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Crispr/Cas9: uno strumento genetico rivoluzionario
Uno strumento genetico rivoluzionario
Negli ultimi anni, un nuovo metodo di "splicing" dei geni ha radicalmente cambiato la genetica: il sistema Crispr/Cas9. Queste “forbici genetiche” permettono di modificare i mattoncini del genoma del DNA con una precisione prima inimmaginabile.
Alla fine di novembre, lo scorso anno, è stato grande lo scalpore internazionale: il biofisico cinese Hè Jiànkuí dell’Università di Shēnzhèn ha annunciato la nascita di due gemelle con DNA geneticamente modificato nella fase embrionale per rendere resistenti all’HIV. L’Università di Shēnzhèn si è detta “profondamente turbata” da questa trasgressione e moltissimi ricercatori e politici si sono sentiti parimenti oltraggiati. Poco dopo, le autorità pubbliche hanno arrestato Hè, che sta scontando la sua pena. Questa manipolazione del genoma è stata resa possibile da una nuova tecnica che viene considerata uno dei più grandi progressi della biologia molecolare: il Crispr/Cas9, le “forbici genetiche”.
I batteri che sconfiggono i virus
Come spesso accade per le scoperte rivoluzionarie, il Crispr/Cas9 è nato da un’osservazione: i batteri possono difendersi efficacemente dai virus ostili. La loro difesa si basa sul cosiddetto sistema Crispr/ Cas. Quando un virus si lega a una cellula batterica e inietta il suo materiale genetico, una breve sezione di questo viene inserita tra le sequenze Crispr del DNA batterico. Queste sezioni sono una sorta di libreria di tutti i patogeni con cui la cellula ha dovuto confrontarsi in passato. In caso di nuova infezione, il sistema Crispr/ Cas offre una “memoria” della difesa del batterio contro l’infezione, consentendogli di tagliare il virus e renderlo innocuo. La libreria viene preservata per generazioni poiché viene trasmessa dal batterio ai suoi discendenti. Pertanto, come nel caso dell’epigenetica, una proprietà acquisita viene ereditata, un meccanismo che viola il concetto di evoluzione di Darwin. Oggi sappiamo che circa metà di tutti i batteri noti hanno un sistema di difesa Crispr/ Cas. A seconda del tipo, si distinguono due grandi classi di Crispr/Cas. I sistemi di classe I comprendono complessi proteici di molte molecole, mentre i sistemi di classe II comprendono una sola proteina di taglio ciascuno.
Mutazioni mirate
Nel 2011 e nel 2012, Emmanuelle Charpentier e Jennifer Doudna dell’Università di Berkeley, California, hanno pubblicato i risultati di una ricerca di base sulla difesa Crispr/Cas9 dei batteri su due note riviste specializzate, Nature e Science. Un anno dopo, Zhāng Fēng del Broad Institute di Cambridge, ha pubblicato l’applicazione del metodo a organismi superiori perché il sistema Crispr/Cas9 funziona non solo nei batteri, ma anche nelle cellule nucleate, ossia in piante, animali ed esseri umani. Il sistema Crispr/Cas si basa su tre componenti: 1) Una molecola RNA corta fun-
ge da sequenza di riconoscimento genetico. Questa “sonda” può essere prodotta con relativa facilità e corrisponde alla sequenza nucleotidica della corrispondente sequenza bersaglio del DNA. 2) Si crea un collegamento con il cosiddetto tracrRNA. 3) Questo complesso RNA si attacca a sua volta come “guida” a uno strumento di taglio enzimatico, la proteina Cas9. In questo modo si completano le “forbici genetiche” molecolari composte da sequenza di riconoscimento RNA, tracrRNA e forbici Cas9. A questo punto, il triplice complesso si lega a una specifica posizione su un DNA bersaglio e lo taglia con le forbici Cas9. Gli studiosi americani si sono resi conto del potenziale di questo meccanismo. Poiché la sequenza di riconoscimento RNA può essere facilmente variata, ora è possibile stabilire esattamente dove le forbici genetiche molecolari si legano e tagliano il DNA bersaglio. È vero che una cellula è in grado di riparare il taglio; tale riparazione, tuttavia, è generalmente incompleta, per cui comporta errori di lettura. In altre parole, tagliando il DNA bersaglio, i geni possono essere specificamente “spenti”. Inoltre, nel taglio è possibile inserire singoli mattoncini di DNA o sezioni di DNA funzionali più grandi, impiantando con estrema precisione nel genoma proprietà completamente nuove.
