Marcadores geneticos by Casa Ciências

Marcadores Genéticos Diana Lobo & Cristina Aguiar, 2013

Dossiê do Estudante

Marcadores Genéticos

Diana Lobo & Cristina Aguiar, 2013

Índice

Introdução Eletroforese Marcadores Bioquímicos Marcadores de DNA Marcadores baseados em restrição e hibridação de sequências de DNA RFLPs

Microssatélites AFLPs SNPs

DNA mitocondrial Aplicações dos marcadores genéticos Estudos de processos demográficos Testes de paternidade e estudos forenses (DNA fingerprinting) Estudos de mapeamento genético Análise filogenética e sistemática

Bibliografia Conclusão

Créditos imagéticos

8 6

Minissatélites Marcadores baseados em PCR RAPDs

3 5 6 2

10 11 12 13 14 16 10

16 17

18 18 20 21 17

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I. Introdução

Tornar possível a distinção entre os genótipos que são relevantes, por possuírem (ou darem origem a uma determinada característica de interesse), é a meta em genética. Muitas vezes, esta distinção não se baseia direta e exclusivamente nas características de interesse, mas antes num sistema de marcadores informativos. Um marcador informativo é um marcador genético que providencia informação acerca da variação alélica num determinado locus. Por definição, um marcador genético é qualquer variação na sequência do DNA de um ser vivo que o distingue de outro indivíduo -‐ ou grupo de indivíduos – ou que permite a identificação de uma característica especifica inerente a esse ser (Schlotterer, 2004). Dois pontos de vista principais devem ser considerados aquando da seleção de um marcador: (i) segundo a perspetiva molecular o procedimento laboratorial deve ser fácil de reproduzir e o mais económico possível, de forma a que seja possível obter o maior número possível de amostras de uma forma rápida e barata e (ii) na perspetiva estatística algumas características são importantes num marcador, como as relações de dominância, o conteúdo informativo, a neutralidade e a independência genética (Vignal et al., 2002). Seja qual for o sistema escolhido, os dados obtidos devem ser o mais fiáveis e semelhantes ao real quanto possível. Até meados da década de 60, os marcadores utilizados em estudos de genética e melhoramento eram controlados por genes associados a caracteres morfológicos. Tais características fenotípicas de variação discreta são utilizadas como marcadores morfológicos desde o tempo de Mendel, como fenótipos de fácil identificação visual (por exemplo: deficiência clorofilina, cor das pétalas ou morfologia foliar). Existe uma ampla gama de marcadores morfológicos (ou fenotípicos) para as diferentes espécies de plantas, sendo contudo insuficientes para mapeamento genético ou outras aplicações em biologia molecular. O número reduzido e a natureza dos marcadores morfológicos restringiram os estudos dos caracteres quantitativos às espécies onde havia sido alcançada uma caracterização genética substancial, sendo que, para além disso, ainda são afetados pela ação génica de dominância, pelo efeito do ambiente e epistasia (Dantas & Nodari, 2002). O primeiro mapa genético a ser construído, pertencente a Drosophila melanogaster, foi baseado em marcadores morfológicos. No entanto, a biologia molecular tem assumido avanços notáveis neste campo, permitindo desenvolver um número crescente de marcadores genéticos, cada vez mais inovadores, e que, por sua vez, têm sido aplicados em muitas áreas da Biologia: no mapeamento genético individual ou ao nível das populações, reconstruções filogenéticas, testes de paternidade e aplicações em genética forense (Schlotterer, 2004). Neste contexto, determinadas mudanças da popularidade dos marcadores moleculares ao longo do tempo podem ser facilmente entendidas. Um dos exemplos mais claros é o da substituição dos RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphims – ou fragmentos polimórficos de DNA) pelos microssatélites no mapeamento genético de espécies animais e de humanos. Na verdade,

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o primeiro e mais importante esforço para desenvolver mapas genéticos de humanos foi desenvolvido utilizando, maioritariamente, RFLPs, dado serem os marcadores genéticos melhor conhecidos na altura (Keller et al., 1987). A visão geral é que o aumento ou a perda de popularidade dos diferentes marcadores refletem o contínuo melhoramento na área, em que os marcadores mais atuais/ úteis serão os mais informativos. Os “novos“ marcadores genéticos podem agrupar-‐se em duas grandes classes: Marcadores Bioquímicos -‐ baseados nas propriedades de migração das proteínas e Marcadores de DNA -‐ em que o polimorfismo é detetado na sequência do DNA. O princípio básico envolvido na obtenção/deteção de cada classe de marcador, bioquímico ou de DNA, reside no uso da técnica de eletroforese para a sua separação (Dantas & Nodari, 2002).

II. Eletroforese

O termo eletroforese foi criado por Michaelis, em 1909, para descrever a migração de coloides sob a influência de um campo elétrico. O princípio desta técnica é bastante simples (Figura 1): as moléculas de carga negativa migram para o pólo positivo e moléculas com carga positiva migram para o polo negativo (Dantas & Nodari, 2002).

