Obtención y Preservación de Células Hematopoyéticas en el Trasplante de Médula Ósea

Protocolo para la Obtención y Preservación de Células Hematopoyéticas en el Trasplante de Médula Ósea para Estudiantes de Medicina Rico C. A., Mendoza G.Y.

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Protocolo para la Obtención y Preservación de Células Hematopoyéticas en el Trasplante de Médula Ósea para estudiantes de Medicina Rico Ceballos, Carlos Alberto, Lic. Biología y Química, Univ. Santiago de Cali, Esp. Educación Ambiental, Esp. Gerencia en Salud Ocupacional, Tesista Doctorado Investigación Educativa Univ. Sevilla, España, Docente Tiempo Completo Univ.

Santiago de Cali, Coordinador Grupo de Investigación Ambiental en Salud (GUIAS) Mendoza Salas Gloria Yineth, Medicó, Univ. Santiago de Cali, Tecnóloga Atención Prehospitalaria, Integrante Grupo (GUIAS).

ISBN: 978-958-46-1489-6

© 2012 todos los derechos Reservados, que dispone la ley 44 de 1993, la información aquí publicada podrá ser reproducida citando la fuente, previo permiso escrito de los autores © 2012 Santiago de Cali, Valle del Cauca, Colombia AUTOR – EDITOR Carlos Alberto Rico Ceballos Santiago de Cali, Calle 5 carrera 62 carlosalbertoricoc@yahoo.com

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CONTENIDO Pág.

PRÓLOGO

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CAPÍTULO I

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RESEÑA HISTORICA DE LOS CULTIVOS CELULARES

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TIPOS Y CARACTERISTICAS GENERALES DE UN CULTIVO CELULAR

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ALTERNATIVAS DEL CULTIVO CELULAR

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ALGUNOS CONCEPTOS IMPORTANTES

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LAS CELULAS MADRE

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ANTECEDENTES DEL CULTIVO CELULAR HEMATOPOYÉTICO

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CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN

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CAPÍTULO II

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HISTORIA DE TRANSPLANTES EN COLOMBIA

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INDICACIONES DEL TRASPLANTE AUTÓLOGO

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EL CULTIVO CELULAR HEMATOPOYÉTICO A NIVEL INTERNACIONAL

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RESEÑA HISTORICA DEL TRASPLANTE DE MEDULA ÓSEA

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TRASPLANTE DE MEDULA OSEA

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TRASPLANTE DE CÉLULAS PROGENITORAS HEMATOPOYÉTICAS OBTENIDAS DE SANGRE DE CORDÓN UMBILICAL.

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MÉTODO DE EXTRACCIÓN DE CÉLULAS Y CULTIVOS

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MÉTODOS DE ESTUDIO HISTOLÓGICO

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CAPÍTULO III

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LEGISLACION

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BIOETICA

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CODIGO DE NUREMBERG (1946)

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PRINCIPIO DE AUTONOMÍA

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CONSENTIMIENTO INFORMADO ESPAÑA

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BIBLIOGRAFIA

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LISTA DE FIGURAS Pag.

Figura 1. Obtención Celulas Madre

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Figura 2. Recolección Celulas Madre de Médula Ósea

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Figura 3 . Celulas Hematopoyéticas de Cordón Umbilical

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Figura 4. Cajas Petri

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Figura 5. Tubos

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Figura 6. Pipetas

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Figura 7. Placas para Cultivo Celular

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Figura 8. Medios de Cultivo

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Figura 9. Autoclave – calor Húmedo

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Figura 10. Tindalización

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Figura 11. Ebullición

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Figura 12. Pasteurización

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Figura 13. Vapor a Presión

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Figura 14. Limpieza del Área

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Figura 15. Técnica para Desinfección

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Figura 16. Catéteres Venosos Centrales

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Figura 17. Aféresis

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Figura 18. Almacenamiento de Celulas Madre

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Figura 19. Infusión de Células Madre

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PRÓLOGO

El Libro presenta básicamente una recolección de información respecto a los Protocolo de Obtención y preservación de Células Hematopoyéticas para el Trasplante de Médula Ósea desde la competencia del estudiante de Medicina, tiene como objetivo General facilitar la consulta y el aprendizaje.

Cuenta con información nacional e internacional, iniciando con los antecedentes, la reseña histórica, mencionando que es el cultivo, como se obtiene mediante técnicas especiales, como se preserva, ventajas y desventajas del cultivo celular y su manejo para luego ser trasplantadas.

Además, aborda una amplia temática en lo relacionado con esterilización y Asepsia, factores primordiales para la preservación exitosa de los cultivos, Tema en el cual es fundamental que el médico tenga conocimiento y manejo.

El contenido está organizado por capítulos, abordando inicialmente la historia de forma básica, posteriormente se presentan procedimientos realizados por expertos a nivel y nacional e internacional, después se presenta algunos casos en diferentes hospitales, para finalizar con trabajos de doctorado realizados Universidades Españolas, se trata de completar la información recogida con las normas jurídicas y Bioéticas que se utilizan en Colombia, así como el consentimiento informado solicitado por España.

Presenta también información sobre como el cambio mundial hacia la tecnología y los nuevos descubrimientos en el trasplante de Médula Ósea, han transformado la sociedad, mejorando la salud de las personas, actualmente se busca profundizar en la aplicación de técnicas quirúrgicas avanzadas, apoyándose en la nano medicina y la medicina robótica, pero ese cambio se origina desde las universidades, cuando se modifican y actualizan los pensum académicos para tener al día el último conocimiento a sus estudiantes, quienes serán los encargados de investigar y aplicar los alcances científicos.

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las facultades de Salud, buscan actualmente el camino de la investigación Biotecnológica, por eso, el trabajo se orienta en el programa de Medicina, en este pequeño recorrido de la información compilada en el libro virtual , se muestran dos aspectos generales que son: el Cultivo de Células Hematopoyéticas y el Trasplante de Médula Ósea, sin descuidar lo que se utiliza en la composición del laboratorio, el ambiente que lo rodea y algunas consideraciones éticas a tener en cuenta.

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CAPÍTULO I

En este libro se presenta, una serie de aspectos referentes a la información básica, para que un estudiante de pregrado en el área de la salud, especialmente en Medicina, pueda fácilmente entender en que consiste, el trabajo que se realiza en los laboratorios a nivel mundial, sobre el manejo de cultivos de células animales, específicamente cuando se trata Células Hematopoyéticas y Trasplante de Médula Ósea, sin pretender profundizar en el tema, pero si, motivar para que inicien un proceso de aprendizaje y experimentación, que son fundamentales en su nueva profesión.

El interés real de la emisión del Libro Electrónico, es reunir la información, para que las personas que lo consulten, puedan acceder a él, sin dificultad y comiencen una carrera sobre la apropiación del conocimiento, sobre conceptos, técnicas, protocolos, equipos, materiales e insumos que son utilizados por los grupos de médicos y Biólogos, expertos en el manejo de las células y del transplante de Médula Ósea.

Cabe destacar que este tipo de investigación y trabajo, se desarrolla en un ambiente de completa asepsia, donde cualquier agente ambiental puede afectar los resultados, no obstante, las condiciones pueden variar en los diferentes hospitales y centros de Investigación, dedicados al transplante, ocasionando a alteraciones no convenientes.

Las Universidades en el valle del Cauca, Colombia, se encuentra en el camino de la Internacionalización de la Investigación en todos sus programas, pero son los de la facultad de salud, los que buscan actualmente el camino de la investigación Biotecnológica, por eso,

el trabajo se orienta en el programa de Medicina, en este

pequeño recorrido de la información compilada en el libro virtual, se muestran dos aspectos generales que son: el Cultivo de Células Hematopoyéticas y el Trasplante de Médula Ósea, sin descuidar lo que se utiliza en la composición del laboratorio, el ambiente que lo rodea y algunas consideraciones éticas a tener en cuenta.

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RESEÑA HISTORICA DE LOS CULTIVOS CELULARES

Cuando se busca la historia de los cultivos celulares, es necesario primero conocer una definición general de ellos y en Wikipedia una enciclopedia o mejor una Biblioteca electrónica, se puede encontrar lo siguiente (Walles J. 2010), “El cultivo celular es el proceso mediante el que células, ya sean células procariotas, eucariotas o vegetales, pueden cultivarse en condiciones controladas. En la práctica el término "cultivo celular" se usa normalmente en referencia al cultivo de células aisladas de eucariotas pluricelulares, especialmente células animales.

El desarrollo histórico y metodológico del cultivo celular está íntimamente ligado a los del cultivo de tejidos y el cultivo de órganos.

El cultivo de células animales empezó a ser una técnica rutinaria de laboratorio durante los años 50, pero el concepto de mantener líneas de células vivas separadas del tejido de origen, fue descubierto en el siglo XIX”.

(Morgan, 1995). También se refiere al cultivo celular diciendo: “El cultivo celular o cultivo de tejidos, como también se le llama, tiene su origen en el siglo XIX, como un método para el estudio del comportamiento de las células animales libres de las variaciones sistémicas ocurridas dentro del organismo durante su normal homeostasis y bajo el estrés de un experimento.

Estas técnicas iniciaron con el cultivo de fragmentos no disgregados de tejidos, los cuales restringían la mitosis de las células cultivadas y por tanto su crecimiento.

Después se realizaron cultivos con fragmentos disgregados de tejidos, los cuales aumentaban el crecimiento celular en cultivo, ya que se utilizaban células dispersas; esto fue un gran avance y provocó una explosiva expansión en esta área desde los años 50s”1

1

http://javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/cultivos.htm , consultado el 02 de septiembre de 2009

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En (Wikipedia 2011), se presenta una descripción histórica del cultivo celular donde dicen: “El fisiólogo inglés Sídney Ringer desarrolló a finales del siglo XIX una solución salina, conocida como solución de Ringer, que contiene cloruro de sodio, potasio, calcio y magnesio, dicha solución es capaz de mantener latiendo el corazón de un animal fuera del cuerpo.3

En 1885 Wilhelm Roux extrajo una porción de la médula de embrión de pollo y la mantuvo varios días en cultivo en una solución salina tibia, estableciendo el principio de los cultivos tisulares. Ross Granville Harrison, trabajando en la Escuela de Medicina de la Universidad Johns Hopkins y más tarde en la Universidad de Yale, estableció la metodología del cultivo tisular en una serie de trabajos publicados entre 1908 y 1910.

Las técnicas de cultivo celular avanzaron significativamente en los 40 y 50, como soporte a la investigación en virología. La utilización de cultivos celulares para producir virus permitió preparar virus purificados para ser utilizados en vacunas. La vacuna Salk de la polio fue una de los primeros productos producidos en masa usando técnicas de cultivos celulares.

Esta vacuna fue posible gracias a la investigación de John Franklin Enders, Thomas Huckle Weller y Frederick Chapman Robbins, quienes fueron galardonados con el Premio Nobel por el descubrimiento de un método de crecimiento de virus en cultivos celulares de riñón de mono”.

Cuando se trata del manejo de células vivas y la realización de cultivos de ellas para el estudio, conservación y preservación de estos cultivos, es necesario tener en cuenta una serie de aspectos Biológicos que contextualizan los estudios, también el manejo ético que se haga de ellos, más adelante se tratara el tema, pero se debe tener en cuenta, su utilización y aplicación posterior a los resultados de las investigaciones, es en las Universidades donde se adelantan dichos estudios, aunque también existen empresas privadas dedicadas exclusivamente a la producción de células y tejidos celulares.

Volviendo a la Universidades, precisamente la Universidad Santiago de Cali

ya ha

comenzado su proceso de investigación en cultivo celular, es el caso del programa de Instrumentación quirúrgica donde se hace un sondeo del conocimiento que tienen los

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estudiantes respecto al manejo de cultivo celular y en él se detalla cómo es escasa la información que tienen dichos estudiantes pero es fuerte el interés por conocer en detalle y realizar pruebas de laboratorio para el manejo de ellos y la producción de tejidos para los casos quirúrgicos,

que atienden en sus prácticas clínicas y en su posterior vida

profesional.

En un trabajo de estas características, se encuentra una compilación en Trabajo de Grado presentada por (Rico C.A. y otros 2011), donde mencionan a (Brand, et al., 1997) cuando dice: “La validez de un cultivo celular como modelo de función fisiológica in vivo ha sido criticado, ya que se presentan problemas de caracterización por la alteración del desarrollo celular; la proliferación in vitro no se presenta de igual manera a la de in vivo, debido a la reducción de la relación célula-célula y la interacción matriz-célula por la no presencia de la heterogeneidad y la estructura tridimensional de las células hallada in vivo, además porque el medio hormonal y nutricional se ve alterado.

Esto crea un ambiente que favorece la difusión, migración y proliferación de células no especializadas, pero no a la expresión de funciones diferenciadas. La provisión de un ambiente apropiado, nutriente, hormonas y sustratos son fundamentales para la expresión de funciones especializadas.

(Freshney, 1995). En un cultivo celular la mayoría de las células crecidas a partir de un tejido sólido disgregado o de un subcultivo tienen la capacidad de adherirse en monocapa, transformarse o anclarse independientemente.

Esta adherencia celular es mediada por receptores celulares específicos de superficie en la matriz extracelular y la dispersión celular podría ser precedida por la secreción de proteínas de matriz extracelular y proteoglicanos por parte de la célula.

Las células se pueden anclar y difundir en el vidrio donde se cultivan por medio de ligeras cargas negativas y al plástico, como el poliestireno, si tienen una propiedad o tratamiento con descargas eléctricas o con radiación ionizante de alta energía. El cultivo en vidrio o plástico provee condiciones favorables para el crecimiento y anclaje celular

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El crecimiento de las células en un cultivo celular primario depende de la supervivencia de éstas a las diferentes técnicas de disgregación y a la capacidad de adherirse al sustrato o de sobrevivir en suspensión. Si el cultivo primario es mantenido por pocas horas podría ocurrir un paso de selección futuro.

Las células capaces de proliferar podrían aumentar, otros tipos de células podrían sobrevivir pero no aumentar y otras podrían ser capaces de sobrevivir en condiciones especiales. Además el crecimiento celular va ligado al espacio del cultivo, ya que unas células detienen su crecimiento, mientras que otras lo incrementan (Freshney, 1995).

Cultivos celulares. El cultivo de células tuvo su origen en el siglo XIX. El inicio del cultivo de células in vitro (Freshney, 1987). El cultivo celular o cultivo de tejidos, como también se le llama, tiene su origen en el siglo XIX, como un método para el estudio del comportamiento de las células animales libres de las variaciones sistémicas ocurridas dentro del organismo durante su normal homeostasis y bajo el estrés de un experimento.

Estas técnicas iniciaron con el cultivo de fragmentos no disgregados de tejidos, los cuales restringían la mitosis de las células cultivadas y por tanto su crecimiento.

Después se realizaron cultivos con fragmentos disgregados de tejidos, los cuales aumentaban el crecimiento celular en cultivo ya que se utilizaban células dispersas; esto fue un gran avance y provocó una explosiva expansión en esta área desde los años 50s (Morgan, 1995)”.

TIPOS Y CARACTERISTICAS GENERALES DE UN CULTIVO CELULAR

Referente

a tipos de cultivo celular se

encuentra una serie de trabajos que hacen

referencia a diferentes técnicas, son muchos los ensayos que se han realizado para poder definir cuál es la indicada, sin embargo una forma sencilla la recogen (Rico C.A. y otros 2011),

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cuando de forma resumida presenta una compilación de publicaciones, por ejemplo referente al cultivo en monocapa dicen que (Cohen, 1995) En Rico C. y otros 2011), “ Las células exhiben una variedad de "comportamientos sociales", permitiendo la formación de una monocapa que cubrirá la correspondiente superficie de crecimiento (confluencia), lo que hace que su multiplicación sea inhibida cuando establecen contacto entre sí (quiescencia), Las células provenientes de cultivos primarios son las que mejor crecen en ésta condición, dada su estabilidad genética y su naturaleza diploide normal.

Los recipientes para el cultivo de células estacionarias son cajas de Petri, frascos para el cultivo de tejido (Roux), entre otros, que pueden ser de material de plástico o de vidrio previamente tratado y su desprendimiento para transferirlas a superficies mayores se realizan con agentes proteolíticos como la tripsina.

Sobre los cultivos en suspensión se dice que las líneas celulares que provienen de cultivos primarios con requerimiento de anclaje a superficies, tienen la propiedad de crecer de manera estacionaria o en suspensión después de un período de adaptación.

Existe evidencia experimental que los sistemas en suspensión también requieren de matrices que son macromoléculas, que sirven de protectores a la superficie celular; estas macromoléculas se encuentran en el suero, el cual contribuye igualmente con el medio de cultivo, proporcionando un sistema balanceado de nutrientes. Dentro de éstas matrices está el Methocel, esencial para el crecimiento de cultivos en suspensión.

Aunque el cultivo estacionario es ideal cuando se busca la elaboración de productos extracelulares, el cultivo en suspensión es deseable cuando los productos son intracelulares o cuando se presentan problemas con la capacidad de anclaje de un determinado tipo de célula.

El proceso de cultivo continuo ofrece factores económicos decisivos (utilización de mejores equipos, reducida manipulación) cuando se trata de producir cultivos a una mayor escala de operación.

Referente a los cultivos primarios tienen características especiales que los diferencian de las líneas celulares: conservan la morfología de las células del órgano del que fueron

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aisladas, sus cromosomas tienen un número diploide (2n), su crecimiento in vitro es limitado y hay inhibición por contacto.

El estar más cercanas a las células que las originaron, se ve reflejado en una mejor actividad y funcionalidad similar a su ambiente natural, por lo que en aislamientos primarios de cepas virales éstas tienen mayor sensibilidad que una Línea Celular ya establecida.

Igualmente para la producción de vacunas los cultivos primarios son recomendables por tener una baja probabilidad de que se transformen en malignos.

Dentro de las desventajas está la de una mayor probabilidad de presentar virus adventicios o latentes, lo que implica el desarrollo de la adecuada tecnología para el control de calidad.

Sobre líneas celulares se dice que son continuas están formadas por células que se diferencian genética y morfológicamente de las células de las cuales se originaron.

Pueden provenir de células que se derivan de tumores o de un proceso de transformación de un cultivo primario mediante transfección con oncogenes o con tratamiento con carcinogenéticos, lo que les confiere un nuevo fenotipo.

Este tipo de cultivo tiene la característica de no tener inhibición por contacto y de crecer de manera indefinida. El paso de un cultivo primario a línea se denomina transformación.

Una transformación puede inducirse fisiológicamente (interacción celular, polaridad) a través de hormonas como la hidrocortisona o utilizando inductores no fisiológicos como el DMS.

