Manual do material Compostos fitoactivos by Casa Ciências

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Compostos fitoactivos: o efeito antibiótico do alho

Maria João Guimarães Fonseca Fernando Manuel dos Santos Tavares

Resumo

Descrição do material

Objectivos

Nível etário 4 Contextualização e conteúdos abrangidos

Enquadramento curricular

Sugestão de implementação 7 Sugestão de avaliação 8 Sugestões de extensão 8 Biossegurança 8 Bibliografia recomendada 10 Referências 10 Anexo I: Tópicos para introdução

Anexo II: Protocolo do Professor

Anexo III: Protocolo do Aluno iii Anexo IV: Tópicos para discussão iv Maria João Fonseca e Fernando Tavares 1 Aceite para publicação em 17 de Janeiro de 2011. Publicado sob uma Licença Creative Commons

Ficha Técnica

Autores: Maria João Guimarães Fonseca Fernando Manuel dos Santos Tavares

Agradecimentos: FCT - Fundação para a Ciência e a Tecnologia, pela bolsa de Doutoramento atribuída a Maria João Fonseca (SFRH/BD/37389/2007).

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COMPOSTOS FITOACTIVOS: O EFEITO ANTIBIÓTICO DO ALHO

RESUMO Esta actividade prática baseia-se no estudo das propriedades antibacterianas do alho (Allium sativum L.) através do método de difusão em meio sólido - uma técnica microbiológica para avaliação da susceptibilidade a antibióticos. De uma forma apelativa e motivadora, pretende-se familiarizar alunos do terceiro ciclo do ensino básico e do ensino secundário com o conceito de substância bioactiva, antibiótico e biossegurança, entre outros. A temática abordada, focada numa aplicação ao controlo de microrganismos infecciosos com eventual aplicabilidade biotecnológica, encontra-se devidamente contextualizada nas orientações curriculares de ciências físicas e naturais e no programa de biologia para o 12º ano. O protocolo proposto está optimizado para ser exequível por alunos pouco experientes em trabalho laboratorial e/ou em escolas com recursos materiais e equipamento limitados. Apresenta-se um conjunto de materiais de apoio, que incluem apresentação introdutória, instruções procedimentais, proposta de tópicos de discussão e reflexão, exemplos de actividades de extensão e sugestões de avaliação.

DESCRIÇÃO DO MATERIAL Esta actividade foi adaptada a partir do protocolo concebido e optimizado pelos autores disponível em Fonseca, M. J. & Tavares, F. (2010). Natural antibiotics: a hands-on activity on garlic’s antibiotic properties. The American Biology Teacher (in press). O conjunto de materiais concebidos para a sua implementação inclui os seguintes documentos: - Apresentação introdutória à temática “Bactérias, doenças infecciosas e antibióticos” em versão original em inglês (vo) e versão traduzida (vp) (ficheiros .ppsx em anexo); - Guião com propostas de tópicos a serem discutidos com os alunos, para dinamização da reflexão acerca das questões abordadas (Anexo I); - Protocolo para o(a) Professor(a), com indicação do objectivo e finalidades da actividade, descrição das tarefas principais, listagem do material e equipamento necessário (com alternativas ao material de laboratório tradicional), instruções procedimentais detalhadas (incluindo esterilização de materiais e manutenção da biossegurança), informação complementar acerca dos processos em estudo e resultados previstos (Anexo II);

Compostos Maria fitoactivos: o efeito eantibiótico alho João Fonseca Fernandodo Tavares 3 Maria João Fonseca e Fernando Tavares Aceite para publicação em 17 de Janeiro de 2011. Publicado sob uma Licença Creative Commons

- Protocolo para o Aluno, com indicação do objectivo e descrição da actividade prática, instruções procedimentais das tarefas a realizar (com ilustrações esquemáticas) e aspectos relacionados com biossegurança (Anexo III); - Proposta de tópicos para discussão com os alunos, incluindo aspectos metodológicos e conceptuais a analisar (Anexo IV).

OBJECTIVOS Pretende-se que esta actividade contribua para que os alunos: - Demonstrem a presença de compostos com propriedades antibióticas existentes naturalmente em organismos vegetais; - Compreendam vários conceitos biológicos, tais como antibiótico, susceptibilidade a antibióticos e biossegurança; - Adquiram competências básicas no manuseamento e cultura de microrganismos; - Compreendam que as bactérias são seres vivos diversificados que interferem de formas variadas na vida dos seres humanos; - Desenvolvam a capacidade de reflexão e pensamento crítico, através da interpretação e discussão de resultados experimentais obtidos a partir de observações qualitativas.

NÍVEL ETÁRIO Esta actividade destina-se originalmente a alunos do 12º ano de escolaridade, embora possa ser adaptada a diversas faixas etárias, nomeadamente a alunos que se encontrem a frequentar o terceiro ciclo do ensino básico (9º ano de escolaridade).

