Michelle Ivana AWORET by Ecole Inter-Etats des Sciences et Médecine Vétérinaires (EISMV Dakar)

UNIVERSITE CHEIKH ANTA DIOP DE DAKAR ECOLE INTER-ETATS DES SCIENCES ET MEDECINE VETERINAIRES (E.I.S.M.V.)

Année 2016

N° 15

EVALUATION DE LA RESISTANCE AUX ANTIBIOTIQUES DES ENTEROBACTERIES ISOLEES DU GIBIER AU GABON.

THESE Présentée et soutenue publiquement le 01 Juin 2016 à 16 heures, devant la faculté de Médecine, de Pharmacie et d’Odontologie de Dakar, pour obtenir le grade de : DOCTEUR EN MEDECINE VETERINAIRE (DIPLÔME D’ETAT) Par Mlle Michelle Ivana AWORET Née le 21 Janvier 1992 à Libreville (GABON) JURY Président

Monsieur Cheikh Saad Bouh BOYE Professeur à la Faculté de Médecine, de Pharmacie et d’Odontologie de Dakar

Directeur et Rapporteur de thèse

Madame Rianatou BADA ALAMBEDJI Professeur à l’E.I.S.M.V. de Dakar

Membre

Monsieur Rock Allister LAPO Maître de conférences agrégé à l’E.I.S.M.V. de Dakar

Co-directeur de thèse

Monsieur Pierre Philippe MBEHANG NGUEMA Docteur

vétérinaire

l’IRET

(Libreville)

ECOLE INTER-ETATS DES SCIENCES ET MEDECINE VETERINAIRES DE DAKAR BP : 5077-DAKAR (Sénégal) Tel : (00221) 33 865 10 08 Télécopie (221) 825 42 83

COMITE DE DIRECTION LE DIRECTEUR GENERAL Professeur Yalacé Yamba KABORET

LES COORDONNATEURS Professeur Rianatou ALAMBEDJI Coordonnateur des Stages et des Formations Post-Universitaires Professeur Ayao MISSOHOU Coordonnateur à la Coopération Internationale Professeur Serge Niangoran BAKOU Coordonnateur des Etudes et de la Vie Estudiantine Professeur Yaghouba KANE Coordonnateur Recherche/Développement

Année Universitaire 2015 – 2016

DEDICACES AU BON DIEU, Je puis tout par Toi mon Dieu, tout ce que Tu fais est bon, et Tu le fais au bon moment. Je ne cesserai jamais de te dire Merci pour tes bienfaits! A la Sainte Vierge Marie, Merci Maman d’être là pour tes enfants et d’intercéder pour nous auprès du Père… A ma mère, Dieu seul sait pourquoi tu es parti trop tôt. Saches que tu me manques et j’aurai aimé que tu sois là… Mais je sais que tu es fière de moi et cela me comble de bonheur. Je n’y serais jamais arrivée sans toi, tu es ma force… Ton espoir A mon Père, Je t’aime malgré tout, je ne t’échangerais pour rien au monde. J’espère que tu seras fière de moi. Je serais toujours là pour toi. A toi Hussein, Dieu t’a mis sur mon chemin, et je le remercie chaque jour pour cela. Tu es une personne formidable. Merci de croire en moi et de me motiver chaque jour à devenir une femme meilleure. A tous mes frères et sœurs, Machère, Papou, Patou, Coucou, Elisa, Audrey et Jade. Merci d’avoir pris soin de moi et de toujours le faire quand vous pouvez. Je vous aime tous. A mes neveux et nièces, Rékia, Altéa, Juniola, Sonia, Maryse, Christian, Zion, Marleigh, Brayan, Dominique, kamil et Marc. Je pense à vous, ce travail est aussi pour vous.

iii

A mes cousins et cousines, Jessica, Toussaint et Arnold. Merci pour votre soutien. A mes amis, mes proches, mes personnes sures, Diarha, Géraldine, Parfait, Gabin, Simonet, Nancyne, Vanessa, Reine, Eunice, Magaly, Toussaint, Serge et Théophane. Merci pour votre soutien et votre amitié. A la communauté gabonaise de l’E.I.S.M.V, Dr Mve, Dr Otoro, Dr Tsoumbou, Dr Mastanga, Dr Natacha, Géraldine et Amy. Merci pour ces bons moments passés ensemble à l’école. A toute la 42ième Promotion, Je vous souhaite à tous le meilleur dans tout ce que vous entreprendrez. A vous tous qui avez pris un peu de votre précieux temps pour venir assister à ma soutenance. Recevez toute ma reconnaissance.

REMERCIEMENTS

Mes sincères remerciements :

A mon directeur et rapporteur de thèse Madame Rianatou BADA ALAMBEDJI ;

A mon co-directeur de thèse Monsieur Pierre Philippe MBEHANG NGUEMA, pour ses enseignements et sa patience ;

A l’EISMV pour m’avoir permis de faire ce que je souhaitais faire depuis toute petite ;

A l’Institut de Recherche en Ecologie Tropicale du Gabon et à tous ses employés en particulier Olivier, Ghislain, Ephrem, Franck, Zack, Cesium et Carl ;

Au Dr NTEME ELLA Gualbert ;

Au Dr OTORO ;

Au Dr DAHOUROU ;

A tous ceux qui de près ou de loin ont participé à l’élaboration de ce travail ;

A mon pays d’accueil le SENEGAL ;

A l’Ambassade du Gabon au Sénégal ;

A ma patrie, le GABON !!!

A NOS MAITRES ET JUGES A notre Maître et président du Jury, Monsieur Cheikh Saad BOUH BOYE, Professeur à la Faculté de Médecine, de Pharmacie et d’Odontologie de Dakar : Vous nous avez fait l’honneur de présider ce jury, malgré votre programme très chargé. Veuillez trouver ici, l’expression de notre profonde gratitude et nos sincères remerciements. Hommage respectueux.

A notre Maître, directeur et rapporteur de thèse, Madame Rianatou BADA ALAMBEDJI, Professeur à l’EISMV de Dakar : Travailler sous votre direction a été pour nous un honneur. Votre disponibilité, votre patience et votre soutien nous ont beaucoup touchés. Les moments passés en votre compagnie, nous ont permis de profiter de vos connaissances et de découvrir en vous l’exemple même de la bienveillance et de l’amour du travail bien fait. Veuillez trouver ici, cher Maître, l’assurance de notre sincère reconnaissance et de notre profonde admiration. Hommage respectueux.

A notre Maître et juge, Monsieur Rock Allister LAPO, Maître de conférences agrégé à l’EISMV de Dakar: Votre sens de la rigueur et du travail bien fait impose admiration et respect. Nous vous sommes très reconnaissante d’avoir accepté avec spontanéité de siéger dans ce jury et cela en dépit de vos multiples charges. Veuillez trouver ici, toute notre gratitude et notre grande considération. Sincères remerciements. vi

A notre Co-directeur de thèse, Monsieur Pierre Philippe MBEHANG NGUEMA, Docteur vétérinaire à l’IRET (Libreville) : Vous avez su guider d’une main rationnelle le travail que nous présentons aujourd’hui. Les moments passés ensemble nous ont permis de découvrir en vous, l’exemple de la rigueur, de la simplicité, de la patience et de l’amour du travail bien fait. Soyez rassuré de notre éternelle reconnaissance. Sincères remerciements.

vii

« Par

délibération la

Faculté

de Médecine,

Pharmacie et d’Odontologie et l’Ecole Inter-Etats des sciences et Médecine Vétérinaires de Dakar ont décidé que les opinions émises dans les dissertations qui leur seront présentées, doivent être considérées comme propres à leurs auteurs et qu’elles n’entendent donner aucune approbation ni improbation »

viii

LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS µg

: microgramme

AAC

: Aminoside acétyl-transférase

ADH

: Arginine déshydrogénase

ADN

: Acide désoxyribonucléique

AmpC

: Adénosine monophosphate Cyclique

ANSES

: Agence nationale de sécurité sanitaire de l’alimentation, de l’environnement et du travail

ANT

: Aminoside adénylyl-transférase

APH

: Aminoside phosphotransférase

ARN

: Acide ribonucléique

ARNr 16S

: Acide ribonucléique ribosomal de la petite sous-unité des procaryotes

BGN

: Bacilles à Gram Négatif

BLSE

: Bêtalactamases à spectre étendu

BMR

: Bactérie Multi-Résistante

BPO

: Bactéries Pathogènes Opportunistes

BPS

: Bactéries Pathogènes Strictes

: concentration critique inférieure

: concentration critique supérieure

C1G

: Céphalosporines de 1ère Génération

C2G

: Céphalosporines de 2ième Génération

C3G

: Céphalosporines de 3ième Génération ix

C4G

: Céphalosporines de 4ième Génération

Carb

: Carboxypénicilline

CA-SFM

: Comité

l’Antibiogramme

Société

Française

Microbiologie CAT

: Chloramphénicol acétyl-transférase

CBE

: Compagnie Equatoriale des Bois

CIT

: Citrate

: centimètre

cm3

: centimètre cube

CMB

: Concentration Minimale Bactéricide

CMI

: Concentration Minimale Inhibitrice

: diamètre critique inférieur

: diamètre critique supérieur

DABAC

: Développement d’Alternatives au Braconnage en Afrique Centrale

DGEG

: Développement au Gabon de l’Elevage de Gibier

EMB

: Eosine Bleu de Méthylène

FAO

: Food and Agriculture Organization of the United Nations (Organisation des nations unies pour l’alimentation et l’agriculture)

GEI

: Gastro-Entérite Infantile

GEL

: Gélatinase

GLU

: Glucose

GPS

: Global Positioning System (Système de positionnement global)

H2S

: Sulfure de dihydrogène

(I)

: Intermédiaire

: Pourcentage d’identification x

IND

: Indole

IRET

: Institut de Recherche en Ecologie Tropicale

: kilogramme

LDC

: Lysine décarboxylase

LPS

: Lipopolysaccharide

MATE

: Multidrug and toxic compound extrusion family (famille de protéines d’extrusion à plusieurs antimicrobiens)

MFS

: Major Facilitator Super family (Super famille de facilitateurs majeurs)

: Mueller-Hinton

: millilitre

: millimètre

NIT

: Nitrate

ODC

: Ornithine décarboxylase

OMS

: Organisation Mondiale de la Santé

ONG

: Organisation Non Gouvernementale

ONPG

: Ornitonitrophényl-b-galactoside

PCR

: Polymerase Chain Reaction (Réaction de polymérisation en chaîne)

PDA

: Phénylalanine désaminase

Péni A

: Pénicilline A

PIB

: Produit Intérieur Brut

PLP

: Protéines de Liaison aux Pénicillines

PNMD

: Parc National de Moukalaba-Doudou

PROGRAM

: Association Protectrice des Grands singes de la Moukalaba

: rough (Rugueuses) xi

(R)

: résistant

RCP

: Résumé des Caractéristiques du Produit

Résapath

: Réseau de surveillance de la résistance des pathogènes d’origine animale

RND

: Resistance

Nodulation

Division

family (Famille

résistance-

nodulation-division) S

: smooth (Lisses)

(S)

: sensible

: espèce

spp

: espèces

TDA

: Tryptophane désaminase

TRI

: TEM Résistantes aux Inhibiteurs

: Trypcase Soja

UNESCO

: United Nations Educational Scientific and Cultural Organization (Organisation des Nations unies pour l'éducation, la science et la culture)

URE

: Urée

VEBO

: Virus de l’Ebola

VEBOZ

: Souche Zaïre du Virus de l’Ebola

VHLT

: Virus Humain Lymphotrope à cellules T

VIS

: Virus de l’Immunodéficience Simien

: Voges-Proskauer

VSF

: Vétérinaire Sans Frontière

VSS

: Virus Spumeux Simien

WCS

: Wildlife Conservation Society (Société pour la Conservation de la Vie sauvage) xii

WWF

: World Wildlife Fund (Fond Mondial pour la Nature)

LISTE DES FIGURES Figure 1

: Détermination de la CMI par dilution en milieu liquide........................... 30

Figure 2

: Détermination de la CMI par dilution en milieu gélosé ........................... 31

Figure 3

: Définition des catégories cliniques selon les concentrations critiques et les diamètres critiques ............................................................ 32

Figure 4

: Localisation du PNMD au Gabon ............................................................. 43

Figure 5

: Localisation de Doussala et de Mbani au PNMD ..................................... 44

Figure 6

: Machines utilisées au Laboratoire de Bactériologie de l’IRET ................ 46

Figure 7

: Collecte des crottes de gibier dans la forêt du PNMD .............................. 48

Figure 8

: Station de recherche en Primatologie de Doussala au PNMD .................. 48

Figure 9

: Matériel utilisé pour la culture des entérobactéries au PNMD ................. 49

Figure 10

: Un étal de viande de brousse au marché d’Akébé .................................... 50

Figure 11

: Laboratoire de Bactériologie de l’IRET.................................................... 52

Figure 12

: Dépôt de disques imprégnés d’antibiotiques sur gélose MH .................... 56

Figure 13

: Lecture des résultats de l’antibiogramme pour l’échantillon I19 (1)........ 56

Figure 14

: Différentes viandes de brousses en vente dans les marchés de Libreville ................................................................................................... 60

Figure 15

: Fréquence des espèces de gibier collectées dans les marchés de Libreville ................................................................................................... 62

Figure 16

: Résultat global des tests de résistance des entérobactéries aux antibiotiques. ............................................................................................. 65

Figure 17

: Pourcentages de souches d’entérobactéries résistantes isolées de prélèvements fécaux de gibiers du PNMD et des marchés de Libreville ................................................................................................... 66 xiii

Figure 18

: Pourcentage des souches d’entérobactéries multirésistantes isolées d’échantillons fécaux de gibiers prélevés dans les deux zones d’étude. ...................................................................................................... 67

Figure 19

: Pourcentages des souches d’entérobactéries résistantes isolées de prélèvements fécaux de gibiers du PNMD. .............................................. 68

Figure 20

: Pourcentages de souches d’entérobactéries multirésistantes isolées de prélèvements fécaux de gibiers du PNMD........................................... 68

Figure 21

: Pourcentages des souches d’entérobactéries résistantes isolées d’échantillons fécaux de gibiers vendus dans les marchés ....................... 69

Figure 22

: Comparaison des pourcentages de souches d’entérobactéries résistantes entre les deux zones d’étude.................................................... 70

xiv

LISTE DES TABLEAUX Tableau I

: Classification des entérobactéries les plus fréquentes en bactériologie clinique et/ou en microbiologie alimentaire ............. 18

Tableau II

: Principaux

caractères

d'identification

des

genres

d’entérobactéries les plus fréquemment rencontrés ....................... 21 Tableau III

: Résistance des entérobactéries aux bêtalactamines ........................ 34

Tableau IV

: Liste des antibiotiques utilisés pour la réalisation de l’antibiogramme ............................................................................. 55

Tableau V

: Espèces de gibier dont les crottes ont été collectées dans les zones Mbani et Boutsiana du PNMD ............................................. 59

Tableau VI

: Espèces de viandes de brousse vendues dans quatre marchés de Libreville ................................................................................... 61

Tableau VII

: Fréquences des espèces d’entérobactéries identifiées dans les deux zones d’étude ......................................................................... 63

Tableau VIII : Fréquences des espèces d’entérobactéries identifiées au PNMD ............................................................................................ 64 Tableau IX

: Fréquences des espèces d’entérobactéries identifiées dans les marchés ........................................................................................... 64

Tableau X

: Analyse statistique des différents pourcentages de résistance constatés dans les deux zones d’étude ............................................ 71

TABLE DES MATIERES INTRODUCTION ............................................................................................... 1 PREMIERE PARTIE : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ........................ 3 CHAPITRE I : GENERALITES SUR LE GIBIER............................................... 4 I.1. Définition ..................................................................................................... 4 I.2. Importance de la viande de brousse ............................................................ 5 I.3. Dangers biologiques liés à la consommation du gibier ............................... 8 I.3.1. Les principales bactéries pathogènes d’origine alimentaire ................... 8 I.3.2. Autres bactéries pathogènes .................................................................... 9 I.3.3. Contamination bactérienne du gibier .................................................... 10 I.3.3.1. Mécanismes de contamination bactérienne du tissu musculaire ..... 10 I.3.3.1.1. Invasion ante-mortem ............................................................... 10 I.3.3.1.2. Invasion post-mortem ............................................................... 11 I.3.3.1.3. Invasion durant l’abattage......................................................... 11 I.3.3.2. Contamination bactérienne dans le tissu interne musculaire du gibier documentée en Afrique centrale ........................................................ 12 I.4. Risques de Santé publique liés à la faune sauvage et à la viande de brousse 13 I.4.1. Risques de Santé publique liés à la faune sauvage ............................... 13 I.4.2. Risques de Santé Publique liés à la viande de brousse ......................... 14 I.5. Règlementation sur la détention et la commercialisation de la viande de brousse au Gabon............................................................................................... 15 CHAPITRE II : GENERALITES SUR LES ENTEROBACTERIES ................ 17 II.1. Définition ................................................................................................. 17 II.2. Habitat ...................................................................................................... 19 II.3. Caractères bactériologiques ..................................................................... 20 II.3.1. Caractères morphologiques.................................................................. 20 II.3.2. Caractères culturaux ............................................................................ 20 II.3.3. Caractères biochimiques ...................................................................... 20 II.4. Pouvoir pathogène .................................................................................... 22 II.4.1. Les entérobactéries pathogènes opportunistes (BPO) ......................... 22 xvi

II.4.2. Les entérobactéries pathogènes strictes (BPS) .................................... 22 CHAPITRE III : LA RESISTANCE DES ENTEROBACTERIES AUX ANTIBIOTIQUES .............................................................................................. 24 III.1. Rappels sur l’antibiorésistance ............................................................. 24 III.1.1. Définition et types de résistance ......................................................... 24 III.1.2. Mécanismes d’acquisition de l’antibiorésistance ............................... 25 III.1.2.1. Mécanismes génétiques d’acquisition de l’antibiorésistance....... 25 III.1.2.1.1. La résistance chromosomique ................................................ 25 III.1.2.1.2. La résistance extra-chromosomique ...................................... 25 III.1.2.2. Mécanismes biochimiques d’acquisition de l’antibiorésistance .. 26 III.1.3. Méthodes d’étude de l’antibiorésistance ............................................ 28 III.1.3.1. Concentrations minimales et classification des souches .............. 28 III.1.3.2. Concentrations critiques et antibiogramme .................................. 29 III.2. Types de résistance et mécanismes de résistance des entérobactéries aux antibiotiques ................................................................................................ 33 III.2.1. Résistance naturelle ............................................................................ 33 III.2.2. Résistances acquises ........................................................................... 34 III.2.2.1. Les résistances acquises par production d'enzymes ..................... 35 III.2-2.2. Les résistances acquises par imperméabilité ou modification de cibles ............................................................................................................ 36 III.3. Epidémiologie de l’antibiorésistance des entérobactéries .................... 37 DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL EXPERIMENTAL .................................... 42 CHAPITRE I : CADRE, MATERIEL ET METHODES ................................... 43 I.1. Cadre de l’étude ......................................................................................... 43 I.2. Matériel d’étude ......................................................................................... 44 I.2.1. Matériel biologique ............................................................................... 44 I.2.2. Matériel de collecte des échantillons sur le terrain ............................... 44 I.2.3. Matériel pour l’isolement et l’identification au laboratoire .................. 45 I.2.4. Matériel pour l’antibiogramme et la cryoconservation au laboratoire . 45 I.3. Méthodes ................................................................................................... 47 I.3.1. Méthode sur le terrain ........................................................................... 47 I.3.1.1. Période de la collecte des échantillons ........................................... 47 I.3.1.2. Collecte des échantillons................................................................. 47 I.3.2. Méthode au laboratoire ......................................................................... 50 xvii

