Guia transducao de sinais 12

GUIA SUPLEMENTAR DE “TRANSDUÇÃO DE SINAIS OU UM GUIA TEÓRICO-PRÁTICO PARA COMPREENDER A COMUNICAÇÃO ENTRE CÉLULAS”

Apresentação do 12º ano Este guia suplementar visa fornecer aos professores um conjunto de informações que facilitem a apresentação por parte do docente. Estes materiais suplementares permitem ao docente ter um conjunto de informações mais abrangente, indo além das informações contidas na apresentação PowerPoint. Recomendamos que caso o docente ache que a apresentação é extensa demais face ao tempo disponível, apresente apenas um exemplo de cada uma das partes do II e III temas nas seguintes combinações: “Diferenciação celular na espermatogénese” + “Embriogénese – Egg Activation” + “Polidactilia” OU “Crescimento celular e apoptose” + “Imunidade – Citocinas na comunicação intercelular” + “Lúpus Eritematoso Sistémico”.

Slide 5 Neste slide é fulcral começar por referir que face à complexidade da organização biológica dos organismos, as células necessitam de comunicar constantemente para promover a homeostasia. Mais ainda, importa salientar que a origem dos sinais pode ser interna (e.g. aumento da frequência cardíaca, diminuição da pressão arterial, ansiedade) ou externa (luz, temperatura, etc.). Importa realçar que mesmo organismos unicelulares necessitam de comunicar com o meio para produzir respostas adequadas em resposta a variações do meio extracelular.

Os sinais são captados pelas células e induzem a produção de respostas que se esperam ser adequadas face ao estímulo inicial. Ao conjunto de processos que ocorrem nas células desde a captação do sinal até a produção da resposta (portanto desde a ligação do ligando ao recetor até à produção de efeitos celulares como a alteração do metabolismo) dá-se o nome de transdução de sinal. Tal corresponde à passagem da informação do sinal de um meio externo para o meio interno celular.

Slide 6 Neste slide importa realçar que a sinalização celular é um processo bastante complexo cuja função é a coordenação das funções celulares de diversas células. Para tal ocorrer é necessário a presença de 3 grupos de intervenientes (mensageiro primário, recetores e mensageiros secundário).

O Mensageiro Primário é a molécula sinalizadora, produzida por uma célula e libertado para o meio extracelular ou proveniente do meio externo (e.g. nutrientes, toxinas, etc) que que irá desencadear um efeito na célula-alvo.

Os Recetores são os elementos que captam o Mensageiro Primário. A ligação do Mensageiro Primário leva à ativação do Recetor que, por norma, ativa moléculas intracelulares denominadas Mensageiros Secundários. Estes determinam a propagação intracelular da resposta, a amplificação do sinal e a aquisição de alterações que permitam a execução de uma resposta adequada.

Importa ainda realçar que para que a resposta produzida não seja exacerbada é necessária a existência de mecanismos que permitam a terminação do sinal, por exemplo por degradação do ligando.

Slide 7 Este slide é bastante straight-forward.

Importa realçar que há uma relação entre o tipo de Mensageiro Primário e o tipo de comunicação celular. Por exemplo, a sinalização parácrina está mais associada a fatores de crescimento, neurotransmissão a neurotransmissores e as hormonas à sinalização endócrina. Todavia deve-se referir que a relação não é absoluta, podendo por exemplo encontrar-se casos de fatores de crescimento associados a sinalização endócrina ou a neurotransmissão. Importa referir que a sinalização autócrina está também associada primariamente a fatores de crescimento. Existe ainda um (sub-)tipo de sinalização que não se encontra referenciada, conhecida como sinalização apócrina que se verifica quando a sinalização parácrina produz efeitos em células da vizinhança que sejam de um outro tipo celular que não o da célula que produz o sinal.

Slide 9 Importante realçar que os principais critérios para diferenciar estas classes de substâncias são o local de produção e o local onde o efeito é produzido. Mais uma vez verificamos que uma molécula pode ser englobada em mais do que uma classe.

Slide 10 Os Recetores são por norma bastante específicos para o ligando, de modo a que apenas sejam ativados por um restrito número de estímulos. A presença de recetores numa célula determina a sensibilidade desta ao mensageiro primário. A regulação do número de recetores é um dos mecanismos que permite a uma célula aumentar ou diminuir a sua responsividade para um determinado ligando Os recetores extracelulares ligam substâncias hidrofilas como péptidos. Por norma apresentam um domínio extracelular, no qual a ligação ao ligando ocorre, um domínio transmembranar e um domínio intracelular que irá exercer o efeito intracelular (iniciar a transdução do sinal) aquando da sua activação.

