La pagina scientifi ca Spettroscopia NIR per l’autenticazione della seppia Sarah Currò et al

Una tecnica rapida, ecologica e non distruttiva per gli OSA

Spettroscopia NIR per l’autenticazione della seppia

di Sarah Currò, Luciano Boff o, Luca Fasolato, Enrico Novelli, Stefania Balzan

Tracciabilità, origine della zona di pesca e autenticazione di freschezza sono concetti con cui quotidianamente gli operatori del settore alimentare (OSA) e le autorità competenti devono confrontarsi. Attualmente, risulta di fondamentale importanza individuare soluzioni che permettano di evidenziare velocemente e facilmente i comportamenti illeciti effettuati essenzialmente a scopo di lucro, ma che possono avere, a volte, importanti impatti negativi sulla salute e sulla fi ducia dei consumatori e sul corretto funzionamento del mercato compromettendo la produzione, la commercializzazione e il consumo dei prodotti. Una risposta e un supporto soddisfacente possono provenire dall’applicazione di metodi analitici untarget, che negli ultimi anni sono stati via via impiegati nelle ricerche nell’ambito della sicurezza degli alimenti con interessanti applicazioni in campo in quanto permettono di ottenere il responso in tempi rapidi e a ridotto impatto ambientale al contrario delle metodiche target.

Target o untarget? Un piccolo vocabolario

I metodi analitici possono essere distinti in target e untarget. I metodi target (mirati) sono quelli che ricercano in modo mirato uno specifi co analita (ad esempio composto chimico, elemento, ecc…) che, ad esempio, potrebbe essere introdotto volontariamente (sofi sticazione o adulterazione) per commettere una frode anche di tipo sanitario (ad esempio monossido di carbonio). I metodi target sono spesso impiegati

Seppie pescate con nasse in Alto Adriatico.

Figura 1 – Comparazione delle assorbanze trasformate per evidenziare le diff erenze tra le seppia fresca (linea azzurra) e quella decongelata (linea grigia). In alcune aree dello spettro è possibile osservare variazioni nell’assorbimento corrispondenti ad alcune componenti chimiche del prodotto.

come metodi di riferimento a cui ricorrono l’autorità competente e gli OSA quando necessitano, ad esempio, di identifi care una specie ittica (ad esempio analisi del DNA) o la presenza di additivi alimentari (ad esempio tecniche cromatografi che) non ammessi o superiori al limite consentito. Possono essere identifi cati uno o più analiti (marker o target) e la conformità di una matrice (ad esempio trancio di tonno) può quindi essere classifi cata confrontandola rispetto a una soglia (ad esempio, limite istamina, solfi ti e polifosfati) oppure confrontando con un database (ad esempio analisi isotopica).

Tuttavia, le metodiche target pur essendo molto sensibili, sono distruttive (il campione viene distrutto per l’analisi), dispendiose in termini di tempo e permettono di risalire al tipo di frode (sanitaria o commerciale) con una singola analisi. Purtroppo, hanno lo svantaggio di dover conoscere l’esatta natura di ciò che si sta ricercando, quindi in certi casi non sono in grado di far emergere ulteriori frodi rispetto a quella ipotizzata o di identifi care ulteriori non conformità.

In queste situazioni sono di aiuto i metodi untarget (non mirati), ovvero degli approcci che permettano di rilevare la presenza di molteplici anomalie o differenze relative a componenti quantitative o caratteristiche qualitative. Infatti, i metodi untarget si caratterizzano per la capacità di analizzare simultaneamente un numero molto elevato di target non specifi ci poiché si basano per la maggior parte su metodiche spettroscopiche (dove sovente uno spettro è composto da oltre 100 lunghezze d’onda che costituiscono dei target aspecifi ci); sono quindi di tipo qualitativo, e sono utili nei casi in cui non siano disponibili analiti da identifi care con certezza.

