Modulo bioingenieria by Universidad Nacional Abierta y a Distancia

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD

ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGÍA E INGENIERÍA BIOINGENIERÍA

Original en portugués: FRANCISCO MAUGHERI FILHO PhD Traducido por: GERMÁN ANDRÉS CASTRO MORENO MSc.

BOGOTÁ D.C., 2006

TABLA DE CONTENIDO 0

INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................................ 3 DEFINICIÓN DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA .................................................................................................... 3 HISTORIA Y EVOLUCIÓN.................................................................................................................................... 4 I. UNIDAD 1: fenÓmenos de transporte en bioprocesos ......................................................................................... 6 INTRODUCCIÓN .................................................................................................................................................... 6 TRANSFERENCIA DE MOMENTO ...................................................................................................................... 7 Transferencia de momento en fluídos Newtonianos ............................................................................................. 7 Transferencia molecular de momento en fluido no-Newtoniano. a. Clasificación de fluidos no-Newtonianos: 8 Transferencia de momento turbulento ................................................................................................................ 10 TRANSFERENCIA DE CALOR ........................................................................................................................... 11 Transferência molecular de calor ........................................................................................................................ 11 Transferencia de calor en régimen turbulento..................................................................................................... 12 Transferencia de calor en biorreactores .............................................................................................................. 13 TRANSFERENCIA DE MASA ............................................................................................................................. 21 Transporte molecular de oxigeno........................................................................................................................ 21 Agitación Mecánica ............................................................................................................................................ 32 Ampliación de Escala ......................................................................................................................................... 42 Transferencia de Masa Externa e Interna con Reacción Química....................................................................... 60 II. UNIDAD 2: CINÉTICA ENZIMÁTICA, DE CRECIMIENTO - BIORREACTORES ................................ 74 ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN ............................................................................................................. 74 Ecuación de Lineweaver- Burk........................................................................................................................... 77 Ecuación de Eadie-Hanes.................................................................................................................................... 77 Ecuación de Hofstee ........................................................................................................................................... 78 REACCIONES REVERSIBLES CON MÚLTIPLES SUSTRATOS .................................................................... 78 Reacciones Reversibles....................................................................................................................................... 78 Reacciones con múltiples sustratos..................................................................................................................... 79 REACCIONES CON INHIBICIÓN ....................................................................................................................... 80 Inhibición Irreversible......................................................................................................................................... 81 Inhibidores reversibles ........................................................................................................................................ 81 OTRAS INFLUENCIAS EN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ........................................................................... 89 Efecto del factor tiempo...................................................................................................................................... 89 Efecto del pH ...................................................................................................................................................... 90 Efecto de la Temperatura .................................................................................................................................... 93 Cinética de crecimento de LOS MicroOrganismos................................................................................................... 100 CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE MONOD ................................................................................................... 102 METABOLISMO ENDÓGENO Y ENERGÍA DE MANTENIMIENTO........................................................... 104 Metabolismo endógeno ..................................................................................................................................... 104 Modelo de crecimento con mantenimiento ....................................................................................................... 105 MODELOS DE CRECIMIENTO......................................................................................................................... 109 No estructurados ............................................................................................................................................... 109 Modelos estructurados ...................................................................................................................................... 124 MODELOS DE FORMACIÓN DE PRODUCTOS ............................................................................................. 129 No estructurados ............................................................................................................................................... 129 Modelos estructurados ...................................................................................................................................... 133 INFLUENCIAS DEL AMBIENTE EN EL CRECIMIENTO.............................................................................. 134 pH ..................................................................................................................................................................... 134 Temperatura ...................................................................................................................................................... 135

INTRODUCCIÓN

DEFINICIÓN DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA

Durante muchos años han aparecido en la literatura varias definiciones de Ingeniería Bioquímica. Prácticamente todas ellas definen la ingeniería bioquímica como una ciencia que nació por la combinación de 3 áreas del conocimiento científico: Microbiología, Bioquímica e Ingeniería Química. Su papel, en realidad, es el de transformar conocimientos obtenidos por microbiólogos y bioquímicos a los procesos industriales,

con el ánimo de perfeccionarlos,

así como de aumentar las

productividades. Para esto, un ingeniero bioquímico debe tener su formación en principios básicos de ingeniería, así como también en ciencias biológicas.

HISTORIA Y EVOLUCIÓN

Milenios antes de saber de la existencia de seres microscópicos, el hombre ya se valía de ellos. Es así que el hombre de las cavernas ya sabía que la carne madurada tenía mejor sabor y producía bebidas alcohólicas. De la misma forma que la fabricación de quesos y obtención de cuajada y vinagre, son conocidas desde estos tiempos remotos. El pan fermentado por levaduras fue encontrado en pirámides egipcias construidas hace milenios. Muchos productos obtenidos por la acción de microorganismos pueden ser incluidos en esta lista histórica: vino (conocido por los antiguos griegos), cerveza (2000 años A.C.), soya fermentada, etc.

Hasta la mitad del siglo XIX el hombre permaneció en la ignorancia total sobre las causas de la fermentación. En 1857, Pasteur demostró que la fermentación alcohólica era producida por levaduras y que estas eran células vivas. Demostró también que varias enfermedades eran causadas por microorganismos. En 1901, Rudolf Emmerich y Oscar Loco, de la Universidad de Múnich, aislaron la piocianasa Pseudomonas Aeruginosa. Centenares de pacientes fueron tratados con éxito por la piocianasa, el primer antibiótico conocido. Sin embargo, la piocianasa fue un descubrimiento muy adelantado para su tiempo y por la inexistencia de técnicas seguras y apropiadas de producción y control de calidad, fue abandonada prematuramente por los riesgos presentados.

En el inicio del siglo XX ya se producía levadura de panificación en tanques abiertos y aireados. Durante la I Guerra Mundial, Chain Weismann consiguió producir acetona a

partir de almidón usando una bacteria, Clostridium Acetobitilim, liberando a Inglaterra de una seria falta de munición, pues la acetona es usada en la fabricación de cordite (explosivo). En 1923, Pfizer inauguró la primera fábrica para obtención de ácido cítrico por fermentación, utilizando Aspergilus Niger,con la conversión del azúcar en ácido, abaratando el producto. Alexander Fleming, en 1928 manipulando Staphylococcus Aureus, notó que en una de las placas de cultivo este microorganismo había contaminación por moho de la familia Penicilium y que alrededor de este no hubo crecimiento de la bacteria. Extrajo del moho una substancia, la cual denominó penicilina, activa contra bacterias. Pero fue solamente en la II Guerra que la penicilina fue industrializada debido a gran necesidad de agentes bactericidas más eficientes que la sufla, hasta entonces utilizada. Posteriormente aparecieron otros antibióticos. Selman Waskman aisló un actinomicete, Streptomycens Grisens, de la garganta de una gallina, productor de estreptomicina. Este antibiótico se mostró altamente eficaz contra bacterias causantes de la tuberculosis. La lista de la antibióticos hoy es larga, además de las penicilinas y estreptomicinas. La investigación es intensa y cada año nuevos productos, nuevas técnicas y nuevos procesos vienen a juntarse a los existentes. Muchas vitaminas son producidas por fermentaciones, como por ejemplo, vitamina B2 (riboflavina), vitamina B12 (cianocobalamina) y vitamina C (ácido ascórbico). Los Procesos fermentativos también son usados en la producción de cortisona y sus derivados, así como en la síntesis de aminoácidos (L-lisina y ácido glutámico). La gliberelina, hormona reguladora del crecimiento de las plantas es un nuevo producto de fermentación usado principalmente en el Oriente. Insecticidas bacterianos (B. Thuringiensis) encuentran gran aplicación en la agricultura.

Antes de haber comenzado la producción de penicilina a escala industrial, ya se producían industrialmente ciertos productos como levaduras, ácido cítrico y ácido glucónico donde las condiciones de acidez del medio de cultivo eran adversas a microorganismos contaminantes. De la misma forma en productos como sorbose, acetona, butanol y etanol donde las concentraciones de sustrato o producto eran demasiado elevadas de forma que los microorganismos contaminantes eran casi que inexistentes. Según esto, los requerimientos para un cultivo puro en los procesos de obtención de los productos arriba descritos, eran prácticamente nulos. Sin embargo, en el caso de la penicilina, las condiciones de operación tenían que ser estrictamente ascépticas, por ende, los ingenieros bioquímicos se encontraron frente a un gran

problema, que hizo que surgiera una nueva filosofía de “Diseño” de fermentadores, de técnicas de operación y de equipamientos en general, de forma que fuera obtenida una perfecta esterilidad. Además de eso, para la extracción de algunos productos con la penicilina que era encontrada en el medio de cultivo en pequeñas concentraciones y relativamente inestable, el desarrollo de nuevas técnicas de filtración, extracción, adsorción

concentración

fue

exigido.

El desarrollo de técnicas para la producción de penicilina, como la fermentación sumergida, fueron posteriormente aplicados a otros antibióticos y también a diferentes productos, de forma que los equipamientos sufrieron una especie de uniformidad, con algunas adaptaciones dependiendo de las características de ciertos procesos. Además de eso, los equipos y operaciones empleados en diferentes procesos fermentativos son similares a los de procesos químicos. Por eso la Ingeniería Bioquímica es basada en los conceptos de operaciones unitarias y procesos unitarios de la Ingeniería Química, así como en sus principios estequiométricos, cinéticos y termodinámicos. Sin embargo, es evidente que a pesar de características comunes entre las dos disciplinas, existen peculiaridades diferentes entre ellas, de forma que la ingeniería bioquímica es encarada como un ramo especializado de la ingeniería química. Como ejemplo de operaciones unitarias comunes entre ellas podemos citar: mezcla de tres fases heterogéneas (microorganismos, medio y aire), transporte de masa (oxígeno del aire para el microorganismo), transporte de calor (del medio de cultivo para el ambiente).

Las transformaciones de materia prima a productos por acción microbiológica poseen aspectos comunes bajo el punto de vista químico o físico, suministrándonos la posibilidad de clasificar los diferentes mecanismos de reacción en procesos unitarios, como

por

ejemplo,

reducciones,

oxidaciones,

conversiones

sustrato,

transformaciones, hidrólisis, polimerización, biosíntesis complejas y formación de células.

UNIDAD 1: FENÓMENOS DE TRANSPORTE EN BIOPROCESOS

INTRODUCCIÓN •

Técnicas microbianas: Biorreactores.

•

Microorganismos deben ser alimentados con nutrientes

•

Productos que pueden y deben ser retirados

•

Suministro y remoción: Procesos de transferencia

•

Transferencia de masa: Transferencia de calor y momento

•

Transportes en Biorreactores presentan mucho mayores consecuencias que en reactores químicos, pues además de disminuir velocidades de reacción, pueden resultar en alteración metabólica originando productos diferentes.

•

Transferencia de momento, calor y masa: conductivo y convectivo

•

Conductivo: debido a los movimientos de turbulencia y moleculares

•

Convectivo: debido a los movimientos del fluído

•

Ecuaciones derivadas empíricamente, no hay ecuaciones teóricas.

•

Aún para conversiones de masa, ya sea química o bioquímicamente.

•

Ecuaciones para transporte y convección, representan leyes químicas y físicoquímicas que gobiernan el comportamiento de fluidos y sólidos.

TRANSFERENCIA DE MOMENTO

Transferencia de momento en fluídos Newtonianos

Ecuación de Newton:

τ m = −η

dw dy

En ella: τm : densidad de flujo de momento o tensión de cizallamiento dw : gradiente de velocidad o taza de cizallamiento dy η : coeficiente de transporte de momento o viscosidad dinámica ( depende de

la presión y de la temperatura del fluído)

La ecuación puede ser escrita:

Donde: ν =

τ m = −ν

d(wρ) dy

η ρ

w ρ : momento/ unidad de volume.

Transferencia

molecular

momento

fluido

no-Newtoniano.

a. Clasificación de fluidos no-Newtonianos:

Los fluidos no-Newtonianos no obedecen a la ley de Newton (ecuación 1.1) y dependen además de P y T, de la τm , del tiempo, de la elasticidad y de otros parámetros.

Los fluidos no-Newtonianos típicos son polímeros, suspensiones espesas, tintas, fluidos de alto peso molecular. Existen 2 grupos:

1. Fluidos viscosos:

η = f1(τ m ) = f 2 (

dw ) dy

2. Fluidos elásticos: η = f 3 (t )

Viscosidad aumenta con el tiempo: reopéctico Viscosidad disminuye con el tiempo: tixotrópico

Transferencia de momento

Bingham

τm τoa τ0b

Pseudoplástico (n<1) Newtoniano (n=1)

Dilatante (n>1)

dw dy

Ley de Potencia (Ostwald DeWaele):

⎛ dw ⎞ ⎟⎟ τ m = K ⎜⎜ − ⎝ dy ⎠

Donde: n: índice de flujo K: índice de consistencia

O τm = µ A

dv dx

⎛ dv ⎞ ⎟ ⎝ dx ⎠

n −1

Donde µ A = K⎜

: viscosidad aparente

n>1: fluído dilatante n<1: fluído pseudoplástico

Para altos gradientes de velocidad, los fluidos presentan aproximádamente comportamiento Newtoniano. ⎛ dw ⎞ ⎟⎟ ⎝ dy ⎠

Bingham: τ m = τ0 + ηB ⎜⎜ −

Transferencia de momento turbulento

τ = τm + τt τ t = −ρε t

dw dt

Donde ρεt : coeficiente de transferencia de momento turbulento

Entonces: τ = −η(1 + ε t / ν )

dw dy

ε t ν : adimensional

εt ν 100

Re=5.104

80 60

Re=2,5.104

40 20 0 0

{

(

0,2

0,4

)[

0,6

{

0,8

(

) }]}

⎡ ⎤ 2 εt = 0,5⎢ 1 + r * 2 Re + 0,14 − 0,08r * 2 − 0,06r * 4 1 − exp − Re + 1 − r * / 26 − 1⎥ ν ⎣⎢ ⎦⎥

r*: radio adimensional

Re* = 0,1.Re7/8

[ (

⎛ εt ⎞ = 2,37.10 −4 Re + 1 − r * ⎜ ⎟ ν ⎝ ⎠ v −1

)]4

⎛ εt ⎞ ⎜ ⎟ =0 ⎝ ν ⎠r =0

La transferencia de momento es dada por el movimiento molecular turbulento, en fluídos no newtonianos es generalmente de menor importancia.

TRANSFERENCIA DE CALOR

molecular turbulento

Transferência molecular de calor

dQ dt

(J/s)

en la que

Q: energía .

Q : flujo de energia

Q d (Q A ) = A dt

Donde

(J/m2s)

q: densidad de flujo de energía

Ley de Fourier:

q m = −λ

dT dy

Donde λ : condutividad térmica o coeficiente de transferencia de calor

d(TρC P ) dy

q m = −a

Donde: difusividad molecular de calor (térmica) ρ : densidad

CP: calor específico a (m2/s) x 106

λ (J/m.s.K)

Água

0,4

0,61

Vidro

0,83

1,4

Mercúrio

4,33

8,14

Aço

14,1

22,2

0,026

Hidrogênio

166,73

0,187

Transferencia de calor en régimen turbulento

En régimen turbulento de transferencia de calor los movimientos moleculares son aumentados por flujos turbulentos.

q t = −ρC P ε q

dT dy

ε q : difusividad térmica en régimen turbulento

(

q = q m + q t = −λ 1 + ε q / a

εq a

(

= Pr 1,5 − 0,5r*

) dT dy

) εν

Cerca de la pared:

qw = qm

ya que desde la superfície de un sólido hacia un líquido la

transferencia de calor es solamente por conducción molecular.

Transferencia de calor en biorreactores

En reactores bioquímicos el intercambio de calor ocurre en casos donde es necesario calentamiento, esterilización por calor y calentamiento en procesos termofílicos por ejemplo, o enfriamiento, como en el caso del mantenimiento de temperaturas constantes en procesos con exceso de generación de calor. Estos cambios son conseguidos

por

intermedio

dispositivos

como

chaquetas,

serpentines,

intercambiadores de placas, entre otros.

De una forma general, los procesos biotecnológicos pueden ser considerados isotérmicos, o sea, no hay acumulación de calor en el interior del reactor, excepto para casos donde ocurre una programación del perfil de temperatura con la finalidad de optimizar el proceso. La principal fuente de calor en una fermentación es debido al crecimiento

del

microorganismo.

a. Generación de calor metabólico

La taza de producción de calor metabólico puede ser calculada con buena precisión a partir de los coeficientes de conversión (Yx/s y Yp/s) y de los calores de combustión de substrato ( ∆H s ), producto ( ∆H p ) y material celular ( ∆H x ), por la siguiente relación:

Y∆ =

[Y∆ ] =g

Yx / s (∆H s − Y x / s ∆H x − Y p / s ∆H p )

célula/kcal

Esta relación es obtenida considerando los aspectos presentados en la siguiente figura:

I Combustión

O2 + Substrato

CO2 + H2O Total

II Respiración con producción de células y producto

∆H S

H2O + CO2 + células + producto

III Combustión de metabolismo celular

∆H C Combustión de producto ∆H p

En ausencia de datos experimentales el calor de combustión del material celular puede ser calculado a partir de la composición media de las células de la siguiente forma: Combustión de Pseudomonas flusrecens creciendo en glucosa produciendo CO2, N2 y H2O. C4,41H7,3N0,86O1,19 + 5,64O2

4,41CO2 + 0,43N2 + 3,65H2O

El calor de combustión por electrón transferido de oxígeno para una relación del tipo metano, es tomada como 26,05 Kcal, o sea, como el oxígeno posee 4 electrones transferibles, el calor total será 104,20 Kcal por mol de oxígeno consumido.