CONTEXTUALIZAÇÃO E CONTEÚDOS ABRANGIDOS O cenário mundial de resistência a antibióticos A identificação e a produção de antibióticos em larga escala revolucionaram o tratamento de doenças infecciosas, o que permitiu um aumento significativo da longevidade e da qualidade de vida das populações humanas (Cebotarenco & Bush, 2008). Contudo, devido à capacidade das bactérias desenvolverem e transmitirem resistência a antibióticos, actualmente o combate às doenças infectocontagiosas está longe de ser uma tarefa simples e garantidamente bem sucedida. Com efeito, a crescente disseminação de casos de resistência a antibióticos tem vindo a constituir um problema de Compostos fitoactivos: o efeito antibiótico do alho Maria Fonseca e Fernando Tavares Maria JoãoJoão Fonseca e Fernando Tavares

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saúde pública de proporções avassaladoras. O papel desempenhado pelo público no que se refere à utilização de antibióticos é um factor determinante neste cenário de proliferação de resistência (Davey, 2002¸McNulty et al., 2007b; Orzech & Nichter, 2008; van de Sande-Bruinsma et al., 2008). À medida que os casos de resistência se sucedem, multiplicam-se também os estudos que descrevem a utilização inadequada de antibióticos e a relacionam com a resistência a estes compostos a nível individual e populacional (Albrich, 2004; van de Sande-Bruinsma et al., 2008; Buke et al., 2005; Cebotarenco & Bush, 2008; Orzech & Nichter, 2008). Verifica-se, por exemplo, que muitos indivíduos recorrem a antibióticos para tratar infecções víricas e respiratórias comuns, como gripes ou constipações (Belongia et al., 2005; Cebotarenco & Bush, 2008; McNulty et al., 2007a), o que revela importantes lacunas no conhecimento acerca da função e mecanismo de actuação dos antibióticos. Neste contexto, de modo a promover a educação para a saúde, torna-se necessário intervir na formação dos mais jovens (Lawson, 2008). Ao partir da discussão de um assunto sócio-científico actual que ilustra claramente o potencial e limitações de uma aplicação biomédica da biotecnologia, esta actividade cria oportunidades para discutir a importância das condutas individuais na promoção da saúde individual e colectiva, contribuindo para fomentar o desenvolvimento de atitudes responsáveis em relação à utilização de antibióticos.

Em busca de novas alternativas Para além da necessidade de desenvolver e implementar intervenções educativas, o cenário de resistência a antibióticos tem motivado a comunidade científica e a indústria farmacêutica a explorar fontes alternativas de compostos com potencial antimicrobiano, nomeadamente plantas aromáticas utilizadas com finalidades culinárias e terapêuticas (Demain, 2006; Ott & Morris, 2008, Saleem et al., 2010). Nas folhas, flores, bolbos, frutos e rizomas de plantas que utilizamos diariamente como ervas aromáticas e especiarias, nomeadamente salsa, orégãos, louro, pimenta e alho, existe uma grande variedade de compostos fitoactivos com propriedades antimicrobianas, incluindo ácidos, cetonas, terpenos e compostos fenólicos (Vigil et al., 2005). Muitos destes compostos têm vindo a ser incorporados em formulações de fármacos utilizados como aditivos na indústria alimentar (Sivam, 2001) e como co-adjuvantes de antibióticos comerciais, tais como a meticilina e a ampicilina (Cutler e Wilson, 2007; Perry et al., 2009). O desenvolvimento de actividades práticas focadas no efeito antibacteriano de compostos bioactivos extraídos de plantas utilizadas na alimentação é uma estratégia apelativa, que permite estimular a curiosidade dos alunos e o seu interesse em relação à exploração de recursos biológicos com eventual aplicação biotecnológica (Kidman, 2008; Shimabukuro & Haberman, 2006). Envolvendo-se activamente na realização de um

João Fonseca Fernando do Tavares CompostosMaria fitoactivos: o efeito eantibiótico alho 5 Maria João Fonseca e Fernando Tavares Aceite para publicação em 17 de Janeiro de 2011. Publicado sob uma Licença Creative Commons

procedimento de extracção e avaliação do efeito inibitório natural de compostos fitoactivos, os alunos têm oportunidade de desenvolver o raciocínio científico, de aperfeiçoar competências de trabalho laboratorial e de reflectir acerca de noções fundamentais relacionadas com o conceito de antibiótico (função, processo de produção, implicações), de susceptibilidade a antibióticos e de biossegurança, entre outras. Os exercícios propostos implicam a utilização de técnicas básicas de microbiologia, que permitem aos alunos contactar com procedimentos utilizados rotineiramente em laboratórios de investigação nesta área. Atendendo a que a realidade do contexto escolar diverge da do contexto científico profissional, o protocolo proposto foi devidamente adaptado com vista a garantir a exequibilidade da actividade em função da experiência dos alunos e das infra-estruturas, equipamento e materiais disponíveis na escola.

ENQUADRAMENTO CURRICULAR Esta actividade enquadra-se no programa de Biologia para o 12º ano de escolaridade, ao nível da terceira unidade temática IMUNIDADE E CONTROLO DE DOENÇAS, a qual, para além de focar mecanismos de defesa do organismo, incide no desenvolvimento de soluções biotecnológicas aplicadas ao diagnóstico e terapia de doenças (Direcção Geral da Inovação e Desenvolvimento Curricular [DGIDC], 2004). Adicionalmente, a abordagem de temáticas relacionadas com antibióticos também se enquadra nas sugestões metodológicas previstas para a quinta unidade temática PRESERVAR E RECUPERAR O MEIO AMBIENTE (DGIDC, 2004). A referência à utilização de antibióticos no controlo de doenças, permite aos alunos contactar com uma aplicação biomédica da biotecnologia que, aumentando a qualidade de vida dos indivíduos, tem repercussões a nível do contexto demográfico. A actividade está também enquadrada nas orientações curriculares de ciências físicas e naturais, concretamente no âmbito do quarto tema geral VIVER MELHOR NA TERRA, através do qual se pretende contribuir para que os alunos compreendam a relação entre saúde e qualidade de vida e tomem consciência do contributo do desenvolvimento biotecnológico para a promoção de ambas (Departamento de Educação Básica [DEB], 2001). Sugere-se que o tema Ciência e Tecnologia e Qualidade de Vida apresentado transversalmente ao longo as orientações curriculares para o terceiro ciclo do ensino básico, seja retomado, nomeadamente através da realização de projectos que abordem o fabrico e a utilização de fármacos numa perspectiva de risco/ benefício (DEB, 2001, p. 24).