Os recetores intracelulares ligam substâncias hidrofóbicas, como hormonas esteroides. Podem localizar-se no citoplasma ou no núcleo. Recetores nucleares tendem a atuar como fatores de

transcrição dependentes de ligando, ativando ou reprimindo a expressão génica perante a presença do mensageiro primário.

Slide 11 Na imagem encontram-se diversos mensageiros secundários necessários para a transdução do sinal associado à sinalização pela insulina. Apenas um número limitado de mensageiros secundários existem, sendo que a maior parte das comunicações intracelulares ocorrem usando um pequeno conjunto de mensageiros secundários, sendo cAMP e o cálcio alguns dos mais comummente usados.

Slide 13 O processo de espermatogénese envolve a passagem das células da linhagem germinativa por uma série de estágios intermédios. As células germinativas sofrem uma série de alterações estruturais e funcionais para originar o espermatozoide, uma célula altamente especializada que contém, entre outras especificidades, um longo e poderoso flagelo, um acrossoma, alterações no número e disposição dos organelos e reduzido citoplasma. A passagem entre as diversas fases envolve uma miríade de moléculas sinalizadoras que servem de trigger para desencadear as diversas alterações. A título de exemplo poderá referir-se o papel de certas hormonas como testetosterona, fulcral para a maturação do espermatídeo, citocinas como a interleucina1 envolvido na síntese de ADN e fatores de crescimento como o EGF e o TGFβ, associados ao desenvolvimento da espermatogónia

Slide 14 Quando os espermatozoides são libertados no epididimo estes apresentam-se completamente formados mas imóvies.

A aquisição da mobilidade ocorre no epididimo verificando-se uma inibição progressiva da fosfatase PP1gamma ao longo do epididimo, que determina alteração de diversas vias de sinalização e aquisição de mobilidade.

A aquisição de hipermotilidade ocorre apenas no aparelho sexual feminino, ao entrar em contato com subtâncias produzidas pelo oócito ou com hormonas sexuais como a testosterona

Slide 15 O ciclo celular divide-se em duas fase, a primeira das quais denominada interfase, fase na qual a célula cresce e multiplica o seu DNA e organelos, criando as condições propícias à Fase M de divisão celular e que se divide, por sua vez, em 3 fases. Na fase M dá-se a divisão do material genético e do citoplasma. A passagem entre as diversas fases do ciclo celular é particularmente bem regulada, assegurando que as condições necessárias para a fase seguinte se encontram reunidas e evitando a propagação de erros. A nível intracelular a progressão no ciclo celular é determinada por conjuntos de proteínas ciclinas e cinases dependentes de ciclinas que, de um modo diferencial, ativam a transcrição de certos genes. Todavia a regulação extracelular que determina alterações nestas proteínas é feita por meio de fatores de crescimento, hormonas e citoquinas que podem ter um efeito pró- ou anti-mitogénico.

A apoptose, por seu turno é um processo fisiológico e activo, no qual se dá a morte celular controlada de modo a eliminar células em excesso ou lesadas. A apoptose tem assim naturalmente de ser amplamente regulada. A origem do estimulo apoptótico pode ter origem intracelular (via intrínseca) geralmente por situações que determinam a desregulação da permeabilidade membrana mitocondrial. Há ainda a via extrínseca da apoptose, no qual o estimulo apoptótico é proveniente de células da vizinhança que detetam a necessidade de eliminar a célula em questão. Apesar de ambos ocorrer de forma diferente na sua origem, ambos levam a activação de proteases (caspases) que degradam uma série de proteínas essenciais à célula e determinam a fragmentação do núcleo e a morte celular controlada, levando à formação de corpos apoptóticos. A regulação superior deste processo é feita principalmente por fatores de crescimento.

Slide 16 O primeiro evento que ocorre após a fertilização do oócito II pelo espermatozoide tem o nome de egg activation. Um ligando apresentado pelo espermatozoide leva à ativação de uma cinase que determinará a proteólise de certas proteínas, nomeadamente ciclinas, securinas e coesinas. O oócito II, que ainda não havia terminado a segunda divisão mitótica, terminará então esse processo. A egg activation leva também à exocitose dos grânulos corticais que determinam alterações na zona pellucida que impedem a fertilização do oócito por mais espermatozoides, evitando a

poliespermia. Tudo isto é determinado pelo aumento drástico de cálcio intracelular em ondas, após a ligação do ligando.