En el ejemplo el calor de combustión total por unidad de masa celular será:

∆H x =

5,64.104,20 = 6,44 kcal / gcelula 4,41.12 + 7,3.10 + 0,86.14 + 1,19.16

El calor arriba debe ser corregido debido a presencia de cenizas, por ejemplo, 10 % en base seca.

6,44.0,9 ≅ 5,8 kcal / gmasa sec a ∆H x ≅ 5,8 kcal / gmasa sec a

De esta forma, la tasa de generación de calor en un proceso batch puede ser calculada por la ecuación:

rq cresc = µX

1 Y∆

⎡ kcal ⎤ ⎢ l.h ⎥ ⎣ ⎦

En reactor continuo CSTR la relación se torna:

Y∆ rq cresc = µX = (S 0 − S )YX / S F

rq cresc =

(S0 − S)YX / S D Y∆

Balance Energético en Reactores Bioquímicos

En los

reactores bioquímicos que

funcionan

a presión constante los cambios en las energías potencial y cinética son despreciable s, de forma que el balance energético puede deberse solamente el cambio de entalpí a, o sea,

⎛ dh ⎞ ⎛ dh ⎞ rq total = ⎜ v ⎟ = ⎜ v ⎟ − rq transferencia + rq agitación − rq radiación − rq evaporación − rq aireación ⎝ dt ⎠ total ⎝ dt ⎠ crec

[rq ] = kcal l.h

[h v ] = kcal l

: entalpía volumétrica

En la mayoría de los casos los cuatro últimos términos pueden ser despreciados, de f orma que la ecuación queda:

⎛ dh ⎞ ⎛ dh ⎞ rq total = ⎜ v ⎟ = ⎜ v ⎟ − rq transferencia = rq crec − rq transferência ⎝ dt ⎠ total ⎝ dt ⎠ crec

Si el proceso sucede a temperatura constante entonces para proceso en batch

rq transferêecia =

µX Y∆

dh v =0 dt

y rqcrec = rqtransferencia ,

y en CSTR

rq transferencia =

(S 0 − S )Y X / S D Y∆

⎡ kcal ⎤ ⎢⎣ l.h ⎥⎦

Por otro lado, el flux de calor q, puede ser estimado por la equación q = U (T1 − T2 )

donde U: coeficiente global de transferencia de calor T1: temperatura del líquido 1 T2: temperatura del líquido 2 El coeficiente U es definido como:

1 1 1 1 = + + U h1 k s h 2

para paredes planas (chaqueta)

ln (d e d i ) 1 1 1 = + + Ud e h e d e 2k s hidi

para tubos

donde de e di: diámetro externo e interno he: coeficiente de transferencia de calor en la pared externa hi: coeficiente de transferencia de calor en la pared interna e: espesor

La determinación de h puede ser hecha a través de relaciones entre el NNu, NPr y NRe etc. Como ejemplo, para fluidos newtonianos con viscosidades próximas a la del agu aÑ

N Nu = 0,023N Re 0,8 N Pr 0,4

donde N Nu = N Re = N Pr =

hd kf

vρd µ C pµ kf

d: distancia kf: condutividad térmica del fluido (cal/s.m.oC) Cp: calor específico (cal/go.C)

µ : viscosidad v: velocidad

ρ : densidad

Muchas otras relaciones son citadas en la literatura, que dependen de varios factores como viscosidad, convección natural, etc.

Ejemplo 1: CSTR con intercambio de calor Considerando que en un reactor bioquímico, el cambio en el volumen es despreciable, la razón de entrada y salida pueden ser consideradas iguales.

Balance de masa del sustrato d (VS ) = FS 0 − FS − rS V dt

rS =

− dS µX = dt cons YX S

V =constante

dS µX V ⇒ = F(S 0 − S) − dt YX S

Balance de células

dS µX = D(S 0 − S) − dt YX S

d (VX ) = FX 0 − FX + rx V = µXV − FX dt dX = µX − DX = (µ − D )X dt

F, T, S, X

F, So, To

Fro Tro

S X V

Balance de energía para fluido reaccionante: d (qV ) = q 0 F − qF + rq crecV − UA(T − Tr ) dt

ρC p V

ρC p

(S0 − S)YX S F dT = ρ 0 C p0 T0 F − ρC p TF + − UA (T − Tr ) Y∆ dt

(S 0 − S)YX S D UA dT (T − Tr ) = ρ 0 C p0 T0 − ρC p T D + − dt Y∆ V

(

)

Balance de energía para fluido refrigerante

(

)

d ρ R VR C pR TR = ρ ro Fro C po Tro − ρ r Fr C pr Tr + UA (T − Tr ) dt

Fr Tr

Se debe considerar también que µ es función de la temperatura, según Arrhenius

1 T

II) µ = µ 0 e

− Ea RT

µ = µ0e

Ed − Ea RT

I) µ = µ 0 e RT

Ejemplo 2: Optimización del perfil de temperatura (Bailay & Ollis, pg 603)

dX ⎛ X⎞ = µX ⎜1 − ⎟ dt σ⎠ ⎝

( ecuación de crecimiento logística)

dp dX = αX + β − γp dt dt

donde: µ = 13,099 = µ 0 σ = 0,9426 = σ 0 α = 4,6598 = α 0

β≅0 γ = 4,4555 = γ 0

Dependencia con la temperatura T=[oC]:

µ (T ) = µ 0 g(T )

σ(T ) = σ 0 g(T )

[

g(T ) = 1,143 1 − 0,005(30 − T )2

[

]

α(T ) = 1,143α 0 1 − 0,005(T − 20)2

]

⎡ 1 1 ⎞⎤ ⎛ γ (T ) = γ 0 exp ⎢ − 6145⎜ − ⎟⎥ ⎝ 273,1 + T 298 ⎠⎦ ⎣

las ecuaciones se convierten en:

[

]

f1 =

⎛ X dX = µ 0 114 1 − 0,005(30 − T )2 − X⎜1 − 2 ⎜ dt ⎝ σ 0 1,143 1 − 0,005(30 − T )

f2 =

dp 1 1 ⎤ ⎡ = 1,143α 0 1 − 0,005(T − 20 )2 X − γ 0 exp ⎢ − 6145 − ⎥p dt 273 , 1 T 298 + ⎦ ⎣

[

]

⎞ ⎟ ⎟ ⎠

]

X t = 0 = 0,0294p t = 0 = 0

Objetivo: hallar T en función del tiempo de 0 a tt tal que p(tt) sea máximo. Por tanto el perfil óptimo de temperatura T(t) debe coincidir con los máximos de la función Hamilto niana H:

H (T ) = λ x (t )f1 + λ p (t )f 2

donde λ x y λ p son obtenidos de las relaciones:

dλ x ∂f 2 ∂f = λx t 1 + λp t ∂x dt ∂x t t

dλ p

∂f ∂f 2 = λx t 1 + λp t dt ∂p t ∂p t

Con λ x (t t ) = 0 y λ p (tt ) = 0 usando un método de integración (Euler o RungeKutta). En seguida se determinan los puntos máximos de la función H(T) para cada temperatura usada de t = 0 hasta t = tt o sea: ∂H (T ) (t ) = λ x T (t ) ∂f1 + λ p T (t ) ∂f 2 ∂T ∂T ∂T

TRANSFERENCIA DE MASA

Transporte molecular de oxigeno

Disolución de O2 (teoria de la doble película)

Considerando la interfase gas-líquido de un sistema aireado, se tiene:

GÁS

Pg , C* Pi , Ci pL , CL LÍQUIDO

Admitiendo estado estacionario, el flux de O2 ( ηO 2 ) está dado por:

(

)

ηO2 = k g H p g − p i = k g H (p i − p L ) = k L C* − C i = k i (C i − C L )

Para la cual: 2

ηO 2 : flux de O2 (masa O2/m h)

kg : coeficiente de transferencia de la película gaseosa (m/h)

kL : coeficiente de transferencia de película líquida H : constante de Henry (g O2/m3atm) p : presión parcial O2 (atm) Las mediciones experimentales de concentración, se hacen fácilmente en la masa del fluido, pero son virtualmente imposibles de hacer en la interfase. De esta forma solamente se puede determinar un efecto global. Observando la figura de abajo, la medida de pL, es tan buena, cuanto lo es la medida de CL, lo mismo se puede decir de C* en relación a la medida de pg. La transferencia de masa global entre las dos fases, puede ser escrita en términos de coeficientes globales de transferencia de masa, Kg o KL y la ecuación se vuelve:

(

)

(

ηO 2 = K g H p g − p L = K L C* − C L

)

donde Kg y KL son coeficientes globales de transferencia de masa en la fase gaseosa y en la fase líquida respectivamente.

P m"

KL/Kx

m' pL

De la figura se obtiene:

Curva de equilibrio del Oxigeno

(

)

(

)

p g − p L = p g − p i + (p i − p L ) = p g − p i + m' (C i − C L ) ⇓ ηO 2 Kg

⇓ ηO 2

⇓ m' ηO 2 kL

o sea:

1 1 m' = + Kg kg kL

o similarmente:

1 1 1 = + K L k L m" k g

donde m" es también conocida como la constante de Henry H. De esta forma se tiene:

1 1 1 = + KL kL kgH

Como en el caso del oxigeno la solubilidad es baja, osea m" o H son grandes y así se obtiene:

1 1 = ⇒ KL ≅ kL KL kL

o sea:

(

ηO 2 = K L C* − C

)

o se multiplica por el área interfacial:

(

ηO 2 a = K L a C* − C

)

donde KLa: coeficiente volumétrico de transferencia de O2 (h-1).

En estado transitorio: ηO2 a = donde

(

dC = K L a C* − C dt

)

dC representa la variación de la concentración de oxigeno en el medio dt

Transferencia de O2 y respiración

El balance de O2 de una fermentación suministra:

(

dC = dt

K L a C* − C

variación

)

−

suministro

QO2 X

demanda

de la conc. O2

Si C = constante,

(

dC = 0 y por tanto dt

)

K L a C* − C = Q O 2 X

Métodos de medición de KLa

c.1.

Método del sulfito

En este método la determinación del KLa es hecha sin la presencia de microorganism os,

Na2SO3+1/2O2

Cu++

Na2SO4

pues el sulfito es un compuesto tóxico y no permitiría el desarrollo de las células. El m étodo se basa en la reacción:

donde el oxígeno es consumido por el sulfito, en presencia de un catalizador, en el cas o del cobre. Por lo tanto es un método puramente químico.

Para la determinación del oxígeno disuelto, las muestras son tomadas en espacios regulares de tiempo y puestas a reaccionar con yodo, de acuerdo a la ecuación:

Esta técnica es conocida como yodometría.

Así el flux de oxígeno será dado por:

Nv =

N.V1 4.t.V2

donde N: normalidad de la solución. V1: volumen gastado de tiosulfato V2: volumen de la muestra en litros t:

intervalo de tiempo entre una muestra y otra

Nv: flux de oxígeno (moles por tempo) Desde que el consumo de oxígeno disuelto es instantáneo, la concentración de oxíge no en el medio es prácticamente cero. De esta forma la ecuación 2.47 se vuelve:

dO 2 N v = = K L a . C* dt V2

donde C* es la solubilidad del oxígeno en las condiciones del experimento, se encuentra en tablas.

Así: K La =

Nv V2 .C*

Solubilidad del oxígeno en diferentes condiciones del medio Temperatur

Solubilidad

Solubilidad en soluciones(mM)

agua Concentraci

HCl

1/2

NaCl

( C)

(mM)

ón

2,18

1,70

1,26

1,54

0,5

1,21

1,07

1,38

1,0

1,16

1,12

0,89

1,26

2,0

1,12

1,02

0,71

1,16

1,09

1,03

c.2.

H2SO4

Método de burbujeo

En este método, igualmente realizado sin la presencia de microorganismos, la variación de oxígeno en el medio es medida por un electrodo de oxígeno, colocado en el interior del fermentador. El oxígeno inicialmente presente en el medio es retirado por el burbujeo de nitrógeno y en seguida se burbujea aire, como se ilustra en la figura y así aumentar la concentración de oxígeno.

Corte da aireación

[O2]

-QO2X

dO2 dt

t Restabelecimento de la aireación

Como no hay presencia de microrganismos, no hay consumo de oxígeno y por lo tant o tenemos la ecuación básica de transporte de oxígeno.

(

dC = K L a C* − C dt

)

Esta ecuación puede ser integrada para obtenerse:

(

= K L a ∫ dt ⇒ − ln C − C ∫ * C −C *

)

C 0

= K L a. t ⇒

⎛⎜ C* − C ⎞⎟ ⎠ − ln ⎝ C*

= K L a. t

El valor de KLa puede ser entonces obtenido gráficamente como se ilustra en la figura. ⎛⎜C*−C⎞⎟ −ln⎝ ⎠ C*

KLa

0 0

c.3.

Método dinámico

Este método se desarrolla en presencia de microorganismos, a diferencia de los métodos precedentes. Se basa en la variación de la concentración de oxígeno en un corto intervalo de tiempo, debido a la respiración del microorganismo, este intervalo es suficientemente

pequeño,

para

así

mantener

concentración

células

prácticamente constante. Se hace inicialmente un corte del suministro de O2 durante algunos minutos y entonces se restablece el suministro, como se ilustra en la figura. En estas condiciones, o sea sin suministro, se tiene apenas consumo (demanda) del oxígeno, produciendo una caída de concentración, y de esta forma la ecuación 2.48 queda:

dC = −Q O 2 ⋅ X dt

Es posible, así, calcular QO2, la velocidad específica de respiración, por la tangente de la primera parte de la curva. En la segunda parte de la curva, después que la aireación es restablecida, se tiene simultáneamente respiración(demanda) y suministro de oxígeno, o sea, toda la ecuación 2.48. Se puede rearreglar esta ecuación, para obtener lo siguiente: ⎞ dC ⎛ * Q O 2 X = ⎜⎜ C − − C ⎟⎟ / K L a dt ⎝ K La ⎠

Para cada condición de trabajo se puede considerar C* y

C * − (QO2 X / K L a) = A' tenemos:

dC = ( A'−C) ⋅ K L a dt

QO2 X K La

constantes. Se hace:

luego:

∫

dC = K L a ⋅ ∫ dt A' −C

Integrando la ecuación de arriba entre C y C0, que corresponden a los tiempos t y t0 = 0, se tiene:

A' −C 0 = K La ⋅ t A'−C

En régimen estacionario, o sea, cuando la concentración de oxígeno es constante, la ecuación 2.48 puede ser escrita de la siguiente forma:

(

)

K L a C* − C = Q O 2 X

donde C tiene una concentración particular Ci. Rearreglando la ecuación de arriba y sustituyendo C por Ci tenemos:

(

)

C* − Q O 2 X / K L a = C i = A '

o sea: C − C0 = K La ⋅ t ln i Ci − C

En la figura de abajo se representa el esquema para la determinación de los parámetros de la ecuación.

Ci Ci-C

-Qo2X

Ci-C0

t=0

Definiciones y nomenclatura

X: concentración celular (g/l) S: concentración del sustrato limitante P: concentración del producto C*: concentración de O2 en el medio en la saturación C: concentración de O2 µ o µ X : velocidad específica de crecimiento

µ=

1 dX X dt

qs: velocidad específica de consumo de sustrato

qS = −

1 dS X dt

q P : velocidad específica de producción

qP =

1 dP X dt

YX/S: factor de conversión sustrato/células YX / S =

∆X µ dX dt = = ∆S qS − dS dt

QO2: velocidad específica de respiración

tempo

QO 2 =

1 dO 2 X dt

dO2 : velocidad de consumo de O2 (g O2/l.h) dt

donde

YX/O: factor de conversión O2/células

YX / O =

dX dt ∆X µ = = ∆O 2 Q O 2 dO 2 dt

Respiración microbiana

Cuando el O2 es el sustrato limitante, o sea, con la concentración por debajo de la concentración crítica (ilustrado por la figura de abajo) se puede representar la cinética de crecimiento por la ecuación de Monod:

µ = µ max

[O 2 ] K + [O 2 ]

o también:

Q O2 = Q O2 max

[O 2 ] K + [O 2 ]

Se sabe que la taza de dilución de O2 está dada por:

(

dO 2 = K L a C* − C dt

y que

)

dX dO 2 = YX / O dt dt

Se obtiene:

(

dX = YX / O k L a C* − C dt

)

QO2 QO2max

Ccrítico

[O2]

Agitación Mecánica

Agitación con aireación

Rushton demonstrou por análise dimensional que (figura 1):

⎛ NDi 2ρ N 2 Di H L D t Wi Wb ⎞ ⎜ ⎟ = , , , , f , ⎜ µ ⎟ D D D D g N 3Di5ρ i i i i ⎠ ⎝ PgC

Número de Potencia (Np)

No de

Reynolds Froude (Nre)

(NFr)

adimensionales relativos a la geometría

Pg C 1 nDi D 3 Pg fuerzas externas NP = = = 3 C5 2 fuerzas inerciales ρn D i n Di ρ

Dimensiones Estándar: son generalmente empleadas en el gráfico Npo versus Re: Son:

fuerzas inerciales ρn 2 Di nDi ρ = = µn fuerzas vis cos as µ Di 2

N Re =

Número de deflectores = 4 Dt 1 = , Di 3

HL = 1, Dt

Hl = 1, Dt

Wb 1 = D i 10

Para sistemas geométricamente semejantes: NP=K(NRe)m(NFr)n NFr importante si existe formación de vórtex, de lo contrário,

NFrn=1

W = 0,2 Di

W = 0,25 Di

para aspas

L = 0,25 Di

W = 0,2 Di

0,25 para hélices

para turbinas

o n=o (que

es el caso normal en reactores). Por tanto:

NP=K(NRe)m Donde: Rushton correlacionó datos de NP versus NRe , figura siguiente, donde se distinguen

W= altura de las aspas del impulsor L= longitud de las aspas del impulsor

3 regiones: región laminar: NRe<100

Paso o distancia entre las líneas de recorrido: “pitch” = van de 1 hasta 2 D

N P = K (N Re )m

KµN 2 D i gc

com m=-1

región turbulenta: NRe>104 N P = K1

Pg C N 3 D i 5ρ

= K1

K1 3 5 N Di ρ gC

región intermedia: 100 < NRe < 104 N P = K 2 (N Re )m

-1< m < 0

El trabajo de Rushton fue hecho para fluidos Newtonianos ypara sistemas con una pal a de agitación. Sin embargo, en fermentaciones muy frecuentemente ocurre que el fluido no es Newtoniano y el sistema contiene más de

un propulsor. De una forma práctica, se recomienda que: Di < Hi < 2*Di. La figura siguiente muestra un sistema con varias palas.