También se hace referencia a los cultivos tridimensionales y dicen que aquellos que buscan mantener la característica o arquitectura del tejido in vivo.

Los sistemas tridimensionales permiten estudiar la proliferación y morfología epitelial y su interacción con otras células como son las del tejido conectivo; igualmente con ellos se

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puede evaluar el efecto de sustancias que pueden influenciar en tales interacciones intercelulares.

Actualmente se producen Kits dérmicos comerciales con base en cultivos, que permiten evaluar la citotoxicidad de componentes químicos presentes en lociones, preservativos, detergentes, perfumes, shampoos y solventes entre otros.

Se debe tener en cuenta que los cultivos celulares tienen una serie de ventajas innegables, pero al mismo tiempo tiene desventajas que hay que tener en consideración.

Como ventajas por ejemplo permiten un control preciso y fino del medio ambiente. En un cultivo se pueden controlar todos los factores del medio: Físico-químicos (pH, temperatura, presión osmótica, niveles de O2, CO2, tensión superficial), y fisiológicos (hormonas, factores de crecimiento, densidad celular...).

Sobre la Caracterización y homogeneidad de la muestra es necesario saber que las células en cultivo de una línea celular, o de una línea continua son homogéneas, con morfología y composición uniformes.

Se pueden obtener con facilidad un número elevado de réplicas idénticas, con lo que se supera el grave problema de heterogeneidad de las muestras inherente asociado al uso de animales de experimentación.

Los cultivos celulares pueden ser utilizados para diferentes estudios, por ejemplo,: cuando se necesita conocer la velocidad de crecimiento de las células, su comportamiento en medios de cultivo específico, el ciclo de vida de cada una de ellas, el manejo y comportamiento de células tumorales, el trabajo con plásmidos, ensayos de citotoxicidad, entre otros.

Para ello es indispensable, contar no solo con los equipos necesarios, sinó, con las condiciones ambientales ideales, para garantizar un crecimiento sano, por eso es tan importante que se mantengan en el laboratorio las condiciones extremas de asepsia y esterilización.

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Para garantizar las condiciones ambientales y físicas de un laboratorio de cultivo celular, es necesario tener una infraestructura básica, donde las zonas de trabajo se encuentren bien diferenciadas, una zona de preparación y esterilización de medios y reactivos, una zona de lavado y preparación de material y otra destinada a obtención, traslado, propagación y crecimiento celular.

Lo anterior debe estar acompañado de un sistema de refrigeración y congelación, el cual debe permanentemente estar sujeto a revisiones periódicas de mantenimiento, especialmente en sus filtros de aire, entre los equipos que se encuentran dentro de un laboratorio, es necesario tener

centrífugas, balanzas electrónicas, microscopios, y

especialmente cabinas de flujo laminar, que son los espacios precisos para realizar el manejo de celulas, traslado y propagación.

Además existe una serie de insumos como el equipo de vidrio, entre ellas cajas Petri, tubos de ensayo, erlenmeyers, beakers, vidrio reloj, pipetas, probetas ambas graduadas, micropipetas, y material polimérico para sellado, empaque y protección, en su gran mayoría desechable.

Es importante tener en cuenta que para la esterilización se requiere autoclaves, que proporciona calor húmedo, el cual puede alcanzar los 120°C, a 20 PSI, para eliminar cualquier presencia de agentes patógenos que afectaran el crecimiento y desarrollo celular.

También existe el trabajo con calor seco proporcionado por hornos que alcanzan temperaturas de 200 grados y que se mantendrán durante varias horas, hasta garantizar la esterilización completa del material.

Referente a la siembra de las células se recomienda tener en cuenta : El Porcentaje de viabilidad (%) = Número de células vivas/Número de células totales *100 (>85-90% se siembra).

*Número de células vivas/ml = Células contadas vivas x factor de dilución x 104 *Número de células necesarias = Número de placas x la mitad del volumen de cada placa x células viables (1.350.000 para neuronas).

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En el cultivo Celular, el Medio de cultivo es tan importante como las células a cultivar, el uno depende del otro, es común encontrar en el mercado al suero fetal bovino, para el establecimiento y mantenimiento de líneas y cultivos celulares.

Cuando estos se han establecido en medios libres de suero, el crecimiento celular requiere, la suplementación con hormonas y otros factores de crecimiento que están involucrados en transporte de nutrientes, mantenimiento de balance de energía celular, control de síntesis de macromoléculas y otros factores.

(Cohen, 1995). Dice que: “Para un experimento de cultivos con antelación se debe tener en cuenta dos aspectos importantes: Programación – tiempos Debido a la extensión de un cultivo, en cultivos primarios se debe programar el tiempo de un experimento desde el momento en que se cruzan los animales para obtener el tejido necesario para los experimentos.

Programación - tamaño de muestra Los cultivos celulares son realizados con diferentes replicaciones para permitir la conversión de experimentos heterogéneos, cuando se realiza un solo cultivo, en experimentos homogéneos o uniformes, cuando se realizan varios cultivos (replicaciones) cada uno con muestra y características de cultivos idénticos.

Cuando las replicaciones experimentales sean virtualmente idénticas, la necesidad del análisis de varianza como estadística se reduce”

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ALTERNATIVAS DEL CULTIVO CELULAR

A continuación se presenta un documento de la revista veterinaria en colombia.com, donde se muestra diferentes alternativas para el crecimiento celular, ”Dentro de este proceso se pueden mencionar inicialmente el cultivo primario de riñón fetal bovino (Ramírez y col, 1994; Parra y col, 1994; Góngora y col, 1995; Vera y col, 1997).

Dicho cultivo se normalizó y se empleó como substrato para pruebas de su neutralización en DVB, se observaron algunos limitantes tales como, el reducido número de pasajes permitidos por el subcultivo, así como la dificultad para conservarlo bajo condiciones de congelación.

Como consecuencia de lo anterior se buscaron otras opciones entre ellas la utilización del testículo, el pulmón y el cornete bovino, los cuales ofrecen la posibilidad de un número mayor de pasajes (quince para testículo y treinta para pulmón y cornete) y la posibilidad de congelación, pero, con el inconveniente para el cornete y pulmón (dado el origen de los tejidos) de presentar la posibilidad de contaminación bacteriana inicial (Mendigaña y col, 1994; Jaime y col, 1996; Vera y col, 1997).

En general cualquiera de los cultivos mencionados anteriormente, presenta un inconveniente mayor, el cual está representado por la alta incidencia de contaminación con virus adventicios, particularmente con el de la DBV (Ramírez y col, 1994; Vera y col, 1997).

Para solucionar esta limitante se intentó con éxito, la normalización del cultivo de células de córnea bovina (Ramírez y col, 1997). Para solucionar esta limitante se intentó con éxito, la normalización del cultivo de células de córnea bovina (Ramírez y col, 1997), obteniéndose un substrato de buena calidad con mínima contaminación por virus adventicios.

Actualmente se están realizando las pruebas de viabilidad a temperaturas de congelación y su potencial en cuanto a números de pasajes.

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Para obviar algunas dificultades en el trabajo con el virus de la leucosis bovina, relacionadas con la frecuente contaminación de la línea FLK (sustrato biológico para la producción del antígeno) por virus adventicios, se normalizó el cultivo primario de células endoteliales de aorta bovina, que posteriormente fue infectado mediante cultivos con linfocitos provenientes de un bovino con linfocitosis persistente.

La infección fue comprobada por medio de la producción de antígeno viral, y la visualización de sincitios a partir de células infectadas. La susceptibilidad y permisividad de dicho cultivo a la infección por el virus de la leucosis, constituye un nuevo modelo celular para el diagnóstico y el estudio de la biología y la patología de la leucosis; probablemente se pueda emplear en el estudio de otros retrovirus de importancia en salud humana (Barreto y col, 1996)”.

ALGUNOS CONCEPTOS IMPORTANTES

Antígeno: Es una sustancia extraña que ingresa en el organismo, que puede ser, entre otras, un órgano trasplantado. Esta sustancia genera una respuesta de producción de anticuerpos, para tratar de destruir el antígeno (en nuestro caso, el órgano trasplantado).2

Asepsia: Conjunto de técnicas que se utilizan para prevenir contaminaciones

e

infecciones; por ejemplo, por ejemplo los procedimientos en los cuales se recurre en los quirófanos para eliminar o disminuir el riesgo de infecciones. El término séptico denota la presencia de microorganismos patógenos en los tejidos vivos.3 “Cultivo celular: Es el proceso mediante el que las células, ya sean células procariotas, eucariotas o vegetales, pueden cultivarse en condiciones controladas. En la práctica el término "cultivo celular" se usa normalmente en referencia al cultivo de células aisladas de eucariotas pluricelulares, especialmente células animales. El desarrollo histórico y metodológico del cultivo celular está íntimamente ligado a los del cultivo de tejidos y el cultivo de órganos.

2

http://www.cucaier.gov.ar/r1.php, consultado el 1 de julio de 2010

3

CARMONA Oswaldo. Microbiología. Quinta edición. Editorial MC GRAW- HILL interamericana de Venezuela, S.A; 1997, consultado el 3 de marzo de 2011.

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Cultivo en monocapa: Las células exhiben una variedad de "comportamientos sociales", permitiendo la formación de una monocapa que cubrirá la correspondiente superficie de crecimiento (confluencia), lo que hace que su multiplicación sea inhibida cuando establecen contacto entre sí (quiescencia).

Cultivo en suspensión: Las Líneas celulares que provienen de cultivos primarios con requerimiento de anclaje a superficies, tienen la propiedad de crecer de manera estacionaria o en suspensión después de un período de adaptación

Cultivos primarios: Los cultivos primarios tienen características especiales que los diferencian de las líneas celulares: conservan la morfología de las células del órgano del que fueron aisladas, sus cromosomas tienen un número diploide (2n), su crecimiento in vitro es limitado y hay inhibición por contacto.

“Desinfección: En un principio este término se utilizo con el significado de destrucción de los microorganismos por agentes químicos. Ahora es necesario definir varios vocablos que guardan íntima relación con la acción y efectos de distintas sustancias, compuestos orgánicos o inorgánicos que se traducen en muerte o inhibición de la reproducción de un determinado microorganismo o grupo de ellos.

Esterilización: Se llama esterilización al conjunto de procedimientos físicos o químicos que permiten destruir

o eliminar los microorganismos patógenos

encuentran en el interior

y saprófitos que se

o en la superficie de objetos y sustancias. Su práctica es

fundamental en el laboratorio de microbiología de modo que todos los instrumentos y materiales empleados en el trabajo diario deben ser esterilizados de antemano”.4

Líneas celulares: Las Líneas Celulares continuas están formadas por células que se diferencian genética y morfológicamente de las células de las cuales se originaron.

Pueden provenir de células que se derivan de tumores o de un proceso de transformación

4

CARMONA Oswaldo. Microbiología. Quinta edición. Editorial MC GRAW- HILL interamericana de Venezuela, S.A; 1997, consultado el 3 de marzo de 2011

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de un cultivo primario mediante transfección con oncogenes o con tratamiento con carcinogenéticos, lo que les confiere un nuevo fenotipo”. 5

Cultivos tridimensionales: Son aquellos que buscan mantener la característica o arquitectura del tejido in vivo.

Los sistemas tridimensionales permiten estudiar la proliferación y morfología epitelial y su interacción con otras células como son las del tejido conectivo; igualmente con ellos se puede evaluar el efecto de sustancias que pueden influenciar en tales interacciones intercelulares.6

Histocompatibilidad: Es el estudio de los antígenos de los leucocitos humanos (HLA). El estudio de estos antígenos se realiza en el donante y en el receptor antes de efectuar un trasplante renal o pancreático para asegurar que el órgano sea compatible con la persona a ser trasplantada y de esta manera disminuir las posibilidades de rechazo.7

5

http://es.wikipedia.org/wiki/Cultivo_celular, consultado el 16 de junio de 2010 http://javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/cultivos.htm, consultado el 16 de junio de 2010 7 http://arwww.cucaiba.gba.gov.ar/Glosario.htm, consultado el 19 de junio de 2010 6

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LAS CELULAS MADRE

En el Trabajo presentado por: (Ríos Miguel Ángel, 2006) Enviado por: Pea Sanchez Carlos Gustavo para definir las células madre comentan que: “La mayoría de las células de un individuo adulto (nos estamos refiriendo al hombre y los mamíferos superiores) no suelen multiplicarse, salvo para mantenimiento de algunos tejidos como la sangre y la piel. Las células del músculo y de la grasa en condiciones normales no se dividen.

Si se engorda, no es que se tenga más células, en realidad se tiene la misma cantidad de células, pero éstas han aumentado de tamaño.

Si una lagartija pierde la cola, le vuelve a crecer. En los mamíferos no ocurre así. Si un individuo pierde un miembro, no lo vuelve a desarrollar.

Su capacidad de regeneración está limitada a la cicatrización. Sin embargo, en prácticamente todos los tejidos hay unas células que, aunque habitualmente no se dividen, en condiciones particulares pueden proliferar y regenerar ese tejido.

Artificialmente se ha visto que estas células tienen capacidad de reproducirse y generar otros tejidos distintos, y reciben el nombre de células madre.”

En este mismo documento definen la células madre como: “son aquellas células dotadas simultáneamente de la capacidad de autor renovación (es decir, producir más células madre) y de originar células hijas comprometidas en determinadas rutas de desarrollo, que se convertirán finalmente por diferenciación en tipos celulares especializados.

En el contexto de la actual investigación, se pretende obtener células madre que se mantengan como tales en cultivo en el laboratorio, y que bajo determinados estímulos puedan conducir a poblaciones de células diferenciadas.

El zigoto (óvulo fertilizado) es una célula totí potente, capaz de dar origen a todo el organismo. Durante las primeras divisiones el embrión es una esfera compacta (mórula), en la que todas las células son totí potentes, y de hecho esto se refleja de modo natural en los gemelos monozigóticos.

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A los pocos días comienza una primera especialización, de modo que se produce un blastocisto, con una capa superficial que dará origen al trofoblasto, del que deriva la placenta, y una cavidad casi "hueca" (rellena de fluido) en la que está la masa celular interna (m.c.i.).

Las células de esta m.c.i. son pluripotentes, porque aunque por sí solas no pueden dar origen al feto completo (necesitan el trofoblasto), son el origen de todos los tejidos y tipos celulares del adulto.

Hay que aclarar un punto: aunque las células de la masa celular interna del blastocisto son pluripotentes, no son en sí mismas células madre dentro del embrión, porque no se mantienen indefinidamente como tales in vivo, sino que se diferencian sucesivamente en los diversos tipos celulares durante la fase intrauterina.

Lo que ocurre es que cuando se extraen del embrión y se cultivan in vitro bajo ciertas condiciones, se convierten en células "inmortales" dotadas de esas dos propiedades de las que hablábamos: autor renovación y pluripotencia.

Pluripotencia: Las células madre pueden diferenciarse in vivo e in vitro en una gran diversidad de tipos celulares.

In vivo dicha multipotencia se manifiesta cuando al incorporar células madre en blastocitos pueden dar origen a cualquier tejido u órgano,

In vitro pueden contribuir igualmente, con las señales adecuadas, a diferentes líneas celulares de las tres capas embrionarias (ecto-, meso- y endodermo). Este es el campo donde más se está investigando actualmente, por su relevancia para la clonación terapéutica”.

Para la Obtención de las células Madre, se diferencian varias fuentes, por ejemplo provenientes de embriones almacenados en clínicas de fertilidad dejados por parejas donante, (ver figura 1). también embriones clonados, fetos de desarrollo temprano abortados, a partir de cordones umbilicales, tejidos u órganos de adultos vivos en una cirugía y de cadáveres con células neurales. (ver figura 2).

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Figura 1. Obtención Celulas Madre

Fuente: http://4.bp.blogspot.com/- 9n8AFwv_iBw/TqkSN6nmBvI/AAAAAAAAA00/Oc33JR8fcBs/s320/celulasmadre.jpg

. Figura 2. Recolección Celulas Madre de Médula Ósea

Fuente: http://www.barriodeflores.com.ar/notas/graf/medula%20osea3.jpg

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Recomiendan en el artículo que: “Las células madre embriónicas deben ser obtenidas cuando el embrión se encuentra en un estado temprano de su desarrollo, es decir, cuando el huevo fertilizado se ha dividido hasta formar aproximadamente 1.000 células. (ver figura 3).

Estas células se separan y se mantienen en un envase de cultivo celular, deteniendo así el desarrollo embriónico que conlleva a la creación de un individuo. Es por esto que la investigación en células madre embriónicas es el tópico de debates éticos.

El uso de células madre de adultos posa menos dilemas éticos. Sin embargo, las células madre de adultos pueden no tener el mismo potencial para usos médicos terapéuticos que tienen aquellas derivadas de los embriones”.

Figura 3 . Celulas Hematopoyéticas de Cordón Umbilical

Fuente: http://www.bscan.org/Images/tejidos2.jpg

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Antecedentes de cultivo celular hematopoyético

Cuando se habla de celulas hematopoyéticas, de inmediato se debe remitir a Alexander Friedenestein, quien fue el primero en describirlas, como lo presenta (FUENTES M. f.

2010) “Alexander Friedenestein fue el primero en describirlas en Medula Ósea (MO) adulta y se estima su numero 0.001% ó 1; 34,000 células mono nucleares como describe Beyer et al en este tejido.

El primer aislamiento de CMM (Células Madre Mesenquimales) lo realizó Friedenestein et al, determinando la adherencia de estas células a superficies plásticas a partir de muestras de medula ósea después de 3 a 5 días de cultivo, donde observaron colonias de 2 a 4 células con morfología fibroblastoide las cuáles denominaron unidades formadoras de colonias fibroblastoides”.

FUENTES. María, Fernanda. Optimización de cultivo y caracterización de células madre mesenquimales obtenidas a partir de la medula ósea. Trabajo de Grado.2008. [En línea].

[Consultado

en

marzo

18

de

2010].

Disponible

en

internet:http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis318.pdf.

En la tesis de grado de maría Fernanda Fuentes Lacouture acerca de Optimización de cultivo y caracterización de células madre mesenquimales obtenidas a partir de la medula ósea

hace referencia

a

las

Células

Hematopoyéticas

diciendo:

las

celulas

hematopoyéticas, clasificación y características.

Desde la etapa prenatal el ser humano, empieza a diferenciarse a nivel del embrión, este comienza a implantarse en el endometrio, dando origen a una figura especial en el trofoblasto, conocida como sinsitiotrofoblasto, caracterizada por ser poco diferenciada celularmente, con abundantes núcleos y con emisión de enzimas líticas encargadas de

Erosionar la mucosa uterina, paso seguido se origina el mesénquima, que migra hacia para entrar a formar la placenta conocida como lacunar, desde este momento se da la formación de eritrocitos embrionarios,

Etapa primordial o pre hepática, cuando el embrión comienza a implantarse en el

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endometrio, aparece una estructura singular en el trofoblasto, llamada Sincitiotrofoblasto, la cual es una masa acelular multinucleada que produce enzimas líticos que erosionan la mucosa uterina.

