Géraldine LEYOGHO

UNIVERSITE CHEIKH ANTA DIOP DE DAKAR ******** ECOLE INTER-ETATS DES SCIENCES ET MEDECINE VETERINAIRES

(E. I. S. M .V)

ANNEE 2016

N° 16

DISTRIBUTION COMPAREE DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS PAR CULTURE ET PAR AMPLIFICATION DU GENE SPA DANS LES SANCTUAIRES DE PRIMATES NON-HUMAINS AU SUD DU GABON. THESE Présentée et soutenue publiquement le 16 Juin 2016 à 15 heures devant la faculté de médecine, de pharmacie et d’odontologie de Dakar pour obtenir le grade de Docteur vétérinaire

Mlle Géraldine LEYOGHO Née le 08 Mai 1987 à BAKOUMBA (GABON) JURY Président :

Mr. Bara NDIAYE Professeur à la Faculté de Médecine, de Pharmacie et d’Odontologie de DakarSénégal

Directeur et rapporteur de thèse :

Mme Rianatou BADA ALAMBEDJI Professeur à l’E.I.S.M.V. de Dakar- Sénégal

Membre :

Mr. Oubri Bassa GBATI Maître de Conférences Agrégé à l’E.I.S.M.V. de Dakar- Sénégal

Co-directeur de thèse :

Mr. Barthélémy NGOUBANGOYE Chercheur au Centre Recherches Médicales (CIRMF)- Gabon

International de de Franceville

DEDICACES

A l’Eternel, le Dieu Tout Puissant, qui par Son Fils Unique Jésus Christ, nous offre le salut et la paix véritable. Sois à jamais loué, Seigneur, pour ta bienveillance et tes compassions sans cesse renouvelées pour nous chaque matin.

A mes parents, Evelyne et Antoine LIYOGHO Chère Maman, tu as tant sacrifié pour nous. Il ne t’a jamais manqué ni la force et ni le courage pour nous défendre au risque de ta propre vie. Prenant exemple sur ta personne, tu m’as poussée à toujours faire mieux, à me surpasser. Merci d’avoir fait de moi la femme que tu conseilles encore aujourd’hui et le docteur que tu as façonné.

P’pa, mon petit Papa. Vous nous avez eu si tôt, et pourtant ta rigueur et ton amour nous ont conduit jusqu’ici. Tu as toujours cru en moi et parallèlement tu t’es tant acharné au travail pour que nous ayons une vie meilleure. Merci d’avoir donné le meilleur de toi-même pour nous et pour ta bienveillance envers moi.

J’espère que ce travail contribuera un peu à vous rendre la joie et l’honneur que vous méritez car il est le votre. Papa, maman, je suis fière d’être votre fille. Puisse l’Eternel vous bénir et vous donner longue vie. Je vous aime infiniment.

A mon ami, Francky Davy NZE Tu es mon ami de longue date. Aujourd’hui encore, plus que par le passé, tu as de la valeur à mes yeux. Merci pour ton amour, ta patience, ta bienveillance et ton soutien.

Que l’Eternel nous aide à concrétiser nos projets de vie à deux et nous permette à nouveau de nous retrouver !

i

A mes ainés, Gaëlle, Laurie et Loïc LEYOGHO Je garde en moi l’image de vous trois, toujours prêts à veiller sur moi d’une façon où d’une autre mais aussi de vos taquineries. Votre défense dans les cours de récréation, votre bienveillance envers moi lorsque j’étais si fébrile et votre soutien à toutes épreuves, sont tant de choses pour moi. C’est l’occasion pour moi de vous exprimer toute ma fierté d’avoir grandi à vos cotés et mes sincères remerciements. Je vous aime.

A mes « coudous » Linda, Evan et Othy LEYOGHO Vous remplissez ma vie de joie et d’étonnement. Puisse l’Eternel vous accordez un avenir radieux, pleins de succès.

A ma très chère et grande famille ; Mes sœurs ; Gaëlle, Arlette, Laurie Stévélia, Linda Xavière, Marne Dania, Déborah Cristale, Laurie Anna, Patrick Shéronne, Anne, Ida, Cheryl, Océane, ma Rosy, Tracy, Truche, Vanessa, Mamie, Sosso, Alicia, Paule, Préma, Grâce, Abigaël, Eunice.

Mes frères ; Loïc, Hulrich et les jeunes : Lucka, Evan, Othyniel, Djay, Christ, Christ Alex, Tommy, Caleb, Cliff, Juste, Dan, Trésor, Sem, Daddy, Asaph.

Je ne vous remercierai jamais assez pour votre soutien, votre amour et toute cette complicité malgré la distance.

Mes mamans ; Evelyne, Jacqueline, Aimée, Eudoxie, Wilfried, Pélagie, Régina et à celles qui nous ont laissé trop tôt maman mame et maman Solange. Je vous serai infiniment reconnaissante pour votre participation à la construction de ma personne.

Que Dieu vous bénisse au centuple et qu’Il accueille celles qui nous ont précédées!

Mes papas. Antoine et Alex. Vous êtes les seuls qui me restés et je vous aime. Merci pour le contraste rigueur et humour que vous m’offrez continuellement. Une pensée pieuse pour toi, papa Bertrand, qui est parti si vite. Repose en paix.

Mes neveux, nièces et futurs enfants. J’espère que ce travail vous inspirera à faire mieux.

Mes oncles et tantes ; Davy, Carine, Marius, Raïssa, Hélène, Batondo, Jude, Yasmine, Dany, Arsène, Mesmin, Annie Flore, Marcel, Angélique, Chantale, Ben, Samy, Janette, Tècle, Ulysse, Cadeau.

Mes cousins et cousines ; Mitch, Nelson, Prisca, Japhet, Anaïs, Sylvie, Olive, Silvain, Justin, Christelle, Daryl, Sinaly, Shékina, Koundi, Darline, Dave, David, Anaïs, Samira, Djénusia, Marius, Sosso, Kurt, Luna, Péniel, Laurys.

Mes beaux-frères et belles-sœurs ; Silvain, Silvère, Inès, Hermann, Paterne, Coucou.

Mes grands-parents ; MAYILA, MBEGHA, BEMI, KOUNDI, M’VOUDOU.

A mes amis au Sénégal, Perf, Hamida, Amy, Folly, Hélène, Fridia, Yitou, Arsène, Eddy, Carole, Daly, Joss, Mazra, Dosso, Reine, Anicet, Aristide, Guy… ma famille de Dakar et en particulier mes sœurs de cœurs ; Ivana, Diarha, Vanessa et Victoire sans oublier ma petite Yasmine. Je suis contente de vous avoir connu et d’avoir tant partagé avec vous. Notre suite dépend de Dieu à qui je nous confie. Je vous aime.

A mes amis au Gabon ; Ingrid, Dorca, Anouchka, Espé, Luise, Monica, Artel, Esmie, Merveille, Shelly, Oberlain, Lydie, Rhabbir, Géraldin, Eunice, Dulcy, Ruth, Thibault, Willy et d’ailleurs ; Francky, Ines, Crépin, Andrey, Erica, Tano, Réné, léonel, July, Hanaé. Merci d’avoir apporté votre contribution par vos encouragements.

A la jeunesse de l’EACMG, CRN et EED

Aux groupes de louanges : Porteur de Gloire de Nzeng-Ayong à Libreville et le Comité de louange de Maboukou à Franceville. Merci pour votre accueil, vos enseignements et votre soutien. Puisse l’Eternel faire de nous de véritables adorateurs !

A la communauté gabonaise de Dakar

A ma promotion, la 42eme du Pr ABIOLA

Au Sénégal mon pays hôte

Au Gabon ma chère patrie.

REMERCIEMENTS A notre Directeur de thèse, Professeur Rianatou BADA ALAMBEDJI, pour votre rigueur, votre compréhension et votre disponibilité. Profonde gratitude.

A notre Co-directeur de thèse, Docteur Barthélémy NGOUBANGOYE pour l’opportunité que vous nous avez donnée de travailler à vos côtés, pour votre encadrement et votre soutien. Merci sincèrement.

Au parrain de la 42ème promotion de l’EISMV, Professeur ABIOLA.

A notre professeur accompagnateur Pr. SAWADOGO.

A nos Maîtres de l’EISMV de Dakar pour la qualité de l’enseignement.

Au personnel administratif et technique de l’EISMV.

Au Commandant M’BOMA, pour votre soutien et vos précieux conseils.

A Monsieur OKOUA BEKALE pour votre aide qui n’a jamais manqué pendant toutes ces années.

A Madame DIOUF, Responsable de la Bibliothèque de l’EISMV.

A Monsieur MABIKA MABIKA, technicien au laboratoire du CIRMF. Infiniment merci pour votre aide.

Au personnel du CIRMF et l’équipe du Centre de Primatologie en particulier ma chérie Ida, Nadou, Pullcherie et maman Agath. Je ne vous oublierai pas.

Aux personnels du parc de la LEKEDI et du Programme de Protection des Gorilles

A mes voisines de chambre et de palier au campus ; Elsie, Carole, Diarha et Ivana ma colocataire.

Aux Docteurs : MAKANGA, OSSEBI, BIBOUTOU, BOUDENGA, IBOUESSE, MVE, ALLELA, GBOYOU, OTORO, TSOUBOU, OYETOLA, TRAORE, SAVADOGO pour votre contribution à ce travail.

Aux familles : LEYOGHO, M’VOUDOU, MAYILA, MOUSSAVOU, VACHEROT, WADA, M’BOMA, MAYIMBA, MABOUAMA, MAKONGO, MATEYA et MOUWAWA pour votre inestimable soutien.

A mes amies du monde. La quête du savoir nous a tous dispersé mais je garde la foi en de prochaines retrouvailles ! Merci de votre présence malgré la distance.

A ma promotion, la 42eme de l’EISMV.

A l’amicale des étudiants vétérinaires gabonais de Dakar (AEVGA).

Aux communautés de l’Eglise Evangélique de Dakar (EED) et du Groupe Biblique Universitaire vétérinaire de Dakar (GBU).

Au personnel de la Reprographie du véto (Infogénie) ; Thierry, Serge, Huber, Moukalaba Eugène et Francis.

A l’Ambassade du Gabon au Sénégal.

A tous ceux que je n’ai pas pu citer et ceux là qui, un jour, ont croisé ma route.

Au Gabon, ma patrie. Malumbi !

Au Sénégal, mon pays d’accueil. Dieureudjeuff !

A NOS MAÎTRES ET JUGES

A notre Maître et Président du Jury, Monsieur Bara NDIAYE Professeur à la faculté de Médecine, de Pharmacie et d’Odontologie de Dakar ; Nous sommes très sensibles à l’honneur que vous nous faites en acceptant spontanément de présider parmi les membres de notre honorable jury. Nous vous prions, cher Maître et Président du jury, d’accepter l’assurance de notre profond respect et de nos sincères remerciements.

A notre Maître, Directeur et Rapporteur de thèse, Madame Rianatou BADA ALAMBEDJI Professeur l’EISMV de Dakar ; Vous nous avez fait l’honneur d’accepter d’encadrer et de diriger ce travail et ce, malgré vos diverses occupations. Les moments passés en votre compagnie, nous ont permis de découvrir en vous l’exemple même de la bienveillance et de l’amour du travail bien fait. Votre connaissance étendue, votre esprit méthodique et votre dévouement sont autant d’exemples pour nous. C’est grâce à votre soutien et votre disponibilité que ce travail a pu voir le jour. Nous garderons de vous le souvenir d’un grand Maître doué d’immenses qualités humaines et nous vous assurons toute notre fierté, notre privilège d’avoir été votre élève. Veuillez trouver ici, cher Maître, l’assurance de notre estime et de notre profonde admiration.

A notre Maître et Juge, Monsieur Oubri Bassa GBATI Maître de Conférences Agrégé à l’EISMV de Dakar ; C’est avec plaisir et spontanéité que vous avez acceptez de siéger parmi les membres de notre honorable jury. Vos qualités humaines, votre humour et votre simplicité nous ont beaucoup touchés. Votre dévouement à votre profession et votre méthode scientifique forcent l’honneur et l’admiration. Veuillez trouver ici, cher Maître le témoignage de notre vive reconnaissance.

A notre Co-directeur de thèse, Monsieur Barthélémy NGOUBANGOYE Chercheur au Centre International de Recherches Médicales de Franceville au Gabon (CIRMF) Vous avez initié et diriger ce travail. Vos conseils et l’accueil chaleureux que vous avez réservés à ma personne au Centre de Primatologie nous ont profondément marqué. Les moments passés en votre compagnie nous ont permis de découvrir en vous l’exemple de la patience, la rigueur et l’amour du travail bien fait. Nous garderons de vous l’image d’une personne humble, attentionnée et dévouée. C’est l’occasion pour nous d’exprimer notre reconnaissance à votre endroit.

Veuillez trouver ici, l’assurance de notre respect et notre profonde gratitude.

« Par délibération, la Faculté de Médecine, de Pharmacie et d’Odontologies et l’Ecole Inter – Etats des sciences et Médecines Vétérinaires de Dakar ont décidé que les opinions émises dans les dissertations qui leurs sont présentées, doivent être considérées comme propres à leurs auteurs et qu’elles n’entendent leur donner aucune approbation ni improbation ».

LISTE DES ABREVIATIONS

Abréviation

Signification

ADN

:

Acide Désoxyribonucléique

ANPG

:

Agence Nationale des Parcs du Gabon

agr

:

Accessory gene relator

bap

:

biofilm associated protein gene

CDP

:

Centre De Primatologie

CENAREST

:

Centre National de la Recherche Scientifique et Technologique.

CIRMF

:

Centre International des recherches médicales de Franceville

CITES

:

Convention on International Trade of Endangered Species

ClfA

:

Clumping Factor A

CNER

:

Comité Nationale d’Éthique et de la Recherche (du Gabon)

COMILOG

:

Compagnie minière de l’Ogooué

dNTP

:

Deoxyribonucléotide Triphosphate

dATP

:

Deoxy-adénine Triphosphate

dCTP

:

Deoxy-cytosine Triphosphate

dGTP

:

Deoxy-guanine Triphosphate

dTTP

:

Deosoxy-thymine Triphosphate

eta

:

exfoliative toxins A

etb

:

exfoliative toxins B

etd

:

exfoliative toxins D

Fab

:

Antigen binding fragment (Fragment liant l’antigène)

FAO

:

Food and Agriculture Organisation

Fc

:

Fragment cristallisable

FnBPA

:

Fibronectin-binding protein A

FnBPB

:

Fibronectin-binding protein B

GPS

:

Global Positioning System

hla

:

alpha-toxin hemolysin

hlb

:

beta-toxin hemolysin

hlg

:

gamma-toxin hemolysin

hld

:

delta-toxin hemolysin

IcaA

:

Intercellular adhesion protein A

IcaD

:

Intercellular adhesion protein D

IgM

:

Immunoglobuline M

IsdA

:

Iron-regulated surface determinant system protein A

IsdB

:

Iron-regulated surface determinant system protein B

kDa

:

kilodalton

Kb

:

Kilobase

LPV

:

Leucocidine de Panton Valentine

lukF-PV

:

Leukotoxins F Panton Valentine

lukS-PV

:

Leukotoxins S Panton Valentine

Mb

:

Mégabase

MEB

:

Microscopie électronique à balayage

mec

:

methicillin resistant gene

NA

:

Non appliqué

NaCl

:

Chlorure de sodium

pb

:

Paire de bases

PBP2a

:

Pénicilline binding protein 2a

PCR

:

Polymerase Chain Reaction

pH

:

Potentiel hydrogène

PL

:

Parc de la Lékédi

PLP2a

:

Protéine de liaison aux pénicillines

PM

:

Poids moléculaire

PMN

:

Polymorphonucléaires

PNH

:

Primates non-humains

PNN

:

Polynucléaires neutrophiles

PNPB

:

Parc National des Plateaux Batéké

PPG

:

Programme de Protection des Gorilles

rpm

:

rotation per minute

SAID

:

Staphylococcus aureus identification

sar

:

Staphylococcal accessory regulator

SARM

:

Staphylococcus aureus résistant à la méticilline

S. aureus

:

Staphylococcus aureus

SCCmec

:

Staphylococcal chromosomal cassette mec*

SODEPAL

:

Société d’exploitation du Parc de la Lékédi

spa

:

Staphylococcal protein A gene

TAQ

:

Thermus aquaticus

TBE

:

Tris Borate EDTA* (Ethylène diamine tétra-acétique)

TS

:

Trypticase soja

TSST-1

:

Toxic shock syndrome toxin-1 gene

UICN

:

Union Internationale pour la Conservation de la Nature

UNESCO

:

United

Nations

Organization UV

:

Ultra violet

Educational,

Scientific

and

Cultural

LISTE DES FIGURES Figure 1 Figure 2 Figure 3 Figure 4 Figure 5 Figure 6 Figure 7 Figure 8 Figure 9 Figure 10 Figure 11 Figure 12 Figure 13 Figure 14 Figure 15 Figure 16 Figure 17 Figure 18 Figure 19 Figure 20 Figure 21 Figure 22 Figure 23 Figure 24 Figure 25 Figure 26 Figure 27 Figure 28 Figure 29 Figure 30

: : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : :

Structure d’une bactérie .......................................................................... 5 Micrographie électronique à balayage de S. aureus ............................. 10 Structure de la paroi bactérienne de S. aureus. ..................................... 11 Mécanisme d’invasion des S. aureus grâce à la protéine A ................. 12 Carte du gène spa. ................................................................................. 15 Structure et productions du S. aureus. .................................................. 17 Etapes de formation et maturation du biofilm bactérien ...................... 21 Localisation des parcs nationaux gabonais. .......................................... 23 Localisation des sites d’étude dans la province du Haut Ogooué. ....... 40 Communauté de PNH ........................................................................... 42 Matériel de capture des PNH. ............................................................... 43 Piège (Tomahawk) pour rongeurs......................................................... 43 Un thermocycleur programmé pour la PCR spa................................... 46 Délimitation de la zone de piégeage des rongeurs................................ 48 Géo-localisation des points de piégeage des rongeurs. ........................ 49 Chiroptères pris aux filets devant les bananes destinées aux PNH. ..... 50 Prise des mesures morphométriques d’un Chiroptère. ......................... 51 Schéma général de traitement des échantillons. ................................... 52 En salle d’inactivation et d’extraction d’ADN. .................................... 53 De l’électrophorèse à la lecture. ........................................................... 57 Milieux Chapman.................................................................................. 57 Milieux SAID........................................................................................ 58 Milieux Trypticase soja ........................................................................ 58 Clichés obtenus après migration sur gel d’agarose............................... 59 Quelques rongeurs du CDP................................................................... 60 Chiroptères capturés au CDP. ............................................................... 60 Distribution des échantillons traités par type d’hôte. ........................... 61 Résultats de cultures par type d’hôte .................................................... 65 Résultats positifs à la PCR par type d’hôtes. ........................................ 66 Comparaison de cultures positives des primates en fonction des sites. ...................................................................................................... 69 Figure 31 : Comparaison des PCR positives des primates en fonctions des sites ....................................................................................................... 70

LISTE DES TABLEAUX

Tableau I

: Bilan des prélèvements par espèce de PNH au CDP ..................... 62

Tableau II

: Bilan de la capture et des échantillons analysés chez les rongeurs. ......................................................................................... 63

Tableau III

: Bilan des prélèvements et de l’analyse des échantillons chez les chiroptères. ................................................................................ 63

Tableau IV

: Bilan des prélèvements issus du PL. .............................................. 64

Tableau V

: Présentation sommaire des résultats tous sites confondus. ............ 66

Tableau VI

: Taux de positivité obtenus au CDP. ............................................... 67

Tableau VII

: Taux de positivité obtenus au PPG. ............................................... 68

Tableau VIII : Taux de positivité obtenus au PL. .................................................. 69

TABLE DES MATIERES

INTRODUCTION......................................................................................................... 1 PARTIE I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ...................................................... 4 Chapitre I : Généralités sur les staphylocoques ......................................................... 5 I. Généralités sur le genre Staphylococcus .................................................................. 5 I.1. Définition et classification ................................................................................. 5 I.2. Propriétés ........................................................................................................... 6 II. Généralités sur Staphylococcus aureus................................................................... 6 II.1. Aperçu historique de Staphylococcus aureus ................................................... 6 II.2. Apparition et évolution des résistances de S. aureus aux antibiotiques ........... 7 II.3. Écologie de S. aureus ....................................................................................... 8 II.4. Caractéristiques morphologiques ..................................................................... 9 II.4.1. Morphologie macroscopique...................................................................... 9 II.4.2. Structure ................................................................................................... 10 II.4.2.1. Microcapsule...................................................................................... 10 II.4.2.2. Paroi bactérienne ............................................................................... 10 II.4.2.3. Membrane cellulaire .......................................................................... 13 II.4.2.4. Cytoplasme ........................................................................................ 13 II.4.2.5. Génome .............................................................................................. 13 II.5. Propriétés de S. aureus ................................................................................... 15 II.5.1. Caractères biochimiques .......................................................................... 15 II.5.2. Caractères culturaux ................................................................................. 15 II.5.3. Sécrétions ................................................................................................. 16 II.5.3.1. Protéines ............................................................................................ 16 II.5.3.1.1. Enzymes ...................................................................................... 17 II.5.3.1.2. Toxines protéiques ...................................................................... 19 II.5.3.2. Biofilm bactérien ............................................................................... 20

Chapitre II : Les sanctuaires à Primates non-humains (PNH) au Gabon............. 22 I. Présentation du Gabon ........................................................................................... 22 II. Espaces protégés ................................................................................................... 22 II.1. Parcs nationaux ............................................................................................... 22 II.2. Parcs privés ..................................................................................................... 23 II.3. Réserves naturelles ......................................................................................... 23 III. Sanctuaires de PNH ............................................................................................. 24 III.1. Parc national de l’IVINDO ........................................................................... 25 III.2. Parc national de LOANGO ........................................................................... 25 III.3. Parc national de la LOPE .............................................................................. 25 III.4. Parc national de MAYUMBA ....................................................................... 26 III.5. Parc national de MINKEBE .......................................................................... 26 III.6. Parc national de MOUKALABA-DOUDOU ............................................... 26 III.7. Parc national de MWAGNA ......................................................................... 27 III.8. Parc national des PLATEAUX BATEKE (PNPB) ....................................... 27 III.9. Parc national de PONGARA ......................................................................... 27 III.10. Parc national de WAKA.............................................................................. 28 III.11. Centre International de Recherches Médicales de Franceville ................... 28 III.12. Parc de la Lékédi (PL)................................................................................. 28 Chapitre III : Infections à Staphylococcus aureus dans les communautés d’hôtes et diagnostic .................................................................................................... 30 I.