En el caso de haber más de un propulsor, se procede de la siguiente forma de acuerdo con la figura de abajo:

•

Se calcula Np para un agitador

•

Se multiplica por el número de agitadores

En el caso de fluidos no-Newtonianos, en fermentación frecuentemente se encuentran fluidos pseudoplásticos, se calcula el NRe equivalente.

Newtoniano: τ = µ

dv dx

Binghamniano: τ = τ0 + γ

dv dx

⎛ dv ⎞ ⎟ ⎝ dx ⎠

Pseudoplástico: τ = K⎜

K: índice de consistencia n: índice de fluidez µ A : viscosidad aparente

γ : coeficiente de rigidez

τ = µA

dv dx

⎛ dv ⎞ µ A = K⎜ ⎟ ⎝ dx ⎠

n −1

Según Metzner & Otto, para fluídos pseudoplásticos: Di N 2 − n ρ ⎛ n ⎞ ⎜ ⎟ 0,1K ⎝ 6n + 2 ⎠ 2

N Re ' =

La figura de abajo correlaciona el Número de Potência con el Reynolds modificado.

Sin embargo, para fermentaciones, las características del fluido varían durante un proceso fermentativo, variando por tanto los índices como K y n (figura 4).

Agitación con Aireación

Al airearse un líquido agitado mecánicamente se observa una reducción de la potencia disipada debido a la reducción de la densidad aparente de la mezcla líquido/burbujas en las vecindades de la turbina. Al estudiar este asunto Oyama definió el número de aireación (Na):

velocidad sup erficial del aire Q Di Q Na = = = velocidad ter min al turbina N Di ND

Q: flujo volumétrico de aire

Y construyó la curva Pg / P versus f(Na) (figura 5).

P: potencia sin aireación Pg: potencia con aireación Michel y Miller examinaron otros medios de relacionar potencia en líquidos aireados, inclusive para grandes volúmenes, desarrollando la siguiente ecuación:

⎛ ND i 3 ⎞ ⎟ Pg = K ⎜ P0 ⎜ Q 0,56 ⎟ ⎠ ⎝

0,45

K: constante que depende de la geometría

Esta correlación se ajusta al gráfico de Oyama y es válida para tanques desde 15 hasta 42000 l. Aunque desarrollada para fluidos newtonianos, es aplicable para fluidos nonewtonianos en régimen turbulento, igualmente para sistemas geométricamente no semejantes . Las dos figuras de abajo muestran los estudios de Michael y Miller para la Potencia disipada con aireación para fluidos newtonianos y no-newtonianos.

Transferencia de masa en sistemas agitados y aireados

El trabajo clásico de estudio de transferencia de O2 en sistemas aireadosagitados fué hecho por Cooper, basado en datos obtenidos a partir del método de sulfito:

K L a = k 1 (Pg V )α VSβ

KLa: coeficiente de transferencia (m H2O/L.h.atm) engloba H y ∆P Pg/V: potencia disipada por unidad de volumen (HP/1000L) VS: velocidad superficial (cm/min) K1: constante de proporcionalidad A partir de los datos de la figura de abajo se propuso la siguiente ecuación para KLa: K L a = k 1 (Pg V )0,95 VS 0,67

Alternativamente, Richards desarrolló la siguiente ecuación a partir del análisis dimensional, cuyos datos están correlacionados en la figura de abajo: K L a = k (Pg V )0,4 VS 0,5 N 0,5

Ambos trabajos se hicieron en tanques pequeños, de hasta 60 litros, usando el método del sulfito. Posteriormente, Fukuda trabajando en tanques más grandes encontró la necesidad de introducir en la ecuación un término relativo al número de turbinas. Asi, llegó a la siguiente ecuación:

(

)

K L a = (α + δN i ) Pg / V 0,77 VS 0,67

para tanques de 100 a 42.000 litros, se ilustra en la figura siguiente

En trabajos con S. cerevisae utilizando un fermentador Waldohof de 20.000L, Hospodka determinó la siguiente relación:

K L a = k (Pg V )0,72 VS 0,11

Mientras Fukuda trabajando con fermentaci贸n de Endomyces (pseudopl谩stico) encontr贸 que la expresi贸n para KLa puede ser: K L a = k (Pg V )0,33 VS 0,56

Ampliación de Escala Desarrollo de procesos microbiológicos

Escala de Banco (screening, medio de cultivo,etc.)

Escala Piloto (condiciones optimizadas de fermentación)

Escala Industrial (maximización de la produtividad)

En los procesos de adaptación de fermentaciones piloto de pequeñas escalas para grandes escalas, las condiciones óptimas ambientales deben ser mantenidas al máximo posible. En el caso de factores químicos (medio de cultivo) esto es relativamente factible, sin embargo para los factores físicos (transferencia de masa, agitación, tensiones de cizallamiento, potencia disipada) se hace más difícil debido a la dependencia de estos de la geometría del sistema.

El criterio de selección de diferentes cepas para traslado a gran escala es también importante.

Criterios para ampliación de escala

•

taza volumétrica de transferencia de O2 constante (KLa)

•

velocidad terminal del propulsor constante ( πND i )

•

potencia por unidad de volumen constante (Pg/V)

•

tiempos de mezcla iguales

•

número de Reynolds o momento similar

•

control del tipo feedback (de retroalimentación) para asegurar que los factores ambientales claves sean mantenidos constantes

En procesos donde el oxígeno es un factor de control importante, KLa es un buen criterio de ampliación. Sin embargo, no siempre es necesario o deseable satisfacer enteramente la demanda de oxígeno para el microorganismo, por varias razones:

•

La producción puede alcanzar la tasa máxima aún cuando la demanda de oxígeno no es satisfecha.

•

Puede ser necesario restringir la oferta de oxígeno para alcanzar la tasa máxima.

•

La potencia extra añadida puede no justificar económicamente las ganancias en productividad.

Los procedimientos de escalado basados en agitación-aireación, incluyen técnicas de pronóstico de la velocidad de agitación requerida para obtener la misma eficiencia de aireación de la pequeña escala. Esto se debe a 4 razones básicas:

•

aumento del área interfacial de las burbujas

•

aumento del tiempo de retención de las burbujas

•

Prevención de la coalescencia

•

disminución del espesor de la película de líquido

Medida de KLa como criterio de ampliación

En este método se tiene como regla medir el KLa en la pequeña escala y en la grande escala. Por conveniencia, se debe usar el mismo método de determinación de KLa en ambas escalas. De esta forma se determinan las condiciones en la escala mayor para que se produzca la misma eficiencia en aireación. Para cada método existente de determinación de KLa se presentan ventajas y desventajas que deben ser tenidas en cuenta en el momento de la elección:

b.1.

Método del sulfito

•

simple y no requiere de equipamentos caros

•

es una medida que corresponde a una media en el fermentador

•

es demorado

•

necesita limpieza escrupulosa, lo que puede ser un inconveniente en plantas industriales

•

el costo del sulfito es alto, que no beneficia el trabajo a gran escala

•

Utiliza electrodos

•

simple y relativamente barato

•

es rápido (3 a 15 minutos)

•

el uso de nitrógeno puede tener un costo muy alto a gran escala

•

es una medida puntual, no es una media, que se convierte en un problema cuando la mezcla no es buena como en los fermentadores industriales

•

se requieren electrodos de respuesta rápida (polarigráfico)

b.2.

•

Método dinâmico

Este método necesita solamente electrodos de membrana, de respuesta lenta (es necesario un factor de corrección)

•

La medida se hace en condiciones reales de fermentación

•

Mide KLa y la taza de demanda de oxigeno al mismo tiempo

•

No puede ser empleado en fermentadores con limitación de oxígeno

•

Medida puntual

•

La mezcla deficiente produce errores grandes

•

Es demorado b.3.

Balance Gaseoso

•

Es simple (mas que los anteriores) y rápido

•

La medida es hecha en condiciones normales de temperatura

•

mide KLa y Qo2

•

Requiere de un electrodo de alta sensibilidad que es costoso (paramagnético)

Además de estas consideraciones, deben hacerse algunas otras como:

No siempre un mismo KLa significa una misma productividad, principalmente si los fermentadores son de relaciones geométricas diferentes.

Se pueden emplear combinaciones de métodos (método sulfito para condiciones preliminares y después dinámico o balance)

Para los casos en que el KLa cambia durante la fermentación, principalmente con organismos filamentosos, la medida debe hacerse en el mismo instante de la fermentación

Este método de escalado no hace previsión de los resultados

Otros métodos dados a continuación, son normalmente usados para prever valores de KLa. Estos se usan a priori y los valores son verificados con medidas de KLa por uno de los métodos descritos.

Método de Pg/V constante

Considerando las ecuaciones de Cooper en régimen turbulento:

(

K L a = k ' Pg V

)0,95 VS0,67

y Rushton

N P = K (N Re )m

⎛ ρND 2 ⎜ = K ⎜ µ ρN 3 D 5 ⎝ P0

⎞ ⎟ ⎟ ⎠

que nos da

P = CρN 3 D 5 en régimen turbulento (m = 0)

P = CµN 2 D 3 en régimen laminar (m = -1)

Se pueden prever los efectos de las variables de operación sobre la potencia consumida y sobre el escalado. En sistemas aireados se utiliza la relación de Michel y Miller para regímenes turbulentos:

⎛ P 2 ND 3 ⎞ Pg = k⎜ o 0,56 ⎟ ⎟ ⎜ Q ⎠ ⎝

0,45

Sin embargo, se acepta bien el uso de la ecuación de Rushton para sistemas noaireados, pues las correcciones hechas para sistemas aireados son tan pequeñas que se podrían ignoradas.

Al mismo tiempo, las técnicas de escalado son bien claras para fermentadores de geometría similares, aunque se pueden hacer aproximaciones aceptables para sistemas no similares.

En el método de escalado con Pg/V constante, se considera que los rendimientos de los productos serán proporcionales a Pg/V y a la eficiencia de aireación (KLa).

c.1.

P = CρN 3 D 5

Régimen turbulento

, donde C = constante que depende de la geometría

P1 V CρN 13 D15 = 1 = P2 V2 CρN 2 3 D 2 5

con fermentadores similares

V1 N 3D 5 = 1 1 V2 N 2 3 D 2 5

con

D1 ⎛ V1 ⎞ 3 ⎟ =⎜ D 2 ⎜⎝ V2 ⎟⎠

tenemos

⎛V N 2 = N 1 ⎜⎜ 1 ⎝ V2

⎞9 ⎟⎟ ⎠

c.2.

Régimen de transición

En este caso es necesario construir toda la curva N Po = f (N Re ) . Si existe similitud geométrica la curva será la misma para diferentes escalas. Así, los pasos a seguir serán:

Calcular NRe1 Hallar NP1 con la curva Calcular P1 = N p1ρN 13 D15 Calcular P2* = P1 * V2 V1 Calcular diferentes números de Reynolds para diferentes N2 Hallar los respectivos NP2 con la curva Calcular P2 para cada N2 de la ecuación P2 = N p2ρN 2 3 D 2 5 Trazar log P2 versus log N2 Hallar N2 correspondiente a P2* del gráfico de arriba

c.3.

Régimen Laminar

A esta región se llega por la manipulación de la ecuación P = CµN 2 D 3 con N2=N1 para Pg/V constante. Para mantener Pg/V constante es necesario alterar la razón de aire para mantener la velocidad superficial (VS) constante. El cálculo de Q2 se puede hacer de la siguiente forma:

VS1 = VS2

4Q1 πD12

4Q 2 πD 2 2

⇒

⎛D Q 2 = Q1 ⎜⎜ 2 ⎝ D1

⎞ ⎟⎟ ⎠

en sistemas geométricamente similares

D 2 ⎛ V2 =⎜ D1 ⎜⎝ V1

⎞3 ⎟⎟ ⎠

∴

⎛V Q 2 = Q1 ⎜⎜ 2 ⎝ V1

⎞3 ⎟⎟ ⎠

A pesar de ser ampliamente utilizado, este método tiene algunas desventajas teóricas y prácticas: el método se basa en la proporcionalidad entre Pg/V y la eficiencia de aireación, lo que no siempre es verdad, aún en regímenes turbulentos. Además de eso, aunque sea deseable trabajar en régimen turbulento (relación de Cooper es establecida en estas condiciones), esto no siempre es posible, principalmente en los casos de fluidos viscosos, que generalmente caen en el régimen transitorio. Por lo tanto en estos casos el uso de Pg/V constante puede ser de validez dudosa. La ecuación de Rushton se basa en sistemas no aireados, aunque pueda ser utilizada con buena aproximación en sistemas aireados, como criterio de escalado. El método se aplica bien para sistemas geométricamente similares, aunque sistemas geométricamente no similares produzcan curvas Np versus NRe diferentes, el factor más importante que afecta la potencia consumida, es la geometría del agitador, como muestra la figura de Rushton (debido a que se disipa mayor potencia en las vecindades del agitador). En este punto las ecuaciones de Richard para 3 tipos de agitadores son muy valiosas:

Agitador de palas rectas:

P0 = 0,035ρN 3 D i 3.7 WB0,8 R 0,4 J 0,3

Agitador de palas curvas

P0 = 0,0085ρN 3 D i 3.7 WB0,8 R 0,4 J 0,3

Agitador de turbina

P0 = 0,25ρN 3 D i 2,2 WL1,5 B0,8 R 0,4 J 0,3

Donde J: longitud de las chicanas B: número de paletas R: número de chicanas

W D i

En el caso de fluidos no Newtonianos se puede usar la metodología de Metzner y Otto o Calderbank y Moo-Young, o sea, se emplea el NRe modificado:

NDi ρ 2

N Re =

Di N 2 − n ⎛ n ⎞ ⎜ ⎟ 0,1K ⎝ 6n + 2 ⎠ 2

N Re =

Debido al hecho de que las características reológicas de estos fluidos varían durante la fermentación, es importante que los datos para la ampliación de escala sean tomados en instantes bien definidos en la fermentación. Además de eso, la tensión de cizallamiento aplicada a un fluido en el fermentador, varía radialmente, siendo mayor en las vecindades de las paletas del agitador. Esto significa, en el caso de los fluidos pseudoplásticos, cuyo comportamiento reológico varía con la tensión de cizallamiento, que se hace difícil evaluar la viscosidad. Conscientes de esto, Metzner y Otto

propusieron el concepto de la tasa de deformación media en el fermentador, que es proporcional a la rotación:

Donde γ : tasa de deformación media

γ = kN

k: constante de proporcionalidad (10<k<13)

Si las propiedades del fluido son conocidas, sepuede determinar la viscosidad aparent e media:

µ=

τ γ

para pseudoplásticos τ = K(γ )n µ a = K(kN )n −1

entonces

µa :

viscosidad aparente media

La ecuación anterior se puede usar para propósitows de escalado.

c.4.

Discusión sobre el método de Pg/V constante

Por análisis dimensional Rushton (1951) obtuvo la siguiente expresión para el coeficiente de transferencia de masa KL:

N Sh α N Re N Sc

KLD α DL

⎛ ρND 2 ⎜⎜ ⎝ µ

⎞ ⎟⎟ ⎠

⎛ µ ⎜⎜ ⎝ ρD L

⎞ ⎟⎟ ⎠

DL: difusividad del oxígeno en fase líquida α, β : constantes experimentales

Asumiendo tanques geométricamente similares, propiedades constantes del fluido, y K L constante, la ecuación de arriba se convierte para escalado en:

N 2 ⎛ D1 ⎞ ⎟ =⎜ N 1 ⎜⎝ D 2 ⎟⎠

2 α−1 α

Para Pg/V constante en la región turbulenta, tenemos a partir de la ecuación de Rushton:

P2 ⎛ N 2 =⎜ P1 ⎜⎝ N 1

⎞ ⎟⎟ ⎠

⎛ D2 ⎜⎜ ⎝ D1

⎞ ⎟⎟ ⎠

Combinando las ecuaciones se tiene:

P2 ⎛ D 2 ⎞ ⎟ =⎜ P1 ⎜⎝ D1 ⎟⎠

5− 3

2 α −1 α

⎛D = ⎜⎜ 2 P1 V1 ⎝ D1

P2 V 2

⇒

⎞ ⎟⎟ ⎠

2−3

2 α −1 α

P2 V2 P1 V1

2 3 4 5

0,1 0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

D 2 D1

Para, α ≅ 0,75 , P2 V2 = P1 V1 ,por

lo tanto, para cualquier valor de D2/D1 el valor de P/V será

igual. Según Aiba, sepuede considerar en α ≅ 0,75 para criterios de escalado, aunque Bart holomew en 1960 haya verificado que en fermentadores bien proyectados el valor de α es un poco mayor que 0,75, esto implica que P/V decrecería con la ampliación de es cala para mantener un mismo KL

Método basado en velocidad terminal constante donde Vi = πND (velocidad terminal)

Vi1 = Vi2

πN1D1 = πN 2 D 2

⇒

N 2 = N1

D1 D2

o para fermentadores geométricamente semejantes

⎛V N 2 = N 1 ⎜⎜ 1 ⎝ V2

⎞3 ⎟⎟ ⎠

El máximo cizallamiento ocurre en la extremidad del agitador. Si comparáramos la ec uación dearriba con la ecuación para P/V constante, el cizallamiento aumentaría en el caso del criterio P/V constante y en el caso del criterio Vi constante la relación P/V dis minuiría.

