленол является микотоксином с наиболее изученными распространенными модификациями. Модифицированные формы деоксиниваленола можно разделить на две основные группы: измененные и скрытые формы. Существует две основные измененные формы деоксиниваленола, выделяемые самим грибом: 3-ацетил-деоксиниваленол и 15-ацетил-деоксиниваленол, которые обнаруживаются в контаминированных фузариями злаковых. Растения также способны скрыть деоксиниваленол, превратив его в деоксиниваленол-3-глюкозид и, как показали последние исследования, он может принимать две сульфированные формы: деоксиниваленол-3-сульфат и деоксиниваленол-15-сульфат. Итак, какой конкретно вред могут нанести модифицированные, скрытые и другие новые микотоксины? Модифицированные микотоксины могут отличаться от родительского соединения по токсичности в большую или меньшую сторону. Например, благодаря модификациям они могут стать более биодоступными. Токсикологических данных по модифицированным микотоксинам немного, и результатов исследования и знаний реальных рисков и эффектов этих соединений в настоящее время недостаточно. Такой недостаток знаний осложняет надлежащую оценку рисков. Тем не менее, было проведено несколько исследований, в которых описывается их потенциальная угроза продовольственной безопасности. Скрытые микотоксины могут «стать явными» в пищеварительном тракте животных или человека, вновь высвобождая родительское соединение, обладающее токсическим эффектом. Аналогичная ситуация возможна и с другими новыми микотоксинами: токсикологических данных недостаточно, из-за чего сложно устанавливать стандарты и максимально допустимые пределы для защиты животных и человека от потенциальных рисков для здоровья. Поскольку модифицированные микотоксины в химических реакциях ведут себя иначе, чем родительские микотоксины, при стандартном анализе их легко пропустить. В современные методы обнаружения микотоксинов в продуктах питания и кормах не входит стандартный скрининг на эти модифицированные микотоксины, поскольку они П у б л и к а ц и я R o m e r L a b s ®
Модифицированные
не включены в стандарты. Такие стандартные методы могут показать, что уровень контаминации ниже допустимых пределов, тогда как контаминация модифицированными микотоксинами остается незамеченной. Такое исследование дает правильный результат, но с токсикологической точки зрения включение модифицированных микотоксинов (например, в виде параметра суммы) даст более надежные данные для оценки риска. Все эти факты вместе указывают на то, что модифицированные микотоксины могут представлять угрозу для здоровья человека. Регламентирование максимальных уровней модифицированных и других новых микотоксинов в настоящее время обсуждается в Европейском управлении безопасности пищевых продуктов.
микотоксины могут отличаться от родительского соединениея по токсичности в большую или меньшую сторону Например, благодаря модификациям они могут стать более
Совместная контаминация несколькими микотоксинами
биодоступными.
Сейчас, когда нам известно, что один и тот же гриб может выделять несколько микотоксинов, нас не должно удивлять то, что сходные эффекты разных микотоксинов становится все более популярным предметом исследования. Данные, полученные в последние годы в нескольких независимых исследованиях, показывают, что сельскохозяйственное сырье часто контаминировано более чем одним микотоксином. Токсикологические взаимодействия микотоксинов обычно синергетические: это означает, что токсикологический эффект двух или более микотоксинов одной пробы выше, чем сумма токсикологических эффектов этих микотоксинов по отдельности. При этом совместная контаминация микотоксинами также может иметь аддитивный Рисунок 2. Синергетические (красная линия) и аддитивные (пунктирная линия) эффекты микотоксинов у птицы. АФ1
ФB1
монили
монилиформин
α-циклопиазоновая кислота ФА
ДОН
Оксипейцеданин
ДАС
ФА Токсины Т-2
Оксипейцедан
Цитринин
Источник: Romer Labs
13
Токсикологические взаимодействия микотоксинов обычно синергетические: это означает, что токсикологический эффект двух или более микотоксинов одной пробы выше, чем сумма токсикологических эффектов отдельных микотоксинов.
