Genotipado

¿QUÉ ES EL GENOTIPADO? El análisis de las variaciones individuales en la secuencia de DNA

¿QUÉ APLICACIONES TIENE? - Identificar marcadores de susceptibilidad/ protección a enfermedades complejas - Identificar marcadores para predecir la respuesta individual a fármacos - Estudios evolutivos para trazar la historia de las poblaciones - Identificación de individuos - Aplicaciones prácticas en diagnóstico y tratamiento de enfermedades

POLIMORFISMOS EN EL GENOMA HUMANO

- 3.000 millones de pares de bases - 99.9% idéntico entre individuos - 0.1% de diferencias/ polimorfismos: Macro: Grandes duplicaciones, inversiones y deleciones Medio: VNTRS (Variable Number of Tandem Repeats) o minisatélites STRs (Short Tandem Repeats) o microsatellites Micro: Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) Single Nucleotide Insertions and Deletions (Indels)

MICROSATÉLITES O STRs (SINGLE TANDEM REPEATS)

- repeticiones de 1-5 nucleótidos - el número de repeticiones varía entre individuos - altamente polimórficos - distribuídos por todo el genoma - fácilmente detectables por PCR

GAACGTACTCACACACACACACATTTGAC TTCGATGATAGATAGATAGATAGATACGT

MICROSATÉLITES O STRs

MICROSATÉLITES O STRs: Multiplexing

SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) - 1 SNP cada 200-300 pb -10-30 millones de SNPs (10 millones en dbSNP) - Frecuencia >1% - Baja tasa de mutación: 10-8 - Típicamente bialélicos - 2 de cada 3 SNPs son transiciones C-T - Distribuidos por todo el genoma: -Regiones codificantes: sinónimos y no sinónimos -Regiones no codificantes GTGGACGTGCTT[G/C]TCGATTTACCTAG

¿CÓMO SE IDENTIFICAN LOS SNPs? - Se alinean secuencias de una misma región y se identifican posiciones variables GCATGCAAGCAGATA GCATGCACGCAGATA GCATGCAAGCAGATA GCATGCAAGCAGATA GCATGCAAGCAGATA GCATGCAAGCAGATA - Posición variable 8 (A|C), ¿es realmente un SNP?

Dos tipos de errores en la identificación de SNPs: Las secuencias alineadas son parálogas y no homólogas (PSV y no SNP) Errores de secuenciación

dbSNP Build 124 (enero 2005)

Organism

Nยบ SNPs (validated)

Homo sapiens / geneReport

10,054,521 (5,054,675)

Gallus gallus / geneReport

3,291,672 (3,281,479)

Oryza sativa

3,899,916 (22,057)

Anopheles gambiae

1,136,268 (0)

Mus musculus / geneReport

581,577 (535,237)

Canis familiaris

957,828 (12,315)

Rattus norvegicus

43,229 (702)

Saccharum hybrid cultivar

42,853 (0)

Danio rerio

2,025 (1,903)

Sus scrofa

1,521 (24)

Bos indicus x Bos taurus

2,425 (0)

Bos taurus

2,058 (45)

Caenorhabditis elegans

1,065 (0)

Pinus pinaster

32 (0)

Cooperia oncophora

426 (96)

Ovis aries

614 (66)

Glycine max

278 (3)

281

Arabidopsis thaliana

184 (184)

184

Plasmodium falciparum

203 (0)

199

Zea mays

146 (80)

90

Ficedula albicollis

37 (18)

37

Ficedula hypoleuca

20 (10)

28

Hydroides elegans

7 (1)

Gorilla gorilla gorilla

4 (0)

Nยบ SNPs with frequency

488,391

2,7

545,5 17 669

2,031

54

425

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP

dbSNP

dbSNP

dbSNP

Métodos para el genotipado de SNPs - Más de 100 métodos distintos - Plataforma ideal para el genotipado de SNPs Alta capacidad de genotipo (nº genotipos/ día): throughput Precios asequibles Alta capacidad de multiplexing Diseño simple Robustez Baja tasa de error Sistema automático de asignación de los alelos Adecuada para la mayoría de SNPs Adecuada para proyectos con distinto nº de SNPs y de muestras

Protocolo típico para el genotipado de SNPs

Amplificación del fragmento diana

PCR

Discriminación de los dos alelos

Hibridación específica de alelo Extensión del primer específica de alelo Ligación específica de alelo Corte enzimático específico de alelo

Identificación del producto específico de alelo

Intensidad de la fluorescencia /FRET/ FP Electroforésis Espectrometría de masas Citometría de flujo