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Para além da abordagem de exploração proposta, esta actividade potencia inúmeras possibilidades de extensão, incluindo por exemplo a sua adaptação a um formato de projecto. Exemplos de actividades de extensão e o seu enquadramento curricular estão disponíveis na devida secção deste documento.

SUGESTÃO DE IMPLEMENTAÇÃO Sugere-se que a actividade seja implementada segundo a organização apresentada na Figura 1. Salienta-se que a flexibilidade de realização das diversas etapas permite ajustar a actividade a diferentes esquemas e horários lectivos.

Compostos fitoactivos: o efeito antibiótico do alho U3. Imunidade e controlo de doenças 2. Biotecnologia no diagnóstico e terapêutica de doenças

Análise de resultados e Discussão

1 a 2 dias

60-90 min

Preparação de extractos aquosos de alho e Bioensaio 45 min

Preparação de meio de cultura* Introdução

45 min

Material

60-90 min - Apresentação “Bactérias, doenças infecciosas e antibióticos” - Guião de exploração da apresentação

- Protocolos do Professor e do Aluno

Teórico-prático

- Protocolos do Professor e do Aluno

Prático

- Proposta de tópicos de discussão

Teórico-prático

U5. Preservar e recuperar o meio ambiente 2. Crescimento da população humana e sustentabilidade

* A preparação do meio de cultura pode ser realizada previamente pelo(a) Professor(a), permitindo reduzir o tempo requerido para os alunos desenvolverem a actividade.

Figura 1. Proposta de estrutura de implementação da actividade com base nos materiais preparados e na contextualização temática no programa de biologia para o 12º ano (DGIDC, 2004).

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SUGESTÃO DE AVALIAÇÃO A avaliação das aprendizagens realizadas pelos alunos ao longo do desenvolvimento desta actividade deverá ter em consideração os seguintes aspectos: - Compreensão de conceitos básicos de microbiologia e biologia celular, tais como a noção de bactéria, célula, composto fitoactivo, e antibiótico, entre outras; - Desempenho de técnicas microbiológicas relacionadas com o manuseamento e cultura de bactérias; - Domínio e aplicação do raciocínio científico na interpretação e discussão de resultados e procura de alternativas para superar eventuais obstáculos. Neste sentido, durante as sessões teórico-práticas e práticas, os alunos devem ser encorajados a discutir as suas observações e opiniões e a propor estratégias alternativas para a resolução de limitações técnicas ou conceptuais com que se deparem ao longo de toda a actividade. Com o objectivo de sistematizar as aprendizagens, avaliar a retenção de informações e averiguar os conhecimentos desenvolvidos, o(a) Professor(a) pode solicitar aos alunos a elaboração de um relatório de actividade. Neste documento devem constar: uma breve fundamentação teórica, a(s) hipótese(s) testada(s), o design experimental, o registo e discussão dos resultados obtidos, as principais conclusões retiradas e as implicações desses resultados no contexto do tema em estudo. De modo a promover o debate, poderão ser organizadas breves apresentações (aproximadamente 10 minutos), em que os alunos apresentam os seus relatórios e discutem entre si os resultados das suas investigações.

SUGESTÕES DE EXTENSÃO O protocolo que serve de base a esta actividade (Fonseca & Tavares, 2010) pode ser adaptado a inúmeras outras actividades em função do ano de escolaridade considerado e da disponibilidade de tempo. Na Figura 2 são apresentados três exemplos de investigações ou experiências de extensão que podem ser desenvolvidas pelos alunos.

BIOSSEGURANÇA A componente prática das actividades deve ser realizada em sala reservada para o efeito. Não deverá ser permitido comer ou beber no local de realização das actividades. Os participantes devem usar bata e lavar bem as mãos antes e após a realização dos trabalhos. Durante as Compostos fitoactivos: o efeito antibiótico do alho Maria João Fonseca e Fernando Tavares Maria João Fonseca e Fernando Tavares 8 Aceite para publicação em 17 de Janeiro de 2011. Publicado sob uma Licença Creative Commons

actividades, todo o material que entrar em contacto com culturas bacterianas deve ser devidamente esterilizado antes de ser eliminado. Instruções detalhadas acerca de procedimentos de esterilização estão disponíveis no Protocolo do Professor (Anexo II). ACTIVIDADE/ INVESTIGAÇÃO

TEMAS/CONCEITOS

ENQUADRAMENTO CURRICULAR

ABORDADOS

Testar a susceptibilidade de diversas bactérias (nomeadamente utilizando isolados obtidos a partir de alimentos ou superfícies) ao extracto aquoso de alho.

- Diversidade biológica

Atendendo a que os únicos casos de resistência a extractos de alho foram identificados em bactérias que ocorrem naturalmente nesta planta (Shim & Kyung, 1999), a pesquisa de bactérias potencialmente resistentes pode ser motivante para os alunos.