Aperçu sur les communautés d’hôtes ................................................................. 30

II.

Effets cliniques de S. aureus sur les communautés d’hôtes ............................ 31

II.1. Chez l’Homme................................................................................................ 31 II.2. Chez les PNH ................................................................................................. 32 II.3. Chez les rongeurs ........................................................................................... 33 II.4. Chez les Chiroptères ....................................................................................... 34 III.

Méthodes de diagnostic ................................................................................... 34

III.1. Cultures ......................................................................................................... 34 III.1.1. Sur milieux non-sélectifs ........................................................................ 34 III.1.2. Sur milieux sélectifs ............................................................................... 35

III.2. Tests biochimiques complémentaires ........................................................... 36 III.3. PCR ............................................................................................................... 37 PARTIE II : ÉTUDE EXPÉRIMENTALE .............................................................. 38 Chapitre I : Cadre d’étude, matériel et méthodes ................................................... 39 I. Cadre d’étude ......................................................................................................... 39 II. Matériel ................................................................................................................. 41 II.1. Communautés d’hôtes .................................................................................... 41 II.1.1. Humains ................................................................................................... 41 II.1.2. Primates non-humains (PNH) .................................................................. 41 II.1.3. Rongeurs .................................................................................................. 42 II.1.4. Chiroptères ............................................................................................... 42 II.2. Matériel de capture ......................................................................................... 43 II.2.1. Des PNH................................................................................................... 43 II.2.2. Des rongeurs ............................................................................................ 43 II.2.3. Des chiroptères ......................................................................................... 44 II.3. Matériel de prélèvement ................................................................................. 44 II.4. Matériel de laboratoire ................................................................................... 44 II.4.1. Matériel et milieux de culture .................................................................. 44 II.4.2. Matériel de diagnostic moléculaire .......................................................... 45 III. Méthodes utilisées ............................................................................................... 46 III.1. Considérations éthiques ................................................................................ 46 III.2. Méthodes sur le terrain .................................................................................. 47 III.2.1. Capture des PNH .................................................................................... 47 III.2.2. Capture des rongeurs .............................................................................. 47 III.2.3. Capture des Chiroptères .......................................................................... 49 III.3. Méthodes au laboratoire ................................................................................ 50 III.3.1. Prélèvements ........................................................................................... 50 III.3.1.1. Prélèvements humains ...................................................................... 50 III.3.1.2. Prélèvements de PNH....................................................................... 50 III.3.1.3. Prélèvements des rongeurs ............................................................... 51 III.3.1.4. Prélèvements des Chiroptères .......................................................... 51

III.3.2. Mise en culture ....................................................................................... 52 III.3.3. Réalisation de la PCR ............................................................................. 52 III.3.3.1. Inactivation des prélèvements .......................................................... 52 III.3.3.2. Extraction d’ADN ............................................................................ 53 III.3.3.3. Solubilisation des amorces ............................................................... 54 III.3.3.4. Dilution des amorces ........................................................................ 54 III.3.3.5. Dilution de la solution Mix de Déoxynucleotide (dNTP) ................ 55 III.3.3.6. Préparation du Mix et distribution dans les plaques ........................ 55 III.3.3.7. Distribution des échantillons d’ADN ............................................... 55 III.3.3.8. Amplification des séquences ............................................................ 55 III.3.3.9. Electrophorèse .................................................................................. 56 III.3.4. Traitement des données .......................................................................... 57 III.3.4.1. Principe de lecture des cultures ........................................................ 57 III.3.4.2. Principe de lecture de la PCR ........................................................... 59 III.3.4.3. Logiciels et analyses statistiques ...................................................... 59 Chapitre II : Résultats ................................................................................................ 60 I. Résultats de la capture et des prélèvements ........................................................... 60 I.1. Espèces de rongeurs et de Chiroptères capturés .............................................. 60 I.2. Résultat global ................................................................................................. 61 I.3. Rapport échantillons prélevés et utilisés.......................................................... 61 I.3.1. CDP ........................................................................................................... 61 I.3.2. PPG ............................................................................................................ 64 I.3.3. Parc de la Lékédi (PL) ............................................................................... 64 II. Résultat d’analyses des écouvillons ...................................................................... 64 II.1. Résultats généraux de la cultures et la PCR ................................................... 64 II.1.1. Résultats généraux de la culture............................................................... 64 II.1.2. Résultats généraux de la PCR .................................................................. 65 II.2. Présentation des résultats de culture et de PCR par sites ............................... 67 II.2.1. CDP .......................................................................................................... 67 II.2.2. PPG .......................................................................................................... 68 II.2.3. Parc de Lékédi (PL) ................................................................................. 68

III. Comparaison des taux de positivité en fonction des localités ............................. 69 III.1. Taux de positivité obtenue par la culture et type d’hôte ............................... 69 III.2. Taux de positivité obtenue par la PCR et type d’hôte .................................. 70 Chapitre III : Discussion et recommandations ........................................................ 71 I. Discussion .............................................................................................................. 71 I.1. Matériel et méthodes ........................................................................................ 71 I.1.1. Contexte ..................................................................................................... 71 I.1.2. Cadre d’étude............................................................................................. 71 I.1.3. Matériel biologique ................................................................................... 72 I.1.4. Laboratoire ................................................................................................ 73 I.2. Discussion des résultats ................................................................................... 75 I.2.1. Prélèvements.............................................................................................. 75 I.2.2. Culture ....................................................................................................... 75 I.2.3. Résultats de PCR ....................................................................................... 76 I.3. Comparaison des taux de positivité par site .................................................... 78 I.4. Culture et PCR ................................................................................................. 79 I.5. Transmission de S. aureus au sud du Gabon ................................................... 80 II. Recommandations ................................................................................................. 81 CONCLUSION ........................................................................................................... 85 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ................................................................. 86 ANNEXES

INTRODUCTION Environ 60% des maladies infectieuses émergentes qui touchent l’homme, sont d’origine animale et proviennent de la faune sauvage (Jones et al., 2008).

L’émergence de ces maladies serait la conséquence des modifications et des perturbations des écosystèmes qui auraient pour corollaire l’augmentation des contacts et des transferts d’agents pathogènes infectieux de la faune sauvage vers l’être humain (Gillespie et al., 2008), en particulier dans les zones tropicales où la biodiversité est importante.

La région tropicale équatoriale a vu ses barrières naturelles être franchies pour des réalisations de l’écotourisme et de la recherche scientifique. Au Gabon, treize (13) parcs nationaux voyaient le jour en 2002, soit 11% de son territoire. Actuellement, encore et mieux que par le passé, le programme national s’articule autour d’une gestion des ressources renouvelables et d’une économie verte. On note la réalisation des projets tels que le Projet Graine qui favorise de grandes étendues d’agriculture dans tout le pays, mais aussi des projets de conservation et le développement de l’écotourisme : on parle du « Gabon Vert ». Cette vision est accompagnée par de nombreuses structures de santé (centres spécialisés, cliniques), de recherche (CIRMF, CNAREST), et de conservation (Parcs, sanctuaires de Primates Non-Humains ou PNH).

Lors de cette cohabitation Homme-animal entretenue dans les lieux de conservation, les contacts rapprochés se font plus régulièrement. En raison de leur étroite ressemblance génétique avec les humains, les PNH sont de potentiels réservoirs d’agents infectieux comme en témoignent les transferts de virus Ebola ou encore celui du VIH (Etienne et Peeters, 2010; Peeters et al., 1989). Cette proximité croissante est aussi observable dans les sites de santé et de recherches affiliés. Les autres espaces tels que les parcs offrent un champ d’exposition varié selon les espèces rencontrées compte tenu de la proximité génétique avec l’homme.

Ainsi, la prise en compte des questions liées au risque de circulation d’agents infectieux d’une part, et de l’adaptation évolutive de ses pathogènes dans les

1

programmes de conservation et de développement des aires protégées d’autre part, constituent une problématique majeure en santé publique (Pedersen et al., 2007; Cleaveland et al., 2001; Daszak et al., 2000). Parmi les pathogènes d’intérêts dans les échanges entre l’homme et l’animal, nous avons le genre staphylocoque dont le plus à craindre pour son intérêt clinique et sa capacité à franchir la barrière inter-espèce est S. aureus.

S. aureus a été décrit pour la première fois en 1884 par Rosenbach. Cette bactérie commensale de l’homme et des autres mammifères (Singes, Rongeurs, Chiroptères, etc.), est incontestablement l’espèce la plus virulente de son genre, par sa production élevée de toxines et d’enzymes extracellulaires à l’origine de pathologies diverses et variées. En outre, elle a développé des souches résistantes à de nombreux antibiotiques initialement actifs sur elle, telles que les pénicillines.

Les caractéristiques moléculaires et phénotypiques de S. aureus chez les animaux sauvages sont peu connues et de ce fait, mal surveillées en Afrique sub-saharienne.

Toutefois, une étude préliminaire entreprise au Gabon en 2013 dans les sanctuaires de PNH a révélé la présence chez le gorille d’une souche d’origine humaine (Nagel et al., 2013).

Notre étude s’inscrit dans un projet de thèse universitaire portant sur la caractérisation et l’évolution adaptative de quatre modèles pathogènes dont Staphylococcus aureus.

Dans cette approche préliminaire que représente notre étude, nous procéderons à la recherche par culture et PCR du S. aureus chez les sous populations humaines, PNH, rongeurs et chauves souris. Dans la suite du projet, il s’agira de procéder à partir de nos produits de PCR, au séquençage des souches isolées. Le traitement phylogénétique et bioinformatique des séquences permettrait de déterminer les bases moléculaires et les facteurs adaptatifs qui permettent le franchissement des barrières inter-espèces.

Globalement, l’objectif principal de notre travail est de déterminer la fréquence du portage de S. aureus par type d’hôtes (Hommes, PNH, rongeurs, Chiroptères) et par sites d’études (artificiel, semi-naturel et naturel) puis de comparer ces variations. De façon spécifique, il s’agira de :

2

 capturer des rongeurs et des Chiroptères ;  prélever des écouvillons sur les muqueuses nasales des Chiroptères, Rongeurs,

PNH et les humains ;  isoler et identifier S. aureus par culture ;  confirmer par PCR les échantillons positifs à la culture ;  analyser les résultats obtenus.

Sur le plan organisationnel, ce travail s’articule en deux parties : la première ou partie bibliographique, présente les généralités sur les staphylocoques, les sanctuaires à PNH au Gabon et les infections à S. aureus rencontrées chez les communautés d’hôtes. Une autre, la partie expérimentale, présente à son tour le matériel et les méthodes utilisées pour la capture, les prélèvements et leurs analyses ainsi que les résultats obtenus, la discussion et les recommandations y afférentes.

3

PARTIE I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE • Généralités sur les staphylocoques • Les sanctuaires de PNH au Gabon • Infections à S. aureus dans les communautés d’hôtes et diagnostic

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Chapitre I : Généralités sur les staphylocoques I. Généralités sur le genre Staphylococcus I.1. Définition et classification Les staphylocoques sont des bactéries de type cocci (coques) à Gram positif. Ils sont souvent immobiles et regroupés en amas comme des grappes de raisin. Leur aspect de grappe traduit du grec « staphyle », est à l’origine de leur nom (Orenstein, 2011). Ces bactéries sont répandues partout dans le monde. Elles sont rencontrées aussi bien chez l’homme que chez de nombreuses espèces animales domestiques et sauvages (Schaumburg et al., 2012a).

Les staphylocoques font partie du règne des bactéries qui sont des organismes unicellulaires procaryotes, dépourvus de réticulum, mitochondries et appareil de golgi (Figure 1). Pendant longtemps, ils ont été considérés comme appartenant à la famille des Micrococcacecae (Cordero et Zumalacárregui, 2000; Holt, 1969) qui comprenait

quatre

genres

(Micrococcus,

Staphylococcus,

Planococcus).

Figure 1 : Structure d’une bactérie Source : Wikimédia commons, 2009.

5

Stramatococcus

et

La classification des staphylocoques fut établie premièrement sur la base de la coagulase. Cependant, il fut admis plus tard que ce seul critère n’est pas suffisant pour déterminer une classification, ainsi il fut proposé par Baird Parker une seconde classification des staphylocoques reposant sur les caractères morphologiques et physiologiques de la bactérie ainsi que sur la composition de la cellule (Baird-Parker, 1965). En 1974, le genre Staphylococcus va être classé en trois espèces : S. aureus, S. epidermidis et S. saprophyticus (Baird‐Parker, 1974). Depuis, leur classification ne cesse d’évoluer et reste assez controversée (Shaw et al., 1951).

Il est admis aujourd’hui que les staphylocoques appartiennent à la famille des Staphylococcaceae (Schleifer et Bell, 2009), au phylum des Firmicutes, à la classe des Bacilli et à l’ordre des Bacillales. La famille des Staphylococcaceae compte cinq genres dont la composition diffère selon les auteurs: Jeotgalicoccus, Macrococcus, Salinicoccus, Nosocomiicoccus en plus de celui des Staphylococcus. Les quatre premiers ne contiennent pas plus de deux espèces alors que le genre Staphylococcus compterait à ce jour de nombreuses espèces. Il regroupe à lui seul plus de cinquante (50) espèces et sous-espèces (Euzéby, 2009). Staphylococcus aureus, responsable de plusieurs troubles chez l’homme et l’animal, en représente le chef de file.

I.2. Propriétés Les staphylocoques sont généralement capables de fermenter le glucose. Ils possèdent une enzyme, la catalase, qui décompose le peroxyde d'hydrogène (ou eau oxygénée) en eau et dioxygène. Par ailleurs, ce sont des bactéries à oxydase négative. Ainsi, ils possèdent de façon individuelle des critères distinctifs qui ont érigé plusieurs classifications (Schaechter et al., 1999).

II. Généralités sur Staphylococcus aureus II.1. Aperçu historique de Staphylococcus aureus La description des staphylocoques remonte autour des années 1870, lors d’une étude microscopique sur des échantillons de pus par un chirurgien écossais appelé Alexander Ogston. Ils furent initialement nommés ‘‘micrococci’’ du grec ‘‘kokkos’’ pour graine à 6

cause de leur forme arrondie. Des années après la poursuite de ses travaux de recherche en 1882, il aboutit à la description des staphylocoques (du grec « Staphyle » qui signifie grappe de raisins), par opposition aux streptocoques (coques en chaîne) précédemment décrits par Billroth en 1874. Il est important de signaler que Louis Pasteur évoqua également leur existence en 1877.

Deux ans plus tard, l’allemand Rosenbach, isola deux souches de staphylocoques différentes. Il nomma les colonies obtenues sur l’apparence de leur pigment phénotypique c’est-à-dire en fonction de la couleur des colonies obtenues. Ainsi, Staphylococcus aureus était la souche de couleur « dorée » (d’où son nom commun de staphylocoque doré) et Staphylococcus albus, les souches de couleur blanches. Ces dernières sont plutôt devenues S. epidermidis (Orenstein, 2011).

Aujourd’hui parler de l’histoire des staphylocoques s’accompagne en général de celle des antibiotiques, car celle-ci a accompagné leur découverte. C’est à Londres, en 1928, qu’Alexander Fleming (1881- 1955), professeur au St Mary’s Hospital observa une culture de staphylocoques au contact de moisissures dans des boites de gélose (Jouzier, 2002). Il appela la moisissure Penicillium. La boite de Pétri qui contenait les staphylocoques avait été accidentellement contaminée par du Penicillium. Il constata également que les colonies de staphylocoques situées à proximité du Penicillium avait été lysées. Ce qui le poussa à caractériser le penicillium et d’en faire une mixture qu’il nomma pénicilline (Cavallo et al., 2004).

II.2. Apparition et évolution des résistances de S. aureus aux antibiotiques Les bêta-lactamines constituent le traitement de première intention des infections staphylococciques. La résistance à ces molécules est apparue et a évolué par vagues successives au gré de l’acquisition de mécanismes de résistance spécifiques. Ainsi, la première vague d’apparition s’est faite dans les années 1950. Il s’agissait de la résistance à la pénicilline G, par production de pénicillinases plasmidiques, observée dans les hôpitaux avant de diffuser dans le reste de la population.

L’introduction de la méticilline et de ses dérivés, bêta-lactamines non dégradées par les pénicillinases, a marqué le début de la deuxième vague de résistance. « Staphylococcus aureus Résistant à la Méticilline » (ou SARM) sera aussi observé 7

pour la première fois dans les hôpitaux (Haenni et al., 2012). Les résistances vont émerger tout d’abord en Angleterre, avant de se répandre de façon épidémique puis endémique dans les hôpitaux à partir des années 1970. Cette résistance à la méticilline est conférée par l’acquisition d’une cassette chromosomique SCCmec portant le gène mecA, qui code pour une protéine membranaire additionnelle : la protéine liant les Pénicillines (PLP2a ou PBP2a). Cette dernière a une affinité très faible pour les bêtalactamines, ce qui entraîne une résistance croisée à toutes les molécules de cette famille. Au final, un petit nombre de clones de SARM multirésistants, dénommés « Hospital-Acquired » SARM (HA-SARM) à l’origine des infections nosocomiales, a diffusé très largement de manière épidémique dans les hôpitaux, à l’échelle nationale, continentale, voire mondiale (Otter et French, 2010).

Récemment (années 2000), des études ont révélé de nouvelles souches résistantes chez l’animal : notamment le porc. En 2011, de nouveaux clones de SARM multirésistants vis-à-vis des autres familles d’antibiotiques (phénotype peu fréquent chez les SARM) ont été décrits pour la première fois dans des prélèvements de mammites bovines et chez l’Homme au Royaume-Uni et au Danemark (García-Álvarez et al., 2011). Cette propagation suscite bon nombre d’interrogations parmi lesquelles : quelle est l’origine de ses nouvelles souches résistantes observées dans la faune animale domestique ? En existe-t-il dans la faune sauvage ? Quelles sont leurs distributions géographiques ?

Existe-t-il des transferts de cette bactérie entre la faune sauvage et les hommes vivant à proximité ?

II.3. Écologie de S. aureus Les souches de S. aureus sont opportunistes. Elles sont couramment rencontrées chez les mammifères et chez les oiseaux. En effet, ce germe est essentiellement retrouvé chez les humains à environ 23% à 60% et jusqu’à 64% chez les enfants (Amir et al., 2006; Smith et al., 2001). Les humains en sont des réservoirs naturels (Casewell et Hill, 1986; Noble et al., 1967). Faiblement porté par les animaux domestiques, S. aureus est rarement retrouvé chez le chien (Pellerin, 2014; Fazakerley et al., 2009), par contre il est rencontré à 29% chez les brebis laitières (Vautor et al., 2005) , 35%

8

chez les vaches (Roberson et al., 1994), 50% chez les poulets (Kawano et al., 1996) et plus rarement encore chez les animaux sauvages (Fitzgerald et al., 2001).

Les souches de S. aureus colonisent la région buccale mais aussi bon nombre d’épithélium (Manivannan, 2007) dont les fosses nasales (Amir et al., 2006), le tractus respiratoire (Smith et al., 2001), le cuir chevelu (Harvey et Gilmour, 2000), les surfaces et glandes de la peau (Kloos et al., 1976). Ubiquitaires, elles sont également retrouvées dans l’eau, le sol, l’air, les objets et même dans les aliments (Devoyod et al., 1969).

Les colonies de S. aureus peuvent être portées pendant une période indéterminée ce qui en fait des hôtes porteurs chroniques ou intermittents. Le manque d’hygiène, les milieux sans eau courante conduisant à l’usage des récipients souvent mal entretenus, l’utilisation des eaux usées, le surpeuplement favorisent une augmentation du taux de portage à S. aureus et accroissent considérablement le risque d’exposition à une infection (Stevens et al., 2010). S. aureus appartient au grand ensemble de germes zoonotiques puisqu’il peut être transmis d’une espèce à l’autre et de ces espèces à l’homme, par contact direct ou indirect (Goldstein et al., 1978).

II.4. Caractéristiques morphologiques II.4.1. Morphologie macroscopique S. aureus est une coque, non-sporulée et immobile dont le diamètre environne 0,8 à 1 µm (Le Loir et al., 2003). Pour la constitution d’un amas, le nombre de bactéries agglutinées les unes aux autres varie de staphylocoques isolés, groupés en diplocoque ou en plusieurs éléments (figure 2).