Preparação dos géis de agarose

Aplicação do DNA no gel de agarose

Eletroforese

Visualização do gel Imagem do gel M: marcador de pesos moleculares; A-‐X: amostras de DNA

Figura 1. Ilustração das etapas realizadas na eletroforese em gel de agarose.

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A eletroforese permite a separação de moléculas em função da carga elétrica, do peso molecular e da conformação, em suportes porosos (géis) e soluções tampão (que estabilizam o pH do meio e permitem o fluxo da corrente elétrica). Na prática, a eletroforese consiste na extração de amostras -‐ seja de proteínas, enzimas ou DNA -‐ e na sua migração num gel (amido, agarose ou acrilamida) submetido a uma corrente elétrica continua. O sentido e a velocidade da migração são determinados pelo tamanho e carga das amostras a separar. Por exemplo, quanto maior a carga elétrica de uma proteína, mais rápida é a sua migração no gel em direção ao elétrodo de carga contrária e quanto mais pequeno for o fragmento da proteína mais rápida será a sua migração no gel (fragmentos mais pequenos aparecem no fundo do gel) (Hirata & Hirata, 1999). A eletroforese pode ser desenvolvida em suportes como papel de filtro, sílica gel, membranas de acetato de celulose e géis de agarose, de amido ou de poliacrilamida (Figura 2). Para enzimas, géis de amido e de poliacrilamida oferecem melhor separação do que outros suportes. Para marcadores de DNA os mais utilizados são os géis de agarose e de poliacrilamida (Hirata & Hirata, 1999).

Figura 2. Sistema de eletroforese horizontal.

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III. Marcadores Bioquímicos

Numerosos métodos têm sido utilizados in vitro para caracterizar as proteínas. Polipeptídeos que apresentam pesos moleculares distintos podem ser separados em gel de poliacrilamida através da eletroforese de duas dimensões (2D -‐ eletroforese), que tem a capacidade de separar as proteínas explorando o seu ponto isoelétrico (carga), numa das dimensões, e o peso molecular (tamanho/conformação) na outra dimensão. As diferentes variantes aparecem como distintas bandas num gel. As isoenzimas, agora denominadas marcadores bioquímicos, foram desenvolvidos na década de 60 do século passado, sendo definidas como diferentes formas moleculares (variantes) de uma mesma enzima, que apresentam função idêntica ou similar e estão presentes num mesmo indivíduo; no entanto, em muitos casos, estes marcadores são também utilizados para distinguir proteínas não enzimáticas (Markert & Moller, 1959). Comumente, muitas enzimas existem em múltiplas formas moleculares, mas apresentam a mesma especificidade. A metodologia usada no caso destes marcadores consiste na utilização da eletroforese em gel de amido ou poliacrilamida e na visualização do produto enzimático por métodos histoquímicos (Hunter & Market, 1957). As distintas bandas observadas no gel representam diferentes formas moleculares que apresentam diferentes propriedades de mobilidade eletroforética. Subsequentemente, a posição de uma enzima no gel pode ser verificada pela sua atividade, que é detetada por um sistema de revelação colorimétrica. Este sistema inclui reagentes específicos para revelar uma determinada enzima através de uma dada reação, levando ao aparecimento de uma ou mais bandas no gel. Com esta técnica, o estudo da variabilidade genética de populações de uma dada espécie será baseada na variação observada nas isoenzimas (Dantas & Nodari, 2002). As vantagens dos marcadores bioquímicos sobre os marcadores morfológicos são: (i) determinação genotípica, (ii) ausência de efeitos deletérios, (iii) ocorrência de um número razoável de alelos, (iv) herança mendeliana simples com codominância entre alelos na maioria dos loci e (V) ausência de efeitos epistáticos e ambientais. As isoenzimas encontram a sua principal aplicação nos estudos de diversidade genética e evolução que têm sido extremamente importantes para a investigação em áreas como a variação intraespecífica, a genética de populações, também na evolução e mapeamento genético (Dantas & Nodari, 2002). Vários estudos anteriores em humanos e em Drosophila melanogaster têm mostrado polimorfismos substanciais nas populações naturais dessas espécies. Este elevado polimorfismo detetado dentro das populações levou a teorias de evolução molecular baseadas em mutações neutrais. Este avanço foi, provavelmente, o maior legado deste tipo de marcadores. Desde essa altura, as isoenzimas têm sido utilizadas com sucesso em inúmeras espécies; no entanto, o número de loci informativos que se pode obter com estes marcadores é muito reduzido, tornando muito difícil a utilização de isoenzimas no

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mapeamento genético. Desta forma, os estudos de diversidade genética ficavam muito limitados quando baseados apenas no polimorfismo das proteínas, sendo por isso necessário o desenvolvimento de novas técnicas, como foi o caso dos marcadores genéticos baseados em polimorfismo de DNA (Schlotterer, 2004).

