Biotecnologías de la reproducción en porcino by Grupo Asís

Dosier de

presentación Biotecnologías de la reproducción en porcino Coordinadores: Rosa María García García María Arias Álvarez Pedro Luis Lorenzo González Servet (División de Grupo Asís Biomedia S.L.) Centro Empresarial El Trovador, planta 8, oficina I Plaza Antonio Beltrán Martínez, 1 • 50002 Zaragoza (España) Tel.: +34 976 461 480 • Fax: +34 976 423 000 • www.grupoasis.com

Carlos García Artiga Yasmín De Loera Ortega Carlos García Saldaña María Jesús Hernández González Adelfa C. García-Contreras

La fuerza editorial de Grupo Asís La editorial Servet, perteneciente a Grupo Asís, se ha convertido en una de las editoriales de referencia en el sector veterinario a nivel mundial. Más de 15 años de experiencia en edición de contenidos veterinarios avalan su trabajo. Con una gran difusión nacional e internacional, las obras de su catálogo pueden encontrarse en multitud de países y ya han sido traducidas a más de ocho idiomas entre los que se encuentran el inglés, francés, portugués, alemán, italiano, turco, japonés y ruso. Su sello de identidad es un gran equipo multidisciplinar compuesto por doctores, licenciados en veterinaria y bellas artes y diseñadores especializados y con un gran conocimiento del medio en el que desarrollan su labor. Cada título se somete a un trabajo técnico y exhaustivo de revisiones, verificaciones y análisis que permite crear obras con un diseño único y un excelente contenido. Servet trabaja con los autores nacionales e internacionales más prestigiosos para incorporar a su catálogo los temas más demandados por el veterinario. Además de obras propias también elabora libros para empresas y entre sus clientes figuran las principales multinacionales del sector.

Biotecnologías de la reproducción en porcino

Biotecnologías de la reproducción en porcino Coordinadores: Rosa María García García María Arias Álvarez Pedro Luis Lorenzo González Carlos García Artiga Yasmín De Loera Ortega Carlos García Saldaña María Jesús Hernández González Adelfa C. García-Contreras

Autores: Rosa María García García (coordinadora),

María Arias Álvarez (coordinadora), Pedro Luis Lorenzo González (coordinador), Carlos García Artiga, Yasmín De Loera Ortega, Carlos García Saldaña, María Jesús Hernández González y Adelfa C. García-Contreras.

Formato: 17 × 24 cm. Número de páginas: aprox. 160. Número de imágenes: por determinar. Encuadernación: por determinar.

PVP ESTIMADO

55 €

Este libro surge de la necesidad de cubrir el área de conocimiento de la biotecnología de la reproducción, ya que no existen libros actualizados disponibles en el mercado de habla hispana que traten sobre la biotecnología de la reproducción en animales domésticos, y concretamente en la especie porcina. Aporta conocimientos útiles de reproducción para el ámbito productivo, de conservación de recursos zoogenéticos y como modelos animales para humanos. Por lo tanto, irá dirigido principalmente a profesionales del sector y estudiantes universitarios de grado, postgrado o máster interesados en la reproducción porcina.

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Biotecnologías de la reproducción en porcino

Presentación de la obra El libro está concebido y coordinado por profesores pertenecientes a la Facultad de Veterinaria de Universidad Complutense de Madrid. En él participan un grupo de autores expertos reconocidos nacional e internacionalmente en el ámbito de la reproducción animal en porcino y procedentes de distintos organismos (Universidad Complutense de Madrid, Universidad de Murcia y Universidad Autónoma de Barcelona). En la actualidad, no existe una revisión actualizada en castellano sobre aspectos importantes, generales y más específicos a tener en cuenta cuando se aplican las biotecnologías de la reproducción en las distintas especies animales de interés veterinario y en particular en porcino. En este libro se revisan y actualizan los conocimientos correspondientes a la especie porcina, de modo que se presenta una revisión general de la fisiología de la reproducción de la cerda y el verraco con los últimos descubrimientos hasta el momento y en la que también se incluyen temas de actualidad en cuanto a investigación se refiere. Se describen los aspectos más novedosos y prácticos de las biotecnologías reproductivas que más se emplean dentro de las técnicas de reproducción asistida (ART) como son el análisis seminal, el sexaje de espermatozoides y embriones y la inseminación artificial o las técnicas de selección reproductiva de los reproductores, incluyendo el genotipado porcino. Además, se abordarán los temas relativos a la obtención y transferencia de embriones, criopreservación y producción in vitro de embriones. Finalmente, debido al creciente protagonismo del uso de organismos modificados genéticamente para el estudio de enfermedades en humanos o para la industria farmacéutica, también se abordarán aspectos relacionados con la transgénesis y la transferencia nuclear de células somáticas y sus aplicaciones.