Poco después de iniciado este proceso, aparece un nuevo grupo de células, el mesénquima, derivado de la línea primitiva, que migra hacia el esbozo placentario y se ubica formando “lagunas hematógenas”, en la etapa de formación de la placenta conocida posteriormente en la etapa fetal, se comienza a formar células sanguíneas a partir del hígado, timo y bazo.

Más adelante dar paso a la

etapa medular linfoide o definitiva, poco después del

nacimiento, de esta forma aparece entonces la hemocitopoyesis que sólo se concentra en la médula ósea roja (en los huesos largos de animales jóvenes y en los cortos de los adultos) y en el tejido linfoide en mención.

También es importante conocer como (Escario A. M., 2011) hace referencia a las células Troncales o Madre: “Células troncales o células madre La transición y los cambios morfológicos y de función observados desde la fertilización del huevo por el esperma hasta el nacimiento del organismo individual es un proceso exquisitamente controlado de cambios secuenciales.

Este proceso de desarrollo está genéticamente controlado y conduce a tejidos y órganos con una precisa integración morfológica y funcional. La clave de este proceso es la conversión de grupos de células multipotentes a células diferenciadas y altamente especializadas, estrechamente ligadas a la función del tejido (Caplan 2007)

Los estudios iniciales de Friedenstein (1980, 1990) y Owen (1985, 1988) establecen que la médula ósea contiene células que pueden dar lugar a un amplio espectro de tejido conectivo plenamente diferenciado.

La aplicación experimental y clínica de estas células ha expandido el campo de la Medicina Regenerativa y de la Bioingeniería (Caplan, 2007).

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Estas células permanecen en un estado indiferenciado por la supresión por factores intrínsecos o extrínsecos, hasta que son estimuladas.

Las células troncales del adulto se han descubierto y múltiples tejidos, lo que ha sugerido su potencial aplicación terapéutica en propio huésped (Wynter et al 1999, Dua et al 2000, Rao 1999).

Como estas células son capaces de diferenciase en líneas celulares específicas cuando son necesarias, la posibilidad de realizar implantes autólogos en clínica o mediante bioingeniería genética, producir proteínas o drogas sin riesgo de rechazo inmunológico se ha visto como una posibilidad.

Sin embargo, el éxito de la aplicación futura depende de la comprensión del comportamiento biológico de estas células. Los resultados aportados en la actualidad sugieren que las células troncales hematopoyéticas de la médula ósea pueden mostrar un fenotipo hepático (Lagasse at al 2000, Petersen et al 1999, Alison et al 2000).

Que las células satélites del músculo muestran capacidad hematopoyética (Jackson et al 1999) y que las células troncales mesenquimales de la médula ósea pueden diferenciarse en músculo esquelético (Ferrari et al 1998) caracterizado en los tejidos del Aspectos generales de las células troncales referentes a las células troncales embrionarias (Tuan et al 2002-3,Yamanaka et al. 2007), células troncales como origen del cáncer (Tuan et al 2002, Alison et al 2007).”

Continúa su trabajo explicando haciendo referencia a los tres tipos de celulas de médula Ósea, y del potencial de diferenciación : ” Fuente de células troncales mesenquimales Las células troncales mesenquimales del adulto (MSC) que tienen la capacidad de diferenciarse en condrocitos, osteoblastos, adipocitos, fibroblastos, estroma médula y otras células mesenquimales residen en distintos tejidos del adulto, tales como el periósteo, tejido adiposo, membrana sinovial, músculo, dermis, médula ósea, e incluso en la trabécula ósea (Tuan et al 2002).

Normalmente, la médula ósea se considera la fuente más accesible y rica en células MSC. La médula ósea contiene tres tipos celulares: células endoteliales, células troncales

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hematopoyéticas, y células estromales. (Friedenstein et al 1976), aislaron células, células clogénicas precursoras de fibroblastos (CFU-F), de médula ósea y observaron que eran capaces de formar colonias, capaces de formar hueso y cartílago.

Estudios posteriores se han interesado no solo en el potencial de diferenciación de las células MSC, sino de los mecanismos que regulan esta diferenciación específica hacia una línea celular, particularmente hacia hueso y cartílago.

(Pittenger et al 1999) mostraron que las células aisladas por aspiración de la médula ósea humana eran capaces de permanecer en un estado de no diferenciación cuando se cultivaban in vitro durante largos periodos de tiempo y que las colonias aisladas de una simple célula podían ser inducidas a diferenciarse en líneas de células osteogénicas, adipogénicas y condrogénicas, cuando se las colocaba en un medio adecuado.

A partir de entonces surgen trabajos con métodos de aislamiento celular y preparación de medios más homogéneos con la posibilidad de clonar células procedentes de colonias MSC. (Kurnetsov et al 1997) mostraron que la población de células estromales, cultivadas en medio con suero, eran capaces de formar colonias en respuesta a factores como: factor de crecimiento derivado de las plaquetas, factor beta transformante de crecimiento (TGF-beta), factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento epidérmico”.

También hace referencia al concepto de Nicho, y dice: “Nichos de las MSCs El concepto de “nicho” de células troncales fue introducido por primera vez por Schofield en 1978 (Schofield 1978), la idea ha ido ganando adeptos, particularmente en los años recientes.

El nicho comprende todo los elementos que rodean a la célula troncal cuando se encuentra en su estado nativo, incluyendo las células no troncales que puedan estar en contacto directo con ellas así como la ECM y las moléculas solubles que se encuentran localmente.

Todos ellos actúan de forma conjunta para mantener las células troncales en su estado de indiferenciación. Esto sugiere que de alguna forma se puede influir o actuar en el nicho para dar una señal a las células troncales para que estas inicien el proceso de regeneración o repoblación del tejido (Kolf et al 2007). En el nicho hay que distinguir tres

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componentes: 1º, Componente celular; 2º, componente soluble; y 3º, componente de matriz extracelular.

Componentes celulares del nicho Los estudios recientes sugieren la naturaleza perivascular del nicho en las MSCs, basándose en la expresión de -SMA en las MSCs aisladas de tejidos (da Silva et al 2006) y en la localización inmuhistoquímica de células CD45 - /CD31 - /Sca-1 + /Thy-1 + de localización perivascular. Las MSCs se encontraron, usando marcadores Stro-1 y CD 146, próximos o bordeando los vasos sanguíneos en médula ósea humana (Shi et al 2003).

Estas células también expresan -SMA y 3G5, un marcador de superficie celular asociado a pericitos. Algunos autores han mostrado que son de hecho MSCs, porque pueden diferenciarse en osteoblastos, condrocitos y adipocitos (Doherty et al 1999).

Proteínas de adhesión celular transmembrana, cadherinas, funcionan en la unión célulacélula, migración, diferenciación y polaridad celular, incluyendo las MSCs (Tuli et al 2003), y se conoce que interactúan con Wnts, que son importantes en la biología de las MSCs (Nelson et al 2004)

El concepto de nicho se ha extendido a otros tejidos. Las preparaciones de células troncales derivadas del tejido adiposo (ADSC) tanto del humano como de animales muestran una capacidad de diferenciación similar a la MSCs (Caplan 2007, Lee et al 2004, Katz et al 2005).

Sin embargo la impresión es que estas células semejantes a las MSCs están asociadas a los vasos sanguíneos (Tavian et al 2005). Los estudios de Caplan (Caplan 2007) sugieren que hay gran correlación entre el título de las colonias CFU-f y la densidad vascular en todas las muestras de tejido adiposo estudiado.

Esta correlación entre el patrón vascular y los títulos de MSCs ha sido puesta en evidencia por otros autores (Kubis et al 2006; Meirelles et al 2006).

En médula ósea de mamíferos se han identificado pequeñas células troncales similares a las células del embrión (Kucia et al 2008). Zhang et al (2003) y Calvi et al (2003) han

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demostrado que el osteoblasto -célula que reside en la médula ósea y segrega la matriz del hueso calcificadojuega un papel crucial en la regulación del nicho de HSCs Imagen 1.1.3.Nicho osteoblástico y nicho vascular (Yin et al 2006) Tipos de nichos según la celularidad.

El concepto de nicho hace referencia a la ubicación de un complejo estructural tisular micro ambiental con responsabilidad en la reconstitución de células con actividad funcional.

Así pues, habrá tantos tipos de nichos según el tejido y órgano donde se sitúe. También se describen otros tipos de nichos (Kolf et al 2007): 1) Nicho osteoblástico, puesto que es claro que el osteoblásto es un componente crucial en el nicho de MSCs en la médula ósea del adulto, en el que las citoquinas, quimoquinas y moléculas de adhesión juegan un papel importante. 2) Nicho vascular, este nicho se puede diferenciar en una parte embrionaria y en una parte adulta”.

En introducción al cultivo de Tejidos ( Garcia J.M., 2002) habla de la esterilización de los cultivos de células Hematopoyéticas y dice: La esterilización es un proceso a través del que se puede lograr la destrucción total de los microorganismos viables presentes en un determinado material.

Este procedimiento es de gran utilidad dentro del campo farmacéutico, ya que existen muchos procesos que requieren la utilización de materiales estériles. Entre éstos podemos destacar:

-La esterilización de equipos quirúrgicos y otros materiales de uso médico con el propósito de reducir el riesgo de infecciones en pacientes.

El acondicionamiento del material cajas Petri (ver figura 4), tubos, (figura 5), pipetas (figura 6), placas para cultivo celular (figura 7) y pinzas, etc.) que va a ser utilizado en los laboratorios de microbiología.

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Figura 4. Cajas Petri

Fuente: http://www.labotienda.com/imagenes/fotos/kartell/45000358.jpg

Figura 5. Tubos

Fuente: http://www.ictsl.net/images/20447342037_462.jpg

Figura 6. Pipetas

Fuente: http://www.cientificasenna.com/files/image/catalogo/articulos/cor4485_ 20435529634f3ec22492d7a.jpg

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Figura 7. Placas para Cultivo Celular

Fuente: http://labsystemssac.com/_imagenes/productos/placas-cultivo-celular.jpg

-La preparación de medios de cultivo que serán empleados con diferentes propósitos (cultivo de microorganismos, control de ambiente, equipos o personal, análisis microbiológico de medicamentos, cosméticos, alimentos, (ver figura 8)

Figura 8. Medios de Cultivo

Fuente: http://www.biotechspain.com/assets_db/technics/assets/asset_133276519267.jpg

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Clasificación de los métodos de esterilización:

Agentes físicos: el calor, este puede ser aplicado como agente esterilizante de dos maneras:

Calor húmedo el cual destruye a los microorganismos por desnaturalización de las proteínas.

Calor seco que destruye a los microorganismos por oxidación de sus componentes celulares.

Las radiaciones ionizantes: Pueden ser utilizadas para la esterilización de materiales termolábiles, entre estos materiales plásticos.

Las radiaciones no ionizantes: Como la luz ultravioleta, puede ser empleada en el control de áreas cerradas.

Esterilización por calor: El calor es el método de elección para esterilizar el material de laboratorio resistente a las altas temperaturas. La temperatura y el tiempo requeridos para esterilizar un material dependen de que se esté utilizando calor seco o calor húmedo.

Esterilización con calor seco: La acción bactericida del calor seco se debe a la oxidación física de un procedimiento lento o coagulación de la proteína bacteriana por quemadura.

En ausencia de humedad se necesita una temperatura más alta, ya que de esta manera los microorganismos son destruidos al absorber el calor.

De forma Directa: Se hace realiza mediante flameado o incineración, siendo la más utilizada en laboratorios y en algunos hospitales pequeños.

De forma Indirecta: Mediante aire caliente u horno de Pasteur con temperatura de 160ºC a 180ºC por 1 a 2 horas siendo más eficaz y seguro el eléctrico.

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Esterilización con calor húmedo: El calor húmedo es la forma de vapor saturado a presión es eficaz para la destrucción de todas las formas microbianas, incluso espora. ( Figura 9)

La muerte de las bacterias es causada por la desnaturalización y coagulación de su proteína o su sistema intercelular enzima-proteína.

Estas reacciones son catalizadas por medio del agua. Estas pueden de dos tipos:

Figura 9. Autoclave – calor Húmedo

Fuente: http://www.portalesmedicos.com/imagenes/publicaciones/0801_esterilizacion_instrumental_quirofano/esteriliz acion_calor_humedo_autoclave_autoclaves.jpg

Calor húmedo discontinuo: Algunos medios de cultivo que contiene carbohidratos Como la gelatina, leche, entre otros, no soportan temperaturas elevadas por lo cual se realiza mediante:

Tindalización:

Utilizando calor húmedo a 100ºC por ½ hora (por tres veces discontinuas) durante 1 día.(figura 10)

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Figura 10. Tindalización

Fuente: http://4.bp.blogspot.com/-y--MwfEHWEE/T6O44z4eDLI/AAAAAAAABPE/yKzq1UddwPM/s1600/05.jpg

Ebullición: Pasando de estado

Líquido al estado de vapor. El agua en ebullición

representa la manera más eficaz y práctica de proporcionar una desinfección de alto nivel de instrumentos y guantes que entren en contacto de las membranas mucosas, si bien al hervirlos por 20 minutos se aniquilan todas las formas vegetativas de las bacterias, los virus, las levaduras y los hongos, pero no destruye a las esporas. (figura 11)

Figura 11. Ebullición

Fuente: http://static.icarito.cl/20100615/969858_280.jpg

Pasteurización: Elimina todos los microorganismos no esporulados variando en las temperaturas pasando de 62ºC por 30 min.

A 70ºC por 15 min. Se utiliza en la

preservación de alimentos como ser leche, cerveza.(figura 12)

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Figura 12. Pasteurización

Fuente: http://www.portalechero.com/innovaportal/file/725/1/pasteurizacion6.jpg

Vapor a presión: Conocido como autoclave o cámara presurizada. Es utilizada normalmente en el laboratorio. Posee todos los requisitos indispensables como grados de temperatura y tiempo de exposición, que junto con el tamaño del autoclave, el flujo del vapor, la densidad y el tamaño de la carga en la cámara aumentan la tasa se muerte de los microorganismos, con una temperatura de 121ºC – 132ºC durante 15 minutos o más(figura 13).

Figura 13. Vapor a Presión

Fuente: http://t1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcS77eKF8FDD30joYRvvX6DjGkxDdcBKFoWWdaITv_IMXEASNg5fw

(García P. et al 2004) plantean recomendaciones respecto al estudio microbiológico de tejidos preservados para implantes diciendo:

Estudio microbiológico de células progenitoras obtenidas de sangre periférica,

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Médula ósea o cordón umbilical

Históricamente, la médula ósea ha sido la fuente primaria de obtención de células progenitoras (troncales) hematopoyéticas para ser usadas en trasplante. Sin embargo, desde más de unas décadas está utilizando, como fuente alternativa de células progenitoras, la sangre periférica de donantes autólogos o alogénicos, cuyas células troncales hematopoyéticas han sido movilizadas desde la médula ósea por factores estimuladores de crecimiento.

De igual forma, se utiliza como fuente de células progenitoras, cosechas de sangre de cordón umbilical.

Es conocido que durante las diferentes etapas de los procesos de obtención, preparación y criopreservación de células progenitoras, cualquiera sea la fuente, existe riesgo de contaminación.

Sin embargo, con la automatización de los procedimientos para cosechar (excepto médula ósea), manipular ex vivo y preparar el material para la criopreservación, los riesgos de contaminación han disminuido notablemente.

En este sentido ha sido importante el desarrollo de procedimientos en circuito cerrado, los que además se realizan en un ambiente de aire filtrado estéril proporcionado por gabinetes de bioseguridad clase II.

En la mayoría de los casos, la contaminación se produce al momento de la obtención de la cosecha, particularmente en médula ósea y sangre de cordón, y no durante el procesamiento o descongelamiento previo a su infusión al paciente.

Procedimiento microbiológico: Cosecha de células progenitoras desde sangre Periférica: obtención de muestras para cultivo microbiológico: Pre-leucoaféresis • Operador de máquinas de leucoaféresis: - lavado concurrente de manos

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- utilización de guantes • Preparación de la piel: - Limpieza:

Limpie el área de la piel a puncionar con lavador quirúrgico (solución espumosa) formando círculos concéntricos de aproximadamente cm de diámetro. Deje actuar por 30 segundos, sin que ella se seque, antes de pasar a la etapa siguiente. En caso que el paciente sea alérgico al yodo, realice la limpieza de la piel con alcohol al 70% y espere que se seque (figura 14)

Figura 14. Limpieza del Área

Fuente: http://revistas.concytec.gob.pe/img/revistas/rpoe/v4n2/a12fig03.jpg

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Desinfección:

Aplique povidona yodada en el área a puncionar formando círculos concéntricos de aproximadamente 5 cm de diámetro. Espere 30 segundos para lograr el efecto bacteriostático de la povidona. Puncione sin volver a tocar el área de la piel que ya se ha descontaminado. Si es necesaria una nueva palpación de la vena, debe utilizar guantes estériles.(figura 15).

Figura 15. Técnica para Desinfección

Fuente: http://farmacointernacional.com/piel_2_2772728929.jpg

• Instalación de catéteres centrales: En aquellos casos en que se requiere de la instalación de un catéter central, éste debe ser instalado en pabellón quirúrgico, con la debida anticipación y siguiendo las técnicas asépticas asociadas (figura 16).

Figura 16. Catéteres Venosos Centrales

Fuente: http://i.oem.com.mx/20ae6226-a01b-4d7a-8551-37494a76cca3.jpg

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Mantención de la línea venosa:

- Evite en todo momento la manipulación innecesaria de la vía.

- Cubra el sitio de punción con una gasa estéril de forma de proteger la entrada de la Aguja en la piel.

Ante cualquier manipulación de la vía venosa, manéjela con técnica aséptica.

- Una vez finalizada la cosecha cierre la bolsa y envíela al laboratorio de criopreservación (No tome en esta etapa una muestra para cultivo microbiológico).

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CAPÍTULO II

HISTORIA DE TRANSPLANTES EN COLOMBIA

Para referirse a la historia de transplantes en Colombia es necesario iniciar con los reportes que realiza brevemente “El MINISTERIO DE PROTECCION DE TRASPLANTES REALIZADOS EN COLOMBIA”, presentado por (Grupo de Endocrinología... http://eurosocialsalud.eu/files/docs/00112.pdf - 1988 ) Ministerio de la Protección Social. República de Colombia. HISTORIA. ❖ 1988: Primer Trasplante simultaneo de Páncreas y Riñón

1973: Primer Homoinjerto Renal de donante vivo (Hermano) Receptor fallece después con una función renal normal a causa de un Accidente de Transito.