IV. Marcadores de DNA Um dos aspetos mais críticos apontado à utilização dos marcadores bioquímicos foi o facto de ser um método indireto e insensível na deteção da variação do DNA. Por oposição, um outro aspeto importante da utilização de marcadores de DNA, em vez dos bioquímicos, é o de permitirem a quantificação de mutações entre os diferentes alelos (Schlotterer, 2004). Os marcadores de DNA podem ser agrupados em duas classes principais: marcadores baseados em restrição e hibridação de sequências de DNA e marcadores baseados em PCR, a técnica da reação de polimerização em cadeia (do inglês polymerase chain reaction) (Dantas & Nodari, 2004). A frequência de alelos partilhados, os alelos privados e as distâncias evolutivas entre os alelos, são os parâmetros que podem ser medidos quando se pretende estudar a variação genética (Schlotterer, 2004).

1. Marcadores baseados em restrição e hibridação de sequências de DNA a) RFLPs (restriction fragment length polymorphism) As variações nos nucleótidos do DNA, devido a mutação, deleção, inserção e inversão, podem ser detetadas se ocorrerem num local de corte das enzimas de restrição. Quando diferentes moléculas de DNA são expostas a enzimas de restrição, fragmentos de diferentes tamanhos, portanto polimórficos, são gerados e podem ser identificados e clonados. Tais fragmentos são denominados de RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphims – ou fragmentos polimórficos de DNA). Os fragmentos polimórficos de DNA correspondem a loci no DNA que podem ser identificados e mapeados (Wu et al., 1998). Os RFLPs têm permitido uma cobertura adequada do genoma, proporcionando a construção de mapas genéticos, que possibilitam a realização de análises genéticas e moleculares e várias aplicações no melhoramento de plantas, como clonagem de genes e mapeamento genético. O elevado custo e o tempo necessário na geração destes marcadores têm restringido o seu uso de forma frequente (Gharrett & Gray, 2001). A obtenção de RFLPs envolve várias etapas (Figura 3). Em primeiro lugar é necessário extrair e purificar o DNA de um indivíduo. Em seguida, este DNA deve ser digerido por enzimas

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de restrição que são capazes de reconhecer um pequena sequência de pares de bases e então clivar o DNA nesse local de reconhecimento ou clivagem. A terceira etapa do processo consiste em separar esta mistura de fragmentos de diferentes comprimentos através da eletroforese em gel de agarose. A migração dos fragmentos de DNA no gel é dependente do seu tamanho. Subsequentemente, os fragmentos de DNA em cadeia simples (após tratamento com hidróxido de sódio), são transferidos para uma membrana de nylon ou celulose (carregada positivamente), técnica que é denominada de Southern blotting, e que proporciona um suporte sólido para o DNA que passa a estar imobilizado neste suporte. A próxima etapa consiste na hibridação do DNA já imobilizado na membrana com uma sonda (ou probe) -‐ que pode ser um fragmento de DNA do próprio organismo -‐ complementar ao fragmento de interesse. Para que haja hibridação, é necessário que pelo menos parte da sonda seja complementar ao fragmento de interesse a identificar.

Figura 3. Ilustração das etapas realizadas em protocolos de RFLPs: 1 – extração do DNA das amostras e purificação; 2 -‐ tratamento com enzimas de restrição; 3 – eletroforese; 4 – transferência dos fragmentos de DNA do gel para a membrana; 5 – colocação da sonda marcada, neste caso com radioatividade; 6 – remoção da membrana de nylon e das sondas que não se ligaram e 7 – revelação do filme.

A fim de assegurar a deteção da hibridação, a sonda deverá estar marcada, por exemplo com radioatividade, embora existam outras alternativas de marcação. Na última etapa, a autoradiografia, a membrana hibridada com a sonda radioativa é exposta a um filme de Raio X. A sonda, sendo radioativa, emite radiação que pode ser detetada por

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filmes de Raio X, sendo posteriormente impressionado apenas nos locais onde ocorreram hibridações. Já que a sonda só híbrida com fragmentos complementares, a precisão é elevadíssima (Dantas & Nodari, 2002). As sequências genómicas de dois organismos da mesma espécie são muito parecidas. Entretanto, os mesmos organismos podem sofrer alterações a nível do DNA (mutações simples, rearranjos e recombinação), as quais podem ocasionalmente alterar a sequência ou substituir bases azotadas num ou mais locais de reconhecimento de uma determinada enzima de restrição. Numa população, estas variações podem ocorrer num indivíduo e não em outro. Tais diferenças (que normalmente são denominadas de variação genética) produzem fragmentos de DNA de diferentes tamanhos (polimorfismo de comprimento do fragmento) quando o DNA é exposto a estas enzimas (Gharrett & Gray, 2001). Estes fragmentos vão apresentar diferentes posições na membrana, e posteriormente também ocuparão diferentes posições no filme (indicação de existência de polimorfismo ao nível do DNA). Estes fragmentos, apresentam herança mendeliana e são denominados de alelos. Na deteção destas diferenças reside uma das principais características da técnica do RFLP (Dantas & Nodari, 2002). Os RFLPs mais informativos são aqueles cuja sequência ocorre somente uma vez no genoma, denominados de cópia única (single copy), sendo específicos. Como estes genes aparecem uma só vez no genoma, apenas uma banda será detetada nos indivíduos homozigóticos (Dantas & Nodari, 2002). Os RFLPs nucleares exibem codominância, ou seja, é possível distinguir os indivíduos homozigóticos entre si e estes dos heterozigóticos. Pleiotropia e epistasia (fatores que afetam a resolução dos marcadores morfológicos) não têm o menor efeito sobre os RFLPs. Além disso, os RFLPs apresentam alta estabilidade, representando uma fonte de informação genotípica segura (Dantas & Nodari, 2002). Uma das desvantagem assinaladas nesta técnica é que requer, no mínimo, 20 nanogramas de DNA purificado e intacto para a realização de uma análise, o que limita a utilidade do método em casos criminais, uma vez que o DNA presente nas provas pode existir em muito pequena quantidade ou apresentar-‐se danificado. Outra desvantagem é que os fragmentos de restrição obtidos são frequentemente muito extensos, dificultando a distinção das bandas após eletroforese. Devido a estas desvantagens a técnica RFLP deixou de ser utilizada e há muito que está ultrapassada, sendo agora substituída pela utilização de microssatélites (Schlotterer, 2004). b) Minissatélites ou loci VNTR (variable number of tandem repeats) Os minissatélites ou loci VNTR (Variable Number of Tandem Repeats – número variável de sequências repetidas) são regiões dispersas no genoma que contêm um número variável de sequências de DNA repetidas (em série ou em tandem (sequência) e que apresentam um núcleo comum de 10 a 15 pares de bases (Figura 4). Podem ser analisados tanto através de RFLPs como utilizando a técnica PCR. Muitos dos