I.3.2.1. Isolement ......................................................................................... 51 I.3.2.2. Identification des colonies isolées .................................................. 52 I.3.2.3. Test de la sensibilité aux antibiotiques : méthode de diffusion en milieu gélosé de disques d’antibiotiques..................................................... 54 I.3.3. Analyses statistiques des résultats......................................................... 57 CHAPITRE II : RESULTATS ............................................................................ 58 II.1. Liste des différentes espèces de gibiers rencontrées .................................. 58 II.1.1. Liste des différentes espèces de gibier rencontrées au PNMD............ 58 II.1.2. Liste des différentes espèces de gibier vendues dans les marchés de Libreville ................................................................................................... 59 II.2. Etude bactériologique des échantillons...................................................... 62 II.2.1. Nature et fréquence des entérobactéries identifiées ............................ 62 II.2.1.1. Résultats globaux ........................................................................... 62 II.2.1.2. Résultats obtenus par zone d’étude ............................................... 63 II.2.2. Fréquence de la résistance aux antibiotiques des entérobactéries identifiées................................................................................................... 65 II.2.2.1. Résultats globaux ........................................................................... 65 II.2.2.2. Résultats obtenus par zone d’étude ............................................... 67 CHAPITRE III : DISCUSSION, RECOMMANDATIONS ET PERSPECTIVES ............................................................................................................................. 72 III.1. Discussion ................................................................................................. 72 III.1.1. Discussion de la méthodologie ........................................................... 72 III.1.2. Discussion des résultats ...................................................................... 74 III.1.2.1. Discussion des résultats des espèces de gibier ............................. 74 III.1.2.2. Discussion des résultats de l’étude bactériologique des échantillons .................................................................................................. 76 III.1.2.2.1. Nature et fréquence des entérobactéries identifiées ............... 76 III.1.2.2.2. Résultats de l’antibiogramme................................................. 77 III.2. Recommandations et perspectives ............................................................ 81 CONCLUSION GENERALE ............................................................................. 83 BIBLIOGRAPHIE .............................................................................................. 86 ANNEXES ........................................................................................................... A

xviii

INTRODUCTION Les populations de l’Afrique Centrale sont attachées à la consommation de gibier. Les estimations de la consommation annuelle de viande de brousse dans le Bassin du Congo varient entre 1 et 3,5 millions de tonnes (FA et al., 2002), ce qui correspond à environ 579 millions d’animaux avec lesquels les communautés humaines de cette région sont en contact (FA et al., 2003). Le Gabon ne fait pas exception, c’est même l’un des plus gros consommateurs de viande de brousse, qui représente, pour une grande partie des gabonais, l’apport principal en protéines animales (STEEL, 1994). Cependant, il est bien établi que la préparation et la consommation de viande de brousse (en tant que sous-produit animal) représentent des risques sanitaires puisque ces viandes peuvent être contaminées par plusieurs agents pathogènes différents (DEWAAL et al., 2006 ; PIRES et al., 2010). En effet, la consommation de la viande de brousse ou gibier constitue l’une des causes de la transmission des maladies bactériennes à l’homme (BACHAND, 2012). Par ailleurs, le contact direct ou indirect entre la faune sauvage et l’homme peut aussi constituer un facteur de transmission de la résistance des bactéries aux antibiotiques. En effet, plusieurs bactéries portant des gènes de résistance à certains antibiotiques ont été isolées chez les gorilles des plaines de l’ouest (Gorilla gorilla gorilla) habitués à la présence humaine vivant dans des anciennes plantations au Parc national de Moukalaba-doudou (PNMD) dans le sud-ouest du Gabon (MBEHANG et al., 2015). Ces résultats ont suggéré qu’une transmission de la résistance aux antibiotiques est possible entre l’homme et ces grands primates d’une part, et que la faune sauvage pourrait constituer un réservoir de la résistance aux antibiotiques d’autre part. Les entérobactéries sont la classe la plus fréquente des bacilles à Gram négatif (BGN) et elles ont acquis des capacités à produire des mécanismes de résistances divers. En effet, elles sont dotées d’une grande plasticité qui leur confère la capacité de s’adapter à leur environnement. La résistance acquise des entérobactéries constitue actuellement un gros problème de santé publique dans le monde entier en général, et au Gabon en particulier, dans les hôpitaux lors d’infections nosocomiales. 1

La pénétration de l’homme de plus en plus dans la forêt tropicale à travers les activités anthropiques peut être à l’origine de la résistance aux antibiotiques chez les animaux sauvages. De même, le contact entre l’homme et les animaux sauvages peut faire apparaitre chez l’homme des maladies opportunistes liées à la réémergence de certaines bactéries résistantes aux antibiotiques. C’est dans ce contexte que la présente étude a été entreprise. L’intérêt étant d’évaluer la résistance des entérobactéries aux antibiotiques chez les animaux sauvages et en particulier chez le gibier, ainsi que les risques de transmission de ces résistances à l’homme. L’objectif principal de ce travail est de déterminer la fréquence de la résistance aux antibiotiques des bactéries de la famille des Enterobacteriaceae chez le gibier présent dans le Parc national de Moukalaba-Doudou (PNMD), au sud-ouest du Gabon, et celui vendu dans les marchés de Libreville au Gabon. Plus spécifiquement, il consistera à : o Etablir une liste des gibiers rencontrés dans le PNMD et dans quelques marchés de Libreville au Gabon ; o Isoler et identifier les entérobactéries présentes dans des fèces fraiches de ces gibiers; o Déterminer la sensibilité des isolats vis-à-vis d’une gamme d’antibiotiques ; o Comparer les fréquences de ces résistances par rapport à la distribution géographique des animaux. Ce travail est articulé autour de deux grandes parties. La première partie consacrée à la synthèse bibliographique, aborde les généralités sur le gibier et celles sur les entérobactéries ainsi que la résistance de ces entérobactéries aux antibiotiques, et ce après un bref rappel sur la résistance bactérienne aux antibiotiques. Une seconde partie expérimentale, traite d’une part du cadre de l’étude, du matériel et des méthodes que nous avons utilisés pour conduire cette étude ; d’autre part des résultats obtenus et enfin de la discussion de ces résultats suivie de quelques recommandations et perspectives.

PREMIERE PARTIE : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE Chapitre I : Généralités sur le gibier Chapitre II : Généralités sur les entérobactéries Chapitre III : La résistance des entérobactéries aux antibiotiques

CHAPITRE I : GENERALITES SUR LE GIBIER I.1. Définition Le gibier représente l'ensemble des animaux sauvages (hors poissons, crustacés, coquillages, fruits de mer et mammifères marins) que l'on chasse pour la consommation ou la vente de sa viande (WIKIPEDIA, 2016b). Aussi appelé « viande de brousse » en zone tropicale, le gibier est une viande qui provient d’une variété d’espèces animales sauvages. En Afrique Centrale, cet aliment est une denrée alimentaire valorisée en tant que source importante de protéines et de revenu (BENNET ET ROBINSON, 2000). Au regard de la réglementation européenne du Rectificatif au règlement (CE) N°853/2004 du Parlement européen et du Conseil du 19 Avril 2004 sur les règles d’hygiène pour les denrées alimentaires d’origine animale, on distingue :  Le gibier sauvage comprenant les ongulés sauvages et les lagomorphes ainsi que les autres mammifères terrestres qui sont chassés pour la consommation humaine, et sont considérés comme du gibier selon la législation applicable dans l'État membre concerné. A ce groupe s’ajoutent, les mammifères vivant en territoire clos dans des conditions de liberté similaires à celles du gibier sauvage, et les oiseaux sauvages chassés pour la consommation humaine. Le gibier sauvage se répartit en : -

petit gibier sauvage constitué du gibier sauvage à plumes (gibier sédentaire, gibier d’eau et oiseaux de passage) et des lagomorphes vivant en liberté (léporidés et rongeurs) ;

gros gibier sauvage comprenant les mammifères terrestres sauvages vivant en liberté qui ne répondent pas à la définition de petit gibier sauvage.

 Le gibier d'élevage, constitué par les ratites d'élevage et les mammifères terrestres d'élevage autres que les ongulés domestiques (bovins y compris buffle et bison), porcs, ovins, caprins, solipèdes domestiques ; et les oiseaux qui ne sont pas considérés comme domestiques, mais qui sont élevés en tant 4

qu’animaux domestiques et qui sont définis comme étant de la volaille. I.2. Importance de la viande de brousse En Afrique centrale et particulièrement au Gabon, l’agriculture est très peu développée (FAO, 2002). En effet, les gabonais ne sont pas un peuple d’agriculteurs et pratiquent plutôt la cueillette et la chasse. De plus, le paysage forestier et la présence endémique de mouches tsé-tsé (Glossina sp), qui sont des vecteurs de la trypanosomose ne favorisent pas la production animale (CHARDONNET et al., 1995). Néanmoins,

des

élevages

d’espèces

sauvages

comme

l’aulacode,

potamochère ou le cricétome ont été tentés par le Développement d’Alternatives au Braconnage en Afrique Centrale (DABAC) et Vétérinaire Sans Frontière (VSF), à travers son programme Développement au Gabon de l’Elevage de Gibier (DGEG). Ainsi, contrairement aux pays plus développés, le gibier contribue de manière importante à la sécurité alimentaire des communautés du bassin du Congo (POULSEN et al., 2009). En effet, l’industrie agroalimentaire y est peu développée. Au Gabon par exemple, plus de 80% des viandes domestiques sont importées (FAO, 2002), avec une production annuelle en l’an 2000 limitée à 571 tonnes pour la volaille, 350 tonnes pour le bœuf et 360 tonnes pour le porc ; et une importation annuelle de ces différentes denrées rapportée à 17 000 tonnes, 7 800 tonnes et 4 350 tonnes, respectivement (FAO, 2002). Quant au poisson, 73 tonnes ont été produites en 2002 et 102 tonnes en 2001 (NDJOYI, 2010). Pour ce qui est du gibier, sa production annuelle a été estimée à environ 30 000 tonnes à l’échelle nationale (WCS, 2005).  Importance alimentaire En Afrique centrale, la viande de brousse constitue 30 à 80% de l’apport en protéines (WILKIE ET CARPENTER, 1998). Le Gabon est l’un des pays africains les plus consommateurs de viande de brousse (FARGEOT, 2004). STEEL (1994) a estimé la consommation nationale de gibier à 17 kg/personne/an, un chiffre 1,7 fois plus élevé que l’estimation de la consommation de bœuf. Cependant, il existe une disparité entre les zones urbaines et rurales. Pour CHARDONNET et 5

al. (1995), au Gabon, en République Démocratique du Congo et en République Centrafricaine, la consommation de gibier (par habitant) en ville serait égale à 10% de la consommation en zone rurale. Une autre étude réalisée au Gabon montre que dans les zones rurales, le gibier représente trois-quarts (76%) de l’ensemble des viandes consommées alors que dans les zones urbaines, particulièrement à Libreville, il ne représente que 4% de la viande consommée (THE DARWIN INITIATIVE, 2005). Ainsi, le gibier représente une source importante de protéines en Afrique centrale. Sa contribution aux économies locales et nationales semble aussi être non négligeable (DAVIES, 2002).  Importance économique L'intérêt que l'homme porte au gibier n'a pas toujours été un intérêt mercantile. Des facteurs modernes, dont l'émergence est liée au développement de nouvelles activités ou de nouveaux modes de vie, menacent la régénération de la ressource faunique. De nos jours, la chasse ne se fait plus en quantité suffisante pour se nourrir et nourrir « son petit monde », mais en quantité industrielle pour gagner de l'argent. L'appât du gain est devenu l'objectif principal poursuivi par ces hommes et femmes. La chasse passe donc de subsistantielle avec des techniques rudimentaires, à industrielle (NDEMEZOGO, 2006). Plusieurs facteurs sont à l’origine de l'émergence de la commercialisation du gibier. Parmi eux, le passage d'une société traditionnelle à une société moderne (usage de la monnaie...) est le plus significatif car il se traduit par l'acceptation de nouvelles règles qui obéissent aux lois de l'économie de marché et non plus à celles de l'économie de subsistance. La présence de nouveaux contextes socioculturels place, en effet, les populations dans une société de marché où le commerce est économiquement rentable. Ayant perdu tout espoir de trouver de l'emploi, certaines personnes retournent vers la forêt nourricière pour chasser ou acheter le gibier pour le revendre. Elles utilisent les techniques traditionnelles de chasse, associées aux techniques modernes, pour chasser le gibier en quantité (NDEMEZOGO, 2006).

De ce fait, la filière viande de brousse tient une place non négligeable dans l’économie du pays. Il est cependant difficile de quantifier cet impact économique car c’est un commerce informel et parfois clandestin qui n’apparaît pas dans les comptes de l’Etat. L’étude menée par STEEL (1994) stipule que ce créneau contribuerait aux alentours de 48 millions de dollars américains annuellement à l’économie du Gabon, dont 22 millions de dollars américains en zone rurale. Sur le volume et la valeur du commerce de la viande de brousse au Gabon, il ajoute que la filière viande de brousse représenterait 1% du PIB national en 1992 et 10,8% du PIB du secteur agriculture, forêt et pêche. Cependant, le passage de la chasse en quantité suffisante à celle en quantité industrielle pour le commerce a un impact négatif sur la biodiversité et l’abondance des animaux dans les forêts tropicales.  Impact écologique Dans le bassin du Congo, le niveau de prélèvement des animaux serait 4 fois plus important que le niveau permettant une exploitation durable de la faune (BROWN, 2003). Au Gabon, et en zone rurale en particulier, la consommation actuelle du gibier dépasse au moins 3 fois le niveau durable, soit 30 000 tonnes de gibier par an (THE DARWIN INITIATIVE, 2005). En effet, le développement d’une chasse à vocation commerciale s’est accompagnée de l’utilisation d’armes à feu (fusil à calibre 12 surtout), de pièges à câble et de nouvelles méthodes de chasse (chasse nocturne). Par conséquent, le nombre et la variété d’espèces capturées ont augmenté et la pression de chasse autour des villages s’est accrue (STEEL, 1994). C’est ainsi que dans plusieurs zones, les villageois perçoivent déjà les effets de la surexploitation du gibier. Les conséquences sont le parcours obligatoire de plus longues distances par les chasseurs, la rareté de certaines espèces de grande taille (potamochère, céphalophe rouge) et une diminution de la quantité de gibier consommée; entrainant des changements alimentaires (THE DARWIN INITIATIVE, 2005). Le potamochère s’illustre comme espèce témoin de la surexploitation au Gabon. Autrefois plus abondants, ils deviennent rares et occupent le onzième rang en 7

quantité (poids) de viande capturée par les chasseurs (THE DARWIN INITIATIVE, 2005). Vue l’importance alimentaire et économique qu’occupe le gibier, quels sont les dangers d’origine biologique liés à cette viande ? I.3. Dangers biologiques liés à la consommation du gibier Certaines viandes de gibier sont considérées comme présentant les qualités nutritionnelles et/ou diététiques de celles issues d'animaux d'élevages, avec toutefois des risques différents du point de vue des maladies, et localement du point de vue de la bioaccumulation de polluants divers. Ainsi, le gibier peut receler des maladies d’origine parasitaire, bactérienne ou virale (THIBOUTOT, 2008). Le consommateur de gibier s'expose à de moindres risques sanitaires que s'il mangeait de la viande issue d'élevage (seuls les gros animaux et dans certains pays uniquement doivent passer en abattoir et se faire estampiller). Le consommateur s'expose aussi à un risque plus élevé de parasitoses ou d'infections particulières par des microbes transportés par la faune sauvage qui constitue le plus souvent, le réservoir de plusieurs maladies transmissibles à l'homme (zoonoses) ou à d'autres espèces. Parmi ces dangers biologiques, la contamination bactérienne attire de plus en plus l’attention à cause de la transmission de gènes de résistances aux antibiotiques de l’animal vers l’homme via ces bactéries et inversement, constituant un sujet très important en santé publique. I.3.1. Les principales bactéries pathogènes d’origine alimentaire Plusieurs développement

bactéries

pathogènes

de maladies

jouent

d’origine

alimentaire

rôle à

important

l’échelle

dans

internationale

(NEWELL et al., 2010). Les principales bactéries pathogènes responsables d’infections alimentaires sont Campylobacter, Salmonella, Escherichia coli, Shigella ; tandis que celles responsables de toxi-infections alimentaires sont Clostridium, Bacillus cereus et Staphylococcus aureus (TODD, 1997 ; ANSES, 2013). Parmi les bactéries responsables d’infections alimentaires, seules quelquesunes ont pour réservoirs certains animaux sauvages. Elles sont associées à la 8

manipulation ou à l’ingestion de viande crue ou inadéquatement cuite. Celles le plus souvent isolées et ayant un impact relativement plus important sur la santé humaine en Afrique centrale (ou à l’échelle mondiale) incluent : Campylobacter, Salmonella, Escherichia coli et Shigella (GRAHAM, 2002; NIYOGI, 2005). Dans les pays en voie de développement, Campylobacter serait responsable d’environ 40 000 à 60 000 cas de diarrhées pour une population de 100 000 enfants âgés de moins de 5 ans par année, comparé à seulement 300 cas dans les pays développés (COKER et al., 2002). Par ailleurs, la prévalence de Shigella est plus importante dans les pays en voie de développement par rapport aux pays développés (NIYOGI, 2005). En effet, Shigella représente la plus importante cause de dysenterie dans ces pays, avec 113 millions de cas par an, comparés à 1.5 millions dans les pays industrialisés (KOTLOFF et al., 1999). Les bactéries pathogènes présentes dans la faune sauvage sont présumées être similaires à celles retrouvées dans les animaux domestiques, bien que très peu d’études existent en ce qui concerne la faune sauvage (MEMBRE, LAROCHE ET MAGRAS, 2011). Globalement, il est constaté que des réservoirs fauniques existent pour Campylobacter, Salmonella et Shigella à l’échelle mondiale. Il en existe possiblement parmi la faune sauvage de l’Afrique Centrale. I.3.2. Autres bactéries pathogènes Quelques pathologies dues à d’autres bactéries pathogènes : -

La tularémie qui est une infection bactérienne due à Francisella turalensis ou bacille de Francis. Il s’agit d'une zoonose dont les principaux réservoirs sont les lagomorphes et les rongeurs. La maladie peut être transmise à l’homme par contact avec des viscères lors de la chasse. Certaines espèces de tiques représentent également les vecteurs de l’infection humaine. Dans les trois quarts des cas, elle est transmise par contact direct avec la peau (saine ou égratignée) avec des animaux infectés, des végétaux, le sol, le matériel contaminé (clous, lame…) ou par des éclaboussures projetées dans l’œil ou sur des plaies cutanées. Plus rarement, la contamination peut être due à des piqures 9

d’insectes Tabanidae et par l’ingestion d’aliments ou d’eau contaminée. C’est une maladie plus fréquente en Europe orientale, il faut donc faire attention lors de l’importation de gibier pour repeupler les chasses. -