Programa de Biologia e Geologia (10º ou 11º anos): Unidade inicial – Diversidade na biosfera (DGIDC, 2001) Programa de Biologia e Geologia (11º ou 12º anos): Unidade 7- Evolução biológica (DGIDC, 2003) Orientações curriculares para Ciências Físicas e Naturais: Unidade 1 Terra no Espaço – Terra; Um planeta com vida (DEB, 2001)

Analisar o mecanismo de síntese da alicina, o principal composto constituinte do extracto aquoso de alho A alicina é o principal composto com propriedades antimicrobianas presente nos tecidos dos bolbos de alho quando ocorre a sua lesão (por exemplo em caso de herbivorismo ou parasitismo). A danificação dos compartimentos celulares leva a que a enzima aliinase (localizada no vacúolo) entre em contacto com o precursor da alicina – aliina (localizado no citoplasma), catalisando a síntese do composto (Harris et al., 2001; Rahman, 2007). É possível realizar uma experiência muito simples, adaptando o protocolo proposto para esta actividade, de modo a substituir o extracto aquoso pela utilização de dentes de alho seccionados e dentes de alho intactos.

- Célula - Estrutura celular

Pesquisar a produção de compostos antimicrobianos naturais em diversos organismos vegetais A maioria das ervas e especiarias utilizadas na culinária são obtidas a partir de plantas que produzem compostos fitoactivos com propriedades antimicrobianas de interesse terapêutico. Uma investigação focada na identificação de organismos produtores de antibióticos naturais permite estimular a curiosidade e criatividade dos alunos. A responsabilização dos alunos pela concepção do esquema metodológico e experimental a implementar contribui para o desenvolvimento da sua capacidade de raciocínio científico.

Programa de Biologia e Geologia (10º ou 11º anos): Unidade inicial – Diversidade na biosfera (DGIDC, 2001) Orientações curriculares para Ciências Físicas e Naturais: Unidade 1 Terra no Espaço – Terra; Um planeta com vida (DEB, 201)

- Enzima - Reacção enzimática

Programa de Biologia para o 12º ano: Unidade 4 — Produção de alimentos e sustentabilidade (DGIDC, 2004)

- Mecanismo de defesa do hospedeiro

Orientações curriculares para Ciências Físicas e Naturais: Unidade 3 Sustentabilidade na Terra – Terra, um planeta com vida; Ecossistemas (DEB, 2001)

- Diversidade biológica

Adequado para projecto interdisciplinar, a ser desenvolvido ao nível do 9º ou 12º anos

- Potencial de recursos biológicos - Aplicações biotecnológicas com interesse para a saúde

Figura 2. Exemplos de actividades de extensão. João Fonseca Fernando do Tavares CompostosMaria fitoactivos: o efeito eantibiótico alho 9 Maria João Fonseca e Fernando Tavares Aceite para publicação em 17 de Janeiro de 2011. Publicado sob uma Licença Creative Commons

BIBLIOGRAFIA E RECURSOS ADICIONAIS RECOMENDADOS Para além do trabalho que serviu de base ao protocolo apresentado (Fonseca & Tavares, 2010) e dos restantes citados neste documento, sugere-se a consulta das seguintes fontes de informação acerca de extracção e utilização de antibióticos naturais e do contexto de resistência a antibióticos. Livros Ahmad, I., Aquil, F., & Owais, M. (2006). Modern phytomedicine. Turning medicinal plants into drugs. Weinheim: WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA.

Artigos Chizzola, R., Michitsch, H., & Franz, C. (2008). Antioxidative properties of Thymus vulgaris leaves: comparison of different extracts and essential oil chemotypes. Journal of Agricultural and Food Chemistr, 6 (16), 6897-6904. Krist, C. & Showsh, S.S. (2007). Experimental evolution of antibiotic resistance in bacteria. The American Biology Teacher, 69(2), 94-97. Nazzaro, F., Caliendo, G., Arnesi, G., Verones, A., Sarzi, P., & Fratianni, F. (2009). Comparative contento f some bioactive compounds in two varieties of Capsicum annuum L. sweet pepper and evaluation of their antimicrobial and mutagenic activities. Journal of Food Biochemistry, 33, 852-868. Souza, M.V.N. (2009). Promising candidates in clinical trials against multidrug-resistant tuberculosis (MDRTB) based on natural products. Fitoterapia, 80, 453-460. Sroka, Z. & Franiczek, R. (2008). Antiradical and antimicrobial activity of extracts obtained from plant raw materials. Advances in clinical and experimental medicine, 17(3), 275-283. Stanojevic, L.P., Stankovic, M.Z., Nikolic, V.D., & Nikolic, L.B. (2008). Anti-oxidative and antimicrobial activities of Hieracium pilosella L. extracts. Journal of the Serbian Chemical Society, 73(5), 531-540. Na Internet Biotechnology Australia (www.biotechnology.gov.au) The Wisconsin Programme for Scientific Teaching (http://scientificteaching.wisc.edu/#) NOVA Science Now Teachers (http://www.pbs.org/wgbh/nova/teachers/) PULSE: Promoting Understanding and Learning for Society & Environmental Health (http://pulse.pharmacy.arizona.edu/index.html) European Medicines Agency (http://www.ema.europa.eu/)