или, реже, антагонистический эффект, при котором эффекты нейтрализуют друг друга. Эти синергетические эффекты могут быть различными у разных животных и очень сложными. На Рисунке 2 показаны синергетические и аддитивные эффекты некоторых микотоксинов у птицы. К примеру, афлатоксин В1 (АФB1) включен в стандарты и проявляет синергетический эффект с диацетоксисцирпенолом (ДАС) и циклопиазоновой кислотой (ЦПК), не включенными в стандарты, а также аддитивный эффект с ДОН, также включенным в стандарты микотоксином. Однако у свиней, как показано на Рисунке 3, совместные эффекты АФB1 с ДОН или ДАС неизвестны, зато наблюдается синергизм с T-2 токсином и охратоксином. Эти лишь несколько примеров совместного присутствия. Рост информированности о совместной контаминации микотоксинами обусловил необходимость разработки методов одновременного анализа на несколько микотоксинов. В ответ на эту потребность компания Romer Labs разработала метод Multi-Mycotoxin Analysis 50+. Этот анализ дает уникальную возможность установить профиль контаминации пробы и количественно определить содержание более чем 50 микотоксинов, включая афлатоксины, токсины грибов Alternaria, алкалоиды спорыньи, фумонизины, зеараленон и скрытые микотоксины, такие как деоксиниваленол-3-глюкозид. Дальше последует обсуждение преимуществ, ограничений и разработки метода с учетом химического разнообразия аналитов, а также спектра сельскохозяйственного сырья, пригодного для исследования. Рисунок 3. Синергетические (красная линия) и аддитивные (пунктирная линия) эффекты микотоксинов у свиней. АФ1
монилиформин
ДОН
α-циклопиазоновая кислота ФА
ДОН
ДАС
Оксипейцеданин
ФА
Токсины Т-2 ЗЕН
ин
Источник: Romer Labs
14
ФB1
Рисунок 4. Схема этапов создания метода анализа на множественные микотоксины на основе ЖХ/МС-МС. Разработка метода
Оптимизация метода
Валидация метода
• Параметры ЖХ и МС • Процедура подготовки пробы • Исследование стабильности • Селективность • Рабочий диапазон
• ПО, ПКО • Линейность, точность • Прецизионность, устойчивость • Эффекты матрицы, восстановление
Анализ на множественную контаминацию микотоксинами Сотрудники лабораторий все чаще обращаются к методу ЖХ/МС-МС (жидкостной хроматографии / тандемной масс-спектрометрии) как основному методу выявления множественной контаминации. За последнее десятилетие анализ на основе ЖХ/ МС-МС стал эффективным и современным методом качественного и количественного определения микотоксинов. Этот метод позволяет одновременно определять широкий спектр микотоксинов из разных семейств химических веществ при помощи одного-единственного анализа: ЖХ/МС-МС позволяет одновременно количественно определять содержание кислых (фумонизины), основных (алкалоиды спорыньи), полярных (монилиформин, ниваленол) и неполярных соединений (зеараленон, беауверицин). К преимуществам этого метода также относится его высокая чувствительность и селективность, а также возможность получения дополнительной информации об отношениях массы к заряду (m/z) AFB1аналитов. и ионных осколках исследуемых Создание метода анализа на множество микотоксинов на основе ЖХ/МС-МС до внедрения обычно проходит три этапа: разработка метода, его оптимизация и валидация. Эти этапы и параметры показаны на Рисунке 4. ----Во время разработки и FB1 DON оптимизации метода следует тщательно оценивать качество и достоверность результатов. Для этого необходимо применять аналитические стандарты высочайшего качества с сертифицированной концентрацией и указанной чистотой. Однако для отдельных аналитов аналитических стандартов нет в продаже. В этих случаях, получится T-2 возможно, Toxin
Специальный выпуск Spot On, посвященный микотоксинам
использовать стандарты, которые еще находятся на стадии разработки, либо работать с доступным менее подробно описанным материалом.