Los autores Rosa María García García (coordinadora) Doctora en Veterinaria por la Universidad Complutense de Madrid (UCM). Máster en Producción Animal del Instituto Agronómico Mediterráneo de Zaragoza (IAMZ). En la actualidad es Profesora Titular del Departamento de Fisiología (Fisiología Animal) de la Facultad de Veterinaria de la UCM y especialista en Fisiología de la Reproducción.

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Imparte docencia en el Grado de Veterinaria de la UCM, así como en el programa de doctorado y cursos de postgrado en la UCM y en otras universidades nacionales (Universidad Politécnica de Madrid, Universidad Católica de Ávila). Dirige y ha dirigido trabajos de fin de máster y tesis doctorales en el área de la reproducción animal. Es coordinadora de la asignatura del Grado en Veterinaria Fisiología Veterinaria II y en la asignatura de Modelos Animales en el Máster de Investigación en Ciencias Veterinarias de la UCM. Ha participado en el Programa Erasmus Profesores realizando tareas docentes en la Universidad de Milán (Italia), Universidad de Sassari (Cerdeña, Italia) y la Universidad de Lisboa (Portugal). Ha colaborado en proyectos competitivos como investigadora y en contratos de investigación y ha sido autora o coautora de numerosas publicaciones científicas en revistas indexadas, artículos de divulgación y capítulos de libros. Ha presentado comunicaciones en congresos científicos internacionales y nacionales y realizado estancias en centros de investigación de reconocido prestigio como son el University College de Dublín, la Universidad de Leeds y la Universidad de Edimburgo, así como estancias breves en la Università di Sassari (Cerdeña) y de Perugia en Italia. Es evaluadora de revistas científicas internacionales indexadas en el Journal of Citation Reports. También ha colaborado en tareas de cooperación al desarrollo en dos proyectos con Egipto y Ecuador. Y en tareas de divulgación mediante la participación en la Semana de la Ciencia y La noche de los investigadores organizadas por la Comunidad de Madrid.

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María Arias Álvarez (coordinadora) Doctora en Veterinaria por la Universidad Complutense de Madrid (UCM) y premio extraordinario de doctorado. Tras completar varias becas y contratos pre doctorales y post doctorales obtenidos por fuentes competitivas de financiación, actualmente es Profesora Ayudante Doctor del Departamento de Producción Animal de la Facultad de Veterinaria (UCM). Su actividad docente comprende docencia en el Grado de Veterinaria y en Ciencia y Tecnología de los alimentos en la UCM, en doctorado y cursos de postgrado y Máster oficial tanto en la UCM como en la Universidad Politécnica de Madrid (UPM). Dirige trabajos de fin de máster y tesis doctorales en el área de la reproducción animal. Es coordinadora de la asignatura del Grado en Veterinaria Cría y Producción Animal y en las asignaturas de Reproducción, genética y gestión de cerdos, aves y conejos en el Máster de Producción y Sanidad Animal de la UCM y UPM. Ha participado en varios proyectos de investigación financiados por organismos públicos, y es responsable de un proyecto de innovación y mejora de la calidad docente UCM. Es autora o coautora de publicaciones científicas en revistas indexadas, artículos de divulgación y un libro especializado en reproducción. Pertenece al Grupo de Investigación Complutense Fisiología de la reproducción de lagomorfos. Ha presentado multitud de comunicaciones en congresos científicos nacionales e internacionales y ha realizado estancias de investigación en centros nacionales y extranjeros de reconocido prestigio como el University College of Dublín, University of Davis (California), la Universidad de Amberes (Bélgica), la Universidad Autónoma de Barcelona (UAB) así como estancias breves en la Universidad de Perugia (Italia) y en la Universidad de Murcia, entre otras. Es evaluadora de revistas científicas internacionales indexadas en el Journal of Citation Reports. Participa en el programa Erasmus Docentia para Profesores impartiendo docencia en la Università di Bologna (Italia) y en la Universidad de Amberes (Bélgica). Es codirectora del Diploma de Formación Continua UCM Biotecnologías de la reproducción en especies de interés veterinario. También ha participado en tareas de cooperación al desarrollo en proyectos con Egipto y Ecuador.

