4 - Cell Spotting - Vamos Combater o Cancro Juntos

DOCUMENTO AUXILIAR

Quem são as entidades responsáveis pela experiência que inclui a aplicação “Cell Spotting”?

A aplicação “Cell Spotting” é parte integrante de uma investigação na área da biologia celular e molecular conduzida por José Carrodeguas Villar, no Instituto para a Biocomputação e Física dos Sistemas Complexos (BIFI) da Universidade de Saragoça.

Onde se insere a aplicação “Cell Spotting” nesta investigação do BIFI? Uma das vertentes desta investigação no BIFI consiste na determinação de compostos químicos indutores da apoptose em células tumorais. Em cada experiência são obtidas mais de 4000 imagens para análise, pelo que a criação de uma aplicação de Ciência Cidadã é pertinente e necessária. Esta aplicação estabelecerá o elo entre o cientista e o cidadão contribuindo para o avanço desta investigação e para a sensibilização dos cidadãos para a importância do voluntariado científico.

Como são geradas as imagens?

A experiência está a ser conduzida utilizando equipamento avançado que inclui um microscópio automático de fluorescência invertida (Leica DMI 6000B), um sistema Optigrid para semiconfocalidade e uma unidade de controlo de temperatura e concentração de CO2 para manter as células vivas. O microscópio tira fotografias das culturas de células de 30 em 30 minutos a uma região, utilizando diferentes tipos de iluminação (luz normal e diferentes canais de fluorescência). Cada experiência dura cerca de 12 a 24h.

Como se obtêm imagens de células com diferentes pigmentações?

As imagens das células HeLa disponibilizadas na aplicação Cell Spotting resultam da combinação de três imagens obtidas por microscopia de fluorescência em diferentes canais de transmissão (campo claro) e de emissão (canal azul e canal verde). O campo claro permite a visualização da membrana celular, o canal azul a visualização do núcleo marcado a azul com o fluorocromo Hoechst 33342, e o canal verde permite visualizar as mitocôndrias marcadas a verde com o fluorocromo Mitotracker.

Que tipo de células tumorais estão a ser utilizadas?

As células tumorais utilizadas são as células HeLa, de Henriquetta Lacks, uma paciente que faleceu em 1951 de cancro cervical ou do colo do útero. As células HeLa correspondem a uma linha celular de células tumorais que se dividem indefinidamente, sendo assim muito utilizadas na investigação do Cancro.

O que devemos considerar durante a análise de imagens das células HeLa para a determinação do seu estado atual (vivo, em apoptose ou necrose)?

As células HeLa podem ser estudadas consoante vários critérios, nomeadamente a forma, o núcleo, a rede de mitocôndrias, a libertação do conteúdo celular e a mobilidade.

A Forma As células HeLa podem apresentar diferentes formas: alongadas; irregulares; em forma de estrela; entre outras. Todas estas formas correspondem a uma célula HeLa saudável. Quando uma célula HeLa assume a forma redonda, está a dividir-se ou a morrer. Quando se trata de uma divisão, a célula altera a sua forma, achata e assume uma das outras formas. Quando se trata de morte celular, a célula acaba fragmentando-se ou libertando o seu conteúdo. Uma célula em necrose pode aumentar sem alterar a sua forma, no entanto, na corrente experiência, as células HeLa têm assumido a forma redonda.

Forma do núcleo O núcleo pode apresentar diferentes formas, podendo ser: arredondado; alongado; em forma de feijão; ou condensado e fragmentado. Um núcleo arredondado, alongado ou em forma de feijão surgem numa célula saudável. A pressão causada por parte de estruturas celulares de células vizinhas fazem com o núcleo varie um pouco a sua forma. No entanto, um núcleo condensado e fragmentado é um sinal da apoptose, uma vez que durante este processo, o DNA condensa e é posteriormente fragmentado por endonucleases. Esta característica permite distinguir facilmente a necrose da apoptose em células HeLa uma vez que se trata de uma característica exclusiva da apoptose.

Forma e distribuição das mitocôndrias As células HeLa, entre outros tipos de células, não apresentam mitocôndrias isoladas como é normalmente representado nos manuais escolares. Elas fazem parte de uma rede dinâmica e bastante alongada com longas formas tubulares. Esta é uma rede que está em constante movimento, alterando a sua forma e sofrendo fusão (entre duas ou mais mitocôndrias) e cisão (fragmentação). Durante a apoptose, a rede de mitocôndrias sofre cisão, convertendo a sua forma longa e tubular em pequenas pontuações. As suas membranas são afetadas sofrendo despolarização (a polaridade da membrana perde-se equalizando as cargas e solutos de ambos os lados). As cristas mitocondriais também sofrem alterações, embora não sejam visíveis ao microscópio.

Libertação do conteúdo celular (morte celular) A libertação do conteúdo celular é uma característica típica da morte celular por necrose. No entanto, esta pode ser verificada num estado tardio da apoptose. Uma vez que nas culturas de células em análise não existe sistema imunitário para remover os corpos apoptóticos, estes podem acabar por perder a integridade da membrana e libertar o seu conteúdo. O melhor método para distinguir, no caso das células HeLa, a apoptose da necrose é através da observação das alterações do núcleo.