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minissatélites são altamente polimórficos, produzindo um grande número de bandas, no entanto, tendem a ser muito instáveis, sendo que o número de cópias de uma dada sequência frequentemente aumenta ou diminui entre gerações, não se mantendo constante. Por estarem espalhados por todo o genoma e apresentarem um número variável de repetições em diferentes indivíduos em relação a uma mesma região cromossómica (locus), são muito utilizados como marcador genético para identificar indivíduos em casos criminais ou em testes de paternidade, sendo por isso também denominados de perfis de DNA (DNA fingerprinting) (Dantas & Nodari, 2002). A expressão (transcrição) de genes vizinhos aos minissatélites pode ser altamente afetada pelas mudanças nas sequências dos minissatélites, o que pode levar a graves consequências, por exemplo, mudanças de determinados loci de minissatélites têm sido apontados como uma possível causa para o aparecimento de cancro ou da diabetes. Os seus maiores contributos para biologia molecular passam por permitirem seguir taxas de mutação, localizar regiões especificas para splicing alternativo e regulação na expressão génica (Seixas, 2011). Para a obtenção do padrão de bandas utiliza-‐se o mesmo procedimento utilizado para o RFLP, com a exceção de que a sonda não contém repetições de sequência conhecida.

Figura 4. A – Esquema de regiões VNTRs em quatro alelos; B – Gel de agarose de regiões VNTR em alelos de 18 indivíduos, sendo possível observar a variação do seu comprimento.

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2. Marcadores baseados em PCR (polymerase chain reaction – reação de polimerização em cadeia) a) RAPDs (randomly amplified polymorphic DNA) Na década de 80, surgiu um novo tipo de marcador molecular denominado de RAPDs (Randomly Amplified Polymorphic DNA – DNA Polimórfico amplificado aleatoriamente). Em relação aos RFLPs, os RAPDs são mais baratos, requerem menos tempo e não necessitam de radioisótopos (Singh et al., 2004). O princípio dos RAPDs está igualmente baseado na identificação de diferenças a nível de DNA, no entanto, a metodologia é totalmente diferente daquela dos RFLPs e baseia-‐se na reação de polimerização em cadeia (PCR). Esta reação foi concebida em 1983 Por Kary Mullis, passando a ser utilizada de forma rotineira a partir de 1988. Este método permite a amplificação de um fragmento de DNA, normalmente até 4.000 pb, ou até 30 kb. Para amplificar DNA é necessário um ou mais primer(s) (ou iniciadores de replicação) -‐ um oligonucleótido de aproximadamente 10 bases que se liga às sequências complementares nas cadeias simples de DNA a amplificar, que por sua vez foram previamente separadas pelo aumento da temperatura (92-‐94°C). A ligação entre os primers e as sequências complementares é efetuada a uma temperatura de 35 a 50°C. A Taq DNA Polimerase estende (ou sintetiza) as cadeias iniciadas pelos primers, a uma temperatura ótima de 72°C. Existem máquinas programáveis de PCR, os termocicladores, capazes de modificar a temperatura rapidamente e criar programas que permitem ajustar as diferentes variantes (temperatura, ciclos, volume) de acordo com o objetivo final. Na realidade, cada ciclo do PCR é composto por três etapas que se repetem: a separação da cadeia dupla do DNA (a 92-‐94°C), a ligação dos primers com o DNA (entre 35 a 50°C) e a extensão ou polimerização da cadeia (a 72°C) (Figura 5). Os tempos utilizados em cada fase são aproximadamente de 1, 1 e 2 minutos, respetivamente. O número de fragmentos amplificados duplica a cada ciclo. Sucessivos ciclos produzem milhões de fragmentos virtualmente idênticos, em apenas algumas horas. Os produtos do PCR podem ser posteriormente visualizados num gel de agarose (Hirata & Hirata, 1999). Os RAPDs têm facilitado a realização de estudos em genética, considerados até então inexequíveis com as técnicas tradicionais. Através dos RAPDs é possível revelar diversos loci dispersos pelo genoma, sem que seja necessário um conhecimento prévio da informação de sequências alvo, não requerendo um sistema especial para a revelação dos polimorfismo (ao contrário, por exemplo, do que se passa na hibridação, onde a utilização de sondas é necessária). Uma diferença entre dois indivíduos que ocorra ao nível do DNA na região de ligação do primer é identificada pela ausência da referida banda em um deles e presença da banda no outro, no entanto não é levado em conta o motivo pelo qual o fragmento não foi amplificado, o que é limitante para uma análise mais precisa. No caso de indivíduos heterozigóticos, estes produzem as mesmas bandas que os homozigóticos, sendo os marcadores RAPDs dominantes (Kovács et al., 2001). Para além