1976: Primer Trasplante Singénico de Medula Ósea (Gemelos Idénticos) Grupo de Trasplantes de Universidad de Antioquía y el Hospital San Vicente de Paul.

1979: Primer Trasplante Hepático por Enfermedad de Wilson (Grupo de Trasplantes de Universidad de Antioquía y el Hospital San Vicente de Paul).

1985: Primer Trasplante Cardiaco (Clínica Cardiovascular de Medellín).

1986: Primer Trasplante Alógenico de Medula Ósea (Grupo de Trasplantes de Universidad de Antioquía y el Hospital San Vicente de Paul).

1988: Primer Trasplante Simultáneo de Páncreas y Riñón (Grupo de Endocrinología de Universidad de Antioquia y el Hospital San Vicente de Paul). Receptor con Diabetes Mellitus Tipo I e Insuficiencia Renal Terminal.

1993: Primer Trasplante Autólogo de Medula Ósea Grupo de Trasplantes de Universidad de Antioquía y el Hospital San Vicente de Paul).

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1995: Primer Trasplante de Corazón y Riñón Grupo de Trasplantes de Universidad de Antioquía y el Hospital San Vicente de Paul).

2000: Primer Trasplante Simultáneo de Hígado y Riñón. Receptor de 42 años con Cirrosis Biliar Primaria e Insuficiencia Renal Terminal Grupo de Trasplantes de Universidad de Antioquía y el Hospital San Vicente de Paul).

2001: Primer Trasplante de Medula Ósea. Cordón Umbilical Grupo de Trasplantes de Universidad de Antioquía y el Hospital San Vicente de Paul).

(Orozco M. 2011) presenta en las memorias del “ primer congreso de profesionales de enfermería clínica y octavo simposio de Actualizaciones en enfermería” presenta de forma clara y sencilla definiciones muy importantes para el entendimiento del tema sobre Trasplante de Médula Ósea:

DEFINICIÓN El trasplante de médula ósea es un proceso mediante el cual, la médula ósea no funcionante, deficiente o con células malignas es eliminada usando altas dosis de quimioterapia, seguida de la infusión de médula ósea o células madre hematopoyéticas de sangre periférica para restablecer la función hematológica e inmunológica de los pacientes.

TIPOS DE TRASPLANTE El tipo de trasplante depende del origen de las células madre.

• Autólogo: cuando • Alogénico: cuando

provienen provienen

de

otro

del

mismo

individuo

individuo,

consanguíneo

o

• Singénico: cuando provienen de un hermano gemelo.

INDICACIONES DEL TRASPLANTE ALOGÉNICO

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no.

Enfermedades malignas

Leucemia Mieloide Crónica (LMC). Es la alternativa de curación para estos pacientes. Los mejores resultados se obtienen en pacientes jóvenes a quienes se les realiza el procedimiento durante la fase crónica y dentro del primer año de diagnóstico. La limitante más frecuente es la edad del paciente y la dificultad en conseguir donantes.

Leucemia Linfoide Aguda (LLA). Se constituye en una alternativa importante para los pacientes de alto riesgo en su primera remisión, con leucocitosis en el momento del diagnóstico y anormalidades cromosómicas de mal pronóstico (Cromosoma Filadelfia); así mismo, se puede realizar durante la segunda o posteriores remisiones superando a la quimioterapia convencional.

Leucemia Mieloide Aguda (LMA). Se han obtenido resultados superiores a la quimioterapia convencional cuan- do se realiza el trasplante en la primera remisión.

Síndrome Mielodisplásico. Se constituye en el único tratamiento curativo para estos pacientes, con las mismas limitantes de edad y dificultad para conseguir donantes.

Enfermedades no malignas

Aplasia medular. Se constituye en una excelente alternativa en pacientes menores de 45 años, en quienes el tratamiento con inmunoglobulinas antilinfocítica o antitimocítica e inmunosupresores ha fallado.

INDICACIONES DEL TRASPLANTE AUTÓLOGO

El trasplante se utiliza frecuentemente como tratamiento de rescate en pacientes con Linfoma Hodgkin y No- Hodgkin; dado que estas neoplasias tiene una elevada sensibilidad a la quimioterapia. También se obtienen buenos resultados en el tratamiento de linfomas de pobre pronóstico.

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OTROS FACTORES

Existen otros factores que intervienen en la elección del tipo de trasplante por realizar: estado de la enfermedad, edad del paciente, disponibilidad de donante histocompatible, presencia de enfermedades asociadas y recursos financieros.

Proceso de un trasplante

Las células madre hematopoyéticas se pueden obtener de varias fuentes: médula ósea, sangre periférica y cordón umbilical. Actualmente, se realizan con mayor frecuencia y buenos resultados trasplantes de células madre extraídas de sangre periférica. A grandes rasgos el trasplante se divide en tres fases: pre, trans, y postrasplante. Sin embargo, existen diferencias entre el autólogo y el alogénico.

Evaluación pretrasplante. Se realiza evaluación general del paciente con el fin de determinar su estado físico y sicosocial. Incluye pruebas hepáticas, pulmonares, cardíacas, renales y evaluación de su entorno familiar y social, entre otros. En el caso de un trasplante alogénico, también se realiza una valoración completa del donante.

Fase de movilización. Consiste en estimular la producción y liberación de células madre a la sangre periférica mediante el uso de quimioterapia y factores de crecimiento hematopoyético, como es el caso de los trasplantes autólogos. En los alogénicos, se administra al donante factores de crecimiento hematopoyético con o sin corticoesteroides.

Aféresis. Es un procedimiento similar al utilizado para la obtención de las plaquetas de donantes voluntarios. Usando esta técnica, durante un período de 1 a 4 días y en sesiones de 3 a 4 horas (5-10 litros), se logra una cosecha de células madre hematopoyéticas hasta diez veces mayor que la obtenida de la médula ósea. También se puede realizar una sola aféresis enérgica (15 –20 litros) con resultados similares (figura 17).

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Figura 17. Aféresis

Fuente: http://www.linfomaymieloma.com/recursos/image/transplante%20MAQUINA%20AFERESIS.jpg

Almacenamiento de las células madre. Es un procedimiento exclusivo para los trasplantes autólogos. Después de cada aféresis, las células madre recolectadas son congeladas utilizando sustancias crioprotectoras y nutritivas para evitar su muerte.

Figura 18. Almacenamiento de Celulas Madre

Fuente: http://www.sobrecelulasmadre.com/wp-ontent/uploads/2010/02/celulasmadre.bmp

Régimen de acondicionamiento. Consiste en administrar dosis extremadamente altas de quimioterapia con el propósito de eliminar la enfermedad maligna, destruir el estado inmunológico preexistente del paciente y crear un espacio en la cavidad medular para la proliferación de las células madre trasplantadas.

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Infusión de células madre o trasplante. En el trasplante autólogo, las células madre son descongeladas en un baño de solución salina normal, se extraen con jeringas de gran calibre y se infunden a través de un catéter venoso central, durante un período de 15 a 20 minutos. En el trasplante alogénico, las células se infunden inmediatamente después de la aféresis del donante.(figura 19)

Figura 19. Infusión de Células Madre

Fuente: http://www.sld.cu/galerias/imagen/sitios/medregenerativa/imagen2_1.jpg

El cultivo celular hematopoyético a nivel internacional

España es un país que se destaca por su incursión e interés temprano en la participación en el campo de Cultivo Hematopoyético y de trasplante de Médula Ósea, en Sevilla, el Hospital Universitario Virgen del Rocío, avanza ordenadamente con un equipo de médicos, enfermeros, Bioquímicos entre otros,

para profundizar en el conocimiento

sobre trasplantes en general, pero se puede mencionar como un caso de admirar el trabajo que se realiza en el área de hematología y aféresis, donde se realizan permanentemente cultivos Hematopoyéticos y el trasplante de médula Ósea.

Vale la pena conocer algunos de sus trabajos presentados en la revista “Actualizaciones en Trasplantes 2008”, que bajo la coordinación Científica del Dr. José Pérez Bernal, presentan un resumen de sus logros científicos, en ella se puede apreciar el artículo sobre

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“Trasplante de médula ósea y regeneración del sistema hematopoyético, (Cerezuela P. y .

Urbano A, 2008) donde dicen: “La célula madre hematopoyética (CMH) posee la capacidad de producir tanto progenitores que mantienen propiedades de célula madre como otros más diferenciados que producirán las célulasmieloides y linfoides de la sangre incluyendo leucocitos, eritrocitos y plaquetas. De hecho, una solaCMH es capaz de repoblar el sistema linfohemopoyético de animales irradiados a dosis letales.

Esta capacidad única de la CMH permitió en 1957 a Thomas y colaboradores su uso pionero en la regeneración de una médula ósea (MO) en pacientes con leucemia en estadios terminales.

Desde entonces, se han llevado a cabo más de 200.000 trasplantes de progenitores hematopoyéticos (TPH) en todo el mundo con una tasa anual de 40000.

Las CMH se obtienen normalmente de la MO o de sangre periférica (SP) y más recientemente,también de cordón umbilical (CU). El número de CMH recolectado es estimado a través de la utilización del marcador de superficie celular CD34. La CMH puede ser usada para la realización de TPH autólogo (autoTPH) y alogénico (aloTPH).

La mortalidad asociada al autoTPH es baja aunque desafortunadamente no es infrecuente la recaída de la enfermedad de forma ulterior al TPH, que es la causa de fallecimiento de muchos pacientes.

El aloTPH posee un potencial curativo mucho mayor dado que tiene un doble efecto beneficioso dependiendo del régimen de acondicionamiento y del llamado "efecto injerto contra leucemia" (EICL) mediado por las células T y NK procedentes del donante.

Sin embargo, ésta reacción se acompaña a su vez de un daño tisular concomitante conocido como "enfermedad injerto contra el huésped" (EICH) que puede ocasionar la muerte del paciente en no pocas ocasiones.

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El grado de compatibilidad del HLA será determinante en el éxito del TPH ya que un HLA idéntico minimiza en gran medida la aparición de la EICH. Con todo, menos de un 30% de los receptores potenciales de TPH disponen de un donante HLA idéntico; en ese caso, se inicia la búsqueda de un donante no emparentado entre los 11 millones de donantes que se encuentran en el registro internacional.

El avance que han experimentado las técnicas de tipaje de HLA desde los primeros métodos serológicos hasta las técnicas moleculares de hoy en día han permitido que pueda seleccionarse el donante no emparentado más compatible. Fuentes de progenitores. Uso actual en Europa.

En Méjico es uno de los países en Latinoamérica que se destaca por su avance en la investigación en el trasplante de médula Ósea, la una série de trabajos realizados en los últimos años son reportados en diferentes medios de comunicación y publicación científica, por ejemplo la revista Biomed en el año 2005 incia su recorrido presentando una reseña histórica del trasplante de Médula Ósea.

En el artículo se recoge información donde se muestra que el Dr. Ricardo Sosa y sus colaboradores en el año de 1980 hicieron su primera intervención Quirúrgica en trasplante de células Progenitoras Hematopoyéticas (TCPH), en el instituto Nacional de la Nutrición

Posteriormente se realizaron aislados en el Centro médico Nacional,en el hospital Universitario de Monterrey, años después se entra en una nueva etapa y apartir de 1995, se inican trabajos con células progentiroas Hematopoyetica de sangre perisferica a cambio de las de médula Ósea y cominezan una etapa de Alotransplantes. A continuación se presenta un informe de la revista elaborado por (Ruiz Arguellez, 2005) que dice :

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RESEÑA HISTORICA DEL TRASPLANTE DE MEDULA ÓSEA

El trasplante de células progenitoras hematopoyéticas (TCPH), se ha convertido en un recurso terapéutico imprescindible en la práctica moderna de la medicina. En México, la historia de los trasplantes de CPH puede dividirse en dos etapas.

La primera etapa se inicia en el año de 1980 cuando se llevó a cabo el primer TCPH en México, que hicieron el Dr. Ricardo Sosa y sus colaboradores, en el Instituto Nacional de la Nutrición en la ciudad de México. Después de este trasplante, se hicieron algunos otros aislados en el Centro Médico Nacional, en el Hospital Universitario de Monterrey, en el propio Instituto Nacional de la Nutrición y en otros sitios, con resultados pobres. Esto dio como resultado que en varias instituciones médicas del país se suspendieran de manera transitoria los programas de TCPH. En México la práctica de los TCPH fue casi anecdótica hasta antes de 1995.

La segunda etapa se inició a partir de 1995, con la llegada de algunos médicos entrenados en la práctica de los TCPH. Otra causa por la que se reactivaron los programas de TCPH, fue la evolución de los conocimientos en esta área: a) se comenzaron a usar CPH de sangre periférica en vez de médula ósea; b) se hicieron simplificaciones de los métodos para llevar a cabo los trasplantes, y c) se inició la práctica de los alotrasplantes con esquemas de acondicionamiento no mieloablativo.

Los trasplantes alogénicos no mieloablativos (TANM) han encontrado un terreno muy fértil para realizarse en países en desarrollo, entre ellos en México, ya que son considerablemente más baratos, más simples e igualmente eficientes.

En el año de 1999 se inició un programa de TANM en Monterrey y Puebla usando un esquema novedoso, accesible y barato, que emplea fludarabina, ciclofosfamida y busulfán. Este esquema “mexicano” ha mostrado ser útil para trasplantar a niños, adultos y sujetos añosos y ha producido resultados similares a los de los esquemas “tradicionales” de acondicionamiento pre-trasplante.

La accesibilidad y eficiencia de este método ha dado como resultado que varias instituciones del país, entre ellas el Centro Médico la Raza del IMSS y el Instituto Nacional

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de Cancerología, lo usen y que además, se haya adoptado como el método de referencia por el grupo LACOHG (Latin-American Cooperative Onco-Hematology Group).

Los trasplantes de células de cordón umbilical se han llevado a cabo en el Hospital Universitario de Monterrey, en el Centro de Hematología y Medicina Interna de Puebla, en el Hospital Ángeles de la ciudad de México y probablemente en otras instituciones.

Se han organizado bancos de células placentarias en el Centro Nacional de la Transfusión Sanguínea, el Hospital Universitario de Monterrey, la Unidad de Criopreservación de Puebla y otras instituciones privadas.

La práctica de los TCPH en México, iniciada en 1980, estuvo estancada durante un tiempo pero, para fortuna de los pacientes quienes requieren de estos tratamientos, ha tenido un crecimiento más rápido en los últimos años. En 2003, se informaron resultados de 1337 pacientes trasplantados en todo el país.

TRASPLANTE DE MEDULA OSEA

También en otra revista de Méjico Revista Muy, (Coperías 1991) hace un recuento de casos sobre trasplante de médula Ósea y menciona por ejemplo lo sucedido a un piloto de la Unión Sovietica después de la explosión de Chernobyl, al cual se le realiza un trasplante: “ Chernobyl, Union Sovietica, 26 de abril de 1986.

Tras la explosion de la planta nuclear, el piloto sovietico Anatoly Grischenko sobrevuela en su helicoptero el reactor principal en llamas. Los mandos califican a la operacion como de alto riesgo. Las sustancias radiactivas descargadas en la atmosfera han superado 90 veces a las de la bomba atomica de Hiroshima, Grischenko, para taponar las fisuras y grietas del reactor por las que estan saliendo verdaderos geiseres radiactivos, deja caer desde su aparato bolsas de cemento y arena humeda.

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Tras su odisea, el heroico piloto fue internado en el templo de los trasplantes de médula.

Nos referimos al Hospital Fred Kutchinson para Investigadones del Cáncer de Seattle, Estados Unidos, uno de los centros pioneros en el trasplante de médula ósea.

En marzo del año pasado el piloto recibió un trasplante de este tipo con el fin de frenar el cáncer de sangre, una leucemia que le sobrevino como consecuencia de las brutales radiaciones a las que estuvo expuesto durante la mision de salvamento. La operación fue un éxito y el piloto se sobrepuso, pero, lamentablemente, el 2 de julio de 1990, un infarto cardíaco acabo con su vida.

En febrero de 1988 el célebre tenor catalán José Carreras fue dado de alta tras haberle sido trasplantada su propia médula Ósea en el Hospital Fred Hutchinson, el mismo centro en el que fue atendido el piloto soviético. Los oncólogos de Seatle le habían diagnosticado una leucemia linfocítica aguda, un mal que se caracteriza por un crecimiento anormal de las defensas del organismo.

Las esperanzas de vida para Carreras eran mínimas. En estos momentos el cantante goza de una envidiable salud, e incluso ha vuelto a subir a los escenarios para deleitarnos con su maravillosa voz, como lo pudo comprobar el mundo entero a través de las transmisiones culturales vinculadas al Mundial de Fútbol del año pasado.

Hospital de Saint Louis, París, 7 de octubre de 1989. El pequeño Matthew Farrow está aislado de su familia en una habitación estéril de paredes de plástico para que no sea atacado por microbio alguno... Deberá permanecer en la burbuja hasta que su organismo se habitúe a la nueva médula que le han implantado. Matthew -hoy totalmente restablecido- padecía anemia de Fanconi, una rara enfermedad hereditaria que se manifiesta por una salvaje disminución del transporte de oxígeno en la sangre.

Hace tan sólo dos décadas la recuperación de Matthew o Carreras hubiera sido -de no haber ocurrido un milagrodel todo imposible.

Grichenko incluso pudo haberse salvado, pero las radiaciones habían destrozado, además de la médula, otros órganos vitales. El trasplante de médula ósea es, sin lugar a dudas, uno de los más espectaculares logros terapéuticos en la historia de la medicina.

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En la actualidad se llevan registrados más de 5.000 trasplantes de este órgano en todo el mundo, con los que se han recuperado la mitad de los pacientes. Verdaderamente asombroso. Pero, ¿qué es la médula ósea? ¿Para qué sirve?

En un adulto normal, la médula osea se encuentra en el interior de los huesos planos: costillas, vértebras, esternón, huesos del cráneo y de la pelvis... Alojada en una estructura de aspecto cavernoso -entre las trabéculas óseas-, la médula trabaja sin descanso en la fabricación de los diferentes tipos celulares que circulan en la sangre.

Se trata, sin duda alguna, del principal órgano hematopoyético, es decir, productor de células sanguíneas.

En la médula se fraguan los glóbulos rojos o hematíes, las células cargadas de cisternas de hemoglobina para el transporte del oxígeno a todos los rincones del cuerpo.