Nulla affidato più al caso
Il Crispr/Cas9 e altri metodi di “modifica del genoma” promettono una serie di possibili applicazioni. Ad esempio, nella coltivazione di piante e nell’allevamento di animali, i genetisti stanno tentando di creare varietà e specie più produttive e resistenti alle malattie. Tra queste, tanto per citare qualche esempio, il grano resistente all muffa o il mais e le patate arricchiti di amico per poter essere conservati a basse temperature. Il meccanismo di base, l’introduzione di una rottura del doppio filamento con successiva riparazione cellulare, è lo stesso seguito dalle mutazioni naturali. Anche la mutazione nella coltivazione delle piante si basa su tale processo. In passato, però, le rotture venivano provocate in modo incontrollato, spesso tramite irradiazione o sostanze chimiche. Era pertanto casuale il punto in cui poteva essere integrato il nuovo gene aggiuntivo nel genoma della pianta.
Con la modifica del genoma e, più specificamente, con il sistema Crispr/Cas9, i risultati non sono più affidati al caso perché la modifica avviene in singoli punti predefiniti. Tuttavia, anche con il sistema Crispr/Cas9 si possono, per quanto raramente, produrre mutazioni involontarie. Poiché le mutazioni “fuori bersaglio” possono avere gravi conseguenze, soprattutto in campo medico, i ricercatori hanno proseguito con prudenza lo sviluppo del sistema Crispr/Cas9 e di altre forbici proteiche per migliorarne la precisione. Ad esempio, nuove varianti del sistema Crispr/Cas9 tagliano un solo filamento di DNA, riducendo così in modo significativo il numero di coppie di basi mancanti o aggiunte (22). Se due singoli filamenti vengono tagliati in posizioni sfalsate, producendo “estremità adesive”, ossia estremità di DNA con sporgenze complementari, la precisione della modifica genetica migliora notevolmente.
Molti aspetti restano ancora poco chiari
Per anni, gli studiosi hanno cercato di affrontare alcune patologie alterando specificamente il patrimonio genetico, nella maggior parte dei casi fallendo. Dalla scoperta del sistema Crispr/Cas9 sono nate nuove speranze. Sono stati resi noti i primi risultati positivi: un trattamento per la distrofia muscolare di Duchenne (DMD). Questa condizione si basa sulla mutazione di un gene che produce una proteina, la distrofina, importante componente delle fibre muscolari. Dopo un trattamento Crispr/Cas9 sono stati riscontrati livelli di proteina leggermente superiori. Nei primi studi clinici, i nuovi metodi di modifica del genoma sono stati anche testati su pazienti affetti da tumore e HIV. I ricercatori, però, stanno ancora combattendo: sinora la riparazione genetica funziona in un numero di cellule umane comparativamente ridotto perché il meccanismo di riparazione è attivo soltanto nelle cellule che si riproducono, mentre la maggior parte delle cellule del corpo non si replica. Vi è inoltre il problema del trasporto delle forbici genetiche nel sito di azione all’interno delle cellule del corpo. Sia lo stomaco che gli immunociti del sangue distruggono queste proteine. È possibile che veicoli come le nanoparticelle (ad esempio, i liposomi) siano in grado di trasportare le molecole Crispr/ Cas9 direttamente all’interno delle cellule. Come veicoli di trasporto si stanno anche testando virus innocui o inattivati artificialmente.
Se si debbano riparare geni difettosi già nella linea germinale, ossia in ovociti, spermatozoi o embrioni, come sembra sia accaduto per le gemelle cinesi, è un tema molto controverso da un punto di vista etico. La maggior parte dei ricercatori dissente da tale approccio perché aprirebbe la via alla “progettazione degli esseri umani”.
Letteratura 1 https://www.transgen.de/forschung/2564.crispr-genome-editing-pflanzen.html 2 https://www.mpg.de/11033456/crispr-cas9-therapien 3 https://www.spektrum.de/wissen/wie-funktioniert-crispr-cas9/1441060 4 https://www.pharmazeutische-zeitung.de/ausgabe-442016/das-zellulaere-baukastensystem/ 5 https://www.die-debatte.org/genchirurgie-medizin/ 6 https://www.transgen.de/aktuell/2595.nobelpreis-crispr-patente.html