La maladie de Lyme est une infection due à Borrelia burgdorferi, bactérie transmise par morsure de tiques infectées du genre Ixodes et dont le réservoir principal est constitué par de très nombreux animaux sauvages tels que les cervidés, les rongeurs, les lézards et les serpents. Les borrélies peuvent se retrouver dans d’autres vecteurs capables de piquer l’homme notamment des moustiques, punaises, taons voire sangsues ou aoutats. La contamination se produit presque toujours lors de parcours en forêt ou autres milieux naturels (THIBOUTOT, 2008). I.3.3. Contamination bactérienne du gibier I.3.3.1. Mécanismes de contamination bactérienne du tissu musculaire Il est généralement admis chez les animaux domestiques, que le tissu

musculaire d’animaux sains est stérile (GILL, 2007). Mais très peu d’études existent à ce sujet en ce qui concerne les animaux sauvages (AHL et al., 2002). Il est donc pertinent d’identifier les mécanismes possibles de contamination du tissu musculaire par des bactéries pathogènes (CASCIO et al., 2011). I.3.3.1.1. Invasion ante-mortem Chez l’humain, une invasion de la circulation sanguine par des bactéries entériques, accompagnée d’une dissémination sanguine de celles-ci à plusieurs organes internes, peut avoir lieu bien avant la mort d’un individu malade (NEHRING et al., 1971). Sur des cobayes, une étude expérimentale a démontré ce phénomène en injectant une dose élevée de bactéries par voie intraveineuse à ces derniers (GILL ET PENNY, 1979). Les auteurs ont suggéré que cette bactériémie n’était pas représentative par rapport à celle retrouvée chez les animaux d’élevage qui sont habituellement sains une fois rendus à l’abattoir. Toutefois, ceci pourrait être possible du côté de la faune sauvage puisque le statut sanitaire des animaux sauvages au moment de l’abattage 10

en forêt n’est jamais connu ou contrôlé (CASCIO et al., 2011). I.3.3.1.2. Invasion post-mortem Le deuxième mécanisme de contamination du tissu musculaire est celui de l’invasion des tissus internes par des bactéries pathogènes après la mort d’un individu (COELLO et al., 2007). Une étude a pu démontrer l’invasion du tissu musculaire par des bactéries pathogènes à partir de 15 heures après le décès d’humains malades (KONEMAN ET MINCKLER, 1970). GILL et al. (1978), plus récemment sur une étude expérimentale effectuée sur des moutons sains, a également pu démontrer la possibilité de ce mécanisme en rajoutant qu’une invasion post-mortem ne peut avoir lieu que si un déversement important de bactéries dans la cavité abdominale a lieu lors de la décomposition des tissus intestinaux. Sur de la viande bovine, une autre étude expérimentale a rapporté la pénétration par des bactéries pathogènes de tissus musculaires en moins de 36 heures à une dose inoculée de 107/cm2 et à 30°C, comparée à environ 3 jours à une dose inoculée de 10²/cm2 pour une même température ambiante (GILL ET PENNY, 1977). Ces conditions climatiques représentent ce qu’il est possible de retrouver du côté du circuit commercial du gibier en Afrique centrale (FARGEOT, 2004). I.3.3.1.3. Invasion durant l’abattage Enfin, une contamination du tissu musculaire pourrait aussi s’expliquer par la présence de bactéries pathogènes introduites à la circulation sanguine ou dans le tissu musculaire au moment même où l’animal se fait abattre (GILL et al., 1976). Des études effectuées en Angleterre ont démontré que plusieurs organes internes de bovins sains, dont des tissus musculaires, ont été contaminés après abattage par des dispositifs contaminés au préalable par des Escherichia coli témoins (BUNCIC et al., 2002). En ce qui concerne la filière du gibier, ce scénario pourrait être représenté par le cas d’une pénétration par des balles de fusil ou une machette souillées du tractus intestinal de l’animal lors de l’abattage (BENGIS, 1997).

A l’heure actuelle, aucune preuve tangible ne peut expliquer qu’un de ces mécanismes de contamination existe réellement. Cependant, des

conditions

similaires existent au sein du circuit commercial de gibier en Afrique centrale, notamment le statut sanitaire inconnu de l’animal au moment de l’abattage; des méthodes de chasse non contrôlées et non réglementées ; un délai d’éviscération du gibier pouvant dépasser plus de 24 heures suite à l’abattage ; le transport du gibier conservé par des méthodes rudimentaires, voire absentes, sur de longues durées ; l’éviscération et la préparation du gibier au niveau de la forêt ou du ménage au lieu d’une usine de préparation; et, finalement, une absence d’inspection de la qualité microbiologique de la viande avant la vente ou la consommation (PAULSEN et al., 2008). Malgré ces conditions particulières et leurs implications potentiellement négatives sur la santé publique, et en plus du fait que la consommation du gibier soit relativement importante en Afrique centrale, peu d’études existent sur le niveau de contamination de la partie interne de la viande de gibier par des bactéries pathogènes (CASOLI et al., 2005). I.3.3.2. Contamination bactérienne dans le tissu interne musculaire du gibier documentée en Afrique centrale Une étude au Nigéria a rapporté que sur 48 échantillons de viande boucanée provenant de grands aulacodes (Thryonomys swinderianus), de lapins sauvages (Oryctolagus cuniculus), de varans (Varanidae) et de plusieurs espèces d’antilopes vendus dans quatre marchés urbains, 6% des échantillons étaient contaminés par Salmonella (KAYODE ET KOLAWOLE, 2008). Toutefois, les auteurs ont souligné qu’il s’agissait plus probablement d’une contamination croisée. En République du Congo, une étude a détecté la présence de Proteus mirabilis et Citrobacter dans du gibier frais, ainsi qu’Enterobacter agglomerans dans du gibier boucané (MAKOSSO-VHEIYE et al., 2008). Différentes souches de Bacillus anthracis ont été détectées dans le tissu musculaire et osseux de chimpanzés et de gorilles retrouvés morts au niveau des forêts 12

de la Côte d’Ivoire et du Cameroun (LEENDERTZ et al., 2006). Ces études illustrent qu’une contamination du muscle de gibier est donc possible ; bien qu’elle soit très peu étudiée en Afrique. I.4. Risques de Santé publique liés à la faune sauvage et à la viande de brousse I.4.1. Risques de Santé publique liés à la faune sauvage Très peu d’études ont été menées sur l’exposition humaine à la faune sauvage ou au gibier en Afrique centrale. Quand bien même, une étude a rapporté que près de 15% des zoonoses chez l’humain ont un mécanisme d’émergence associé à la forêt tropicale où des réservoirs fauniques pour une diversité d’agents pathogènes existent (WILLCOX ET ELLIS, 2006). Depuis

quelques

dizaines

d’années,

l’intensification

des

activités

d’exploitation forestière dans ces régions ne fait qu’engendrer la création de plusieurs routes qui favorisent une pénétration plus profonde de zones forestières jadis inaccessibles, ainsi qu’une augmentation de la fréquence des contacts hommefaune sauvage (CASCIO et al., 2011). Ces contacts homme-faune sauvage favoriserait la transmission bidirectionnelle d’agents pathogènes (GOLDBERG et al., 2008; KARESH ET NOBLE, 2009). Au sud du Cameroun, une étude a rapporté la détection d’anticorps contre le virus spumeux simien (VSS) parmi des chasseurs locaux communément exposés à des carcasses de primates non-humains chez lesquels, un réservoir pour ce virus avait préalablement été identifié (WOLFE et al., 2004). Une autre étude a rapporté la détection d’anticorps contre des souches du virus humain lymphotrope à cellules T (VHLT), dont celui du VHTL-1, parmi une cohorte de 930 chasseurs camerounais régulièrement exposés à des primates non-humains suspectés d’être infectés par des homologues de ce virus (WOLFE et al., 2005). Toutefois, les auteurs de cette étude expliquent que l’établissement d’un lien direct entre la présence d’anticorps et une exposition humaine à ces primates non-humains infectés n’a pu être possible dans le cadre de cette étude.

Plusieurs autres espèces animales sauvages peuvent servir de porteurs pour une gamme d’agents pathogènes transmissibles à l’humain tel que pour le virus de l’Ébola (VEBO) (GREGER, 2007; GILLESPIE et al., 2008). Huit (8) épidémies d’Ébola, chacune précédée d’une mortalité importante de la faune sauvage, ont eu lieu au Gabon et en République Démocratique du Congo entre 1994 et 2003 (LEROY et al., 2004). Une étude a d’ailleurs pu démontrer l’association entre des anticorps humains contre la souche Zaïre du VEBO (VEBOZ), une souche très virulente, et la présence de ce même virus dans des échantillons de tissu musculaire et osseux provenant de différentes espèces animales (ROUQUET et al., 2005). Au Gabon, une forte prévalence des anticorps anti-Ebola zaïre ont été détectés chez des populations rurales (BECQUART et al., 2010), suggérant une source commune d’exposition à ce virus comme la salive des chauves- souris laissée sur des fruits. Ces quelques études montrent, du moins pour les virus, qu’un risque sanitaire associé à l’exposition humaine à divers tissus et sécrétions corporelles de gibier est non seulement possible, mais aussi important. La transmission aux humains d’agents pathogènes issus de la faune sauvage étant possible, elle pourrait ainsi l’être pour d’autres types d’agents pathogènes notamment les bactéries. I.4.2. Risques de Santé Publique liés à la viande de brousse La viande de brousse communément consommée en Afrique centrale présente certaines particularités car, les méthodes de sa production et de sa distribution, ainsi que les problématiques de santé publique qu’elle peut engendrer, diffèrent de celles applicables aux viandes d’animaux domestiques (LECOCQ, 1997). De plus, le gibier ne peut être considéré comme aliment générique puisqu’il est dérivé de différentes espèces animales sauvages (SCHENCK et al., 2006). Et, quoique le gibier ait été le sujet de très peu d’études en matière de santé publique, quelques études effectuées dans certains marchés urbains de l’Afrique centrale ont tout de même pu rapporter la présence de certaines souches des virus de l’immunodéficience simienne (VIS) (PEETERS et al., 2002 ; APETREI et al., 2005 ; AGHOKENG et al., 2010), ainsi que la présence de certains parasites (POURRUT et al., 2011) dans du gibier vendu et 14

destiné à la consommation humaine. Compte tenu de l’importance alimentaire, économique et écologique de la viande de brousse ainsi que les risques liés à la détention de celle-ci, un certain nombre de lois a été mis en place par les autorités gabonaises. I.5. Règlementation sur la détention et la commercialisation de la viande de brousse au Gabon Au Gabon, la législation régissant la faune sauvage, et, par extension, la chasse et le commerce de viande de brousse, est issue de la loi N°0016101 portant sur le code forestier datant du 22 juillet 1982. En 2001, se sont ajouté des décrets et des arrêtés réglementant, plus précisément, la détention et la commercialisation des espèces sauvages. Toute activité de chasse non conforme à ce code est considérée comme illégale et constitue le braconnage. Les autorités assermentées pour rechercher, constater et poursuivre les infractions en matière d’environnement sont les agents des Eaux et Forêts ayant prêté serment devant la juridiction compétente, des officiers de police judiciaire à compétence générale ainsi que des collaborateurs extérieurs auxquels a fait appel l’administration des Eaux et Forêts pour la protection de la faune (lieutenants de chasse, guides de chasse). Ces autorités sont habilitées à saisir, à confisquer et à mettre sous séquestre les objets constituant des éléments de preuve (animaux, matériel). Les poursuites judiciaires sont initiées par le procureur de la République et peuvent être exercées par les agents assermentés des Eaux et Forêts, les ONG, les associations de défense de l’environnement et les collectivités locales. A l’issue du jugement, les sanctions vont des paiements d’amendes de 10000 à 50 000 000 FCFA à des peines de prison allant jusqu’à 5 ans (MBA OWONO, 2002). L’application des lois est toutefois relative : -

au niveau des permis de chasse et des autorisations de port d’armes ; beaucoup de chasseurs n’en possèdent pas ou ne les renouvellent pas (STEEL, 1994). De plus, les permis apparaissent souvent comme des instruments de contrôle de police et de perception fiscale et leur délivrance fait rarement l’objet 15

d’une vérification des connaissances cynégétiques du demandeur (KONATE, 2001) ; -

aux périodes de chasse q u i ne sont pas respectées ; les populations vivant de cette ressource ne pouvant se permettre d’arrêter de chasser pendant une partie de l’année ;

aux méthodes de chasse et à la pression économique qui font que les animaux tués sont peu discriminés. Le pangolin géant et le chevrotain aquatique sont des espèces que l’on voit communément sur les marchés. La viande de chimpanzé, de gorille et d’éléphant est probablement vendue dans des quantités supérieures à celles enregistrées, leur commerce empruntant des voies plus clandestines (STEEL, 1994).

Ce défaut d’application des lois résulte en partie de la faiblesse du système répressif. Pour MBA OWONO (2002), cette faiblesse se traduit par un nombre limité des procédures judiciaires et par la souplesse des juridictions. Il constata, en enquêtant auprès de différentes autorités compétentes locales, que les moyens mis en œuvre pour le contrôle des infractions étaient insuffisants. A titre d’exemple, sur l’année 2001, l’inspection provinciale des Eaux et Forêts de l’Ogooué-Ivindo, n’a effectué que 6 patrouilles (qui étaient toujours initiées par le WWF). De plus, les procès-verbaux dressés ne sont que très rarement transmis aux tribunaux (1/17 à la brigade de faune et de chasse du Parc National de la Lopé). En outre, les jugements en matière d’environnement ont souvent recours au classement sans suite ou à des condamnations symboliques, réduites au strict minimum prévu par la loi.

CHAPITRE II : GENERALITES SUR LES ENTEROBACTERIES II.1. Définition Les entérobactéries constituent une famille hétérogène de Bacilles à Gram Négatif (BGN) dont certaines sont responsables d’infections humaines parfois sévères (fièvre typhoïde, dysenterie bacillaire, peste). En pathologie, ce sont des bactéries importantes de par leur abondance dans l’intestin, la rapidité de leur multiplication, et leur acquisition fréquente de mécanismes de résistance aux antibiotiques. La famille des Enterobacteriaceae comprend de nombreux genres bactériens répondant à la définition suivante : -

Bacilles à Gram négatif (BGN) ;

Aéro-anaérobies facultatifs ;

Mobiles ou immobiles grâce à une ciliature péritriche ;

Non exigeants (facilement cultivables) ;

Fermentant le glucose (avec ou sans production de gaz) ;

Réduisant les nitrates en nitrites (Nitrate réductase positif) ;

Oxydase négative ;

Catalase positive à l’exception de Shigella dysenteriae ;

Non sporulés ;

Certains sont thermodépendants et ne poussent pas à 37°C tels que Hafnia alvei, Yersinia enterocolitica. Actuellement, 130 espèces sont répertoriées comme appartenant à la

famille des Enterobacteriaceae (DECOSTER et al., 2008a). Le tableau I représente les 12 genres auxquels appartiennent les espèces les plus communément isolées en bactériologie clinique.

Tableau I : Classification des entérobactéries les plus fréquentes en bactériologie clinique et/ou en microbiologie alimentaire Genres

Principales espèces

Salmonella

Espèce enterica qui comprend 6 sous espèces (dont enterica, arizonae...). La sous espèce enterica est divisée en plus de 2600 sérovars déterminés par sérotypage (dont typhi ; paratyphi A, B, C ; typhimurium...)

Escherichia

blattae, coli, fergussonii, hermannii, vulneris

Citrobacter

amalonaticus, braakii, farmeri, freundii, genomospecies 10, genomospecies 11, koseri, rodentium, sedlakii,

Shigella

werkmanii,youngae dysenteriae, flexneri, boydii, sonnei

Genres rencontrés en

Klebsiella

bactériologie clinique et/ou en microbiologie alimentaire

pneumoniae,

oxytoca,

ozaenae,

rhinoscleromatis, planticola, terrigena, Enterobacter

ornithinolytica

aerogenes,

amnigenus,

asburiae, cancerogenus, cloacae, gergoviae Serratia

hormaechei, kobei, sakazakii marcescens, liquefaciens, ficaria, fonticola, odorifera, entomophila,

plymuthica,

piscatorum,

symbiotica Hafnia

alvei

Proteus

mirabilis, vulgaris

Morganella

morganii (seule espèce du genre)

Providencia

alcalifaciens, rettgeri, stuarti, rustigianii

Yersinia

pestis, enterocolitica, pseudotuberculosis, frederiksenii, intermedia, kristensenii Source : MOREDA

II.2. Habitat Le nom d'entérobactéries a été donné parce que ces bactéries sont en général des hôtes normaux ou pathologiques, suivant les espèces microbiennes, du tube digestif et principalement du colon de l'homme et des animaux (SCHEFTEL, 2010). Mais, elles prolifèrent également en abondance dans l'environnement (sols et eaux). Ainsi, elles peuvent être saprophytes ou commensales :  Les entérobactéries saprophytes sont présentes dans les sols, les eaux, les végétaux et dans tout type d'environnement humide en général. Elles participent à la dégradation des matières organiques. Parmi celles-ci, les genres Proteus (qui vivent aussi bien en saprophytes qu'en commensaux), Providencia, Enterobacter, Serratia, Hafnia sont plus adaptés à l'environnement;  La plupart des espèces sont commensales, c’est-à-dire que ces germes vivent dans la lumière intestinale de l’homme et des animaux sans provoquer de pathologie particulière. Elles peuvent être retrouvées dans la cavité buccale, les régions humides de la peau en particulier le périnée, les fosses nasales et les voies génitales féminines dans lesquelles elles peuvent constituer une flore transitoire. C’est le cas par exemple de Proteus, Enterobacter et Escherichia coli. L'espèce Escherichia coli y joue un rôle prépondérant en raison de sa présence constante notamment dès les premières heures de la naissance, et de sa large prédominance sur les autres espèces. Les entérobactéries se multiplient généralement aussi bien chez un hôte (Escherichia coli) que dans l’environnement (Serratia marcescens), bien que certaines espèces soient plus adaptées à l’un ou à l’autre de ces habitats. La transmission de certaines espèces d’entérobactéries est possible entre l’homme et l’animal. Cette adaptabilité des espèces en fonction d’un habitat n’est-elle pas liée à leurs caractères bactériologiques ?

II.3. Caractères bactériologiques II.3.1. Caractères morphologiques Les entérobactéries ont une morphologie habituellement typique, sous forme de bacilles à Gram négatif de 2 à 3 micromètres de long sur 0,6 micromètres de large, généralement polymorphes. Les espèces mobiles, les plus nombreuses, le sont grâce à une ciliature péritriche porteuse d’antigènes facilement modifiables. Les autres sont immobiles (Klebsiella, Shigella, Yersinia pestis, Salmonella gallinarum) ou encore capsulées (Klebsiella). La plupart des espèces pathogènes pour l'homme possèdent des fimbriae ou pili qui sont des facteurs d’adhésion (DRAME, 2001 ; BAKHOUM, 2004). II.3.2. Caractères culturaux Les entérobactéries se développent rapidement in vitro sur des milieux "ordinaires", car leurs exigences nutritionnelles sont généralement réduites. La plupart se multiplient en milieu synthétique avec une source de carbone simple comme le glucose. La température optimale de croissance est de 37°C, mais la culture est possible entre 20° et 40°C et leur temps de division varie de 20 à 40 minutes (DECOSTER et al., 2008a). Sur gélose, les colonies d’entérobactéries sont habituellement lisses, brillantes, de structure homogène (type «smooth» ou S) atteignant 2 millimètres de large sauf celles de Yersinia qui sont plus petites. Cet aspect peut évoluer après cultures successives vers des colonies à surface sèche et rugueuse (type «rough» ou R). Les Proteus ont tendance à envahir la gélose et à y former un tapis uniforme. Les colonies de bactéries capsulées telles que Klebsiella sont mucoïdes, larges (plus grandes que les colonies S) avec une tendance à la confluence. En bouillon, on observe un trouble uniforme (PILET et al., 1979 ; FERON, 1984). II.3.3. Caractères biochimiques Les propriétés qui définissent la famille doivent être mises en évidence pour affirmer que la souche est une entérobactérie. Puis les caractères d'identification de genre et d’espèce sont essentiellement "biochimiques" et utilisent des tests qui étudient le métabolisme protéique (présence d'uréase, production d'indole, dégradation du 20

tryptophane), la fermentation des sucres (glucose, lactose, saccharose), la capacité d'utiliser le citrate, la présence d'enzymes (décarboxylases, désaminases), la production d'hydrogène sulfuré ou la formation de gaz comme le résume le tableau II (LE MINOR ET VERON, 1984). Tableau II : Principaux caractères d'identification des genres d’entérobactéries les plus fréquemment rencontrés VP

Glucose

Lactose

ONPG

Indole

PDA

H2S

Escherichia

Citrobacter

+/-

Enterobacter

Klebsiella

+/-

Serratia

Salmonella

+/-

Shigella

+/-

Proteus

+/-

Providencia

Yersinia

+/-

(Acétoïne)

Citrate

Mobilité

Urée

* à 20°C seulement Source : DECOSTER et al., 2008a Ce tableau fournit un résultat probable grâce à des caractères biochimiques discriminants. Tout résultat devra être validé par la vérification des caractères de l’ensemble de la galerie d’identification à l’aide d’un tableau d’identification plus complet (celui de la galerie api 20E par exemple).