Slide 17 A comunicação por via das citocinas envolve a ligação das citocinas aos recetores. Tal ligação ativa as cinases JAK que fosforilam e ativam os transdutores de sinal STAT. Os STATs dimerizam e são translocados para o núcleo onde actuam como fatores de transcrição de certos genes.

Slide 18 Uma enorme variedade de citocinas existe, com diferentes funções e produzidas por diferentes células. Algumas encontram-se associadas à imunidade inata, enquanto outras à imunidade adaptativa. Por exemplo, as citocinas do tipo interferão-α são produzidas por macrofagos e entre as suas funções conta-se a ativação de células NK (linfócitos Natural Killer) e indução de um estado antiviral na maioria das células nucleadas.

Slide 20 A polidactilia é uma anomalia congénita na qual o indivíduo afetado apresenta um número excessivo de dedos nos pés ou nas mãos. Pode ter uma origem teratogénica (exposição a certas substâncias nocivas durante o desenvolvimento embrionário) ou genética, sendo que pode fazer parte de certas síndromes ou situações isoladas (menos comum). Durante a embriogénese a comunicação correta entre as células é fulcral para que o feto seja normal. Assim alterações em certas proteínas da sinalização celular foram documentadas como estando associadas ao desenvolvimento de polidactilia, nomeadamente proteínas das vias do TGFβ e FGF e no recetor da hormona Paratiroideia (PTH)

Slide 21 Tratando-se o LES sistémico de uma doença multifactorial é natural que tenham sido identificado muitos fatores de risco associados a esta doença. Sendo vista como uma doença auto-imune, alterações em

diversas proteínas associadas à imunidade (quer inata, quer adquirida) foram identificadas, nomeadamente em recetores e nos transdutores de sinais das citocinas.

Slide 22 A deteção de mutações é parte importante para determinar quais dos elementos de uma via de sinalização se encontram alterados ao nível do ADN. Caso a alteração seja num único nucleótido várias técnicas podem ser aplicadas. A sequenciação permite conhecer toda a sequência do gene e identificar alterações mesmo em locais não esperados.

O sequenciador pode, por exemplo, detetar qual o nucleótido em cada posição por estes se encontrarem marcados com fluorescência de diferentes comprimentos de onda. Para detetar uma mutação que seja frequente, por exemplo associada a uma determinada doença, é possível utilizar a restrição enzimática, no qual enzimas de restrição fragmentam o ADN se o local de corte se encontrar intacto. Todavia na existência de mutações a restrição não ocorre e o fragmento gerado será maior e facilmente identificado numa electroforese como tendo um maior peso molecular. Mutações cromossómicas, todavia, são geralmente identificáveis pela análise do cariótipo, isto é, número, forma e padrão de bandas dos cromossomas, que permitem identificar trissomias, grandes deleções, inversões entre outras situações.

Slide 23 Frequentemente é necessário avaliar a existência de alterações de proteínas numa determinada via de sinalização, por exemplo após adição de um componente ou mutação induzida de um interveniente. Estes estudos proteicos prendem-se muitas vezes com a avaliação da expressão (Western Blotting), localização (imunocitoquímica) ou interacções proteicas formadas (co-imunoprecipitação).

No Western Blotting as proteínas são separadas inicialmente por electrofose gel de poliacrilamida de acordo com o seu peso molécular. Posteriormente as protíinas são transferidas para um suporte sólido (nitrocelulose). A detecção da proteína de interesse dá-se por meio de anticorpos marcados (p.e. quimioluminescentes). A largura da banda é proporcional à quantidade de proteína existente, pelo que é possível efectuar-se uma quantificação relativa.

Na imunocitoquímica a localização das proteínas de interesse é detectada por meio de anticorpos fluorescentes, sendo utilizado um microscópio de fluorescência para visualizar os resultados.

Na co-imunoprecipitação, a proteína de interesse é precipitada (p.e. com auxílio de beads magnéticas) e, assim, isolada das restantes proteínas da mistura proteica extraída das células/tecidos. Posteriormente, o conteúdo precipitado é separado num gel de poliacrilamida e as proteínas aí identificadas (p.e. por Western Blotting ou por espectrometria de massa) estavam ligadas à proteína de interesse e, por tanto, interagem.