También se gestan en ellas las plaquetas o trombocitos -unas tiritas químicas encargadas de taponar las heridas y determinar la fluidez del líquido rojo- y los diferentes glóbulos blancos o leucocitos, que tienen el cometido de vigilar y evitar que nada ni nadie ose invadir el organismo. Privado de médula, incluso el más musculoso se convertiría un un ser raquítico, abandonado en una jungla de microbios y sustancias tóxicas... Una condena a muerte segura.

Las plaquetas, los glóbulos rojos y los blancos nacen, crecen y maduran al calor de la médula, a partir de unas células progenitoras.

Estas, las más primitivas, tienen la propiedad de ser totipotenciales, es decir, que son capaces -antes de diferenciarse irreversiblemente- de transformarse en cualquiera de los tres tipos de células anteriormente mencionadas.

Las progenitoras mas maduras, o madre, ya diferenciadas, son los llamados proeritroblastos, linfoblastos y megacarioblastos. De éstos nacerán los glóbulos rojos, blancos y plaquetas, respectivamente.

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Las células madre sirven de molde para hacer, en serie, miles de millones de copias de hematíes. Cuando las células han crecido lo suficiente, migran por el hueso hasta zambullirse en el torrente sanguíneo.

El interés por este órgano viscoso, y en concreto su trasplante, arranca poco después de que los norteamericanos lanzaran la primera bomba atómica sobre Hiroshima, para tratar de prevenir la muerte de los japoneses irradiados.

Los médicos estaban interesados en conocer a fondo los daños y secuelas que causaban las radiaciones: cáncer, Quemaduras, malformaciones congénitas... Y en reparar una de las consecuencias más terribles: la destrucción de la médula ósea.

En experimentos con animales sometidos a fuertes dosis radiactivas, los científicos observaron que éstos sobrevivían siempre que se les protegía el bazo -órgano que interviene en forma activa en la hematopoyesis y en la renovación sanguínea, destruyendo los hematíes caducos- con plomo, y si se les trasplantaban células sanguíneas procedentes de otros animales.

Por diversos motivos -una infección virósica, un tóxico, una radiación o una malformación congénita-, la médula puede resultar seriamente dañada, haciendo desaparecer o trastornando las células madre.

Cuando esto ocurre, los niveles de glóbulos rojos descienden peligrosamente, y aparecen los primeros síntomas de la anemia: cansancio, mareos, fatiga, vómitos, soplos sistólicos y acúfenos tales como las sensaciones de silbidos y zumbidos inexistentes... La población de linfocitos también puede desmoronarse, dejando al paciente desarmado ante el ataque de virus, hongos y bacterias. Y en último extremo, los trombocitos desaparecen de la sangre, aumentando el riesgo de hemorragias interminables.

También puede darse la situación inversa: que las células comiencen a dividirse alocadamente, sin orden ni concierto, y sean liberadas en la sangre aún inmaduras, sin las instrucciones necesarias para desempeñar su función.

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Son células cancerosas. El plasma se ve literalmente invadido por linfocitos inútiles, en cantidades que rebasan el millón por centímetro cúbico. En estos casos de histeria colectiva, los médicos hablan de cáncer de sangre o leucemia, término que significa sangre blanca, aunque se apresuran a aclarar que es incorrecto hablar de leucemia como si se tratara de una única enfermedad, ya que ésta se presenta en múltiples formas, que se corresponden con enfermedades muy distintas: leucemias agudas y crónicas; agudas linfoides y mieloides; crónicas linfoides y mieloides, etcétera.

En los niños, el 80 por ciento de las leucemias agudas, que por cierto son de origen desconocido son del tipo mieloide, mientras que en adultos, en la misma proporción, son linfoides. El tratamiento de este tipo de leucemias ha mejorado notablemente en los últimos veinte años. En el caso de las leucemias agudas infantiles, el 70 por ciento de los afectados pueden ser curados por quimioterapia.

Gracias a esta novedosa técnica, los oncólogos cuentan con un arma poderosa para luchar contra el cáncer. A través de una arteria, el quimioterapeuta introduce un fino catéter hasta las proximidades del tumor, para enviar auténticos misiles químicos teledirigidos que destruyen las células cancerosas en forma contundente. En otras ocasiones no queda otra salida que el trasplante de médula.

Doce años más tarde del primer holocausto nuclear, en 1957, se llevan a cabo los primeros trasplantes de médula ósea en humanos.

Tres científicos yugoslavos que trabajan en un reactor nuclear se exponen accidentalmente a una radiación letal suficiente como para derretir un ratón en pocos segundos. Los técnicos tuvieron que ser trasladados urgentemente a un hospital francés, para ser sometidos a un trasplante de médula ósea.

La intervención resultó un fracaso, pero el fracaso no supuso freno alguno para que los investigadores cejaran en su empeño.. Poco a poco, los éxitos comenzaron a cosecharse.

Hace veinte años, los trasplantes de médula estaban restringidos únicamente a pacientes con una leucemia crónica, anemia severa aplástica y cuadros de inmunodeficiencia severa combinada.

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Desde entonces, la técnica se ha ido perfeccionando, y ha encontrado multitud de aplicaciones para tratar otros males de la sangre. Hoy resulta eficaz para curar linfomas y enfermedades congénitas como la anemia de Fanconi, la agranulocitosis infantil, a muco polisacaridosis, la osteoporosis y la talasemia.

El trasplante no es más que una inyección de vida, y nunca mejor dicho. Una vez que el donante ha sido anestesiado, el cirujano, con una jeringa especial, aspira la médula ósea de las crestas ilíacas, es decir, del borde superior del hueso coxal o ilíaco; este hueso alargado y en forma de hélice constituye la parte anterior y lateral de la pelvis.

El extracto celular, pastoso y de color rojo, tras ser sometido a una serie de pruebas y análisis, se inyecta por vía intravenosa en el receptor.

Las células viajan por los vasos del paciente hasta que encuentran su nueva casa, se instalan en ella, forman colonias, proliferan y generan un nuevo tejido hematopoyético. Es necesario extraer hasta 200 millones de células sanguíneas por kilo de peso del receptor, lo que se traduce en unos 500 a 600 mililitros de médula.

En ocasiones lo que se trasplanta es la propia médula del enfermo, previamente congelada en nitrógeno líquido y tratada con radiaciones y productos químicos. Según los expertos, en el próximo quinquenio, este tipo de trasplante, llamado autológico, experimentará un espectacular aumento.

A primera vista el trasplante de médula parece sencillo, en realidad es bastante complicado. En primer lugar hay que tener en cuenta que el trasplante de médula ósea no es considerado como tal por muchos especialistas, ya que en realidad no se trata de un trasplante como puede ser el de corazón o el de riñón.

Se precisa un equipo de especialistas perfectamente compenetrado para llevarlo a buen fin. Hematólogos, inmunólogos, microbiólogos, radio y fisioterapeutas, anestesistas y enfermeras se integran como las piezas de un reloj de precisión, para que todo quede coordinado a la perfección.

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Los problemas que se presentan no son pocos. En primer lugar, la médula enferma del receptor debe ser destruida mediante radioterapia o quimioterapia. Además, no hay que olvidar que la nueva médula es sensiblemente diferente de la del enfermo, pudiendo aparecer el fantasma del rechazo.

Es en este punto donde radica el gran problema de los trasplantes -desde el de córnea hasta el de hígado o pulmón-corazón-, el abismo en el que caían una y otra vez los cirujanos pioneros.

Gracias al desarrollo de ía inmunologia, los biólogos han aprendido que las células de los órganos y tejidos llevan en su superficie una especie de carnés de identificación conocidos por los inmunólogos con el nombre de HLA (Human Leucocyte Antigens)-, que son reconocidos como algo propio por las células de reconocimiento que patrullan por la sangre, los linfocitos T.

Los científicos han aprendido a falsificar estos carnés, anularlos o eliminar a los policías moleculares, mediante inmunodepresores, como la ciclosporina o el zorivax.

El donante ideal es, por lo tanto, aquel que tenga su HLA idéntico al del receptor. Excepto en el caso de los hermanos gemelos monozogóticos que incluso se parecen a nivel molecular como dos gotas de agua-, no hay dos personas sobre la Tierra con los HLA calcados.

Para el trasplante de médula se recurre, en primera instancia, a los hermanos del enfermo, y en su defecto, a los familiares más próximos. La probabilidad de que los HLA entre hermanos coincidan es de una contra cuatro y, aunque no lo parezca, éste es un índice bastante alto.

Entre gente sin parentesco el distanciamiento crece. Se ha estimado que entre un grupo de 250.000 donantes, sólo el 59 por ciento tenía la suerte de que su médula fuera compatible con la de algún receptor.

Existen registros internacionales, a los que se puede recurrir para buscar un donante, como son la Cruz Roja Holandesa o el Antony Nolan Bone Marrow Appeal and Research

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Trust, de Gran Bretaña. Este último tiene registrados los historiales hematológicos de más de 170.000 donantes. Todas las donaciones son practicadas en forma altruista.

Pero a pesar de que el equipo médico tome todas las medidas de precaución sanitarias, y las médulas sean prácticamente indistinguibles, el éxito de la operación no está garantizado.

En tres o cuatro semanas los linfocitos T del antojadizo sistema inmunológico del receptor pueden reconocer como extraña la nueva médula y asediaría con legiones de anticuerpos. Inmediatamente después de recibir la médula, el paciente pasa a una habitación completamente esterilizada, una especie de burbuja de plástico donde permanecerá durante semanas, aislado por completo 'del exterior.

Son momentos muy delicados. Sólo los médicos y personal especializado tienen acceso a la habitación. Todo lo que traspase la barra de plástico debe ser previamente esterilizado.

El enfermo carece de defensas, su sistema inmunológico está deprimido, y cualquier microbio, hasta el más inofensivo en situaciones normales, puede instalarse en él y causarle un daño fatal.

Para evitar esto, hay que sostener al recién trasplantado con transfusiones de glóbulos, plaquetas y antibióticos.

"Contamos con diez años de experiencia en este tipo de trasplantes, y nuestros resultados están estabilizados desde 1980. Con la llegada de las habitaciones esterilizadas y las drogas inmunodepresoras podemos resolver con éxito el 50 por ciento de los casos", comenta la doctora Eliane Gluckman, dijectora del Programa de Trasplante de Médula Osea del Hospital Saint Louis, centro que recientemente celebró el trasplante 500. Gluckman está convencida de que todos los enfermos podrían sanar.

Para lograrlo, el primer paso es controlar el rechazo por parte de los linfocitos T del receptor. En este sentido la biotecnología está diseñando las armas para combatirlos. Por una parte están los anticuerpos monoclonales, diseñados para maniatar a los linfocitos molestos, y por otra, las investigaciones que se están llevando a cabo con los factores de crecimiento, para estimular la formación de células sanguíneas.

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En los últimos quince años, el avance en el tratamiento de la leucemia infantil ha sido espectacular, pasando del 30 al 80 por ciento el número de curaciones. Estos datos permiten afirmar que el futuro es, sin lugar a dudas, prometedor.

Cuba es otros de los países de Latino América que se destaca por su avance en el campo del transplante de Médula Ósea, en la revista Cubana de Hemtología, Inmunología y Hemoterapia ISSN 0864-0289 , en diciembre de 2008, (Jimenez R. 2008), muestra una compilación de información sobre casos específicos donde su resumen dice ; “Se brinda una breve información acerca de los temas que sirvieron de guía para la compilación de la bibliografía de trabajos en hematología, inmunología, medicina transfusional y medicina regenerativa, vinculada con temas de interés en situaciones de desastre y su evolución a través del tiempo.

Se presenta un inventario bibliográfico de 109 artículos, que registra trabajos de autores de todo el país, pero en su mayoría investigadores del Instituto de Hematología e Inmunología, publicados desde 1985 hasta 2006 en la Revista Cubana de Hematología, Inmunología y Medicina Transfusional, y en otras revistas científicas, e incluye los asuntos abordados por ellos en ese período.

Esta compilación permite demostrar los aportes que durante más de 20 años de trabajo investigativo han realizado un grupo de hematólogos, hemoterapeutas, inmunólogos y otros especialistas y técnicos, en los temas vinculados con los desastres”.

Instituto

de

Hematología

e

Inmunología

Trasplante

de

células

progenitoras

hematopoyéticas: tipos, fuentes e indicaciones, en esta revista se presentan casos recientes de los trabajos realizados en ese país, se puede mencionar uno de ellos que publicado por (JAIME, J., DORTICÓS E. Y OTROS 2008) “Trasplante de células progenitoras hematopoyéticas: tipos, fuentes e indicaciones”.

Donde se presenta el siguiente artículo: “El trasplante de células progenitoras hematopoyéticas (TCPH), consiste en la infusión de precursores hematopoyéticos a un

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receptor que ha sido previamente acondicionado para recibir el injerto y constituye una terapéutica útil,

En ocasiones única, para una gran variedad de enfermedades hematológicas

y no

hematológicas, Tras las primeras experiencias con el trasplante de médula ósea (TMO) realizado por E. Donnall Thomas en la década de los 50, comenzó su expansión mundial en la década de los 70,1 para experimentar un espectacular desarrollo en los años 80 y 90. En el año 2000 se realizaron cerca de 30 000 trasplantes en el mundo, de ellos el 70 % fueron autólogos y el 30 % alogénicos.

La sangre periférica (SP) fue la fuente de progenitores hematopoyéticos en el 90 % de los trasplantes autólogos,

Después que se identificó a la aplasia medular producida por irradiación como una causa importante de muerte en la población japonesa expuesta a los efectos radiactivos de las explosiones de las bombas atómicas, se aceleraron las investigaciones en animales relacionadas con la cantidad de irradiación corporal que era necesaria para provocar aplasia medular, y se establecieron las bases para una aplicación clínica más racional del TMO.

Investigación permanente

En Colombia el Hospital Universitario San Vicente de Paúl se destaca por prestar sus servicios internacionalmente, ha proyectado sus servicios a varios países de Latinoamérica y a Israel. La cirugía plástica y los transplantes son los servicios de mayor demanda posicionando la medicina antioqueña como una de las mejores en el ámbito latinoamericano.

Uno de los pilares fundamentales del Hospital San Vicente de Paúl es la investigación y, en él área renal y de transplantes, la experimentación y la búsqueda creativa de soluciones a los problemas de salud de los pacientes ha sido una labor contínua que sigue brindando excelentes resultados para el Hospital, la sociedad y el avance científico.

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A partir de 1964 se iniciaron en el Hospital los tratamientos de hemodiálisis con riñones artificiales aunque la Unidad Renal funciona en el Hospital desde 1966, cuando en un sótano del pensionado se empezó a experimentar en esta área.

Con la ayuda de la industria se diseñó el primer riñón artificial bautizado GRACEC, en honor

a

las

dos

primeras

pacientes

dializadas

con

él.

En 1998, cuando el Hospital celebraba sus 85 años, avanzaba la construcción del Centro Internacional de Diálisis y Transplantes, mediante un convenio con la empresa alemana Fresenius Medical Care y se construyó el más moderno edificio de América Latina dotado de alta tecnología para la atención del paciente renal sometido a tratamiento de diálisis y transplante.

El Grupo de Transplantes, que se convertiría en un hito del Hospital desde el punto de vista científico y empresarial, se creó en 1968. Este equipo hizo posible el primer trasplante de médula ósea en América Latina; el primer trasplante de riñón y páncreas simultáneo, el primer trasplante de hígado y el primer trasplante exitoso de pulmón.

Conjuntamente con el equipo científico de la Clínica Cardiovascular Santamaría, el primer trasplante de corazón en Colombia.

A la fecha se han realizado más de 2.000 transplantes renales, varios de hígado, páncreas y algunos mixtos (riñón-corazón, riñón-hígado, riñón-páncreas), Además se han realizado 57 trasplantes de médula ósea, córnea y hueso.

Los reimplantes de mano, por su parte, desarrollaron la Cirugía Plástica en el medio como respuesta a la alta incidencia de amputaciones en la región; el Hospital es un centro de referencia a nivel nacional e internacional en este campo pues se han realizado más de 400 casos exitosos. Así, el Hospital tiene uno de los equipos de trasplantes más eficientes del mundo y posee la mayor estadística de reimplantes de mano, y el más alto número de suturas de heridas de corazón con supervivencia.

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Hace más de 30 años, con el soporte académico e investigativo de la Universidad de Antioquia, se inició en el Hospital Universitario San Vicente de Paúl el programa de trasplantes.

También La Clínica de MARLY, en Bogotá, se considera el programa líder en Colombia, con más de 10 años de labor continua en sus dos modalidades (Autólogo y Alógenico) en adultos y niños.

Cuenta con habitaciones de aislamiento, laboratorio de criopreservación de médula ósea y células progenitoras, tecnología de aféresis y todo el soporte de las demás áreas de la clínica, Un equipo humano altamente especializado ofrece atención permanente tanto a los pacientes nacionales como extranjeros, los cuales se benefician de este servicio.

TRASPLANTE DE CÉLULAS PROGENITORAS HEMATOPOYÉTICAS OBTENIDAS DE SANGRE DE CORDÓN UMBILICAL.

La Unidad de Trasplante de Médula Ósea inició su funcionamiento hace 15 años.

Desde entonces se han realizado más de 500 trasplantes, en sus dos modalidades: Autólogo y Alógenico.

La Unidad cuenta hoy en día con tecnología de punta para el aislamiento de pacientes de alto

riesgo

infeccioso,

congelación

y

descongelación

de

células

progenitoras

hematopoyéticas y un recurso humano altamente especializado, que le permite ofrecer a los pacientes con indicación de trasplante Alógenico sin donantes compatibles dentro su familia una opción de tratamiento curativo:

El trasplante de células progenitoras hematopoyéticas obtenidas a partir de sangre de cordón umbilical. La sangre que se obtiene al canalizar la porción placentaria de la vena umbilical después del nacimiento de un recién nacido, es rica en progenitores hematopoyéticos.

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Estos pueden ser criopreservados y almacenados por tiempo prolongado en tanques de nitrógeno líquido, para después ser utilizados con el fin de restituir la hematopoyesis normal en un paciente sometido a altas dosis de quimioterapia.

Así la sangre de cordón umbilical se convierte en una fuente inagotable de progenitores hematopoyéticos. A través de registros internacionales de fácil acceso en internet, se pueden realizar búsquedas para encontrar unidades de sangre de cordón umbilical inmunológicamente compatibles con un paciente sin donante intrafamiliar, que después de ser descongeladas, son transfundidas a un paciente previamente preparado con una quimioterapia altamente mieloablativa.