II.4. Pouvoir pathogène Les entérobactéries pathogènes possèdent une grande variabilité dans leur comportement et leur agressivité chez l’hôte (WIKIPEDIA, 2016a). Cependant, dans l’ensemble, leur pouvoir

pathogène

concerne

les

syndromes

digestifs

(diarrhées, gastroentérites, entérites, dysenterie, adénite mésentérique, pouvant évoluer vers un état septicémique), les infections du tractus urinaire, et une maladie très particulière, la peste. D'autres localisations sont possibles mais liées souvent à la dissémination des germes à partir du foyer initial. Ainsi, on distingue deux groupes d’entérobactéries pathogènes : les pathogènes opportunistes (BPO) et les pathogènes strictes (BPS). II.4.1. Les entérobactéries pathogènes opportunistes (BPO) Les BPO ne disposent pas d'un pouvoir pathogène suffisant pour déclencher une pathologie chez un hôte sain. Elles peuvent être présentes dans l'intestin et faire partie intégrante de sa flore commensale (Escherichia coli). Elles sont en revanche susceptibles

déclencher

une

infection

chez

sujet

immunodéprimé comme des septicémies surtout en milieu hospitalier (Serratia, Klebsiella…), des infections respiratoires, urinaires, abdominales en particulier iatrogènes en post-opératoire. La fréquence de leurs manifestations pathologiques est en augmentation en raison de l'existence chez ces espèces de plasmides de résistance aux antibiotiques permettant leur sélection et favorisant à leur avantage les dysmicrobismes. Ce caractère est particulièrement vérifié avec l'espèce Klebsiella pneumoniae, hôte des voies respiratoires, parfois responsable d'infections respiratoires (PHILLIPON, 2001). II.4.2. Les entérobactéries pathogènes strictes (BPS) Leur présence dans l'organisme est anormale quel que soit leur nombre et entraîne souvent une infection dont la gravité dépend de leur point d'entrée. Introduites par un aliment contaminé, elles provoqueront des troubles intestinaux en adhérant sur la muqueuse intestinale puis en traversant la barrière entérocytaire. 22

Les symptômes se caractérisent souvent par des diarrhées importantes suivies d'une déshydratation. Certaines

espèces

provoquent

des

pathologies spécifiques

notamment

l'espèce Salmonella typhi responsable de la fièvre typhoïde ; l'espèce Shigella dysenteriae est l'agent responsable de la dysenterie bacillaire et l’espèce Yersinia pestis responsable de la peste. Ces germes entéropathogènes sont agressifs par euxmêmes ; leur identification est donc capitale.

CHAPITRE III : LA RESISTANCE DES ENTEROBACTERIES AUX ANTIBIOTIQUES III.1. Rappels sur l’antibiorésistance III.1.1. Définition et types de résistance Une souche résistante est une souche qui supporte une concentration d’antibiotique plus élevée que celle qui inhibe le développement de la majorité des souches de la même espèce. Ou encore, une souche résistante est une souche qui supporte une concentration d’antibiotique notablement plus élevée que la concentration qu’il est possible d’atteindre in vivo (CARLE, 2009). Certaines bactéries sont naturellement résistantes à des antibiotiques. Cette résistance est programmée par le génome bactérien et préexiste donc à l’introduction des antibiotiques : on l’appelle encore résistance innée ou intrinsèque. Il s’agit d’une caractéristique constitutive, stable et propre à toutes les souches qui appartiennent à un groupe bactérien donné qui peut correspondre, selon les molécules, à une espèce ou à un groupe phylogénétique plus ou moins vaste. Le support génétique de cette résistance est chromosomique, elle est donc toujours transmissible à la descendance (transmission verticale). La résistance naturelle est une résistance connue et prévisible, qui peut aider à l’identification d’une espèce (CHASSAGNE, 2012). Plus préoccupant, le phénomène de résistance acquise entraine l’apparition subite d’une résistance à un ou plusieurs antibiotiques auxquels la bactérie était auparavant sensible. Les résistances acquises ne concernent qu’une proportion plus ou moins importante, temporellement variable, de souches d’une espèce. Elles résultent d’une mutation génétique affectant le chromosome bactérien pouvant se transmettre à la descendance (transmission verticale). Elle provient également de l’acquisition de matériel génétique exogène (plasmide, transposons, intégrons ou cassettes) porteurs de gènes de résistance ou encore de l’acquisition de matériel génétique libéré dans le milieu par des bactéries (de même espèce ou d’espèces différentes) lysées, transmissibles horizontalement (CHASSAGNE, 2012).

La fréquence de la résistance aux antibiotiques est en croissance rapide, mais variable selon l’antibiotique. En effet, ces résistances sont transférables à travers des gènes de résistances, mais l’addition de mécanismes de résistance est également très fréquente dans le monde bactérien. Ainsi, les bactéries deviennent de plus en plus résistantes à plusieurs antibiotiques, d’où l’appellation de Bactéries MultiRésistantes (BMR). Par ailleurs, la résistance croisée a lieu lorsque la résistance à un antibiotique confère de la résistance à un autre antibiotique de la même classe ou famille d’antibiotiques. III.1.2. Mécanismes d’acquisition de l’antibiorésistance III.1.2.1. Mécanismes génétiques d’acquisition de l’antibiorésistance Une bactérie peut acquérir une résistance aux antibiotiques par deux grands mécanismes génétiques dont le premier a pour support le chromosome, définissant une résistance chromosomique ; le second, ayant pour support les plasmides, les éléments transposables ou les intégrons, définit une résistance extra-chromosomique ou plasmidique (LOZNIEWSKI ET RABAUD, 2010). III.1.2.1.1. La résistance chromosomique La résistance chromosomique est le résultat d’une mutation de l’ADN chromosomique bactérien, conférant à la bactérie la possibilité de résister à un antibiotique. Ce processus spécifique entraine généralement une monorésistance à un antibiotique voire à une famille d’antibiotiques. Cette résistance est donc rare et spontanée (indépendante de l’antibiotique). Elle est également stable et héréditaire car la mutation est conservée par le patrimoine génétique et donc transmise verticalement à la descendance (TOKO, 2010; LOZNIEWSKI ET RABAUD, 2010). III.1.2.1.2. La résistance extra-chromosomique La résistance extra-chromosomique ou plasmidique résulte de l’acquisition par la bactérie de petits fragments d’ADN extra-chromosomique (plasmides), ayant la propriété de se répliquer indépendamment du chromosome bactérien et contenant l’information génétique de résistance. Ce processus est lié à la synthèse de protéines 25

additionnelles et non à une modification des constituants normaux de la bactérie (TOKO, 2010). Ces courtes séquences d’ADN sont capables de se transférer entre le chromosome bactérien et les plasmides ou entre plasmides, avec comme conséquence une dissémination rapide à des bactéries phylogéniquement éloignées, et pouvant appartenir à des espèces ou des genres différents. S’ils sont porteurs de plusieurs gènes de résistance, ils confèrent d’emblée une multirésistance. C’est un processus instable et réversible, car certaines bactéries peuvent perdre leurs plasmides. Dans le cas du transfert de gène, il existe trois modalités : -

la conjugaison : un élément génétique mobilisable est transféré d’une bactérie à une autre.

la transduction : un segment d’ADN est transféré d’une bactérie à une autre via un bactériophage.

la transformation : un ADN libre est intégré au chromosome ou à un plasmide d’une bactérie (GILBERT et al., 2010). La résistance extra-chromosomique peut également provenir d’autres éléments

génétiques tels que les éléments transposables, les intégrons ou cassettes. III.1.2.2. Mécanismes biochimiques d’acquisition de l’antibiorésistance Les bactéries se défendent contre l'action des antibiotiques par quatre grands types de mécanismes biochimiques :  en se rendant imperméables à leur pénétration : ce mécanisme n'affecte pas les bactéries à Gram positif, car les antibiotiques diffusent librement à travers le peptidoglycane qui constitue la paroi de ces bactéries. Chez les bactéries à Gram négatif, au contraire, la barrière constituée par le lipopolysaccharide (LPS) de la membrane externe s'oppose à la pénétration des antibiotiques, mais les porines, protéines formant des canaux, permettent le passage de molécules hydrophiles comme les pénicillines à large spectre, les céphalosporines, les aminosides, les phénicolés ou les tétracyclines. Des mutations entraînant des modifications 26

quantitatives ou qualitatives de ces porines sont responsables de résistances acquises souvent croisées à plusieurs familles d'antibiotiques (DECOSTER et al., 2008b).  en produisant des enzymes capables de les inactiver : ces enzymes produites par les bactéries inactivent l’antibiotique en le modifiant ou en l’hydrolysant. L’inactivation enzymatique des bêtalactamines est le mécanisme le plus fréquemment rencontré. Elle est due aux bêtalactamases capables de scinder le noyau bêtalactame présent dans toutes les molécules de bêtalactamines (MASSOVA ET MOBASHERY, 1998).  en modifiant la structure de leurs cibles : pour qu'un antibiotique soit efficace, il faut qu'il se fixe à une cible dans la bactérie. Si cette cible est remplacée ou modifiée de telle manière que l'antibiotique ne puisse plus s'y fixer, la bactérie acquiert une résistance qui souvent s'étend à toute une famille d'antibiotiques. Ainsi, une modification de la cible ribosomale par mutation par exemple, diminue l’affinité de l’antibiotique pour son site d’action et rend la bactérie résistante aux macrolides, à la clyndamicine, aux aminosides et aux phénicolés (QUINCAMPOIX ET MAINARDI, 2001).  par expulsion de l’antibiotique ou mécanisme d’efflux actif : les transporteurs d’efflux empêchent l’antibiotique d’atteindre sa cible par pompage actif ; l’antibiotique est refoulé à l’extérieur de la cellule bactérienne après son entrée (MESSAROS et al., 2005). Les systèmes de pompes d’efflux impliqués dans le rejet d’antibiotiques sont généralement classés en trois familles selon les homologies de séquences d’acides aminés. On distingue ainsi la « major facilitator super family » (MFS), le « resistance-nodulation-division family » (RND) et la « multidrug and toxic compound extrusion family » (MATE) (TOKO, 2010).

III.1.3. Méthodes d’étude de l’antibiorésistance III.1.3.1. Concentrations minimales et classification des souches Plusieurs méthodes d’étude peuvent être utilisées en laboratoire pour étudier la résistance d’une bactérie à l’action d’un antibiotique. Mais toutes ces méthodes reposent sur la détermination de deux paramètres : la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) et la Concentration Minimale Bactéricide (CMB). Pour un antibiotique donné, la CMI et la CMB sont définies en fonction de son activité sur une souche bactérienne. La CMI correspond à la concentration minimale d’antibiotique qui inhibe la croissance visible du germe en 24 heures. La CMB est la plus faible concentration d'antibiotique pour laquelle l'effet bactéricide est de 99,99 % (soit 0,01% de survivants), les conditions de culture étant standardisées. Cependant, pour l’étude de la sensibilité des bactéries à l’action des antibiotiques, la concentration minimale inhibitrice (CMI) est le paramètre le plus utilisé. Elle est définie par le Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie (CA-SFM) comme étant la plus faible concentration d’une gamme de dilutions d’antibiotique de demi en demi qui entraîne l’inhibition de toute croissance bactérienne visible (BURNICHON ET TEXIER, 2003). Il existe plusieurs méthodes pour la détermination de la CMI : la dilution successive en milieu liquide (croissance bactérienne appréciée par l’apparition d’un trouble), l’utilisation de bandelettes imprégnées d’un gradient d’antibiotique (ETest) et la méthode par dilution successive en milieu solide qui est la méthode la plus souvent utilisée pour déterminer la sensibilité bactérienne aux antibiotiques. Cette détermination exige une standardisation rigoureuse du protocole expérimental car toute modification des conditions expérimentales rendrait l’interprétation difficile. Une caractérisation des souches en fonction de la sensibilité exige également une classification en catégories de sensibilité. Trois catégories cliniques ont été retenues par le Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie (CA-SFM) : Sensible (S), Résistant (R) et Intermédiaire (I) :

Les souches catégorisées (S) sont celles pour lesquelles la probabilité de succès thérapeutique est forte dans le cas d'un traitement par voie systémique avec la posologie recommandée dans le résumé des caractéristiques du produit (RCP).

Les souches catégorisées (R) sont celles dont il existe une forte probabilité d'échec thérapeutique quel que soit le type de traitement et la dose d'antibiotique utilisée.

Les souches catégorisées (I) sont celles dont le succès thérapeutique est imprévisible. Ces souches forment un ensemble hétérogène pour lequel les résultats obtenus in vitro ne sont pas prédictifs d'un succès thérapeutique.

In vitro, on utilise des gradients de concentration de l’antibiotique testé auxquels est soumise la souche bactérienne. Ces gradients de concentration s’organisent autour de deux valeurs, la concentration critique inférieure (c) et la concentration critique supérieure (C). III.1.3.2. Concentrations critiques et antibiogramme Les concentrations critiques des antibiotiques sont établies sur la base des concentrations sériques obtenues après administration d’une posologie « usuelle » (concentration critique inférieure c) et de la posologie maximale tolérée (concentration critique supérieure C). Pour un couple bactérie-antibiotique, la souche bactérienne est dite sensible (S) lorsque sa CMI est inférieure à la concentration critique inférieure de l’antibiotique. A contrario, elle est dite résistante (R) lorsque sa CMI est supérieure à la concentration critique supérieure de l’antibiotique. Pour une CMI se situant entre les deux valeurs de concentration critique c et C, la souche est dite intermédiaire. La détermination de la CMI d’un antibiotique pour une souche bactérienne donnée passe par l’antibiogramme. Un antibiogramme est une technique de laboratoire visant à tester la sensibilité d'une souche bactérienne vis-à-vis d'un ou de plusieurs antibiotiques supposés ou connus.

Le principe consiste à placer la culture bactérienne en présence d’un ou de plusieurs antibiotiques et à observer les conséquences sur le développement et la survie de celle-ci. La réalisation de l’antibiogramme utilise deux types de méthodes classiques, les méthodes de dilution et la méthode de diffusion :  Les méthodes de dilution consistent à mettre un inoculum bactérien standardisé au contact de concentrations croissantes d'antibiotiques selon une progression géométrique de raison 2. Les méthodes de dilution sont effectuées en milieu liquide ou en milieu solide. -

En milieu liquide, l'inoculum bactérien est distribué dans une série de tubes (méthode de macrodilution) ou de cupules (méthode de microdilution) contenant l'antibiotique. Après incubation, la CMI est indiquée par le tube ou la cupule qui contient la plus faible concentration d'antibiotique où aucune croissance n'est visible (figure 1).

Figure 1 : Détermination de la CMI par dilution en milieu liquide Source : Burnichon et Texier, 2003 Dans l’exemple ci-dessus, la CMI de la souche testée est de 2μg/ml (premier tube dans lequel aucune croissance n'est visible à l'œil nu). -

En milieu solide, l'antibiotique est incorporé dans un milieu gélosé coulé en boîtes de pétri. La surface de la gélose est ensemencée 30

avec un inoculum des souches à étudier. Après incubation, la CMI de chaque souche est déterminée par l'inhibition de la croissance sur le milieu contenant la plus faible concentration d'antibiotique (figure 2).

Figure 2 : Détermination de la CMI par dilution en milieu gélosé Source : Burnichon et Texier, 2003 La CMI de la souche 3 vis-à-vis de l'antibiotique incorporé à la gélose est de 1μg/ml. La CMI de la souche 2 est de 2μg/ml. Les déterminations des CMI des souches 1 et 4 nécessiteraient de tester des concentrations plus fortes en antibiotique (Figure 3). La méthode de dilution en milieu gélosé, réalisée avec une gamme de concentrations en progression géométrique de raison 2 est la méthode de référence. Cependant, cette méthode est beaucoup moins utilisée au profit de la méthode de diffusion.  La méthode de diffusion ou antibiogramme standard consiste à placer des disques de papier buvard, imprégnés des antibiotiques à tester, à la surface d'un milieu gélosé, préalablement ensemencé avec une culture pure de la souche à étudier. Dès l'application des disques, les antibiotiques diffusent de manière uniforme si bien que l’on a des gradients de concentration d’antibiotique autour du disque inversement proportionnels à la distance d’avec le centre du disque. Après incubation, les disques s'entourent de zones d'inhibition circulaires correspondant

une

absence

culture.

Lorsque

technique

est

parfaitement standardisée, les diamètres des zones d'inhibition dépendent 31

uniquement de la sensibilité du germe. À la limite des zones d'inhibition, il existe dans la gélose des concentrations d’antibiotique égales aux CMI. La méthode par diffusion réalise le classement en utilisant la relation entre la CMI et le diamètre d’inhibition autour du disque d’antibiotique. La lecture est donc relativement directe (figure 3). Chaque antibiotique a ses concentrations critiques propres, donc ses diamètres critiques propres. Les diamètres critiques inférieurs (d) et supérieurs (D) correspondent respectivement aux concentrations critiques hautes (C) et basses (c). Pour une bactérie et un antibiotique donnés, le diamètre d’inhibition mesuré est comparé aux diamètres critiques : -

En dessous d’un diamètre critique inférieur d (donc au-dessus de la concentration critique supérieur C), la souche est classée résistante (R) ;

Au-dessus du diamètre critique supérieur D (donc en dessous de la concentration critique inférieur c), la souche est classée sensible (S) ;

Entre les deux valeurs de diamètres critiques, la souche est dite intermédiaire (I).

Figure 3 : Définition des catégories cliniques selon les concentrations critiques et les diamètres critiques Source : Burnichon et Texier, 2003  La méthode par E-test est proposée depuis une vingtaine d’années et également validée par le CA-SFM. Il s’agit d’une technique de dilution en milieu gélosé permettant de donner une mesure précise de la CMI d’un antibiotique (JOLY-GUILLOU, 2007).

Un gradient de concentration d’antibiotique est obtenu dans une bandelette plastifiée. Celle-ci déposée sur une gélose MH préalablement ensemencée à l’aide d’un inoculum bactérien 24 à 48h avant à 37°C. Une ellipse d’inhibition se dessine autour de la bandelette et la CMI correspond à la valeur lue à l’intersection de la culture bactérienne et de la bandelette. Outre la détermination de la mesure précise de la CMI d’un antibiotique, cette méthode peut être utilisée pour la mise en évidence d’un mécanisme de résistance comme par exemple la résistance aux glycopeptides chez Staphylococcus aureus ; ou encore

la réalisation de tests d’association

d’antibiotiques révélant en image une synergie ou un antagonisme entre deux antibiotiques (SANCAK et al., 2005). III.2. Types de résistance et mécanismes de résistance des entérobactéries aux antibiotiques III.2.1. Résistance naturelle Les entérobactéries possèdent un certain nombre de phénotypes de résistance naturels tels que l'expression d'une pénicillinase ou d'une céphalosporinase selon la classe d'entérobactéries. Elles opposent une résistance naturelle aux Pénicillines G et M, aux

macrolides

(Erythromycine…),

aux

lincosamides

(Lincomycine,

Clindamycine), aux synergistines (Pristinamycine) et aux glycopeptides (Téicoplanine, Vancomycine) (PHILLIPON, 2001). Certaines d'entre elles sont naturellement résistantes à d'autres molécules (tableau III). Ainsi, les genres Proteus et Serratia sont résistantes à la colistine, Klebsiella et Levinea quant à elles le sont à l’ampicilline. Les

aminosides,

quinolones

phénicolés

sont

normalement

actifs

contre les entérobactéries mais les résistances acquises sont fréquentes (DECOSTER et al., 2008b).