È un approccio che tipicamente può essere impiegato per l’autenticazione degli alimenti con marchio di qualità (ad esempio prodotti DOP). Si parla anche di impronta digitale (fi ngerprinting) specifi ca per il prodotto soprattutto quando si utilizzano metodi analitici come la spettrometria di massa, la spettroscopia, la risonanza magnetica nucleare (NMR) e molti altri. Come suggerito da alcuni autori, si tratta di metodi che possono essere impiegati per evidenziare frodi, per monitoraggi o screening e lavorare in sinergia con i metodi target. È un approccio olistico, ovvero che tiene in considerazione la complessità della realtà e l’interazione tra tutte le sue parti.

In questo articolo verranno evidenziate le potenzialità applicative di metodi basati sulla spettroscopia nel vicino infrarosso per autenticare la seppia come prodotto di pregio per alcune marinerie Italiane essendo caratterizzata da una lunga tradizione e da un grande interesse commerciale (si veda box dedicato alla Seppia di Chioggia).

La spettroscopia nel vicino infrarosso

Più nota come NIRS (Near Infrared Spectroscopy) è una tecnica untarget utilizzata in molti ambiti tra cui quello agroalimentare, farmaceutico, petrolchimico solo per citarne alcuni. La spettroscopia si basa sull’interazione della materia con la radiazione elettromagnetica; nel caso del vicino infrarosso, la regione d’interesse è collocata nella porzione tra il visibile e il medio infrarosso (750±2500 nm). Quando un alimento (ad esempio fi letto di pesce) viene analizzato tramite spettroscopia NIR, lo strumento restituisce uno spettro che può essere opportunamente elaborato (Figura 1) e che rappresenta l’assorbimento di energia da parte dei vari gruppi

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Tabella 1 – Origine geografi ca, specie e numerosità dei campioni utilizzati per lo studio

Origine geografi ca Zona FAO Specie N. campioni

Oceano Atlantico nord-orientale 27 Sepia offi cinalis 371 Oceano Atlantico centro-orientale 34 Sepia offi cinalis 279 Oceano Indiano orientale 57 Sepiella inermis 28 Oceano Pacifi co centro-occidentale 71 Sepiella inermis 30 Mar Adriatico 37.2.1 Sepia offi cinalis 19

chimici di cui l’alimento è composto. Le caratteristiche della tecnica NIRS hanno molteplici vantaggi che incentivano la sua applicazione in ogni fase della fi liera produttiva e in ogni settore. In particolare, si contraddistingue dalle tecniche routinarie per il pregio di essere: 1. rapida e quindi compatibile con la vita commerciale dei prodotti deperibili e i tempi dell’operatività in campo;

2. a ridotto impatto per l’ambiente

perché non necessità di altri materiali o reagenti, e di complessa

preparazione del campione; 3. non distruttiva, in quanto i prodotti analizzati potranno continuare il proprio percorso nel commercio; 4. versatile, in quanto può essere integrata in strumenti fi ssi da laboratorio o in strumenti di ridotte dimensioni (Figura 2) adatti ad essere trasportati in ogni fase della fi liera di produzione/lavorazione.

Data la polifunzionalità e facilità di applicazione, può essere adoperata direttamente da personale minimamente formato o integrata nel processo di produzione/lavorazione in modo automatizzato. Infatti, questa tecnica può essere utilizzata durante il fl usso di lavorazione/produzione (in-line e on-line) o anche in uno specifi co momento della lavorazione/produzione interrompendo temporaneamente il processo (atline) per il controllo preliminare o la verifi ca fi nale del prodotto (off-line). Per contro, richiede un investimento iniziale per l’acquisizione della strumentazione e un solido approccio statistico che prevede il ricorso a

Sepe de Ciosa (Seppia di Chioggia)