Desde el primer trasplante de este tipo realizado en Francia en 1972, se han criopreservado alrededor de 250.000 unidades de sangre de cordón umbilical y se han realizado más de 8000 trasplantes en adultos y niños en todo el mundo.

En la Unidad de Trasplante de Médula Ósea se implementó desde finales del año 2007, el programa de trasplante de sangre de cordón umbilical (TSCU) y se realizó el primer trasplante exitoso en esta modalidad. Así la Clínica de Marly se convierte de nuevo en pionera, siendo está la única Unidad de Trasplante que ofrece TSCU en la ciudad.

Este tratamiento novedoso y de alta complejidad, abre una puerta, y se convierte en una luz de esperanza, para un gran porcentaje de pacientes con indicación para trasplante Alógenico, que no tienen un donante intrafamiliar compatible, quienes hasta ahora no tenían una opción de tratamiento efectivo.

PROTOCOLO

(Escarrio A. 2011) en su tesis Doctoral de la sobre Medicina regenerativa: células madre como nueva terapia biológica aplicada en el transporte osteocondral. España: Universidad Complutense de Madrid, Presenta el siguiente protocolo:

Materiales Agujas insulina 0,33 x 8 mm Becton Dickinson Cuchillas desechables de microtomo marca Feather, modelo R 35 Esponja de colágeno, Espongostan Frascos de cultivo Roux de 25 y 75 cm Hemocitómetro de Neubauer Instrumental microcirugía.

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quirúrgico 2 convencional de poliestireno Cultex e instrumental quirúrgico Membranas estériles de 0.22 μ de nitrato de celulosa de Millipore.

Específico de Placas de cultivo celular de 6 y 24 pocillos BD Falcon Multiwell Plate polystyrene Becton Dickinson.

Placas radiográficas, marca Kodak X.OMAT MA film (18 x 22 cm) Programa de medición de imágenes, ImageJ 1.37v National Institutes of health, USA Programa de tratamiento de textos y hoja de calculo NeoOffice 2.1 Patch 7, OpenOffice org. para Mac OS X Programa montaje de imágenes Quark X Press 4.2 Programa para captura de imágenes DC Viewer. para tratamiento estadístico, Programa tratamiento de imágenes Adobe Photoshop CS 8.0

Medios de cultivo DMEM básico: Dulbecco's Modified Eagle Media, bajo en glucosa (1000 mg/l) (Invitrogen Ref 21885-108), sin suero, suplementado con Glutamina 4 mM, Hepes 15 mM, Acido ascórbico 15μg/ml, solución de penicilina 100 UI+estreptomicina 100 μg.

Este medio se ha utilizado para el cultivo “in vitro” de la placa de crecimiento Medio de cultivo de MSC: medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (GIBCO BRL, Gaithersburg, E.E.U.U.), 2mM de glutamina, 400 μM de aminoácidos no esenciales, 0,01% de estreptomicina, 0,06% de penicilina G y 50 μg/ml de gentamicina. 10 g/l de glucosa, más suero seleccionado para estas células.

Medio de cultivo de condrocitos: medio DMEN al cual se le añaden por cada 100 ml :2ml de glutamina 50X, 2ml de Hepes 0.75 M, 0.2ml de kanamicina, 0.5ml de nistatina, 1ml de penicilina/estreptomicina, 10 ml de suero fetal bovino, 1500 mg de ácido ascórbico.

DMEM-Ins: DMEM básico enriquecido con insulina: Se ha utilizado medio DMEM básico suplementado con: Glutamina 4 mM, Ácido ascórbico 15μg/ml, solución de penicilina 100 UI+estreptomicina 100 μg. piruvato, 400 μM de aminoácidos no esenciales, y 1% de ITS (mezcla de insulina+transferrina+selenio) DMEM-Ins-TGF Tiene la misma composición del medio anterior al que añadido como suplemento 10 ng/mL de TGF1 y 200 μg/ml dexametasona se le ha 4.1.5 Soluciones y reactivos Ácido ascórbico: Ácido periódico

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extemporánea.

Sigma preparado a una concentración 15 mg /ml de agua destilada. al 0,5 %: Ácido periódico 1 g. Agua 200 ml.

Anti-BrdU/nucleasa mezcla: bromodeoxyuridine antibody 130 μl ( biosciences UK Ltd, Ref RPN202) Anti-5-2'-deoxyuridine de origen concentrado en Tris-Buffersalino conteniendo 0,8 % de Seroalbumina Nucleas en Tris-Buffersalino conteniendo 1 % de Seroalbumina bovina.

Solución anti-digoxigenin anticuerpo, conjugado a fosfatasa alcalina, (1:500) Amersham murino, bovina.

Azul Alcian: Azul alcian 2,5 g. Acido acético al 3 % Bisulfito sódico al 2 %: Bisulfito sódico 5 g.

250 ml. pH: 2,5 Biotina-streptavidina : Biotin-streptavidin detection reagents. (Amersham Biosciences ) Agua destilada 250 ml Bromo-deoxiuririna (BrdU): 5-bromo-2deoxyuridine, Sigma.

Buffer formalina al 7%: Fosfato sódico (PO 4 H 2 Na.2H 2 O) 4,55g; Fosfato disódico (PO 4 HNa 2 ) 6,5 g; Formol comercial (40%) 70 ml; agua destilada 930 ml Colagenasa: colagenasa al 0.2% en GBSS. Colagenasa tipo V, 100 mg, Sigma.

Dexametasona: Sigma. (Peso molecular:392.5). obteniendo una concentración de DEX de 5.10 -2 M. Añadir 5 ml de agua bidestilada Diaminobencidina: 3,3'-Diaminobenzidine (3,3', 4,4'-tetraaminobiphenil) (DAB), 100 mg, SIGMA.

Salmon Sperm DNA Sonicated (Abnova Ref DNA de esperma de salmón sonicado: R0014), disuelto en agua desionizada, con unos fragmentos de 300-700 pares de bases.

Conc. 10 mg/ml. Conservar a -20ºC, hervir 3 min y enfriar en baño de hielo antes de usar.

Eosina alcohólica: Eosina 1 g; Etanol de 96º 100 ml; una gota de ácido acético glacial por cada 100 ml de disolución.

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GBSS. Gey´s g/l; KCl 0.37 Na 2 HPO 4 .12 H 2 Balanced Salt Solution: Usado en cultivos de condrocitos. NaCl 7,0 g/l; CaCl 2 0,17 g/l; MgCl 2 .6 H 2 O 0,21 g/l; MgSO 4 .7H 2 O 0,07 g/l; O 0,30 g/l; KH 2 PO 4 0,03 g/l; NaHCO 3 2,27 g/l; Glucosa 1,0 g/l Gentamicina: solución de Sigma (Ref. G-1397) diluida en agua calidad inyectable hasta una concentración de 50 mg/ml. se añade extemporáneamente al medio de cultivo en la proporción de 0,1 ml /100 ml de medio.

Glutamina: Sigma preparado a una concentración 200 mM (12,92 g de Glutamina en 100 ml de agua destilada), se añade al medio en la proporción de 1 ml/100 ml de medio, concentración final de glutamina en el medio de 2 mM Hematoxilina de Carazzi: Yodato potásico 0.1 g; Hematoxilina 0,5 g; Sulfato de aluminio y potasio (alumbre potásico) 20 g; Glicerina 100 ml; Agua destilada 400 ml. Se deja madurar mínimo un mes en frasco destapado Filtrar antes de su utilización.

Hepes: Sigma (Ref. H-9136) a una concentración 0,75M (17,87 g /100 ml de agua), se añade al medio en la proporción de 2 ml /100 ml de medio, concentración final de Hepes en el medio de 15 mM Inmunoglobulina biotinilada anti-conejo como segundo anticuerpo (ZYMMED), Insulina-transferrina-selenio (ITS), GIBCO™ Insulin-Transferrin-Selenium-G Supplement (100X) from Invitrogen 1.0 mg/ml insuline pancreatica bovina, 0.55 mg/ml de transferrina humana, 0.5 μg/ml selenito sodico, 50 mg/ml seroalbumina bovina y 470 μg/ml de acido linoleico.

Kanamicina: Kanamycin sulfate (Fluka 60615) Nistatina: suspensión de Sigma (Ref. N1638) con una concentración de 10.000 UI/ml, diluida en PBS hasta una concentración final de 50 UI/ml. se añade extemporáneamente al medio de cultivo en la proporción de 0,5 ml / 100 ml de medio.

Penicilina-estreptomicina: concentrado de penicilina-estreptomicina de Sigma (Ref.

P-0781) concentración de 100.000 UI de penicilina + 10 mg de estreptomicina. se diluye en agua hasta una concentración final de 100 UI de penicilina +100 μg de estreptomicina / ml. se añade extemporáneamente al medio de cultivo en la proporción de 1 ml / 100 ml de medio.

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SCC Buffer solution 20x pH 7,0: Citrato sódico dihidratado 100,0 g/l: ClNa 175,2 g/l Solución anestésica: Ketolar (Ketamina) 50 mg / ml, de Parke Davis Cod 776211; Rompun (xilacina) sol inyectable al 2 % 10 ml de Bayer cod. 596790; Atropina de Braum 1 mg (10x1) Cod. 896829. La mezcla anestésica contiene: Ketamina 3,2 ml; Xilacina 1 ml; Atropina 0,1 ml ; Sol. Salina 4,3 ml. La solución se ha utilizado mediante inyección i.p. a la dosis de 0,1 ml/ 25 g. de peso rata.

Suero fetal bovino(GIBCO BRL, Gaithersburg, E.E.U.U.)

Métodos Animales : anestesia, tratamiento, eutanasia, Anestesia de los animales Los animales han sido anestesiados mediante inyección intraperitoneal de solución anestésica, compuesta por ketamina, 10mg/kg; xylazine, 30 mg/kg; atropina, 0.05 mg/kg. diluida en cantidad suficiente de solución salina, para obtener un volumen de inyección de 0,1 ml / 25 g. de peso, Administración de BrdU A todos los animales sometidos a ensayo se les ha administrado BrdU (5-bromo2deoxyuridine). Dosis de 50 mg/kg en solución salina isotónica estéril, vía intraperitoneal, dos horas previas a la eutanasia.

Administración de células MSCs A todos los animales que recibieron tratamiento coadyuvante con terapia celular se les inóculo por vía intravenosa en la vena lateral de la cola 500.000 células rMSCs de rata macho suspendidas en solución de PBS en un volumen de 0,5 ml.

Las células mesenquimales procedentes de la rata fueron suministradas por JP García Ruiz, Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Facultad de Ciencias, Univ. Autónoma de Madrid. 41

Eutanasia de los animales Los animales fueron sacrificados en los distintos periodos de tiempo establecidos para cada gupo con CO 2 , empleando procedimientos humanitarios de acuerdo a la Directiva (86/609/CEE) y al RD 223/1988.

Los animales empleados en la obtención de células o extracción de la crecimiento para su utilización en los cultivos fueron sacrificados por decapitación. placa de Las extremidades anteriores se seccionaron, se separaron los músculos y tendones para dejar el hueso

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limpio y se introdujeron en buffer formalina para su posterior estudio radiológico e histológico.

Ambas extremidades superiores se radiografiaron a los 2-3 días de realizada la autopsia, antes de proceder a su descalcificación.

La tratamiento de ATHISA eliminación de restos biológicos se realizó cumpliendo Residuos Biosanitarios del gupo III, a través la de la empresa reglamentación de ECOCLINIC

Método de extracción de células y cultivos

Extracción de células MSCs Para la extracción de las células mesenquimales del tejido hematopoyético, MSCs, se usaron ratas Sprague Dawley macho de 15 a 21 días de edad.

Tras la eutanasia, se extrajeron bajo condiciones de esterilidad, en cabina de flujo laminar con mechero de gas incluido, y condiciones de asepsia en todo el material usado, los huesos tubulares tales como el fémur y la tibia.

Los huesos se liberaron de las inserciones tendino-musculares y del periostio mediante raspado con hoja de bisturí (nº 11). A continuación se practicó osteotomía del hueso y a continuación extracción del tejido de médula ósea.

El tejido medular se colocó en una placa Petri con medio de cultivo. En días sucesivos se extrae el medio y las células muertas flotantes. En el fondo, adheridas a la placa van surgiendo colonias celulares que según su tipología se definen como colonias de células MSC.

Las Cultivo de células mesenquimales células fueron cultivadas en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)

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Suplementado con 10% de suero fetal bovino (Sigma), 2mM de glutamina, 400 μM de aminoácidos no esenciales, 0,01% de estreptomicina, 0,06% de penicilina G y 50 μg/ml de gentamicina. 1 g de glucosa por litro, más suero seleccionado para estas células. Los cultivos primarios fueron mantenidos a 37ºC, 7% de CO2 y 97% de humedad relativa, con cambios de medio cada 2 ó 3 días, seleccionando los clones adherentes al plástico.

Durante el crecimiento de las células el medio fue reemplazado dos veces por semana, una vez conseguida la expansión las células fueron despegadas con solución de EDTAtripsina, resuspendidas en DMEM básico y congeladas en nitrógeno liquido con un 10 % de DMSO para posteriores estudios.

Diferenciación condrogénica de células MSC La inducción a la diferenciación se realizó mediante cultivo de más de 200.000 células en 0,5 ml, en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con, 2mM de glutamina, 400 μM de aminoácidos no esenciales, 0,01% de estreptomicina, 0,06% de penicilina G y 50 μg/ml de gentamicina, 625 μg/mL of insulina, 625 μg/ml de transferrina, 625 ng/ml of selenito sódico, 125 mg/ml of albumina de suero , 50 μM acido ascórbico, 100 nM dexametasona y 10 ng/ml de TGF.

Durante la expansión de las células (15-20 días) el medio fue reemplazado tres veces por semana, una vez conseguida la expansión las células fueron despegadas con solución de EDTA-tripsina, se resuspendieron en PBS con suero para inactivar la tripsina centrifugando 5 minutos a 600g, se resuspendieron en PBS dos veces mas centrifugando de igual forma.

Las células fueron contadas en hemocitómetro con azul tripán (dilución 1:50) y ajustadas a una concentración final de 1 x 10 6 células /ml 4.2.2.4 Extracción de condrocitos Extracción de la zona germinativa: Los condrocitos fueron extraídos de la zona germinativa y lavados con GBSS. Decantar el GBSS y añadir 0.25 ml de hialuronidasa al 0,5% en GBSS, digerir 5 min. a temperatura ambiente.

Decantar la hialuronidasa y añadir 0.5 ml de solución fresca de hialuronidasa al 0.5% y digerir durante 10 min. Decantar la solución y lavar dos veces con 0.5ml de GBSS. Lavar con 0.25 ml de tripsina al 0.2% en GBSS. Incubar el tejido con 0.5ml de tripsina al 0.2% a 37ºC durante 30 min con agitación.

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Decantar la tripsina y lavar en GBSS a temperatura ambiente. Lavar los fragmentos durante 5 min con 0.25 ml de colagenasa al 0.2% en GBSS. Decantar la colagenasa de lavado. Incubar el tejido con colagenasa al 0.2% durante 30 min a 37ºC. Quitar el sobrenadante. añadir de nuevo colagenasa al 0.2% e incubar a 37ºC durante 90 min..

Centrifugar a 600 g durante 8 min, quitar el sobrenadante.

Resuspender las células en PBS y centrifugar a 180 g, 1 min para que sedimenten las partículas no digeridas. Pasar el sobrenadante a otro tubo y centrifugar a 600 g, 10 min para que sedimenten las células. Resuspender las células en PBS.

Cultivo de condrocitos Cuando fue necesario los condrocitos fueron mantenidos en cultivo en medio DMEM.

A 100 de DMEN se añade 2ml de glutamina 50X, 2ml de Hepes 0.75 M, 0.2ml de kanamicina, 0.5ml de nistatina , 1ml de penicilina/estreptomicina, 10 ml de suero de ternera fetal, 1ml de ácido ascórbico (150 mg cada 10 ml). Se resuspenden las células en 1ml y se colocan en los pocillo en la cámara de cultivo.

Métodos de estudio histológico

Procesamiento descalcificación e inclusión en parafina Las piezas tras la extracción se fijaron en buffer formalina al 7%, durante 3 días, a continuación fueron introducidas en solución de ácido fórmico al 7 % durante 5-10 días, verificando su correcta descalcificación. Las piezas se tallaron, se lavaron en agua desionizada y se deshidrataron en etanol de concentraciones crecientes, 70º, 96º, 100º, terminando en acetato de butilo.

La inclusión en parafina se realizó en estufa de cultivo a 60 ºC, en 3 pasos durante un tiempo total de 2 horas. Los bloques fueron montados orientando cada pieza según la sección tallada, realizando a continuación cortes histológicos de 5-7 μm

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Tinción de hematoxilina eosina Es la tinción más básica y utilizada para ver las estructuras celulares. La hematoxilina es un colorante del núcleo celular, que lo tiñe de azul intenso. La contra tinción se realizo con eosina, un colorante débilmente ácido que colorea el citoplasma, el tejido conjuntivo y las fibras de colágeno de rojo intenso. (Fig 4.2.1) Imagen

Placa de crecimiento 4x tinción HE (Hematoxilina eosina) Imagen 4.2.2. Placa de crecimiento 4x tinción AA (azul-Alcian)

Cultivo de placa de crecimiento “in vitro” Cultivos simples Se utilizaron ratas SpragueDawley de 8 días con un peso de 12-14 g.

Tras la eutanasia se les extrajo la tibia y mediante el empleo de lupa estereoscópica con transiluminación se extrajo la placa.

La placa se seccionó primero en sentido longitudinal. Se cortaron 2 casquetes polares y 3 secciones centrales C-1, C-2 y C-3 (Fig 4.2.3) A continuación, cada sección central se dividió en dos partes germinativo y proliferativo, eliminando una pequeña lamina entre ambas zonas como zona indefinida para asegurarnos que en cada sección cultivada tenemos solo germinativo en un caso y proliferativo en el otro. (Fig 4.2.4) Imagen Esquema de los cortes realizados Imagen

Esquema de separación de las secciones

En todos los casos se realizaron medidas con microscopio, objetivo de 20x, y ocular milimetrado de todas las piezas diseccionadas antes del cultivo, a la vez que se verificaba microscópicamente su correcta separación en germinativo y proliferativo e hipertrófico.

Previo al cultivo, dado que las piezas no presentaban una forma rectangular exacta, se realizaron entre 5-7 medidas para valorar el alto de la pieza y entre 2-3 medidas para la valoración de largo. Los resultados tabulados para cada caso corresponden a los promedios de estas medidas.

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Para evitar la desecación del tejido durante la observación microscópica, las piezas se depositaron en un porta excavado, manteniendo en todo momento la humedad del tejido con PBS.