Pedro Luis Lorenzo González (coordinador) Profesor Titular de Universidad del Área de Fisiología en la Universidad Complutense. Doctor en Veterinaria por la UCM. Diplomado en Reproducción Animal por el Colegio Europeo de Reproducción Animal (ECAR) desde 2001. Su actividad docente comprende docencia en el Grado de Veterinaria en la UCM, en doctorado y cursos de postgrado, tanto en la UCM como en otras universidades nacionales y extranjeras. Dirige y ha dirigido tesis doctorales en el ámbito de la reproducción animal y ha impartido seminarios a nivel nacional (Universidad Politécnica de Madrid, Universidad de Murcia, Universidad Autónoma de Barcelona) e internacional (Universidad de California, USA, Universidad Nacional de San Marcos, Perú, Centro Aggeu Magallaes, Brasil, entre otros). Es responsable de cuatro Proyectos de Innovación Educativa UCM. Su actividad investigadora se ha desarrollado en el marco de proyectos competitivos financiados en el que ha participado como investigador principal o investigador. Ha realizado estancias de investigación en centros extranjeros, como el Institut Fur Tierzuch und Tieverhalten (Mariensee, Alemania), la Universidad de California (Davis, USA), Centro Aggeu Magallaes (Recife, Brasil) y en el Lethbridge Research Centre (Canadá). Colabora extensamente con otros grupos de investigación españoles (Dpto. de Producción Animal, ETSI Agrónomos UPM, Dpto. de Reproducción y Conservación de Recursos Zoogenéticos, INIA, Dpto de Biología Celular, Universidad de Murcia), y extranjeros (Universidad de California, Davis, Università di Perugia, Universidad Autónoma de México, etc.). Finalmente, realiza también labores de gestión en la Facultad de Veterinaria de la UCM. Ha sido Secretario del Comité de Ética en Experimentación Animal (hasta 2003), ha sido Vicedecano de Investigación y Doctorado y actualmente ocupa el puesto de Decano de la Facultad.

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Carlos García Artiga Doctor en Veterinaria por la Universidad de Murcia. Profesor del Departamento de Fisiología (Fisiología Animal) de la Facultad de Veterinaria de la UCM. Especialista en biotecnología de la reproducción en ganado porcino.

Yasmín De Loera Ortega Licenciada en Medicina Veterinaria y Zootecnia por la Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco de México. Especialista en reproducción y nutrición porcina.

Carlos García Saldaña Colaborador en la Unidad Docente de Zoología del Departamento de Fisiología (Fisiología Animal) de la Facultad de Veterinaria de la UCM. Experto en biotecnología de la reproducción en ganado porcino.

Colaboradora en la Unidad Docente de Zoología del Departamento de Fisiología (Fisiología Animal) de la Facultad de Veterinaria de la UCM. Especialista en biotecnología de la reproducción en ganado porcino.

Adelfa C. García Contreras Doctora en Veterinaria por la Universidad Complutense de Madrid. Licenciada en Medicina Veterinaria y Zootecnia por la Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco de México. Especialista en reproducción y nutrición porcina.

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María Jesús Hernández González

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Índice de contenidos 1. Aplicación de las biotecnologías de la reproducción en porcino. Importancia. Perspectivas 2. Fisiología de la reproducción en la cerda y el verraco 3. Obtención, procesado y conservación del semen 4. Sexaje de espermatozoides y embriones: un presente con futuro 5. Inseminación artificial 6. Técnicas de selección reproductiva de los reproductores. Genotipado porcino 7. Sincronización de ciclo y tratamientos de superovulación. Recogida de embriones y transferencia embrionaria 8. Criopreservación de embriones y alternativas 9. Producción in vitro de embriones. Problemática. Perspectivas de futuro 10. Animales modificados genéticamente: clonación y transgénesis

