¥
Revue Africaine de Santé et de Productions Animales © 2005 E.I.S.M.V. de Dakar
A RTICLE ORIGINAL Effet de la fermentation du lait sur la survie de Brucella abortus A. FANE1, B. BONFOH1,2*, J. ZINSSTAG2, Z. FARAH3, M. NIANG1,S. TEMBELY1 I.O. ALFAROUKH4 et A.J. AKAKPO5 1 2 3 4 5
Laboratoire Central Vétérinaire, BP 2295, Bamako, Mali Santé publique et épidémiologie, Institut Tropical Suisse, PO Box, 4002 Bale, Suisse Institut des Sciences Alimentaires, Ecole Polytechnique Fédérale, 8092 Zurich, Suisse Institut du Sahel, BP 1530, Bamako, Mali Ecole Inter-Etats des Sciences et Médecine Vétérinaires, BP 5077, Dakar, Sénégal * Correspondance et tirés à part , e-mail : bassirou@agrosoc.insah.org
Résumé
L’étude a pour objet d’évaluer la survie de Brucella abortus dans le lait fermenté. 100 ml de lait sont ensemencés avec 1 ml de ferment lactique et d’une suspension (Mc Farland N°1 : 0,8 106 ufc/ ml) de souche Brucella abortus (Souche Togo 248). Ce lait a été incubé à 37°C pendant 7 jours. De J0 à J7, 0,5 ml de lait en fermentation est prélevé et quotidiennement ensemencé sur le milieu de culture pour Brucella, pour détecter et dénombrer les colonies. A J0 les colonies ne sont pas visibles. Elles apparaissent à J1 (0,3 102 ufc/ml) augmentent entre J2 et J3 6 3 (10 ufc/ml) et diminuent avec le pH à J4 (0,5 10 ufc/ml). Aun pH de 4, les colonies ne sont plus visibles. Le pH acide entraîne une diminution des brucelles. Mais à J6 et J7 il n’y a plus de brucelles. La fermentation du lait, n’offre donc pas une garantie de sécurité sanitaire pour les consommateurs de lait fermenté. (RASPA, 3 (1) : 3-6).
Mots-clés : Lait - Fermentation - B r u c e l l a a b o r t u s - Survie - Mali. Abstract Effect of milk fermentation on the survival of B ru c ell a ab or tu s
The aims of the study is to evaluate the survival of Brucella abortus in the fermented milk. A volume of 100 ml of milk was inoculated with 1 ml of the starter culture and with a suspension (Mc Farland N°1: 0,8 106 ufc/ ml) of Brucella abortus (Strain Togo 248). This milk was incubated at 37°C for 7 days. From day 0 to day 7, 0,5 ml of milk in incubation was taken everyday and inoculated on Brucella agar media to detect and count colonies. At day 0, colonies were 3not visible. They appeared at day 1 (0,3 102 ufc/ml), increased between day 2 and 3 (106 ufc/ml) and decreased with the pH in day 4 (0,5 10 ufc/ml). At pH =4, the colonies were no more visible. The acid pH reduced the number of Brucella but do not the sterilise it. But fermention does not offer sanitary safety guarantee fermented milk consumers.
Key – Words: Milk - Fermentation - B r u c e l l a a b o r t u s - Survival - Mali.