Tableau III : Résistance des entérobactéries aux bêtalactamines Groupe Péni A

Carb

C1G

C3G

Entérobactéries Escherichia

Proteus

coli,

mirabilis,

Salmonella, Shigella

Klebsiella, Levinea

Mécanismes et résistance Phénotypes sensibles,

Absence

de bêtalactamases Pénicillinase chromosomique

Enterobacter, R

Citrobacter Proteus

indole +, Serratia,

Céphalosporinase

Providencia R

Yersinia

Pénicillinase

enterocolitica

Céphalosporinase

Source : DECOSTER et al., 2008b III.2.2. Résistances acquises Les entérobactéries ont acquis de nouveaux phénotypes de résistance leur permettant d’échapper aux antibiotiques. Ces mécanismes sont de trois ordres : -

diminution de la quantité d’antibiotique atteignant la cible par diminution de la perméabilité ou par apparition de systèmes d’efflux ;

modification de la cible de l’antibiotique soit par une mutation soit par acquisition de gènes exogènes ;

inactivation de l’antibiotique par production d’enzymes. C’est le mécanisme le plus fréquent. Il peut s’agir d’une destruction de l’antibiotique, ou d’une modification de la molécule par ajout de radicaux libres (OPAL et al., 2000).

III.2.2.1. Les résistances acquises par production d'enzymes Dans le cas des bêtalactamines, la résistance acquise est due à une inactivation de l’antibiotique par l’acquisition d’enzymes (bêtalactamases). Trois principaux types d’enzymes sont connus : -

Les pénicillinases (TEM) qui sont d’origine plasmidique : elles rendent les souches qui en produisent résistantes aux aminopénicillines, aux carboxypénicillines et aux uréidopénicillines mais si le niveau de production est élevé, la résistance s'étend aux acyluréido-pénicillines, aux C1G, C2G et à quelques C3G ;

Les enzymes dites TRI (pour TEM résistantes aux inhibiteurs) : elles hydrolysent le cycle bêtalactame, mais aussi l’inhibiteur des bêtalactamases. Les souches productrices sont donc résistantes aux aminopénicillines, aux uréidopénicillines,

aux

carboxypénicillines

aux

inhibiteurs

bêtalactamases. -

Les céphalosporinases : la production importante de céphalosporinase (céphalosporinase "déréprimée"), d'origine chromosomique, rend les souches résistantes à toutes les bêtalactamines sauf aux carbapénemes (DECOSTER et al., 2008b). Depuis peu sont apparues, chez Klebsiella pneumoniae et Enterobacter

aerogenes surtout, des bêtalactamases à spectre étendu (BLSE), d'origine plasmidique qui inactivent toutes les bêtalactamines, sauf certaines C2G et les carbapénèmes. Les entérobactéries du groupe 1 (tableau III) et Escherichia coli en particulier expriment parfois une pénicillinase sensible aux inhibiteurs (50% des colibacilles). Il arrive que cette pénicillinase soit abondamment produite (pénicillinase de haut niveau) ; dans ce cas les inhibiteurs se révèlent moins efficaces. Une pénicillinase TRI est présente chez 3% environ des souches d'Escherichia coli. Les entérobactéries du groupe 2 (Klebsiella, Levinea) (tableau III) produisent parfois leur pénicillinase naturelle à un haut niveau. C'est également principalement mais non exclusivement chez les klebsielles qu'on rencontre les BLSE. 35

Les

entérobactéries du

groupe

3 (Enterobacter,

Citrobacter, Proteus,

Providencia, Serratia) (tableau III) produisent naturellement une céphalosporinase qui peut être déréprimée. Les entérobactéries sont naturellement sensibles aux aminosides. Le mécanisme de résistance le plus fréquent est une inactivation enzymatique des aminosides en modifiant leur structure par phosphorylation. Les enzymes qui hydrolysent les aminosides sont les aminosides phosphotransférases (APH), les aminosides nucléotidyltransférases (ANT) et les aminosides acétyltransférases (AAC). En effet, les phénotypes résistants sont moins de 3% chez Escherichia coli, Salmonella et Shigella, un peu moins rares chez Proteus mais deviennent plus fréquents, atteignant 20 à 50%, chez les autres entérobactéries comme Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Serratia. Un chloramphénicol acétyltranférase (CAT) est responsable de la résistance des entérobactéries aux phénicolés, c’est le cas particulier de certaines souches de Salmonella (DECOSTER et al., 2008b). III.2-2.2. Les résistances acquises par imperméabilité ou modification de cibles Les résistances acquises par imperméabilité ou modification de cibles sont rarement les causes de résistance chez les entérobactéries. Une mutation portant sur les porines est cause de résistance à haut niveau chez Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Proteus et rarement chez Salmonella. Les mutations qui affectent le transport actif des aminosides sont également responsables d'une résistance croisée à ces antibiotiques. Une mutation affectant l'ADN gyrase détermine une résistance aux quinolones chez Klebsiella, Serratia, Citrobacter et Providencia. Les mutations qui affectent les protéines ribosomales, entraînent une diminution de l'affinité des ribosomes pour les aminosides. De tels mutants sont rarement isolés en clinique. 36

Les mécanismes de résistance des entérobactéries aux fluoroquinolones sont de deux types notamment par altération de la cible des fluoroquinolones ou par efflux avec

diminution

concentration

intracellulaire

l'antibiotique.

Les

fluoroquinolones sont largement actives in vitro sur plus de 80 % des souches d'entérobactéries, sauf pour Enterobacter aerogenes et Providencia stuartii chez lesquels le taux de sensibilité est faible (NEUHAUSER et al., 2003). III.3. Epidémiologie de l’antibiorésistance des entérobactéries  En médecine humaine Les entérobactéries représentent la deuxième cause d'infections graves après les Cocci à Gram positif (ZOGHEIB ET DUPONT, 2005). Une grande étude a comparé les incidences des infections à BGN entre 5 pays européens entre 1994 et 1995 (HANBERGER et al., 1999). Les entérobactéries représentaient 59 % des BGN, suivies par 24 % de Pseudomonas aeruginosa. Les entérobactéries retrouvées par ordre décroissant étaient Escherichia coli, Enterobacter spp, Klebsiella spp, Serratia spp, Proteus spp, Morganella morganii et Citrobacter spp. L'Escherichia coli (groupe 1) présentait une pénicillinase hyperproduite pour 17 à 50 % des souches, alors que les résistances aux C3G et à l'imipenème restaient exceptionnelles (HANBERGER et al., 1999). Les mêmes proportions étaient retrouvées pour Klesiella spp (groupe 2) en ce qui concerne la pipéracilline et son association au tazobactam. En revanche, dans certains pays (France, Portugal), 20 à 34 % des souches sont résistantes à la ceftazidime mais sensibles à l'imipenème (BLSE) (HANBERGER et al., 1999). Quant aux entérobactéries de groupe 3 (Enterobacter spp surtout), elles expriment dans près de la moitié, une céphalosporinase inductible les rendant résistantes à toutes les bêtalactamines, sauf à l'imipenème (HANBERGER et al., 1999). Une étude a été réalisée à l’hôpital militaire Moulay-Ismail de Meknès au Maroc sur 730 souches d’entérobactéries non répétitives isolées d’infections urinaires chez des patients hospitalisés au service d’urologie et des consultants externes. L’espèce Escherichia coli domine le profil épidémiologique aussi bien pour les 37

entérobactéries hospitalières que communautaires, avec respectivement 65 et 80 % des isolats. La fréquence de la résistance globale des souches d’entérobactéries hospitalières et communautaires à l’amoxicilline, amoxicilline associée aux inhibiteurs de bêtalactamases, quinolones, fluoroquinolones, sulfaméthoxazole+ trimethoprime et nitrofuranes est élevée. Les céphalosporines de troisième génération et les aminosides conservent une bonne activité. La prévalence globale de la production de bêtalactamases à spectre étendu (BLSE) est observée chez 9 % des entérobactéries (LAHLOUM, CHEGRI ET L’KASSMI, 2009). Différents réseaux ont été développés afin de mettre en place des bases de données européennes (MYSTIC) ou mondiales (SENTRY) permettant de suivre l'évolution des infections et des profils de résistance des BGN. Dans l'étude MYSTIC (1997-2002), 60 centres européens ont participé (TURNER, 2005). Environ 5 260 entérobactéries ont été isolées : Escherichia coli (32 %), Klebsiella pneumoniae (18%), Enterobacter cloacae (14 %), divers (8,8 %). La production de BLSE par les entérobactéries en 2002 était de 8,1 % contre 14,4 % en 1997 (Turner, 2005). Une céphalosporinase déréprimée était produite par 4,5 % des entérobactéries en 2002 et 6,9% en 1997 avec des grandes variations entre les pays (TURNER, 2005). Récemment, le groupe SENTRY a mené une étude sur la prévalence des souches BLSE incluant 5 000 souches européennes d'entérobactéries (NIJSSEN et al., 2004). La production de BLSE a été confirmée pour 1,3 % des souches d'Escherichia coli, 18,4% des souches de Klebsiella pneumoniae, 12,6 % des souches de Klebsiella oxytoca et 5,3% des souches de Proteus mirabilis (NIJSSEN et al., 2004). Par ailleurs en France, une étude épidémiologique a évalué l'évolution des résistances aux bêtalactamines et aux fluoroquinolones sur trois années consécutives (1996 à 1998) avec plus de 7 000 souches d'entérobactéries testées (SIROT et al., 2002). Globalement, peu de variations des taux de résistance étaient observées sauf pour les souches de Klebsiella pneumoniae où le pourcentage de BLSE était passé de 18 à 19%, et pour les souches d'Enterobacter aerogenes avec des taux de BLSE variant de 32 à 54 % (SIROT et al., 2002). Le pourcentage d'isolement d'entérobactéries varie selon l'origine communautaire ou de cliniques privées des 38

patients, mais la grande majorité des isolats dans ce cadre restent urinaires (QUENTIN et al., 2004).  En médecine vétérinaire Les animaux aussi sont de gros consommateurs d’antibiotiques. D’après l’OMS en 2013, au moins 50% des antibiotiques produits dans le monde sont destinés aux animaux. Cependant, tout comme chez l’Homme, la surconsommation d’antibiotiques dans les élevages est responsable de l’apparition des résistances qui peuvent être transmises à l’Homme directement ou via la chaine alimentaire. Peu d’études existent sur la recherche de l’antibiorésistance des entérobactéries chez les animaux et encore moins chez le gibier. Cependant, quelques études ont été effectuées chez les animaux de rente et certains animaux sauvages. En France, le rapport du Résapath (le réseau de surveillance épidémiologique de l’antibiorésistance des bactéries pathogènes animales de l’Anses), s’appuyant sur 36 989 antibiogrammes réalisés en 2014 à partir de prélèvements sur des volailles, des porcs, des chevaux, des bovins et des animaux de compagnie, montre que les taux les plus élevés de résistance aux céphalosporines (C3G et C4G) se situent entre 5 et 10% chez les veaux, les chevaux, les chiens et les chats. Il montre aussi que ce taux est égal ou inférieur à 5% chez les poulets, porcs et dindes. Concernant les fluoroquinolones, le taux de résistance était plus élevé que celui des céphalosporines, et il restait supérieur à 20% chez les bovins, supérieur à 15% chez le chien et supérieur à 10% chez le porc. Il n’était que de 5% chez les volailles et les équidés (ANSES, 2015). Dans le parc national d'Amboseli au Kenya, une étude réalisée en 1985 par ROLLAND et al. sur 3 groupes de babouins sauvages (Papio cynocephalus), a permis de déterminer la prévalence des bactéries fécales aérobies résistantes aux antibiotiques chez les primates non humains avec et sans contact avec les déchets humains. De faibles quantités de bactéries entériques à Gram négatif résistantes aux antibiotiques ont été constatées dans les deux groupes de babouins (groupe Alto 47,5% et groupe Hook 36 %) vivant dans leur habitat naturel, et ayant peu ou pas de contact avec les humains. Par contre, la résistance était significativement plus 39

élevée (91,4%) chez les bactéries entériques du troisième groupe de babouins (groupe Lodge) vivant à proximité d'un gite touriste et ayant des contacts quotidiens avec les déchets humains non transformés. Les résistances fréquemment observées dans tous les échantillons l’étaient à la tétracycline et à la kanamycine. Aucune résistance à la gentamicine n’a été détectée. Une étude a été effectuée afin de déterminer les profils de résistance aux antibiotiques dans 1 286 souches d'Escherichia coli isolées à partir de 2 522 échantillons

boues

humaines,

faune,

d’animaux

domestiques,

des

environnements d'exploitation, et de l'eau de surface dans le bassin versant de cèdre rouge dans le Michigan (SAYAH et al., 2005). Les tests de sensibilité aux antimicrobiens par la méthode de diffusion en milieu gélosé a été réalisée pour la néomycine, la gentamicine, la streptomycine, le chloramphénicol, l'ofloxacine, la triméthoprime-sulfaméthoxazole, la tétracycline, l'ampicilline, l'acide nalidixique, la nitrofurantoïne, la céphalothine, et sulfisoxazole. Une résistance à au moins un antibiotique a été démontrée dans des isolats provenant du bétail, des animaux de compagnie, des boues humaines, de la faune, et de l'eau de surface. En général, les souches d’Escherichia coli isolées à partir d'espèces domestiques ont montré une résistance au plus grand nombre d'antibiotiques par rapport aux isolats de boues humaine, de la faune, et de l'eau de surface. Les antibiotiques dont la résistance a été démontrée plus fréquemment étaient la tétracycline (27,3%), la céphalothine (22,7%), le sulfisoxazole (13,3%), et la streptomycine (13,1%). La multirésistance a été observée dans une variété de sources, et les plus hauts niveaux d’Escherichia coli multirésistants ont été observés avec les échantillons fécaux de porcs. Dans le Parc National de la Lopé au centre du Gabon, une étude a été réalisée pour déterminer la prévalence du modèle de Escherichia coli résistant aux antibiotiques d’isolats provenant de matières fécales d'une population de gorilles de plaine

occidentale (Gorilla

gorilla

gorilla),

d'autres mammifères

sauvages

(chimpanzés, mandrills, singes, céphalophes, potamochères, buffles, éléphants) et d’humains. Elle a montré une forte prévalence des isolats bactériens de résistance aux antibiotiques chez les humains et les niveaux faibles chez les gorilles et autres animaux sauvages. En effet, dans l'ensemble, 7,6% de tous les isolats étaient résistants à 40

l'ampicilline, 6,4% au sulfaméthoxazole, 5,9% à la streptomycine, et 5,5% à la tétracycline. Aucune résistance n'a été observée pour la néomycine, la ciprofloxacine et le ceftiofur. La multirésistance a été détectée dans 17 (56%) des isolats résistants (30). La multirésistance est plus élevée dans les isolats humains, suivie des isolats provenant d'animaux domestiques, des isolats provenant d'animaux sauvages, et enfin dans les isolats de gorilles (BENAVIDES et al., 2012).

DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL EXPERIMENTAL Chapitre I : Cadre, matériel et méthodes Chapitre II : Résultats Chapitre III : Discussion, recommandations et perspectives

CHAPITRE I : CADRE, MATERIEL ET METHODES I.1. Cadre de l’étude Notre étude concerne d’une part les zones Mbani (fleuve Mbani) et Boutsiana (rivière Boutsiana) du PNMD, dans le Sud-ouest du Gabon, et d’autre part les marchés de Libreville, première ville du pays en nombre d’habitants, où est vendue la viande de brousse. La Zone Mbani, située au Sud-est du Parc, fait actuellement l’objet d’un écotourisme par l’ONG PROGRAM. La Zone Boutsiana quant à elle, se situe à côté d’un bras de la rivière Doughoughou (à côté du village Doussala), la rivière Boutsiana d’où son nom. Elle est située au Nord-est du Parc (figures 4 et 5). A Libreville, notre zone d’étude était constituée par les marchés d’Akébé, de Nzeng- ayong, d’Oloumi et de La peyrie où le gibier est très souvent commercialisé.

Figure 4 : Localisation du PNMD au Gabon Source : Jean Louis ALBERT, 2011

Figure 5 : Localisation de Doussala et de Mbani au PNMD Source : Jean Louis ALBERT, 2011 Tous les mammifères considérés comme petits, moyens et grands gibiers au Gabon constituent la population cible de cette étude. Notre travail a porté sur les souches d’entérobactéries antibiorésistantes. Les prélèvements ont été faits au Gabon dans les zones du PNMD et des marchés de Libreville comme mentionné plus haut. Les travaux de recherche se sont déroulés du 14 Avril 2015 au trente 30 Novembre 2015 (durant 9 mois). Cette étude a été effectuée sur fonds propres. I.2. Matériel d’étude I.2.1. Matériel biologique Le matériel biologique était constitué de 41 échantillons de crottes de gibier, parmi lesquels il y avait 29 échantillons provenant du PNMD et 12 échantillons issus des marchés de Libreville. I.2.2. Matériel de collecte des échantillons sur le terrain 44

pour la collecte dans la forêt du PNMD : o petit matériel : pinces stériles, gants, anses en plastiques stériles, sacs en nylon étanches, boîte isotherme en polystyrène, glacière, marqueurs, hand-warmers, GPS et thermomètre ; o milieu de culture : gélose EMB au préalable préparée et coulée dans des boîtes de Pétri de 60mm. Il s’agit d’un milieu de culture sélectif pour l’isolement et l’identification des entérobactéries.

pour la collecte dans les marchés : o petit matériel : gants, sacs en plastique, glacière, marqueurs et GPS. I.2.3. Matériel pour l’isolement et l’identification au laboratoire

Le matériel d’analyse de laboratoire comprenait : -

matériel lourd : incubateur, autoclave, étuve, hotte ou poste de sécurité microbiologique avec bec bunsen, réfrigérateur, microscope, ordinateur, balance électronique, agitateur magnétique et micro-onde (figures 6a-d) ;

petit matériel : flacons de 500ml, boîtes de Pétri de 90mm, anses stériles en plastique de 1 et 10µl, tubes de 2ml stériles, gants, lames et lamelles, disques de papier filtre, pipettes pasteurs stériles, portoirs, marqueurs, huile de paraffine et huile à immersion ;

milieux de culture et réactifs : milieux gélosés EMB et TS, kit pour la coloration de GRAM, galeries API20E et réactifs d’identification, réactif test oxydase, alcool à 90°C, eau distillée et eau déminéralisée stérile. I.2.4. Matériel pour l’antibiogramme et la cryoconservation au laboratoire

Matériel lourd : incubateur, autoclave, étuve, hotte ou poste de sécurité microbiologique avec bec bunsen et congélateur.

Petit matériel : flacons de 500ml, boîtes de Pétri de 90mm, anses en plastique stériles, écouvillons stériles, tubes de 2ml stériles, gants, micropipettes, pipettes Pasteur stériles, pinces stériles et marqueurs. 45

Milieux de culture et réactifs : gélose MH et disques de diffusion imprégnés d’antibiotiques.