Biotecnologías de la reproducción en porcino

IntroduccIón En el presente capítulo repasaremos brevemente las distintas fases que pueden considerarse desde que se obtiene un eyaculado hasta que las dosis seminales son aplicadas. Esto incluye el entrenamiento de sementales, la extracción de eyaculado, la elaboración de dosis seminales, así como los programas actuales de gestión para centros de inseminación artificial. Comentaremos las distintas técnicas que se utilizan para determinar la calidad seminal. Esta evaluación tiene como objetivo disminuir el efecto del semen seleccionado sobre los resultados de fertilidad y prolificidad. La calidad seminal está relacionada con factores inherentes al macho (raza, edad, genética, salud) así como al sistema de obtención y almacenaje del eyaculado. Asimismo, las características seminales suelen estar relacionadas entre ellas, y pueden cambiar según las condiciones del eyaculado y el tiempo que ha transcurrido desde su obtención, evaluación y utilización. Finalmente, mencionaremos uno de los protocolos que se utiliza de rutina para la criopreservación de espermatozoides en la especie porcina.

obtencIón del eyaculado entrenamiento del verraco El tiempo de entrenamiento para verracos jóvenes está comprendido entre 15 y 20 minutos, mañana y tarde (Martín Rillo et al., 2000). Se ha comprobado que con tiempos superiores, los animales pierden totalmente el interés por el potro de manejo (maniquí) y supone el riesgo de agotar al macho y que su comportamiento se torne agresivo o simplemente no responda frente al maniquí. Deben efectuarse periodos diarios de entrenamiento hasta que se considere que el verraco está listo y realice correctamente la monta y la eyaculación. Es

recomendable dar un descanso de 1 ó 2 días, considerando que el entrenamiento debe realizarlo la misma persona, para evitar interrumpir la adaptación del verraco al proceso. La duración total del entrenamiento no debe ser superior a 3 meses. Se considerará que un animal está entrenado cuando monta el maniquí sin la estimulación del entrenador (fig. 1) y cuando se obtienen tres eyaculaciones consecutivas. Una vez que el verraco ha saltado sobre el maniquí, lo que resta es habituarlo al trabajo rutinario (fig. 2). Es recomendable que los animales jóvenes trabajen una vez a la semana para mantenerlos en una buena condición. El ritmo de recolección óptimo dependerá de la edad y de las características individuales del verraco (García et al., 1999; De Alba, 2010; Sonderman y Luebbe, 2008). La observación de las reacciones de los animales frente al maniquí determinará el tipo de estrategia o técnica que se utilizará para facilitar el entrenamiento del verraco. Si el animal no muestra interés, el entrenador puede estimular suavemente pero con firmeza empujando la cabeza del verraco hacia el potro para incitarlo a que monte. Las caricias tienen un efecto positivo en los animales; de hecho, se ha demostrado en algunos estudios que los cerdos son muy sensibles a las interacciones táctiles con las personas (entrenador). Si el animal no muestra ningún interés por el potro, lo más recomendable es que salga de la sala de colección y vuelva a intentarlo más tarde.

Figura 1. Verraco sobre potro de recogida.

Obtención, procesado y conservación del semen

Figura 2. entrenamiento de verracos.

Para estimular que el verraco se acerque y obtener una respuesta favorable ante el maniquí, éste puede impregnarse con orina de hembras en celo, semen o saliva de otros machos. De lo contrario no lograremos atraer su interés hacia el potro. Cuando el verraco muestra interés por el maniquí, se acerca poco a poco desde la parte trasera o lateral; durante este tiempo se deben evitar ruidos y movimientos bruscos para evitar distraer, asustar o sorprender al verraco. Una vez que el macho ha identificado el maniquí, algunos animales montan con facilidad comenzando a realizar movimientos pélvicos (de empuje), mientras que otros necesitan ser dirigidos por el entrenador (García et al., 1999; De Alba, 2008; Sonderman y Luebbe, 2008).

El deseo de montar generalmente se presenta a los diez minutos de entrenamiento (García et al., 1999; De Alba, 2010).

extracción seminal Durante las primeras recogidas, debe tenerse especial cuidado para no causar daño en el pene (por roce con el potro o demasiada presión). Cuando el verraco se encuentra sobre el maniquí, se realizará una serie de masajes en la zona prepucial facilitando la exteriorización

Figura 3. Método de la mano enguantada.