Combinaciรณn de distintas estrategias de discriminaciรณn, formato y detecciรณn para el genotipado de SNPs

Métodos bioquímicos para la discriminación de los dos alelos de un SNPs

HIBRIDACIÓN ESPECÍFICA DE ALELO (ASO)

EXTENSIÓN DEL PRIMER ESPECÍFICA DE ALELO (ASE)

LIGACIÓN DE OLIGOS ESPECÍFICA DE ALELO (OLA)

EXTENSIÓN DEL PRIMER CON UN NUCLEÓTIDO (SBE O MINI SECUENCIACIÓN) CORTE ESPECÍFICO DE ALELO

Métodos bioquímicos para la discriminación de los dos alelos de un SNPs: ASO

HIBRIDACIÓN ESPECÍFICA DE ALELO (ASO)

-Homodúplex termodinámicamente más estable - Para aumentar la precisión se utilizan muchas sondas para cada alelo y se toma como resultado el promedio de todas ellas (microarray).

-Desventajas: baja especificidad

Métodos bioquímicos para la discriminación de los dos alelos de un SNPs: ASE

EXTENSIÓN DEL PRIMER ESPECÍFICA DE ALELO (ASE)

-La polimerasa extiende el primer con un missmatch a 3’ entre con una eficiencia entre 100 y 10.000 menor - ASE-PCR: un tercer primer reverso permite a la vez amplificar la región.

- Ventajas: los oligos no tienen que estar marcados, se puede realizar en formato microarray - Desventaja: no es tan específico como el SBE, especialmente el ASE-PCR.

Métodos bioquímicos para la discriminación de los dos alelos de un SNPs: SBE

EXTENSIÓN DEL PRIMER CON UN NUCLEÓTIDO (SBE O MINISECUENCIACIÓN)

- Ventajas: altamente específico

Métodos bioquímicos para la discriminación de los dos alelos de un SNPs: OLA

LIGACIÓN DE OLIGOS ESPECÍFICA DE ALELO (OLA)

-La DNA ligasa es más sensible a detectar missmatches en el extremo 3’ - Ventajas: altamente específico

Métodos bioquímicos para la discriminación de los dos alelos de un SNPs: Invader CORTE ESPECÍFICO DE ALELO (ENSAYO INVADER)

- Endonucleas que utilizan como sustrato una doble cadena bifurcada con el extremo 5’ libre y que cortan sólo cuando detectan 1 o más bases de solapamiento - Ventaja: no necesita de la amplificación previa por PCR - Desventaja: necesita grandes cantidades de DNA

Formatos

Homogeneos: todos los ractivos juntos en un tubo, no hay pasos de purificación. Fáciles de automatizar, baja capacidad de multiplexing.

Semihomogeneos: los productos no están separados ni existe un suporte sólido, pero los reactivos se añaden secuencialmente.

Sólidos: Productos en soporte sólido y con pasos de purificación. Más sensibles y con alta capacidad de multiplexing.

Formatos microarrays

microesferas

Mecanismos para la detección e identificación

Transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET): interacción entre dos fluoróforos muy cercanos (10-200 amstrongs) El fluoróforo excitado transfiere la energía al fluoróforo aceptor que por tanto actúa como inhibidor de la emisión de fluorescencia. La eficiencia del proceso es inversamente proporcional a la distancia entre el fluoróforo i el quencher.

Polarización de la fluorescencia. Se marca una pequeña molécula con un fluoróforo, de forma que cuando se une a una molécula mayor se modifica su velocidad de rotación que se puede detectar utilizando luz polarizada y midiendo la polarización de la fluorescencia emitida.

MĂŠtodos mĂĄs populares para genotipado de SNPs

Ensayo nucleasa 5’ (TaqMan)

Transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET):

Ensayo nucleasa 5’ (TaqMan)

Ensayo nucleasa 5’ (TaqMan)

- Dos sondas marcadas con distintos fluoróforors - El incremento de la fluorescencia es proporcional a la cantidad de producto formado.

-Ventaja: un único paso, sin purificaciones -Desventajas: 1 SNP/ reacción, difícil de optimizar

Ensayo nucleasa 5’ (TaqMan)

Espectrometría de masas (MALDI-TOF)

MALDI-TOF: Matrix-Associated Laser Desorption time-Of Flight Mass spectrometry) - Permite determinar de forma precisa la masa de una molécula (diferencias de 3 Daltons) - Equipo complejo: nanodispensador, espectrómetro con ionizador, analizador.