La aplicación de este método está restringida a microorganismos sensibles al cizallam iento, como protozoários y microorganismos filamentosos.

Steel y Maxon (1959) mostraron que este método puede ser aplicado efectivamente en fluidos con microorganismos filamentosos. Se verificó que la tasa de transferencia de oxígeno obedece a la siguiente ecuación:

TTO = k' Vi1,6

La explicación dada es que en sistemas viscosos el problema de coalescencia de las burbujasde aire no es tan dramático, siendo sólo necesario una zona de alto cizallami ento para promover la formación de pequeñas burbujas.

Bajo estas circunstancias la eficiencia de aireación se correlaciona con la velocidad te rminal del agitador.

Para fluidos Newtonianos se observa lo contrario, o sea, la eficiencia de aireación dependerá de la potencia disipada y no de la velocidad terminal.

Método basado en el tiempo de mezcla

El tiempo de mezcla es definido como el tiempo requerido para que una gota de líquido sea completa y uniformemente diluida en el seno de un fluido cont enido en un tanque agitado, considerando que los fluidos poseen las mismas propiedades físi cas, lo que significa que la mezcla ocurre a nivel molecular. Nowood y Metzner (1960) correl acionaron un tiempo de mezcla adimensional con el número de Reynolds para un agit ador de paletas planas.

φ=

(

)

2 1 1 2 3 6 2 NO t g D 1 3 H2D2

donde φ : tiempo de mezcla adimensional Dt: diámetro interno del tanque g: constante gravitacional H: altura del líquido D: diámetro del agitador

La figura φ versus número de Reynolds es muy similar a la Np versus NRe de Rushto n y particularmente para el agitador usado, φ = N Po = 6 y para NRe > 104.

Los mismos autores verificaron que para criterios de escalado, en tanques geométrica mente similares y en régimen turbulento:

tm1 N 12 3 D1 −1 6 = tm 2 N 2 2 3 D 2 −1 6

Con tm1 = tm2, entonces:

⎛D N 2 = N 1 ⎜⎜ 2 ⎝ D1

⎞ ⎟⎟ ⎠

Según Rushton se tiene:

P2 V2 P2 V1 P2 D13 N 2 3 D 2 2 = = = P1 V1 P1V2 P1 D 2 3 N 13 D 1 2

Combinando las ecuaciones:

P2 V2 ⎛ D 2 =⎜ P1 V1 ⎜⎝ D1

⎞ ⎟⎟ ⎠

11 4

⎛V = ⎜⎜ 2 ⎝ V1

⎞ ⎟⎟ ⎠

11 12

Se puede concluir, en el uso de este método, que la potencia por volumen unitario aum entará casi que proporcionalmente con el volumen. La experiencia muestra que este enorme aumento es innecesario. Este método no es por lo tanto recomendado en sistemas con aireación-agitación. Podría ser útil, sin embargo, para sistemas no-aireados y viscosos.

Método basado en el KLa constante

Aiba (1965) desarrolló un método basado en el mantenimiento del KLa constante, inclu yendo el cálculo de la razón de aire requerida a partir de las relaciones de aireación por bu rbujeo (sin agitación mecánica) y la estimativa de la velocidad de agitación a partir de las relaciones de Cooper.

Las ecuaciones de aireación por burbujeo desarrolladas por Eckenfalder (1956, 1959) son: KL = a=

βν B H

1 N Sc1 2

QH 1 + β' 10d B ν B V H'

donde dB: diámetro de las burbujas νB :

velocidade terminal del aire

β,β' : constantes

Combinando las 2 ecuaciones y despreciando el término β' 1 , normalmente pequeño, H'

se tiene:

K La =

β H 2 3Q 10Vd B N Sc1 2

Si las propiedades físicas del líquido son constantes:

a α

Q H V

2 3

Para escalado:

[K L a ]1 [K L a ]2

Q V ⎛H = 1 1 ⎜⎜ 1 Q 2 V2 ⎝ H 2

⎞ ⎟⎟ ⎠

d B2 d B1

Para el mismo KLa y dB1=dB2

Q 2 Q1 ⎛ H 1 ⎜ = V2 V1 ⎜⎝ H 2

⎞ ⎟⎟ ⎠

Esta relación proporciona el flujo de aire, Q2, en la escala mayor. Para determinar la velocidad de agitación, son necesarios los siguientes pasos:

tomar las relaciones de Cooper, relacionando KLa y Pg/V. Ejemplo para “vaned disc”

⎛ Pg K L a = 0,0635⎜⎜ ⎝V

⎞ ⎟ ⎟ ⎠

0,95

VS 0,67

donde KLa: kgmol/h.m3.atm Pg/V: HP/m3 VS: m/h conocido KLa en la pequeña escala, Pg en la escala grande y con V y VS conocidas

Pg 2

⎛ K La = V2 ⎜ ⎜ 0,0635V 0,67 S2 ⎝

⎞ ⎟ ⎟ ⎠

1 0,95

la agitación se determina por un método iterativo como se describe a continuación: ; Se determina P0 por el gráfico de Oyamah y Endoh que relaciona Pg/P0 versus Na ( Na = Q/ND3) dando un valor de N. ; Con el mismo valor de N se calcula P0 a partir de la ecuación de Rushton

P0 = CρN 3 D 5

(regiónturbulenta)

; Comparar los 2 valores de P0. Este método tiene serios inconvenientes como el cálculo del flujo de aire basado en relaciones de aireación por burbujeo sin agitación, el sistema de fermentación normalmente posee agitación mecánica; debido al uso de las ecuaciones de Cooper, este método sólo es válido si se usa el método del sulfito en la determinación de KLa.

Las relaciones de Oyamah y Endoh son aplicables para tanques con un único agitador .

Observaciones:- En el caso de fluidos no Newtonianos, se debe usar la relación de Calderbank y Moo-Young, donde se adapta el NRe para fluidos viscosos.

N Re =

D 2 N 2 − nρ k ⎛ 6n + 2 ⎞ ⎜ ⎟ 10 ⎝ n ⎠

para el cálculo de Po en vez de la ecuación de Rushton.

- Para el cálculo de Pg se puede usar la ecuación de Michel y Miller en vez de la de Cooper.

(

)

⎛ 3 0,44 ⎜ P ND i C⎜ 0 ⎜ Na 0,56 ⎝

⎞ ⎟ ⎟ ⎟ ⎠

0,45

⎛ P 2 ND i 3 ⎞ ⎟ = Pg = k' ⎜ 0 ⎜ Q 0,56 ⎟ ⎠ ⎝

0,45

Donde: Pg: HP N: min-1 Di: cm Q: l/min k’: depende da geometria e dimensões

Segun Nishikawa, k’ depende de las características del fluido.

Fluido

k’

Newtoniano

0,087

no-newtoniano

0,91

0,4

0,087

no-newtoniano

0,73

3,4

0,087

altamente no-new-

0,65

0,05-0,065

toniano

En vez de la relación de Cooper se pueden usar otras relaciones para KLa:

⎛ Pg K L a = k' ⎜⎜ ⎝V

⎞ ⎟ ⎟ ⎠

0, 4

N 0,5 VS 0,5

⎛ Pg K L a = (1 + 2,8N i )⎜⎜ ⎝V

Richards

⎞ ⎟ VS bµ ap c ⎟ ⎠

La elección del valor de KLa que será usado en el escalado, debe ser hecha en relació n al ingreso del proceso, permitiendo la máxima productividad, evitando excesos y desp erdicio de energía.

Método basado en la transferencia de momento

Blakebrough y Sambamurthy (1966) sugirieron un método basado en la transferencia de momento, considerando que el agitador funciona como una bomba. El factor momento definido por ellos es el siguiente:

M f = (WL)(ND i ) N (D i − W )

donde L: ancho de las palas del agitador W: longitud de las palas del agitador

Y el KLa por la ecuación: ⎡ ⎛ Pg K L a = k ⎢ tm 0,203 ⎜⎜ ⎢ ⎝V ⎣

1,79

⎞ ⎟ ⎟ ⎠

⎤ M f 1,08 N 0,0437 ⎥ ⎥ ⎦

Método basado en relaciones geométricamente no similares

Oldshwe (1966) sugirió que la geometría similar no es tan importante para escalado co mo

mantener constantes KLa y el cizallamiento. Sugirió que la relación Di/DT puede variar dentro de ciertos límites. Locomún es mantener constantes KLa y la velocidad terminal y ajustar Di/DT dentro de los límites sugeridos por la figura de abajo. El valor típico de Di/DT es de 0,25-0,4 y la velocidad terminal típica es de 500 cm/s.

faixa de Franja de operação operación p/ ferm.

(Di/Dt)ot p/Kla

6 5 HP aumentando

4 3

Área de buena Área de boa dispersión del dispersão de gas gás

2 1 0 10

100 Potencial (H.P.) Taxa de aeração Tasa Aireación

1000

Otras consideraciones

Para ampliaciones de escala, 500-1000 m3, factores adicionales dificultan el escalado. Por ejemplo, si el fermentador va a ser adquirido los problemas de transporte limitan e l diámetro del tanque (3,6-4,3 m), lo que afecta consecuentemente la geometría. También los problemas de control de temperatura. El fermentador debe ser capaz de remover de 10.000 a 15.000 cal/Lh. A veces es necesario intercambiadores externos, o soluciones como serpentines (inconvenientes) o también chicanas y tubo de aspiración serpentin ados. j.

Selección del procedimento de escalado

No existe un método que pueda ser aplicado en todo tipo de fermentador con una alta probabilidad de éxito. Al contrario, existen pocos casos donde un método puede ser aplicado con total convicción. La selección de un método depende, de un

lado, de la preferencia personal y de otro, de las características del proceso, del fluido y de las condiciones de operación:

•

El método basado en el tiempo de mezcla, no tiene prácticamente aplicabilidad.

•

El método de la velocidad terminal constante puede ser aplicado si el

microorganismo es sensible al cizallamiento.

•

Los métodos basados en las medidas de KLa son demorados y no permiten prever

resultados. Pueden, sin embargo, ser usados junto con otros métodos, como el del KLa constante

•

El método de P/V constante, a pesar de sus limitaciones, es probablemente el mejor

procedimiento.

Transferencia de Masa Externa e Interna con Reacción Química En sistemas con células o enzimas inmovilizadas, o aún hongos creciendo en forma pe letizada, los fenómenos de transferencia de masa son bastante importantes. De form a general ellos son los factores limitantes del proceso, afectando negativamente la velo cidad global de reacción. Existen dos tipos a considerar: transporte de masa externo e interno.

•

El perfil de concentración en las vecindades y en el interior de una esfera de biocatalizador puede ser del tipo

LÍQUIDO

SÓLIDO

Sm P Ss S

Pm Ps

P,S: concentración de sustrato y producto enel interior del catalizador

Pm, Sm: concentración media de sustrato y productos Ps, Ss: concentración de sustrato y producto en la superfície del soporte

δ : espesor de la película de líquido R: radio de la partícula

Transferencia de massa externa

El flux másico externo puede ser dado por la ecuación: j = K (S m − Ss )

aquí

j: flux másico por unidad de área de la partícula K: coeficiente global de transferencia de masa, incluyendo coeficiente de transferencia de masa y permeabilidad de membrana (cm/s) Datos conocidos: j y Sm

j = rs

volumen de la partícula R = rs 3 área de la partícula

rs = robs

volumen del reactor volumen de la partícula

rs: velocidad de reacción por volumen de partícula Datos desconocidos: K y Ss relacionando números adimensionales como:

d.1.

N Sh = 2,0 + 0,47 N Re

0,62

para reactor de mezcla (Levins y Glastonoury)

N Sc

0,36 ⎛

D ⎜⎜ i ⎝ DT

⎞ ⎟⎟ ⎠

0,17

donde

N Sh =

kd p D

;

N Re =

d p 4 3 ε1 3 ν

;

N Sc =

ν D

k: coeficiente de transferencia de masa dp: diámetro de la partícula D: difusividad del sustrato en solución

ε : disipación de energía/unidad de masa

ε=

P W

P: potencia consumida W: masa de fluido en el reactor

ν=

µ ρ

viscosidad cinemática

Di: diámetro del agitador DT: diámetro del tanque Para reactor de tanque

N Sh = 2,0 + 0,012 N Re 0,41 N Sc 0,64

El cálculo de ε es hecho para reactores en régimen turbulento (NRe > 104) donde Np es constante y función de la geometría del reactor.

Np =

ε=

P ρN D i 5 3

3 5 N p N 3D i5 P N p ρN D i = = W V ρV

V: volumen líquido del reactor

Por el NRe y por la geometría del reactor se determina Np y conociendo N, V y Di se determina ε .

d.2.

Reactor de lecho fijo

Es comun en términos de reactores de lecho fijo definir el factor jD que es una función de números de Sh, Re y Sc, o sea

jD =

N Sh (N Sc )2 3 = k ⎛⎜⎜ µ ⎞⎟⎟ N Re N Sc v ⎝ ρD ⎠

k: coeficiente de transferencia de masa (cm/s) v: velocidad superficial (basada en la sección transversal del reactor vacío)

Segun Divivede y Updhay la siguiente relación representa bien un reactor de lecho fijo: 0,458 ⎛ d p vρ ⎞ ⎜ ⎟ jD = ε B ⎜⎝ µ ⎟⎠

−0,407

donde ε B : porosidad del lecho Se sabe que j = k (S m − Ss ) ⎛ µ ⎞ E k = jD v⎜⎜ ⎟⎟ ⎝ ρD ⎠

−2

−2 0,458 N Re −0,407 N Sc 3 εB

O sea

Ss = S m −

2 jε B N Re 0,407 N Sc 3 0,0458

Reactor de lecho fluidizado

Según Cher et al

⎡ d p vρ ⎤ jD = 1,77 ⎢ ⎥ ⎣ µ(1 − ε B ) ⎦

−0,44

⎡ N Re ⎤ ⎥ ⎣ (1 − ε B ) ⎦

o sea k = 1,77 v ⎢

−0,44

N Sc

−2

Ss = S m

j ⎡ N Re ⎤ − ⎢ ⎥ 1,77 v ⎣ (1 − ε B ) ⎦

0,44

N Sc

Segun algunos autores las relaciones de transferencia de masa en lecho fijo son dependientes del Reynolds (Wilson y Geankoplis).

55 < NRe < 1500

j B = N St N Sc

0,35 < ε < 0,75

0,25 N Re −0,31 ε

0,0016 < NRe < 55

j D = N St N Sc

2 1,09 N Re 3 ε

Transferencia de masa interna

Los catalizadores bioquímicos (enzimas y células), son frecuentemente utilizados en la for ma inmovilizada, sea en el interior de poros de soportes porosos o aprisionados en matrices en un gas. La figura deabajo representa un poro esférico o partícula de gel de radio R de un biocatalizador conocido. Entonces el balance de materia en un volumen esférico infinitesimal, contenido entre las esferas de radio r y r+dr, es el siguiente, sabiendo que el flujo de masa está dado por la Ley de Fick:

j = − D ef

ds dr

R r r+dr

Asumiendo régimen estacionario

ds ds ⎛ ⎞ ⎛ ⎞ 4πr 2 ⎟ − ⎜ − D ef 4 πr 2 ⎟ = rs 4πr 2 dr ⎜ − D ef dr dr ⎝ ⎠r ⎝ ⎠ r + dr

⎛ ds ds − r2 D ef ⎜⎜ r 2 dr ⎝ dr r + dr dr

⎞ ⎟ ⎟ r⎠ = r 2 rs

Haciendo limite dr

D ef

d ⎛ 2 ds ⎞ 2 ⎜r ⎟ = r rs dr ⎝ dr ⎠

⎛ d 2 s 2 ds ⎞ ⎟=r + D ef ⎜ ⎜ dr 2 r dr ⎟ s ⎝ ⎠

D ef = D s

donde Def: difusividad efectiva

ε τ

Ds: coeficiente de difusión del sustrato en solución

ε : porosidad τ : tortuosidad rs: tasa de reacción rs = −

ds dt

Esta ecuación solo tiene resolución analítica cuando rs es lineal, orden cero o cuando es del tipo rs =

−ds = kS m dt

(m constante).