9

Figure 2 : Micrographie électronique à balayage de S. aureus Source : Wikipédia, 2005.

II.4.2. Structure La cellule staphylococcique comprend plusieurs éléments.

II.4.2.1. Microcapsule La capsule est un revêtement habituellement de nature polysaccharidique excrété par certaines bactéries. La plupart des souches de S. aureus produit des microcapsules (Fox et al., 1998). A ce jour, onze (11) types de microcapsules polysaccharidiques sérotypés sont connus et de tous, les types 5 et 8 sont à l’origine de 75 % des infections contractées par l’homme (Albus et al., 1991) . Le rôle de la microcapsule est d’inhiber la phagocytose (Lowy, 1998).

Une étude réalisée en 2004 par O’Riordan et Lee, a montré que la capsule staphylococcique permettait d’accentuer l’adhérence au niveau des cellules endothéliales de l’hôte. Par la même occasion, elle entrainerait chez les animaux une colonisation bactérienne plus accrue et la persistance de S. aureus dans le mucus de l’hôte. Elle diminue ainsi l’élimination de cette bactérie via la phagocytose et augmente les risques de pathogénicité chez l’hôte (O'Riordan et Lee, 2004).

II.4.2.2. Paroi bactérienne Elle comprend des éléments propres aux bactéries à Gram positif auxquels sont ajoutés des éléments spécifiques à S. aureus comme le montre la figure 3.

10

Figure 3 : Structure de la paroi bactérienne de S. aureus.

Source : Spicer, 2003

 Protéine A C’est une protéine de surface dont le poids moléculaire (PM) est de 42 kDa. Elle est insoluble à l'état natif et caractérise l'espèce S. aureus (Graille et al., 2000).

Synthétisée par plus de 90% de souches d'origine humaine ou biotype A, la protéine A est moins souvent produite par les souches d'origine animale (cinq autres biotypes connus) (Avril et al., 2000). Elle est également absente chez les staphylocoques à coagulase négative, sauf chez ceux d’entre eux qui possèdent une nucléase thermostable.

La protéine A est anti-phagocytaire car il semblerait qu’elle soit capable de se fixer de façon non spécifique au fragment Fc de presque toutes les Immunoglobulines. En effet, elle est connue pour son interaction avec les différents éléments de la cellule hôte

parmi

lesquels

les

plaquettes,

le

facteur

de

Von

Willebrand,

les

immunoglobulines A, E et G (Hartleib et al., 2000; Cheung et al., 1997). En fait, la liaison conçue entre le fragment Fc des immunoglobulines et la protéine A va empêcher à ces dernières d’exercer leur pouvoir d’anticorps. L’autre fraction Fab des Immunoglobulines reste donc « flottante » alors qu’elle est naturellement impliquée dans la formation de complexe anticorps-antigène. Cette protéine est donc un moyen que possède S. aureus pour échapper au système de neutralisation des leucocytes

11

polymorphonucléaires (PMN) ou polynucléaires neutrophiles (PNN) comme le montre la figure 4.

Figure 4 : Mécanisme d’invasion des S. aureus grâce à la protéine A Source : Kobayashi et DeLeo, 2013.  Adhésine L’adhésine est une protéine membranaire servant à l’adhérence. En effet, il s’agit de protéine de liaison à la Fibronectine (fibronectin-binding protein A et B ou FnBPA et FnBPB) et au Fibrinogène (clumping factor A ou ClfA) (Vaudaux et al., 1995). Elle favorise la colonisation de S. aureus chez la cellule hôte par la formation de complexe.  Muréine Le peptidoglycane ou muréine participe à la formation de la réponse inflammatoire. Le peptidoglycane forme un réseau de macromolécules englobant le cytoplasme de la bactérie.  Acide téichoïque L’acide téichoïque est quant à lui impliqué dans l’activation du complément. On l’appelle aussi polysaccharide A. C’est un assemblage de phosphate et de glucose ou rubitol qui sert d’attache aux peptidoglycanes des bactéries Gram positives.  Lipotéichoïques

12

L’acide lipotéichoïque est un polymère de glycérol phosphate lié à une extrémité glycolipidique ancrée dans la membrane cytoplasmique (Lowy, 1998). Leur rôle est peu connu.

II.4.2.3. Membrane cellulaire Elle possède des protéines communes aux bactéries Gram positives et notamment aux autres staphylocoques. C’est la limitante externe du cytoplasme.

II.4.2.4. Cytoplasme S. aureus est une cellule procaryote. De ce fait, son cytoplasme est dépourvu de compartiment et se compose majoritairement de ribosomes.

II.4.2.5. Génome Le matériel génétique de S. aureus se compose d’environ 2619 à 2748 gènes identifiés.

Ils désignent l’ensemble des séquences codantes dont l’estimation est d’environ 80 à 84% du génome bactérien (Fitzgerald et al., 2001; Kuroda et al., 2001). La taille de quelques génomes de S. aureus séquencés rapportés varie de 2813 à 2903 Mb. Le génome comprend des prophages, des plasmides intégrés, des transposons, des îlots de pathogénie, des cassettes, des îlots génomiques (Lindsay et Holden, 2004).

Le génome bactérien de S. aureus est constitué d’ADN sous forme de chromosome circulaire (2800pb) parfois accompagné d’un plasmide. Ce dernier existe sous trois formes possibles : les plasmides I, II et III dont les tailles respectives varient de 5Kb, 40Kb à 60Kb. Ainsi, la classe I peut porter un ou deux gènes codants pour la résistance aux antibiotiques tandis que le plasmide II peut en porter plusieurs parmi lesquels ceux de la résistance aux β-lactames (Laboratoire de Microbiologie et Génétique Moléculaires, sd). Ces gènes responsables de la résistance staphylococcique peuvent être transférables entre différentes souches (Schaberg et Zervos, 1986).

L’analyse de la séquence nucléotidique d’un seul gène avait déjà été proposée en 1996 (Frénay et al., 1996). Ainsi, de nombreux gènes sont actuellement recherchés pour l’identification particulière des souches pathogènes de S. aureus. On distingue parmi eux : 13

 Les gènes eta, etb et etd (Exfoliative toxin A, B, D) : ils codent pour la synthèse

des toxines exfoliatives A, B et D (Yamaguchi et al., 2002);  Les gènes hla, hlb, hlg et hld (alpha-toxin, beta-toxin, gamma-toxin, delta-toxin

hemolysin) : ils codent respectivement pour la synthèse des hémolysines alpha, beta, gamma et delta (Jarraud et al., 2002);  Le gène tst (Toxic shock syndrome toxin-1) : il est responsable de la synthèse

de la toxine du syndrome de choc toxique (Akineden et al., 2001). Ce gène est retrouvé à 20% chez les souches isolées de S. aureus (Marrack et Kappler, 1990).  Le gène mecA (Methicillin resistance) : il code pour la production de la

PLP2a (Beck et al., 1986) qui est située dans la membrane cytoplasmique et est responsable de la résistance à la méticilline.  Le gène lukS-PV-lukF-PV (Leukotoxin Panton-Valentin) : Responsable de la

synthèse des classes S et F, composants de la Leucocidine de Panton-Valentine.

(Dufour et al., 2002; Lina et al., 1999);  les gènes agr (Accessory gene relator) et sar (Staphylococcal accessory

regulator) : ils interviennent dans la régulation et l’induction de la virulence staphylococcique. Une étude effectuée sur les rongeurs montre que l’inactivation de ces gènes entraine automatiquement une réduction de la virulence bactérienne due à S. aureus (Cheung et al., 1994). Le gène agr induit l'expression de protéines extracellulaires (exoprotéines) (Ji et al., 1995).  Le gène spa (Staphylococcal protein A) : il code pour la synthèse de la protéine

A qui est exprimée à la surface de S. aureus. Il induit la virulence des S. aureus (Lindsay, 2008).

Le gène spa, illustré par la figure 5, est un ensemble de segments codants qui correspondent aux différentes cases. Ces dernières codent pour la séquence signal (S) qui marque l’extrémité N-terminale d’une protéine, la région liant l’immunoglobuline G (A-D), la région homologue à A-D (E), l'extrémité COOH de la protéine (X), qui comprend les microsatellites ou les courtes séquences répétées (Xr) et la séquence de 14

fixation à la paroi cellulaire (Xc). Les amorces de la figure sont numérotées de l'extrémité 5' de l'amorce vers l’extrémité 3’ sur le brin sens (F ; Forward). Ainsi, la région polymorphique X du gène spa contient un nombre variable (2 à 23) de séquences répétées de 24 Pb. Cette variabilité est causée par l’ensemble des délétions, duplications et mutations à l’origine de la diversité génétique des souches de S. aureus ou types de S. aureus (El-Sayed et al., 2006; Kahl et al., 2005; Shopsin et al., 1999).

5’

3’

Figure 5 : Carte du gène spa.

Source : Shopsin et al., 1999.

II.5. Propriétés de S. aureus II.5.1. Caractères biochimiques S. aureus est une bactérie aéro-anaérobie facultative, oxydase négative, coagulase et catalase positives (Baird‐Parker, 1974, 1965; 1963). Il métabolise également le glucose. C’est un germe qui conduit de nombreuses réactions enzymatiques dont la dégradation du mannitol sur la gélose Chapman.

II.5.2. Caractères culturaux La coloration de la colonie de S. aureus est due à un pigment jaune à jaune-orangé.

C’est une bactérie mésophile et neutrophile. Koch a pu montrer en 1949 que cette bactérie était également halophile (Chapman, 1945; De Buyser, 1996). Ce caractère peut être mis à profit dans des bouillons hypersalés à 7% de NaCl (Le Loir et al., 2003).

15

II.5.3. Sécrétions II.5.3.1. Protéines S. aureus possède une multitude de gènes codant pour la synthèse de nombreuses protéines dont les toxines et les enzymes.

Au cours de l’évolution de S. aureus, les différentes phases de croissance y sont observées. Lors de la synthèse protéique, l’expression des gènes impliqués se fait de façon séquentielle et est régulée par des gènes tel que le gène agr. En effet, les protéines exprimées à la surface bactérienne (protéines extramembranaires externes) sont principalement produites au cours de la phase exponentielle. A ce moment, la vitesse de multiplication cellulaire devient constante car elle a atteint son maximum.

Ce sont des protéines de liaison qui interviendront également dans la colonisation des tissus de l’hôte : la protéine A, la protéine de liaison à l'élastine, la protéine de liaison à la fibronectine, la protéine de liaison au collagène, la coagulase et le Clumping factor ou protéine de liaison au fibrinogène (figure 6, panneau A et panneau transversal C).

Au cours de la phase stationnaire, période au cours de laquelle la croissance bactérienne semble nulle, les protéines sécrétées sont synthétisées (figure 6, panneau A et panneau transversal B). Elles seront ainsi déversées dans le milieu extérieur et se propageront vers les tissus adjacents (Lowy, 1998).

16

Figure 6 : Structure et productions du S. aureus.

Source : Lowy, 1998 II.5.3.1.1. Enzymes Ce sont des protéines dotées de propriétés catalytiques. Chez S. aureus, on en distingue plusieurs parmi lesquelles :  Catalase

Elle diminue l’action destructrice des phagocytes en les empêchant de former des radicaux oxygénés toxiques pour S. aureus (El Kouri et al., 1998).  Staphylocoagulase libre ou coagulase libre

Il s’agit d’une protéine extracellulaire qui se lie à la prothrombine de la cellule hôte et favorise la transformation du fibrinogène en fibrine. Elle entraine une coagulation du plasma autour de la bactérie, ce qui rend automatiquement la phagocytose impossible pour ce germe puisque le milieu devient difficile à franchir (Schaechter et al., 1999).  Clumping factor ou coagulase liée

17

Protéine de la paroi bactérienne, elle permet la fixation du fibrinogène et l’agglutination des S. aureus. Elle est plus présente chez les souches staphylococciques humaines (Le Loir et al., 2003).  Staphylokinase ou fribrinolyse

La staphylokinase est une séquence longue de 136 acides aminés et sécrétée par des souches lysogéniques de Staphylococcus (Bokarewa et al., 2006). Leur rôle est de neutraliser le pouvoir bactéricide provenant des leucocytes humains.  β-lactamases

Elles inactivent les pénicillines. Globalement, elles sont responsables de la résistance aux β-lactamines. On en compte quatre classes (A, B, C et D) (Jacoby et MunozPrice, 2005).  Hyaluronidase

Elle favorise la diffusion par destruction de l’acide hyaluronique qui constitue la substance de base de la matrice extracellulaire. En effet, ceci est rendu possible par l'hydrolyse des acides qui va augmenter la perméabilité de la matrice et diminuer la viscosité de tissu conjonctif.  Protéase Grace aux lésions qu'elle provoque sur les tissus de l'organisme hôte, la protéase confère à S. aureus son pouvoir invasif.  Phosphatase acide

Synthétisée puis intégrée sous forme de protéine périplasmique soluble ou de protéine attachée aux lipoprotéines membranaires, la phosphatase acide déphosphoryle plusieurs phosphoesters (Gandhi et Chandra, 2012). Ainsi elle participe à l’expression génique, la nutrition cellulaire (Beacham, 1979) et la régulation du métabolisme cellulaire. C’est une enzyme utilisée comme critère du pouvoir pathogène et en bactériologie alimentaire.  Désoxyribonucléase

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Elle catalyse les acides désoxyribonucléiques en nucléotides ou polynucléotides. Elle est produite en grande quantité par S. aureus et son activité semble être étroitement liée à celle de la coagulase (Weckman et Catlin, 1957).  La thermonucléase ou ADNase thermostable

Elle permet aux souches de S. aureus de résister lorsqu’elles sont exposées aux températures élevées (15 minutes à 100%) (Le Loir et al., 2003).

II.5.3.1.2. Toxines protéiques Les staphylocoques à coagulase positive produiraient de nombreuses toxines (Shaw et al., 1951).  Exfoliatine ou épidermolysines On en compte trois, l’épidermolysine A, B et D. Elles provoquent le décollement intra-épidermique de la peau (syndrome de Lyell) précisément entre le stratum granulosum et le stratum spinosum (Akineden et al., 2001). Elles sont aussi à l’origine des infections néonatales et impétigo bulleux.  Hémolysines ou staphylolysines Il existe 5 types connus : l’hémolysine alpha, beta, gamma, delta, epsilon (Ali and Haque, 1972). Elles lysent des hématies ainsi que d’autres cellules, ont une action vasoconstrictrice et induisent la nécrose de la peau (El Kouri et al., 1998).  Entérotoxines Il en existe sept types connus (A, B, C1, C2, C3, D et E). Ce sont des protéines super antigéniques thermostables et responsables des nombreuses intoxications alimentaires dues à S. aureus. Elles résistent aux enzymes protéolytiques du tube digestif et sont produites par 30% à 60% des souches de S. aureus.

 Protéine du syndrome du choc toxique (SCT) La toxine super antigénique TSST-1 serait responsable de 75 % des cas de syndrome de choc toxique. Elle active de nombreuses sous-populations de lymphocytes 19

simultanément, ce qui aboutit à une libération d’interleukine, interféron gamma, TNF (Tumor Nécrosis Factor) alpha et bêta. Ces médiateurs provoquent ainsi le choc toxique. Lors de ces infections, la mortalité y est très élevée et elle surviendrait rapidement, deux heures maximum. S. aureus, colonisant les muqueuses vaginales, va entrainer, dans des cas assez rares, une production de toxines pendant les menstruations ou conduire à des complications chirurgicales au moment du choc (Akineden et al., 2001; Becker et al., 1998).  Leucocidine de Panton-Valentine Elle est formée de 2 sous-unités, codées par des gènes distincts, agissant en synergie ; les composés de classe S et F. Ainsi elle provoquerait la perte de mobilité, la dégranulation, la destruction nucléaire et la lyse cellulaire des polynucléaires et des macrophages. La LPV intervient aussi dans la formation de pus (Avril et al., 2000; Dufour et al., 2002) et est associée aux infections sévères de la peau (Cribier et al., 1992).

II.5.3.2. Biofilm bactérien L’élaboration du biofilm bactérien (Otto, 2008) est un mécanisme de défense beaucoup moins spécifique que les autres mécanismes connus de S. aureus. Le biofilm est un agrégat sophistiqué et structuré de cellules bactériennes attachées à une surface biotique (muqueuse) ou abiotique (équipement, objet inanimé) et enrobé d’une matrice polymérique (Hall‐Stoodley et Stoodley, 2009; Costerton et al., 1999).

Composé à 85% de polysaccharides, cet agglomérat de tours bactériennes comprend de nombreuses niches fonctionnelles. Ces dernières sont espacées par des canaux aqueux qui assurent le transport des nutriments et d’oxygène réparties de façon inégale car les niveaux de couches profondes en reçoivent très peu (La Recherche, 2005; Møller et al., 1996). Le biofilm protège la bactérie contre la cellule hôte et les stimuli étrangers. Il sert de système digestif localisé à l’extérieur de la cellule puisqu’il métabolise les substances dissoutes, colloïdales et solides à proximité de celle-ci (Flemming et Wingender, 2010). Les souches excrétrices de biofilm portent les gènes mecA, IcaA (Intercellular adhesion protein A), IcaD (Intercellular adhesion protein D) et bap (Biofilm associated protein) (Tremblay et al., 2014; Dromigny, 2011). Il 20

semblerait aussi que certains gènes sont exprimés par les bactéries selon qu’elles soient sous forme planctonique ou dans un biofilm (Whiteley et al., 2001).

Les étapes de formation du biofilm sont présentées dans la figure 7. Ainsi, les bactéries (S. aureus) s’attachent à une surface (1). Celles-ci commencent à excréter des polysaccharides (2) qui forment aussitôt une couche protectrice : c’est le biofilm (3).

Progressivement, la maturation du biofilm (4) aboutit à la libération des bactéries des couches supérieures (5) dans l'environnement. Ces bactéries planctoniques seront à l’origine de la propagation du biofilm une fois qu’elles auront adhéré à de nouvelles surfaces (biotique ou abiotique). Elles sont chargées de continuer le cycle (5).

Figure 7 : Etapes de formation et maturation du biofilm bactérien Source: Beloin et al., 2008.

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Chapitre II : Les sanctuaires à Primates non-humains (PNH) au Gabon I. Présentation du Gabon Le Gabon est un pays d’Afrique centrale dont la superficie est de 267 667 km2. Dans sa subdivision, il compte neuf (9) provinces : l’Estuaire, le Haut-Ogooué, le MoyenOgooué, la Ngounié, la Nyanga, Ogooué-Ivindo, Ogooué-Lolo, Ogooué-Maritime et le Woleu-Ntem. Le Gabon comprend plusieurs cours d’eau dont le principal est l’Ogooué, avec 1200 km de long, qui traverse le pays du sud-est (où il prend ses origines) à l’ouest (dans l’océan atlantique). Constitué à 80% (environ 22 millions d’hectares) de forêt vierge, sa végétation est très dense. Dans le but de préserver sa faune et sa flore, de nombreux parcs ont vu le jour.

II. Espaces protégés II.1. Parcs nationaux En 2002, le gouvernement Gabonais entreprit avec la participation de Wildlife Conservation Society de créer 13 parcs nationaux qui représentent 3 millions d’hectares, soit environ 11% du territoire. Ces parcs représentent la plus grande part de conservation faunique et floristique au Gabon. La figure 8 est une carte qui montre leur répartition.

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Figure 8 : Localisation des parcs nationaux gabonais.

Source : Voyage Gabon, 2005.

II.2. Parcs privés Les parcs naturels privés sont peu nombreux au Gabon. On distingue parmi eux : le parc animalier de LECONI (2050 Km², dans la province du Haut-Ogooué) géré par la société des Plateaux Batéké (SPB) ; le parc de la LEKEDI (140 km2, Haut-Ogooué) géré par la Société d’Exploitation du Parc de la LEKEDI (SODEPAL) ; le Centre De Primatologie (CDP) du CIRMF (40 ha, Haut-Ogooué) ; le zoo-parc de Port-Gentil (20 ha, Ogooué-Maritime) créé par Emile Gorayeb en 1980.

II.3. Réserves naturelles Le Gabon héberge de nombreuses espèces animales rares et mêmes endémiques. Cet état des choses octroie aux réserves gabonaises, des statuts variés. Les réserves sont souvent comprises dans des parcs ou à leurs extrémités 23

Les réserves spécialisées dans la conservation des espèces animales sont (Data bassin, 2011) : la réserve naturelle intégrale d'Ipassa-Makokou (150 km2, Ogooué-Ivindo) ; la réserve faunistique de Moukalaba-Dougoua (800 km2, entre les provinces de l’Ogooué-Maritime et la Nyanga) ; la réserve faunistique d’Ouanga Plain (108,87 km2, Nyanga) ; la réserve faunistique Petit Loango (500 km2, l’Ogooué-Maritime) ; la réserve faunistique du Mont Doudou (3000 km2, Nyanga). Parmi les réserves qui favorisent la conservation de la végétation et des paysages, on distingue : la réserve floristique et faunistique de Rabi-Ndogo (province de l’Ogooué-Maritime) ; la réserve de Minkol-Makok (province du Woleu-Ntem) ; le sanctuaire floristique du Mont Iboudji (province l’Ogooué-Lolo).

Par ailleurs, certaines réserves ont le statut de réserves de chasse. Elles sont accessibles sur la présentation d’un permis de chasse ou de capture pour les animaux sauvages. Les espèces concernées sont non-protégées ou partiellement protégées et la chasse est autorisée pendant les périodes d’ouverture fixées par décret ministériel.