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de não permitirem uma análise com elevado grau de precisão, esta técnica requer elevada experiência em técnicas moleculares, uma vez que a preparação das reações exige cuidados extremamente rigorosos, bem como mestria ao nível da leitura e análise dos fragmentos que serão posteriormente visíveis no gel, o que pode ser vito como desvantagem (Seixas, 2011). Figura 5. Ilustração das etapas realizadas na PCR: 1– desnaturação da cadeia dupla de ADN; 2 – ligação dos primers às cadeias simples de DNA e 3 – extensão da cadeia.

b) Microssatélites ou STR (short tandem repeats) Entre as diversas sequências repetidas em tandem, algumas são simples, formadas por um ou poucos nucleótidos. Tais repetições curtas em tandem ou STR (do inglês Short Tandem Repeats) são denominadas microssatélites. Os microssatélites são pequenos fragmentos repetitivos abundantes no genoma eucariótico que exibem repetições em séries com cerca de dois a seis pares de bases (Figura 6). São marcadores codominantes e altamente multialélicos, de elevado polimorfismo, apresentando o maior conteúdo informativo por locus dentro de todas as classes de marcadores moleculares (Schlotterer, 2004). São bastante frequentes no genoma humano, ocorrendo a cada 1000 a 2000 pares de bases, característica que permite a análise desde indivíduos até espécies proximamente relacionadas (Brohede & Ellegren, 1999). A principal causa da enorme

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variação no número de repetições dos microssatélites é o deslizamento (slippage) da DNA polimerase durante o processo de replicação do DNA.

Gel

Bandas das amostras de DNA A e B

Sequências dos microssatélites

Figura 6. Exemplo de uma análise utilizando microssatélites. As bandas que se situam no fundo do gel correspondem a fragmentos mais pequenos comparativamente aos que ficam na parte superior do gel (distinção baseada no tamanho).

A utilização dos microssatélites está associada a custos e esforços iniciais elevados uma vez que há necessidade de amplificar a região de interesse, sequenciá-‐la e, por fim, sintetizar os primers específicos para o locus respetivo (este locus poderá depois ser utilizado indefinidamente para essa espécie). Pelo contrário, o custo subsequente à fase inicial é baixo e o procedimento bastante simples (Dantas & Nodari, 2002). Quando comparados aos RFLPs, os microssatélites proporcionam 3 a 4 vezes mais polimorfismo ou informação. Os microssatélites, na generalidade, são considerados os marcadores moleculares mais informativos para estudos genéticos de um elevado número de espécies, estando já a ser utilizados em grande escala para as principais espécies de importância agrícola, nas espécies modelos e também nas populações humanas. São excelentes marcadores para estudar relações em subespécies e entre populações muito próximas devido à sua rápida taxa de mutação. A facilidade de amplificação por PCR possibilita uma vasta utilização em estudos forenses e análises moleculares não-‐invasivas, uma vez que permite a amplificação em amostras de reduzida quantidade e/ou qualidade de DNA, mesmo quando se trata de DNA altamente degradado (Brohede & Ellegren, 1999). A utilização dos microssatélites apresenta, no entanto, algumas limitações, nomeadamente o facto de não ser possível amplificar determinados alelos no PCR.

b) AFLPs (amplified fragment length polymorphism) A análise dos polimorfismos dos fragmentos amplificados (AFLPs – amplified fragment length Polymorphism) resulta do uso combinado de enzimas de restrição e da técnica PCR. A utilização dos AFLP passa pela resolução de quatro etapas: 1) digestão do DNA, 2) ligação dos primers, 3) pré-‐amplificação e 4) amplificação. É uma técnica que proporciona

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alta especificidade e resolução, bem como elevado poder de amostragem (Dantas & Nodari, 2002). Os AFLPs são altamente informativos e úteis para estabelecer relações entre espécies relacionadas ou entre indivíduos da mesma espécie. Atualmente representam o método mais utilizado em estudos de fingerprinting. Uma das principais vantagens na sua utilização reside no facto de permitirem a deteção de um maior número de loci, quando comparada com as restantes técnicas de identificação dos marcadores moleculares, possibilitando também uma generalizada cobertura do genoma a um custo mais económico. Não ser requerido a priori um conhecimento acerca da sequência nas espécies alvo, uma vez que são usados os mesmos primers para todas as espécies, é outra das vantagens a assinalar para este marcador (Foulley et al., 2006).