Introduction En Afrique sub-saharienne la production et la consommation de lait et des produits laitiers varient avec les régions et dépendent fortement des facteurs environnementaux, de la productivité des animaux, des saisons et des habitudes alimentaires des différents groupes ethniques. Le Mali a une longue tradition d’élevage, de production et de consommation de lait. La production laitière au Mali est très faible malgré l’effectif élevé de son cheptel (7 millions de bovins) et répond seulement à 40% des besoins laitiers du pays. Paradoxalement le pays a, d’une part, augmenté ses exportations de bétail sur pied vers les pays côtiers, depuis la dévaluation du Fcfa [11] et d’autre part ses importations en poudre de lait évaluées à près de 15,5 milliards de Fcfa [5], [6]. Les deux intrants (lait frais local et lait en poudre importé) subissent des transformations semi modernes ou artisanales dans des circuits très complexes [10]. Ce qui contribue à la mise sur le marché de produits laitiers dont la qualité médiocre est peu connue des consommateurs. Les pathologies animales (zoonoses, mammites subcliniques) et certaines pratiques tel que le mouillage, peuvent rendre ces produits impropres à la consommation [14]. RASPA Vol.3 N 0 1, 2003
La recrudescence de certaines maladies zoonotiques comme la brucellose [7], [ 9], [19], [20], [21], [22], milite en faveur d’études épidémiologiques sur ces pathologies. L’isolement des brucelles de liquide d’hygroma effectués au Mali [2], [ 3], [22] a permis d’identifier quatre souches de Brucella au Mali. La mise en évidence de ces brucelles prouve l’existence du risque de contamination pour les professionnels de la filière laitière et les consommateurs de lait cru et de ces dérivés [18]. La recherche dans les pools de lait (frais et fermenté) d’anticorps de Brucella, témoins d’infection des vaches montre des prévalences relativement élevées avec 30% à Bamako et 4,5-9,6% dans les région [8]. Ces résultats reflètent bien la prévalence de la maladie au sein des troupeaux [2], [ 3], [22]. Près de 43% des consommateurs de lait et produits laitiers ignorent encore que ces produits peuvent dans certaines conditions transmettrent des maladies [15]. Parmi eux 56% consomment du lait cru (résultats non publiés). La brucellose est transmise à l’homme entre autres, par contact avec les animaux malades et la consommation du lait cru provenant d’une vache infectée. En milieu traditionnel, le lait est consommé cru ou spontanément fermenté à la température ambiante.
3
A. FANE et al.
Il est démontré que la fermentation permet de réduire la flore microbienne pathogène dans le lait [17]. L’objectif de l’étude est de mettre en évidence le risque pour les consommateurs du lait fermenté provenant d’un lait cru contenant des Brucella, par l’évaluation de la survie du germe dans le lait soumis à la fermentation.
poudre à 200 ml d’eau distillée stérile (121°C) puis ramenée à 65°C (LSR).
Matériel et Méthodes
2. CONTRÔLE DE LA QUALITÉ BACTÉRIOLOGIQUE
L’étude a été conduite au Laboratoire Central Vétérinaire de Bamako avec des échantillons prélevés autour de Bamako (rayon 40 km). 1. LAIT ET FERMENT LACTIQUE 1.1. Lait
Deux produits laitiers sont utilisés pour l’étude, le lait frais de ferme et le lait en poudre du commerce. Le lait frais de ferme (LFF) est obtenu de façon aseptique dans les fermes de production. Environ 500 ml de lait sont prélevés des trayons directement dans des flacons stériles. Les flacons sont ensuite placés dans une glacière et acheminés au laboratoire central vétérinaire de Bamako où ils arrivent à une température variant entre 8-10°C en 2 heures maxima. Les prélèvement et le transport du LFF sont effectués suivant les recommandations de la fédération internationale du lait (FIL) [16] et du Codex alimentarus sur l’hygiène alimentaire [12, 13]. Le lait en poudre (Rapilait ®) est reconstitué stérilement en mélangeant 10g de
1.2. Ferment lactique
Le ferment lactique est obtenu à partir de 5 g de poudre de ferment de commerce EZAL ® (MY 800, 100E/U) contenant Streptococcus thermophilus,ajoutés à 200 ml de lait frais pasteurisé (80°C) et incubé pendant 4 heures à 42°C. DES PRODUITS LAITIERS
Le dénombrement des germes est effectué sur le LFF et le LRS. Les isolements ont concerné les germes totaux (GT), les Enterobacteriaceae (EB), les Entérocoques (EC), Staphylococcus aureus (SA), les levures et les moisissures. Les procédures standards de la fédération internationale du lait [16] ont été utilisées pour ces analyses bactériologiques. 3. ENSEMENCEMENT DES SOUCHES DE BRUCELLA ET DU FERMENT DANS LE LAIT
Environ 100 ml de LFF, de LRS ont été ensemencés avec 1 ml d’une suspension (Mc Farland N° 1) soit une concentration de 0,8 106 ufc/ml de la souche (Togo N°248) de Brucella abortus provenant de la bactériothèque de l’Ecole Inter-Etats des Sciences et Médecine Vétérinaires de Dakar (EISMV). Les lots de produits ensemencés, l’ambiance de température et les concentrations de Brucella sont indiqués dans le tableau I. Il est ajouté 1 ml de solution de ferment lactique dans chaque flacon (100 ml) puis le tout est incubé à +4° C ou 37° pendant 7 jours.