Parmi elles, on peut citer : la réserve de Wonga Wongue (réserve de chasse présidentielle, 4281 km2 entre les provinces de l’Estuaire et de l’Ogooué-Maritime) ; la réserve d’Iguela (1 800 km2, province de l’Ogooué-Maritime) ; la réserve de Moukalaba (200 km2, province de la Nyanga) ; la réserve de Ngove-Ndogo (2 500 km2, province de l’Ogooué-Maritime) ; la réserve de Setté-Cama (2200 km2 province de l’Ogooué-Maritime).

III. Sanctuaires de PNH Les primates non-humains (PNH) sont inclus dans les espèces intégralement protégées au Gabon. En effet, le Gabon, qui se situe dans le versant de la forêt équatoriale, partage avec le Congo la plus grande réserve de primates, soit environ 80 000 individus (Oates, 1996). De ce fait, de nombreux parcs et réserves sont impliqués dans leur conservation. Parmi tous ces parcs (nationaux et privés), les localités où sont rencontrés les PNH sont nombreuses (ANPG, 2008) :

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III.1. Parc national de l’IVINDO Le parc de l’Ivindo a été créé en 1972. Il est localisé dans l’Ogooué Ivindo et couvre 3000 km². Financé par l’Union Européenne, sa végétation est constituée majoritairement d’Okoumé (Aucoumea klaineana), des forêts marécageuses et des chutes d’eau. Il compte plus de 131 espèces de mammifères (mammalofaune) : 17 espèces de PNH, 13 espèces de carnivores, 16 espèces d’ongulés dont les plus abondants sont les éléphants (Loxodonta africana), les gorilles (Gorilla gorilla) et les chimpanzés (Pan troglodytes). On note aussi la présence de 397 espèces d’oiseaux (avifaune) et de nombreuses espèces de poissons (ichtyofaune).

III.2. Parc national de LOANGO Créé en 1986, le parc est logé dans la province de l’Ogooué-Maritime avec une superficie de 1550 km². Sa diversité floristique est très importante. Pour la faune, on y retrouve 16 espèces de PNH, des carnivores en forêt et particulièrement de nombreux papillons diurnes (Lepidoptera). Ses plages sont des lieux de jeux des éléphants et au large, des hippopotames. On y aperçoit aussi des baleines à bosse. Le parc propose des campements touristiques à Iguéla et Setté Cama.

III.3. Parc national de la LOPE Situé le long du fleuve Ogooué et à la confluence de plusieurs provinces (Ogooué Ivindo, Ogooué lolo, Moyen Ogooué, Ngounié), ce parc est un ensemble de collines, de forêt et de savane d’une superficie de 4970 km². Son programme de gestion fut initié en 1993 par l’Union Européenne et fut inscrit en 2007 sur la liste du patrimoine mondial de l'UNESCO. C’est un site archéologique comprenant des vestiges de la préhistoire et de l'Antiquité (Gravures rupestres, des traces d’homme datant de plus de 400 000 ans). Il compte plus d’une cinquantaine d'espèces, dont plus d’une dizaine de primates parmi lesquels près d'un millier de gorilles de plaine et 2000 chimpanzés, plusieurs

espèces

de

cercopithèques,

de

mangabeys

(Cercocebus)

et

de

mandrills (Mandrillus sphinx). On y rencontre peu d'hippopotames et de sitatunga (Tragelaphus spekii), une forte concentration d’éléphants, de buffles ainsi que des

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espèces de céphalophes, le guib harnaché, le potamochère et plus de 350 espèces de l’avifaune.

III.4. Parc national de MAYUMBA Créé en 2002, le parc de MAYUMBA couvre 920 km² et il est situé à la pointe sudouest ou à l'extrémité méridionale du Gabon, entre la ville de Mayumba et la frontière congolaise (province de la Nyanga). La végétation est constituée de mangroves, de forêts inondées de lagunes, des îles. Avec ses 60 km de plage, il s'étend sur 15 km vers la mer. Il fut construit dans le but de protéger et de conserver la biodiversité marine.

C’est le premier site du monde pour la ponte des tortues-luths et un habitat marin pour les dauphins (Delphinus delphis), les requins (Alopias vulpinus ) et autres baleines à bosse de l’Atlantique (Megaptera novaeangliae). Les animaux forestiers tels que les buffles, les éléphants, les mandrills, les gorilles, les chimpanzés et autres primates habitent la forêt.

III.5. Parc national de MINKEBE Situé entre les provinces du Woleu-Ntem et de l’Ogooué Ivindo, ce parc est le plus important au Gabon avec ses 7560 km². Il est composé de dômes rocheux et du plus grand bloc forestier inhabité du Gabon. Le parc national de Minkébé ainsi que deux autres parcs (le parc national d'Odzala-Kokoua en République du Congo et la réserve de faune du Dja au Cameroun), forment la zone TRIDOM (pour TRInationale du Dja, Odzala et Minkébé) du Fonds mondial pour la nature (WWF), qui intervient pour la protection des forêts denses africaines du bassin du Congo. La diversité végétale et animale présente au parc de Minkébé est importante mais faible en termes de quantité de PNH (gorilles et chimpanzés) et d’éléphants depuis 1994-1996 (due à l’épidémie de fièvre ébola).

III.6. Parc national de MOUKALABA-DOUDOU Le parc national de MOUKALABA-DOUDOU est situé en milieu forestier et côtier, dans la province de la Nyanga. Depuis 2005, il est inscrit sur la liste du patrimoine mondial de l'UNESCO et couvre 5029 km². Il comprend de fortes concentrations de primates dont celui du gorille qui est la plus forte au Gabon. Les peuples Pounou, 26

interdisant la chasse aux gorilles et aux chimpanzés, aurait permis de renfoncer leur conservation et la mise en place d’un tourisme de nature. Des hippopotames, des éléphants, des antilopes (Cobe defassa) et chacals (Canis aureus) ainsi que des oiseaux migrateurs (hirondelle striée, cigogne) s’y refugient également.

III.7. Parc national de MWAGNA Logé dans l’Ogooué Ivindo, il couvre une part importante du vaste bloc forestier de l’est du Gabon et du nord Congo (1160 km²) qui représente la deuxième plus grande forêt pluviale presque inhabitée du monde après le Brésil. Le parc de Mwagna possède aussi la plus grande baie du Gabon, où abondent de nombreux gorilles et éléphants ainsi que plusieurs autres animaux.

III.8. Parc national des PLATEAUX BATEKE (PNPB) Le PNPB est situé dans la province du Haut-Ogooué. Ce parc de 2050 km², présente de vastes étendues de savanes herbeuses et arbustives entrecoupées de forêts. Il possède aussi des vestiges archéologiques. C’est l’un des derniers refuges des grands mammifères. Sa faune est diversifiée car on y rencontre des éléphants de forêt, des hyènes, des buffles, des potamochères, de nombreuses variétés d’oiseaux. Hormis le tourisme culturel, la plus grande particularité du PNPB est le tourisme aux gorilles.

Ces derniers sont habitués à la présence humaine. Un projet est essentiellement basé sur leur observation et un programme de réinsertion des jeunes gorilles orphelins ou nés en captivité, a renforcé le tourisme. Ce programme appelé Programme Protection des Gorilles (PPG) sera détaillé dans la deuxième partie de ce travail.

III.9. Parc national de PONGARA Localisé sur la rive gauche de l’Estuaire du Komo, en face de Libreville et sur la façade Atlantique, ce parc (870 km²) possède de nombreuses plages dont certaines sont des plages de Mangroves, de sites de ponte de tortues marines et des sites de loisirs pour les citadins qui y ont accès par bateaux. Le reste du parc, dédié à la forêt comprend de nombreux animaux : des buffles, des céphalophes, de nombreux petits singes, des chimpanzés et des gorilles sans oublier la grande variété d’oiseaux.

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III.10. Parc national de WAKA Avec ses 1060 km² et situé au centre de la province de la Ngounié, on dit de ce parc qu’il est logé au cœur du pays Mitsogho, peuple mystérieux aux nombreux secrets et rituels traditionnels. Leur histoire culturelle suscite davantage l'intérêt international.

Son paysage, situé entre le Fougamou et la Lopé, se compose de savane et de nombreuses montagnes dont celui du massif de Chaillu qui l’entourent entièrement et une autre, Boutombé la plus haute avec 902m. C’est un refuge forestier inexploré avec une faille profonde de 100 km de long en forêt. Le parc de la WAKA est un refuge de plus de 1500 espèces de plantes, environ 85 mammifères dont de nombreux PNH, plus de 400 espèces d’oiseaux, et une multitude de reptiles et d’amphibiens.

III.11. Centre International de Recherches Médicales de Franceville Situé à Franceville, à environ 728 Km de Libreville, le Centre International de Recherches Médicales de Franceville (CIRMF) est un Institut Gabonais de référence pour la recherche, la formation et le soutien au système de santé. Au départ orienté vers la fécondité de la population gabonaise et les pathologies parasitaires, le CIRMF s’est aujourd’hui ouvert à un panel plus large de thématiques de recherches concernant les problématiques de santé publique tant sur le territoire gabonais que pour l’ensemble de la sous-région d’Afrique centrale. Les activités du Centre se diversifient et intéressent des recherches en virologie fondamentale et épidémiologie, en parasitologie, primatologie, génétique, hématologie et en écologie de la santé. Le CIRMF, qui œuvrait dans la recherche sur les PNH, est dorénavant orienté vers la protection de ce patrimoine par le CDP qui sera décrit dans la deuxième partie de ce travail.

III.12. Parc de la Lékédi (PL) Construit en 1991 après l’arrêt de l’exploitation du téléférique par les frères Gress avec des fonds de la COMILOG (Compagnie minière de l’Ogooué), le parc de la Lékédi est un parc privé. Il est administré par la SODEPAL (Société d’exploitation du Parc de la Lékédi) et couvre une superficie de 14 000 ha entièrement clôturé. Il est situé en périphérie d’un petit village nommé Bakoumba qui se trouve à 100 km, au sud-ouest 28

de Franceville. Les animaux présents sont essentiellement les PNH mais on y retrouve aussi des étangs de pisciculture, des buffles, des antilopes, des panthères et de nombreux reptiles. La présence humaine y est permanente mais les animaux vivent en liberté.

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Chapitre III : Infections à Staphylococcus aureus dans les communautés d’hôtes et diagnostic I.

Aperçu sur les communautés d’hôtes

Selon la niche ou les sanctuaires, des communautés animales sont fréquemment retrouvés. On distingue dans ces parcs :  les humains Dérivé des primates selon la théorie de l’évolution, les humains font fait parti de l’ordre des Primates et appartiennent à la famille des Hominidés avec le gorille et le chimpanzé. Le genre Homo est tiré de l’expression « hemo » du latin ancien, qui signifie « fils de la terre », « être humain », « Homme ». Il comprend deux espèces distinctes Homo sapiens et Homo neanderthalensis.  les PNH L’expression primate est tirée du latin primas et matis, qui signifient « celui qui occupe la première place », « le premier ». Cet ordre comprend deux sous-ordres : Haplorhiniens et Strepsirhiniens. Ce sont, en général, des espèces arboricoles et diurnes. On distingue parmi eux les gorilles, chimpanzés, Orang-outans, ouistiti, mandrills et bien d’autres.  les Rongeurs Les rongeurs ou Rodentia sont un ordre important de mammifère. Ils sont caractérisés par leur petite taille et leur système dentaire marqué par des incisives prédominantes (dents rongeuses). Parmi eux, on retrouve les rats, porc-épics, écureuils, souris, castors…Ils sont doués d’un odorat et d’une ouïe très développés. Certains sont herbivores, d’autres omnivores et d’autres encore prédateurs.  les Chiroptères Les Chiroptères (couramment appelés chauves-souris ou Chiroptera) sont un ordre de mammifères nocturnes volant. C’est le deuxième ordre le plus important des mammifères placentaires après celui des rongeurs. On distingue les mégachiroptères et les microchiroptères. Ce sont des animaux essentiellement frugivores et nectarivores

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mais d’autres présents en Amérique du Sud ou chauves souris vampires consomment du sang prélevé sur d’autres animaux.

II. Effets cliniques de S. aureus sur les communautés d’hôtes II.1. Chez l’Homme Les infections à S. aureus représentent 95 % de la part des staphylocoques à coagulase positive (Agence de la Santé Publique du Canada, 2012). De façon générale, il existerait trois groupes

dont le premier est formé de patients non porteurs de

staphylocoque (20%), les porteurs intermittents (60%) pour le second et le dernier celui des porteurs chroniques (20%) (Kluytmans et al., 1997). En Afrique, les infections à S. aureus sont souvent diagnostiquées en retard et particulièrement dans la partie ouest-africaine où les infections génito-urinaires sont très répandues (43 %). S. aureus dressent des tableaux cliniques qui varient en fonction de la localisation. C’est ainsi que les souches productrices de la Leucocidine de Panton et Valentine sont considérablement plus fréquentes en Afrique avec 30 % contre 2 % (p < 0,001) en Europe (Moussa et al., 1999).

S. aureus peut devenir pathogène pour l’organisme après une rupture de la muqueuse cutanée. En effet, l’ouverture des muqueuses favorise l’intrusion de la bactérie qui peut, par la voie sanguine, atteindre de nombreux organes et être source de nombreuses pathologies (Edwards et Massey, 2011) surtout chez les personnes immunodéprimées. C’est pourquoi ces infections sont courantes en milieu hospitalier où sont fréquemment réalisés des soins et des interventions chirurgicales. Le portage de S. aureus résistant à la méticilline par certains patients et/ou personnel soignant a donné naissance aujourd’hui aux infections nosocomiales. Ces dernières sont associées à des coûts élevés de prise en charge et à un surcroît de morbidité et de mortalité (Lucet, 2002). Ces infections entraineraient une consommation supplémentaire d’antibiotiques « empiriques » et participeraient ainsi à la « spirale de la résistance ».

Lors d’infection invasive, certains S. aureus utilisent l’hémoglobine de l’hôte pour y soutirer du fer nécessaire à leur prolifération. Il s’y produit alors une liaison entre la paroi du S. aureus avec l’hémoglobine qui entrainerait une extraction de l’hème de la

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cellule hôte. L’hème est à son tour dégradé dans la bactérie pour libérer le fer. Cette agglutination de S. aureus avec l’hémoglobine humaine est plus aisée contrairement à la liaison avec l’hémoglobine des autres mammifères car S. aureus possède des récepteurs IsdB (iron-regulated surface determinant protein B) spécifiques à l’hémoglobine humaine. Ce critère hémolytique de S. aureus est plus prépondérant chez les humains (Pishchany et al., 2010; Barber, 1961). Des études réalisées en 2006 et 2008, montraient également que sur les types de récepteurs du système Isd présentes à la surface de S. aureus, les récepteurs IsdA, IsdC et IsdH ont une affinité moindre ou variable avec l’hémoglobine (Liu et al., 2008). L’inactivation des récepteurs IsdB entrainait automatiquement de manière significative une baisse de liaison entre la paroi staphylococcique et la membrane de l’hémoglobine ce qui diminue considérablement la capture du fer (Torres et al., 2006).

Au niveau nutritionnel, les souches de S. aureus sont responsables de nombreuses intoxications alimentaires en rapport avec leurs productions de toxines. Elles induisent des syndromes de choc toxique (Todd et al., 1978).

De façon générale, les effets néfastes de S. aureus sont variés. Ils vont du panaris, aux septicémies, endocardites, en passant par des infections des oreilles, des yeux, du nez, de la gorge, du palais, des cas de perte cutanée, papules, furoncles, impétigo, folliculite, endocardite, , abcès du cerveau, méningite, perte de liquide et infection secondaires osseuses et pulmonaires (Alabi et al., 2013; Aires de Sousa et Lencastre, 2004). C’est le premier pathogène reconnu comme responsable d’infection bronchopulmonaire chez les patients atteints de mucoviscidose.

II.2. Chez les PNH Les caractéristiques moléculaires et phénotypiques de S. aureus en faune sauvage d’Afrique sub-saharienne sont peu connues. Cependant, chez les grands singes, les analyses faites par Schaumburg en 2012 montrent que ces derniers peuvent être colonisés par deux groupes de souches de S. aureus dont le groupe le plus important appartiendrait aux souches rencontrées chez les humains (Schaumburg et al., 2012a).

Ainsi, les singes africains peuvent être colonisés par des souches de S. aureus hautement divergentes qui sont rarement retrouvées chez les humains tandis que les 32

grands singes conservent principalement les lignées de S. aureus affectant les êtres humains. Le typage de S. aureus de petits singes d’origine ivoirienne, Cercopithecus polykomos et Pan troglotydes et, d’origine gabonaise de Cercopithecus cephus et Cercopithecus nictitans, a montré la transmission entre ces espèces de souches de S. aureus. D’autre part, la chasse des Chimpanzés et la consommation de petits singes tels que les Colobus sp. Ou les Cercopithecus sp. Et bien d’autres proies sont des processus qui expliquent la transmission de S. aureus.

Chez des chimpanzés (Pan troglotydes) observés aux USA en 1992 au Yerkes Regional Primate Research Center, on notifia des cas d’abcès, de méningite, de ventriculite, de pneumonie, de septicémie, d’entérocolites dues à S. aureus. D’autres infections ont pu être observées chez les chimpanzés à des fréquences variables (Eder et al., 1994).

II.3. Chez les rongeurs Très souvent utilisés pour l’ensemble des expérimentations, les rongeurs ont aidé à comprendre les phénomènes intrinsèques de S. aureus. Une étude de Calhun (1963) réalisée sur près de 200 rats sauvages obtenus au total après deux (2) ans, nourris et abreuvés régulièrement, aux Etats-Unis, a permis d’observer après analyse, plusieurs virus et bactéries chez ces derniers. Calhun ne trouva en eux aucune trace de S. aureus (Calhoun, 1963). Par contre, chez des souris nouveaux- nés, des souris en reproduction ou immunodéprimées, S. aureus figurent parmi les pathogènes principaux et sont la cause majeure d’infections cutanées (Grézel, 2006).

C’est aussi le cas des 91 rats d’égouts capturés à Lyon en 1982 qui présentaient un portage majoritaire de Staphylococcus aureus (53%) suivi de Yersinia et des Pasteurella (29% chacun) (Seguin et al., 1986).

Suite à de nombreuses études faites sur les rongeurs de laboratoire, le portage de cette bactérie leur a été reconnu comme naturelle. Ainsi, le portage nasal des rongeurs a montré les risques d’infections liés à S. aureus. Ce modèle de colonisation a permis de mettre en cause la capsule et l’acide téichoïque présent à la surface staphylococcique comme facteurs favorisants cette colonisation. Cette étude montre en effet que des

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souches mutantes de S. aureus en manque de ces facteurs ou de facteur d’agglutination B ont une réduction de la colonisation nasale (Schaffer et al., 2006).

II.4. Chez les Chiroptères En 2008, à l’hôpital vétérinaire de l’Université Libre de Berlin, des souches de S. aureus ont été isolées d’animaux exotiques dont les chauves-souris. Ces souches se sont révélées résistantes à la méticilline (Walther et al., 2008). Cependant, actuellement les infections dues à S. aureus sont peu enregistrées chez les chiroptères et méconnues.

III. Méthodes de diagnostic III.1. Cultures La détection des staphylocoques se fait par de nombreuses méthodes. L’usage fait mention de deux sortes de milieux : les milieux non-sélectifs et les milieux sélectifs.

III.1.1. Sur milieux non-sélectifs Les milieux non sélectifs utilisés en pratique courante en bactériologie sont le milieu Trypticase soja (TS), la gélose nutritive ordinaire, le milieu lactosé au Bromocrésol pourpre et la conservation dans du glycérol.  Gélose Trypticase soja (TS) La gélose TS est un milieu où la croissance bactérienne est maximale et présente une sensibilité élevée. Elle comprend du chlorure de sodium, glucose et peptone en grande partie. Elle entraine pour toutes sortes de souches une augmentation en nombre, en taille et en forme des colonies (Sultanov et al., 2011). Ces milieux permettent la croissance des bactéries de tout genre.  Gélose nutritive La gélose nutritive ordinaire composée en majorité d’agar, permet de caractériser les souches bactériennes qui y sont ensemencées. Elle isole les différents types de colonies présents dans un échantillon d’une part et purifie les souches d’une colonie en

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cas de contaminations d’autre part. Elle rend aisée la description phénotypique des colonies isolées.  Milieu Bromocrésol Le milieu lactosé au Bromocrésol pourpre permet surtout la distinction des bactéries lactose positif et négatif. Il comprend du lactose, peptone, mais surtout du pourpre de Bromocrésol et de l’agar. Les souches responsables du virage au jaune (pH acide) sont les bactéries lactose positif. Elles utilisent le lactose contenu dans le milieu comme source d’énergie et ainsi acidifient le milieu. Par contre, les souches lactose négatif laissent le milieu neutre (pourpre) car elles utilisent plutôt les peptones contenues dans le milieu et alcalinisent ce dernier (pH basique).  Glycérol Le glycérol est un milieu de conservation sous forme liquide, adapté pour les bactéries.

C’est un cryoprotecteur de choix puisqu’il rend le milieu atone et empêche la formation de cristaux de glace capable de léser les membranes bactériennes au cours de la congélation.