La città di Chioggia (VE) è legata alla lavorazione della seppia da secoli: infatti i documenti la citano già nel XI secolo testimoniando una lavorazione particolare (sepe seche) svolta dalle famiglie degli stessi pescatori. Questa lavorazione prevedeva che subito dopo la cattura le seppie fossero eviscerate, lavate con acqua di mare e quindi essiccate all’aria e al sole, fase che conferiva colore giallo e durezza ma anche possibilità di essere conservate e commercializzate nei mercati del Nord Italia, Grecia e Istria. Storicamente erano commercializzate solo a livello locale, in ragione della limitata conservabilità, le seppie bianche, ovvero spellate dopo eviscerazione. Lo stretto legame con questo prodotto ha portato a inserire nel 2014 la Seppia di Chioggia (Sepia offi cinalis) nell’elenco nazionale dei Prodotti Agroalimentari Tradizionali italiani (PAT). La pesca della seppia viene praticata tutto l’anno nell’alto Adriatico (Area FAO 37.2.1), mentre nelle acque costiere delle lagune venete si effettua soprattutto nei mesi di aprile e maggio ed è prevalentemente commercializzata a livello locale presso i mercati ittici del Veneto. Attualmente il prodotto viene spellato ed eviscerato a mano, lavato in più cicli con acqua di laguna depurata che rende turgidi i tessuti, e commercializzato fresco, decongelato o congelato e glassato A volte su richiesta può essere sezionato e preparato in “fettuccine” che diventano spesso ingredienti di preparazioni più complesse. Tipicamente “la seppia di Chioggia” dopo lavorazione si presenta “bianca” e viene commercializzata in cassette di polistirolo sotto ghiaccio. Nelle etichette applicate alle singole casse vengono riportate oltre le informazioni previste per legge per il consumatore anche il marchio di qualità del prodotto. Dato il legame storico, culturale ed economico con il territorio nel 2015 i pescatori hanno ritenuto fondamentale rafforzare il valore del riconoscimento uffi ciale ottenuto dal Ministero delle Politiche Agricole e Forestali con la creazione di uno specifi co marchio depositato presso il Ministero dello Sviluppo Economico. Tuttavia, in alcuni periodi dell’anno, data la ridotta disponibilità della materia prima, sono possibili frodi di sostituzione con prodotto di diversa origine o vendita di decongelato per fresco. I metodi spettroscopici, in particolare la spettroscopia NIRS portatile, possono essere impiegati per caratterizzare la Seppia di Chioggia al fi ne di preservare la sua genuinità.

In alto: fase scongelamento seppie. In basso: fase di lavaggio prodotto dopo eviscerazione.

Figura 2 – Raccolta del dato spettrale attraverso utilizzando uno strumento NIRS portatile. Figura 3 – Finestra di lettura collocata nella superfi cie inferiore dello strumento NIRS. competenze esterne per lo sviluppo di modelli analitici basati su approcci statistici (chemiometria) per svolgere le determinazioni richieste.

La tecnica NIRS può essere utilizzata per analisi di tipo qualitativo al fi ne di attribuire delle caratteristiche identifi cative. Esempi di tale applicazione sono nell’ambito dell’autenticazione di prodotto, come l’identificazione di specie distinguendo tra i fi letti di Gadus morhua e Melanogrammus aeglefi nus e altre preparazioni o del metodo di produzione (branzino selvaggio o d’allevamento) e l’area di pesca (Area FAO). Nelle analisi di tipo quantitativo i dati spettrali vengono interpretati per quantifi care le informazioni chimiche del prodotto come il contenuto di grasso o di acqua. La tecnologia NIRS può essere impiegata sia nell’ambito del controllo qualità sia per l’autenticazione degli alimenti come sistema di tutela, controllo dei fornitori e della fi liera o per valorizzare particolari ambiti legati alla tipicità o al sistema produttivo.

La ricerca

Vengono presentati due esempi di utilizzo della spettroscopia NIR per l’autenticazione della seppia (Sepia offi cinalis) per defi nire lo status fi sico (fresco vs decongelato) e l’areale di provenienza (Area FAO). Gli studi sono stati condotti all’interno di uno stabilimento ittico all’ingrosso (Blupesca Srl, Chioggia, VE) per analizzare i campioni in condizioni reali di operatività aziendale utilizzando uno strumento NIRS portatile (PoliSPECNIR (ITPhotonics, Breganze, VI; Figura 2). Dal punto di vista operativo, lo strumento viene semplicemente posto a contatto con la superfi cie della seppia e “strisciato” per 5 secondi, necessitando di una superfi cie utile per la lettura di 3,2 cm2 (Figura 3).