Figure 6 : Machines utilisées au Laboratoire de Bactériologie de l’IRET

I.3. Méthodes La méthode de collecte a consisté à récolter différents échantillons de fèces fraiches de gibiers dans les zones Mbani et Boutsiana du PNMD premièrement ; et deuxièmement, des intestins de gibiers dans certains marchés de Libreville. I.3.1. Méthode sur le terrain I.3.1.1. Période de la collecte des échantillons L’échantillonnage a duré 15 jours dans la zone Boutsiana et 5 jours dans la zone Mbani au cours du mois de Juillet 2015. Dans les différents marchés de Libreville, la collecte d’intestins de gibier s’est effectuée pendant 9 jours, cela du 22 au 30 octobre 2015. I.3.1.2. Collecte des échantillons  Dans la forêt du PNMD Pour la collecte des échantillons dans la forêt du PNMD, nous étions accompagnés par deux pisteurs (anciens chasseurs) pour l’aide à l’identification et à la collecte des fèces fraiches de gibier. En effet, ces pisteurs ont des connaissances empiriques sur les crottes d’animaux à partir de leur odeur, couleur et morphologie. Mais la plupart du temps, nous avons fait des observations directes des animaux, ensuite lorsqu'ils se sont déplacés, nous sommes allés ramasser leurs crottes. Des fèces fraiches de diverses espèces de gibier ont été ramassées et mises dans des sacs en plastiques stériles numérotés, tout en marquant le point GPS et l’espèce correspondant à l’échantillon prélevé dans un carnet (figure 7).

Figure 7 : Collecte des crottes de gibier dans la forêt du PNMD Au total, 29 échantillons ont été collectés au PNMD, dont 16 échantillons dans la zone Mbani et 13 échantillons dans la zone Boutsiana. Après avoir récolté une dizaine d’échantillons à chaque sortie, l’isolement a eu lieu à la station de recherche de Doussala (figure 8) sous une hotte, par ensemencement des échantillons dans des boites de gélose EMB préalablement préparée et coulée dans des boîtes de Pétri de 60mm (figure 9a) au Laboratoire de Bactériologie de l’IRET.

Figure 8 : Station de recherche en Primatologie de Doussala au PNMD

L’incubation a ensuite été réalisée dans une boîte isotherme en polystyrène chauffée (figure 9b) à 37°C à l’aide de 2 à 3 chauffe-mains (Hand-warmers) (figure 9c) (MBEHANG et al., 2015) pendant 24 heures. La température de la boite était périodiquement surveillée (toutes les 3 à 4 heures) à l’aide d’un thermomètre (figure 9c). Vingt-quatre heures (24 heures) après, les boites qui portaient des colonies ont été hermétiquement fermées avec de la paraffine et stockées au réfrigérateur de Tchibanga, la ville la plus proche du village Doussala.

a : Boîte de Pétri de 60mm contenant

b : Hand-warmer (chauffe-mains)

la gélose EMB

c : Boîte en polystyrène et thermomètre Figure 9 : Matériel utilisé pour la culture des entérobactéries au PNMD

 Dans les marchés de Libreville Dans les quatre marchés de Libreville sillonnés, les vendeurs de viande de brousse étaient des femmes. Sur les étals, le gibier se présente frais ou fumé, entier ou en morceaux (figure 10). Les viscères, et en particulier les intestins n’étant pas consommés, sont en général jetés à la poubelle ou stockés dans un coin après l’éviscération de la viande. La collecte s’est faite en fonction des viandes trouvées sur les différents étals et de la disponibilité des viscères. Trois (3) à 4 échantillons d’intestins de gibier différent par marché ont été collectés en fonction de l’abondance d’espèces différentes et de manière à obtenir les mêmes espèces par marché. Au total, une douzaine d’échantillons a été récoltée dans les quatre marchés précités.

Figure 10 : Un étal de viande de brousse au marché d’Akébé I.3.2. Méthode au laboratoire Les échantillons recueillis au PNMD ayant déjà été isolés à la station de recherche en primatologie de Doussala, les boîtes de Pétri ensemencées et stockées ont été acheminées au Laboratoire de Bactériologie de l’IRET pour la culture et l’identification (figures 11a et 11b).

I.3.2.1. Isolement Après avoir acheté les échantillons d’intestins de gibiers dans les différents marchés, la culture a eu lieu au Laboratoire de Bactériologie de l’IRET (figure 11a). Il a consisté à prélever sous une hotte, pour chaque échantillon et à l’aide d’une anse en plastique stérile, un petit bouton de fèces d’une anse intestinale (colon) préalablement disséquée et à ensemencer une boîte de Pétri de 90mm contenant la gélose EMB (figures 11c et 11d). La boite a été ensuite placée dans un incubateur chauffé à 37°C pendant 24 heures. Après

heures

d’incubation,

les

colonies

sont

caractérisées

macroscopiquement sous la hotte (taille, forme et couleur). Puis, en fonction de leur morphologie, elles sont dénombrées. Enfin, chaque colonie observée a été repiquée sur la gélose TS et incubée à 37°C pendant 24 heures. Après incubation, l’identification des bactéries isolées s’est poursuivie à partir de leurs caractères biochimiques.

a: Bâtiment de l’IRET

b: Arrivée des échantillons ensemencés en forêt au Laboratoire de Bactériologie de l’IRET

c: Dissection d’un rat géant pour prélever une anse intestinale

d: Prélèvement du contenu d’une anse intestinale de crocodile nain

Figure 11 : Laboratoire de Bactériologie de l’IRET

I.3.2.2. Identification des colonies isolées Suite à l’isolement, les colonies obtenues ont été identifiées à partir de leurs caractères biochimiques à l’aide de galeries Api20E. Mais avant d’utiliser Api20E, ces colonies ont subi un ensemble de tests, à savoir : recherche de la mobilité, la coloration de Gram et le test d’oxydase. A l’issue de ces tests, n’ont été retenues que les colonies Gram - et Oxydase - qui sont les deux caractères communs aux entérobactéries.

 Utilisation des galeries Api20E Pour se faire, le test a débuté par la préparation d’une suspension bactérienne d’opacité équivalente à 0,5 MacFarland pour chaque type bactérien en mélangeant 5ml d’eau distillée stérile avec 3 à 4 colonies isolées pures et identiques. L’inoculation de la galerie a suivi en introduisant la suspension bactérienne dans les tubes à l'aide d’une pipette Pasteur stérile : -

pour les tests CIT, VP et GEL, tube et cupule ont été remplis ;

pour les autres tests, uniquement les tubes ont été remplis ;

pour les tests : ADH, LDC, ODC, H2S, URE, une anaérobiose a été créée en remplissant leur cupule de deux gouttes d'huile de paraffine. Pour finir, la boîte d'incubation a été fermée et incubée à 37°C pendant 24 heures. Après incubation, les galeries ont été sorties de l’étuve. Toutes les

réactions spontanées ont été notées sur la fiche de résultats et les tests nécessitant l'addition de réactifs ont été révélés : -

Test TDA : 1 goutte de réactif TDA a été ajoutée puis la lecture du résultat a été immédiate ;

Test IND : 1 goutte de réactif JAMES a été ajoutée puis la lecture du résultat a été immédiate ;

Test VP : 1 goutte des réactifs VP 1 et VP 2 a été ajoutée;

Test GLU : 1 goutte des réactifs NT 1 et NT 2 a été ajoutée. Pour ces deux derniers tests (VP et GLU), la lecture des résultats a été faite

après une dizaine de minutes. Pour le test GLU, en cas de résultat négatif (coloration jaune), il a été ajouté 2 à 3 mg de poudre de zinc puis l’attente a duré 5 minutes pour la lecture du résultat. S’il est resté jaune, cela indique une réaction positive, il est alors Nitrite – et azote +.Si il y a eu changement de coloration (orange-rouge), la réaction est négative, les nitrates encore présents dans le tube ont été réduits en nitrites par le Zinc ; il est alors Nitrite + et azote -.

Enfin, les résultats ont été inscrits sur la fiche de lecture. Les informations contenues dans chacune de ces fiches de lecture ont été ensuite soigneusement rentrées dans le logiciel Api web pour avoir une identification finale des colonies obtenues. Au final, uniquement les souches dont l’Indice d’identification (ID) a été supérieur ou égale à 95% ont été retenues. Ce sont ces souches bactériennes qui ont fait l’objet des tests de résistance aux 8 antibiotiques précités. Mais en attendant la réalisation de cette susceptibilité aux antibiotiques, les souches identifiées ont été stockées dans du TS liquide à 10 % de glycérol au congélateur. I.3.2.3. Test de la sensibilité aux antibiotiques : méthode de diffusion en milieu gélosé de disques d’antibiotiques L’utilisation des disques d’antibiotiques ou antibiogramme standard consiste à évaluer in vitro de manière semi-quantitative la sensibilité aux agents antimicrobiens des bactéries à croissance rapide par une méthode de diffusion en milieu gélosé. Le milieu gélosé adéquat pour cette méthode est celui de Mueller Hinton (MH). La méthode utilisée est celle décrite par le Comité de l’Antibiogramme de la société Française de Microbiologie (CA-SFM). Les huit (8) antibiotiques utilisés ont été sélectionnés en utilisant les recommandations du CA-SFM (2015) mais aussi parce qu’ils sont très utilisés en médecine humaine et/ou animale et selon la disponibilité chez le fournisseur (tableau IV).

Tableau IV : Liste des antibiotiques utilisés pour la réalisation de l’antibiogramme Familles

Charge du

Antibiotiques

Codification

disque Bétalactamines

Ampicilline

10ug

AMP10

Tétracyclines

Tétracycline

30ug

TET30

Sulfamides

Sulfonamide

300ug

SSS300

Fluoroquinolones

Ciprofloxacine

5ug

CIP5

Nitrofuranes Aminoglycosides

Nitrofurantoine Gentamycine

300ug 30ug

FTN300 GME30

Kanamycine

30ug

KMN30

Streptomycine

500ug

STR500

Après préparation des boîtes de gélose MH de 90mm, une suspension bactérienne a été réalisée à partir de 2 à 3 colonies pures et identiques (18 à 24 heures sur milieu TS) de chaque isolat retenu dans 2ml d’eau distillée stérile pour atteindre une turbidité équivalente à l’étalon 0,5 de la gamme de McFarland. Puis, à l’aide d’un écouvillon stérile trempé dans cet inoculum, toute la surface de la gélose MH a été ensemencée en tapis. Le milieu MH ainsi ensemencé a été laissé à sécher pendant une dizaine de minutes à la température ambiante sous la hotte. Après séchage, 4 disques imprégnés d’antibiotiques différents ont été déposés dans chaque boîte de gélose MH (deux boîtes pour chaque isolat) (figure 12) à l’aide d’une pince stérile. Enfin, après dépôt des disques d’antibiotiques, les boîtes ont été retournées et placées dans l’incubateur pendant 16 à 24 heures à 37°C.

Figure 12 : Dépôt de disques imprégnés d’antibiotiques sur gélose MH La lecture a été faite en mesurant avec une règle millimétrée le diamètre du halo clair formé autour des disques (figure 13). L’interprétation a été faite qualitativement, pour chaque antibiotique et chaque souche bactérienne, en comparant le diamètre mesuré au diamètre critique publié par les recommandations 2015 du CASFM permettant ainsi de classer la souche étudiée comme Sensible (S), Intermédiaire (I) ou Résistante (R).

Figure 13 : Lecture des résultats de l’antibiogramme pour l’échantillon I19 (1)

I.3.3. Analyses statistiques des résultats Les résultats d’analyse bactériologique ont été saisis et enregistrés dans le tableur Microsoft Excel 2010 qui a également servi au calcul des fréquences, à la construction des graphiques et des tableaux. Elles ont ensuite été transférées dans le logiciel d’analyse PAST 3.11 pour la réalisation des tests statistiques servant à comparer les pourcentages de résistance dans les deux zones d’étude (PNMD et marchés de Libreville). Pour les tests statistiques, un niveau de confiance de 95% a été considéré, donc un degré de signification de 5%. Quand les fréquences attendues étaient supérieures à 5, le test de Khi carré a été réalisé. Mais quand les fréquences étaient inférieures à 5, le test exact de Fischer est réalisé. La différence est dite significative si la p value obtenue est inférieure à 0,05.

CHAPITRE II : RESULTATS II.1. Liste des différentes espèces de gibiers rencontrées II.1.1. Liste des différentes espèces de gibier rencontrées au PNMD Le PNMD offre une très grande diversité autant sur les plans floristiques que faunistique. Cependant, il n’est pas facile de croiser toutes ces espèces d’un coup lors d’une escapade en forêt ; cela dépend des différents endroits du parc mais aussi des saisons. Aussi, il n’était pas aisé de trouver des crottes fraiches de ces animaux sauvages. En effet, durant notre échantillonnage dans la forêt du PNMD, les prélèvements effectués étaient constitués de 29 échantillons au total dans les deux zones avec 16 échantillons (55,17%) à Mbani dont 6 de céphalophe (37,5%), 3 de buffle (18,75%), 3 de singe (18,75%); 2 d’éléphants (12,5%) et 2 de potamochère (12,5%). A Boutsiana, 13 échantillons (44,82%) ont été recueillis dont 8 d’éléphants (61,53%), 4 de céphalophe (30,76%) et 1 de potamochère (7,69%). Ainsi, au PNMD, les espèces les plus représentatives de notre échantillonnage sont les éléphants et les céphalophes au même pourcentage (34,48%) suivis des potamochères, des buffles, et des singes à 10,34% chacun (tableau V).

Tableau V : Espèces de gibier dont les crottes ont été collectées dans les zones Mbani et Boutsiana du PNMD Ordre

Famille

Nom

commun

scientifique

Nombre d’animaux Mbani

Cercopithecidae

Primates

Artiodactyles

Suidae

Fréquence

Boutsiana

(%) Total

Colobe

Colobus spp

Cercocebe

Cercocebus spp

10,34

Potamochère

Potamochoerus

10,34

34,48

porcus

Bovidae/ Bovinae

Buffle nain

Syncerus cafer nanus

de forêt

Bovidae/Cephalo-

Céphalophe

phinae Proboscidiens

Elephantidae

Cephalophus spp

Eléphant

Loxodonta africana

II.1.2. Liste des différentes espèces de gibier vendues dans les marchés de Libreville Au Gabon, la viande de brousse est une viande dont la vente est règlementée. En effet, quatre principaux marchés où il est possible d’en trouver ont été sillonnés, notamment les marchés d’Akébé, de Nzeng-ayong, d’Oloumi et de La peyrie. A cause de la réglementation de ce commerce, très peu de gibier sont exposés sur les étals des commerçantes. Par exemple, au marché d’Akébé, 2 à 3 étals de viande étaient disponibles; tandis qu’aux marchés d’Oloumi et de Nzeng-Ayong, il pouvait y avoir jusqu’à 6 étals avec une plus grande diversité d’animaux sauvages en entier (surtout pour les petits et moyens gibiers) ou en morceaux, frais ou fumés. Dans ces différents marchés, la vente a lieu en matinée ou en début de soirée (figures 14a et 14b).

Durant notre échantillonnage, les espèces de gibier les plus souvent rencontrées dans les différents marchés visités étaient des céphalophes (tout genre), des crocodiles, des porcs épics, des cricétomes, des pangolins, des sangliers, des chevrotains, des singes et des genettes (tableau VI). Ainsi 12 échantillons de 5 espèces de gibier ont été collectés dans l’ensemble des quatre lieux d’échantillonnage, dont 4 de porcs épics (33,33%), 4 de céphalophes (33,33%), 2 de crocodile (16,66%), 1 de pangolin et 1 de cricétome (8,33%) (figure 15). Cet échantillonnage montre que le porc-épic est l’espèce de gibier retrouvée dans les quatre marchés cités au moment de la collecte et donc, celle la plus représentée sur les étals de viande de brousse.

a : singe, gazelles, cricétomes, genette.

b : gazelle, singe, genettes, pangolin.

Figure 14 : Différentes viandes de brousses en vente dans les marchés de Libreville

Tableau VI : Espèces de viandes de brousse vendues dans quatre marchés de Libreville Ordre Primates

Artiodactyles

Famille Cercopithecidae

Nom commun

Nom scientifique

Hocheur

Cercopithecus nictitans

Moustac

Cercopithecus cephus

Suidae

Sanglier

Tragulidae

Chevrotain

Sus scrofa

Hyemoschus aquaticus

aquatique

Bovidae/Cephalophinae Céphalophe

Cephalophus spp

Fissipèdes

Viverridae

Genette servaline

Genetta servalina

Pholidotes

Manidae

Pangolin à longue

Manis longicaudata

queue Rongeurs

Cricetidae

Rat géant

Cricetomys emini

Hystricidae

Athérure africain

Atherurus africanus

(porc-épic) Crocodiliens

Crocodylidae

Crocodile nain

Ostealamus tetrapsis

8.33% 8.33% 33.33%

porc epic Cephalophes

16.16%

Crocodile Pangolin Cricetome

33.33%

Figure 15 : Fréquence des espèces de gibier collectées dans les marchés de Libreville II.2. Etude bactériologique des échantillons II.2.1. Nature et fréquence des entérobactéries identifiées II.2.1.1. Résultats globaux Sur un total de 41 échantillons de crottes de gibier collectés dans l’ensemble des sites ciblés, 40 (97,56%) ont donné des colonies sur EMB. Plus précisément, 28/29 au PNMD et 12/12 pour les marchés. Les 40 échantillons qui ont poussé sur EMB ont donné 123 colonies, dont 104 colonies à Gram négatif (84,55%), 16 colonies à Gram positif (13%) et 3 colonies dont le Gram n’a pas été clairement établi (2,43%). Parmi les 104 colonies à Gram négatif, 33 entérobactéries identifiées par Api20E avec un pourcentage d’identification (ID) supérieur ou égal à 95 % ont été considérées. Comme l’indique le tableau VII, ces 33 entérobactéries étaient constituées de 45,45% d’Escherichia coli, 21,21% de Serratia odorifera 1, 12,12% d’Enterobacter cloacae, 12,12% de Raoultella ornithinolytica et enfin pour Enterobacter amnigenus 2, Klebsiella oxytoca et Proteus vulgaris, 3,03% chacun.

Tableau VII : Fréquences des espèces d’entérobactéries identifiées dans les deux zones d’étude Espèce d’entérobactéries

Effectif

Fréquence (%)

Escherichia coli

45,45

Serratia odorifera 1

21,21

Raoultella ornithinolytica

12,12

Enterobacter cloacae

12,12

Enterobacter amnigenus

3,03

Klebsiella oxytoca 2

3,03

Proteus vulgaris

3,03

Total

100

II.2.1.2. Résultats obtenus par zone d’étude  Résultats obtenus pour le PNMD Les 28/29 échantillons qui ont poussé sur EMB ont donné 89 colonies dont 70 à Gram négatif (78,65%), 16 à Gram positif (17,97%) et 3 inconnues (3,37%). Parmi les 70 bactéries à Gram négatif, 16 e n t é r o b a c t é r i e s ont été identifiées avec un pourcentage d’identification supérieur ou égal à 95 %. Ces 16 entérobactéries étaient constituées de 6 Escherichia coli, 5 Serratia odorifera 1, 3 Raoultella ornithinolytica, 1 Enterobacter cloacae et 1 Klebsiella oxytoca (tableau VIII).