III.1.2. Sur milieux sélectifs Il existe divers milieux sélectifs suivant les types de bactéries.  Gélose Chapman Parmi ces milieux d’isolement de S. aureus, on distingue la gélose Chapman. Elle permet de différencier la fermentation du mannitol et comprend comme agent sélectif une forte concentration en NaCl (De Buyser, 1996; Chapman, 1945). Les staphylocoques étant des bactéries halophiles vont survivre tandis que les autres sont inhibées. Au niveau biochimique, c’est donc cette utilisation du mannitol comme source de carbone qui va acidifier le milieu, aidé par un indicateur de pH, ici le rouge phénol. Cette acidification du milieu se traduit par un virage de l’indicateur au jaune.  S. aureus Identification (SAID) Outre le milieu Chapman, on distingue le milieu SAID qui est un milieu chromogène ou discriminant. Cette identification de S. aureus repose sur le principe de coloration 35

verte spontanée des colonies productrices. Ainsi, lorsque le substrat est métabolisé par cette enzyme, le chromogène associé devient chromophore en prenant une couleur particulière, dans notre cas, le vert. C’est un test rapide dont le temps d’incubation varie entre 18 et 24h. Il oriente également l’identification vers les autres espèces : S. saprophyticus en colonies roses, S. xylosus en colonies mauves et S. epidermis en colonies blanches. Les autres bactéries et levures y sont totalement inhibées.

Suite à la culture sur ces milieux, on réalise des tests biochimiques complémentaires pour l’identification.

III.2. Tests biochimiques complémentaires  Test à la catalase Ledit test consiste à mettre une colonie de bactéries en contact avec le peroxyde d’hydrogène (H2O2). La technique consiste à déposer une goutte d’eau oxygénée à laide d’une pipette pasteur sur un support stérile et à y dissocier une colonie de bactéries. Lorsque la colonie contient des bactéries possédant la catalase, ces dégradent le peroxyde d’hydrogène en eau et en dioxygène. Cela est visible à la formation de bulles qui traduit un résultat catalase positive.  Test de la coagulase On se sert le plus souvent de ce test pour la différenciation des espèces du genre Staphylococcus dont essentiellement l’identification des souches de S. aureus.

En effet, elles sont les seules de ce genre à synthétiser cette enzyme, qui est capable de coaguler le plasma de lapin (in vitro). La technique consiste à ensemencer un bouillon de coagulase avec quelques gouttes d’une suspension de la souche à tester.

Sur la base du fibrinogène que contient le plasma, la coagulase (libre) va induire la polymérisation de la fibrine qui se traduit par la coagulation du plasma. Ce résultat est dit coagulase positif et cela oriente le diagnostique vers S. aureus. Si le plasma reste liquide, la réaction est dite coagulase négative et oriente le résultat vers un autre staphylocoque que S. aureus.

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 Mini galerie Api Staph C’est un test permettant l’identification des germes Staphylococcus, Micrococcus et apparentés. Il est constitué d’un ensemble de 20 microtubes comprenant des substrats déshydratés. La colonie de bactéries à analyser est transférée dans un récipient API Staph Medium pour l’obtention d’une solution homogène que l’on distribue dans la galerie. Les puits dénommés ADH et URE sont à maintenir en anaérobiose par le remplissage de la cupule avec de l’huile de paraffine en forme de ménisque convexe.

Après incubation, une goutte de quelques réactifs est ajoutée dans des puits particuliers. On observe des virages colorés qui vont déterminer, selon la succession des couleurs, un code de chiffre. Ce dernier, répertorié dans un annal associé, va permettre d’identifier l’espèce analysée.

III.3. PCR La PCR (Polymerase Chain Reaction ou Réaction de Polymérisation en Chaîne), est une méthode d’amplification génique. C’est une réaction en boucle au cours de laquelle se fait la reconnaissance d’une portion d’ADN par les amorces d’où résulte une multiplication de ses amplicons. A travers son système basé sur la reconnaissance de quantités infinitésimales d’ADN, c’est une technique rapide ayant de bonnes performances globales. Elle est beaucoup plus rapide que la méthode conventionnelle de culture, 18 heures contre 48 heures (deux jours) (Tissari et al., 2010). Découverte en 1985, ses qualités essentielles sont la sensibilité, la spécificité et la rapidité. En effet, cette méthode présente 95% de sensibilité, 99% de spécificité et elle irait même, pour S. aureus résistant (SARM), jusqu’à 100%. L’utilisation de la PCR pour la détection moléculaire de S. aureus est sûrement un moyen diagnostique de choix mais aussi coûteux (Billiald et Goyffon, 1995).

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PARTIE II : ÉTUDE EXPÉRIMENTALE • Cadre d’étude, matériel et méthodes • Résultats • Discussion et recommandations

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Chapitre I : Cadre d’étude, matériel et méthodes I. Cadre d’étude Les sanctuaires ont été sélectionnés sur la base des projets d’étude des zoonoses existant entre l’homme et la faune sauvage. Le CIRMF, qui détient déjà près de 400 PNH via son Centre de Primatologie (CDP), et la plate-forme d’étude, était d’office sélectionné. Le Parc de la Lékédi de Bakoumba (PL) et le Programme Protection Gorille (PPG) ont été ajoutés comme sites de prélèvement

pour des raisons de

proximité (tous localisés dans la province du Haut-Ogooué, figure 9) et pour l’aspect naturel du milieu de vie des PNH qui y vivent.  Le parc de la Lékédi (PL) Précédemment décrit dans la première partie, le parc de le Lékédi offre donc un espace touristique semi- artificiel aux animaux. Ainsi, il faut préciser que les interventions humaines y sont permises (vétérinaire, chercheurs, animaliers) mais puisque certaines espèces sont très agressives (buffles, gorilles, chimpanzés, panthères), les activités à effectuer dans cette enceinte restent très limitées.  Le Centre de Primatologie (CDP) Installé en 1980 dès la création du CIRMF, le CDP occupe 40 ha. Au niveau national, le CDP travaille en collaboration avec l’Agence Nationale des Parcs du Gabon (ANPG) et les Sanctuaires à primates. Dans ce but, il est réalisé de façon périodique, des contrôles sanitaires (pour les animaux vivants saisis des suites de braconnage, lors de nouvelles introductions dans les dits parcs, pour les animaux détenus en captivité dans les sanctuaires). Aussi doté d’un équipement chirurgical, médical et de nombreux experts en primatologie, le CDP intervient dans l’apport des soins aux grands blessés et bien d’autres pathologies propres aux primates. Le CDP dispose d’environ 400 PNH, pour la plupart originaires du Gabon, d'Afrique ou d'Asie. Leur population est régulée par un programme de maîtrise de la reproduction.

Selon les possibilités, les animaux sont maintenus captifs soit en cage individuelle dans des bâtiments de haute sécurité, soit dans de grandes « volières » pouvant héberger une dizaine d'individus selon la taille et la composition des groupes ou encore 39

dans des enclos de semi-liberté de plusieurs hectares. Une équipe d'animaliers, d'éthologues et de vétérinaires assure son bon fonctionnement. Le CDP œuvre depuis quelques années pour l’amélioration des conditions de captivité des primates qu'il élève et dans cette optique, il collecte des fonds pour la réintégration de la totalité de ses sujets en milieu naturel par l’achat de quelques îles à l’ouest du pays.  Programme de Protection des Gorilles (PPG) Projet initial de la Fondation Aspinall (1987), c’est en 1998 que le PPG a vu le jour. Il est abrité au sein des plateaux Batékés, dans la région de la Mpassa, au sud-est du Gabon et s’étend jusqu’au Congo. Les PPG-Gabon ont été assimilés au Parc National des Plateaux Batéké (PNPB) depuis 2002. C’est un espace sauvage avec une intervention humaine très réduite. Globalement, les gorilles y sont très peu dérangés.

N

Figure 9 : Localisation des sites d’étude dans la province du Haut Ogooué.

CDP : Centre de Primatologie, PL : Parc de la Lékédi, PPG : Programme de Protection des Gorilles. Echelle : 1/2750000.

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II. Matériel II.1. Communautés d’hôtes II.1.1. Humains Ce groupe était constitué d’agents de terrain essentiellement représentés par des animaliers, les vétérinaires, les stagiaires du CDP, du PL et des PPG. Ce sont des hommes et des femmes adultes consentants dont les données furent enregistrées sous anonymat. L’individu volontaire se voyait attribuer un code d’identification dont seuls les médecins du centre de santé du CIRMF connaissaient la correspondance. La participation du personnel s’est faite suivant les recommandations du comité d’éthique (autorisation n° PROT N° 0020/2013/SG/CNE).

II.1.2. Primates non-humains (PNH) Le parc animalier du CDP est constitué de PNH endémique au bassin du Congo et de PNH importés d’Afrique ou d’Asie pour les besoins de la recherche. De façon sommaire, le groupe endémique au bassin du Congo est constitué de Gorilles (Gorilla gorilla), Chimpanzés (Pan troglodytes) ; Mangabeys à collier blanc (Cercocebus torquatus) ;

Cercopithèques

(Cercopithecus nictitans

hocheurs

(Cercopithecus

cephus)

et

hybrides

et C. cephus), Mandrills (Mandrillus sphinx). Pour les

espèces importés d’Afrique, nous avons les Vervets (Chlorocebus aethiops), Cercocèbe à crête ou mangabey agile (Cercocebus agilis); Singe roux (Erythrocebus patas) alors que les espèces importés d’Asie se compose essentiellement de macaques crabiers ou cynomolgus (Macaca fascicularis) et macaques rhésus (Macaca mulatta).

Outre ces espèces, le centre dispose de la seule colonie au monde du Cercopithèque à queue de soleil (Cercopithecus solatus) qui présente la particularité de n’exister qu’au Gabon. Les images de la figure 10 présentent certains d’entre eux.

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Figure 10 : Communauté de PNH a. Mandrillus sphinx (source personnelle), b. Gorilla gorilla (source : Image CIRMF), c. Pan troglotydes (source : Image CIRMF), d. Erythrocebus patas (source : fr.wikipedia.org), e. Cercopithecus cephus (source : Image CIRMF), f. Cercopithecus solatus (source personnelle), g. Cercopithecus nictitans (source : Image CIRMF).

II.1.3. Rongeurs Les rongeurs furent capturés à l’aide de pièges géo localisés disposés aux alentours du CDP. Comme recommandés par le CNER, les sujets capturés étaient euthanasiés pour le prélèvement d’organes utilisés dans d’autres volets du projet. De nombreuses espèces furent saisies.

II.1.4. Chiroptères Les Chiroptères utilisés étaient ceux capturés sur les sites d’entreposage de bananes destinés aux PNH et autour des zones de nourrissage. Le diagnostic de l’espèce (morphologique, génétique) était à réaliser à l’issue de chaque capture.

42

II.2. Matériel de capture II.2.1. Des PNH La capture des primates nécessitait une sarbacane ou un fusil (figure 11, r) et des fléchettes anesthésiantes (figure 11, q). Une fiche de capture était également remplie (Annexe 1).

Sarbacane Fusil

Figure 11 : Matériel de capture des PNH. q. fléchettes anesthésiantes de 1 à 1,5 ml de KétamineR ; r. sarbacanes et fusil utilisés pour la teléanesthesie.

II.2.2. Des rongeurs Chez les rongeurs, la capture se faisait à l’aide de piège en alliage (figure 12).

Figure 12 : Piège (Tomahawk) pour rongeurs.

La distribution de ces pièges, s’est faite avec l’usage d’un équipement de géolocalisation communément appelé GPS (Global Positioning System, CSX60, Garmin,

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Taiwan, Chine) ; du ruban est utilisé pour marquer chaque lieu de dépôt ; des pièges Sherman (déclenchement automatique, entièrement fermé, 1,800 dm3) et des piège Tomahawk (déclenchement automatique, piège grillagé, 4 dm3) ; des appâts (noix de palme, arachides, etc) ; des fiches de localisation et des captures quotidiennes (Annexe 2) et stylo ; du fil de fer et une pince métallique ; une machette pour frayer le chemin dans la forêt autour du CDP. II.2.3. Des chiroptères Le matériel se composait de deux (2) filets de capture, des gants en cuir, des sacs en tissus ainsi que des fiches quotidiennes de capture (Annexe 2).

II.3. Matériel de prélèvement Il se compose d’une trousse de prélèvement (pinces, écouvillons stériles pour les prélèvements). Pour toutes les espèces en dehors de l’homme, du matériel de contention chimique (anesthésie) et physique (sacs en tissu, ficelles solides) étaient également utilisés.

II.4. Matériel de laboratoire Le matériel variait en fonction des locaux de travail. Ainsi, les manipulations se sont faites dans des laboratoires différents selon l’organisation interne de la structure et ceci dans le but de minimiser les risques de contaminations lors de l’étude. Un revêtement spécial était obligatoire (combinaison à usage unique, gants stériles, masques à usage unique, des charlottes, etc).

II.4.1. Matériel et milieux de culture Pour la culture, le matériel utilisé était : un bec Bunsen, des anses stériles, un incubateur. A la sortie de chaque laboratoire, un dispositif était aussi utilisé pour le lavage des mains. Outre ce matériel, nous utilisons trois types de boîtes de Pétri pour l’ensemencement des écouvillons :

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 Le milieu Chapman C’est un milieu sélectif d’isolement des bactéries du genre Staphylococcus. Il contient 1 g/L d’extrait de viande de bœuf pour l’apport de facteurs de croissance ; 10 g/L de peptones ; 10 g/L de mannitol ; 75 g/L de chlorure de sodium ; 0,025 g/L de rouge de phénol qui est un indicateur coloré de pH et 15 g/L de gélifiant agar.  Milieu SAID C’est un milieu chromogène de détection spécifique de S. aureus. Il est composé de façon théorique d’un litre d’eau purifiée mélangé à 20,1g de peptones végétale et animale (porcine ou bovine) ; 0,65g de Tris ; 0,53g de mélange chromogène ; 4,1g de mélange sélectif ; 14g de gélifiant agar ; avec un pH à 7,3.  Milieu Trypticase soja C’est un mélange de 5 g/l de peptone papainique de soja, 15 g/l de peptone trypsique de caséine, 5 g/l de NaCl et 15 g/l d’agar.

II.4.2. Matériel de diagnostic moléculaire Le matériel utilisé pour les inactivations des souches et les extractions d’ADN comprenait un bain-marie, des eppendorfs de 1,5 à 2 µL, des pipettes, des cônes stériles de 20, 100 et 1000 µL, des portoirs plastiques, des gants, une blouse, des surchaussures, des masques, des charlottes clip blanche, une centrifugeuse, un kit d’extraction complet. En plus, on disposait de quelques échantillons dont le statut étaient déjà connus (cultures positives, typage des souches : échantillon positif humain, échantillon positif de PNH et échantillon positif de rongeur) que nous utilisions comme témoins positifs lors de la réalisation de la PCR. La salle de préparation du Mix comprenait : un thermocycleur (figure 14), une hotte, une balance, un appareil d’homogénéisation, des réfrigérateurs de stockage.

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Figure 13 : Un thermocycleur programmé pour la PCR spa.

Dans la salle de migration d’électrophorèse, le matériel était constitué des réactifs pour la préparation de gel (agarose, GelRed, Bleu de charge, etc), de cônes stériles, des pipettes, des puits plastiques, une balance, une micro-onde, la verrerie, une cuillère, du papier aluminium, des gants, des bacs de migration corrélés aux générateurs de courants, un dispositif de lecture comprenant un ordinateur et une enceinte à rayons UV. III. Méthodes utilisées III.1. Considérations éthiques En raison de la participation humaine et des espèces protégées classées en annexe 1 de la convention CITES (Convention on International Trade of Endangered Species), ce projet a été présenté au Comité National d’Ethique et de la Recherche du Gabon (CNER). Il a été autorisé sous le numéro PROT N° 0020/2013/SG/CNE. Les rongeurs et les Chiroptères étant consommés localement, le CNER a estimé que les prélèvements réalisés sur eux les rendaient impropres à la consommation. De ce fait, il nous a été recommandé de les euthanasier par la suite. De même, sous la recommandation du CNER, la participation des travailleurs devait être volontaire, les prélèvements devaient être réalisés par des médecins qui avaient pour devoir de retourner les résultats avec au besoin une prise en charge. Les prélèvements devraient également être transmis sous anonymat.

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III.2. Méthodes sur le terrain Notre étude s’est déroulée sur deux ans. Elle débutait en février 2013 et s’achevait en novembre 2015. La récolte des écouvillons s’est faite sur les différentes communautés d’hôte par intervention des unités appropriées.

III.2.1. Capture des PNH La capture des PNH s’est faite par teléanesthesie. Le produit anesthésiant initialement préparé (KétamineR) est disposé dans des fléchettes de 1 à 1,5 ml maintenues sous pression. Il est administré en fonction du poids et de la forme physiologique (insuffisance rénale/hépatique) de l’animal. Ainsi, le critère de survie de l’animal était considéré et pris en compte (0,1mg de kétamine /kg de poids vif ; monitoring post anesthésique). Les prélèvements sont réalisés lors des contrôles sanitaires annuels.

Les sujets sont identifiés par des numéros tatoués sur les cuisses ou sur la poitrine suivant les lignées matrilinéaires.

III.2.2. Capture des rongeurs La capture commence par le déploiement des pièges équipés d’appât à base de noix de palme. Compte tenu de la localisation du PPG (situé dans un parc) et du parc de Bakoumba (PL) qui sont des zones de protection d’animaux, la capture des rongeurs ne s’est faite qu’au CDP. Pour éviter tout biais de capture, les pièges étaient disposés à égale distance à partir de leurs coordonnées GPS comme décrit ci-dessous.  Détermination des coordonnées des points de capture Avec un GPS (CSX60, Garmin,), les points ont été géo-référencés de Google Earth, Mapsource, Excel et des logiciels DNRGPS et CONVERS 3 selon la méthode suivante : Sur le terrain de prélèvement (figure 14), on relevait avec le GPS les coordonnées de deux points de référence suffisamment éloigné dans la zone de capture.

Puis dans Mapsource, à partir du premier point, on traçait une droite puis d’autres droites parallèles de 50 m d’intervalle. A partir du second point, on traçait également

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une droite suivie de ses parallèles espacées de 50m d’intervalle et perpendiculaires aux premières. Le résultat est un quadrillage dont les points sont à équidistance de 50m.

La grille est ensuite directement basculée sur Google Earth où seront identifiées les zones de capture et éliminer les points inutiles situés dans des zones non praticables (bâtiments, enclos, routes, volières, marécages…). Les points retenus sont enfin relevés ainsi que leurs coordonnées GPS (figure 15). La liste des points et leurs coordonnées sont transférées dans le GPS pour le marquage des points sur le terrain et le traçage des trajets en forêt.

Plus tard, le GPS sera connecté au logiciel DNRGPS pour le traitement des coordonnées. Une fois le GPS connecté sur DNRGPS, la liste des coordonnées peut être copiée en TXT puis transférée sur Excel. DNRGPS permet de trier les informations retenues par le GPS pour la récupération des données nécessaires.

Pour le traitement des données, Excel permet de modifier certaines informations parasites pour obtenir une liste définitive des points de capture et leurs coordonnées.

Une fois la liste finalisée, il est important de la réintégrer au GPS, d’où la nécessité du logiciel CONVERS 3 car le passage de ces coordonnées sur Google Earth a entrainé leur modification, il faut alors les reconvertir. Sur CONVERS 3, il est primordial d’effectuer certaines modifications sur les coordonnées GPS en fonction du format (changer le N et le E en + et – pour le format world geodetic system 1984) pour qu’elles puissent être converties. Ce qui nous a permis d’obtenir la répartition des points ci-dessous (figures 14 et 15) :

Figure 14 : Délimitation de la zone de piégeage des rongeurs 48

Figure 15 : Géo-localisation des points de piégeage des rongeurs.

Deux types de pièges à déclenchements automatiques ont été utilisés : ShermanR et TomahawkR. Il s’agit de pièges couramment employés pour la capture des petits mammifères terrestres dont la pose se faisait aux environs de neuf heures en période de capture puis récupérés soit en après-midi lorsqu’un animal était retenu, soit le lendemain matin. En cas de prise, le piège était amené au laboratoire du CDP. L’identification des espèces s’est faite à partir des caractères morphologiques clé (Duplantier, communication personnelle, 2011; Duplantier, 1989).

III.2.3. Capture des Chiroptères Pour les mêmes raisons que celles citées plus haut, la capture des Chiroptères ne s’est faite qu’au CDP. Il s’agit essentiellement d’espèces frugivores qui sont attirées par les bananes et autres fruits (goyaves, mangues…) utilisés pour les PNH. La capture nécessitait l’usage de deux filets à mailles serrées avec poches. La pause des filets était stratégiquement réalisée à proximité des bananes douces suffisamment mûres (figure 16). Pour le second filet, en l’absence de support ou de bâtisse, on utilisait plutôt des pics métalliques d’un mètre placés deux à deux et solidarisés par du sparadrap. On obtenait ainsi deux supports métalliques de deux mètres chacun que l’on enfouissait dans le sol de part et d’autres du goyavier. Les deux extrémités larges du filet furent attachées formant également trois nœuds et trois longues poches horizontales. Placés 49

pendant la journée (J0), la capture se faisait la nuit et la collecte le jour suivant (J1), à 8h du matin.