del pene al tiempo que vaciaremos el divertículo prepucial que contiene restos de orina con una alta carga bacteriana, evitando de esta manera contaminar el eyaculado (De Alba, 2010). Una vez exteriorizado el pene, se sujetará el extremo del mismo con la mano, de tal forma que los dedos queden al borde de la espiral del glande. Se debe agarrar con firmeza aplicando una presión determinada en el glande (fig. 3). Esto permitirá la estimulación total del macho, comenzando la eyaculación (Hafez, 2000; Estienne et al., 2001). La técnica utilizada para obtener el eyaculado es la técnica de la mano enguantada. El método manual tiene la ventaja de evitar reacciones de inhibición en los verracos, así como la producción de eyaculados incompletos por variaciones de temperatura u otros estímulos inhibitorios ocasionados por el uso de una vagina artificial o la electroeyaculación. Por último, una vez finalizada la eyaculación, debemos dejar que el animal retire el pene y baje del potro. De esta

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forma evitaremos que el verraco adopte malas costumbres. Es importante no forzar al verraco ya que si éste asocia el entrenamiento como una experiencia negativa, probablemente se negará a subir al potro en próximas sesiones. La duración de la eyaculación (tiempo de reacción y eyaculación) se estima entre los 3 y 20 minutos (Hull y Rodríguez-Manzo, 2009; Ren et al., 2009). Actualmente, en los centros de inseminación artificial pueden utilizarse sistemas de extracción automatizada, los cuales permiten realizar un mayor número de saltos por día, aportando además una mayor comodidad y seguridad para el operario, siendo al mismo tiempo un proceso más higiénico. La recogida tanto por el método tradicional de la mano enguantada como con los sistemas automatizados, se facilita cuando se dispone de un foso adyacente al sitio de colección. El operario trabajará de pie y manejará al verraco a través de una puerta corredera (Domínguez et al., 2009). La habilidad de montar y producir eyaculados fértiles son factores importantes a la hora de utilizar un verraco. Por tanto, la instauración de protocolos de manejo que permitan acelerar el entrenamiento de verracos destinados a la inseminación artificial, mejorará tanto la eficiencia como la productividad de los programas reproductivos.

se valoran una serie de parámetros macro y microscópicos que requieren de un aparataje como el que se observa en la figura 4. De manera general y de forma comercial las pruebas que se utilizan para valorar la producción y calidad seminal son:

Volumen de eyaculado Durante la eyaculación, el plasma seminal y el contenido del epidídimo pasan por la uretra y se liberan a través de movimientos peristálticos. El volumen del eyaculado está formado por tres fracciones: pre-espermática, Fracción Rica (FR) o espermática y Fracción Pobre (FP) o post-espermática (fig. 5). La recogida del eyaculado debe realizarse de forma fraccionada, para evitar el efecto del plasma seminal en la actividad metabólica de los espermatozoides (Martín-Rillo, 1986).

Figura 4. contrastación seminal. Microscopio óptico con cámara adaptada.

contrastación seminal Una vez recolectado el eyaculado, el semen debe ser protegido de cambios bruscos de temperatura y luz ya que pueden dañar a los espermatozoides, por lo que el eyaculado se debe trasladar inmediatamente al laboratorio para su valoración (Estienne et al., 2009; De Alba, 2010). El control de la calidad seminal se realiza en distintos niveles, dependiendo si se trata de una granja, de un centro de inseminación artificial (IA) o de un laboratorio especializado. Para el control de dicha calidad seminal

Figura 5. Volumen de eyaculado.

Obtención, procesado y conservación del semen

Movimiento general de los espermatozoides expresado en porcentaje. Ej.: 80 %. Se observa en el campo del microscopio un total del 80 % con movimiento. A continuación hay que determinar la calidad de dicho movimiento Calidad de movimiento: se evalua en una escala de 0 a 5.

0. Sin movimiento. 1. Sin movimiento progresivo, giro sobre sí mismo. 2. Movimientos anormales en zig-zag. 3. Movimiento progresivo lento y sinuoso. 4. Movimiento progresivo rápido. 5. Movimiento progresivo muy rápido (óptimo).

Figura 6. Motilidad.