Espectrometría de masas: MassExtend - Diferencias pequeñas entre el peso molecular entre las 4 bases, especialmente entre A y T. - Reacción de extensión del primer con dNTPs y ddNTPs. - Productos de los dos alelos con distinto nº de bases.

EspectrometrĂ­a de masas: multiplexing

Primers con distintos pesos moleculares

Espectrometría de masas: multiplexing Hasta 12 SNPs en una única reacción utilizando primers con distintos pesos moleculares

Genotipado como T GA C ( los picos ‘P’ son primers de extensión no extendidos)

Espectrometría de masas: resultados El software de análisis asigna genotipos a los SNPs en cada ensayo en función de las masas obtenidas.

SNPlex PROTOCOLO DE SNPlex PARA LA DETECCIÓN DE SNPs 1.

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Activación de los oligonucleótidos Ligación de los oligonucleótidos Purificación de los oligonucleótidos ligados Amplificación con primers universales Captura del DNA biotinilado Hibridación con sondas ZipChute Elución de las sondas ZipChute Electroforesis capilar para la detección de las sondas ZipChute Análisis de los resultados con GeneMapper

GENOTIPOS

SNPlex: Activación de los oligonucleótidos LINKERS

N

N

N

N NN N

OLIGONUCLEÓTIDOS

primer universal F N N

N ASO1 NN NNNNNNNNNNNNN N N N N N NN NN NN

N

N

N

N NN N

fosforilación

P NNNNNNNNNCTTAGCATACTAGATTCCGA P

primer universal F N N

N NN ASO2 NNNNNNNNNNNNN N N N N N NN NN NN N NN N N N N N N N NNNNNNNNNNNNN NN N N N N N NNNN NN

LSO

ZipCode1

ZipCode2

fosforilación

P NNNNNNNNNCTTAGCATACTAGATTCCGC P

fosforilación

primer universal R

CACCTAGGGATCCATTAGTGTNNNNNNNNN P P

SNPlex: Ligación de los oligonucleótidos primer universal F NN NN NN NN ZipCode1 NN NN N ASO1 NN NN NN NN NN NN NN NN CTTAGCATACTAGATTCCGA NN NN NN NN NCTTAGCATACTAGATTCCGC ZipCode2

primer universal R N NN N N NN CACCTAGGGATCCATTAGTGT NN

LSO

ASO2

ligación de oligonucleótidos

DNA genómico TTTGGACGCGATCGAATCGTATGATCTAAGGCGGTGGATCCCTAGGTAATCACAGATATCC AAACCTGCGCTAGCTTAGCATACTAGATTCCGCCACCTAGGGATCCATTAGTGTCTATAGG desnaturalización

SNPlex: Purificaciรณn de los oligonucleรณtidos ligados

primer universal F

NN NN NN NN ZipCode1 NN NN NN NN NN NCTTAGCATACTAGATTCCGA

primer universal F

NN primer universal R NN actividad exonucleasa NN ZipCode2 NN NN N NN NN NN N NN NN NN NCTTAGCATACTAGATTCCGC CACCTAGGGATCCATTAGTGT NNN DNA genรณmico TTTGGACGCGATCGAATCGTATGATCTAAGGCGGTGGATCCCTAGGTAATCACAGATATCC

AAACCTGCGCTAGCTTAGCATACTAGATTCCGCCACCTAGGGATCCATTAGTGTCTATAGG

SNPlex: Amplificación con primers universales primer universal R

primer universal F NNNNNNNN

NNNNNNN

NNNNNNNN

NNNNNNN

síntesis NNNNNNNNCTTAGCATACTAGATTCCGCCACCTAGGGATCCATTAGTGTNNNNNNN NNNNNNNNGAATCGTATGATCTAAGGCGGTGGATCCCTAGGTAATCACANNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNCTTAGCATACTAGATTCCGCCACCTAGGGATCCATTAGTGTNNNNNNN

ZipCode2

NNNNNNNNNNNNNNNNGAATCGTATGATCTAAGGCGGTGGATCCCTAGGTAATCACA

SNPlex: Captura del DNA biotinilado

Primer con biotina NNNNNNNNNNNNNNNCTTAGCATACTAGATTCCGCCACCTAGGGATCCATTAGTGTNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNGAATCGTATGATCTAAGGCGGTGGATCCCTAGGTAATCACANNNNNNN

desnaturalizaciรณn lavados

Placa con estreptavidina

SNPlex: Hibridaciรณn con sondas ZipChute

Marcador fluorescente Modificadores de movilidad ZipCode2

ZipCode1

NNNNNNNNN

NNNNNNNNN

sondas Zipchute

hibridaciรณn NNNNNNNNNNNNNNNNNNGAATCGTATGATCTAAGGCGGTGGATCCCTAGGTAATCACA NNNNNNNN

ZipCode2 Placa con estreptavidina

SNPlex: Eluciรณn de las sondas ZipChute

ZipCode2 eluciรณn NNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNGAATCGTATGATCTAAGGCGGTGGATCCCTAGGTAATCACA NNNNNNNN