Caso studio fresco vs. decongelato Oltre a rispondere a quanto richiesto dal Regolamento (UE) n. 1379/2013, per alcune specie ittiche è importante capire se un prodotto è stato sottoposto a congelamento per ragioni sanitarie di bonifi ca dai parassiti naturalmente presenti. I metodi

tradizionali come l’osservazione del cristallino, la variazione della conducibilità elettrica dei tessuti, l’analisi istologica o i test enzimatici a volte risentono di vari fattori che ne limitano l’effi cacia e sono strettamente applicabili attualmente solo agli osteitti (pesci ossei). Per i cefalopodi, a causa dell’elevata percentuale cartilaginea di cui il corpo è composto, attualmente non sono disponibili metodi consolidati per discriminare il prodotto fresco dal decongelato. Questo studio ha valutato la capacità di utilizzare la spettroscopia NIR per riconoscere lo stato fi sico della Sepia offi cinalis. Sono stati utilizzati 669 esemplari di cui 221 seppie fresche (analizzate entro 12 ore dal loro arrivo) e 448 seppie decongelate (tempo di congelamento 2-14 mesi) derivanti da 44 lotti commerciali pescati in tre stagioni di cattura (inverno, primavera ed estate) al fi ne di considerare la variabilità stagionale. Le misure NIRS sono state effettuate su seppie eviscerate, spellate e conservate a temperatura di 0-2 °C.

Elaborazioni chemiometriche dei dati NIRS

I dati acquisiti sono stati sottoposti ad analisi statistica per sviluppare un modello di classifi cazione atto a differenziare lo stato fi sico delle seppie (prodotto fresco vs decongelato). Dal profi lo degli spettri emerge che il congelamento modifi ca la struttura fi sica dei tessuti (danni cellulari, perdita di liquidi o altro) determinando delle differenze evidenti soprattutto a particolari intervalli dello spettro di assorbimento (902–1030, 1090–1452 e 1612–1670 nm). Tali differenze sono probabilmente ascrivibili ai cambiamenti derivati dal congelamento nel quale intervengono fenomeni di proteolisi (con aumento degli aminoacidi liberi e diminuzione della capacità di trattenere acqua), modifi cazione dei lipidi e della struttura muscolare con formazione a livello microscopico di spazi vuoti che interagiscono con la radiazione elettromagnetica in modo diverso rispetto il tessuto fresco.

Dallo studio è emerso che la spettroscopia NIR è stata in grado di identificare correttamente lo stato fi sico di 97 esemplari su 100 confermando la possibilità di essere impiegata per evidenziare frodi commerciali o di segregare il prodotto in tempi rapidi, compatibili con una categoria merceologica caratterizzata da una veloce deteriorabilità.

Caso studio Zona di cattura

L’attribuzione dell’origine geografi ca nel settore ittico (oltre che tramite verifi ca documentale), viene generalmente eseguita utilizzando tecniche che si basano sull’analisi del DNA, delle proteine o della misurazione degli isotopi. Si tratta di metodiche che però necessitano di tempo, reagenti, distruzione del campione e personale addestrato. L’identifi cazione della zona di cattura con la spettrometria NIR è stato l’obiettivo del secondo studio. Sono state analizzate 727 seppie (fresche = n. 221; decongelate = n. 506; peso 0,1-0,3 kg) appartenenti a 49 lotti commerciali. Lo studio ha considerato cinque diversi areali di cattura (Tabella 1).

L’analisi statistica dei dati spettrali ha evidenziato che le molteplici aree di pesca hanno degli effetti sulla composizione delle seppie (Figura 4). Infatti, gli spettri presentano dei picchi di assorbimento che differiscono tra loro in molti intervalli (934–952 nm, 1126–1138 nm, 1168–1254 nm e 1356–1418 nm, ecc…) ma le porzioni spettrali più informative sono quelle legate ai lipidi. Infatti, molteplici studi hanno indicato che la variabilità del profi lo di acidi grassi (parte dei lipidi) è correlata alla zona di pesca e alle proprie caratteristiche ambientali che comprendono i fattori fi sici (ad esempio correnti, temperatura), chimici (ad esempio salinità e pH) e biologici (dalla diversità e disponibilità alimentare), e dalle loro interconnessioni che conferiscono attributi distintivi agli organismi che ci vivono.