Разработка метода Во время разработки метода на основе ЖХ/МСМС нужно оптимизировать параметры МС и ЖХ, а также процедуру подготовки пробы. Для оптимизации параметров МС каждое целевое соединение следует внести в форме чистого аналитического стандарта непосредственно в масс-спектрометр. Это позволяет отобрать лучший режим ионизации (положительный или отрицательный) и наиболее многочисленные родительские и дочерние ионы. На этом этапе также можно корректировать условия хроматографии: необходимо подобрать идеальные подвижные фазы и градиент, а также оптимальную хроматографическую колонку. Во многих методах множественного анализа на микотоксины используется подход разведения и впрыскивания, т.е. экстракт пробы разводится перед внесением в систему ЖХ/МС-МС. В рамках подготовки пробы можно также использовать этап очистки. Однако во время очистки пробы профиль микотоксинов меняться не должен, т.е. необходимо убедиться в том, что в материале, используемом для очистки, не удерживается ни один из интересующих нас микотоксинов.
Оптимизация метода Оптимизация метода анализа включает исследование аналитов на стабильность в стандартных растворах и пробах, а также подтверждение селективности и определение рабочего диапазона.
Валидация метода Валидация метода является необходимым условием для получения достоверных результатов в плане сравнимости и прослеживаемости. Валидацию метода необходимо проводить отдельно для каждого целевого аналита во всех необходимых матрицах. Стандартные технические характеристики, которые необходимо оценивать во время валидации количественного метода: пределы обнаружения (ПО), пределы количественного определения (ПКО), линейность, прецизионность, селективность, устойчивость, точность, эффекты матрицы и восстановление. Для метода Multi-Mycotoxin Analysis 50+ валидированы матрицы пшеницы, кукурузы, корма для свиней и силоса. Эффекты матрицы имеют место в случае, когда компоненты матрицы вмешиваются в процесс П у б л и к а ц и я R o m e r L a b s ®
ионизации целевых аналитов. Эффекты матрицы могут оказывать существенное влияние на количественное определение микотоксинов. Поэтому исключительно важно определить это влияние матрицы и компенсировать его. Этого можно добиться путем определения наблюдаемого восстановления с последующей математической коррекцией результатов с этим значением, путем калибровки с согласованной матрицей или путем применения меченных изотопами внутренних стандартов. Последний подход приведет к получению результатов с максимальной точностью и надежностью при минимальных затратах времени и денег на пробу. Этот метод можно валидировать путем добавки к холостым пробам каждого требуемого аналита в диапазоне концентраций и проведения параллельных анализов. По возможности надежность метода следует подтвердить при помощи аттестованных стандартных образцов. Более того, материалы с согласованной матрицей и участие в квалификационных испытаниях позволяют дополнительно гарантировать качество.
Сотрудники лабораторий обращают все чаще обращаются к ЖХ/МС-МС как основному методу для выявления множественной контаминации микотоксинами.
Выводы Разработка метода анализа на множественные микотоксины на основе ЖХ/МС-МС имеет большой потенциал для решения проблемы риска совместной контаминации несколькими микотоксинами. По мере того, как научное сообщество накапливает знания о синергизме при множественной контаминации микотоксинами, в том числе новыми и скрытыми, важность валидированных методов анализа для их выявления в одной пробе будет только возрастать. Необходимо тщательно изучить большое число различных параметров, оказывающих существенное влияние на качество и достоверность результатов метода ЖХ/МС-МС, для каждого аналита в каждой матрице по отдельности. Кроме того, химическое разнообразие микотоксинов обуславливает необходимость поиска компромиссов при разработке метода, который может оказаться далеко не идеальным для определенных аналитов. Широкий спектр сельскохозяйственных сырьевых материалов, а также разные диапазоны концентраций и разное распределение распространенности еще больше усложняют задачу разработки и оптимизации метода. Тем не менее, разработка метода анализа на множественные микотоксины помогает удовлетворить острую потребность; усовершенствование технологии позволит еще больше расширить ее применимость.
15
Ваш экземпляр Spot On
Multi-Mycotoxin Analysis 50+
Эта небольшая проба может рассказать о многом. Исследование одной пробы на более чем 50 аналитов.
Более подробная информация на нашем сайте: romerlabs.com/en/multi-mycotoxin-analysis-50-plus