Tableau I : Ensemencement des souches de Brucella dans le lait et les solutions tamponnées Milieux
Quantité (ml)
Ambiance de température (°C)
Solution de ferment (ml)
Nombre de Brucella ensemencées (ufc)
Durée d’incubation (jours)
Rapilait® reconstitué
100 100
37°C +4°C
1 1
3x108 3x108
7 7
Lait de ferme
100 100
37°C +4°C
1 1
3x108 3x108
7 7
Tampon pH = 3,5
100 100
37°C +4°C
0
3x108 3x108
7 7
Tampon pH = 4
100 100
37°C +4°C
0
3x108 3x108
7 7
Tampon pH = 4,5
100 100
37°C +4°C
0
3x108 3x108
7 7
Tampon pH = 5
100 100
37°C +4°C
0
3x108 3x108
7 7
Tampon pH = 5,5
100 100
37°C +4°C
0
3x108 3x108
7 7
Tampon pH= 6,8
100 100
37°C +4°C
0 0
3x108 3x108
7 7
ufc = unité formant colonie
4. ISOLEMENT DES BRUCELLA DANS LE LAIT FERMENTÉ
Chaque jour, 0,5 ml de chaque lot de lait (à 4°C et à 37°C) est prélevée après homogénéisation pour l’ensemencement sur les milieux de culture pour Brucella (Brucella selective Supplement Oxoid SR 83). Les géloses ainsi ensemencées sont incubées à 37°C dans une atmosphère contenant 10% de CO et examinés au jour le jour pendant 5 jours. L’identification des2 souches de Brucella est faite au microscope suivant les méthodes classiques [4]. Les colonies sont bleuâtres, petites et rondes avec un contour régulier. 4.1. pH et Températures
Le pH est mesuré quotidiennement avec un pH-mètre (Metrohm Ltd CH-9101 Herisau) étalonné avec les solutions Standard à PH4 et à PH- 7 à 25°C. Les températures de l’incubateur et du réfrigérateur sont contrôlées et ajustées (incubateur : 37°C ; réfrigérateur : 4°C) quotidiennement pendant les 7 jours. 4
Résultats
1. QUALITÉ BACTÉRIOLOGIQUE DU LAIT DE FERME ET DU LAIT RECONSTITUÉ
Les dénombrements montrent un lait de ferme très contaminé avec une flore très variée alors que le lait reconstitué garde sa propriété stérile (tableau II). 2. DÉNOMBREMENT ET IDENTIFICATION DE BRUCELLA ABORTUS DANS LES PRODUITS LAITIERS INCUBÉS À +4°C
Le lait frais de ferme et le lait reconstitué conservés à +4° ne présentent pas de variation de pH au cours des 7 jours RASPA Vol.3 N 0 1, 2005
Effet de la fermentation du lait sur la survie de Brucella abortus
d’incubation; cependant lorsqu’ils sont ensemencés (ferment et Brucella) et incubé à 4°C, seul le LFF montre une croissance de levures mais peu de Brucella. Avec le lait reconstitué, on observe la croissance de levures à J0. On y retrouve également des Brucella dont la croissance commence à J1 puis diminue à partir de J5 de manière non significative (tableau III). Dans le lait frais de ferme, les contaminants (levures et moisissures) masquent la présence des colonies de Brucella de J0 à J7 ce qui a rendu impossible le dénombrement de Brucella dans le LFF. Tableau II : Qualité micro biologique des produits laitiers soumis à la fermentation Dénombrement
Lait cru de ferme (ufc.ml-1)
Germes totaux Enterobacteriaceae Enterocoques Staphylococcus aureus Levures Moisissures
6,4 106 1,4 105 1,6 105 <10 9,3 104 3,4 104
Lait reconstitué (Rapilait ®) (ufc.ml-1)
Lait pasteurisé pour préparation du ferment <10 <10 <10 <10 <10 <10
<10 <10 <10 <10 <10 <10
Tableau III : Suivi de la survie des brucelles dans le Rapilait ® incubé à 4°C Période de fermentation J0 J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7
Température ambiante du lait
pH du lait
Croissance de Brucella
23°C 4°C 4°C 4°C 4°C 4°C 4°C 4°C
6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5
+ + + + + + -
Moyennes des colonies (ufc.ml-1) de Brucella après 5 jours d’incubation
3. DÉTECTION DES BRUCELLA DANS LES PRODUITS LAITIERS INCUBÉS À 37°C
<10 4,4-102 4,1 102 2,9 102 3,5 102 1,1-102 <10 <10
Les boites ensemencées avec le lait frais de ferme à J0 présentent une très forte contamination (levures) qui empêche l’observation des colonies de Brucella abortus. Brucella abortus semble avoir une vitesse de croissance lente au pH=6,8. Ce pH diminue jusqu’à 4 à J5. Les colonies ne sont visibles qu’à partir de J1 mais difficilement détectables. La mise en évidence des colonies se précise mieux à J2 avec un nombre difficilement quantifiable sur les boîtes de Pétri (≤ 1,5x106 ufc). Par la suite, on note une baisse considérable (3000 fois moins) du nombre de colonies à J4 (0,5x 103 ufc) avec une disparition de ces colonies de J5 jusqu’à J7 (≤ 10 ufc) (tableau IV). Tableau IV : Survie des brucelles dans le lait frais de ferme fermenté à 37° Période de fermentation J0 J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7