Referências Albrich, W., Monet, D., Harbarth, S. (2004). Antibiotic selection pressure and resistance in Streptococcus pneumoniae and Streptococcus pyogenes. Emerging Infectious Diseases, 10, 514-517. Belongia, E. A., Knobloch, M. J., Kieke Jr, B. A., Davis, J. P., Janette, C., & Besser, R. E. (2005). Impact of statewide program to promote appropriate anitmicrobial drug use. Emerging Infectious Diseases: Centers for Disease Control & Prevention (CDC). Buke, C., Hosgor-Limoncu, M., Ermertcan, S., Ciceklioglu, M., Tuncel, M., Köse, T., & Eran, S. (2005). Irrational use of antibiotics among university students. Journal of Infection, 51(2), 135-139. Cebotarenco, N. & Bush, P. J. (2008). Reducing antibiotics for colds and flu: a student-taught program. Health Education Research, 23(1), 146-157. Cutler, R. R., & Wilson, R. (2004). Antibacterial activity of a new, stable, aqueous extract of allicin against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. British Journal of Biomedical Science, 61(2), 71-74. Davey, C. P. & Hayes, A. (2002). The patient's role in the spread and control of bacterial resistance to antibiotics. Clinical Microbiology & Infection, 8(2), 43-68. Demain, A. (2006). From natural products discovery to commercialization: a success story. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 33(7), 486-495. Departamento de Educação Básica. (2001). Orientações curriculares do Ensino Básico - Ciências Físicas e Naturais. Lisboa: Ministério da Educação. Maria João Fonseca e Fernando Compostos fitoactivos: o efeito antibióticoTavares do alho 10 Maria João Fonseca e Fernando Tavares Aceite para publicação em 17 de Janeiro de 2011. Publicado sob uma Licença Creative Commons

Direcção-Geral de Inovação e Desenvolvimento Curricular. (2004). Programa de Biologia 12º ano. Curso Científico-Humanístico de Ciências e Tecnologias. Lisboa: Ministério da Educação. Direcção-Geral de Inovação e Desenvolvimento Curricular. (2001). Programa de Biologia e Geologia 10 ou 11º anos. Curso Científico-Humanístico de Ciências e Tecnologias. Lisboa: Ministério da Educação. Direcção-Geral de Inovação e Desenvolvimento Curricular. (2003). Programa de Biologia e Geologia 11 ou 12º anos. Curso Científico-Humanístico de Ciências e Tecnologias. Lisboa: Ministério da Educação. Harris, J. C., Cottrel, S. L., Plummer, S. & Lloyd, D. (2001). Antimicrobial properties of Allium sativum (garlic). Applied Microbiology and Biotechnology. 57, 282-286. Fonseca, M. J. & Tavares, F. (2010). Natural antibiotics: a hands-on activity on garlic’s antibiotic properties. The American Biology Teacher (in press) Kidman, G. (2008). Asking students: What key ideas would make classroom biology interesting? Teaching Science, 54(2), 34-38. Lawson, M. A. (2008). The Antibiotic Resistance Problem Revisited. The American Biology Teacher, 70(7), 405410. McNulty, C. A. M., Boyle, P., Nichols, T., Clappison, P. & Davey, P. (2007a). The public's attitudes to and compliance with antibiotics. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 60(1), 63-68. McNulty, C. A. M., Boyle, P., Nichols, T., Clappison, P. & Davey, P. (2007b). Don't wear me out--the public's knowledge of and attitudes to antibiotic use. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 59(4), 727-738. Orzech, K. M., & Nichter, M. (2008). From resilience to resistance: political ecological lessons from antibiotic and pesticide resistance. Annual Review of Anthropology, 37(1), 267-282. Ott, J., & Morris, A. M. (2008). Homeopathic alternatives to conventional antibiotics. BIOS, 79(2), 50-55. Perry, C. C., Weatherly, M., Beale, T., & Randriamahefa, A. (2009). Atomic force microscopy study of the antimicrobial activity of aqueous garlic versus ampicillin against Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Journal of the Science of Food and Agriculture, 89(6), 958-964. Rahman, M.S. (2007). Allicin and other functional active components in garlic: health benefits and bioavailability. International Journal of Food Properties, 10, 245-268. Saleem, M., Nazir, M., Ali, M. S., Hussain, H., Lee, Y. S., Riaz, N., et al. (2010). Antimicrobial natural products: an update on future antibiotic drug candidates. Natural Product Reports, 27(2), 238-254. Shim, S.T. & Kyung, K.H. (1999). Natural microflora of prepeeled garlic and their resistance to garlic antimicrobial activity. Food Microbiology. 16, 165-172. Shimabukuro, M. A., & Haberman, V. (2006). An aromatic adventure with allelopathy: using garlic to study allelopathy in the classroom. The American Biology Teacher, 68(4), 242-247. Sivam, G. P. (2001). Protection against Helicobacter pylori and other bacterial infections by garlic. The Journal of Nutrition, 131(3), 1106-1108. van de Sande-Bruinsma, N., Grundmann, H., Verloo, D., Tiemersma, E., Monen, J., … Ferech, M. (2008). Antimicrobial drug use and resistance in Europe, Emerging Infectious Diseases: Centers for Disease Control & Prevention (CDC). Vigil, A.L.M., Palou, E., & Alzamora, S.M. (2005). Naturally occurring compounds — plant sources. In P.M. rd Davidson, J.N. Sofos, & A.L. Branen (Eds.) Antimicrobials in foods (3 Ed.). (pp.429-452). Boca Raton, FL: Taylor & Francis Group, LLC.