En ciertos casos con la ecuación de Michaelis-Menten para enzimas o Monod para microorganismos la resolución solo es obtenida numéricamente.

d 2S dr

2 ds v max S = r dr D ef S + k m

En muchos casos es común encontrar fenómenos de inhibición, sea por substrato, sea por producto, o aún por ambos, lo que complica aún más la ecuación de la tasa de reacción.

d 2s dr

2 ds v max S = r dr D ef S + k m + S 2 K I

Para la resolución de este tipo de ecuación, o sea, determinar el perfil de concentraci ón de S enel interior de la partícula, es necesario conocer, además de Def, también la s constantes cinéticasde la reacción, Vmax, Km, KI, cuando el catalizador está inmovil izado (en este caso las constantes generalmente difieren de aquellas del catalizador en solución). Es común y más conveniente trabajar con las ecuaciones adimensionalizadas. Con esto, se tiene para la ecuación adimensionalizada:

d 2C dx

Ck1 2 dC =β x dx k1 + C + k 2 C 2

donde C=S/Sm x=r/Ri k1=km/Sm k2=Sm/KI β=

R 2 v max D ef k m

(número de Damköhler modificado)

Sm: concentración en el medio líquido Con las condiciones de contorno:

- El gradiente es cero en el centro de la partícula

dC =0 dx

para x = 0

para x =1 se tiene

j = Def

dS dr

j* = Def

= k (S m − S s ) r=R

dC dx

x =1

= kR (1 − C r =1 )

o sea

dC dx

= x =1

(

kR 1 − C x =1 Def

Haciendo

kR =α Def

(

dC = α 1 − C x =1 dx x =1

)

(número de Biot)

)

Módulo de Thiele

Otro parámetro muy común en difusión con reacción es el módulo de Thiele, qu e se define a continuación

φ=R

rsm D ef S m

donde rsm: tasa de reacción en las condiciones del medio líquido (o sea S=Sm en el interior

de la partícula)

⎛ v max S m φ = R⎜ ⎜ k +S + S 2 K S D m m I m ef ⎝ m

⎞2 ⎟ ⎟ ⎠

)

(

⎛ R 2 v max k m 1 ⎞ 2 ⎟ φ=⎜ ⎜ D ef k m S m k1 + 1 ⎟ ⎠ ⎝

⎛ β k1 φ = ⎜⎜ ⎝ k1 + 1 + k 2

⎞ ⎟⎟ ⎠

Factor de efetividad

El factor de efectividad es la relación entre la velocidad de reacción observada y la velocidad de reacción que sería observada si S=Sm en el interior de la partícula.

η=

( flux másico ) A V tasa observada = tasa S = S m v max S m (k m + S m + S 2 K I ) D ef

η=

(

dS 3 dr r = R R

v max S m k m + S m + S m

⎛ k1 + 1 + k 2 η = 3⎜ ⎜ R 2v max D ef k m ⎝

⎛ k + 1 + k2 η = 3⎜⎜ 1 β k1 ⎝

3 ⎛ dC ⎞ η= 2 ⎜ ⎟ φ ⎝ dx ⎠ x =1

⎞ Sm ⎟ ⎟ km ⎠

)

⎛ k + 1 + k2 = 3⎜ 1 ⎜ R 2v max D ef ⎝

⎞ dC ⎟S m ⎟ dx x =1 ⎠

⎛ dC ⎞ ⎟ ⎜ ⎝ dx ⎠ x =1

⎞⎛ dC ⎞ ⎟⎟⎜ ⎟ ⎠⎝ dx ⎠ x =1

donde

r R2 dC = s dx x =1 3D ef S m

La utilidad práctica del factor de efectividad es la de prever tasas de reacción en un r eactor en diferentes condiciones de diámetro de la partícula, concentración del sustra to, etc...

e.1.

Metodología para estudios cinéticos con enzima inmobilizada

Tomemos como ejemplo un reactor de mezcla con enzima inmobilizada y esferas de

F S0 F S gel:

dS ⎞ ⎟ V ⎝ dt ⎠ ac

Balance de masa: FS0 − FS − robs V = ⎛⎜ En estado estacionario:

robs =

dS =0 dt

F (S0 − S) = S0 − S V τ

Considerando ε : porosidad del lecho ε=

Vlíquido Vlíquido + Vsólidos

1− ε =

Vl V

Vsólidos V = s Vlíquido + Vsólidos V

Entonces:

rs = rsob

r V = obs Vs 1 − ε

(masa de sustrato/volumen de sólidos.tiempo)

Por otro lado, el flujo de masa para el interior de la partícula por unidad de área es d ado por la ecuación de abajo, considerando que el sistema está en régimen estacionario.

j = rs

Vpartícula A partícula

4 3 πR 3 4 πR

= rs

R 3

De la misma forma

js s = D ef

R dS = k (S m − Ss ) = rs 3 dr r = R

o sea, en la forma adimensional

r R2 dC jR = = s dx x =1 D ef S m 3D ef S m

C x =1 = 1 −

rR j = 1− s KS m 3kSm

Se toma la ecuación de difusión adimensionalizada

d 2C dx

Ck1 2 dC −β =0 x dx k1 + C + k 2 C 2

Haciendo y = dC dx

Ck1 dy 2 =β − y 2 dx x k1 + C + k 2 C

Cuyas condiciones de contorno son:

(

)

dC kR = 1 − C x =1 = y x =1 dx x =1 D ef C x =1 = 1 −

rs R 3kS m

dC dx

x =0

= 0 = y x =0

De forma que se puede aplicar un método de resolución de la EDO, Euler o RungeKutta por ejemplo, conociendo las constantes Vmax, Km, KI de la enzima inmovilizada y Def. Por lo tanto se debe conocer previamente Def y determinar Vmax, Km y KI por el siguiente método de lógica:

Primera consideración

Para concentraciones de sustrato muy bajas, se puede considerar que rs sigue la ecuación de Monod, o sea,

rs = v max ap

Ss k m ap + Ss

k ap 1 1 1 = + m rs v max ap v max ap Ss

⇒

v max : velocidad máxima aparente

rs : tasa de reacción observada ap

k m : km aparente

Ss: concentración de sustrato en la superfície del soporte 1

robs ap

1 v max

km ap v max 1 Ss

Y cuando Ss → 0

1 k m ap 1 = rs v m ap Ss

⇒

rs v m ap = Ss k m ap

o sea, una relación lineal, de forma que la ecuación general se reduzca:

d 2C dx

2 dC = βC x dx

cuya solución analítica es

⎞ ⎛ φ dC = C x =1 ⎜⎜ − 1⎟⎟ dx x =1 ⎝ tghφ ⎠

(módulo de Thiele de 1a orden)

donde φ = β

Por otro lado, rs =

3D ef S m dC R 2 dx x =1

o sea rs =

⎞ 3D ef S m ⎛ φ ⎜⎜ − 1⎟⎟C x =1 2 R ⎝ tghφ ⎠

donde C x =1 =

Ss Sm

entonces rs 3D ef = Ss R2

ap ⎞ v ⎛ φ ⎜⎜ − 1⎟⎟ = max k m ap ⎝ tghφ ⎠

De la ecuación de abajo se obtiene φ φ = 1+ tghφ

v m ap R 2 k m ap 3D ef

donde φ = R

v max D ef k m

Segunda consideración

Considerándose que v max ≅ v max

(no hay pérdidas de actividad en la inmovilización),

se puede hallar km. Alternativamente, se obtiene S por integración numérica de forma que la ecuación general se convierte en:

d 2C dx

2 dC βk1C = x dx k1 + C

Como β ya es conocido de la etapa anterior ( β = φ = R 2

v max ). Asi, se estima km D ef k m

(k1=km/Sm). Para el caso con inhibición por sustrato:

d 2C dx

βk1C 2 dC = x dx k1 + C + k 2 C 2

En este caso, se conoce β y k1 de forma que se puede determinar k2 (k2=Sm/KI) por integración numérica de la ecuación. La etapa siguiente es trazar curvas del factor de efectividad (η ) en función del módulo de Thiele ( φ ) para así poder prever tasas de reacción en un rango amplio de condiciones de operación.

⎡ v max S m φ = R⎢ 2 ⎢⎣ k m + S m + S m K I S m D ef

(

)

⎤2 ⎥ ⎥⎦

⎡ ⎡ ⎤2 v max S m βk m φ=⎢ = R⎢ ⎥ 2 2 ⎢⎣ k m + S m + S m K I S m D ef ⎢⎣ k m + S m + S m K I ⎥⎦

(

η=

3 dC φ2 dx x =1

η=

rs R 2 φ2 3D ef S m 3

)

⎤2 ⎥ ⎥⎦

II.

UNIDAD

CINÉTICA

ENZIMÁTICA,

CRECIMIENTO

BIORREACTORES

ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN La velocidad de una reacción enzimática depende de la concentración de la enzima conforme muestran las figuras de abajo.

4 × [E] 3 × [E] 2 × [E] 1× [E ] 1o ordem

Probables Problemas con Métodos de Det. de Activ. Enz.

v = k [E ]

[E ]

Si, por otro lado, se fija la concentración de la enzima y se varia la concentración de sustrato, se observa el siguiente comportamiento:

v Fase III: cinética de orden cero

v max 2

Fase II: cinética de orden variable ( de 1 a 0 )

Fase I: cinética de 1a orden

Observaciones sobre la curva:

A bajas concentraciones de S sustrato la reacción es de primer orden A medida que S aumenta el orden de reacción disminuye de 1 hasta 0 La tasa máxima de reacción es proporcional a la cantidad de enzima presente A altas concentraciones de S la reacción es de orden cero.

Michaelis y Menten desarrollaron un modelo cinético que se ajusta al comportamiento expuesto en la figura anterior, para una reacción enzimática simple: E+S

k1 k2

E+P

E : Enzima S: Sustrato ES: Complejo enzima-sustrato P : Producto K : Constantes de reacción.

Cuando se mezcla enzima más sustrato, la formación del complejo ES es inmediata y así mismo este se rompe para formar Y

+ S y Y + P . Para llegar al modelo

matemático, Michaelis-Menten asumieron lo siguiente:

1. Como el estudio se basaba en velocidades iniciales, la

concentración de

producto en este caso puede ser considerada despreciable, de forma que la reacción inversa prácticamente no ocurriría. 2. Después de la mezcla de la enzima con el sustrato ocurre la formación del complejo ES, que permanece en una concentración constante, o sea

d [ ES ] =0 dt

Así se tiene:

d [ ES ] = [ E ][ S ]K1 + [ E ][ P ]K 4 − [ ES ]K 2 − [ ES ]K 3 = 0 dt

K 2 + K 3 [ E ][ S ] = = Km K1 [ ES ]

Nota: Por lo tanto, la constante Km, llamada constante de Michaelis-Menten, puede ser aproximadamente igual a la constante de disociación del complejo [ES], en vista que la constante K3 es generalmente mucho menor que K1 y K2, se llega a:

Km =

K2 + K3 K2 ≅ K1 K1

Por otro lado, el total de enzima inicial de la reacción [Eo] es igual a la suma de la enzima libre [Y] mas la enzima en forma de complejo [ES], o sea:

[E 0 ] = [E] + [ES] Debido a que K3 es mucho menor que K1 y K2, la transformación de ES en Y + P será la etapa limitante del proceso, o sea: v = K 3 [E 0 ]

misma forma, si toda la

enzima estuviera participando de

entonces la velocidad de esta estaría en su máximo, o sea:

reacción,

v max = K 3 [E 0 ]

Entonces se tiene:

[ E ][ S ] v [ ES ] Km = = = v max [ Eo] [ E ] + [ ES ]

v = v max

[ E ][ S ] [S ] Km = [ E ][ S ] Km + [ S ] [E] + Km

[S ] : Ecuación de Michaelis-Menten Km + [ S ]

De esta ecuación se obtiene: Se [S] >> Km → v = v max (reacción de orden cero)

Se [S] << Km → v =

Se v =

v max [ S ] (reacción de primer orden) Km

v max → Km = [S] 2

La determinación de las constantes Km y vmax de la Ecuación de Michaelis-Menten es difícil de obtenerse a partir de la gráfica v = fs (s), pues Vmax es una asíntota, por lo tanto sujeta a grandes imprecisiones. Existen maneras más prácticas de obtener estas constantes, siguiendo la técnica de linealización de la ecuación. Existen 3 tipos corrientes de linealización para la ecuación de Michaelis-Menten: Ecuación de Lineweaver- Burk 1 Km 1 1 = + v v max S v max

Ecuación de Eadie-Hanes 1 Km S S+ = v max v v max

Ecuación de Hofstee v = − Km

v + v max S

1 v

vmax

S v

v 1

km vmax

vmax

1 − km

km v`max

1 v`max

vmax km −

− km

1 S

1 km

Lineweaner- Burk

v S

Eadie-Hanes

Hofstee

REACCIONES REVERSIBLES CON MÚLTIPLES SUSTRATOS Reacciones Reversibles Las

reacciones

reversibles

particularmente cuando la

son

muy

frecuentes

concentración de

procesos

enzimáticos,

producto alcanza concentraciones

considerables. Esto es muy frecuente en reacciones de

isomerización, como la

transformación de glucosa en fructosa por la enzima glicosa-isomerasa. El modelo para este tipo de reacción es del tipo:

E+S

De donde se puede obtener:

vp max vs max )S − ( )P Ks Kp dS dP − = = S P dt dt 1+ + Ks Kp (

k1 k2

k3 k4

E+P

Reacciones con múltiples sustratos Gran parte de las reacciones enzimáticas presentan 2 o más sustratos. En buena parte de ellas el 2º sustrato es el agua (hidrólisis), cuya concentración es más de 1000 veces superior a la del otro sustrato, pudiendo considerarse constante, de forma que se cae en un tratamiento semejante al de Michaelis-Menten. En el caso de existir efectivamente 2 sustratos, un posible tratamiento matemático es el siguiente:

E + S1 E + S2 ES1 + S 2 ES 2 + S 1 ES 1 S 2

k1 k2 k12 k 21 k

ES 1 ES 2 ES 1 S 2 ES1 S 2

P+E

V = K [ES1S2] Llamando:

[E] = e

[ES1] = es1

[ES1S2] = es1s2

[S1] = s1

[ES2] = es2

[Eo] = eo

[S2] = s2 Tenemos: eo = e + es1 + es2 + es1s2 Entonces se debe hallar el valor de es1s2 para tener la ecuación de V.

K1. es1 = (eo - es1 - es2 - es1s2 ) s1 K2. es2 = (eo - es1 - es2 - es1s2 ) s2

K12. es1s2

es1. s2

→ es1 =

K12 . es1s2 / s2

K21. es1s2

es2. s1

→ es2 =

K21 . es1s2 / s1

K 12 es1 s 2 = (eo − es1 − es 2 − es1 s 2 ) s1 s2 K es s K 2 2 1 1 2 = (eo − es1 − es 2 − es1 s 2 ) s 2 s1

K1 K12 = K 2 K 21

K es s K 12 es1 s 2 K es s = (eo − 12 1 2 − 2 1 1 2 − es1 s 2 ) s1 s2 s2 s1 eos1 eo es1 s 2 = = K 1 K 12 K 12 s1 K 1 K 12 K 21 K 12 + K 21 + + s1 + + +1 s2 s2 s1 s 2 s1 s2 K1

Por tanto:

K 1 K 12 s1 s 2

K [ Eo ] K K + 21 + 12 + 1 s1 s2

v = v max *

S1 K m * + S1

determinación de

(*)

donde:

v max * =

KEoS 2 S 2 + K 12

Km* =

K12 K1 + K 21S 2 S 2 + K12

las constantes de esta ecuación es un proceso bastante

trabajoso, descrito con detalles por Dixon y Webb, basándose en el mantenimiento de un sustrato constante y variando el otro y viceversa. Por otro lado, si los sitios activos de la enzima son diferentes para cada sustrato, no ocurrirá interferencia en las respectivas afinidades, o sea, K1 = K21 y K2 = K21, de forma que la ecuación se reducirá a:

S1S 2 K1K 2 v= S1 S2 (1 + )(1 + ) K1 K2 K [ Eo ]

REACCIONES CON INHIBICIÓN

No todas las reacciones enzimáticas, siguen la teoría clásica descrita por MichaelisMenten. En muchos casos se encuentra problemas de

inhibiciones, sea por un

compuesto dado presente en la solución, sea por el propio producto formado. Los inhibidores pueden ser del tipo irreversible y reversible.

Inhibición Irreversible En este tipo de inibición el inhibidor forma un complejo inactivo irreversible con la enzima. E+S + I

E+P

EI Como ejemplos de inhibidores irreversibles se pueden citar: cianuros, gases tóxicos, metales pesados.

Inhibidores reversibles En la clase de inhibidores reversibles se encuentra una gran diversidad de tipos. Los más comunes son: competitivos, no-competitivos, incompetitivos, parcialmente competitivos y no competitivos y mixtos. Veremos cada uno a continuación:

a. Competitivo:

El inhibidor se combina reversiblemente con la enzima. El valor de Km es alterado, sin embargo vmax permanece constante. Este tipo de inhibición puede ser atenuada o eliminada por el aumento de la concentración del sustrato.

a.2 Totalmente Competitiva

E+S + I

E+P

ki EI inactivo

El modelo matemático para esta reacción puede ser determinado de la siguiente forma:

[Eo] = [E] + [ES] + [EI] V = K [ES]

vmax = K [Eo]

[E ][S ]

S [ES ] v S Km Km = = = = v max [E ] + [ES ] + [EI ] [E ] + [E ][S ] + [E ][I ] 1 + S + I Km + S + Km I Km Ki Ki Km Ki

v = v max

S I ⎞ ⎛ S + Km⎜1 + ⎟ Ki ⎠ ⎝

a.2 Parcialmente Competitiva

E+S + I

Modelo: [Eo] = [E] + [ES] + [EI] + [EIS] v = K {[ES] + [EIS]} vmax = K [Eo]

EIS

E+P

k i!

ki EI + S

ES + I

k m!