Température ambiante du lait
pH du lait
23°C 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C
6,8 5,5 5 4,5 4,4 4 4 4
Croissance de Brucella + + +++ +++ ++ -
Moyennes des colonies (ufc.ml-1) de Brucella après 5 jours d’incubation <10 0,3 102 ≤ 1,5 106 ≤ 1,5 106 0,5 103 <10 <10 <10
Dans le Rapilait ®, l’observation de Brucella se fait entre J1 et J5 mais avec un nombre moins important de colonies (102-103 ufc) par rapport au lait frais fermenté. A ce niveau, la baisse du pH se situant entre 4,4 (J5) et 4 (J6) entraîne une diminution, voire une disparition des brucelles (<10 ufc/ml) (tableau V). RASPA Vol.3 N 0 1, 2005
Tableau V : Survie des brucelles dans le Rapilait ® fermenté à 37° Période de fermentation J0 J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7
Température ambiante du lait
pH du lait
Croissance de Brucella
23°C 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C
6,5 5 4,7 4,4 4,4 4,4 4 4
+ + +++ +++ ++ + -
Moyennes des colonies (ufc.ml-1) de Brucella après 5 jours d’incubation <10 5,1 102 4,5 102 4,04 103 1,07 103 1,8-102 <10 <10
Entre J2 et J3, le nombre de Brucella est plus élevé dans le lait frais fermenté que dans le Rapilait ® reconstitué. Cela dénote aussi de la différence de composition des deux produits laitiers.
Discussion La brucellose humaine est bien décrite au Mali [1], [21], [9] et [20] où une partie de la population consomme le lait non pasteurisé et les produits laitiers fermentés. Le lait frais de ferme que nous avons analysé, est très contaminé, ce qui confirme les résultats de Bonfoh et al [7]. Il n’y a pas eu de croissance de Brucella dans les différentes solutions tamponnées parce que les milieux ne contenaient aucun élément nutritif. Les résultats de l’étude sur les laits fermentés montrent que le pH acide influence négativement la survie des bactéries. Une baisse du pH entraîne une diminution du nombre de brucelles dans le lait. La fermentation guidée est un moyen de conservation du lait pasteurisé D’autres études ont montré que la baisse du pH entraînait une diminution voire une disparition des germes pathogènes [17], [14]. Dans les conditions où le lait est fermenté sans pasteurisation, les risques de présence de brucelles demeurent. La fermentation qui entraîne une acidification du milieu devant atteindre un pH de 4, s’accompagne d’une diminution des Brucella, mais pas d’une stérilisation. La souche de Brucella abortus résiste à l’effet de la fermentation jusqu’à un pH minimum de 4,4 au-dessous duquel sa présence n’est plus détectée dans le lait fermenté. En dessous d’un pH de 4 les sucres et les protéines sont fortement dégradés. Ce milieu ne permettrait plus la survie de Brucella abortus. Ainsi, l’inhibition serait aussi due à l’effet conjugué de l’acidité du lait fermenté et à son épuisement en nutriments. La survie des Brucella est donc dépendante des facteurs comme le degré de contamination du lait, la valeur nutritive du lait et le degré de fermentation évalué avec la mesure du pH. Dans les conditions normales de terrain le pH 4 ne peut être obtenu qu’après 5-6 jours de fermentation. La forte demande en produits laitiers sur le marché fait que le lait fermenté est rapidement vendu en 24 à 48 heures de fermentation. De ce fait, le pH de 4 n’est pas atteint et donc les risques de persistance des Brucella dans un tel produit sont élevés et ceux de transmission au consommateur non négligeables. Ceci confirme les résultats de Steinmann [20] qui a montré que 10,1% des patients fébriles consultant pour des accès palustres et qui sont consommateurs habituels de lait (frais ou caillé) avaient une sérologie positive en brucellose (Rose Bengale et test ELISA). 5