3. SNPs (single-‐nucleotide polymorphism) Atualmente, uma alternativa bastante competitiva à utilização de microssatélites e da sequenciação são os SNPs (single nucleotide polymorphism – polimorfismo de um nucleótido. Os SNPs são uma classe mais geral de polimorfismos que surgem a partir de mudanças em nucleótidos únicos de uma determinada sequência de DNA (Figura 7), as quais podem ou não gerar locais de clivagem por enzimas de restrição. As mutações mais comuns são as do tipo transição, onde ocorre troca de uma purina por outra purina (adenina por guanina e vice versa) ou de uma pirimidina por outra pirimidina (citosina por timina e vice versa). São mais frequentes que os microssatélites e estão uniformemente distribuídos por todo o genoma. Ocorrem a cada 300 a 600 nucleótidos e 90% das variações humanas têm precisamente origem nos SNPs (Brumfield et al., 2003). Figura 7. Moléculas de DNA diferindo apenas num par de bases (SNP).

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A utilização de SNPs permite uma comparação direta e são particularmente úteis para estudos de diversidade genética, sendo maioritariamente utilizados para mapeamento genético e genotipagem. Têm-‐se tornado os marcadores de preferência pela sua grande abundância e pelo desenvolvimento de tecnologias de genotipagem em larga escala. Quando comparados com os microssatélites apresentam a desvantagem de ser marcadores bialélicos, ou seja, normalmente são encontradas duas variantes numa espécie (por exemplo, um alelo pode corresponder a um par de bases A-‐T e o outro a um G-‐C) (Tabela 1) e, por essa razão, a quantidade de DNA a usar terá que ser muito superior à necessária no caso dos microssatélites (Hyten et al., 2008). Tabela 1. Comparação dos diferentes marcadores genéticos baseados no DNA.

Marcador

SNPs

Microssatélites

RAPDs e derivados

Vantagens

Desvantagens

Elevado grau de polimorfismo

Protocolos dispendiosos

Muito abundantes

Baixo conteúdo informativo num único SNP Marcador bialélico

Novas abordagens analíticas estão a ser desenvolvidas Estudos comparativos fáceis de realizar Marcador codominante

Alta taxa de mutação

Fáceis de isolar e automatizável

Não são muito abundantes

Protocolos económicos

Estudos de comparação requerem preparação laboratorial especial

Simplicidade, rapidez e economia Produz um número elevado de bandas

Análise e estudos comparativos bastante difíceis de executar Baixo conteúdo de informação por locus

Não requer bibliotecas genómicas

Baixa reprodutibilidade

IV. DNA mitocondrial Um dos primeiros marcadores genéticos a ser utilizado no estudo genético das populações foi a molécula de DNA mitocondrial, que constitui o material genético dos compartimentos celulares para a produção de energia, as mitocôndrias. Esta molécula é facilmente amplificada e analisada pois cada célula possui centenas de mitocôndrias, o

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que facilita a obtenção de quantidades razoáveis de DNA mesmo em amostras degradadas ou naturalmente pobres em material genético. O DNA mitocondrial é transmitido maioritariamente por via materna aos descendentes, possuindo cada indivíduo apenas um tipo de molécula (haplótipo) que recebeu da sua progenitora. Atualmente, alguns estudos têm admitido a ocorrência de formas de recombinação no processo de transmissão hereditária do DNA mitocondrial, contrariando por isso a exclusividade de transmissão por via materna (White et al., 2008), no entanto, este processo ainda não se encontra totalmente esclarecido de forma a que se admite, devido ao número e frequência dos casos, que a transmissão do DNA mitocondrial é feita maioritariamente por via materna. Estes haplótipos são transmitidos à descendência apenas pelas fêmeas, não recombinando com outro material genético. Este modo particular de transmissão permite assim definir linhagens maternas (o que é útil para a definição de grupos/ populações e relações de proximidade entre eles). Apresenta ainda a vantagem de evoluir, em geral, de um modo neutral, isto é, a sua diversidade não é limitada ou enviesada pela seleção natural (Yaffe, 1999). A transmissão exclusivamente materna do DNA mitocondrial pode, por outro lado, limitar as interpretações decorrentes da análise desta molécula, já que apenas a História das linhagens maternas é reconstruída. Para complementar os dados mitocondriais pode recorrer-‐se à análise do cromossoma Y, o cromossoma masculino dos mamíferos. Este marcador está apenas presente nos machos, sendo por isso sempre transmitido por via paterna, permitindo completar a informação obtida para as linhagens maternas. No entanto, tanto o DNA mitocondrial como o do cromossoma Y, embora muito úteis na reconstrução de grupos e linhagens, são limitativos por serem de transmissão uniparental. Além disso, a sua taxa de variabilidade não permite, normalmente, estudos a um nível mais detalhado do que o populacional nem, por exemplo, a identificação individual, sendo nestes casos utilizados os microssatélites ou STRs (Figura 8) (Schlotterer, 2004). A molécula de DNA mitocondrial é circular e relativamente pequena quando comparada com o material genético existente no núcleo das células. Contudo, possui várias regiões que têm diferentes taxas de variação e que, por isso, permitem estudos de diferente alcance temporal. Uma região muito utilizada em estudos populacionais é a região de controlo que, por não codificar proteínas, ao contrário das restantes regiões, é altamente variável (Schlotterer, 2004).