Motilidad La valoración de la motilidad es la primera característica que se observa al microscopio, presentando limitaciones en función del método utilizado. En la mayoría de los casos la valoración es subjetiva y variable. No obstante, en los últimos años se han mejorado los protocolos utilizando sistemas automatizados de análisis espermático (CASA), arrojando información tan precisa como la velocidad individual, la morfología de los espermatozoides, la amplitud del movimiento y el tipo de movimiento. Sin embargo, este sistema tiene un elevado coste y requiere de estandarización debido a los diferentes sistemas ópticos y software, limitando la extrapolación de los resultados de un laboratorio a otro (Malo, 2009). La motilidad es un indicador de calidad seminal que se desarrolla durante la estancia de los espermatozoides en el epidídimo, donde los cambios conformacionales de las células permiten adquirir al principio un movimiento débil, circular no progresivo, apoyado por el aporte de excreciones epididimarias y cantidades de andrógenos que ayudan a este proceso. Al llegar a la cola del mismo, el espermatozoide muestra una cola rígida y recta con la que

puede moverse rápidamente y dirige linealmente el movimiento. Este movimiento se denomina motilidad progresiva (fig. 6).

concentración espermática La determinación de la concentración espermática es parte del análisis básico necesario para la valoración de un eyaculado. Existen metodologías que utilizan la cámara de Neubauer, la cámara de Makler, o la de Bürker (fig. 7). En las figuras 8 y 9 se ilustra el recuento de espermatozoides en una cámara de Bürker. Otros métodos son los que utilizan el NucleoCounter SP-100 y el Spermax, los cuales no requieren la observación directa en el microscopio, ni el contaje de las células, pero sí una mayor inversión en equipo.

Figura 7. cámara de bürker.

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Figura 8. esquema de los cuadrados (n=40) que se deben contar en la cámara de bürker.

Figura 9. los espermatozoides que se cuentan como válidos por cuadrícula se muestran colocados en amarillo.

Aunque los resultados de contaje directo con cámara suelen ser precisos, requieren mayor tiempo, siendo además necesarios en la mayoría de los casos para estandarizar las técnicas implementadas en los laboratorios de inseminación artificial, donde se emplean fotocolorímetros o sistemas de contaje automatizados (Hansen et al., 2006).

de excelente calidad ha derivado en la creación de sofisticados programas computerizados. El análisis automatizado de la morfología espermática (Automated Sperm Morphology Analysis, ASMA) determina el tamaño y la forma del espermatozoide de una manera objetiva y reproducible, siendo utilizada desde hace algún tiempo de manera experimental para determinar las dimensiones individuales de los espermatozoides de cerdos, además de hacer posible la separación de los espermatozoides de una muestra seminal en subpoblaciones. Sin embargo, la técnica de evaluación más utilizada es la extensión de semen teñido sobre portaobjetos y examen por microscopía de campo claro. Existe una variedad importante de morfoanomalías, relacionadas con daño en cabeza

Morfoanomalías En la figura 10 se muestran las morfoanomalías en el espermatozoide de cerdo y en la tabla 1 las causas de aparición más frecuentes de dichas morfoanomalías. Un eyaculado con un aumento de las morfoanomalías espermáticas es indicativo de una fertilidad baja. Por ello, la necesidad de incrementar el nivel tecnológico para obtener espermiogramas objetivos

A. Espermatozoide normal B. Gota citoplásmica proximal C. Gota citoplásmica distal D. Cola en látigo A

Figura 10. tipos de morfoanomalías más frecuentes en porcino

E. Cola en ovillo

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Tabla 1. causas de aparición de morfoanomalías en el espermatozoide porcino.

Alteración

Causa Choque térmico en el proceso Choque osmótico Alteraciones del pH

Cola en látigo

Contacto con sustancias espermicidas Exposición a temperaturas elevadas Estados febriles

Gotas citoplásmicas

Inmadurez del macho Machos sobreutilizados Lesión testicular

Cola en ovillo

Defecto genético

Colas filiformes

Defecto genético

para encontrar colas con poca fortaleza en su movimiento, o colas flexionadas; por ello se clasifican como daños secundarios. Una vez que los espermatozoides son eyaculados, el choque térmico o las soluciones hipotónicas pueden inducir la aparición de espermatozoides con colas en látigo o en ovillo, falseando los resultados de una actividad de maduración inadecuada, por lo que éstas se pueden considerar como daños terciarios. Las técnicas más utilizadas para la evaluación son la tinción de las células a través de un frotis. La ventaja es el gran número de espermatozoides que pueden verse y la facilidad con la que se realiza mediante un microscopio de campo claro. El valor máximo recomendado en un eyaculado es del 10 % (Mozo, 2006).