A. FANE et al.
L’évaluation du risque de la brucellose chez les consommateurs de lait et de produits laitiers passe par l’isolement des agents (Br. abortus et Br. melitensis ) dans les produits (frais et fermentés) pour effectivement prouver la transmission.
bactériologique. Rev. Elev. Méd. Vét. Pays trop. 40 (4) : 307320. 4 - ALTON G.G. & JONES L.M., 1988. Techniques for the brucellosis laboratory. Institut National Recherche Agronomique, Paris, 43-44pp. 5 - BONFOH B., 2002. Lait Sain pour le Sahel. Atelier de restitution des résultats. Bamako, Mali, LCV/INSAH STI/ETHZ: 44. 6 - BONFOH B., FANE A., TRAORE, N.A., COULIBALY Z., SIMBE C.F., ALFAROUK I.O., NICOLET J., FARAH Z. AND ZINSTAG J., 2002a. Qualité microbiologique du lait et des produits laitiers vendus en saison chaude dans le district de Bamako au Mali . Bioterre N° spécial: 242-250 7 - BONFOH, B., FANÉ, A., TRAORE, A. P., TOUNKARA, K., SIMBE, C. F., ALFAROUKH, O. I., SCHALCH, L., FARAH, Z., NICOLET, J., ZINSSTAG, J. 2002b “Use of an indirect enzyme immunoassay for detection of antibody to Brucella abortus in fermented cow milk.”Milchwissenschaft 57(7). 8 - BONFOH, B., FANE, STEINMANN P., HETZEL M., TRAORE, A. N., TRAORE M., SIMBE, C. F., ALFAROUKH, O. I., NICOLET, J., AKAKPO J.A., FARAH, Z., ZINSSTAG, J. 2003. Qualité microbiologique du lait et des produits laitiers vendus au Mali et leurs implications en santé publique. Etudes et recherches sahéliennes N°8-9 19-27. 9 - COULIBALY, A.., 1992. Contribution à l’étude de la brucellose bovine au Mali, cercle de Youvarou. Thèse. Doc, Méd. Vét. ENVL, n° 77 p 127. 10 - DEBRAH S, SISSOKO K, SOUMARE S., 1995. Etude économique de la production laitière dans la zone périurbaine de Bamako au Mali. Revue d’Elevage et de Médecine vétérinaire des pays tropicaux 48, 101-109. 11 - DIAGANA B., AKINDES F., SAVADOGO K., REARDON T., STAATZ J., 1999. Effects of the CFA franc devaluation on urban food consumption in West Africa: overview and crosscountry comparisons, Food Policy 24:465 12 - FAO & WHO, 1997a. The Codex Alimentarius Commission and the FAO/WHO Food Standards Programme. FAO, Rome. 13 - FAO & WHO, 1997b. General requirements (Food Hygiene). Codex Alimentarius (Supplement to Vol.1B) FAO, Rome. 14 - GRAN, H.M., MUTUKUMIRA, A.N., WETLESEN, A. and NARVHUS, J.A., 2002. Smallholder dairy processing in Zimbabwe: The production of fermented milk products with particular emphasis on sanitation and microbiological quality. Food Control, 13 (3):161-168. 15 - H ETZE L M.W., BONFOH B., FARAH Z., TRAORE M., SIMBE C.F., ALFAROUKH I., SCHELLING E., TANNER M., ZINSSTAG J., 2004. Diarrhoea, vomiting and the role of milk consumption: perceived and identified risk in Bamako (Mali). Tropical Medicine and International Health. 9:11321138. 16 - I D F, 1990. Handbook on milk collection in warm developing countries. IDF Special issue N°9002 (Brussels (Belgium). pp. 1-148. 17 - MENSAH, P., 1997. Fermentation - the key to food safety assurance in Africa Food Control 8, 271-278. 18 - MEYER M. E., 1985. Characterization of Brucella abortus strain 19 isolated from human and bovine tissue and fluids. Am. J. Vet. Res. 46: 902-904. 