E+P

[ES ] + [EIS ] v = = v max [E ] + [ES ] + [EI ] + [EIS ]

v = v max

[E ][S ] + [E ][I ][S ]

Km K mI Ki = E ][S ] [E ][I ] [E ][I ][S ] [ [E ] + + + Km Ki K mI Ki

1 I ⎞ ⎛ ⎜ 1+ ⎟ Km ⎝ Ki ⎠ 1+ S ⎛ I Km ⎞ ⎜ 1+ ⎟ ⎜ Ki K I ⎟ m ⎠ ⎝

S I ⎞ ⎛ ⎜1 + ⎟ Ki ⎠ ⎝ S + Km ⎛ I Km ⎞ ⎜1 + ⎟ I ⎟ ⎜ Ki K m ⎠ ⎝

No-competitiva:

El inhibidor se combina reversiblemente con la enzima o con el complejo enzimasustrato, inactivandolos. En este caso ocurre una disminución de vmax sin, a pesar de todo, afectar Km. El aumento de

concentración del sustrato no eliminará el

problema, al no restituir el valor de vmax sin la inhibición.

b.1 Totalmente no-competitiva

E+S + I

ki EI + S

S v max I Km + S 1+ Ki

b.2 Parcialmente no-competitiva

ES + I

EIS

E+P

E+S + I

EI + S

[E ][S ] [ES ]

v = K 5 [ES ] + K 6 [EIS ]

v = K5

E+P

k i!

E+P EIS E I EI. S ES . I Ki = = = EI EIS EIS

Eo = E + ES + EI + EIS

E. S EI . S ES EIS + K6 = K5 + K6 Km Km Km Ki Km

Eo = E +

Km =

ES + I

E .S E . I E . I . S + + Km Ki Km Ki

Eo .S . I .S S I + + 1+ Km Ki Km . Ki

K5 + K6 Km

I Ki =

Eo I .S S I 1+ + + Km Ki Km . Ki

I ⎤ ⎡ ⎢ K 5 (Eo ) + K 6 (Eo ) Ki ⎥ .S ⎣ ⎦ I .S I Km + S + Km + Ki Ki

K 5 [Eo] + K 6 [Eo]

I I K 5 [Eo] + K 6 [Eo] S Ki . S = Ki . v= I I ⎞ I ⎞ Km + S ⎛ ⎛ 1+ Km⎜1 + ⎟ + S ⎜1 + ⎟ Ki Ki ⎠ Ki ⎠ ⎝ ⎝

Modelo

K [Eo] + K I [Eo] 1+

I Ki

S S + Km

Obs. 1- ausencia de inhibidor v = K [Eo] con exceso de sustrato. 2 - con exceso de inibidor y exceso de sustrato v = K’[Eo]

Mixta

Corresponde a la

combinación de

la a.2

(parcialmente competitiva) con b.1

(totalmente no-competitiva) o la a.2 (parcialmente competitiva) con b.2 (parcialmente no-competitiva); sin embargo no podrán ocurrir combinaciones de a.1 con b.1 o b.2, pues en inhibición totalmente competitiva no ocurre formación de EIS.

El modelo de abajo representa la asociación de un proceso con inhibición totalmente no competitiva (b.1) con una acción parcialmente competitiva (a.2), o sea,

E+S + I

k i!

ki EI + S

[Eo] = [E ] + [EI ] + [ES ] + [EIS ] v = K [ES ]

La ecuación será:

v max Km I ⎛ Km Km ⎞ ⎜ + + I ⎟⎟ 1+ S Ki ⎜⎝ S Km ⎠

Que puede ser reescrita como:

v max S I Km I 1+ 1+ I Ki K m S + Ks Ki I Km 1+ Ki K mI ⇓

ES + I

⇓

k m!

EIS

E+P

debido inhib. No-compet.

Debido a inhib. Parc. compet.

Se puede observar que esta ecuación es similar a la

ecuación para inhibidor

parcialmente competitivo con un término adicional afectando vmax debido a la parte no-competitiva del inhibidor. La representación gráfica de esos diferentes tipos de inhibición puede ser vista en la siguiente figura:

No-Competitivo: v

1 v

v max

km i vmax

i v max

km vmax

1 i v`max

1 v`max k m = k mi

−

1 1 =− i km km

1 S

Competitivo: v v

k mi vmax

1 v 1 v

i vmax = vmax

vmax

km vmax

i vmax

1 1 i v`max

km km

k mi k

S i m

1 − km 1 − km

− −

v`max

1 v 1 `max

k mi 1 k mi

1 i `max

1 S 1 S

Mixto:

La tabla de abajo representa los valores de las intersecciones en los gráficos de Lineweaver-Burk para enzimas con inhibidores.

Intersección

Tipo

los Intersección en los ejes

ejes de las ordenadas de las abscisas

a1. Puramente Competitivo 1 v max

a2.Parcialmente Competitivo

1 v max

b1.Puramente

no-

competitivo b2.Parcialmente competitivo

c. Mixta (a2+b1)

no-

1 I ⎞ ⎛ Km ⎜1 + ⎟ Ki ⎠ ⎝ ⎛ I Km ⎞ ⎟ 1 + ⎜⎜ I ⎟ ⎝ Ki K m ⎠ I ⎞ ⎛ Km ⎜1 + ⎟ Ki ⎠ ⎝

I Ki v max

1 Km

I Ki vI v max + max Ki

1 Km

I Km Ki Km v max

⎛ I Km ⎞ ⎟ 1 + ⎜⎜ I ⎟ ⎝ Ki K m ⎠ I ⎞ ⎛ Km ⎜1 + ⎟ Ki ⎝ ⎠

Las constantes son determinadas haciendo medidas sin inhibidores para hallar Km y vmax y

enseguida con inhibidor para determinar Kim y

vimax. En el caso de

las

inhibiciones parciales o mixtas, tienen que efectuarse medidas extras, a fin de obtener K’m

y v’max : v’max es obtenido con exceso de inhibidor y de sustrato y K’m con

exceso de inhibidor. Dixon desarrolló otra forma de determinar las constantes, graficando 1/v vs [I], para varios valores de I.

Competitivo:

1 v

No-Competitivo:

1 v

⎛ S2 − k i ⎜⎜ 11 ⎝ km

⎞ ⎟ ⎟ ⎠

− ki

Inhibición por sustrato

E+S

E+P

ES + S

km ki

ESS

(eo − es − ess ) s = Km . es

es . s = Ki ess

v Michaellis-Menten

Con inhibición por sustrato

K Eo Km S 1+ + S Ki

Llamando:

K Eo = v max

v max S S2 1 + Km + Ki

Cuando S >> Km entonces v = v max

Ki que en la forma recíproca se vuelve: S + Ki

1 1 S = + v v max Ki v max

Cuando S << Ki entonces v = v max

S que es la ecuación de Michaelis-Menten, o Km + S

sea, en la forma recíproca

1 1 Km 1 = + v v max v max S

1/ν Km/νmax 1/νmax

1/S

OTRAS INFLUENCIAS EN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Efecto del factor tiempo

La enzima, por ser una proteína, esta sujeta a la desnaturalización, lo que implica la pérdida de

actividad. Generalmente esta desnaturalización es irreversible,

produciendo la pérdida definitiva del poder catalizador. Esta desnaturalización puede ser más o menos rápida dependiendo de las condiciones del medio. En relación a la temperatura, ella es más estable mientras más baja sea la temperatura. Por esta razón que es aconsejable almacenar las enzimas a baja temperatura. Otros factores que también influyen en la estabilidad de la enzima son el pH, concentración de sales, etc. El ideal es conocer las condiciones de

óptima estabilidad no sólo para el

almacenamiento del producto, sino también para minimizar la

pérdida durante el

procesamiento.

Normalmente es aconsejable realizar un estudio de la productividad y costos en función de estos factores, para minimizar pérdidas. El gráfico de abajo ilustra bien este argumento:

Vida media

En el gráfico se observa que no siempre la temperatura óptima de la enzima es la temperatura ideal de operación.

donde T1 sería la temperatura de operación con menor pérdida de enzimas y T2 sería la temperatura de máxima productividad, sin embargo, con pérdida considerablemente mayor de enzimas.

Efecto del pH

Debido al hecho que la enzima posee varios grupos ionizables, los cambios en el PH afectarán el sitio catalítico y la conformación de la enzima. En general, las enzimas son activas en una franja limitada de PH y en muchos casos existe un óptimo. Se muestran algunos ejemplos en la figura inferior.

% de la activ. max

1 – Invertasa de levaduras 2 - α-amilasa de Bacillus sp 3 – Aminoacilasa ( A. oryzae) 4- Proteasa alcalina (Bacillus sp)

El efecto del PH en la actividad enzimática se puede expresar matemáticamente, a través de modelos que tienen en cuenta el siguiente mecanismo de acción del protón H+

−

H+

H+ E

k e1

k e2

Donde

K ei =

[E ][H ] −

[E ]

K e2 =

[E ] [E ] [H ] +

E: concentración de la enzima activa E- y E+: concentraciones de las formas inactivas H+: concentración de los protones Et: concentración total de enzima (activa + inactiva)

E+

Ei: concentración total de enzima inactiva Ke2, Ke1: constantes de equilibrio. O sea

E + = K e 2 (E t − E i ) . H + K e1 (E t − E i ) H+

E− =

[E ] + [E ] = [E ] = (E +

−

Ei = Et

K ⎞ ⎛ − E i ) ⎜ K e 2 . H + + e+1 ⎟ H ⎠ ⎝

K e1 H+ K 1 + K e 2 H + + e+1 H K e2 H + +

Si se parte de la definicvión de actividad a = K [E ]

a = K (E t − E i ) ⎛ E ⎞ a = K E t ⎜⎜1 − i ⎟⎟ Et ⎠ ⎝

O sea K Et

1 + K e2 . H + +

K e1 H+

Para el punto de máxima actividad

da = 0 y H + = 10 − pHm donde pHm es el pH de dH +

máxima actividad. Derivando la ecuación anterior respecto a H+ e igualando a cero, se obtiene: K e2 =

K e1 10 − 2 pHm

Y remplazándose esta ecuación en la anterior se tiene:

K Et

a= 1+

K e1 10

− 2 pHm

H+ +

[ ]

K e1 H+

Sin embargo H + =10 − pH

asi

K Et

1 + K e110

( 2 pHm − pH )

+ K e1 .10 pH

Para la determinación de las constantes Ke1 y KEt y pHm se procede primero a linealizar la ecuación anterior y posteriormente se grafica. K 1 1 = + e1 (10 (2 pHm − pH ) + 10 pH ) a K Et K Et

1 a

K e1 KE t 1 KE t

[10 (

2 pH m − pH )

+ 10 pH

]

Se deben dar valores de pHm hasta obtener una buena correlación

Efecto de la Temperatura Cuando ocurre un aumento en la temperatura de reacción, ocurren dos fenómenos simultáneamente:

•

La velocidad de reacción aumenta, similarmente a lo que ocurre con reacciones químicas.

•

El aumento en la tasa de desnaturalización de la enzima como consecuencia de una disminución de la estabilidad.

El resultado final es una curva como la de la ilustración de abajo, cuya forma depende del tiempo de reacción.

zona de activación térmica

zona de desnaturalización

Tóptima

Activación térmica

Se sabe que v = K [E]

La velocidad v puede relacionarse con la temperatura, en la zona de activación térmica, según la formalización de Arrhenius:

v = vo e

−

Ea RT

O sea E ln v = ln v o − a RT

Si a bajas temperaturas, la desnaturalización fuera despreciable entonces [E] es constante y tendríamos

E − a

K = K o* e RT

Donde

K: constante cinética K*o: constante cinética hipotética para una T infinítamente alta Ea: energía de activación R: constante universal de los gases T: temperatura absoluta

Por otro lado, la desactivación a temperaturas más altas puede no ser despreciable de forma que en este caso debe considerarse la cinética de desnaturalización. Es común describir la cinética de desnaturalización, como de primer orden, aunque muchos casos más complejos sean frecuentes.

Cinética de desnaturalización de primer orden

En la cinética de primer orden la enzima pierde la actividad según la ecuación:

dE = − K d .E dt

Donde:

E: concentración de la enzima activa Kd: constante cinética de desnaturalización a una temperatura dada Integrando la ecuación de arriba selle ga alo siguiente: E = E0 ⋅ e − Kd t

Donde:

Eo: concentración de enzima activa en el tiempo 0 t: tiempo de reacción

Se puede también obtener a partir de la ecuación de arriba el tiempo de vida media de la enzima ( t1 / 2 ) a una temperatura dada. Se sabe que t1 / 2 corresponde al tiempo transcurrido para el cual la enzima ha perdido un 50% de la actividad inicial, o sea, E = 0.5 . De esta forma se tiene: Eo

E = 0.5 = e − Kd t1/ 2 Eo

O t1 / 2 = −

ln 0.5 Kd

Se debe considerar que la constante Kd es dependiente de la temperatura, así como lo es K, dentro de la formalización de Arrhenius. Entonces se puede escribir para Kd:

Kd = K . e * d

−

Ed RT

Donde: Kd*: constante de desnaturalización hipotética a T infinito Ed: energía de activación de desnaturalización de la enzima

Según esto, la ecuación global de la dependencia de v con la temperatura sería:

v = K [E] K = K* e

−

Ea RT

E = Eo e-Kd.t

−

Kd = K *d e RT

Entonces ⎧ ⎡ Ea ⎛ Ed ⎞⎤ ⎫ + t . Kd * exp⎜ − v = k * Eo exp⎨− ⎢ ⎟⎥ ⎬ ⎝ RT ⎠⎦ ⎭ ⎩ ⎣ RT ⎡ ⎛ Ea t + 0.69 v = k * Eo exp ⎢− ⎜⎜ t1 / 2 ⎣⎢ ⎝ RT

⎞⎤ ⎟⎟⎥ ⎠⎦⎥

Cinética de desnaturalización no lineal

Además del mecanismo de desnaturalización lineal visto anteriormente, existen otros tipos de desnaturalización que pueden ser explicados por un mecanismo denominado “modelo en serie”, donde existe un estado intermediario de la enzima donde ella no está completamente desnaturalizada y puede tener una actividad diferente de la inicial, inclusive pudiendo ser mayor.

k2 E1

Matemáticamente sería:

−

dE = K1 E dt

E = Eo exp (-K1.t) Partiendo del mecanismo de desnaturalización en serie ilustrado arriba se puede llegar a:

−

dE1 = k 2 E1 − K 1 E dt

−

dE1 = K 2 E1 − K 1 Eo exp (− K 1. t ) dt

Integrando esta ecuación para t = 0 y E1 = 0 se tiene:

E1 =

K 1. Eo K 2 − K1

[exp(− K . t ) − exp(− K . t )] 1

Con: E2 = Eo – E – E1 Se obtiene: ⎤ ⎡ K1 K1 exp(− K 1 t ) + exp(− K 2 t )⎥ E 2 = Eo . ⎢1 − exp(− K 1 . t ) − K 2 − K1 K 2 − K1 ⎦ ⎣

La actividad total de la enzima en un determinado tiempo t, es resultante de las tres formas de la enzima, combinando sus respectivas actividades. Con:

E, E1, E2 = concentraciones enzimáticas v, v1, v2 = velocidades o actividades

α1 e α2 = razón de la actividad en los estados intermedios respecto a la velocidad inicial

α1 =

v1 v

α2 =

v2 v

Entonces la velocidad o actividad global puede ser descrita por la ecuación: E + α 1 E1 + α 2 E 2 v v=K Eo

De forma que la ecuación final será:

⎡ ⎤ α1 K1 ⎛ ⎛ α K α2K2 ⎞ α 2 K1 ⎞ ⎟ . exp(− K 1 .t ) − ⎜⎜ 1 1 − ⎟⎟ . exp(− K 2 . t )⎥ − v = K ⎢α 2 + ⎜⎜1 + ⎟ K 2 − K1 K 2 − K1 ⎠ ⎢⎣ ⎥⎦ ⎝ K 2 − K1 K 2 − K1 ⎠ ⎝

Con esto y dependiendo del valor de α2 en un tiempo dado, la actividad puede ser menor o aún mayor que la inicial (α2 > 1). Si α1 y α2 fueran nulos, se llega a una cinética de primer orden. Así este modelo puede englobar las distintas formas de desnaturalización enzimática encontradas en la literatura.

CINÉTICA DE CRECIMENTO DE LOS MICROORGANISMOS

Al colocar una cierta cantidad de

microorganismos en una solución que contenga

nutrientes esenciales y en condiciones de temperatura y pH apropiados, ellos irán multiplicándose. Para microrganismos unicelulares, el crecimiento implicará un aumento de la población. Por otro lado, cuando se trata de hongos filamentosos, el crecimiento está asociado al aumento de la longitud y del número de micélios. En este caso, el crecimiento implica un aumento del tamaño y de la densidad pero no necesariamente del número de individuos de la población.

Asociado al crecimiento celular está el consumo de sustrato y la liberación de productos metabólicos finales en el medio. Los modelos que representan el crecimiento celular pueden variar de simples a los más complejos posibles, dependiendo del uso y la aplicación así como de la complejidad de la situación física. La figura de abajo muestra un perfil y da una idea de cuán complejo es el proceso de crecimiento de un microorganismo.