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ANEXOS

Maria João Fonseca e Fernando Tavares Compostos fitoactivos: o efeito antibiótico do alho 12 Maria Joãosob Fonseca e Fernando Tavares Aceite para publicação em 17 de Janeiro de 2011. Publicado uma Licença Creative Commons

Anexo I Tópicos para introdução

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COMPOSTOS FITOACTIVOS: O EFEITO ANTIBIÓTICO DO ALHO

Tópicos sugeridos para introdução (com base na apresentação Bactérias, Doenças infecciosas e Antibióticos):

Diapositivo Bactérias: diversidade e abundância; simbiontes vs. patogénicas

2-5

Doenças infecto-contagiosas: impacto das bactérias

Doenças infecto-contagiosas: algum controlo permitido pelo aparecimento dos primeiros antibióticos

O que são antibióticos e como funcionam (visão global)

7-13

Exemplos de antibióticos naturais produzidos por bactérias (Streptomyces spp.): significado ecológico

As doenças infecto-contagiosas voltam a assumir relevância como questões de saúde pública a nível mundial

14-17

A resistência a antibióticos: o que significa e que mecanismos existem (visão global)

17-20

Diversidade de mecanismos consistente especificidade de actuação dos antibióticos

com

Factores que contribuem para a resistência a antibióticos Contextos de utilização desregrada

21, 22

Produção: poucos novos antibióticos + complexidade do processo de produção

23-28

Em busca de alternativas – antibióticos naturais: compostos activos presentes em alimentos

29-32

Para reflectir – proposta de protocolo pelos alunos

Extracto aquoso de alho: síntese de alicina – algumas noções pós-reflexão (mais informações sobre o processo de síntese de alicina disponíveis no protocolo para o(a) Professor(a)

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Anexo II Protocolo do Professor

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COMPOSTOS FITOACTIVOS: O EFEITO ANTIBIÓTICO DO ALHO Objectivo Avaliar o efeito antibiótico de extracto aquoso de alho, através do método de difusão em meio sólido.

Finalidades Os alunos vão: - familiarizar-se com um procedimento de extracção de compostos fitoactivos com propriedades antimicrobianas; - comprovar a existência de compostos com actividade antimicrobiana em plantas utilizadas em culinária; - aprender e praticar técnicas microbiológicas, nomeadamente relacionadas com o isolamento, cultura e manutenção de células bacterianas, bem como com a avaliação da susceptibilidade de organismos a compostos bioactivos; - discutir resultados obtidos a partir de observações qualitativas.

Sumário Os alunos investigam a existência de compostos bioactivos com propriedades antibióticas em extractos de alho ou outras plantas utilizadas no dia-a-dia com finalidades gastronómicas e/ou terapêuticas.

Descrição 12345-

Preparação, esterilização e plaqueamento do meio cultura; Preparação do inóculo bacteriano; Preparação de extracto aquoso de alho; Bioensaio; Observação e discussão dos resultados

Materiais (por turno de alunos) Preparação de meio de cultura 500 mL caldo de carne (pode ser solicitado a vários alunos) 3 provetas 100 ou 250 mL 3 funis 3 quadrados gaze 5 x 5 cm 3 frascos de vidro para meio de cultura (ex: matraz) mínimo 250 mL 12 g açúcar de mesa 2.5 g de sal de cozinha 7.5 g agar 1 balança 1 vidro de relógio ou papel para pesagem 1 espátula (ou colher de chá ou café)

Papel higiénico ou papel absorvente 6 “rolhas” de algodão esterilizadas 1 microondas Etanol (70%) 3 lamparinas e fósforos 6 placas de Petri 3 canetas de acetato 1 manga ou saco de plástico transparente Bioensaio Inoculação 3 culturas bacterianas* 3 frascos ou balões com 100 mL de água destilada esterilizada 6 tubos de ensaio ou Falcon esterilizados

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6 suportes de tubos de ensaio (ou 6 gobelés) 6 pipetas esterilizadas pelo menos 1 mL (para água destilada) e pró-pipetas 6 ansas de repicagem ou palitos compridos (de espetada) esterilizados 6 lamparinas e fósforos 6 pipetas de vidro 1 mL esterilizadas (para suspensão bacteriana) e pró-pipetas 6 pipetas de Pasteur esterilizadas (para suspensão bacteriana) 3 recipientes para resíduos biológicos líquidos com lixívia (20%) 3 canetas de acetato Preparação dos extractos Alhos 6 bisturis, lâminas ou facas esterilizadas 6 almofarizes ou esmagadores de alho esterilizados

1 balança 6 frascos de vidro (ex: gobelés) esterilizados 6 espátulas ou colheres esterilizadas 6 pipetas de vidro mínimo 1 mL esterilizadas (para água destilada esterilizada) e pró-pipetas 6 seringas 5 ou 10 mL esterilizadas 6 quadrados de gaze 1 x 1cm 6 tubos de ensaio esterilizados com “rolhas” de algodão esterilizado ou tubos Falcon esterilizados 6 lamparinas e fósforos 6 pipetas de Pasteur esterilizadas (para água – controlo) 6 pipetas de Pasteur esterilizadas (para extracto – controlo) Incubadora (a 37° C) Saco para resíduos biológicos sólidos *podem ser adquiridas através de fornecedores certificados, nomeadamente BCCMTM/LMG Bacteria Collection (http://bccm.belspo.be/about/lmg.php) ou obtidas a partir de isolados ambientais, por exemplo de alimentos e superfícies.

Esterilização de materiais Materiais de vidro, plástico, algodão e gaze podem ser esterilizados no microondas (2 ou 3 minutos) e armazenados em tupperwares (também esterilizadas no micro-ondas) até a sua utilização nas aulas. Os líquidos também podem ser esterilizados no microondas.

Biossegurança Os alunos deverão lavar bem as mãos antes e após a realização da actividade. Todos os procedimentos deverão ser realizados em superfícies previamente desinfectadas com etanol a 70%. No final da experiência todo o material que tiver estado em contacto com as culturas bacterianas deverá ser devidamente esterilizado antes de ser eliminado.