Figure 16 : Chiroptères pris aux filets devant les bananes destinées aux PNH. III.3. Méthodes au laboratoire III.3.1. Prélèvements III.3.1.1. Prélèvements humains Les prélèvements humains se faisaient à l’aide d’un d’écouvillon stérile tapissé sur la muqueuse nasale. Ils sont réalisés par les médecins du CIRMF et la participation des travailleurs se faisait de façon volontaire comme recommandé par le CNER. Les prélèvements nous sont transmis sous anonymat. Pour le personnel, un retour des résultats était assuré par la même équipe médicale à qui sont transférés les bilans d’analyses et une prise en charge médicale.

III.3.1.2. Prélèvements de PNH Après la contention chimique puis physique (liens au niveau des membres), le prélèvement est réalisé par frottement de l’écouvillon sur la muqueuse nasale en 4 rotations. L’échantillon était ensuite notifié avant d’être conservé au réfrigérateur (environ 4°C) ou appliqué directement à la culture. Pour les sujets prélevés au PPG et au PL, les échantillons récoltés sont notifiés puis placés dans une glacière avec des pains de glaces à températures basses pour le transport.

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III.3.1.3. Prélèvements des rongeurs Le rongeur est transféré dans un sac en tissu correctement noué avec un système de ficelle. Le sac en tissu est ensuite rangé dans un autre sac plastique plus grand où est mis un coton imbibé de formol ou d’halothane. Après inhalation, l’animal est récupéré pour les différents prélèvements. On procédait à l’écouvillonnage par frottement de la partie cotonnée sur la muqueuse de la zone nasale en 4 rotations.

III.3.1.4. Prélèvements des Chiroptères Après la capture, l’animal était euthanasié selon le même procédé que celui employé chez les rongeurs. On procédait ensuite à la prise des mesures morphologiques (figure 17), aux prélèvements des différents d’organes et à l’écouvillonnage par frottement sur la paroi nasale en 4 rotations. On mettait directement en culture les prélèvements ou on les conservait au réfrigérateur à +4°C pendant 24 heures au maximum.

Figure 17 : Prise des mesures morphométriques d’un Chiroptère.

De façon générale, les échantillons sont traités suivant le schéma ci-après (Figure 18) :

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Figure 18 : Schéma général de traitement des échantillons.

III.3.2. Mise en culture Les échantillons sont ensemencés sous forme de stries à quelques centimètres de la flamme (pour éviter tout risque de contamination) sur milieu Chapman. Les boîtes sont par la suite incubées à 37°C pendant 24 h à l’étuve. Les boîtes à mannitol positif présentent des colonies jaunes. Les cultures positives au milieu Chapman sont ensemencées secondairement dans des boîtes contenant un milieu chromogène ou SAID pour l’identification immédiate lorsque celle-ci étaient encore disponibles. Dans le cas échéant, les résultats de Chapman étaient maintenus seuls pour être confirmés ou infirmés lors de la PCR. III.3.3. Réalisation de la PCR La réalisation de la PCR nécessite plusieurs étapes préliminaires à savoir : la désactivation de la bactérie, pour anéantir son effet pathogène, l’extraction de l’ADN et sa conservation.

III.3.3.1. Inactivation des prélèvements L’inactivation s’est faite à haute température en portant l’aliquote de travail (comprenant 1ml de glycérol à 30% et une colonie positive en culture provenant du milieu TS) à 95°C pendant 20 minutes au bain-marie. Pour confirmer l’inactivation, on ensemençait à nouveau pour vérifier qu’aucun isolat ne repousse.

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Figure 19 : En salle d’inactivation et d’extraction d’ADN. III.3.3.2. Extraction d’ADN Le kit d’extraction utilisé était « Thermo scientific molecular biology ». Les aliquotes inactivés étaient transférés dans des eppendorfs (tube conique) de 1,5ml et centrifugés à 6000g pendant une minute (équivalent 8000rpm ; g ou force centrifuge). En conservant le culot, on y ajoutait 190µl de mélange solution tampon de lyse (El Buffer), lysozyme et lysostaphine préparée. Cette première préparation est portée au bain-marie pour être incubée toute la nuit à 37°C. Elle favorise la lyse bactérienne. Le jour suivant, on y ajoutait 20 µl de protéinase K et 200 µl de solution tampon (Buffer Al). Après homogénéisation, le mélange est incubé à 56°C pendant 30minutes tout en remuant toutes les 10 minutes. L’ajout de 20 µl de RNase à l’échantillon suivi du mélange et de l’incubation à température ambiante pour 10 minutes, suivront ensuite l’addition de 400µl d’éthanol à 50%, puis, l’étape du rinçage. La mixture est transférée dans des minis tubes pourvus de membrane (DNeasy Mini spin column) qui sont placés dans des collecteurs de 2ml. Après centrifugation, à 6000g pendant une minute, les collecteurs remplis de liquide sont jetés et remplacés par de nouveaux collecteurs.

Ensuite, 500 µl de la première solution de lavage (ou Buffer AW1 comprenant de l’éthanol) sont ajoutés et le tout est centrifugé à 8000g pendant une minute. Ces seconds collecteurs sont vidés puis conservés. Une solution tampon contenant de l’éthanol appelée Buffer AW2 ou deuxième solution de lavage, est prélevée à 500 µl à son tour pour être ajoutée au mélange. On centrifuge à vitesse maximale de 12000 g pendant 3 minutes pour sécher les membranes contenues dans les DNeasy Mini spin 53

column. Les collecteurs chargés sont jetés à l’arrêt de la centrifugeuse. Pour obtenir de l’ADN, les DNeasy Mini spin column sont placés dans des eppendorfs de 1,5 ml ou étaient faites tour à tour des élutions 50 et 30. En utilisant 50 µl de solution d’élution (Elution Buffer) que l’on déposait directement sur la membrane, on laissait incuber à température ambiante pendant une minute avant de centrifuger à 6000g pendant une minute. Le procédé reprenait pour la dernière élution avec 30 µl. Les extraits d’ADN ainsi collectés étaient conservés à -20°C, au congélateur.

III.3.3.3. Solubilisation des amorces Le couple d’amorces utilisé pour cette PCR était PA1095F (F= Forward c'est-à-dire le brin sens) et PA1517R (R= Reverse c'est-à-dire le brin anti-sens) dont les séquences nucléotidiques sont les suivantes : PA1095F : 5’-AAGACGATCCTTCGGTGAGC-3’ PA1517R : 5’-GCTTTTGCAATGTCATTTACTG-3’ Le but de la solubilisation des amorces étant d’obtenir une solution stock à 100 µmol/l (ou 100pmol/µl). Suivant les recommandations du fabricant, nous avons additionné 208 µl d’eau à 20,8 pmol/µl d’amorce sens (ou brin F) et 304 µl d’eau à 20,5 pmol/µl pour l’amorce anti-sens (ou brin R) de façon à obtenir de nouvelles concentrations.

III.3.3.4. Dilution des amorces Elle permet d’obtenir des amorces à 10 µmol/l à partir de la solution mère obtenue ci haut. Par calcul, on a utilisé la formule Ci.Vi= Cf.Vf

puisque nous disposons

d’amorces à 100 µmol/l avec un volume final (Vf) de 1 ml, une concentration initiale (Ci) de 100 µmol/l, une concentration finale (Cf) de 10 µmol/l. On a donc obtenu par règle de trois un volume initial (Vi) de 0,1ml ou 100 µl. Puis, on prélève 100 µl d’amorces à 100 µmol/l que l’on additionne à 900 µl d’eau pour retrouver le volume final.

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III.3.3.5. Dilution de la solution Mix de Déoxynucleotide (dNTP) Les dNTP sont un mélange de plusieurs DéoxyriboNucléotides TriPhosphates (déoxyadénine triphosphate ou dATP, déoxy-guanine triphosphate ou dGTP, déoxy-cytosine triphosphate ou dCTP et déoxy-thymine triphosphate ou dTTP).

La dilution permet d’obtenir une solution Mix de dNTP à 5mmol/µl. A partir d’une solution préalable de dNTP à 25mmol/µL, les paramètres de calcul sont : Cf= 5 µmol/l, Vf=1ml=1000µl, Ci= 25 µmol/l. Le résultat fut, après multiplication de Cf à Vf et divisé par Ci, de 200 µl pour Vi. Ainsi, on prélève 200 µl de la solution dNTP à 25mmol/µl auxquels on ajoute 800 µl d’eau.

III.3.3.6. Préparation du Mix et distribution dans les plaques L’amplification s’est effectuée à partir du kit « Thermo scientific » et constitué de 2,5 µl de tampon10X ; 1,25 µl d’amorces (PA1095F et PA1517R) à 10pmol/µl ; 1,75 µl de dNTP dilué au 10ième ; 0,4 µl de TAQ polymérase Invitrogen ; 16,85µl d’eau stérile et 2 µl de matrice d’ADN pour un volume final de 25 µl. En complément des réactions de PCR préparées pour les différentes matrices d’ADN (nombre d’échantillons déterminé par le manipulateur), trois tubes supplémentaires sont ajoutés pour les cas suivants : le premier est pour la marge d’erreur de pipetage, un 2e tube faisant office de témoin positif, constitué d’une matrice d’ADN dont on connait le statut d’infection. Le troisième est prévu pour le témoin négatif dans lequel il n’y a pas de matrice d’ADN mais de l’eau stérile.

III.3.3.7. Distribution des échantillons d’ADN Elle se fait à l’extérieur de l’enceinte PCR. On a prélevé 2 µl d’ADN ajouté aux 23 µL de Mix présent dans chaque puits de la plaque.

III.3.3.8. Amplification des séquences Les étapes classiques de la PCR (dénaturation, hybridation, élongation) ont été réalisées par un thermocycleur « Esco Healthcare Swift.Maxpro ». Les étapes de la PCR se sont déroulées sous les conditions suivantes : 10 minutes à 95°C pour la dénaturation longue, [30 secondes à 95°C pour la dénaturation ; 30 secondes à 55

60°C pour l’hybridation ; 45 secondes à 72°C pour la polymérisation] x 40 cycles, 10 minutes à 72°C (pour l’élongation) puis infiniment à 4°C. La suite de la PCR s’est faite en salle de migration par la réalisation d’électrophorèse.

III.3.3.9. Electrophorèse Les amplicons de PCR obtenus ont été faits migrés sur un gel d’agarose à 1.5% mélangé au Tris Borate EDTA (TBE) à 0,5 X. La préparation du gel nécessitait une pesée de 1.5g d’agarose auquel il fallait ajouter 100 ml de TBE 0,5 X (ou 3g d’agarose pour 200 ml de TBE 0,5X) et bien homogénéiser le mélange avant de le mettre dans un four à micro-ondes pour le chauffage à 3 minutes puis laisser tiédir.

On y ajoutait 4 à 5 µL de GelRed (intercalant d’acide nucléique colorant qui sous la lumière UV fluoresce avec une couleur orange et s’intensifie fortement après liaison à l’ADN) avant de laisser polymériser environ 20 minutes dans un bac contenant des peignes (qui laissent des marques ou des puits dans le gel solidifié) utiles pour le dépôt. Le gel est ensuite placé dans une cuve à électrophorèse puis, à l’aide d’une pipette, 10 µl de chaque amplicon (échantillons d’ADN, témoins positif et négatif) préalablement mélés à 2 µl de Bleu de Charge ou de Blue orange étaient déposés dans des puits individuels. Ces puits sont intercalés par un dépôt du marqueur de poids moléculaire (PM) DNA ladder 100 pb dilué avec du Bleu de charge (10 µl). La migration s’est faite pendant 45 minutes à 100 volts. Compte tenu de la charge négative de la molécule d’ADN, le dépôt s’est fait du côté de la borne négative (noire) de sorte à laisser la molécule migrer vers la borne positive (rouge) (Figure 20).

Après la migration, le gel d’agarose (de 1.5%) est placé sur une plaque à ultra-violet Trans-illuminateur émettant des ondes de 312 nm dans une enceinte à rayons UV. L’enceinte est connectée à un appareil photo qui est, lui aussi, connecté à un écran (d’ordinateur) et une imprimante. Ce dispositif permet la visualisation des produits de PCR par fluorescence (figure 20) sous forme de cliché.

56

x

y

z

Figure 20 : De l’électrophorèse à la lecture. x. Bac électrophorétique et générateur de courant ; y. Gel d’agarose placé dans le Tans-illuminateur ; z. Dispositif de lecture du gel.

III.3.4. Traitement des données III.3.4.1. Principe de lecture des cultures  Milieu Chapman La culture positive sur Chapman se traduit l’apparition de colonies (jaunâtres). On dit de ce résultat qu’il est Chapman positif. Lorsque le milieu, préalablement rouge, vire au jaune cela correspondant à l’acidification du milieu par réduction du mannitol : on parle de mannitol positif. Pour notre étude portant sur S. aureus, les colonies jaunes (suspicion de colonie Staphylococcus) sont repiquées sur un autre milieu. La figure 21 est la présentation d’un milieu non ensemencé et d’un milieu Chapman positif mannitol positif.

Chapman +

Mannitol + a

b Figure 21 : Milieux Chapman

a. Milieu non ensemencé ; b. Milieu Chapman et mannitol positifs.

57

 Milieu SAID Les colonies jaunes du milieu Chapman sont repiquées à l’aide d’une anse par des striations sur le milieu SAID pour l’identification des colonies S. aureus. Dans ce milieu, les colonies productrices d’alpha-glucosidase deviennent vertes et indiquent un résultat positif (suspicion de colonie S. aureus) après une durée d’incubation est de 48h (figure 22).

Suspicion de S. aureus

a

b

Figure 22 : Milieux SAID a. Milieu non ensemencé ; b. Présence de colonies vertes du SAID positif.  Milieu TS La culture sur ce milieu nous permet de multiplier les colonies de S. aureus recherchées. Après 24h (à 37°C), on obtient des cultures amplifiées selon le model de stries dessiné.

a

b Figure 23 : Milieux Trypticase soja

a. Milieu non ensemencé ; b. Présence de colonies amplifiées.

58

III.3.4.2. Principe de lecture de la PCR Lors de la recherche des S. aureus par la méthode de PCR, les bandes révélées par les UV allant de 150 à 500 paires de base sont considérées positives selon le protocole d’extraction. La figure 24 est un cliché obtenu à l’issue de la PCR. Elle présente les résultats de l’électrophorèse après migration sur le gel d’agarose (fleche vers le bas) de chaque échantillon déposé dans les differents puits ou démarquation des peignes dans le gel solidifié (A). Les échantillons positifs présentent la bande recherchée (150 à 500 bp) correspondant au gène Spa.

A

A

A

Figure 24 : Clichés obtenus après migration sur gel d’agarose.

PM : poids moléculaire ; T+ : témoin positif ; T- : témoin négatif ; + : échantillon positif.

III.3.4.3. Logiciels et analyses statistiques Les données recueillies ont été compilées sur un tableau Excel puis après dépouillement ont été ordonnées. Les effectifs et prévalences ont été comparés, au seuil de 5%, par le test de khi-2 et les statistiques à partir du logiciel R (version R.2.7.2). Pour des effectifs inférieurs à 5, une correction de Yates a été appliquée par utilisation du test exact de Fisher. Les références bibliographiques ont été gérées avec le logiciel EndNote (version X7).

59

Chapitre II : Résultats I. Résultats de la capture et des prélèvements I.1. Espèces de rongeurs et de Chiroptères capturés La figure 25 illustre la diversité d’espèces capturées lors de cette campagne.

Figure 25 : Quelques rongeurs du CDP h.

Rattus

rattus,

i

k. Mastomys natalensis,

et

m.

Lephuromys

nudicaudus,

j.

l. Lemniscomys stiatus.

La figure 26 illustre la diversité des sujets capturés.

a

c

b

Figure 26 : Chiroptères capturés au CDP. a. Epomops franqueti ; b et c. espèces à identifier.

60

Praomys

sp,

I.2. Résultat global Au cours de cette étude, le nombre d’échantillons obtenu était de 1393. Cependant, par défaut d’étiquetage et de conservation, seulement 1270 échantillons ont été exploités.

Cette étude est basée sur le nombre d’échantillons obtenu plutôt que sur le nombre d’individus prélevés.

La répartition générale des différents groupes de notre échantillonnage était de 85 échantillons humains soient 6,69% ; 625 échantillons de PNH (49,21%) ; 413 échantillons de rongeurs (32,51%) et 147 échantillons de chiroptères (11,57%) (Figure 27). Soit un total de 1185 échantillons de rongeurs, chiroptères et PNH à l’issue de la capture.

%

%

%

%

Figure 27 : Distribution des échantillons traités par type d’hôte.

I.3. Rapport échantillons prélevés et utilisés I.3.1. CDP Ce site comprend les quatre (4) modèles d’hôtes répartis comme suit :  Les PNH Parmi les 625 échantillons utilisés au CDP, 573 représentent la portion des prélèvements de PNH (91,68% soit 573/625). De façon descriptive, Les prélèvements 61

de PNH issus de l’espèce Mandrillus sphinx étaient les plus exploités (89,95% soit 376/418) suivi des Macaques (97,70% soit 85/ 87) et des chimpanzés (94,25% soit 82/87 (Tableau I).

Tableau I : Bilan des prélèvements par espèce de PNH au CDP Groupes

Echantillons

NA*

récoltés

Echantillons

%

utilisés

Pan troglodytes

87

5

82

94,25

Cercopithecus cephus

5

3

2

40

Cercopithecus solatus

12

0

12

100

Cercocebus

2

0

2

100

Chlorocebus aethiops

9

0

9

100

Macaca

87

2

85

97,70

Mandrillus sphinx

418

42

376

89,95

8

3

5

62,5

625

55

573

91,68

Gorilla gorilla TOTAL NA*= Non analysé  Les rongeurs

Nous avons capturé au total 413 rongeurs dont l’identification d’espèce était basée sur une diagnose de caractères morphologiques. L’espèce majoritairement capturée est Rattus norvegicus (24,45% soit 101/ 413) suivi de Lemniscomys striatus (22,27% soit 92/413) et Praomys sp (21,79% soit 90/413). Comme le montre le tableau II, tous les prélèvements de rongeurs ont été traités.

62

Tableau II : Bilan de la capture et des échantillons analysés chez les rongeurs.

Espèces

Echantillons

NA

Echantillons Pourcentage

récoltés

utilisés

(%)

Lephuromys nudicaudus

52

0

52

100

Praomys sp

90

0

90

100

Mastomys natalensis

38

0

38

100

Rattus rattus

34

0

34

100

Rattus norvegicus

101

0

101

100

Lemniscomys striatus

92

0

92

100

Lemniscomys barbarus

3

0

3

100

Non identifié

3

0

3

100

413

0

413

100

TOTAL

 Les Chiroptères L’espèce majoritairement obtenue était Epomops franqueti qui est une espèce frugivore. La diagnose est également basée sur des caractères morphologiques quand bien même certaines espèces restent à identifier. Par défaut de conservation, les 78,19% des prélèvements ont été exploités soit 147 échantillons parmi les 188 récoltés (Tableau III).

Tableau III : Bilan des prélèvements et de l’analyse des échantillons chez les chiroptères.

Espèces

Echantillons récoltés

NA

Echantillons Pourcentage utilisés

(%)

Epomops franqueti

159

32

127

79,87

**En cours d’identification

29

9

20

68, 96

TOTAL

188

41

147

78,19

** : Analyse génétique en cours pour la spéciation

63

I.3.2. PPG Il s’agit d’un programme exclusivement axé autour des gorilles (de par sa définition).

Pour éviter toute interférence avec les sujets déjà relâchés, nous n’avions travaillé que sur le groupe en voie de réintroduction qui ne comptait que quatre (4) sujets. La totalité des 4 prélèvements fut analysée.

I.3.3. Parc de la Lékédi (PL) Au PL, la capture a porté sur les PNH uniquement. Les Chimpanzés constituent l’espèce majoritairement prélevée (42/65 soit 64,61%) contre 08 prélèvements de gorilles dont 6 ont été traités (soit 75%). Les prélèvements d’un cercopithèque et d’un Mandrills pris à l’occasion n’ont fait l’objet d’aucun traitement (Tableau IV) Tableau IV : Bilan des prélèvements issus du PL. Espèces/

Echantillons

Groupes

récoltés

Pan troglodytes

65

C. solatus Mandrillus

NA

Echantillons Pourcentage utilisés

(%)

23

42

64,61

1

1

0

0

1

1

0

0

Gorilla gorilla

8

2

6

75

TOTAL

77

27

48

62,37

sphinx

II. Résultat d’analyses des écouvillons II.1. Résultats généraux de la cultures et la PCR II.1.1. Résultats généraux de la culture Le traitement des échantillons par culture s’est fait sur Chapman puis sur le milieu SAID (majoritairement). A l’issue de ce processus de culture, nous avons obtenu 762 échantillons positifs (60 %) sur les 1270 analysés (avec moins de 10 échantillons non traités par SAID).

64

Suivant le type d’hôte, et sans tenir compte des lieux de prélèvements, notre étude a révélé que le nombre d’échantillons de chiroptères ensemencés positifs étaient de 113 sur 147 soit 76,87%. Chez les PNH 388/625 prélèvements étaient positifs (62,08%) contre 220/413 chez les rongeurs (53,26%) et 41/85 chez les humains (48,24%). Les chiroptères sont significativement plus infectés (p= 7,49.10-7) que les autres espèces (Figure 28 et Tableau V).

Hôtes

Pourcentage des positifs

Figure 28 : Résultats de cultures par type d’hôte II.1.2. Résultats généraux de la PCR Après les différentes étapes de réalisation de PCR et de lecture, nous avons obtenu de nombreux clichés. La révélation du gel de migration nous a permis de compter 446 échantillons positifs sur 762 analysés par la méthode de PCR (58,53 %).