Medio

• Multicomponentes • Reacciones en solución • Equilibrio ácido-base • pH, T, . . . variables • Prop. reológicas variables • Fases múltiples (G-L, S-L, G-S..) • Heterogeneidad espacial

Nutrientes

⇒ Productos ⇐ Calor ⇔ Int. Mecánicas

Población celular

• Componentes múltiples •Heterogeneidad entre • Reaçciones múltiples • Controles internos • Adaptabilidad • Probabilidad • Degeneración

Está claro que la representación matemática de todos los fenómenos envueltos en la figura precedente no es práctica. Por este motivo, se hacen aproximaciones para simplificar la representación de modelos de crecimiento. Las simplificaciones más corrientes son:

•

Un único sustrato limitante y el resto en exceso, de forma que se considere la concentración solamente de este sustrato;

•

ocasionalmente la presencia de un inhibidor;

•

frecuentemente se controlan o se mantienen otras variables en el medio (PH, temperatura, El2, etc) en valores que afectarán mínimamente la cinética de crecimiento;

•

en algunos casos puede ser necesario incluir variables múltiples en el modelo de crecimiento.

La figura inferior sintetiza las diferentes concepciones de modelos y las aproximaciones hechas para llegar a modelos más simples del comportamiento celular.

No estructurado

Estructurado

No segregados

Mayor simplificación Composición celular tratada

Células tratadas como Aproximación comoCrecimiento Balanceado

un componente soluto del medio

individuos de múltiples componentes con composición Aproximación media

Aproximación Composición celular media

Composición

celular media semejante

Aproximación Crecimiento Balanceado

Segregados

Células como seres Células como seres individuales

individuales distintos y

distintos, pero descritos por

descritos como un

un único componente

sistema de múltiples componentes CASO REAL

Aproximaciones:

•

Si la diferencia de los componentes múltiples y el comportamiento entre células no es importante en el proceso cinético, se considera a las células como un cuerpo homogeneo, de múltiples componentes.

•

Si la heterogeneidad de las células es importante pero un único componente es significativo, se desprecian los otros componentes.

•

Si la heterogeneidad y los múltiples componentes no son importantes, se considera a la población como un ser homogeneo con una única propiedad.

Crecimiento balanceado significa que todas las actividades de síntesis de las células funcionan de modo coordinado, de forma que la composición celular media no es afectada por la proliferación de la población. Normalmente encontrado en fermentaciones continuas en régimen permanente. Difícilmente encontrado en procesos de cochada.

CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE MONOD Si solamente un sustrato es limitante y los otros están en exceso, de forma que solo el cambio de la concentración del sustrato limitante es relevante, la cinética de crecimiento varía típicamente en una forma hiperbólica, como se aprecia en la figura de abajo, donde S es el sustrato limitante (normalmente fuente de carbono) y µ la velocidad específica de crecimiento.

µmax

µmax/2

Monod

µ = µ max

S ks + S

donde

µ=

1 dX X dt

Las mismas consideraciones hechas para la

ecuación de

Michaelis-Menten son

válidas aquí:

cuando:

S >> ks

⇒

µ = µmax

S << ks

⇒

µ=kS

µ=

µ 2

⇒

(S > 10 ks)

(S < 0,10 ks)

ks = S

donde ks puede ser tomado como el valor de la concentración de sustrato abajo del cual µ es linealmente dependiente de independiente de S.

S y

por encima de la cual µ se hace

La determinación de ks y µmax se puede hacer mejor por la linealización de la ecuación de Monod. La ecuación de Lineweaver-Burk es un ejemplo (consultar el capítulo III para ver otros tipos de linealizaciones), como sigue :

µ max

1 µ max S

⋅

Así, de la figura de abajo se pueden determinar las constantes ks y µmax por los coeficientes de la recta.

1 µ K S µ max

1 µ max

1 S

METABOLISMO ENDÓGENO Y ENERGÍA DE MANTENIMIENTO

Metabolismo endógeno En algunos casos, principalmente cuando la

tasa de

dilución en un fermentador

continuo es muy baja, se observa una desviación de la ecuación de Monod, que se transforma en:

µ = µ max

S - ke ks + S

donde ke es llamada tasa de

metabolismo endógeno, que significa que ocurren

reacciones en las células. Por otro lado, ke puede ser también considerado como tasa de muerte, de forma que hayamos:

µobs = µ - k d

donde:

µobs: velocidad específica de crecimiento observada; µ: velocidad específica de crecimiento segun Monod; kd: coeficiente específico de muerte. Así:

µ obs = µ max

S - kd ks + S

O también: dX S⋅ X - kd ⋅ X = µ max dt ks + S

Otra posible interpretación para este comportamiento se da por el uso del concepto de energía de mantenimiento, visto a continuación.

Modelo de crecimento con mantenimiento Como se mencionó anteriormente, la desviación de la ecuación de Monod en ciertos procesos puede ser explicada por el metabolismo endógeno (o

muerte) o

por la

energía requerida para mantenimiento. Esta energía representa lo que es gastado en procesos como muerte, transporte activo, separación de células hijas, reposición de material celular desnaturalizado, resistencia a

presión osmótica.

gastada en mantenimiento, no aparece en los coeficientes de

energía

rendimiento, lo que

implica pérdidas. Por lo tanto, es importante que se pueda evaluar, y si es posible minimizar. La evaluación del coeficiente de mantenimiento no puede hacerse con medidas directas, pero sí a través de recursos matemáticos y gráficos. Una de las formas de evaluar el coeficiente de mantenimiento m viene descrita abajo.

Consideremos rs como la tasa global de consumo de sustrato, que puede ser descrita por la ecuación inferior:

rs = rsx + rsp + rsm donde: dS dt total

: velocidad global de consumo de sustrato = -

rsx

: velocidad de consumo de sustrato para crecimiento = −

rsp

: velocidad de consumo de sustrato para producción = −

rsm

: velocidad de consumo de sustrato para mantenimiento =

: rendimiento límite de biomasa

: rendimiento límite de producto

dS dt

crec

rX ; YX

rP dS ; prod = dt YP

dS dt

= mX .

El valor del rendimiento límite del producto puede ser obtenido a partir del balance estequiométrico de la reacción química de formación del producto, o sea, en la hipótesis que no haya interferencia biológica. Como ejemplo podemos citar la ecuación de Gay-Lussac para formación del etanol:

C6H12O6 → 2 CH3-CH2-OH + 2 CO2 El valor de Yp puede ser determinado como sigue:

YP =

2 M etanol 92 = = 0,51 M glicose 180

o sea, este valor de Yp es el máximo rendimiento posible que puede alcanzarse en la formación del etanol. Como en el caso de los procesos biológicos hay consumo de sustrato para crecimiento y mantenimiento, el rendimiento real será siempre menor que 0,51.

Para la determinación de m y Yx se puede realizar la siguiente operación con la ecuación del consumo del sustrato:

rS =

rX r + P + mX YX YP

Si YP es conocido podemos tener:

rS∗ = rSX - rSP =

rX + mX YX

Si P = 0, entonces rS∗ = rS

rS∗ 1 rX 1 1 dX µ = +m= +m= +m X YX X YX X dt YX

Si YX y m fueran constantes durante la reacción, entonces la ecuación de arriba sería lineal.

Rearreglando, tenemos:

rS∗ 1 X = +m rX YX rX rS∗ 1 = rX YX

se rP = 0 ou

1 YX

⎛ YP/S ⎞ ⎜⎜1 ⎟ se rP ≠ 0 YP ⎟⎠ ⎝

Por definición YX/S (rendimiento global de producción de biomasa) es:

r YX / S = x rs*

o sea:

1 1 m 1 m = + = + YX/S YX µ YX D

→

en procesos continuos.

1 YX / S m

1 YX 1⎛ 1⎞ ⎜ ou ⎟ µ⎝ D⎠

El coeficiente angular suministra el valor de m y el lineal 1/YX. Entonces el modelo de crecimiento incluye el concepto de mantenimiento lo cual se describe de la siguiente forma:

rS∗ 1 m q ∗S = = X YX µ µ

o sea: YX/S =

q − qP ⎛ ⎞ ⎜⎜ ou S se P ≠ 0 ⎟⎟ µ ⎝ ⎠

YX ⋅ µ µ ou q ∗S = + m ou µ = (q S∗ − m ) ⋅ YX µ + YX ⋅ m YX

Nota: Los conceptos de

respiración endógena y

mantenimiento de

células son

fundamentalmente semejantes, sólo que el primero aparecerá en la

ecuación de

crecimiento y el segundo en la ecuación de consumo o rendimiento.

MODELOS DE CRECIMIENTO

No estructurados a.

Crecimiento balanceado

Los modelos no estructurados son aquellos que tratan la biofase, como formada sólo por un elemento (normalmente masa celular), que se multiplica en crecimiento balanceado. Como ejemplo de este tipo de crecimiento tenemos:

a.1.

Monod:

µ = µ max

S , ks + S

a.2.

µ = µ max

Monod con metabolismo endógeno o con mantenimiento

S - ke ks + S

µ = (q ∗S − m )⋅ YX

a.3.

Tessier:

µ = µ max (1 − e -S/Ks )

a.4.

Moser:

µ = µ max (1 + k SS-λ )

−1

a.5.

µ = µ max

Contois:

S βX + S

a.6.

Inhibición por sustrato (Andrews):

µ = µ max

ks + S +

a.7.

S2 ki

Inhibición por producto:

µ = µ max

kP S ks + S kP + P

µ = µ max

P ⎞ S ⎛ ⎜⎜1 − ⎟ k s + S ⎝ Pmaz ⎟⎠

a.8.

µ = µ max

→ (Levenspiel)

Dos o mas sustratos limitantes:

S1 S2 ⋅⋅⋅ k 1 + S1 k 2 + S 2

Un gran número de modelos pueden encontrarse en la literatura. Los modelos de crecimiento pueden ser muy restrictos, representando un proceso dado, con un microorganismo dado, o aún una fase determinada de un proceso fermentativo. Las tablas a continuación traen un resumen de microorganismos.

algunos modelos de

crecimiento de

Modelos cinéticos sin inhibición y con un sustrato limitante Referencia

Modelo Cinético

s KS + s

Monod

µ = µ max

Teissier

µ = µ max 1 − e −s / Ks

Moser Contois

(

µ = µ max

sn KS + sn

µ = µ max

s KS ⋅ x + s

µ = µ max

s (K S + K D ) + s

Fugimoto Powell

µ Blackman

µ max e

Dabes et al. Kono Kono e Asai

)

1 s ⋅ 2 K µ µ max

s = µ⋅K +

para s < 2K =1

µ − KS µ max − µ

rx = µ ⋅ φ ⋅ X

para s > 2K

Representación gráfica de la ecuación Simulación computacional del

modelo cinético encontrada en el proceso batch utilizando la cinética de

análisis de procesos cinéticos: µ o qp vs. Monod para diferentes valores de S en el caso de cinética de saturación µmax: simple (1), inhibición por sustrato (2), tiempo

muestra con

dependencia

biomasa

del

(x)

inhibición por producto (3), metabolismo concentración de sustrato (s) para el endógeno (4) bisorción en

un caso de caso de

s0= 1g/L, x0=0,05 g/L,

cinética con múltiples sustratos (5) y YX/S=0,5, KS=0,01 g/L. fenómeno transitorio con fase lag o represión catabólica (6).

Simulación

computacional

para

un Simulación

computacional

para

proceso batch utilizando la cinética de proceso batch utilizando la cinética de Monod y

variando los valores de

(conforme a la figura 14.9).

KS Monod y coeficiente

variando los valores del de

rendimiento

(conforme a la figura 14.9).

YX/S

Modelos cinéticos con inhibición por sustrato Referencia

Modelo Cinético

Andrews

µ = µ max

1 s 1 ≈ µ max ⋅ 1 + K S / s + s / K 1⋅S K S + s 1 + s / K 1⋅S

Webb

µ = µ max

s(1 + β ⋅ s / K S' ) s + K S + s 2 / K S'

Yano et al

µ = µ max

Noack

1 + K S / s + ∑ (s / K 1⋅S )

s ⋅ e −s / K1⋅S KS + s

Aiba et al

µ = µ max

Teissier-Type

µ = µ max [exp(− s / K 1⋅S ) − exp(− s / K S )]

Webb Tseng y Waymann Waymann y Tseng

µ = µ max

s ⋅ e1,17⋅σ com σ = força iônic s + K S (1 + σ K 1⋅S )

µ = µ max

s − K 1⋅S (s − s C ) KS + s

Siimer

[

k cat ⋅ e 0 (1 − ζ S ) 1 + δ(1 − ζ S ) / K S' + εζ S / K P 2 a + bζ S + cζ S2

Simulación de la cinética en proceso Cinética de

inhibición por sustrato y

batch con inhibición por sustrato para método gráfico de varios

valores

constante

de parámetros.

]

estimación de

inhibición por sustrato-K y

1,S;

concentración de

Biomasa (x) sustrato (s)

dependiente del tiempo utilizando los siguientes valores: Y

X/S=

0,5, µmax

=0,35, KS=0,1 g/L, so= 10 g/L, xo= 0,5 g/L.

Cinética de inhibición por sustrato y método de estimación de parámetros de acuerdo con HUMPHREY.

Modelos cinéticos para cinética con inhibición por producto Referencia

Modelo Cinético

Dagley y Hinshelwood

µ (s, p ) = µ max

Holzberg et al.

µ = µ max − k 1 (p − k 2 )

Ghose y Tyagi

⎛ p µ = µ max ⎜⎜1 − ⎝ p max

Aiba y Shoda

µ(s, p ) = µ max

s ⋅ e − kp KS + s

Jerusalimsky y Neronova

µ(s, p ) = µ max

K 1⋅P s ⋅ K S + s K 1⋅P + p

Bazua y Wilke

s (1 − k ⋅ p ) KS + s

⎞ ⎟⎟ ⎠

µ max = µ 0 − k 1 ⋅ p(k 2 − p )

(

µ max = µ 0 1 + p p max

)

rx = k obs ⋅

Levenspiel

com k obs = k (1 − p p crit ) µ = µ max

Hoppe y Hansford

Gráfico

concentración de

acción

Monod,

(1), decrecimiento exponencial (1a, 2a) o función escalón (2,3).

Gráfico da ação de concentração de diferentes tipos de produto (p) sobre a velocidade específica de crescimento () com

HINSHEL-WOOD:

Linear (1), decréscimo exponencial (1a, 2a) ou função degrau (2,3).

kobs

función

del

velocidad decrecimiento de n yelo aumento de p

acuerdo con HINSHEL-WOOD: Lineal

acordo

K 1P s ⋅ K S + s K 1P + [YP / S (s 0 − s )]

crecimiento (µ) de (Ec. de Levenspiel).

específica de

la Variación de la constante de la ecuación

diferentes tipos de de

productos (p) sobre la

s ⋅x KS + s

Crecimiento en estado transitorio

Durante ciertos intervalos en procesos de cochada o durante perturbaciones en procesos continuos, la población crece en régimen transitorio, para el cual se observan comportamientos cinéticos más complicados. Generalmente existen modelos diferentes para distintos tipos de comportamiento transitorio. Aquí examinaremos algunos tipos de crecimiento transitorio.

b.1.

Fases del ciclo de crecimento de un cultivo en cochada

Típicamente el número de células vivas en un cultivo varía con el tiempo de acuerdo a la figura que aparece a continuación:

Nº de células

F.Estacionaria

F. Lag

F. Exponencial

F.Muerte

Tempo

Fase lag : fase de adaptación donde no hay crecimiento. Fase exponencial: también llamada de

fase logarítmica donde hay un aumento

exponencial del número de células. Fase estacionaria: la población alcanza su número máxima Fase de muerte: eventualmente podrá ocurrir una fase de descenso del número de células característico de la fase de muerte.

Todas las fases son de

primordial importancia en procesos microbiológicos. Por

ejemplo, los objetivos generales de un buen proceso prevén la minimización de la

fase lag, la maximización de la velocidad, la extensión de la fase exponencial y el

retardamiento de

fase de

transición del crecimiento estacionario. Alcanzar la

máxima concentración celular a finales del proceso es generalmente muy importante. Para alcanzar este objetivo es necesario entender cómo cada variable influencia el crecimiento microbiano. Cada fase será discutida a continuación y

en la

siguiente discutiremos más sobre modelos cinéticos que cubren toda la

sección curva de

crecimiento.

fase lag:

La extensión de la fase lag, invariablemente indeseable, depende del cambio (si hubiese) en la composición del medio en que es efectuado el inóculo, de la edad y del volumen de este. La forma de eliminar o minimizar esta fase es haciendo inóculos sucesivos en volúmenes crecientes hasta que el volumen de trabajo sea alcanzado, utilizando medios de cultivo idénticos. El cambio de medio implica la adaptación del microorganismo a los nuevos nutrientes y concentraciones lo que requiere de la síntesis de otros tipos de enzimas necesarias para las nuevas condiciones. A veces se observan múltiples fases lag, debido a la existencia de múltiples fuentes de carbono. Este fenómeno es conocido como diauxia y es causado por el cambio en las vías metabólicas para adaptarse al nuevo sustrato, después que el primero y preferente ha sido consumido, este fenómeno esta ilustrado en la figura siguiente. X

S X

tiempo

Crecimiento tipo diauxia

Con base en lo dicho arriba, algunas recomendaciones pueden ser dadas para minimizar la fase lag:

a . El cultivo inóculo debe ser tan activo como sea posible y hacerse cuando el microorganismo aún esté en la fase exponencial. b. El medio de cultivo del inóculo debe tener la misma composición o muy parecida a la composición del medio usado en la etapa final del proceso. c. Usar una cantidad de inóculo razonablemente grande (5 - 10%) del volumen de medio a ser fermentado.

fase exponencial:

Al final de la fase lag la población de microorganismos se encuentra bien adaptada al medio y comienzan a multiplicarse rápidamente, doblando su número en intervalos regulares de tiempo. El esquema que aparece a continuación ilustra esta forma de reproducción y el consecuente modelo matemático:

o o o

o o

| Xo

| Xo 22

| Xo 23

o |

Xo 21

División Celular

|N° de células

|N° de generaciones|Generalización

|Xo: n° inicial de

células

Entonces para N generaciones tenemos: X = Xo2N Si llamáramos a g el tiempo de generación o el tiempo de duplicación de una población y t el tiempo de crecimiento, tendremos :

N= t/g

entonces X = X02t/g aplicando Ln se tiene: Ln X/X0 = ln 2 t/g ⇒ ln X/ X0 = 0,69 t/g

Si 0,69/g fuera constante, tendremos una reacción de primer orden.