Tableau VIII : Fréquences des espèces d’entérobactéries identifiées au PNMD Espèce d’entérobactéries

Effectif

Fréquence (%)

Escherichia coli

37,5

Serratia odorifera 1

31,25

Raoultella ornithinolytica

18,75

Enterobacter cloacae

6,25

Klebsiella oxytoca

6,25

Total

100

 Résultats obtenus pour les marchés de Libreville Les 12 échantillons collectés aux marchés ont donné 34 colonies étant toutes à Gram négatif. Parmi les 34, 17 entérobactéries ont été identifiées avec un pourcentage d’identification supérieur ou égal à 95%. Parmi

les

différentes

espèces

d’entérobactéries

identifiées

dans

les

échantillons des marchés, nous avons obtenu 52,94% d’Escherichia coli, 17,64% d’Enterobacter cloacae, 11,76% de Serratia odorifera 1 et de Raoultella ornithinolytica chacun, et 5,88% de Enterobacter amnigenus 2 et de Proteus vulgaris chacun (tableau IX). Tableau IX : Fréquences des espèces d’entérobactéries identifiées dans les marchés Espèce d’entérobactéries

Effectif

Fréquence (%)

Escherichia coli

52,94

Enterobacter cloacae

17,64

Serratia odorifera 1

11,76

Raoultella ornithinolytica

5,88

Enterobacter amnigenus 2

5,88

Proteus vulgaris

5,88

Total

100

II.2.2. Fréquence de la résistance aux antibiotiques des entérobactéries identifiées II.2.2.1. Résultats globaux De manière globale, le taux de résistance aux antibiotiques est faible dans les deux sites échantillonnés (11,36%) ; c'est-à-dire en zone protégée (PNMD) et en zone non protégée où se pratique la chasse (terroirs villageois) (figure 16).

11,36%

14,39%

Sensibles Intermédiaires Résistants 74,24%

Figure 16 : Résultat global des tests de résistance des entérobactéries aux antibiotiques. Au total, 33 isolats d’entérobactéries ont fait l’objet d’un test de sensibilité à huit (8) antibiotiques différents. Pour 4 des 8 antibiotiques notamment pour la gentamycine, la ciprofloxacine, la tétracycline et la streptomycine, aucune résistance n’a été détectée. Toutes les entérobactéries se sont révélées strictement sensibles à la gentamycine, la ciprofloxacine et la streptomycine par contre pour la tétracycline elles étaient sensibles ou intermédiaires. Pour les 4 autres antibiotiques (ampicilline, kanamycine, nitrofurantoine et sulfonamide), des niveaux de résistance non négligeables à faibles ont été enregistrés. Pour l’ensemble des isolats testés à ces derniers, le taux de résistance le plus élevé a été obtenu avec le sulfonamide (48,48%), suivi de la nitrofurantoine (27,27%), de l’ampicilline (9,09%) et de la kanamycine (6,06%) (figure 17). 65

Pourcentages d'entérobactéries résistantes

60 50 40 30 20 10 0

Antibiotiques

Figure 17 : Pourcentages de souches d’entérobactéries résistantes isolées de prélèvements fécaux de gibiers du PNMD et des marchés de Libreville De façon globale, parmi les 33 entérobactéries testées, 21 ont été résistantes à au moins un antibiotique. Le taux de monorésistance est assez élevé avec 13 entérobactéries résistantes (61,9%), alors que 8 des 21 isolats résistants aux antibiotiques sont multirésistants (38%), c’est-à-dire résistants à au moins 2 antibiotiques. La majorité (87,5%) des souches multirésistantes le sont à 2 antibiotiques tandis que seulement 12,5% des souches le sont à 3 antibiotiques comme le montre la figure 18.

12,5%

Résistants à 2 Résistants à 3

87,5%

Figure 18 : Pourcentage des souches d’entérobactéries multirésistantes isolées d’échantillons fécaux de gibiers prélevés dans les deux zones d’étude. II.2.2.2. Résultats obtenus par zone d’étude  Résultats obtenus pour le PNMD En ce qui concerne le PNMD, parmi les 16 isolats testés, aucune résistance n’a été détectée pour la gentamycine, la ciprofloxacine, la tétracycline et la streptomycine. Quant aux autres antibiotiques, les plus forts pourcentages ont été enregistrés avec le sulfonamide (50%) et la nitrofurantoine (31,25%) ; viennent ensuite la kanamycine et l’ampicilline avec 12,5% chacun (figure 19).

Pourcentages d'entérobactéries résistantes

60 50 40 30 20 10 0

Antibiotiques

Figure 19 : Pourcentages des souches d’entérobactéries résistantes isolées de prélèvements fécaux de gibiers du PNMD. Concernant la monorésistance, dans le PNMD, sur les 11 isolats résistants, un peu plus de la moitié étaient monorésistants (54,54%) alors que la multirésistance a été enregistrée sur 5 isolats (45,45%) dont 4 isolats résistants à 2 antibiotiques (80%) et 1 seul isolat résistant à 3 antibiotiques (20%) (figure 20).

20%

Résistants à 2 Résistants à 3

80%

Figure 20 : Pourcentages de souches d’entérobactéries multirésistantes isolées de prélèvements fécaux de gibiers du PNMD

 Résultats obtenus pour les marchés de Libreville Pour les 17 isolats d’entérobactéries testés issus d’échantillons fécaux de gibiers achetés dans les marchés de Libreville, aucune résistance n’a été détectée pour la gentamycine, la ciprofloxacine, la tétracycline, la streptomycine mais aussi pour la kanamycine. La fréquence de la résistance est non négligeable avec 47,05% pour le sulfonamide, suivi de la nitrofurantoine (23,52%) et de l’ampicilline (5,88%) comme

Pourcentages d'entérobactéries résistantes

l’indique la figure 21 ci-dessous. 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

Antibiotiques

Figure 21 : Pourcentages des souches d’entérobactéries résistantes isolées d’échantillons fécaux de gibiers vendus dans les marchés Sur les 10 isolats résistants détectés, la prévalence de la monorésistance dans cette zone est de 70%. La multirésistance est de 30% avec la totalité des isolats résistants à seulement deux antibiotiques. En comparant les deux zones d’étude, on se rend compte d’une répartition similaire des pourcentages de résistance (figure 22). En effet, pour la gentamycine, la ciprofloxacine, la tétracycline et la streptomycine, aucune résistance n’a été détectée dans les deux zones d’études. Par contre, dans l’ensemble des deux sites échantillonnés, les entérobactéries présentent des résistances à l’ampicilline, à la nitrofurantoine et au sulfonamide. 69

Pourcentages d'entérobactéries résistantes

60 50 40 30 20 10 0

Antibiotiques PNMD

Marchés

Figure 22 : Comparaison des pourcentages de souches d’entérobactéries résistantes entre les deux zones d’étude Toutefois des différences se dégagent entre les deux zones. En effet, les résistances observées sont toujours plus élevées dans la zone du PNMD que dans celle des marchés de Libreville (sulfonamide : PNMD 50%, marchés 47,05% ; nitrofurantoine : PNMD 31,25%, marchés 23,52% ; ampicilline : PNMD 12,5%, marchés 5,88% ; kanamycine : PNMD 6,06%, marchés 0%). Mais cette différence estelle significative ? L’analyse statistique a montré qu’il n’existe aucune différence significative entre les pourcentages de la résistance observés dans la zone du PNMD et celle des marchés de Libreville pour les quatre antibiotiques (sulfonamide, nitrofurantoine, ampicilline et kanamycine) au niveau de confiance de 95% (tableau X).

Tableau X : Analyse statistique des différents pourcentages de résistance constatés dans les deux zones d’étude Ampicilline

Kanamycine

Nitrofur antoine

Sulfonamide

Sensibilité

PNMD

Marchés de

Libreville p value

0,60117

0,22727

0,6187

0,86583

Pour les 4 antibiotiques pour lesquels les résultats ont été comparés entre les deux zones, la différence observée entre les isolats du PNMD et ceux des marchés de Libreville est non significative.

CHAPITRE III : DISCUSSION, RECOMMANDATIONS ET PERSPECTIVES III.1. Discussion III.1.1. Discussion de la méthodologie Notre sujet portant sur l’évaluation de la résistance des entérobactéries aux antibiotiques chez le gibier du PNMD et des marchés de Libreville au Gabon, les sites de collecte de nos échantillons ont été ces zones qui sont respectivement des zones protégées (PNMD) et non protégées (marchés) du pays. Nous avons choisi le PNMD car des études portant sur la culture et l’isolement des bactéries intestinales dans les mêmes conditions ainsi qu’une enquête préliminaire sur les bactéries porteuses de résistance aux antibiotiques chez les grands singes sont en train d’y être effectuées, avec une méthodologie et une logistique bien établie (MBEHANG et al., 2015). D’autre part, nous nous sommes intéressés aux marchés de Libreville parce qu’ il s’agit des lieux de vente de viande de brousse chassée normalement dans des espaces forestiers réservés aux villageois (terroir villageois), qui sont des zones non protégées avec accès libre aux populations humaines. Ainsi, le gibier collecté dans ces marchés provenait de cinq zones différentes du pays en l’occurrence de Lambaréné (Sud-est du Gabon), de Ndjolé (Est du Gabon), de Bitam (Nord du Gabon), de Lastourville (Ouest du Gabon) et de Mitzic (Nord du Gabon). Notre étude s’intéressant aux entérobactéries qui sont des bactéries d’origine intestinale, le matériel biologique échantillonné était constitué par des fèces fraiches de ces gibiers. Les fèces jouent également un rôle de dissémination de bactéries entrainant une contamination environnementale qui affecte la santé publique. Au total, 41 crottes fraiches de gibier ont été récoltées dont 29 au PNMD et 12 dans les différents marchés de Libreville sillonnés. Ce nombre d’échantillons est relativement faible par rapport à ceux réalisés chez les babouins par ROLLAND et al (1985), et chez les gorilles par MBEHANG et al. (2015); qui sont respectivement de 92 et 177. Dans la forêt du PNMD, le nombre limité de fèces de gibier récolté (29) est dû au fait qu’il a été difficile d’obtenir des crottes fraiches de gibier dans une forêt (secondaire ou tertiaire) souvent très fermée. En outre, la collecte a eu lieu en saison 72

sèche, période durant laquelle les fruits sont rares avec pour conséquence une baisse de la fréquence de défécation chez certains animaux sauvages, et donc la rareté de fèces fraiches. La difficulté rencontrée lors de la collecte d’intestins de gibier dans les marchés de Libreville était principalement le manque de moyens financiers pour l’achat de viande de brousse qui était surtout vendue entière. Et, lorsqu’elle était vendue en morceaux, les intestins avaient déjà été jetés à la poubelle. La culture des échantillons provenant du PNMD a été réalisée à la station de recherche du Centre de primatologie de Doussala disposant d’un Laboratoire de Bactériologie alimenté en électricité par deux groupes électrogènes. Cependant, ne disposant pas encore d’un incubateur et d’un réfrigérateur durant notre passage, nous avons utilisé une technique originale d’incubation qui a été développée les années précédentes. A cet effet, il faut choisir des boîtes de Pétri de petite taille (60mm) pour mieux maintenir l’anaérobiose. L’incubation se réalise dans une boite isotherme en polystyrène. Pour chauffer une boîte de 4500 cm3 à 37°C pendant la journée, nous avons utilisé 2 à 3 chauffe-mains (Hand-warmers) ; alors que la nuit, ce nombre allait jusqu’à 6 parce que la température extérieure baisse considérablement à cette période. L ’ i n c u b a t i o n d u r e 2 4 h e u r es e t la température de la boîte e s t périodiquement surveillée (toutes les 3 à 4 heures) à l’aide d’un thermomètre. Quant aux échantillons recueillis dans les différents marchés de Libreville, ils ont été cultivés au Laboratoire de bactériologie de l’IRET. Le milieu de culture utilisé pour la culture des entérobactéries était le milieu EMB qui est un milieu sélectif pour l’isolement et l’identification des Enterobacteriaceae. L’isolement et l’identification de tous les échantillons ont été faits à l’aide d’un matériel classique souvent utilisé en bactériologie au Laboratoire de bactériologie de l’IRET. L’identification s’est faite à l’aide de galeries API20E à la suite de la réalisation de plusieurs tests à savoir la recherche de la mobilité, la coloration de Gram, les tests d’oxydase pour assurer l’identification. La technique d’antibiogramme utilisée était celle de la diffusion en milieu gélosé de disques d’antibiotiques selon les règles générales édictées par le Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie (CA-SFM). Cependant, 73

cette méthode utilisant le milieu MH est considérée comme moins précise (réponse qualitative) par rapport à la méthode de dilution qui permet de déterminer les Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI). III.1.2. Discussion des résultats III.1.2.1. Discussion des résultats des espèces de gibier Le PNMD, comme la plupart des parcs du Gabon est riche en animaux sauvages avec chacun ses spécificités. Selon l’UNESCO, le relief qui est le même depuis des millénaires, très accidenté, s’érige en bouclier contre les prédateurs et le taux de fréquentation des mammifères, entre autres, est constamment élevé. Outre les espèces phares du Gabon, telles que l’éléphant de forêt (Loxodonta africana) et le buffle de forêt (Syncerus caffer nanus), il est également possible d’observer des espèces plus spécifiques comme le Cobe de fassa (Kobus ellipsiprymnus), l’hippopotame (Hippopotamus amphibius), le crocodile du Nil (Crocodylus niloticus), le faux gavial (Crocodylus cataphractus) et plus de trois cent (300) espèces ornithologiques. Aussi, le PNMD possède la plus forte concentration en grands singes du Gabon avec le gorille des plaines de l’Ouest (Gorilla gorilla gorilla), et le chimpanzé commun (Pan troglodytes), ainsi que de nombreuses espèces de petits singes et de galagos. Cependant, il n’a pas été aisé de collecter des crottes fraiches de ces différentes espèces de gibier. Les

échantillons

fèces

gibier

échantillonnés

provenaient

principalement d’éléphants (10) et de céphalophes (10), suivis des potamochères (3), des buffles (3) et des singes (3). Le nombre élevé d’échantillons d’éléphants et de céphalophes s’explique par le fait qu’ils font partie des espèces de mammifères les plus abondantes dans le PNMD en dehors des grands singes (RAPPORT PROCOBHA, 2010 non publié). Les animaux retrouvés sur les différents étals dans les marchés d’Akébé, de Nzeng- ayong, d’Oloumi, et de La peyrie étaient des céphalophes, des crocodiles, des porcs épics, des cricétomes, des pangolins, des sangliers, des chevrotains, des singes et des genettes. Au total, une douzaine d’échantillons a été collectée dans les quatre 74

marchés cités (5 espèces différentes de gibier) dont 4 de porcs épics, 4 de céphalophes, 2 échantillons de crocodile, 1 échantillon de pangolin et 1 échantillon de cricétome. Ce faible échantillonnage est dû à la contrainte financière comme précédemment mentionnée. Cependant, il est important de signaler que les espèces rencontrées variaient en fonction des marchés et de leur provenance. Nous avons donc acheté les échantillons de manière à obtenir les mêmes espèces dans chaque marché pour une meilleure comparaison. En général, les porcs épics et les céphalophes sont les gibiers les plus facilement rencontrés. Ce sont d’ailleurs les espèces que nous avons le plus collectées, car elles étaient toujours fortement représentées sur les étals de viande de brousse des différents marchés où nous avons échantillonné. En effet, selon BINOT ET CORNELIS (2004), les résultats provisoires du projet DABAC montrent que les espèces préférées des consommateurs librevillois sont l’athérure ou porc-épic (42%), le potamochère (22%) et les antilopes ou céphalophes rouges (18%). Les primates ne représentent que 5% du premier choix des consommateurs en termes de préférence. Une autre étude menée par THE DARWIN INITIATIVE en 2005 sur les espèces préférées par 104 consommateurs habituels de viande de brousse au Gabon, montre que parmi les espèces disponibles, le porc-épic est de loin l'espèce la plus prisée (56%), en raison de son goût et la qualité de sa peau. Le céphalophe bleu (gazelle) (16%), le pangolin (10%), le sanglier (8%) et le céphalophe rouge (antilope) sont d’autres espèces aussi appréciées. Notre échantillonnage dans les marchés, bien que statistiquement très faible à l’échelle de la capitale à cause de l’importance de la consommation de la viande de brousse, donne les mêmes tendances en termes d’espèces de viande de brousse les plus consommées au Gabon. Ainsi, les porcs épics et les céphalophes sont non seulement les espèces de gibier les plus rencontrées dans les marchés de Libreville, mais aussi les plus prisées par les gabonais. A la différence des céphalophes qui comptent parmi eux plusieurs espèces, le porc-épic est plus facile à identifier. Par conséquent, il pourrait constituer le modèle de gibier pour des études de partage de pathogènes entre la viande 75

de brousse et l’homme. III.1.2.2. Discussion des résultats de l’étude bactériologique des échantillons III.1.2.2.1. Nature et fréquence des entérobactéries identifiées Sur les 41 échantillons fécaux de gibier recueillis, 123 colonies ont été isolées et seulement 33 entérobactéries ont été identifiées par API20E. Le résultat d’identification est faible comparé à celui de MBEHANG et al (2015) dans lequel sur 107 échantillons fécaux de gorilles collectés, 139 colonies ont été isolées et 137 entérobactéries ont été identifiées. En effet, dans cette étude, en plus de l’utilisation des galeries API20E pour identifier les souches qui ont été purifiées avec succès, pour d’autres souches, le gène de l'ARNr 16S de chaque colonie isolée a été amplifié par PCR avec des amorces universelles (TSUKAHARA ET USHIDA, 2002) et les produits PCR ont été séquencés pour les études phylogénétiques. Ainsi, les 33 entérobactéries obtenues sur 123 colonies isolées s’explique par le fait que les systèmes API (Laboratoires BioMérieux), bien qu’ils soient fiables, possèdent néanmoins des limites car leurs banques de données API ont été initialement constituées à partir des souches d’origine humaine, qui présentent des caractéristiques biochimiques quelque peu différentes de celles d’origine animale (CONTRERAS et al., 2002) et surtout des animaux sauvages. Si nous nous référons aux résultats par zone d’étude, nous constatons que pour le PNMD, les 28 échantillons qui ont poussé sur EMB ont donné 89 colonies dont 70 bactéries à Gram négatif pour lesquelles seulement 16 entérobactéries ont été identifiées. Tandis que pour les 12 échantillons collectés dans les marchés, nous avons eu 34 colonies étant toutes des bactéries à Gram négatif et parmi elles, 17 entérobactéries ont été identifiées. Les résultats obtenus dans le PNMD sont plus faibles que ceux des marchés, bien que le nombre d’échantillons dans le PNMD soit plus élevé. Cela est certainement dû aux conditions de culture dans le PNMD qui, bien que donnant des résultats exploitables, ne sont pas les mêmes que celles d’un laboratoire.

Parmi les 33 entérobactéries identifiées, Escherichia coli (15) était en tête, suivi de Serratia odorifera 1 (7) ; Enterobacter cloacae (4), Raoultella ornithinolytica (4), Enterobacter amnigenus 2 (1), Klebsiella oxytoca (1) et Proteus vulgaris (1). Dans l’étude de MBEHANG et al. (2015) sur les gorilles du PNMD, les résultats de l’étude bactériologique obtenus sont assez similaires aux nôtres. En effet, la bactérie la plus répandue chez les gorilles était Enterobacter cloacae (24,8%), suivie par Escherichia coli (20,4%), Serratia odorifera (19,0%), Erwinia sp (7,3%), Providencia rettgeri (6,6%), et Salmonella sp (4,4%). La prédominance de Escherichia coli dans nos échantillons fécaux est normale parce qu’il s’agit d’une bactérie naturellement présente (commensale) dans la flore intestinale de l’homme et des animaux ; elle représente 80% de la flore aérobie du tube digestif (DECOSTER et al., 2008a). III.1.2.2.2. Résultats de l’antibiogramme Globalement, le taux de résistance des isolats de gibier aux huit antibiotiques dans les deux sites échantillonnés est faible (11,36%). Aucune résistance n’a été détectée à 4 des 8 antibiotiques testés notamment à la gentamycine, la ciprofloxacine, la tétracycline et la streptomycine. Par contre, les isolats se sont révélés résistants aux quatre autres antibiotiques avec un taux de résistance plus élevé pour le sulfonamide (48,48%), suivi de la nitrofurantoine (27,27%), de l’ampicilline (9,09%) et de la kanamycine (6,06%). Nos résultats présentent quelques similitudes avec ceux rapportés par quelques auteurs. En effet, au Kenya, ROLLAND et al. (1985) ont rapporté de faibles quantités de bactéries entériques à Gram négatif résistantes aux antibiotiques dans les deux groupes de babouins (groupe Alto et groupe Hook) vivant dans leur habitat naturel et ayant peu ou pas de contact avec les humains. Par contre, la résistance était significativement plus élevée chez les bactéries entériques du troisième groupe de babouins (groupe Lodge) vivant à proximité d'un gite touriste et ayant des contacts quotidiens avec les déchets humains non transformés. Des résistances ont été observées à la tétracycline, la kanamycine et à la streptomycine, mais aucune résistance à la gentamycine n’a été détectée.