Le taux de portage de S. aureus exprimé par les Hommes est de 68,29% (28/41) contre 64,69% des PNH (251/388), aux 56,36% des rongeurs (124/220) et aux 38,05% des chiroptères (43/113) (Tableau V). Toutefois, bien qu’à priori plus représentatif, le portage humain n’est significativement pas plus important (p= 4,35) que ceux des autres populations d’hôtes.

65

Tableau V : Présentation sommaire des résultats tous sites confondus.

Culture

PCR Spa

+

-

N

%

+

-

N

%

Humains

41

44

85

48,24

28

13

41

68,29

PNH

388

237

625

62,08

251

137

388

64,69

Rongeurs

220

193

413

53,26

124

96

220

56,36

Chiroptères

113

34

147

76,87

43

70

113

38,05

Total

762

508

1270

60

446

316

762

58,53

N : effectif total, + : échantillons positifs, - : échantillons négatifs ; % : pourcentage des positifs.

La figure 29 montre les pourcentages des échantillons positifs obtenus chez les différentes espèces de l’étude en relation avec le tableau V. Hôtes

Pourcentages de positifs

Figure 29 : Résultats positifs à la PCR par type d’hôtes.

66

II.2. Présentation des résultats de culture et de PCR par sites Les résultats de culture présentés sont compilés avec ceux de PCR (Tableaux VI à VIII).

II.2.1. CDP  Taux de positivité obtenu par culture et type d’hôte Au CDP, les cultures positives représentent 62,14% (727/1170) de la cohorte. On note également que dans ce site, plus de la moitié des échantillons a été analysée et trouvée positive (Tableau VI). On a obtenu 113 positifs sur 147 chez les Chiroptères (76,87%) ; 373 positifs sur 573 chez les PNH (65,09%) ; 21 positifs sur 37 chez les humains (56,76%) et 220 positifs sur 413 chez les rongeurs (53,26%). Ainsi, les chiroptères sont significativement plus infectés (p= 1,40.10-6) que les autres hôtes.  Taux de positivité obtenu par la PCR et par type d’hôte Lors de notre analyse PCR, l’ensemble des prélèvements du CDP était estimé à 727 obtenus après la culture. La révélation de nos gels montre que 427 prélèvements étaient positifs (58,73%). On a obtenu 17 positifs sur les 21 analysés chez les humains (80,85%) ; 243/373 chez les PNH (65,14%) ; 124/220 chez les rongeurs (56,36%) et 43/113

chez

les

chiroptères

(38,05%)

(Tableau

VI).

Les

humains

sont

significativement plus infectés (p=7,75.10-7) que les rongeurs, les PNH et les Chiroptères.

Tableau VI : Taux de positivité obtenus au CDP. Culture

PCR Spa

+

-

N

%

+

-

N

%

Humains

21

16

37

56,76

17

4

21

80,85

PNH

373

200

573

65,09

243

130

373

65,14

Rongeurs

220

193

413

53,26

124

96

220

56,36

Chiroptères

113

34

147

76,87

43

70

113

38,05

Total

727

443

1170

62,14

427

300

727

58,73

67

II.2.2. PPG  Taux de positivité obtenu par la culture et type d’hôte Au PPG, seuls les échantillons humains ont été testés positifs à hauteur de 6 sur 14 soit 42,86%. Aucun des 4 prélèvements de gorille ne s’est révélé positif (Tableau VII).

Cette différence de répartition du portage de S. aureus n’est pas significative (p=0,11).  Taux de positivité obtenu par la PCR et type d’hôte Au total nous avons obtenu 66,67% d’échantillons positifs à la PCR. Il s’agissait de prélèvements humains dont 4 positifs sur les 6 traités. Parmi ces analyses, aucun prélèvement de gorille du PPG n’a été utilisé puisqu’étant négatifs à la culture (Tableau VII).

Tableau VII : Taux de positivité obtenus au PPG. Culture

PCR Spa

+

-

N

%

+

-

N

%

Humains

6

8

14

42,86

4

2

6

66,67

PNH

0

4

4

0

NA

NA

NA

NA

Total

6

12

18

33,33

4

2

6

66,67

II.2.3. Parc de Lékédi (PL)  Taux de positivité obtenu par la culture et type d’hôte Au total, nous avons obtenu 29 positifs sur 82 échantillons mis en culture (35,39%).

Suivant la nature de l’hôte, nous dénombrons 14 échantillons positifs humains sur 34 (41,18%) contre 15/48 de PNH (31,25%) (Tableau VIII). Il n’y a aucune différence significative de portage entre les échantillons humains et PNH testés (p = 0,35).  Taux de positivité obtenue par la PCR et type d’hôte Quinze (15) échantillons positifs ont résulté de cette PCR sur l’ensemble des 29 prélèvements reçus du parc de la Lékédi (51,72%). Les taux obtenus à l’issue de l’électrophorèse révélatrice sont : 50% (7/14) pour les prélèvements humains contre

68

53,33% (8/15) pour les PNH (Tableau VIII). Il n’y a aucune différence significative de portage entre les sous-populations humaine et de PNH (p= 0,85).

Tableau VIII : Taux de positivité obtenus au PL. Culture

PCR Spa

+

-

N

%

+

-

N

%

Humains

14

20

34

41,18

7

7

14

50

PNH

15

33

48

31,25

8

7

15

53,33

Total

29

53

82

35,37

15

14

29

51,72

III. Comparaison des taux de positivité en fonction des localités III.1. Taux de positivité obtenue par la culture et type d’hôte Lorsqu’on compare la distribution des échantillons positifs par site et par type d’hôte, on constate qu’il n’ya aucune différence entre les taux de portage humain au CDP, PPG ou PL (p= 0,383) (Figure 30). A l’opposé, les PNH du CDP sont significativement plus exposés que ceux du PL (p= 7,74.10-7).

Taux de positifs

Populations de Primates

Figure 30 : Comparaison de cultures positives des primates en fonction des sites.

69

III.2. Taux de positivité obtenue par la PCR et type d’hôte Comme pour les résultats de culture, il n’y a aucune différence significative du nombre de prélèvements confirmés positifs dans la population humaine du CDP, PL et PPG (p= 0,16) (Figure 31). De même, on n’enregistre aucune différence au niveau des prélèvements de PNH testés par PCR (p = 0,34).

Taux de positifs

Populations de Primates

Figure 31 : Comparaison des PCR positives des primates en fonctions des sites

70

Chapitre III : Discussion et recommandations I. Discussion I.1. Matériel et méthodes I.1.1. Contexte Les grands singes sont les animaux en voie de disparition (Poulsen et Clark, 2004; Kormos et al., 2003; Wilkie et al., 2000). Le Gabon et le Congo constituent l’un des plus grands refuges de chimpanzés avec leurs quelques 80 000 individus (Oates, 1996). Dans cette optique, 13 parcs nationaux ont été répartis sur l’ensemble du territoire gabonais. Pour éviter une probable extinction des grands primates, il est important que les questions liées à leur conservation soient une préoccupation majeure pour les pays concernés. Cependant, compte tenu de la proximité génétique existant avec l’homme, on ne saurait parler de conservation de PNH sans prise en compte du volet santé. En effet, sans dispositions sanitaires et suivi appropriés, les sanctuaires de PNH peuvent constituer des carrefours de zoonoses aux conséquences imprévisibles.

C’est pourquoi ; le rôle du vétérinaire en faune sauvage dans les parcs et autres aires de conservation paraît fondamental tant pour la gestion de la faune que celui de la mise en place, en amont, de politique de santé via l’épidémio-surveillance. La meilleure politique de santé n’est-elle pas la prévention ?

I.1.2. Cadre d’étude Notre étude est une enquête ciblée au sud du Gabon. A ce niveau, le choix des lieux de prélèvements était lié à plusieurs aspects. Le premier aspect porte sur les espèces animales rencontrées. L’étude des micro-organismes transmissibles entre l’homme et les PNH étant le fil conducteur de cette œuvre, le choix des sanctuaires était d’abord associé à la présence des PNH dans chacun des milieux puis à la contribution humaine qui y est affectée.

Un autre critère pris en compte est la répartition des sites. En effet, le rapprochement des trois sanctuaires a facilité l’usage des différents sites de collecte. Ce sont trois « réserves » que l’on retrouve au sud du pays, dans la province du Haut-Ogooué.

71

Le troisième aspect concerne le type d’espace de vie pour les animaux. Ainsi, le PPG offre un milieu neutre et sauvage où les animaux vivent en totale liberté. Le CDP est un centre de conservation urbain d’habituation dont une partie est sous forme de Zoo avec les volières et l’autre en semi-liberté (enclos). Le PL est quant à lui un espace semi-naturel puisque les animaux vivent dans un parc entièrement clôturé.

Selon les trois types de sanctuaires, l’homme intervient à des degrés variés ; c’est notre dernier aspect de sélection. Hormis les travailleurs (vétérinaire, animaliers, techniciens), une forte participation de touristes est enregistrée au PL, bien que les rapports soient très restreints avec les animaux. Au CDP également, on note une fréquence élevée des visiteurs contrairement au PPG où la présence et les contacts humains-PNH sont quasi inexistants. C’est d’ailleurs pourquoi notre étude à ce niveau n’a été faite que sur des gorilles en voie de réintroduction.

I.1.3. Matériel biologique La population d’hôtes composée des sous-populations humaine, de PNH, de rongeurs et de Chiroptères était une donnée variable d’un site à l’autre. Au CDP, les quatre (4) communautés étaient présentes. Les captures des rongeurs et des chiroptères, lesquelles ont été ajoutés au projet d’étude préalable des germes transmissibles entre l’homme et les PNH, s’expliquent par leur proximité avec ces deux hôtes. En effet, nous avons constaté que les hommes, les rongeurs et les chiroptères viennent se nourrir dans les réserves alimentaires prévues pour les PNH (bananes, goyaves, tomates, arachides, manioc… et même au niveau des arbres fruitiers). Outre ce constat, les rongeurs et les chiroptères entrent aussi directement en contact avec les PNH puisqu’ils se nourrissent également de débris d’aliments en volières et en zones de nourrissage (dans les enclos). Du fait qu’ils viennent souvent autour des habitations, ils rentrent également en contact avec les humains ou des objets utilisés par ces derniers.

Les rongeurs et des Chiroptères étaient euthanasiés comme conseillé par le CNER gabonais du fait qu’ils constituent une source de protéine pour les populations autochtones. Leur manipulation à but scientifique (puce, prélèvement) les rendrait impropres à la consommation. Ce procédé a ainsi permis de prélever du matériel biologique (organes) pour d’autres études réalisées au CIRMF sur la recherche 72

d’éventuels virus et bactéries rencontrés chez l’hôte capturé. Par contre, eu égard au contexte de conservation assignée aux parcs (aires de conservation par définition, aucun prélèvement possible) du PPG et du PL, chacun de ces sites n’a comptabilisé que deux (2) types d’hôtes : les PNH et l’homme.

I.1.4. Laboratoire  Notion de culture Les écouvillons étaient réalisés au niveau des muqueuses nasales où s’installent préférentiellement S. aureus (Spendlove et Fannin, 1983). Ensuite, les prélèvements ont été directement ensemencés sur Chapman puis repiqués en milieu SAID lorsque l’échantillon était mannitol positif. Outre ce schéma et en dépit de la disponibilité des milieux SAID, il est arrivé que certains échantillons positifs à la culture sur Chapman ne puissent pas être repiqués dans le milieu SAID. De ce fait, nous avons groupé tous les résultats issus des différentes pratiques d’ensemencement (résultats définitifs de SAID et résultats uniques de Chapman) sous le vocable « culture ». Une présentation différente des résultats aurait pu être formulée pour indiquer à chaque niveau de traitement la prévalence du portage des staphylocoques à l’issue de la culture par Chapman d’abord puis la prévalence du portage de S. aureus issue de la culture par SAID chez les différentes communautés d’hôtes en fonction des sites. Mais dans le souci de la gestion et l’interprétation des résultats particulièrement axés autour de la PCR, il nous a paru commode de procéder selon le schéma retenu.  Déficit en matériel La difficulté majeure rencontrée au laboratoire était liée au manque du matériel. Il est souvent advenu que l’un des éléments du kit d’extraction s’épuise, un réactif ou un milieu de culture. Lorsque le milieu Chapman était épuisé, cela allongeait la durée des écouvillons au réfrigérateur. Au delà de 48 heures, les échantillons étaient écartés de l’étude : ce sont les prélèvements non analysés. Environ 123 échantillons, soit 8,82% des prélèvements totaux, ont été écartés par défaut d’identification (étiquetage) et la conservation des échantillons. Cet handicap était particulièrement lié aux différents intervenants ayant contribué à ce projet qui a, en réalité, débuté en 2013. Huletsky et

73

al. (2005), écartaient également certains écouvillons pour l’analyse PCR de S. aureus.

Il le fit sans en préciser le nombre de perte (Huletsky et al., 2005).

Aussi, le milieu SAID, qui permettait de resserrer le tri des S. aureus, était parfois épuisé. Vu la précocité de cette méthode dans le schéma de traitement des écouvillons, il était difficile de rattraper ce manque dans l’immédiat. Lorsque les boîtes contenant le milieu SAID étaient épuisées, les colonies d’échantillons positifs à la culture par Chapman étaient automatiquement transférées dans le milieu Trypticase soja.

Cependant, le nombre de ces échantillons n’était pas important. Pour les éléments constitutifs des kits d’extraction d’ADN ou les réactifs de la PCR, les commandes se faisaient essentiellement en Europe. Les échantillons conservés au congélateur pouvaient « attendre » que le matériel soit à nouveau disponible. De même, certains tests tel que celui de la catalase, les galeries Api Staph, étaient utilisés préalablement dans ce travail mais pour la même raison d’indisponibilité, nous avons retiré ces étapes pour nous porter uniquement vers la PCR comme moyen de confirmation.  La détection par PCR La PCR a été réalisée pour repérer le gène spa et établir une discrimination basée sur le génotype des souches. Parce qu’elle est plus spécifique et bien plus sensible que la culture (Nguyen Van et al., 2006), la PCR nous a aussi permis de clôturer cette étape préliminaire du projet global avant d’envisager la suite de l’étude (séquençage du gène spa). Cependant le gène spa, présent à plus de 90% chez les souches de S. aureus, laisse aussi littéralement une marge d’environ 10% aux autres souches de S. aureus qui ne possèdent pas ce gène. Ce qui est une limite à notre moyen de confirmation par PCR. Ensuite, dans le but d’amplifier la détection du gène spa, le même nombre d’écouvillons aurait pu être appliqué à la fois à la culture et à la PCR. Dans ce sens, nous aurons pu établir une comparaison entre ces deux méthodes. Mais pour des raisons liées au financement du matériel, il nous a semblé plus aisé de faire un tamisage à l’aide de la culture et confirmer les positifs par PCR. Puis, l’objectif du projet étant la caractérisation génétique des souches en circulation et non la comparaison des méthodes, nous n’avons donc pas développé ce volet.

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I.2. Discussion des résultats I.2.1. Prélèvements Les individus prélevés représentent en grande partie les PNH (625 soit 49,21% de l’échantillonnage). Ce qui s’explique par le fait que l’accent était essentiellement porté sur eux et que ces sanctuaires leur sont dédiés (logement, soin, reproduction).

La qualité non négligeable des prélèvements de rongeurs (413 soit 32,51% des échantillons) témoigne de leur forte présence sur le site. Ainsi, ils véhiculent des bactéries et virus puisqu’ils en sont porteurs (Owen, 1992). Il en est de même pour les chiroptères dont les vols de nuit se font de plus en plus fréquemment autour du CDP. Plusieurs se sont installés dans la toiture du centre, ce qui témoigne de leur forte proximité avec les PNH et les autres communautés d’hôtes rencontrées sur le site.

Par contre en ce qui concerne les humains, on note une faible implication (6,69%). Il faut préciser que ce manque de contribution n’est en rien lié à la quantité de la main d’œuvre qui est rencontrée dans les sanctuaires de PNH mais au manque de volontariat. Certains exprimaient une gêne quand au type de prélèvement. D’autres refusaient tout simplement de participer à des protocoles de recherche. Dans le projet global de PhD dans lequel cette étude est une partie préliminaire, l’implication humaine était plus marquée. Ceci est sans nul doute lié aux exposés (séminaires, stages de formations, protocoles de recherche, réunions quotidiennes de service) présentant les risques d’infections dues aux germes pathogènes contractés pendant le service.

I.2.2. Culture A l’issue de la culture des différents prélèvements, il en ressort que, pris dans l’ensemble, les Chiroptères (76,87%) sont significativement plus infectés que les autres espèces au seuil 5% (p= 1,40.10-6). Epomops franqueti qui est l’espèce majoritairement capturée (127/147) de ce groupe, exprime donc un portage élevé à S. aureus. Moreno et al. obtenaient en 1974, sur 100 espèces de Desmodus rotundus (Chiroptères) capturées à Sao Paulo au Brésil, via l’analyse de fèces, 20% de Staphylococcus (Moreno et al., 1974). Constantine et al. rapportent en 1988 pour une étude similaire menée par Moreno en 1975, un portage de 56% de Chiroptères positifs à S. aureus (Constantine et al., 1988). Cette différence de rendu est sûrement due aux 75

écarts liés aux méthodes d’analyses utilisées. Par ailleurs, notre étude ne nous a pas permis de sélectionner un seul hôte en particulier comme ce fut le cas dans les études antérieures. La collecte s’est faite de façon hasardeuse et tous les Chiroptères pris au filet étaient automatiquement intégrés au projet de recherche.

I.2.3. Résultats de PCR Les résultats de PCR montrent un renversement de la pyramide établie sur la base des résultats de la culture. Les humains sont les plus infectés avec 68,29% (p<0,05). Leur portage est significativement plus important que celui des autres espèces. Ce portage atteint les 80,85% au CDP ; 66,67% au PPG et descend à 50% pour la population du PL. De nombreuses études, faites sur les hommes telles que celle portant sur la population des Pygmées Babongo du Gabon, habitants des forêts, montre un portage de S. aureus à 33% (Schaumburg et al., 2011). Ce qui diffère de celui obtenu dans notre travail. Ce fort taux de portage obtenu dans notre étude peut s’expliquer par la taille de notre échantillonnage qui parait faible alors que les autres études comparées ont des cohortes plus importantes. Une comparaison plus approfondie prenant en compte le mode de vie des populations, les comportements à risque et d’autres aspects socio-écologique pourrait objectivement permettre de mieux expliquer ces différences de portages observés entre notre étude et celles citées en comparaison. Toutefois, pour établir un parallèle avec l’étude de Schaumburg et al. de 2001 notamment, on peut suggérer que si les populations humaines des zones urbaines sont plus exposées (information non affirmée), c’est que le niveau d’anthropisation est un facteur de risque. En effet, certains travailleurs des PPG vivent à la capitale provinciale (Franceville) ainsi que ceux du CDP contrairement à ceux du PL qui vivent dans un village (Bakoumba). Cependant, la différence de taille de ces différentes cohortes ne nous permet pas cette comparaison de façon objective et nous limite à un simple à priori.

Nos données montrent aussi que 56,36% de rongeurs sont positifs. Ce résultat est proche de celui de l’étude de Seguin effectuée sur des rats d’égouts à (53%) (Seguin et al., 1986). Ceci est sans doute lié au fait que comme pour l’étude de Séguin, Rattus norvegicus était l’espèce la plus rencontrée. Bien que notre étude ait porté sur un plus 76

grand nombre de prélèvements et que les milieux de vie paraissent totalement différents entre les rats d’égouts de Lyon et les rats capturés en zone péri-urbaine du CDP, le rapprochement des résultats pourrait signifier que les milieux d’infestation sont similaires sinon un peu plus dangereux aux alentours du CDP. Les rongeurs se réfugient au sous-sol du CDP, dans les conduits de canalisation, dans les systèmes d’évacuation des déchets des volières, dans la forêt avoisinante. Ils peuvent fréquenter tous les lieux à risque sur le campus du CIRMF lorsqu’ils sont à la recherche de nourriture.

Le portage de nos PNH (54,85%) présente une légère baisse par rapport aux données obtenues par Schaumburg et al. (2012a). En effet, ces auteurs avaient une cohorte de 95 PNH (64 échantillons de petits singes et 31 de grands singes) dont 58 échantillons étaient positifs à l’analyse par PCR (61,05%). Bien qu’une certaine diversification des sanctuaires ait été planifiée dans la récolte de nos échantillons tous originaires de la zone sud-est du Gabon, l’étude de Schaumburg intègre à la fois la diversité de pays et de sanctuaires à PNH puisque leurs prélèvements provenaient de la Côte d’Ivoire et du Gabon. Cela pourrait expliquer le décalage entre les résultats.

Pour les chiroptères, la PCR a révélé 38,05% d’échantillons positifs. Ce résultat est nettement plus élevé que celui obtenu par Akobi et al. (2012). En effet, sur 560 échantillons fécaux de Chiroptères prélevés au Nigeria, 107 (soit 19,10%) étaient des isolats positifs à S. aureus. Cela pourrait être dû au fait que notre travail était plus porté sur Epomops franqueti (Chien volant à épaulettes blanches) tandis que le leur ciblait entièrement Eidolon helvum (Roussette paillée africaine).

La différence de résultats de la PCR avec ceux de la culture, où les chiroptères étaient plus importants (76,87%), est fort probablement due aux amorces de synthèse nonspécifiques aux différents hôtes sur lesquels notre étude a porté. Kortbaoui et al.