Membranas espermáticas (microcabezas, cabezas en forma irregular, cabezas gigantes), y con la cola, donde las gotas citoplásmicas distales y proximales son las más estudiadas, junto con las colas enrolladas o también llamadas colas en látigo (fig. 11).

colas dañadas La cola espermática formada durante la espermiogénesis requiere la eliminación del zinc para formar las fibras densas, obteniendo la fortaleza y longitud necesarias para su movimiento. Sin embargo, algunos problemas en la maduración epididimaria pueden ser motivo

La membrana espermática es una estructura dinámica que participa en el reconocimiento y transporte de moléculas, que podemos valorar con técnicas de tinción (figs. 12a y 12b). Las funciones de la membrana espermática permiten que el espermatozoide adapte su metabolismo al medio en el que se encuentra, proporcionando un sistema molecular para el reconocimiento del ovocito. Durante la maduración en el epidídimo existen cambios en la membrana a través de la modificación del patrón constituyente de proteínas, es decir, se adicionan proteínas epididimales, se pierden o

Figura 11. Formas anormales observadas en un microscopio de campo.

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MUERTOS

VIVO

Tripán azul 1:1 (v/v) 2 gr. de colorante 100 ml. diluyente Incubación 15 minutos a 37 oC Eosina/nigrosina 1 gr. de eosina 5 gr. nigrosina 100 ml agua destilada Extensión sobre porta a 37 oC

VIVOS

MUERTOS

1: Vivo con acrosoma normal 2: Vivo sin acrosoma 3: Muerto con acrosoma normal 4: Muerto sin acrosoma Figura 12. tinciones vitales. (a) en la doble tinción vital se utilizan colorantes como la eosina-nigrosina o tripán azul para determinar el porcentaje de espermatozoides vivos y muertos. (b) triple tinción. Sirve para determinar la vitalidad de la célula espermática y el estado del acrosoma.

se redistribuyen las ya existentes, y se adiciona colesterol a la membrana. Estas membranas deben ser capaces de proteger a la célula, siendo su integridad indispensable. Además, la integridad del citoplasma no sólo es fundamental para el metabolismo del espermatozoide, sino que también lo es para una adecuada capacitación y reacción del acrosoma y, por lo tanto, para la fertilidad del macho. La evaluación de la integridad de la membrana constituye una importante información en la evaluación de la fertilidad potencial del macho. La incorporación de técnicas de valoración espermática como la prueba hiposmótica (hyposmotic swelling test, HOST) permitirían complementar el espermiograma convencional. La integridad de membrana se evalúa como el porcentaje de espermatozoides que responden a cambios de presión osmótica. El HOST (Jeyendran et al., 1984) permite evaluar la funcionalidad de la membrana plasmática de los espermatozoides mediante la observación de alteraciones morfológicas que sufren las células espermáticas al ser expuestas a condiciones hipotónicas (incremento de tamaño y flagelos curvos o en ovillo). Se ha observado que la suspensión de espermatozoides en un medio hipotónico ocasiona un desequilibrio osmótico entre el medio extra e intracelular, situación que el espermatozoide trata de equilibrar difundiendo agua al compartimento intracelular, y como consecuencia la célula aumenta su volumen. La morfología del acrosoma puede ser estudiada por distintas técnicas. Por ejemplo, observando el borde apical del acrosoma con ayuda de un microscopio de contraste de fases (figs. 13 y 14). Asimismo, el marcaje del acrosoma realizado a través del uso de lectinas unidas a fluorocromos está siendo utilizado cada vez con mayor frecuencia (Pursely Johnson, 1975). Las lectinas más utilizadas son la PSA (Pisum sativum agglutinin) y ConA (Concavalina A) combinada con el fluorocromo FITC (isotiocianato de

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Fragmentación del adn espermático

NORMAL

DAÑADOS

PERDIDO

Figura 13. esquema del estado del acrosoma mediante evaluación con microscopio de contraste de fases.

La determinación del estado en el que se encuentra el ADN no es una técnica que se utilice de manera rutinaria en el control de la calidad seminal en los centros de IA porcina. La evaluación del estado del ADN puede facilitar el diagnóstico de posibles fallos reproductivos relacionados con el verraco (López-Fernández et al., 2008). Es frecuente que los verracos presenten cierto grado de fragmentación de ADN espermático, el cual está considerado como normal en función de la capacidad que tiene la célula de restablecer aquellos fragmentos de ADN que se desprenden durante la síntesis del mismo. En un análisis es común encontrar eyaculados con un 5 % de espermatozoides que presentan ADN fragmentado. Sin embargo, los estados patológicos o febriles, los golpes de calor y el aumento en la edad están considerados como factores de incremento de esta fragmentación (López-Fernández et al., 2008).

capacidad fecundante de los espermatozoides

Figura 14. acrosomas observados en un microscopio de contraste de fases (40x).

fluoresceína), o la lectina SBTI (Trypsin inhibitor from Soybean) combinada con biotina. Todas estas lectinas se unen a la enzima acrosina, siendo la intensidad de marcaje elevada en los acrosomas intactos.