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Figura 8. Comparação de três tipos de marcadores genéticos: DNA mitocondrial, microssatélites e cromossoma Y.

V. Aplicações dos marcadores

São várias as aplicações já descritas em que se podem utilizar os marcadores genéticos, por exemplo em filogenia e sistemática, processos evolutivos, estudos de diversidade genética, filogeografia, genética forense. Os marcadores genéticos estão a facilitar a realização de estudos genéticos, de taxonomia e de evolução proporcionando um substancial avanço no conhecimento científico e em outras áreas de interesse comercial, como por exemplo na caracterização genética de espécies com elevado interesse agrícola e a seleção assistida de algumas delas de acordo com as características desejáveis (procedimento bastante comum, por exemplo, nas plantas para analisar a hereditariedade de características quantitativas, como o peso dos grãos ou o tamanho de frutos). As principais implicações deste avanço refletem-‐se no poder, precisão e rapidez no estudo da variabilidade genética.

1. Estudos de processos demográficos Em estudos demográficos, onde se pretende avaliar a distribuição de determinadas espécies no passado, é importante conhecer a distribuição alélica para se tornar possível

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identificar as novas mutações, permitindo inferir acerca da diferenciação das populações (Schlotterer, 2004). A utilização dos microssatélites acaba por ser uma boa resposta para as necessidades apresentadas. A elevada taxa mutacional dos microssatélites acaba por ser uma vantagem na inferência de eventos demográficos passados. Atualmente também se tem recorrido aos SNPs para realizar este tipo de estudos, no entanto a sua utilização ainda é muito recente e portanto ainda é necessário efetuar vários ajustes nos procedimentos. Infelizmente também, as comparações diretas entre ambos os marcadores ainda são muito escassas, não sendo ainda claro qual dos marcadores é mais útil para este tipo de estudos (Schlotterer, 2004).

2. Testes de paternidade e estudos forenses (DNA fingerprinting) Quer em testes de paternidade, como em estudos forenses, é necessário utilizar marcadores genéticos informativos e fiáveis. Apesar dos microssatélites representarem uma das melhores escolhas, o facto de ainda não estarem desenvolvidos para todas as espécies ou então apenas num número bastante limitado, faz com que a sua utilização para este tipo de técnicas nem sempre seja possível. Nesses casos, a alternativa mais usual passa pela utilização de RAPDs ou AFLPs, sendo os mais utilizados devido a permitirem de uma forma mais eficiente a reprodutibilidade dos dados, facilitando a partilha da informação entre laboratórios. No entanto, tantos os RAPDs como os AFLPs produzem marcadores dominantes e bialélicos; portanto, para atingir o mesmo poder de resolução dos microssatélites, ou até mesmo que os SNPs, um número elevado de marcadores terá que ser estudado. Para além disso, em grande parte das análises realizadas, assume-‐se a independência entre os marcadores e por isso, apesar destas duas técnicas produzirem facilmente um número elevado de marcadores, é necessário ter especial cuidado quando se utilizam muitos marcadores, especialmente quando a sua posição no mapa genético é completamente desconhecida (Vignal et al., 2002).

3. Estudos de mapeamento genético Para estudos de mapeamento genético é requerida a utilização de um elevado número de marcadores distribuídos por todo o genoma. A ampla variedade de marcadores disponíveis possibilita o desenvolvimento e melhoramento dos mapas genéticos, que permaneciam como uma utopia numa fase anterior ao desenvolvimento dos marcadores, e que atualmente são uma ferramenta tanto para pesquisa básica quanto aplicada. Os marcadores de DNA segregam em proporções mendelianas e não interferem na segregação de outros genes. Nos últimos anos foram construídos mapas genéticos das

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principais espécies vegetais cultivadas, de animais domesticados e de espécies utilizadas como modelo em laboratório (Dantas & Nodari, 2002). Em estudos experimentais, AFLPs, microssatélites e os SNPs são bons marcadores e podem revelar resultados bastante satisfatórios (Schlotterer, 2004). A escolha do marcador irá depender da escala do estudo que está a ser efetuado e da disponibilidade dos próprios marcadores. No entanto, estudos teóricos acerca deste assunto indicaram que os microssatélites são muito mais potentes que os SNPs (Schlotterer, 2004).

4. Análise filogenética e sistemática O DNA mitocondrial tem sido altamente utilizado em estudos filogenéticos e de sistemática e também em estudos de diversidade genética. O facto de ser haplóide, possuir uma transmissão hereditária exclusivamente materna (na maioria dos casos) e exibir uma elevada taxa mutacional permite realizar estudos de reconstrução evolutiva entre e dentro das espécies através da avaliação dos padrões de mutação. Os marcadores baseados no DNA mitocondrial também são intensivamente utilizados para detetar hibridações entre espécies (Schlotterer, 2004).