(2009) présentaient une situation similaire. Ses travaux de PCR sur des espèces différentes s’accompagnaient d’une préparation méticuleuse de chaque amorce en tenant compte des différences génétiques de chaque locus de gène recherché liée à son échantillonnage. Nos amorces provenaient comme à l’accoutumée d’instituts de fabrications agréés basés sur des bactéries isolées dans les hôpitaux et particulièrement sur les humains.

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I.3. Comparaison des taux de positivité par site Comparés ensemble, les effectifs d’échantillons positifs chez les humains n’ont montré aucune différence significative qu’il s’agisse du PPG, du CDP ou du PL (p=0,38) après la culture et la PCR. Ceci indique que les humains sont infectés indépendamment du site sur lequel ils travaillent. Il s’agit peut-être d’un portage endogène qui ne varie pas avec le sanctuaire de prélèvement ou d’une contamination en relation avec les habitudes de vie (hygiène corporelle, hygiène de l’habitat…).

Chez les PNH, par contre, la différence est importante (p<0,05). Les populations du CDP (65,14%) sont plus infectées que celles du PL (31,25%) et plus infectées à leur tour que celles du PPG (0%) à la culture. Cela montre que les animaux du CDP sont plus exposés aux staphylocoques que ceux des autres sanctuaires et pourrait s’expliquer par les espaces de vie restreints (cages, volières) chez les PNH du CDP totalement opposés aux grands espaces des animaux du PPG. Les animaux seraient plus exposés lorsqu’ils sont sédentaires et en cage. Il semblerait même que les animaux se transmettent les souches de S. aureus entre eux. En effet, il est établi que la promiscuité et les contacts sont des facteurs favorisant la circulation et la persistance des pathogènes (Zuk et McKean, 1996). La limitation de l’espace en système de volière au CDP fait que les PNH sont fréquemment en contact avec les visiteurs et le personnel qui y travaille. C’est pourquoi, on pense que les forts taux de portage au CDP pourraient s’expliquer par le type d’habitat (volière, enclos vs parc). Cette hypothèse est d’autant plus plausible qu’elle est vérifiée par le fait que les souches partagées entre les PNH et primates humains (Homme) sont plus importantes au CDP que dans les parcs (données en cours de publication dans le cadre du projet PhD).

Les résultats d’analyse par PCR, montraient qu’il n’y a aucune différence significative entre les PNH capturés au CDP (65,14%) et ceux du PL (53,33%). Nous retiendrons que l’impact de la sédentarisation mêlée à la contribution des vecteurs mécaniques (rongeurs, chiroptères), les souillures du milieu et le manque d’hygiène influencent la colonisation nasale de S. aureus chez les singes. Cela confirmerait que le surpeuplement des individus, l’utilisation accrue et répétée de niches écologiques

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couplées à une hygiène moins rigoureuse exposent davantage au portage de S. aureus (Stevens et al., 2010).

I.4. Culture et PCR Bien que le but de ce travail ne soit pas la comparaison des deux méthodes diagnostiques, on constate tout de même une différence importante dans les résultats obtenus. En effet, à l’instar des résultats de la PCR où les humains (68,29%) étaient significativement plus infectés face aux Chiroptères (38,05%), la sous-population la moins infectée, la culture en est la représentation inverse. Les Chiroptères y étaient significativement plus infectés (76,87%) que les humains qui représentaient le niveau inférieur (48,24%) de la « pyramide ». Cela implique que la PCR ne confirme pas les résultats de la culture. En effet, ces résultats discriminent ceux de la culture puisque certains échantillons uniquement positifs dans le milieu Chapman n’indiquent pas qu’il s’agissait déjà de S. aureus mais d’une bactérie du genre Staphylococcus. La PCR a constitué pour cette étude un filtre orienté vers les S. aureus que nous recherchons. Le gène spa est connu pour son importante variabilité. La discordance des résultats pourrait tout aussi bien être liée à des mutations dans les régions d’hybridation des sondes (Nguyen Van et al., 2006) lors de la réalisation de la PCR. Littéralement, on pourrait aussi ajouter à ce constat un autre plus controversé selon lequel, le portage à S. aureus soit moins important chez les animaux sauvages contrairement aux humains et que le taux d’échantillons positifs après la culture pourrait tout aussi bien appartenir aux potentielles 10% des souches de S. aureus qui n’expriment pas le gène spa recherché. L’usage de la culture fut aussi bénéfique car elle nous a permis de discriminer les individus (humains, PNH) ayant suivi ou encore sous traitement d’antibiotique antistaphylococcique chez lesquels le germe peut être retrouvé non viable dans la muqueuse. En outre, Cette étude permet également d’émettre des réserves sur le diagnostic sur le milieu SAID puisque le nombre de positif à ce test est très éloigné de celui obtenu par la PCR.

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I.5. Transmission de S. aureus au sud du Gabon La présence de S. aureus au sein des espèces animales montre une colonisation plus élevée dans les sanctuaires de PNH au Sud du Gabon que dans la littérature (Schaumburg et al., 2012b; Constantine et al., 1988).

Le surpeuplement est indexé car il favorise la proximité des individus. Les germes sont plus facilement transmis à l’hôte voisin car les aérosols sont communs. Le manque d’hygiène également pourrait expliquer cette transmission. Hygiène corporelle, hygiène alimentaire, hygiène des habitations et des volières sont des moyens de lutte contre la formation de biofilm bactérien. Car la maturation du biofilm entrainera automatiquement la propagation de S. aureus et l’acquisition de nouveaux facteurs de virulence.

Cette positivité élevée serait peut-être due aux transferts des germes entre ces populations. Des études portant sur les chimpanzés démontraient que ces derniers, se nourrissant de produits de leur chasse (petits singes, rongeurs…) (Boesch et Boesch, 1989), pouvaient être colonisés par les S. aureus de l’animal consommé (Leendertz et al., 2008).

Les souches de S. aureus ont probablement été transmises d’un individu très infecté à un autre par contact direct (cas de l’homme et des PNH), contact indirect avec un objet inanimé ou une sécrétion contenant des colonies de S. aureus (cas fréquent avec les animaux opportunistes). Dans ce sens, les humains étant les plus infectés et les plus actifs dans les parcs (nettoyage, rangement), l’hypothèse majeure serait qu’ils sont à l’origine de ce partage. Partant des résultats de PCR, on peut déduire que les autres espèces (Chiroptères, PNH, rongeurs) seraient beaucoup plus sensibilisées par les S. aureus originaires des humains même si la réciproque est également possible.

Schaumburg montrait d’ailleurs en 2012, que les PNH du Gabon, et par extension ceux de l’Afrique, étaient très souvent colonisés par les souches humaines de S. aureus. Par contre, le cas rencontré chez les populations pygmées, qui vivent elles aussi de chasse et de consommation de viande de brousse, indique une controverse du transfert de cette bactérie de l’animal vers l’homme. Ce qui n’exclut en rien les cas de transmission potentiels connus liés au dépeçage, au commerce ou à la consommation de viande de brousse (Schaumburg et al., 2012 ; 2011 ; Wolfe et al., 2005).

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Ainsi, dans le cadre de la continuité de ce travail sur l’étude des transferts de la bactérie S. aureus entre les communautés d’hôtes voisines au niveau des sanctuaires à PNH, un premier lot d’échantillons que nous avons envoyé en séquençage en Europe, révélait déjà une transmission interspécifique des souches de S. aureus. Quelques souches de S. aureus propres aux rongeurs étaient retrouvées chez les humains, celle des humains chez les PNH. De façon sommaire (confidentialité oblige, résultats en cours de publication), la description de la diversité de souches isolées dans ce projet révèle qu’un type prédominant initialement décrit et connu comme souche humaine (t189) est désormais décrit chez les PNH, les rongeurs et chauves-souris. Dans une publication portant sur les transferts au CDP (Nagel et al., 2013), le type t189 était déjà impliqué dans la mort d’un gorille par septicémie. Ces résultats attestent non seulement de la circulation et la transmission de S. aureus entre les animaux de la faune sauvage et les humains, mais confirme aussi l’origine entre autres humaine d’un fort taux de portage des PNH discuté plus haut.

Ces constats soulèvent d’autres préoccupations majeures et fondamentales : peut-on contrôler la circulation de ces souches « sauvages » en milieu communautaire humain ainsi que l’évolution des souches humaines chez les animaux ? Ce phénomène ne pourrait-il pas être à l’origine des résistances bactériennes chez les animaux sauvages ? En plus des mutations staphylococciques déjà répertoriées et des souches provenant d’animaux domestiques, comment éviter l’apparition de nouveaux mutants ?

II. Recommandations  Aux pouvoirs publics Le Gabon a déjà une bonne politique conservatrice et ses efforts dans ce sens sont patents. Toutefois, quelques axes d’amélioration sont envisageables. Le principal axe d’amélioration serait d’informer les populations sur les réels dangers liés à cette bactérie. Cela passerait par la mise en place de manuels détaillant les précautions à prendre dans les parcs et sanctuaires d’une part, d’autre part, par l’organisation de véritables journées de sensibilisation pour les populations avoisinantes.

Les spots d’informations sont souvent retransmis en période de crise comme pour le cas de la fièvre hémorragique (Ebola) et disparaissent aussitôt ensuite. Il serait donc 81

judicieux de mettre en place des campagnes d’informations audiovisuelles afin d’informer régulièrement la population sur l’ensemble des dangers.

Garder en permanence un cap sur l’information apparaît comme l’un des meilleurs moyens de conscientiser et d’éduquer les populations afin de leur permettre de corriger leurs comportements à risque dans leur vie quotidienne.  Aux laborantins et aux chercheurs Il serait souhaitable d’instaurer plus de rigueur dans le suivi du travail des stagiaires et des exécutants. Ce suivi régulier pourrait réduire considérablement le taux de perte des échantillons, les erreurs d’écritures, les défauts de conservation ou les erreurs de préparation qui entrainent un coût élevé dans le financement du projet. Il faudrait aussi limiter le nombre de participant pour une activité donnée. Cela permettrait, par exemple, de minimiser la perte de données car chaque intervenant a une méthodologie de travail qui lui est propre.

Pour les manipulations en laboratoire, il serait aisé d’effectuer des commandes de réactifs et de kit d’extractions relatifs à l’échantillonnage total ou encore d’émettre les commandes avant que ceux-ci ne s’épuisent complètement. Cela rentabiliserait le temps perdu à l’attente des commandes de réactifs à l’extérieur (du pays ou du continent).

Il serait souhaitable d’identifier chaque espèce bactérienne ainsi que sa souche exacte par typage (ou séquençage) pour établir le profil génétique des bactéries en circulation.

Dans la présente étude, il s’agit de S. aureus mais d’autres pathogènes d’intérêt clinique pourrait également être surveillés. Par la même occasion, il serait aussi favorable de surveiller leurs évolutions au sein des communautés humaine et animale.  Aux personnels des sanctuaires et parcs Outres les soins corrects apportés aux animaux, il serait d’avantage intéressant de limiter l’expansion de S. aureus par une meilleure gestion des produits alimentaires reçus sur les différents sites. Ceci passe par le dépôt des produits alimentaires dans des espaces plus adaptés c’est-à-dire un milieu fermé, propre et régulièrement nettoyé avec

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pédiluve à l’entrée pour les milieux artificiels comme le CDP et des bacs fermés pour les animaux en liberté.

Le respect des règles d’hygiène et de sécurité sanitaires prévues par les sanctuaires et les parcs sont des aspects sur lesquels il faudrait insister. Dans cette optique, la notion de biosécurité est à prendre en compte pour les déchets d’animaux surtout en milieu artificiel. Il s’agit très particulièrement du traitement des eaux résiduaires et d’une meilleure gestion quotidienne des déchets et excréments provenant des cages animales.  Aux visiteurs et aux touristes Pendant les balades touristiques, il serait souhaitable d’éviter le contact avec les animaux. En effet, il est souvent fréquent d’observer des visiteurs qui émerveillés devant les animaux, veulent partager avec eux des objets personnels ou des aliments.

Ce qui devrait être formellement interdit. Les touristes ne doivent ni jeter ou partager des objets avec les animaux. Cela réduira les échanges et par ricochet les transferts avec les PNH. Le statut des animaux est le plus souvent connu, mais pas celui des touristes. En agissant ainsi, on protège les animaux et le touriste lui-même.

C’est dans le même élan, qu’il est recommandé de ne pas trop s’approcher des animaux. Cela va éviter le simple contact mais aussi le cas particulier d’une potentielle agressivité.  A la population avoisinante Malgré les difficultés liées au manque d’eau dans les habitations, l’usage de récipients hermétiquement fermés et constamment nettoyés serait favorable pour les populations.

Il serait aussi bénéfique pour elles de renforcer leur hygiène de vie. Cette hygiène passe par le lavage des mains et des ustensiles, le nettoyage des aliments, du milieu de vie et par une cuisson correcte des aliments ou animaux capturés autour des habitations et en forêt (Chiroptères, rongeurs...). Par la même occasion, éviter de ramasser des animaux trouvés morts pour les consommer ou même pour les manipuler.

A cela, nous ajouterons qu’il serait bienvenu de signaler la présence d’animaux issus du braconnage aux autorités compétentes plutôt que de cohabiter directement avec eux. Avant toute cohabitation avec un animal sauvage, un suivi sanitaire est utile pour 83

davantage réduire l’apparition de zoonoses qui souvent jusqu’ici demeurent méconnues.

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CONCLUSION Situé en zone équatoriale africaine, le Gabon est un pays qui a vu ses barrières naturelles (forêts) être franchies pour des aménagements liées à l’écotourisme, la recherche scientifique et l’alimentation. Cette dernière, souvent associée au braconnage, est à l’origine de la disparition des grands singes (PNH). Pour éviter une probable extinction de ces primates, les questions liées à leur conservation sont une préoccupation majeure. Ainsi, environ 11% du territoire ont été dédiés à la création de 13 parcs nationaux en plus des nombreuses réserves fauniques où les PNH figurent parmi les espèces intégralement protégées. Du fait de la proximité génétique existant entre ces derniers et l’homme puis du partage de la même niche écologique avec des animaux opportunistes (Chiroptères, rongeurs), leur conservation suscite des dispositions sanitaires appropriées car les sanctuaires de PNH peuvent constituer des carrefours de zoonoses aux conséquences imprévisibles.

Cependant, dans le cadre d’un projet de santé publique érigé au CIRMF visant à la recherche des pathogènes d’intérêts dans les échanges entre l’homme et l’animal des aires protégées, Staphylococcus aureus, présente un intérêt certain en clinique. Il est très connu dans le domaine médical et vétérinaire des animaux domestiques mais peu connu en ce qui concerne les animaux de la faune sauvage. Sa capacité d’adaptation et à franchir la barrière interspécifique, en fait de loin le pathogène le plus agressif du genre Staphylococcus.

Notre étude a été réalisée sur une population d’hôtes constituée d’humains, de PNH, de rongeurs et de Chiroptères de 3 sanctuaires du Haut-Ogooué (le CDP du CIRMF; le parc de la Lékédi, et le PPG du PNPB). Elle avait pour objectif principal : de déterminer la fréquence du portage de S. aureus par type d’hôtes et par sites de prélèvement ; puis, de comparer ces valeurs de façon à comprendre si les communautés d’hôtes d’une même niche écologique sont plus exposées que d’autres.

A cet effet, 1270 écouvillons nasaux ont été analysés par la culture sur milieu Chapman et SAID. Il en ressort que 762 prélèvements (60%) étaient positifs parmi lesquels 113/147 échantillons de Chiroptères (76,87%) ; 388/625 échantillons de PNH (62,08%) ; 220/413 échantillons de rongeurs (53,26%) et 41/85 échantillons 85

d’humains (48,24%). Les Chiroptères étaient significativement plus infectés que les PNH, les Humains et les rongeurs. Le CDP présente le taux de portage le plus élevés avec ses 62,14% (727/1170) contre les 33,33% (6/18) du PPG et 35,37% (29/82) du PL. A l’issue de la PCR de confirmation des 762 échantillons analysés, 446 (59 %) étaient positifs. Ainsi, de façon générale, sur les 41 échantillons reçus des humains, 28 étaient positifs (68,29%). Ils n’étaient significativement pas plus infectés que les rongeurs avec leurs 124/220 positifs (56,36%), les 251/388 positifs de PNH (54,85%) et les 43/113 positifs de chiroptères (38,05%). Les échantillons humains du CDP étaient significativement plus infectés (17/21 soit 80,85%) que les autres espèces.

A travers la comparaison des taux de positivité des communautés d’hôtes fréquemment rencontrées (humains, PNH) dans les sites de prélèvement, nous avons constaté qu’il n’y a aucune différence significative entre les taux de portage des humains originaires du CDP, du PPG et du PL. A l’opposé, chez les PNH, les animaux du CDP sont significativement plus exposés que ceux du PL et du PPG. Face à ces résultats, qui ne nous permettent pas de tirer des conclusions en tout point par manque d’éléments approfondis (faible échantillonnage au PPG et PL, manque de considération du mode de vie des populations humaines, différence des communautés d’hôtes en fonction des sites, méconnaissance des comportements à risque et autres aspects socio-écologiques), nous en déduisons que l’exposition à S. aureus n’est pas fonction des sites de collecte mais elle est liée à l’hygiène de vie, l’anthropisation, l’alimentation et aux contacts. Aussi, les humains seraient probablement à l’origine du portage de S. aureus chez les PNH, les rongeurs, et les Chiroptères.

Au sortir de ces analyses, les autorités compétentes devraient davantage informer les populations sur les réels dangers liés à cette bactérie. Il serait également avantageux de limiter l’expansion de S. aureus par une meilleure gestion des produits alimentaires reçus sur les différents sites. Ceci passe aussi par une meilleure gestion des produits alimentaires (conservation, stockage, …), un meilleur entretien des milieux artificiels (lieux de vie des animaux). Le respect des règles d’hygiène et de biosécurité est aussi une notion qui devra dorénavant accompagner chaque membre actif de cette 86

proximitĂŠ : les touristes, le personnel employĂŠ des parcs et les populations avoisinantes.

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97

ANNEXES

ANNEXE I

2015

ANNEXE II FICHE CAPTURE CHAUVE-SOURIS :  Nom

:

Espèces :

 Date

:

sexe :

 Site

:

Age :

 Climat :

Poids : Etat General :

Mesures : 

Prélèvements :

L. corps (total) :

- Ecouvillons :

 L. avant-bras :

- Cerveau : - Sang : - Intestins: - Foie-Rate : - Autres Organes :

FICHE CAPTURE RONGEURS :  Nom

:

Espèces :

 Date

:

Sexe :

 Site

:

Age :

 Climat :

Poids : Etat General :

Mesures : 

L. corps (total) :

Prélèvements : - Ecouvillons :

 L. queue :

- Sang :

 L. pattes ante :

- Fèces:

 L. pattes post :

- Organes :

SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR « Fidèlement attaché aux directives de Claude BOURGELAT, fondateur de l’enseignement vétérinaire dans le monde, je promets et je jure devant mes maîtres et mes aînés:

 d’avoir en tous moments et en tous lieux le souci de la dignité et de l’honneur de la profession vétérinaire ;  d’observer en toutes circonstances les principes de correction et de droiture fixés par le code de déontologie de mon pays;

 de prouver par ma conduite, ma conviction, que la fortune consiste moins dans le bien que l’on a, que dans celui que l’on peut faire ;  de ne point mettre à trop haut prix le savoir que je dois à la générosité de ma patrie et à la sollicitude de tous ceux qui m’ont permis de réaliser ma vocation.

Que toute confiance me soit retirée s’il advient que je me parjure »

DISTRIBUTION COMPAREE DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS PAR CULTURE ET PAR AMPLIFICATION DU GENE SPA DANS LES SANCTUAIRES DE PRIMATES NON-HUMAINS AU SUD DU GABON

RESUME La cohabitation de plusieurs espèces animales dans une même niche écologique est souvent à l’origine de nombreux partages. Dans le cadre d’une approche en santé publique, la question se pose sur les potentiels transferts de bactéries pathogènes de l’homme vers les animaux de son environnement immédiat et vice versa.

La présente étude a pour but de déterminer la fréquence du portage de Staphylococcus aureus chez quatre communautés d’hôtes (humains, primates nonhumains ou PNH, rongeurs et Chiroptères) prélevées dans trois sanctuaires de PNH localisés au sud du Gabon. Pour ce faire, 1270 écouvillons nasaux ont été réalisés après captures. Ils ont été analysés par la culture sur les milieux Chapman puis SAID. Parmi eux, les Chiroptères (76,87%) étaient plus infectés que les autres espèces (62,08% de PNH, 53,26% de rongeurs et 48,24% d’humains) lors de la culture. Ainsi, la recherche du gène spa de S. aureus, par la PCR, a concerné les 762 positifs issus de ce premier niveau de tamisage. Au final, ce sont 446 échantillons qui ont été trouvés positifs. Les humains étaient plus infectés (68,29%) que les autres hôtes (64,14% de PNH ; 56,36% de rongeurs et 38,05%). Le CDP présente un fort taux de portage contrairement aux autres sanctuaires.

Mots clés : Staphylococcus aureus, gène spa, sanctuaires, CIRMF, Gabon.

ADRESSE DE L’AUTEUR : Géraldine LEYOGHO BP : 5991, Okala, Libreville, Gabon.

E-mail : geyleyo@gmail.com Tél. : 00 221 78 121 45 32 (Sénégal)/ 00 241 06 61 15 12 (Gabon)