Procedimento 1. Preparação e esterilização do meio de cultura: Para preparar 250 mL de agar de carne: cozer 150 g de carne (vaca ou porco); depois de arrefecer, filtrar o caldo de carne através de gaze para um frasco de 1 L; adicionar 6 g de açúcar, 1.25 g de sal e 3.75 g de agar; misturar bem. Esterilizar o meio de cultura utilizando o microondas (900 W) durante cinco minutos (para evitar sobreaquecimento, o aquecimento deve ser descontínuo: recomenda-se a utilização de ciclos de 1 minuto de aquecimento intercalados com períodos de 30 segundos de arrefecimento). Para esterilizar o meio de cultura, os frascos devem ser fechados com uma rolha de algodão esterilizado. Quando o processo de esterilização estiver concluído, as rolhas devem ser substituídas por outras secas.

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2. Plaqueamento do meio de cultura Numa bancada recentemente desinfectada, colocar o meio de cultura nas placas de Petri, quando este estiver aproximadamente a 45-50° C (evitando a solidificação do agar). O agar solidifica a aproximadamente 42° C, pelo que este procedimento deverá ser realizado imediatamente a partir do momento em que a temperatura do frasco permita o seu manuseamento. Para reduzir o risco de contaminação, o procedimento deverá ser realizado na proximidade de uma lamparina acesa. Quando o meio estiver sólido, as placas devem ser invertidas e se não forem utilizadas no prazo de três ou quatro dias, armazenadas no frigorífico dentro de mangas plásticas, a fim de reduzir a desidratação. Placas armazenadas no frigorífico devem ser mantidas à temperatura ambiente pelo menos 24 horas antes de serem utilizadas. A fim de evitar a abertura acidental das placas, estas podem ser seladas com tiras de película aderente.

3. Preparação do inóculo bacteriano Preparar suspensões bacterianas, transferindo uma pequena quantidade de células de uma cultura em placa para um tubo com 5 mL de água destilada esterilizada, e agitando cuidadosamente para homogeneizar o conteúdo.

4. Preparação do extracto aquoso de alho Descascar e lavar em água corrente três ou quatro dentes de alho de tamanho médio. Esmagar os dentes de alho até obter entre 3 a 5 g de alho triturado e adicionar 3 a 5 mL de água destilada esterilizada (1:1). Depois de misturar, filtrar a solução através de uma seringa contendo gaze para tubos esterilizados. A alicina é o principal composto com propriedades antimicrobianas (antibacterianas, antifúngicas, antivíricas e antiprotozoáricas) produzido nos bolbos de alho (Allium sativum L.) (Rhaman, 2007). A alicina intervém em mecanismos de defesa da planta contra herbivorismo e parasitismo, sendo sintetizada através de uma reacção enzimática na qual estão envolvidos o precursor – aliina – e a enzima – allinase (Harris et al., 2001). A lesão das células permite que a enzima e o precursor, que normalmente se localizam em compartimentos celulares distintos (aliinase no citoplasma e aliina no vacúolo), entrem em contacto (Figura 1). A alicina é um composto extremamente reactivo e volátil, que é rapidamente removida do tecido, através da reacção com a própria enzima aliinase, sendo substituída por compostos mais simples, com menos poder antimicrobiano. Isto permite reduzir os danos causados nas células da própria planta (Ankri & Mirelman, 1999). A fim de evitar o desaparecimento do composto, o que resultaria num extracto com menor actividade antibacteriana, a preparação do extracto deverá ser realizada o mais rapidamente possível. Se o extracto não for utilizado imediatamente, deverá ser armazenado a -20° C. Nestas condições, o extracto manterá as suas propriedades durante pelo menos 3 meses. Para além do extracto aquoso de alho, podem também ser exploradas as propriedades antimicrobianas de formulações comerciais de alho, nomeadamente em óleo e pó. A alicina exerce a sua acção antimicrobiana ao interferir com grupos tiol (-SH) de proteínas essenciais, afectando processos metabólicos como Figure 1. Representação esquemática de céulas de bolbo de alho a síntese lipídica e a de RNA (Rhaman, 2007). (A-intacta e B-seccionada), ilustrando os compartimentos celulares nos quais se localizam a enzima (aliinase) e o precursor (aliina) envolvidos na síntese de alicina. Maria João Fonseca e Fernando Tavares 18 Aceite para publicação em 17 de Janeiro de 2011. Publicado sob uma Licença Creative Commons

5. Preparação das placas Transferir 1 mL de suspensão bacteriana para uma placa de meio; rodar cuidadosamente a placa fechada para distribuir a suspensão homogeneamente; deixar a placa inclinada durante cinco minutos e remover o excesso de suspensão com uma pipeta esterilizada. Deixar as placas repousar sem inverter durante cerca de cinco minutos (para permitir a adesão das células ao meio).

Legendar as placas

6. Bioensaio Com uma pipeta de Pasteur esterilizada, aplicar uma gota de água destilada esterilizada (aproximadamente 20 μL) num dos lados de cada placa (controlo). Aplicar uma gota de extracto no outro lado. Deixar as placas repousar sem inverter até a água e o extracto se difundirem. Incubar as placas em posição invertida durante 8 a 10 horas a 37° C. Resultados previstos Os alunos devem ser encorajados a fazer uma previsão dos resultados, que deverá ser confrontada com os resultados obtidos na sessão seguinte.

Susceptibilidade de Bacillus cereus ao efeito antibiótico de extracto aquoso de alho (20 µL; 1:1), registada após 24 horas de incubação à temperatura ambiente.