In questo scenario, in generale la tecnica NIRS ha permesso di identificare il 92% delle seppie analizzate; invece, nello specifi co, le seppie derivanti dall’Oceano Indiano sono state identifi cate completamente indipendentemente dalla specie, dalle dimensioni e dallo stato fi sico. Questo potrebbe essere attribuito alle differenze marcate degli ambienti idrici e delle fonti alimentari rispetto a quelle della stessa specie Sepiella inermis proveniente dall’Oceano Pacifi co. Anche questo risultato suggerisce che l’impiego di uno strumento NIRS portatile può rappresentare una soluzione veloce e adatta per supportare il controllo dell’origine del prodotto utile agli OSA, alla grande distribuzione ma anche alle autorità competenti per migliorare la rintracciabilità e le garanzie al consumatore, sfavorendo la concorrenza sleale e le attività fraudolente. Inoltre, questo approccio potrebbe essere impiegato per valorizzare e tutelare gli alimenti che sono il risultato di una interconnessione tra tradizione e luogo di origine e che possono essere riconosciute sia a livello internazionale (DOP) che a livello regionale (Prodotto Agroalimentare Tradizionale – PAT). Tra le 21 PAT venete relative ai prodotti ittici emerge la Seppia bianca di Chioggia.

Figura 4 – Comparazione delle assorbanze trasformate per evidenziare le diff erenze tra le seppie pescate in diff erenti zone di pesca FAO.

Opportunità e competenza

Gli studi evidenziano concretamente la possibilità di utilizzare la tecnica NIRS all’interno di aziende che ricevono, lavorano e vendono il prodotto o in piattaforme di distribuzione per classifi care, e quindi commercializzare correttamente il prodotto nel rispetto delle dichiarazioni relative all’etichettatura secondo i Reg. EU 1169/2011 e 1379/2013. Inoltre, robustezza e facilità d’uso unite alla rapidità di lettura della strumentazione portatile rendono la tecnica compatibile con la dinamicità della realtà aziendale, preservando l’integrità del prodotto e quindi non causando perdite economiche. La versatilità della tecnica permette di trasferire lo stesso approccio anche ad altre specie (animali o vegetali) e di lavorare anche con il prodotto preparato per la tutela di prodotti a marchio di qualità quali DOP, IGP e PAT.

L’applicazione di questi metodi untarget, tuttavia, per supportare l’autenticazione deve superare alcuni punti critici per costruire un modello di classifi cazione robusto e stabile che garantisca l’affi dabilità delle misure. In primis, l’acquisto della strumentazione che rappresenta la parte più onerosa di tale approccio (€ 3.000-15.000); lo sviluppo del modello qualitativo o quantitativo che deve essere costruito includendo la più ampia variabilità che caratterizza il prodotto analizzato (metodo di produzione, stagione di pesca, ecc…); la scelta degli approcci chemiometrici più adeguati e più performanti in base alla caratteristica da defi nire, fase che prevede una adeguata competenza statistica; l’aggiornamento dei modelli di autenticazione per includere la variabilità derivante dai nuovi processi di produzione/ lavorazione, cambiamenti climatici e dall’inquinamento dei mari.

Dott.ssa Sarah Currò

Dipartimento di Biomedicina Comparata e Alimentazione Università di Padova

Dott. Luciano Boffo

Consulente Sicurezza Alimentare Chioggia

Prof. Luca Fasolato

Dipartimento di Biomedicina Comparata e Alimentazione Università di Padova

Prof. Enrico Novelli

Dipartimento di Biomedicina Comparata e Alimentazione Università di Padova

Dott.ssa Stefania Balzan

Dipartimento di Biomedicina Comparata e Alimentazione Università di Padova

Nota

Le fonti bibliografi che sono disponibili presso gli autori. Si ringrazia la Blupesca Srl di Chioggia (VE) per la disponibilità e la collaborazione.