Mobilidade Dois tipos de movimento podem ser considerados: a mobilidade da célula e a mobilidade da sua membrana. Uma célula saudável explora o ambiente deslocando-se no meio e estendendo porções da sua membrana – os pseudópodes. Quando uma célula HeLa entra em morte celular, esta mobilidade é afetada, pois a célula torna-se imóvel e com a forma arredondada.

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Células vivas ou mortas No primeiro ecrã, deverá ser indicado o número total de células, classificando-as de vivas ou mortas.

A imagem que é apresentada por defeito (vamos chamar-lhe de canal normal) é o resultado da sobreposição de três imagens: uma em campo claro (tons cinzentos), uma em azul fluorescente (para visualizar o núcleo) e outra em verde (para visualizar as mitocôndrias). Para observar o núcleo ou as mitocôndrias separadamente, é possível escolher o canal azul ou verde. Estes facilitam a observação de cada um destes organelos individualmente.

A forma mais comum destas células assemelha-se a um fuso alongado, embora também possam adotar outras formas como estrelas, esferas, etc. Estas células crescem aderentes à superfície da cultura. Assim, quando estão vivas, as células assumem uma das formas anteriormente mencionadas ,com um núcleo relativamente uniforme arredondado, oval ou em forma de feijão. As mitocôndrias apresentam-se em rede e com uma forma normalmente tubular.

As células que morrem por apoptose tornam-se inicialmente redondas e depois atrofiam enquanto a membrana muda de forma, dando origem a pequenas vesículas-corpos apoptóticos. O núcleo atrofia e pode também fragmentar-se. Neste caso, a cor azul torna-se mais intensa uma vez que o corante fluorescente concentra-se num volume mais pequeno. As mitocôndrias também se fragmentam assumindo a forma de pequenas pontuações ou pequenas esferas na vez de na forma alongada e tubular. No entanto, as células também podem assumir uma forma arredondada quando se dividem por mitose. Assim, quando se observa uma célula redonda com uma superfície suave (perímetro), não se pode assumir que o arredondamento da célula esteja associado à morte ou à divisão da célula (existem outros detalhes que poderão ajudar a distinguir cada processo, no entanto, estes são aspetos que não serão aqui abordados). A melhor forma de saber se uma célula redonda se está a dividir é analisando as fotografias que a sucedem. Caso se trate de uma divisão, uma ou duas fotografias depois (30 a 60 minutos) existirão duas células na vez de uma. Caso se trate de uma situação de morte celular, a célula manter-se-á redonda por várias fotografias até ao momento em que atrofia, altera a sua membrana ou até se fragmenta.

Quando uma célula morre por necrose, esta mantém normalmente a sua forma e tamanho, podendo no entanto diminuir ligeiramente. O núcleo mantém a sua forma e as mitocôndrias podem fragmentar. No entanto, a característica mais evidente da necrose corresponde à libertação do conteúdo celular (citosol) que pode ser observado pela presença de uma ou várias bolhas que crescem em torno da célula.

Normalmente, uma célula viva e saudável adota uma forma achatada apresentando um núcleo redondo e homogéneo, um citoplasma abrangente (que rodeia o núcleo) e mitocôndrias tubulares distribuídas ao longo do citosol.

Libertação do conteúdo celular A libertação do conteúdo celular é observada através das bolhas transparentes em torno das células. Se visualizar o vídeo abaixo (recomenda-se a sua visualização em modo de ecrã completo) poderá observar o seu crescimento em determinados pontos do perímetro da célula. Neste vídeo, as células que libertam o seu conteúdo celular estão, na sua maioria, posicionadas à esquerda. O conteúdo celular é libertado quando a membrana plasmática perde a sua integridade, isto é, quando rebenta ou surgem poros. O líquido citosólico escapa através desses poros. Se esses poros forem suficientemente grandes, alguns organelos poderão inclusive sair da célula.

A libertação do conteúdo celular sem uma alteração significativa da morfofologia geral da célula é indicativa de uma morte por necrose. Se a célula atrofiou inicialmente e sofreu alteração da membrana com a formação de vesículas, a libertação do conteúdo celular indica que a célula morreu por apoptose. Esta libertação ocorreu devido à perda da integridade da membrana. Durante a apoptose, não ocorre libertação do conteúdo celular. Apesar das células se fragmentarem em corpos apoptóticos, estes encontram-se sempre revestidos por uma membrana. Como as células estão em cultura, os corpos não são eliminados pelo sistema imunitário existindo assim a possibilidade de, após a apoptose, a membrana rebentar e observar-se a libertação do conteúdo celular.

Distribuição das Mitocôndrias Células com mitocôndrias dispersas ou homogeneamente distribuídas pelo citosol precisam de ser diferenciadas das que se encontram em grupos numa ou em várias regiões da célula. Os aglomerados de mitocôndrias, quando presentes, encontram-se normalmente junto do núcleo. Por vezes, elas podem até distorcer a forma do núcleo. A aglomeração de mitocôndrias está por norma associada à fragmentação das mitocôndrias, arredondamento da célula ou atrofiamento celular.