µ = 0,69/g ⇒ ln X/ X0 = µt

Esta relación puede ser demostrada experimentalmente de la siguiente manera: la velocidad de aumento de la población será directamente proporcional a esta población, o sea: dx/dt ( aumento de la población) = µx (Cantidad poblacional) Entonces la constante de proporcionalidad µ ( tasa específica de crecimiento) será igual a :

µ = (1/x)dx/dt

Integrando, se obtiene: Ln X/X0 = µt donde µ es la velocidad específica de crecimiento, corresponde al aumento de la población por unidad de tiempo y por unidad de población. La máxima inclinación, obtenida en la parte lineal de la curva, como se ilustra abajo, es µmax, o sea, la velocidad específica de crecimiento máxima

Considerando que existe una fase lag, tenemos: f (x ) =

dX = µX dt

o sea, la velocidad de crecimiento del microorganismo depende solamente de la concentración del microorganismo, donde µ; es constante. La fase de velocidad decreciente puede ser tratada como un fenómeno de inhibición proporcional a X2. Así, el modelo puede ser extendido para:

dX = K ⋅ X (1 - βX ) dt

La integración de esta ecuación genera una curva logística:

X 0 ⋅ e kt X= donde X0 = X cuando t = 0, 1 − βX 0 (1 − e kt )

βX

β X est donde: X est =

1 2

1 β

que puede ser ilustrado por la figura de abajo: b.2.

Crecimiento de organismos filamentosos

Considerando el crecimiento de un hongo en la forma de un pellet esférico, se tiene:

dr = k donde r es el radio del pellet. dt

La masa M puede definirse así:

4 M = ρ πr 3 donde ρ es la densidad del pellet. 3

Con esto se tiene:

dM dr = ρ 4πr 2 = K4πr 2 ρ dt dt

pero r está dado por:

⎛ 3M r = ⎜⎜ ⎝ ρ 4π

⎞ ⎟⎟ ⎠

1/ 3

entonces:

⎛ 3M dM = K4πρ ⎜⎜ dt ⎝ 4 ρπ

⎞ ⎟⎟ ⎠

2/3

= γM 2 / 3

donde:

γ = K(36πρ )1 / 3

Integrando se tiene: d

γ t⎞ ⎛ M = ⎜ M1/3 ⎟ 0 + 3 ⎠ ⎝

Sin embargo, M0 es casi siempre despreciable, así tenemos:

⎛γ t ⎞ M =⎜ ⎟ ⎝ 3 ⎠

e f g

b.3.

Representación gráfica del crecimiento de los microorganismos

Crecimento exponecial a

Crecimento lineal d e f g

a, d →fase lag b, e → fase exponencial c, g → fases de retardamiento y estacionario f

→ fase lineal

Modelos estructurados Los modelos no estructurados considerados en la sección anterior describen solamente la cantidad de la fase biológica. No reconocen, ni representan la composición o lo que quiere que sea que pueda relacionarse con la calidad de la biofase. En la medida en que la composición celular cambia significativamente en un proceso y ese cambio afecta el comportamiento cinético, deben utilizarse los modelos estructurados. Como no es nada práctico hacer balance para todos los componentes celulares, se debe escoger con buen criterio las variables y procesos más representativos en el momento de formular el modelo estructurado. Las variables de la biofase son típicamente masa por unidad de volumen de medio (Xi) o moles por unidades de volumen de biofase (Ci). En un reactor de mezcla, el balance de masa del componente j es:

X0 F Cj

X V

X F Cj

⎤ 1 d ⎡ 1 1 V ⋅ X ⋅C j⎥ = VXr j + F(X - X 0 ) ⋅ C j ⎢ ρC dt ⎣ ρ C ⎦ ρC

ρC

: densidad (masa celular/unidad de volumen celular);

: velocidad de formación del componente j (moles de j/tiempo.volumen de

células);

: masa celular (masa de células/volumen de medio);

: moles de j/volumen de células.

En el balance anterior, se considera que la fracción del componente j es la misma tanto en las células que entran como en las que salen del reactor. Asumiendo que ρC y V son constantes, entonces se tiene: ⎡ dC j dX ⎤ 1 1 V ⋅ X ⋅ rj + F ⋅ (X - X 0 ) ⋅ C j V ⎢X + Cj ⎥= ρ C ⎣ dt ρC dt ⎦ ρ C 1

X - X0 ⎛ dX 1 ⎞ = rj − C j ⎜ ⎟ + ⋅Cj ⋅D X dt ⎝ dt X ⎠

dC j

dC j dt

= rj − C j ⋅ µ + ⋅ C j ⋅ D

X - X0 X

En proceso batch:

dC j dt

= rj − C j ⋅ µ

donde el término (- µCj) representa la reducción de la concentración causada por la dilución debida al crecimiento celular.

Modelo de compartimientos

Como ejemplo, será mostrado aquí un modelo de 2 compartimientos desarrollado por Williams (J. Theoret, 1967). En el modelo, la célula es dividida en dos compartimientos, uno sintético (R) y otro genético estructural (E). La porción R es alimentada directamente por el sustrato y la porción (E) es alimentada a su vez por la porción R. En un crecimiento balanceado R y E corresponden a la concentración media de las porciones R y E en un tiempo dado y a la masa celular X = R + E. Podemos esquemáticamente representar el modelo por las reacciones:

K1 K2 S + X ⎯⎯→ R + E ⎯⎯→ E

(1)

O sea:

dX = K 1S ⋅ X dt dS - K 1S ⋅ X = dt YX/S

(2) (3)

dR = K 1S ⋅ (R + E ) − K 2 R ⋅ E - µ ⋅ R dt dE = K 2R ⋅ E - µ ⋅ E dt

(4) (5)

Una consideración importante del modelo es que habrá duplicación de la población cuando la porción E doble de valor. En otras palabras, el número de células es proporcional a E.

N α E

µ = K1S

Tomando la densidad celular constante (= ρC) y ρR ρE, respectivamente, las masas de las porciones R y E por unidad de volumen de células tendríamos:

ρR + ρE = ρC = constante fE =

ρE ρC

fracción del componente E

Entonces : dρ R = K 1S(ρ R + ρ E ) − K 2 ρ R ρ E − µ ⋅ ρ R dt y dρ E = K 2 ρR ρE − µ ⋅ ρE dt y

(6)

(7)

df E 1 1 dρ E (K 2 ρ R ρ E − µ ⋅ ρ E ) = − K 1Sf E + K 2 ρ C f E (1 − f E ) = = ρ C dt ρC dt

df E = - K 1f E + K 2 ρ C f E (1 − f E ) dt

(8)

Se toman las ecuaciones 2 y 3 y se obtiene:

dX dS =YX/S dt dt

⇒

S = S 0 - YX/S (X - X 0 )

(9)

Substituyendo la ecuación (9) en la (3), tenemos:

dX = K 1 ⋅ X(S 0 + YX/S X 0 - YX/S X ) dt o sea dX = K 1 ⋅ X ⋅ (a - b ⋅ X ) dt

donde

a = S0 + YX/SX0 b = YX/S entonces

dX ∫X X ⋅ a - b ⋅ X = K 1 ∫0 dt 0 X=

X 0 e K1at a − bX 0 1 − e K1at

(

)

(Ecuación logística)

Este modelo describe razonablemente la masa celular, el número de células, el tamaño de las células y el sustrato en una cochada, donde, en términos adimensionales se puede representar:

S+

: Sustrato adimensional

X+

: masa adimensional

: tamaño adimensional

= S/S0; = X/YX/SS0; = -1 + 1/fE

En este caso, el tamaño adimensional considera el tamaño de la célula en relación a las células en estado estacionario (ρR = 0 ⇒ ρE = ρC), o sea,

V+ =

ρR ρC − ρE 1 = −1 + = ρE fE ρE

El número de células puede ser representado por:

N = fE

X YX / SS 0

Este modelo representa:

•

Existencia de fase lag con aumento del tamaño de las células;

•

Fase exponencial con tamaño máximo de células;

•

Cambio en la composición de las células durante la fase de crecimiento;

•

Fase estacionaria.

Otros modelos

Además del modelo de Williams existen algunos otros explorando el mismo concepto de compartimientos internos de las células. Las figuras a continuación ilustran el modelo de compartimientos de Hander y Roels [Advances in Biochemistry Engineering, 21, un 1982], semejante al modelo propuesto por Williams, y el modelo de tres compartimientos propuesto por los autores anteriores.

rSK

MODELOS DE FORMACIÓN DE PRODUCTOS La producción de un metabolito dado está íntimamente asociada al crecimiento celular, de forma que sólo habrá formación de producto cuando haya crecimiento. Las asociaciones entre velocidades de producción y crecimiento pueden ocurrir en diferentes formas; y los modelos de crecimiento como los vistos anteriormente pueden usarse (estructurados o no estructurados).

No estructurados La cinética de formación de productos puede ser descrita de forma simple, según el planteamiento de Gaden y Luedecking-Piret. Gaden clasificó la interrelación entre producción y crecimiento de la siguiente forma:

A cinética de formação de produtos pode ser descrita de forma simples, segundo a descrição de Gaden e Luedecking-Piret. Gaden classificou a interrelação entre produção e crescimento da seguinte forma:

X P

Tipo I

Tipo II

Tipo III

Producción asociada

Producción ión

Producción disociada

parcialmente

del crecimiento

Crecimiento

asociada al crecimiento

Luedecking-Piret propusieron el siguiente modelo para la formación de producto:

dP dX =α +β⋅X dt dt Producción asociada a la masa celular Producción asociada al crecimiento celular

que también puede ser escrito en la forma: q P = αµ + β

En la clasificación de Gaden esta ecuación sería: Tipo I : q P = αµ = YP / X µ Tipo II : q P = αµ + β Tipo III : q P = β

Además del modelo de Luedecking-Piret que asocia producción de metabolito al crecimiento, se tienen otros como el ilustrado en las tablas de abajo.

Ecuaciones de modelos para velocidades de formación de producto Referencia

Modelo Cinético

o q P = YP / X ⋅ µ

rP = YP / X ⋅ rx Gaden

rP = YP / S ⋅ rS

rP = q P⋅max

con YP/X =

YP / S YX / S

s ⋅x KS + s

rP = k P ⋅ x q P = k1 ⋅ ο L + k 2

Giona et al Gaden

q P = YP / X ⋅ µ + k p

Rowley y Pirt

q P = q p⋅max − YP / X ⋅ µ

Terui

⎡exp{− k 1 (t − t max )} ⎤ q P = q P⋅max ⋅ exp{− k 2 (t − t max )} + K 1 ⎢ ⎥ ⎣− exp{− k 2 (t − t max )}⎦

Constantinides et

rp = YP / X ⋅ µ ⋅ x + k P ⋅ x − k p,d ⋅ P

rP = ∑ k 1⋅i ⋅ e − k 2⋅i Λ i

Shu

P = ∫ x (Λ) ∫ ∑ k 1,i ⋅ e

− k 2 , i ⋅Λ

⋅ dΛ ⋅ dΛ

Aiba e Hara

Brown y Vass Ryu y Humphrey

()

rP = q P Λ ⋅ x

(rP )t

Λ(t i ) =

= YP / X ⋅ (rX )t − t M q p = q P⋅max

x 0 ⋅ Λ 0 + ∫ x ⋅ dτ t0

x (t i ) Pt = YP / X ⋅ x t − t M

ε ⋅ µ rel 1 + (ε − 1)µ rel

q p = q p⋅max Bajpai y Reuss

q p = q P⋅max

s ⎛ ⎞ K P + s⎜1 + s ⎟ K repr ⎠ ⎝

(1 − µ rel )(µ rel ) (K P / K s ⋅ x )(1 − µ rel ) + (1 − µ rel )(µ rel ) + (µ rel )2 / (K repr / K S ⋅ x )

modelo con mantenimiento Kono Kono y Asai

⎛ Y∗ 1 − S/ X rP = ⎜⎜ aP ⎝ a P ⋅ YX / S

⎞ m ⎟rx + S x ⎟ aP ⎠

rP = k P1 ⋅ φ ⋅ x + k P 2 (1 − φ)x com k p1 e k P2 〉〈 0 e 0 〈 φ 〈 1

Asai y Kono

Representación esquemática de la

Método gráfico de prueba y error para

forma cinética entre la tasa específica

estimar los parámetros (YP/X, tM) para el

de formación (qP ) y tasa específica de

caso del concepto de cinética de

crecimiento (µ): crecimiento asociado (I), tiempo de maduración. sin crecimiento asociado (II), mezcla de crecimiento asociado con formación de producto (III) y un caso de correlación negativa (IV).

Representación gráfica de la

Representación gráfica de la ecuación

ecuación de Ryu y Humphrey,

Bajpai y Reuss como modelo cinético

mostrando una cinética general

generalizado de formación de producto

aproximada para formación de

en un gráfico de las tasas

producto debida a la variación de los

adimensionales qP vs µ. La figura A

valores de ε.

presenta patrones previos sugeridos de la tasa de producción de penicilina de la literatura.

KP/KS.x=0,00133(I); 0,0133(II); 0,0133(III); 0,00133(IV) Krepr/KS.x=0,6667(I); 0,6667(II); 6,667(III); 6,667(IV)

Modelos estructurados Poco o casi nada se ha hecho en términos de desarrollo de modelos estructurados para producción. Algunos trabajos han sido adaptados de modelos estructurados para metabolitos secundarios (antibióticos, toxinas, etc). Un ejemplo es el modelo propuesto para producción de alcalóides por Clavices purpúrea:

dX ⎫ = K 1 [1 − exp(− K 1 pi )] ⋅ X − K 2 X 2 ⎬ Masa celular dt ⎭ ⎫ dP p X + (YP / X + pi )K 2 X 2 ⎬ Fosfato extracelular = −K 3 dt p + K2 ⎭ ⎫ dPi p = K3 − K 1 (YP / X + pi )[1 − exp(− K 1 pi )]⎬ Fosfato intracelular p + K2 dt ⎭ K3 X da = K4 dt K 3 + pi2

INFLUENCIAS DEL AMBIENTE EN EL CRECIMIENTO pH El pH, o concentración de H+, o aún, la actividad de hidrógeno, ah, pueden afectar significativamente la actividad biológica. Generalmente, siempre existe un pH óptimo para una propiedad específica dada del microorganismo, como crecimiento y formación de producto, aunque estos pH’s óptimos muchas veces no son coincidentes de especie a especie, cepa a cepa y aún para el mismo microorganismo (PH óptimo de producción puede ser diferente del PH óptimo de crecimiento). En el desarrollo de un proceso, estas características tienen que ser tenidas en cuenta en el momento de la optimización.

µ µ maz

qp/qpmáx

pHótimo

Las curvas de velocidad de crecimiento contra el pH pueden ser modeladas usando las ecuaciones utilizadas en cinética, por ejemplo:

µ m (pH ) =

µm 1 + K1 H + + K 2 H +

[ ]

Temperatura Las reacciones que ocurren dentro de las células son influenciadas por la temperatura, sus velocidades de reacción obedecen a la ecuación de Arrhenius:

⎛−E⎞ K = A exp⎜ ⎟ ⎝ RT ⎠

Lo que se observa normalmente es una curva del tipo que se muestra continuación:

−

ln µ

Ea R 15 < Ea < 20 Kcal/mol

1/T

Colocada en la forma de Arrhenius nos dá: La clasificación de los microorganismos en términos de la dependencia de la velocidad de reacción en función de la temperatura es la siguiente:

Classificación de los microorganismos según la temperatura de crecimiento T (oC) Mínimo

Óptimo

Máximo

Termófilos

40 - 45

55 - 75

60 - 80

Mesófilos

10 - 15

30 - 45

35 - 47

-5 a 5

15 a 18

19 a 22

-5 a 5

25 a 30

30 a 35

Psicrófilos Obligatorios Facultativos

En un modelo no estructurado, si se presenta cambio de temperatura durante el proceso, este debe ser incorporado en el modelo. De forma general, las constantes cinéticas son dependientes de la temperatura según las ecuaciones:

⎛ − Ea ⎞ ⎛ − Ed ⎞ ∗ µ m (T ) = µ ∗m exp⎜ ⎟ − K d exp⎜ ⎟ ⎝ RT ⎠ ⎝ RT ⎠

y el modelo con inhibición sería:

µ=

µ m (T ) KS + S +

S2 K i (T )

Forma práctica de obtener:

µ ∗m , E a , K ∗d e E d :

µ m1 = a1 exp (− Ea / RT )

ln µ m

µ m 2 = a 2 exp (− Ed / RT ) µ m = a1 exp (− Ea / RT ) − a 2 exp (− Ed / RT ) −

Ea R

1⎤ ⎡ Curva ⎢ln (µ m1 − µ m )vs ⎥ T⎦ ⎣ 1/T