19 - PEREZ -AVRAHAM G., YAGUPSKY P., SCHLAEFFER F., B O R E R A., CAISERMAN S., RIESENBERG K., 2001. Zoonotic infections as causes of hospitalization among febrile Bedoin patients in southern Israël. Transactions of the Royal Society of Tropical Medecine and Hygiene 95 : 301-303. 20 - STEINMANN P., 2003. Brucellosis and Q-fever in Mali: Case detection, role of milk contamination and other risk factors. Diploma Thesis. Biology 1, University of Basel. 77 p. 21 - TASEI, J.-P., RANQUE, P., BALIQUE H., TRAORE, A.M., QUILICI, M.C., 1992. La brucellose humaine au Mali. Résultats d’une enquête séroépidémiologique. Acta Tropica. 39 253–264 22 - T O U N K A R A , K . , M A I G A , S . , T R A O R E , A . , S E C K , B . M . , AKAKPO, A.J., 1994. Epidémiologie de la brucellose bovine au Mali : enquête sérologique et isolement des premières souches de Brucella abortus. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz.13 (3) 777–786.
Conclusion L’étude sur la survie de brucelles dans le lait fermenté montre que celles-ci résistent à l’effet de la fermentation jusqu’à un pH de 4 obtenu après 6 jours. La fermentation du lait dans les conditions habituelles du marché, n’offre donc pas une sécurité aux consommateurs contre l’infection brucellique, car la durée de fermentation du lait ne dépasse pas 48 heures. Le temps de fermentation ne permet donc pas d’éliminer les brucelles du lait. En l’absence de toute décision politique visant à éradiquer la brucellose dans le cheptel malien, la sensibilisation des consommateurs sur les risques de contamination par la consommation du lait cru et de ses dérivés s’impose. Le contrôle de la qualité du lait et des produits laitiers doit être de rigueur. Dans l’attente des mesures plus rigoureuses, la pasteurisation reste le seul moyen d’application facile, pour minimiser les risques d’infection brucellique à partir de la consommation du lait. Le chauffage du lait, mieux, sa pasteurisation avant la fermentation, devient donc impérieuse pour diminuer ces risques. La croyance populaire admet que le goût du lait recherché par le consommateur, disparaît avec la pasteurisation. Il serait donc opportun de mener des recherches sur des ferments lactiques qui pourraient redonner le goût recherché par le consommateur, à un lait pasteurisé, dépourvu de tout agent pathogène.
Remerciements La présente étude a été réalisée grâce aux financements du Fond National Suisse de Recherche Scientifique (FNS) et de la Coopération Suisse pour le Développement (SDC). Nous exprimons nos sincères remerciements à tout le personnel du Laboratoire Central Vétérinaire (LCV), de l’Institut du Sahel (INSAH) et des différents acteurs de la filière laitière au Mali pour leur précieuse collaboration.
Bibliographie 1 - AG-IKATAHIT, A., 1988. Etat actuel des connaissances sur la brucellose au Mali. A propos de 24 cas observés en médecine interne (Hôpital du Point G). Thèse. Doc. Méd. ENMP, Bamako, Mali. 2 - AKAKPO A.J. & BORNAREL P., 1987. Epidémiologie des brucelloses animales en Afrique tropicale : enquêtes clinique, sérologique et bactériologique. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 6 (4 ): 981-1027. 3 - AKAKPO A.J. 1987. Brucelloses animales en Afrique tropicale. Particularités épidémiologique, clinique et ²²²
6
RASPA Vol.3 N 0 1, 2005