Se practicaron dos formas distintas de cultivo: cultivo simple de cada zona de la placa de crecimiento separadas. co-cultivos de ambas zonas germinativa y proliferativa.

Imagen

Secciones de germinativo y proliferativo 4x TI Imagen 4.2.6. Secciones de germinativo y proliferativo 10x TI Los tejidos de cultivo se manejaron en cabina de flujo laminar. Las piezas fueron colocadas en una placa Nuclon de 24 pocillos.

Se colocaron en unos pocillos germinativo solo, en otros pocillos proliferativo solo y en otros se colocaron en el mismo pocillo ambas piezas separadas como se ha descrito.

Todas las piezas fueron cubiertas con 1 ml de medio de cultivo. Como medio de cultivo se utilizo DMEM-INS y DMEM-INS-TGF, se emplearon ambos medios en todos los casos para valorar el crecimiento de las piezas con uno u otro.

Las piezas permanecieron en un incubador con un 5 % de CO 2 durante 3 días , transcurridos los cuales se valoraron por transiluminación directa (TI) mediante microscopia óptica, se volvieron a medir y posteriormente fueron incluidas en parafina para su estudio histológico mediante tinciones.

Los parámetros a valorar han sido la histometría de la pieza de cultivo, la arquitectura tisular, y los fenotipos tisulares de los cultivos.

sirven como un antígeno marcador para una inmunoselección positiva de la células troncales hematopoyéticas, este marcador se pierde en los cultivos in vitro. El marcador más persistente para las células hematopoyéticas es CD50 (Waller et al 1995).

El aislamiento y enriquecimiento de la población MSCs se ha facilitado por el anticuerpo monoclonal Stro-1 (Simmons et al 1994). Los marcadores más recomendados son Stro-1, CD73 y CD106 o VCAM-1 (Kolf et al 2007).

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En nuestro laboratorio hemos observado que las células hMSCs aisladas de la médula ósea humana son o llegan a ser células progenitoras en cultivos. En ausencia de FBS y en presencia de insulina o prolactina, las células muestran organización citoesquelética y un lugar de transcripción AP-1 que recuerda los condrocitos, mientras que las células en presencia de dexametasona y con adicción de prolactina o TGFrecuerdan a los osteoblastos diferenciados (Romero-Prado et al 2006).

Autorenovación, mantenimiento y numero de las MSCs El proceso de autorenovación se refiere a la ruta biológica y mecanismos que preservan las células troncales indiferenciadas. Todo el aparato genómico ha sido usado para identificar las posibles moléculas que mantienen el estado de la células troncales, incluyendo las MSCs (Ito et al 2001).

Entre los factores que se han definido como posibles se encuentran: LIF, EGF, HGF, PDGF, CFU-F (Kolf et al 2007). En la autorenovación de las MSCs participa Wnt y esta a su vez depende del entorno tanto para renovarse como para diferenciarse (Kleber et al 2004) El proceso de envejecimiento ocurre por una serie de cambios regulados por la información genética del organismo.

Los cambios fenotípicos producidos en una célula progenitora en una secuencia de transición del desarrollo dependiente del tiempo define su línea celular. Una vez que la célula muere, es reemplazada por una segunda célula.

De esta forma todos los animales permanecen en su estado vital y constantemente rejuvenecen sus tejidos. Esta secuencia de recambio requiere, en el adulto, la existencia de células progenitoras con posibilidad de madurar en varios fenotipos celulares. Esta célula progenitora se denomina célula troncal del adulto con la función de renovar las células que normalmente mueren.

Estos cambios a través de la edad es lo que se denomina envejecimiento. Por ejemplo, en el adulto las MSCs son responsables de de la sustitución de los osteoblastos que tienen una vida media de 8-10 días en el humano (Caplan 2007).

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En qué medida la desregulación génica que aparece en las células envejecidas es causa o efecto del envejecimiento se desconoce (Dykstra et al 2008) Número de MSCs. Se ha observado que el número y el potencial proliferativo de las rMSCs declinan con la edad en las ratas y esto se manifiesta por la menor capacidad en

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CAPÍTULO III

LEGISLACIÓN

Un marco jurídico es todo el conjunto de normas que organiza y ordena a un estado; no solo tiene que ver con las leyes sino con el cumplimiento de las normas regidas por ella.

La República de Colombia en su Resolución Nº 008430 DEL 4 DE OCTUBRE DE 1993.

Articulo 63 habla acerca de la importancia de contar con un equipo de laboratorio que se rija bajo las normas técnicas emitidas por el Ministerio, que garanticen el manejo seguro de gérmenes en toda institución investigadora.

En su artículo 72 destaca la importancia de contar con El Comité de Ética en toda institución investigadora con el fin de garantizar el cumplimiento de estas normas evitando así la exposición a riesgos infecciosos no controlados tanto al personal que trabaja en el laboratorio como a la comunidad y el medio ambiente.

A continuación se presenta la resolución emitida por el Ministerio de Salud que habla acerca de la Bioseguridad de las investigaciones.

http://www.unal.edu.co/viceinvestigacion/normatividad/etica_res_8430_1993.pdf, consultado el 26 de agosto de 2010

REPUBLICA DE COLOMBIA MINISTERIO DE SALUD “RESOLUCION Nº 008430 DEL 4 DE OCTUBRE DE 19938

TITULO IV DE LA BIOSEGURIDAD DE LAS INVESTIGACIONES CAPITULO I DE LA INVESTIGACION CON MICROORGANISMOS PATOGENOS O MATERIAL BIOLOGICO QUE PUEDA CONTENERLOS

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http://www.unal.edu.co/viceinvestigacion/normatividad/etica_res_8430_1993.pdf, consultado el 26 de agosto de 2010

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ARTICULO 63. Las instituciones investigadoras en las que se realice investigación con microorganismos patógenos o material biológico que pueda contenerlos deberá: a. Contar con las instalaciones y equipo de laboratorio de acuerdo con las normas técnicas, que al efecto emita este Ministerio, que garanticen el manejo seguro de tales gérmenes b. Elaborar un manual de procedimientos para los laboratorios de microbiología y ponerlo a disposición del personal profesional, técnico, de servicios y de mantenimiento. c. Adiestrar al personal sobre la manipulación, transporte, utilización, descontaminación y eliminación de desechos. d. Determinar la necesidad de vigilancia médica del personal que participa en las investigaciones y en su caso, implementarla. e. Establecer un programa de supervisión y seguimiento de seguridad en los laboratorios de microbiología. f. Disponer de bibliografía actualizada y un archivo sobre la seguridad de los equipos, la disponibilidad de sistemas de contención, normas y reglamentos, riesgos involucrados y otros aspectos relacionados. g. Cumplir con las demás disposiciones que determine este Ministerio.

ARTICULO 64. En las instituciones de investigación mencionadas en el artículo anterior, los laboratorios de microbiología cumplirán con los requisitos que señalen las normas técnicas que dicte este Ministerio y se clasificarán en tres tipos así:

a. Laboratorio básico de microbiología. b. Laboratorio de seguridad microbiológica. c. Laboratorio de máxima seguridad microbiológica.

ARTICULO 65. El manual de procedimientos al que se refiere el literal b del artículo 63 de ésta reglamentación, describirá los siguientes aspectos:

a. Prácticas de laboratorio. b. Seguridad personal de los empleados. c. Manejo y mantenimiento de las instalaciones y equipos. d. Situaciones de urgencia.

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e. Restricciones de entrada y tránsito. f. Recepción y transporte de materiales biológicos. g. Disposición de desechos. h. Descontaminación. i. Las demás que se consideren necesarias para lograr la seguridad microbiológica.

ARTICULO 66. El investigador principal de acuerdo con el Comité de Ética Hospitalaria, o el Comité de Ética en Investigación, y el representante legal de la institución investigadora, determinarán conforme a las normas técnicas existentes, el tipo de laboratorio en el que se realizarán las investigaciones propuestas; así como los procedimientos respectivos tomando en cuenta el grado de riesgo de infección que presenten los microorganismos a utilizar.

ARTICULO 67. Para evaluar el grado de riesgo a que se refiere el artículo anterior este Ministerio emitirá la norma técnica correspondiente y clasificará los microorganismos dentro de cuatro grupos, según los siguientes criterios: a. GRUPO DE RIESGO I: Microorganismos que representan escaso riesgo para el individuo y para la comunidad.

ARTICULO 68. Los microorganismos que se clasifiquen en los grupos de riesgo I y II deberán manejarse en laboratorios de tipo básico de microbiología, empleando gabinetes de seguridad cuando se considere necesario.

ARTICULO 69. Los microorganismos que se clasifiquen en el grupo de riesgo III deberán manejarse en laboratorios de seguridad microbiológica.

ARTICULO 70. Los microorganismos que se clasifiquen en el grupo de riesgo IV deberán manejarse en laboratorios de máxima seguridad microbiológica, bajo la autorización y control de las autoridades sanitarias correspondientes.

ARTICULO 72. El Comité de Ética en Investigación de la institución investigadora deberá realizar visitas periódicas para evaluar el cumplimiento de las medidas y recomendar modificaciones a las prácticas de laboratorio, incluyendo la suspensión temporal o

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definitiva de las investigaciones que representen un riesgo no controlado de infección o contaminación para los trabajadores de laboratorio, la comunidad o el medio ambiente”.

Es importante que los programas de las

carreras profesionales se implementen de

acuerdo a la ley ofreciendo así, a su cuerpo estudiantil, calidad en la educación, es por esto que el programa de medicina de la Universidad Santiago de Cali, no es ajena a este deseo y por este motivo siempre esta en constante evolución actualizándose y generando cambios en las asignaturas del programa de créditos para brindar una educación completa e integral.

BIOETICA

http://.www.dcupn.files.wordpress.com/2008/04/definicion-de-etica.doc. Consultado el 22 de octubre de 2010.

Teniendo en cuenta que la ética se define como “La ciencia que estudia lo bueno y lo malo del comportamiento humano”, sabemos que el bien es contribuir a que la otra persona alcance su estado máximo de bienestar mediante la ejecución libre de actos responsables que le beneficien.

A continuación se presenta el motivo por el cual fue creado el Comité de Bioética de la universidad y cuales son sus funciones.

Comité de Bioética Facultad de Salud Universidad Santiago de Cali “POR LA CUAL SE CREA EL COMITÉ DE ÉTICA Y SE ESTABLECE SUS FUNCIONES”

El CONSEJO DE LA FACULTAD DE SALUD DE LA UNIVERSIDAD SANTIAGO DE CALI, en uso de sus atribuciones legales y estatutarias, y CONSIDERANDO:

Que es deber de la Universidad Santiago de Cali, y en especial del Consejo de Facultad de Salud, trabajar incansablemente por el mejoramiento del nivel académico.

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Que de conformidad con lo dispuesto por el Consejo Académico según consta en Acta-28 del 6 de septiembre, corresponde a este Consejo ejercer la dirección académica de la facultad y decidir sobre los asuntos académicos.

Que en consecuencia, es necesario producir un marco general que fundamente y regule el funcionamiento de los comités de la facultad de Salud en la Universidad.

Que es necesario aprobar la creación de los diferentes comités que funcionan en la Facultad.

Que los comités conformados en la facultad estén reconocidos y reglamentados al interior de la misma.

RESUELVE:

ARTÍCULO PRIMERO: CREACION establece 19 de Abril de 2007 como la fecha de creación del comité de ética.

ARTÍCULO SEGUNDO: RECONOCER las labores de apoyo a la investigación que viene desarrollando la facultad de salud desde que se formaron los programas de salud.

ARTÍCULO TERCERO: MISIÓN velar porque se cumplan las actividades investigativas que se desarrollan en la facultad de salud, con principios sustentados en valores éticos universalmente reconocidos, así como los aspectos particulares consignados a nivel nacional a ese respecto.

ARTÍCULO CUARTO: FUNCIONES el comité de ética de la Facultad de Salud de la Universidad Santiago de Cali, cumplirá con las siguientes funciones:

Formular criterios éticos sobre la investigación, con base en principios, normas y acuerdos nacionales e internacionales proferidas a ese respecto.

Pronunciarse sobre la viabilidad y los demás aspectos éticos de proyectos de investigación

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Asesorar a solicitud de los centros de investigación en la toma de decisiones relacionadas con aspectos éticos en investigación.

Promover un reglamento para su funcionamiento, el cual debe ser aprobado por el Consejo de Facultad.

Rendir informe de actividades solicitados por la dirección de Investigaciones y/o el vicerrector académico.

Las demás que señalen la Ley, los Estatutos, Reglamentos y Disposiciones especiales de los órganos competentes nacionales y de la Universidad Santiago de Cali.

ARTÍCULO QUINTO: CONFORMACION el comité de ética de la Facultad de Salud de la Universidad Santiago de Cali estará conformado por un representante de cada Programa, Docente de tiempo completo y/o Dedicación exclusiva.

PARRAGRAFO 1.

El comité de ética debe tener un coordinador y un Presidente que deberá ser elegido por el Consejo de la Facultad de Salud.

La investigación para la elaboración libro electrónico Sobre Protocolo de Obtención y Preservación de Células Hematopoyéticas para el Trasplante de Medula Ósea desde la Competencia del Medico en La Universidad Santiago de Cali en el año 2011. Se realizará basada en principios científicos y éticos donde prevalecerá el respeto a la dignidad y la protección de los derechos humanos.

Normatividad internacional

Las pautas Eticas Internacionales para la Investigación Biomédica en seres humanos.

Fueron creadas para indicar el modo en que los principios éticos deben guiar la conducta de la investigación biomédica en seres humanos, establecidos por la declaración de Helsinki, para que sean aplicadas adecuadamente, especialmente en los países en vía de desarrollo, teniendo en cuenta las circunstancias socioeconómicas, leyes, regulaciones al

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igual que las disposiciones ejecutivas y administrativas y consideran que la investigación en los seres humanos no deben violar ninguno de los estándares éticos aplicados de forma universal entre los cuales esta la autonomía

individual y el consentimiento

informado.

Estas fueron elaboradas por el Consejo de Organizaciones Internacionales de las Ciencias Médicas (CIOMS) en colaboración con la Organización Mundial de la Salud Ginebra 2002. A continuación se presenta el documento.

PAUTAS ÉTICAS INTERNACIONALES PARA LA INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA EN SERES HUMANOS Pautas Éticas internacionales para la investigación Biomédica en seres humanos. Marzo del 2000. [En línea]. [Consultado septiembre 20 de 2010]. Disponible en Internet: http//.www.paho.org/Spanish/BIO/CIOMS.pdf

ANTECEDENTES

El Consejo de Organizaciones Internacionales de las Ciencias Médicas (CIOMS) es una organización internacional no gubernamental que tiene relaciones oficiales con la Organización Mundial de la Salud (OMS). Fue fundado bajo el auspicio de OMS y de la Organización de las Naciones Unidas para la Educación, la Ciencia y la Cultura (UNESCO) en 1949, con el mandato, entre otros, de colaborar con las Naciones Unidas y sus agencias especializadas, particularmente con UNESCO y OMS.

A fines de la década de los 70, CIOMS, en asociación con OMS, empezó a trabajar en ética de la investigación biomédica.

En ese momento, algunos Estados Miembros de OMS, recientemente independizados, estaban estableciendo sistemas de atención de salud. OMS aún no estaba preparada para promover la ética como un aspecto de la atención o la investigación en salud.

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Por este motivo, CIOMS, en cooperación con OMS, empezó a preparar pautas "para indicar el modo en que los principios éticos que debieran guiar la conducta de la investigación biomédica en seres humanos, establecidos por la Declaración de Helsinki, podían ser aplicados en forma efectiva, especialmente en los países en desarrollo, considerando sus circunstancias socioeconómicas, sus leyes y regulaciones, así como sus disposiciones ejecutivas y administrativas".

La Asociación Médica Mundial había formulado la Declaración de Helsinki original en 1964, revisándola en 1975. El resultado de la tarea CIOMS/OMS culminó en 1982, con la Propuesta de Pautas Éticas Internacionales para la Investigación Biomédica en Seres Humanos.

En el período siguiente comenzó la pandemia de VIH/SIDA, con las consiguientes propuestas para realizar ensayos de vacunas y medicamentos a gran escala para su tratamiento.

Esta situación hizo surgir nuevos temas éticos no considerados durante la preparación de la Propuesta de Pautas. También hubo otros factores, tales como rápidos avances en medicina y biotecnología, nuevas prácticas de investigación -ensayos multinacionales, experimentación en la que participan grupos de poblaciones vulnerables-y un cambio de visión, tanto en países ricos como pobres, en cuanto a que la investigación en seres humanos constituía, en general, más bien un beneficio que una amenaza. La Declaración de Helsinki fue revisada dos veces durante los años ochenta, en 1983 y 1989.

Era oportuno revisar y actualizar las Pautas de 1982 y CIOMS, con la cooperación de OMS y su Programa Global sobre SIDA, asumió esta tarea. El resultado fue la aparición de dos conjuntos de pautas: las Pautas Internacionales para Revisión Ética de Estudios Epidemiológicos, en 1991, y las Pautas Éticas Internacionales para la Investigación Biomédica en Seres Humanos, en 1993.

Después de 1993 surgieron temas éticos para los cuales las Pautas de CIOMS no tenían disposiciones específicas. Se referían, principalmente, a ensayos clínicos controlados con patrocinadores e investigadores externos efectuados en países de bajos recursos, y al

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uso de comparadores diferentes de una intervención de efectividad comprobada. El tema en debate era la necesidad de obtener soluciones de salud pública tecnológicamente apropiadas y de bajo costo, especialmente para el tratamiento del VIH/SIDA, por medio de medicamentos y vacunas cuyo costo pudiesen afrontar los países más pobres. Los expertos adoptaron posiciones opuestas acerca de este tema.

Algunos abogaban, en países de bajos recursos, por ensayar intervenciones que podrían ser menos efectivas que el tratamiento empleado en países de mejor situación, pero de menor costo. Por considerarlo falto de ética, insistieron en que no debía rechazarse ningún esfuerzo de investigación para ofrecer soluciones públicas apropiadas para los países en desarrollo.

El contexto de la investigación debiera ser considerado. Por regla general, las decisiones debieran tomarse localmente. El paternalismo de los países más ricos hacia los más pobres debiera evitarse. El desafío consistiría en estimular la investigación para encontrar soluciones locales para enfermedades de gran parte de la población mundial, a la vez que entregar normas claras para la protección contra la explotación de individuos y comunidades vulnerables.

Para otros, esos ensayos eran inherentemente no éticos ya que constituían o podían llegar a constituir una explotación de los países pobres por parte de los más ricos. Los factores económicos no debieran influir en las consideraciones éticas. Los países ricos o la industria farmacéutica poseen la capacidad de proporcionar tratamientos efectivos para propósitos de comparación.