Medir os halos de inibição. Se comparadas diferentes bactérias e assumindo que a densidade do inóculo e a concentração do composto no extracto são idênticos, o diâmetro dos halos de inibição dá uma indicação da diferente susceptibilidade das bactérias estudadas ao composto.

controlo

extracto de alho

Referências Ankri, S. & Mirelman, D. (1999). Antimicrobial properties of allicin from garlic. Microbes and Infection, 2, 125-129. Harris, J.C., Cottrel, S.L., Plummer, S., & Lloyd, D. (2001). Antimicrobial properties of Allium sativum (garlic). Applied Microbiology and Biotechnology. 57, 282-286. Rahman, M.S. (2007). Allicin and other functional active components in garlic: health benefits and bioavailability. International Journal of Food Properties, 10, 245-268. Maria João Fonseca e Fernando Tavares 19 Aceite para publicação em 17 de Janeiro de 2011. Publicado sob uma Licença Creative Commons

Anexo III Protocolo do Aluno

Maria João Fonseca e Fernando Tavares Compostos fitoactivos: o efeito antibiótico do alho 20 Mariasob Joãouma Fonseca e Fernando Tavares Aceite para publicação em 17 de Janeiro de 2011. Publicado Licença Creative Commons

iii

COMPOSTOS FITOACTIVOS: O EFEITO ANTIBIÓTICO DO ALHO

Objectivo Avaliar o efeito antibiótico de extracto aquoso de alho, através do método de difusão em meio sólido.

Descrição 678910-

Preparação, esterilização e plaqueamento do meio cultura; Preparação do inóculo bacteriano; Preparação de extracto aquoso de alho; Bioensaio; Observação e discussão dos resultados.

Procedimento 1. Preparação e esterilização do meio de cultura Para preparar 250 mL de agar de carne: cozer 150 g de carne (vaca ou porco); depois de arrefecer, filtrar o caldo de carne através de gaze para um frasco de 1 L; adicionar 6 g de açúcar, 1.25 g de sal e 3.75 g de agar; misturar bem.

Esterilizar o meio de cultura utilizando o microondas (900 W) durante cinco minutos (para evitar sobreaquecimento, o aquecimento deve ser descontínuo: recomenda-se a utilização de ciclos de 1 minuto de aquecimento intercalados com períodos de 30 segundos de arrefecimento).

3. Preparação do inoculo bacteriano Preparar suspensões bacterianas, transferindo uma pequena quantidade de células de uma cultura em placa para um tubo com 5 mL de água destilada esterilizada e agitando cuidadosamente para homogeneizar o conteúdo. Maria João Fonseca e Fernando Tavares 21 Aceite para publicação em 17 de Janeiro de 2011. Publicado sob uma Licença Creative Commons

Deixar as placas repousar sem inverter durante cerca de cinco minutos. Legendar as placas. 6. Bioensaio Com uma pipeta de Pasteur esterilizada, aplicar uma gota de água destilada esterilizada (aproximadamente 20 μL) num dos lados de cada placa. Aplicar uma gota de extracto no outro lado.

Deixar as placas repousar sem inverter até a água e o extracto se difundirem. Incubar as placas em posição invertida durante 8 a 10 horas a 37° C.

BIOSSEGURANÇA Os participantes na actividade deverão lavar bem as mãos antes e após a realização da actividade. Todos os procedimentos deverão ser realizados em superfícies previamente desinfectadas com etanol a 70 %. No final da experiência todo o material que tiver estado em contacto com as culturas bacterianas deverá ser devidamente esterilizado antes de ser eliminado.

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Anexo III Tópicos para discussão

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COMPOSTOS FITOACTIVOS: O EFEITO ANTIBIÓTICO DO ALHO

Tópicos sugeridos para discussão: Os alunos deverão propor uma ou várias hipóteses para explicar os resultados obtidos, e confrontá-las com os resultados esperados enunciados durante a execução da componente prática. A partir deste ponto, aconselha-se a discussão dos tópicos seguintes.

Questões metodológicas -

Método de difusão em meio sólido: gradiente de antibiótico (relacionar diâmetro do halo de inibição e susceptibilidade) Extracto: influência da concentração e das propriedades do(s) composto(s) extraído(s); tempo de incubação/ visualização de resultados Solvente: justificação do controlo; sugestões para outros solventes Organismo modelo: uma bactéria = todas as bactérias? por exemplo, Gram+ = Gram-? Administração deste composto em formulação terapêutica (toxicidade selectiva; integridade, forma de administração) + tipos de testes a ser submetido (microbiológicos, animais, humanos) Transição

Questões conceptuais -

     

Noção de antibiótico Acção exclusiva sobre bactérias Origem natural (bactérias, fungos, compostos fitoactivos, …)/ sintética/ semi-sintética Significado ecológico Modo de funcionamento: diversidade + especificidade: espectro de acção (inespecíficos para patogénicos: a administração implica depleção das comunidades simbióticas susceptíveis ao espectro de acção do composto considerado) e toxicidade selectiva Função terapêutica e não profiláctica (antibióticos vs. vacinas) Características desejáveis num composto antibiótico para utilização terapêutica

Noção de resistência a antibiótico  Característica da bactéria  Causas: utilização desregrada (i.e. quando não é necessário, sem cumprir o plano de prescrição, automedicação) + número limitado de novos compostos naturais com propriedades antibióticas + processo de produção complexo -

Propostas para mitigar/ resolver o problema da resistência a antibióticos (condutas pessoais + alternativas no desenvolvimento de novos antibióticos)

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