La capacidad fecundante (CF) de los espermatozoides se ha definido como la habilidad que tienen estas células para fecundar un ovocito fisiológicamente normal y estructuralmente intacto. El método más preciso y que mayor información arroja para predecir la CF es el que utiliza la penetración de ovocitos en sistemas in vitro, aunque esta prueba no valora fases fundamentales del proceso de penetración del ovocito como son el reconocimiento, la unión y la penetración de la zona pelúcida. La CF está relacionada con los parámetros de calidad espermática que incluyen la motilidad, la integridad morfológica de cada una de las partes de la célula (acrosoma, ADN y cola), la contaminación microbiana del eyaculado y la cantidad de células espermáticas en el medio.

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La valoración con la prueba in vitro de los verracos ofrece algunas limitaciones, como son la inconsistencia de los resultados por la evaluación de un reducido número de células, la variabilidad por la subjetividad del observador y la correspondiente a las muestras seminales, ya que la raza, la edad, el nivel nutricional y el tipo de almacenamiento y transporte suelen afectar al eyaculado (Saacke, 1984). A pesar de todo ello, existe una elevada correlación entre las tasas de penetración in vitro y la capacidad de fecundación in vitro (FIV) de los verracos, lo que es importante para la producción in vitro de embriones (Martinez et al., 1996).

elaboracIón de doSIS SeMInaleS En primer lugar, hay que tener en cuenta que todo el material que va a estar en contacto con el eyaculado debe estar limpio, esterilizado y atemperado a 37 ºC. Actualmente, existen en el mercado dos tipos de potros de recogida automáticos que reducen notablemente la contaminación del eyaculado. El volumen de fracción espermática (color blanco lechoso) varía entre los 50 y 150 ml. Al sujetar horizontalmente el pene, el eyaculado cae directamente sobre el vaso de recogida, donde se ha colocado una gasa que filtra la presencia de grumos gelatinosos (tapioca), impidiendo la gelificación del contenido seminal (fig. 15).

Figura 15. Grumos gelatinosos (tapioca).

Una vez obtenido el eyaculado, debe llevarse inmediatamente al laboratorio para su contrastación y procesado, evitando en todo momento choques térmicos, manteniendo la muestra de eyaculado a 37 ºC en el baño María.

Preparación del diluyente El diluyente debe reunir una serie de características que aporten a la célula espermática un sustrato energético, un sistema tampón, estabilización de la membrana y antibióticos, de tal forma que permita mantener la capacidad fecundante de los mismos durante varios días. Existen diluyentes de larga duración (hasta 7 días de conservación) y diluyentes que conservan el semen refrigerado durante 48-72 horas. El agua utilizada debe reunir también una serie de requisitos imprescindibles como son: conductividad: 1 microsiemens/cm; pH: 5 a 5,7; recuento bacteriano: 0 a 10 UFC/ml, y una presión osmótica entre 0 y 3 miliosmoles. El diluyente en polvo se debe disolver en el volumen adecuado de agua a 37 ºC y debe ser almacenado en un recipiente (Erlenmeyer o bolsa). Posteriormente se realiza una homogenización de mezcla con ayuda de un agitador.

Preparación de dosis Una vez determinada la calidad seminal y conociendo la concentración por mm3 se procede al cálculo de dosis seminales. La concentración de dichas dosis varía entre 1.500 x 106 a 3.000 x 106 espermatozoides de buena calidad. Se realiza la dilución semen/diluyente a 37 ºC. Esta dilución final no debe sobrepasar los 15 minutos. Debemos comprobar que no existen diferencias de temperatura entre el eyaculado y el diluyente. La dilución debe hacerse con sumo cuidado y verter el semen suavemente sobre el diluyente, permitiendo una dilución homogénea (fig. 16). El grado de dilución debe estar entre 1/10 y 1/25. Una vez preparadas las dosis deben permanecer

Dosier de

Carlos García Artiga Yasmín De Loera Ortega Carlos García Saldaña María Jesús Hernández González Adelfa C. García-Contreras