Algunos países de bajos recursos ya habían hecho accesibles mediante sus propios recursos algunos tratamientos de efectividad comprobada para pacientes con VIH/SIDA.

Este conflicto complicó la revisión y actualización de las Pautas de 1993. Finalmente, quedó claro que los puntos de vista en conflicto no podían reconciliarse, a pesar de que los que proponían el último punto de vista opinaban que el borrador de las nuevas pautas había incluido garantías contra la explotación.

El Comentario sobre la Pauta 11 reconoce el conflicto no resuelto o imposible de resolver.

82

La revisión y actualización de las Pautas de 1993 comenzó en diciembre de 1998. Los consultores de CIOMS prepararon un primer borrador, el cual fue revisado por el comité directivo de redacción en mayo de 1999.

Éste propuso algunos cambios y entregó una lista de temas para los cuales sugirió pautas nuevas o modificadas; recomendó tópicos, así como autores y comentaristas, para presentar y discutir en una reunión de consulta de CIOMS.

Se consideró que una reunión de los miembros del comité directivo de redacción, junto con autores de artículos y comentaristas, seguida por una nueva versión, distribución electrónica y retroalimentación, sería un procedimiento más adecuado para los propósitos del proyecto que el proceso originalmente ideado. Por lo tanto, se organizó la consulta en marzo de 2000, en Ginebra.

En la reunión se avanzó en la revisión y se analizó las materias conflictivas. Ocho artículos encomendados y distribuidos previamente, fueron presentados, comentados y discutidos. El trabajo de la reunión continuó durante varias semanas con grupos ad hoc de trabajo electrónico, cuyo resultado fue puesto a disposición para la preparación de la tercera versión.

El material solicitado para la reunión fue publicado por CIOMS bajo el título: Biomedical Research Ethics: Updating Internacional Guidelines. A Consultation (Ética de la investigación biomédica: Una consulta para la actualización de las pautas internacionales) (diciembre de 2000).

Un grupo informal de redacción, constituido por ocho personas provenientes de África, Asia, Latinoamérica, Estados Unidos y de la Secretaría de CIOMS, se reunió en Nueva York en enero de 2001, continuando luego su interacción en forma electrónica. La versión revisada fue puesta a disposición en el sitio web de CIOMS en junio de 2001 y ampliamente distribuida por otros medios.

Muchas organizaciones e individuos la comentaron, algunos en forma extensa, otros en forma crítica. Algunos puntos de vista eran antagónicos, especialmente sobre los ensayos

83

controlados por placebo. Para la siguiente revisión se agregaron al grupo dos miembros, provenientes de Europa y Latinoamérica. La siguiente versión fue puesta a disposición en el sitio web de CIOMS en enero de 2002 para preparar la conferencia de CIOMS de febrero - marzo del mismo año.

Se acordó que la conferencia de CIOMS discutiría y, en lo posible, presentaría una versión final para la última aprobación del Comité Ejecutivo de CIOMS. Además de la representación de organizaciones miembros de CIOMS, entre los participantes se incluyó expertos en ética e investigación de todos los continentes. Revisaron las pautas provisionales una a una y sugirieron modificaciones.

La Pauta 11, Elección del control en ensayos clínicos, fue reformulada en la conferencia en un esfuerzo por reducir los desacuerdos. El texto reformulado de esa pauta fue discutido intensamente y en general bien recibido.

Sin embargo, algunos participantes continuaron objetando la aceptabilidad ética de la excepción a la regla general que limita el uso del placebo a las condiciones indicadas en la pauta, argumentando que los sujetos de investigación no debieran ser expuestos a riesgo de daño serio o irreversible cuando una intervención de efectividad comprobada podía prevenirlo, y que tal exposición podría constituir explotación.

Finalmente, el Comentario sobre la Pauta 11 refleja las posiciones opuestas sobre el uso de un comparador distinto de una intervención de efectividad comprobada para propósitos de control.

El nuevo texto del año 2002, que sustituyó al de 1993, establece principios éticos generales, un preámbulo y 21 pautas, con una introducción y una breve descripción de anteriores instrumentos y pautas.

Al igual que las Pautas de 1982 y 1993, está destinado a orientar, especialmente a los países de escasos recursos, en la definición de pautas nacionales sobre ética de la investigación biomédica, aplicando estándares éticos en condiciones locales, y estableciendo o redefiniendo mecanismos adecuados para la evaluación ética de la investigación en seres humanos.

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De acuerdo al código de Nuremberg publicado el 20 de agosto de 1947, que rigen la experimentación con seres humanos no aplica para este proyecto del libro electrónico sobre Protocolo de Obtención y preservación de Células Hematopoyéticas para el Trasplante de Medula Ósea, porque no requiere realizar experimentación, por ende no atenta contra la vida ni ética de las personas, se considera solamente una descripción de pasos y técnicas.

Sin embargo es importante tenerlos en cuenta, porque en el momento de ejecutarse de manera experimental por parte de los investigadores se debe conocer y estar sujeto a estas normas.

Con la elaboración de este trabajo de grado se tiene en cuenta los siguientes principios básicos para toda investigación médica de la declaración de Helsinki.

- Para tomar parte en este proyecto de investigación, los individuos deben ser participantes voluntarios e informados.

- Siempre debe respetarse el derecho de los participantes en la investigación a proteger su integridad. Deben tomarse toda clase de precauciones para resguardar la intimidad de los individuos, la confidencialidad de la información del paciente y para reducir al mínimo las consecuencias de la investigación sobre su integridad física y mental y su personalidad.

A continuación se presenta el documento.

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CODIGO DE NUREMBERG (1946)

Código de Núremberg (1946). [En línea]. [Consultado septiembre 20 de 2010]. Disponible en Internet: Tomado de: http://www.bioeticaweb.com/Codigos_y_leyes. La prueba de crímenes de guerra y de crímenes contra la humanidad

1. El consentimiento voluntario de la persona objeto del experimento es absolutamente necesario; es decir, el afectado ha de poseer la capacidad legal de dar su asentimiento, ha de estar en situación de tomar una decisión libre que no esté influida por violencia, engaño, astucia, presión, ilusión o cualquier otra forma del influjo o de la coacción, ha de poseer un conocimiento y una comprensión suficiente de las partes del experimento en cuestión para poder tomar una decisión comprensiva e ilustrada.

Esta última condición hace necesario que se haya aclarado a la persona objeto del experimento antes de la aceptación de su decisión afirmativa la índole, duración y finalidad del experimento, así como todas las molestias y peligros que son buenamente de esperar, y las consecuencias para su salud o su persona que pudieran resultar de su participación.

El deber y la responsabilidad de fijar el valor del asentimiento corresponden a todo aquél que ordena, dirige o lleva a cabo el experimento. Se trata de deberes personales y responsabilidades personales que no pueden traspasarse a otros sin penalización.

2. El experimento debe ser tal que sean de esperar resultados fructíferos para el bien de la sociedad que no se puedan conseguir con otros medios de investigación o métodos y que por su índole no sean arbitrarios e innecesarios.

3. El experimento ha de estar planificado y basado en los resultados de experimentos en animales y en el conocimiento de la esencia de la enfermedad o del problema, de manera que los resultados conjeturables justifiquen la realización del experimento.

4. El experimento ha de llevarse a cabo de tal modo que se eviten todos los sufrimientos y lesiones corporales y psíquicos innecesarios.

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5. No es lícito llevar a cabo un experimento si existe una razón a priori para suponer que se producirá la muerte o un perjuicio corporal duradero, con la excepción quizá de los experimentos en los que los directores del experimento sirven simultáneamente de personas objeto del mismo.

6. La magnitud del peligro no debe sobrepasar nunca la

frontera que resulta de la

importancia humanitaria del problema que se trata de resolver

7. Se han de hacer los preparativos adecuados y se han de tomar las precauciones suficientes para proteger a las personas objeto del experimento de incluso la más pequeña posibilidad de una lesión, de un daño permanente para su salud o de la muerte

8. El experimento debe ser realizado sólo por personas formadas científicamente. Quienes dirijan o realicen el experimento han de aplicar en todas las fases del mismo la mayor destreza y el mayor cuidado.

9. Durante el experimento la persona objeto del mismo debe conservar su libertad de dar por terminado el experimento si ha alcanzado corporal o psíquicamente el punto en el que su continuación le parece imposible.

10. En el transcurso del experimento el director del mismo ha de estar dispuesto en todo momento a detenerlo si al aplicar la buena fe, especial destreza y cuidado al enjuiciar que se le exigen tiene razones para suponer que una continuación del experimento podría originar una lesión, un daño permanente para la salud o la muerte de la persona objeto del experimento.

En otro punto, los Principios Bioéticos. Principios definidos por (Beauchamp y Childress en 1979) dicen:

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PRINCIPIO DE AUTONOMÍA

Este principio debe ser respetado en su totalidad, cuando la persona se encuentra en función de todas sus capacidades y es apta para tomar decisiones de manera voluntaria sin que esta interfiera con su estado de salud ni su vida, teniendo en cuenta que existen algunas excepciones como es el estado vegetativo o daño cerebral. Para lo cual se hace necesario, justificar por qué no existe autonomía o se ve impedida para que su decisión sea respetada.

En el ámbito médico, el consentimiento informado es la máxima expresión de este principio de autonomía, constituyendo un derecho del paciente y un deber del médico, pues las preferencias y los valores del enfermo son primordiales desde el punto de vista ético y suponen que el objetivo del médico es respetar esta autonomía porque se trata de la salud del paciente.

PRINCIPIO DE BENEFICENCIA “Obligación positiva que tienen todos los seres humanos de obrar en beneficio de los demás, obligando a actuar en beneficio de los demás” .En el campo de la medicina, referente a intervenciones siempre existe un riesgo y unas contraindicaciones lo cual conlleva a acudir a un principio de utilidad no solo económica sino en términos de la salud para sopesar los beneficios e inconvenientes estableciendo el resultado mas favorable a favor de la salud.

Sin embargo, las preferencias individuales de médicos y de pacientes pueden discrepar respecto a qué es perjuicio y qué es beneficio. Por ello, es difícil defender la primacía de este principio, pues si se toman decisiones médicas desde éste, se dejan de lado otros principios válidos como la autonomía o la justicia.

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PRINCIPIO DE NO MALEFICENCIA “Obliga a no hacer daño intencionalmente Abstenerse intencionadamente de realizar acciones que puedan causar daño o perjudicar a otros. Implica simplemente abstenerse intencionadamente de realizar acciones que puedan causar daño”.

Teniendo en cuenta que como médicos de manera voluntaria o involuntaria podemos llevar a un paciente a un estado de disconfort, o admitir que no somos capaces con determinado manejo o técnica, nuestro gran compromiso y responsabilidad como mínimo es no hacer el mal. No sólo en el ámbito biomédico sino en todos los sectores de la vida humana. El análisis de este principio va de la mano con el de beneficencia, para que prevalezca el beneficio sobre el perjuicio.

Las implicaciones médicas del principio de no maleficencia son varias: tener una formación teórica y práctica rigurosa y actualizada permanentemente para dedicarse al ejercicio profesional, investigar sobre tratamientos, procedimientos o terapias nuevas, para mejorar los ya existentes con objeto de que sean menos dolorosos y lesivos para los pacientes; avanzar en el tratamiento del dolor; evitar la medicina defensiva y, con ello, la multiplicación de procedimientos y tratamientos innecesarios.

PRINCIPIO DE JUSTICIA

Tratar a cada uno como corresponda, con la finalidad de disminuir las situaciones de desigualdad (ideológica, social, cultural, económica, etc.). Actualmente en el área de salud y con la medicina actual se dificulta cumplir con este principio partiendo de muchos aspectos que van desde diversos criterios médicos, racionalidad técnico-científica, leyes, asignación de recursos para suplir las necesidades que demanda cada paciente de manera individual debido a que los bienes son escasos y las necesidades múltiples en la atención de la salud sobre todo en países en vía de desarrollo como el nuestro.

El principio de justicia puede desdoblarse en dos: un principio formal (tratar igual a los iguales y desigual a los desiguales) y un principio material (determinar las características relevantes para la distribución de los recursos sanitarios: necesidades personales, mérito, capacidad económica, esfuerzo personal, etc.).

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Las políticas públicas se diseñan de acuerdo con ciertos principios materiales de justicia.

En España, por ejemplo, la asistencia sanitaria es teóricamente universal y gratuita y está, por tanto, basada en el principio de la necesidad. En cambio, en Estados Unidos la mayor parte de la asistencia sanitaria de la población está basada en los seguros individuales contratados con compañías privadas de asistencia médica.

Para excluir cualquier tipo de arbitrariedad, es necesario determinar qué igualdades o desigualdades se van a tener en cuenta para determinar el tratamiento que se va a dar a cada uno. El enfermo espera que el médico haga todo lo posible en beneficio de su salud.

Pero también debe saber que las actuaciones médicas están limitadas por una situación impuesta al médico, como intereses legítimos de terceros.

La relación médico-paciente se basa fundamentalmente en los principios de beneficencia y de autonomía, pero cuando estos principios entran en conflicto, a menudo por la escasez de recursos, es el principio de justicia el que entra en juego para mediar entre ellos. En cambio, la política sanitaria se basa en el principio de justicia, y será tanto más justa en cuanto que consiga una mayor igualdad de oportunidades para compensar las desigualdades.

Se presenta un modelo de consentimiento informado utilizado por España que podría orientar el trabajo que se realiza en colombia

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CONSENTIMIENTO INFORMADO ESPAÑA

CONSENTIMEINTO INFORMADO

Este documento tiene como finalidad dejar constancia de que usted, o quien le represente, ha otorgado su consentimiento a la aplicación del procedimiento arriba mencionado y, por tanto, nos autoriza a intervenir en los términos acordados previamente.

Antes de firmar este documento, usted debe haber sido informado de forma verbal y por escrito sobre el procedimiento que le aplicarán.

CONSENTIMIENTO

Manifiesto que estoy conforme con el procedimiento que me han propuesto, y que he recibido y comprendido satisfactoriamente toda la información sobre mi derecho a retirar mi consentimiento en el momento en que lo considere oportuno, sin obligación de justificar mi voluntad y sin que de ellos derive ninguna consecuencia adversa para mí.

También manifiesto que se me ha informado sobre mi derecho a solicitar más información complementaria en caso de que lo necesite y a que no se me practique ningún procedimiento adicional, salvo aquellos de los que he sido informado, para el que doy mi aprobación, salvo que sea estrictamente necesario para salvar mi vida o para evitar algún daño irreparable para mi salud.

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IMPORTANTE: Antes de firmar este documento, por favor, lea la información impresa en el reverso de esta hoja.

CONDICIONES DE LA INFORMACIÓN



Información suficiente sobre las características de su enfermedad y la necesidad de

aplicar este procedimiento



Explicación breve y sencilla de la finalidad del procedimiento, en qué consiste y cómo

se llevará a efecto.



Información sobre en que centro se llevará a cabo el procedimiento.



Descripción de las consecuencias seguras del procedimiento y que deban

considerarse de importancia.



Descripción de los riesgos típicos del procedimiento, es decir, aquellos que cabe

esperar que ocurran conforme a la experiencia y estado actual de la ciencia. También aquellos otros que, siendo infrecuentes pero no excepcionales, pueden ser determinantes para la salud.



Descripción de los riesgos relacionados con las circunstancias personales del

paciente, ya sea por su edad, padecimiento de otras enfermedades, creencias, valores y

92

actitudes, o cualquier otra circunstancia que modifique los riesgos generales del procedimiento.



Molestias probables del procedimiento y sus consecuencias transitorias.



Curso previsible de la enfermedad en el supuesto de no aplicarse la intervención

indicada, y qué otros procedimientos alternativos existen.



En el caso de que pudiera necesitar sangre ajena o derivados de la misma,

explicaciones sobre los riesgos propios de su administración.



Información sobre la posible aplicación de otros procedimientos complementarios al

indicado por su médico, ante una situación imprevista.



Información sobre cualquier otra cuestión planteada por usted.



Posibilidad de que se le oferte ser intervenido en otro centro distinto.

NOTA: Este documento no es válido si no va acompañado del documento de INFORMACIÓN CLÍNICA ESPECÍFICA

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Finalidad La donación de progenitores hematopoyéticos tiene por finalidad la realización de un trasplante de progenitores hematopoyéticos. Este procedimiento terapéutico se realiza para reemplazar una médula ósea enferma por otra sana.

Descripción del proceso 1. Antes de la obtención será necesario descartar posibles efectos adversos de la donación tanto en el donante como en el receptor. Para reducir al máximo el riesgo de transmisión de enfermedades infecciosas, se le realizarán los siguientes tests sexológicos: Virus de Inmunodeficiencia humana (HIV 1 y 2); virus de Hepatitis B y Virus Hepatitis C, Treponema (sífilis).

Toxoplasma y virus herpes (Citomegalovirus, Herpes simple, Varicela Zoster). Usted tendrá derecho a solicitar los resultados de dichas pruebas, y se le solicitará autorización para comunicar los resultados positivos al médico facultativo y al receptor.

2. Unos días antes de la recolección el donante debe someterse a un tratamiento por vía subcutánea con factores estimulantes de colonias, con objeto de recolectar una cantidad adecuada de células a trasplantar.

3. Para recoger los progenitores hematopoyéticos de la sangre periférica se realizan aféresis. Las aféresis consisten en conectar dos venas del donante a una maquina separadora de células mediante un equipo de bolsas y tubos de recolección estériles. Una de las vías lleva sangre al separador celular, donde se procesa y se selecciona las células a recolectar, por la otra vía se devuelve al donante la sangre una vez procesada. La duración de cada aféresis suele ser de 3 a 6 horas. Para obtener una cantidad suficiente

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de progenitores hematopoyéticos puede ser necesario realizar varias aféresis en días consecutivos. Este procedimiento se realiza bajo la supervisión de personal médico y de enfermería con experiencia en este tipo de donación. Periódicamente se realizan una serie de controles de la donación como pulso, tensión, estado general del donante.

Efectos secundarios  Durante el tratamiento con factor estimulante el donante puede experimentar ciertos efectos secundarios como dolores musculares, dolores óseos o fiebre.  Durante las aféresis los efectos secundarios más frecuentes son los calambres musculares, que se solucionan con cierta facilidad suministrando calcio.  Otros efectos secundarios de muy baja frecuencia son: hipotensión debido a la circulación extracorpórea, malestar general o síncope.

Alternativas Los progenitores hemopoyéticos también pueden obtenerse de medula ósea mediante multipunciones en crestas ilíacas bajo anestesia general en un quirófano.

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