VI. Conclusão Existem atualmente vários marcadores genéticos disponíveis para serem utilizados em diferentes aplicações, dependendo a sua escolha das necessidades e especificidades do estudo a realizar. Os marcadores RAPDs e os seus derivados, como os AFLPs, são mais utilizados em estudos de avaliação da relação entre espécies e dentro da mesma espécie. Em espécies com um genoma grande e/ ou pouco conhecido a análise baseada em AFLPs tem sido muito eficaz na construção de mapas genéticos. Os microssatélites são uns dos marcadores genéticos mais populares para mapeamento genético, testes de paternidade e estudos de genética populacional. Provavelmente, possuem o maior impacto na construção de mapas genéticos numa gama alargada de espécies. Em genética humana, o desenvolvimento de novas tecnologias envolvendo microssatélites tem representado um papel muito importante na investigação de numerosas doenças monogénicas humanas. A alta sensibilidade da técnica de PCR também fez dos microssatélites o método de escolha para estudos forenses, estudos de amostras não-‐invasivas e a análise de insetos muito pequenos. Os SNPs surgem atualmente como uma alternativa aos microssatélites e estão em fase de

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expansão, estando a ser desenvolvidas novas abordagens onde a sua utilização se apresenta muito promissora. A sequenciação de uma dada região do genoma representa o máximo de informação genética que se pode obter atualmente. Apesar deste método constituir inicialmente uma opção dispendiosa e extremamente morosa, avanços recentes na tecnologia da sequenciação fizeram com que seja possível analisar vários fragmentos de DNA, de vários indivíduos, num período de tempo relativamente curto e de forma mais económica.

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VII. Bibliografia Brohede J & Ellegren H (1999). Microsatellite evolution: Polarity of substitutions within repeats and neutrality of flanking sequences. PNAS, 266: 825-‐833. Brumfield RT, Beerli P, Nickerson A & Edwards SV (2003). The utility of single nucleotide polymorphisms in inference of population History. Trends in Ecology and Evolution, 18: 249-‐256. Dantas A & Nodari R (2002). Marcadores Genéticos. Biotecnologia. Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal de Santa Catarina. Foulley JL, Schriek MGM, Alderson L, Amigues Y, Bagga M, Boscher MY, Brugmasn B, Cardellino R, Davoli R, Delgado JV, Fimland E, Gandini GC, Glodek P, Groenen MAM & Olliver L (2006). Genetic Diversity Analysis Using Lowly Polymorphic Dominant Markers: The example of AFLP in Pigs. Journal of Heredity, 97: 244-‐252. Gharrett AJ & Gray AK (2001). Identification of rockfish (Sebastes spp.) by restriction site analysis of the mitochondrial ND-‐3/ND-‐4 and 12S/16S rRNA gene regions. Fishery Bulletin, 99: 49-‐62. Hirata M & Hirata R (1999). Apostila de noções de Biologia molecular. Laboratório de Biologia Molecular Aplicada ao Diagnóstico. Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo. Hyten DL, Song Q, Choi II, Yoon M, Specht JE, Matukumalli LK, Nelson RL, Schoemaker RC, Young ND & Cregan PB (2008). High-‐throughput genotyping with the GoldenGate assay in the complex genome of soybean. Theor Appl Genet, 116: 945-‐ 952. Hunter RL & Market CL (1957). Histochemical demonstration of enzymes separated by zone electrophoresis in starch gels. Science, 125: 1294-‐1295. Keller DH Green P, Helms C, Cartinhour S, Weinffenbach B, Stephens K, Keith TP, Bowden DW, Smith DR, Lander ES, Botstein D, Akots G, Rediker KS and Crooks SM (1987). A genetic linkage map of the human genome. Cell, 51: 319-‐337-‐ Kovács B, Egedi S, Bártfai R & Orbán L (2001). Male-‐specific DNA markers from African catfish (Clarias gariepinus). Genetica, 110: 267-‐276. Markert CL & Moller F (1959). Multiple forms of enzymes: issues, ontogenetic and species specific patterns. Proc Natl Acad Sci, 45: 753-‐763. Schlotterer C (2004). The evolution of molecular markers -‐ just a matter of fashion? Nature Reviews, Genetics, 5: 63-‐69.

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VIII. Créditos Imagéticos Figura 3: Hammelev D, Madden D, Norby S & Turner J (1998). DNA Profiling Unit 2. EIBE – European Initiative for Biotechnololy Education, 13. Figura 5: Vierstraete A (1999). PCR to amplify the request gene – Principle of the PCR (http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr/html) [Acedido em: 06 de Maio de 2012]. Figura 7: Sirius genomics – What is a single nucleptide polymorphism? (http://www.siriusgenomics.com/technology/) [Acedido em: 06 de Maio de 2012]. Figura 8: Adaptado de: Godinho R, Lopes S & Ferrand N (2007). Estudo da diversidade genética e estruturação genética das populações de lobo (Canis lupus) em Portugal. Relatório Final. CIBIO/UP.