L’étude de SAYAH et al. (2005) sur des souches d’Escherichia coli isolées

partir d’échantillons

boues

humaines,

faune,

d’animaux

domestiques, des environnements d’exploitation et de l’eau de surface ont rapporté un taux de résistance en général plus élevé chez les souches d’Escherichia coli isolées à partir d'espèces domestiques par rapport aux isolats de boues humaine, de la faune, et de l'eau de surface, avec des taux de prévalence plus fréquentes à la tétracycline (27,3%), la céphalothine (22,7%), le sulfisoxazole (13,3%), et la streptomycine (13,1%). Quant à BENAVIDES et al. (2012), dans leur étude portant sur des souches d’Escherichia coli isolées de fèces de gorilles et d’autres animaux sauvages ainsi que d’humains du Parc national de la Lopé au Gabon, ils ont montré une prévalence plus élevée de la résistance aux antibiotiques des isolats bactériens provenant des humains (48%), et des niveaux faibles chez les gorilles (6,7%) et chez les autres animaux sauvages (10,4%). En effet, dans l'ensemble, 7,6% de tous les isolats étaient résistants à l'ampicilline, 6,4% au sulfaméthoxazole, 5,9% à la streptomycine, et 5,5% à la tétracycline. Aucune résistance n'a été observée pour la néomycine, la ciprofloxacine et le ceftiofur. Ainsi, les taux de résistance aux antibiotiques sont faibles chez les animaux sauvages car ces derniers vivent en forêt, le plus souvent loin des populations humaines et n’ont jamais subi de traitement antibiotique. Cela pourrait expliquer l’absence de résistance aux antibiotiques. Néanmoins, bien que les aminosides soient actifs contre les entérobactéries, l’absence de résistance observée pour la gentamycine et la streptomycine est due aux charges de disques utilisées pour la réalisation de l’antibiogramme. En effet, pour ces deux antibiotiques les charges utilisées étaient largement supérieur à celles prescrites par le CA-SFM qui recommande des charges respectives de 15ug et 10ug, alors que ceux que nous avions étaient de 30ug et 500ug; ce qui pourrait expliquer la sensibilité systématique des isolats à ces antibiotiques. De même, les fluoroquinolones dont la ciprofloxacine sont normalement et largement actifs contre 8 0 % d e s s o u c h e s d’entérobactéries, ce qui pourrait expliquer l’absence de résistance à cet antibiotique. La tétracycline étant un antibiotique à large spectre, la sensibilité de nos isolats peut s’expliquer ainsi. 78

Comme mentionné précédemment, les animaux sauvages ne subissent aucun traitement médical. Par conséquent, les résistances à des antibiotiques seraient soit des résistances

intrinsèques

des

bactéries,

encore

proviendraient

leur

environnement. La fréquence plus élevée des résistances au sulfonamide (48,48%) et à la nitrofurantoine (27,27%) qui sont des antibiotiques surtout utilisés dans le traitement des affections des voies digestives et du tractus urinaire (VAN BAMBEKE ET TULKENS, 2008), montre bien des possibles contaminations humaines à travers les selles et déjections d’urine à ciel ouvert par les hommes dans la forêt. Les isolats présentent également de faibles résistances à l’ampicilline (9,09%) et à la kanamycine (6,06%) ; elles montreraient également une acquisition horizontale de résistance ou encore une possible transmission des résistances via l’environnement par une pression sélective d’antibiotiques prescrits pour l’homme dans la zone d’étude. En effet, des études antérieures ont suggéré que le contact et la transmission ultérieure de souches bactériennes résistantes aux antibiotiques provenant de sources à haute résistance (humains ou bétail), pourrait expliquer la présence de la résistance aux antibiotiques chez les animaux sauvages (ROLLAND et al., 1985; SKURNIK et al., 2006; DOLEJSKA et al., 2007; LITERAK et al., 2010). Toutefois, Benavides et al. ont conclu qu’il n’y avait pas ou qu’il y avait une très faible transmission directe d’Escherichia coli résistants de l’homme aux gorilles sauvages dans le parc national de la Lopé. Cependant, la charge anthropologique des animaux du PNMD n’est pas la même que celle des animaux du parc national de la Lopé. En effet, la densité de la population humaine autour la Lopé était 4 fois plus faible que celle autour du PNMD (BLOM et al., 2003 ; THIBAULT ET BLANEY, 2003) ; ce dernier avait des activités d’exploitation forestière et agricole intensives. Ainsi, la transmission des bactéries humaines résistantes dans le PNMD est envisageable. En ce qui concerne la multirésistance, dans l’ensemble une faible prévalence a été enregistrée (38%), avec 87,5% des souches résistantes à au moins deux antibiotiques et seulement 12,5% à trois antibiotiques. Nos résultats corroborent ceux obtenus par BENAVIDES et al. (2012) qui ont rapporté une prévalence de la multirésistance de 40% sur les isolats d’Escherichia coli provenant d’animaux sauvages. 79

A l’issue de la comparaison des fréquences de la résistance dans les deux zones d’études (PNMD et marchés de Libreville) via les analyses statistiques, les différences observées, en l’occurrence des taux de résistances plus élevés vis-à-vis du sulfonamide, de la nitrofurantoine, de l’ampicilline et de la kanamycine se sont révélés non significatives. En effet, la viande de brousse retrouvée dans les marchés de Libreville est chassée dans les terroirs villageois des forêts avoisinantes qui sont des endroits non protégés, réservées aux activités des villageois. Par contre, dans les parcs nationaux et en particulier au PNMD, la chasse est strictement interdite, sauf cas de braconnage. Ainsi, notre étude a consisté à comparer le taux de résistance des bactéries aux antibiotiques du gibier des zones protégées et non protégées du pays. Objectivement, les résultats attendus se pencheraient vers un taux élevé de la résistance dans les zones les plus fréquentées par les hommes, en l’occurrence les terroirs villageois où la chasse se fait en toute légalité. Cependant, dans notre étude, les résultats montrent le contraire. Cette différence pourrait s’expliquer par l’histoire du PNMD. En effet le secteur du PNMD et sa périphérie a été l’emplacement d’un chantier de la compagnie forestière CEB (Compagnie Equatoriale des Bois) des années 1960 aux années 1980, avec plus de 1000 travailleurs qui y vivaient (MATSUURA et al., 2014). Par conséquent, la transmission de bactéries résistantes d’origine humaine dans le PNMD est possible comme suggéré par COHEN (1992), qui a conclu que l'émergence et la propagation des entérobactéries multirésistantes est en principe considérée comme d’origine humaine. En considérant les possibles échanges de gènes de résistance aux antibiotiques entre l’homme et les mammifères, ou encore entre bactéries, il pourrait donc s’agir de vieilles contaminations. En somme, la fréquence élevée de la résistance au sulfonamide et à la nitrofurantoine par rapport aux autres antibiotiques testés, ainsi que les résistances globales observées dans les deux sites pourraient bien avoir pour cause la présence humaine dans ces environnements.

III.2. Recommandations et perspectives De nos jours, la propagation des bactéries résistantes aux antibiotiques est un problème majeur et d’actualité en santé publique. Il s’agit d’un phénomène présent aussi bien en santé humaine qu’en santé animale avec des transmissions possibles. Les

animaux

sauvages

également,

bien

que

n’ayant

jamais

consommés

d’antibiotiques, ne sont pas exempts de ce phénomène. En effet, l’intensification des activités anthropiques (chasse, écotourisme, activités de recherche) dans les habitats des animaux sauvages entraine non seulement la propagation des maladies zoonotiques dans les populations humaines mais aussi l’apparition de maladies chez les animaux sauvages et donc la transmission d’agents pathogènes en tout genre. Dans notre étude en particulier, malgré le faible niveau observé, il existe bel et bien des bactéries résistantes chez le gibier consommé par les populations, provenant à la fois de zones protégées ou des zones non protégées du pays. Face à cela, nous formulons les recommandations suivantes à l’endroit :  des pouvoirs publics : en vue de protéger l’homme mais aussi de conserver la biodiversité et l’écotourisme dans notre pays, ils doivent sensibiliser les chasseurs, les chercheurs, les pisteurs, les villageois et les touristes sur l’application rigoureuse des mesures d’hygiène et de sécurité sanitaire en forêt, notamment : o le port de bottes et de vêtements spécialement destinés pour la forêt ; o creuser un trou de 30 cm de profondeur au minimum pour uriner ou déféquer ; o ne pas laisser des restes de nourritures en forêt ; o éviter le contact physique direct avec les animaux sauvages.  des professionnels de la santé humaine et de la santé animale : renforcer la collaboration pour établir des programmes de surveillance de la résistance aux antibiotiques des bactéries d’origine humaine, animale et alimentaire.

 des chercheurs : o orienter plus leurs recherches sur les résistances bactériennes aux antibiotiques par exemple dans les autres parcs et autres marchés du pays afin de mesurer l’ampleur de ce phénomène et de proposer des solutions efficaces aux acteurs publics ; o évaluer également à la prévalence de la résistance des entérobactéries aux antibiotiques chez les populations humaines de la région, qui sont en contact direct ou non avec la faune sauvage. o se servir du porc-épic comme modèle d’étude de la résistance aux antibiotiques car il s’agit de la viande la plus prisée par les populations ; o ne pas se limiter à l’étude qualitative des résistances mais aller plus loin par la mesure de CMI et la caractérisation des gènes de résistance ;

CONCLUSION GENERALE La consommation de viande de brousse en Afrique centrale et au Gabon en particulier, est très importante encore de nos jours. En effet, au-delà des aspects alimentaires et économiques de cette viande, elle constitue une ressource culturelle d’importance capitale. Au Gabon, le gibier est vendu toute l’année dans les marchés de Libreville, bien que la chasse soit circonscrite chaque année dans une période allant de mars à septembre. Cependant, cette consommation de gibier, non contrôlée, présenterait des risques sanitaires liés au partage de pathogènes entre l’homme et la faune sauvage. Par ailleurs, la viande de brousse pourrait être porteuse de bactéries résistantes aux antibiotiques, qui constituent un problème majeur actuel en santé publique dans le monde. En effet, les activités anthropiques des hommes dans la forêt seraient le facteur le plus marqué de dissémination de ces résistances dans la faune sauvage. Les animaux sauvages constitueraient ainsi un réservoir de la résistance aux antibiotiques. Les entérobactéries, hôtes communs du tube digestif des hommes et des animaux, sont la classe la plus fréquente des BGN et elles ont acquis des capacités à produire des mécanismes de résistance divers. En effet, elles sont dotées d’une grande plasticité qui leur confère la capacité de transférer plus facilement des gènes de résistance. Elles font partie de ces bactéries dont la résistance aux antibiotiques pose un sérieux problème de traitements adaptés dans le monde entier en général et au Gabon en particulier dans les hôpitaux lors d’infections nosocomiales. Plusieurs études ont abordé les aspects de l’antibiorésistance des entérobactéries chez les animaux domestiques et d’élevage dans le monde. Mais, très peu d’entre elles se sont intéressées à la faune sauvage, surtout dans les forêts du bassin du Congo, riches en biodiversité faunique où plusieurs projets en vue de la conservation de ces espaces sont en train d’y être effectués. Notre étude qui s’inscrit dans l’optique de contribuer à cette conservation, vise à l’évaluation de la résistance des entérobactéries aux antibiotiques chez le gibier présent dans le PNMD et celui vendu dans les marchés de Libreville. L’intérêt de ce travail étant de comparer les taux de résistance des entérobactéries aux antibiotiques chez le gibier vivant en zone protégée (Parc national) 83

et celui vivant en zone non protégée (terroirs villageois). A cet effet, nos sites d’études ont été les zones Mbani et Boutsiana du PNMD d’une part et d’autre part, les marchés d’Akébé, de Nzeng-ayong, d’Oloumi et de La peyrie à Libreville au Gabon. Pour cela, 41 échantillons de fèces fraiches de gibier ont été prélevés dans les zones Mbani et Boutsiana du PNMD et dans les marchés de Libreville. Dans le PNMD, 29 échantillons ont été collectés au total dont 10 p r o v e n a n t d’éléphants, 10 de céphalophes, 3 de buffles, 3 de potamochères et 3 de singes. Dans les marchés de Libreville, les 12 échantillons recueillis étaient quant à eux constitués de 4 échantillons de porcs épics, 4 de céphalophes, 2 de crocodiles, 1 de pangolin et 1 de cricétome. La culture des 29 échantillons du PNMD a donné 89 colonies dont 70 à Gram négatif (78,65%) avec un pourcentage d’identification supérieur ou égal à 95%. Parmi les 70 colonies à Gram négatif, 16 ont été identifiées comme étant des entérobactéries. Ces 16 entérobactéries étaient constituées de 37,5% d’Escherichia coli, de 31,25% de Serratia odorifera 1, de 18,75% de Raoultella ornithinolytica, et de 6,25% d’Enterobacter cloacae et de Klebsiella oxytoca chacun. Les 12 échantillons collectés aux marchés ont donné 34 colonies qui étaient toutes à Gram négatif (100%). Parmi les 34, 17 entérobactéries ont été identifiées. Ces 17 entérobactéries étaient constituées de 52,94% d’Escherichia coli, de 17,64% d’Enterobacter cloacae, de 11,76% Serratia odorifera 1 et de 5,88% de Raoultella ornithinolytica, d’Enterobacter amnigenus 2 et de Proteus vulgaris chacun. Ces entérobactéries ont été ensuite soumises au test de sensibilité à 8 antibiotiques. Les résultats obtenus ont été analysés globalement, mais aussi par zone d’étude c’est-à-dire dans le PNMD (zone protégée) et dans les marchés de Libreville (zone non protégée). Globalement la résistance des entérobactéries aux 8 antibiotiques testés sur l’ensemble des isolats est faible (11,36%). Une absence de résistance à 4 des 8 antibiotiques testés a été enregistrée pour tous les isolats, notamment à la gentamycine, la ciprofloxacine, la tétracycline et la streptomycine. Par contre, pour les 4 autres antibiotiques (ampicilline, kanamycine, nitrofurantoine et sulfonamide), des niveaux de résistance non négligeables ont été enregistrés. Pour l’ensemble des 84

isolats testés à ces derniers, le taux de résistance le plus élevé a été obtenu pour le sulfonamide (48,48%), suivi de la nitrofurantoine (27,27%), de l’ampicilline (9,09%) et de la kanamycine (6,06%). L’antibiogramme a également révélé un faible pourcentage de la multirésistance (38%) avec 87,5% des isolats testés résistants à 2 antibiotiques et 12,5% résistants à 3 antibiotiques. Une analyse statistique des fréquences dans les deux zones d’étude et pour les 4 antibiotiques pour lesquels les isolats se sont révélés résistants, a conclu à une différence non significative au niveau de confiance de 95%. Au vu de ces résultats, il apparait clairement que les entérobactéries isolées de la viande de brousse issue de zones protégées ou non du Gabon constituent un potentiel réservoir de la résistance aux antibiotiques. De ce fait, des mesures d’hygiène et de sécurité sanitaire rigoureuses sont à promouvoir. Pour cela, les pouvoirs publics doivent sensibiliser les populations et surtout les villageois, les chercheurs et les consommateurs, afin de limiter les risques de transmission et de propagation des résistances. En outre, des recherches complémentaires doivent être conduites dans l’ensemble du pays afin de mieux quantifier l’ampleur au niveau national. Ces études pourraient aussi s’orienter vers l’identification des supports de résistance.

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ANNEXES

Annexe 1 : Les animaux partiellement protégés au Gabon

Source : Ministère des Eaux et Forêts, chargé de l’Environnement et de la Protection de la Nature.

Par décret du 31 décembre 2001, les 6 espèces suivantes ont été ajoutées: -

tortue verte (Chelonya mydas) ;

tortue olivâtre (Lepidochenis olivacea) ;

tortue imbriquée (Erethmochelys imbricata) ;

perroquet vert (Poicephalus robustus) ;

inséparables à tête rouge (Agapornis pularias) ;

canard de Hartlaub (Pteronetta hartlaubi).

Annexe 2 : Les animaux partiellement protégés au Gabon

Source : Ministère des Eaux et Forêts, chargé de l’Environnement et de la Protection de la Nature.

Par décret du 31 décembre 2001, les 4 espèces suivantes ont été ajoutées : -

baleine à bosse (Megaptera novaeangliae) ;

pélican blanc (Pelicanus onocrotalus) ;

picatharte à cou gris (Picathartes oreas);

tortue luth (Dermochelys coriacea). C

SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR « Fidèlement attaché aux directives de Claude BOURGELAT, fondateur de l’enseignement vétérinaire dans le monde, je promets et je jure devant mes maîtres et mes aînés:  d’avoir en tous moments et en tous lieux le souci de la dignité et de l’honneur de la profession vétérinaire ;  d’observer en toutes circonstances les principes de correction et de droiture fixés par le code de déontologie de mon pays;  de prouver par ma conduite, ma conviction, que la fortune consiste moins dans le bien que l’on a, que dans celui que l’on peut faire ;  de ne point mettre à trop haut prix le savoir que je dois à la générosité de ma patrie et à la sollicitude de tous ceux qui m’ont permis de réaliser ma vocation.

Que toute confiance me soit retirée s’il advient que je me parjure »

EVALUATION DE LA RESISTANCE AUX ANTIBIOTIQUES DES ENTEROBACTERIES ISOLEES DU GIBIER AU GABON

RESUME L’Objectif de cette étude était d’évaluer la résistance aux antibiotiques des entérobactéries isolées du Gibier du PNMD et de celui vendu dans quelques marchés de Libreville au Gabon. Pour cela, 41 échantillons de fèces de gibiers dont 29 issus du PNMD et 12 des marchés de Libreville ont été analysés. Au total, 33 souches d’entérobactéries ont été identifiées à partir de tests biochimiques. Ces entérobactéries ont ensuite été testées par antibiogramme standard avec 8 antibiotiques différents en vue de déterminer leur sensibilité. Globalement, un faible pourcentage de résistance a été enregistré (11,36%) pour tous les antibiotiques. Les fréquences de résistance les plus élevées concernaient le sulfonamide (48,48%) et la nitrofurantoine (27,27%). Des résistances bien que faibles ont été également enregistrées avec l’ampicilline (9,09%) et la kanamycine (6,06%). Quant aux 4 autres antibiotiques notamment la gentamicine, la ciprofloxacine, la tétracycline et la streptomycine, aucune résistance n’a été détectée pour chacun d’eux. Cette étude n’a déterminé que l’antibiorésistance et pourrait se poursuivre par une identification des supports de la résistance. Mots clés : Résistance – Antibiotique – Entérobactéries – Gibier - Gabon Auteur : Michelle Ivana AWORET Email : yvanaaworet@gmail.com Adresse : Alibandeng, 222, Libreville (Gabon) Tel : +221 78 121 45 08 / +241 06 57 20 12