ZipCode2 Placa con estreptavidina

SNPlex: Electroforesis capilar ZipCode1 ZipCode1

ZipCode2 ZipCode2

NNNNNNNNN NNNNNNNNN

NNNNNNNNN NNNNNNNNN

electroforesis electroforesis

A A11A A11

A A11A A22

A A22A A22

SNPlex: AnĂ lisis de los resultados

SNPlex: AnĂ lisis de los resultados

A2A2

A1A2

A1A1 Ctrol -

Diagrama cartesiano

SNPlex: AnĂ lisis de los resultados

Microarrays: minisecuenciaciรณn

Arrayed Primer Extension (APEX).

Primer Extension en soluciรณn: oligos con tags (secuencias identificadoras) y arrays universales

Microarrays: array of arrays

Array con distintas cรกmaras que permite hacer reacciones separadas (muchos SNPs en muchas muestras

BeadArray

Array Matrix 96 haces

1 Haz 50.000 fibras

1 haz tiene 50.000 microesferes

1 fibra 1 microesfera (ensamblaje al azar)

BeadArray

Array Matrix 96 haces

Cada microesfera tiene unos oligos unidos que permite decodificarla medainte hibridaciones secuenciales

Existen 1520 microesferas distintas 1 haz tiene 50.000 microesferas

30% redundancia

BeadArray DNA inmovilizado mediante estreptavidina/ biotina

OLA: tres oligos (ASO1, ASO2 y LSO). LSO tiene una secuencia que hibrida con la secuencia identificadora de una determinada microesfera.

PCR con primers universales P1 i P2 marcados con dos fluorรณforos distintos

BeadArray

BeadArray

Ejemplos de estudios de genotipado

Ejemplo de estudios de genotipado agran escala: HapMap

Poblaciones SNPs genotipados

CEU 956,730

HCB 412,669

JPT 412,608

Affymetrix platform (Broad) BeadArray platform (Broad, Illumina, Sanger, McGill, Beijing, Shanghai/Taipei) FP-TDI platform (UCSF/WashU) Invader platform (used by RIKEN) MIP platform (used by Baylor) Perlegen platform (used by Perlegen) Sequenom platform (used by Broad, Beijing, HongKong)

YRI 432,523

Estudios de asociación a escala genómica

50.000 tagging SNPs - 500.000 SNPs necesarios Affymetrix GeneChip® Mapping 10K Set: 10.000 SNPs (1/100 kb) GeneChip® Mapping 100K Set: 100.000 SNPs (1/10 kb) Paral.lel 10.000 cSNPs

Estudios de asociaciรณn a escala genรณmica

Molecular Haplotyping - PCR a partir de una única molécula - Clonaje de fragmentos de PCR - Híbridos somáticos - Microscopía de alta resolución

AutomatizaciĂłn: robots de manejo de lĂ­quidos

Automatizaciรณn: robots para la extracciรณn de DNAs

Automatizaciรณn: cรณdigos de barras

LIMS: Laboratory Information Management Solutions

LIMS: Laboratory Information Management Solutions

Conclusiones

•

El genotipado de SNPs a gran escala es una área emergente

•

Numerosas tecnologías con ventajas y desventajas

•

La tecnología del futuro – No debería tener un paso de PCR – Podría basarse en el análisis de moléculas únicas de DNA (molecular haplotyping) – Una tecnología barata y con un elevado throughput tendrá consecuencias importante en investigación y diagnóstico.

Nodo de Barcelona del CEGEN

CRG

PRBB

Nodo de Barcelona del CEGEN ÆDirector del nodo: Dr. Xavier Estivill ÆResponsable de la Plataforma: Dra. Mònica Bayés ÆResponsable de Análisis de Datos: Dr. Rafael de Cid ÆPersonal Técnico: Carles Arribas, Anna Carreras, Cecilia García, Kristín Hildur Kristjánsdóttir, Anna Puig

Nodo de Barcelona del CEGEN Genotipado a media-gran escala mediante SNPlex