Ferritina newsletter

AVANCE

N° 11 Junio 2013

AVANCE Publicación de contenido científico editada por GT Laboratorio S.R.L. Necochea 3274 Rosario

FERRITINA Inmunoquant

Método turbidimétrico exaltado por partículas de látex para determinar Ferritina

GT Lab ha desarrollado un nuevo kit para la determinación de ferritina en suero, basado en la inmunoturbidimetría, con participación de partículas de látex para incrementar la sensibilidad.

Los reactivos se proveen listos para usar, con larga vida útil, y la técnica es simple y adaptable al uso manual o a analizadores automáticos.

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FERRITINA Inmunoquant

AVANCE INTRODUCCIÓN

organismo. Sin embargo, permite establecer una muy buena correlacion con la cantidad total de hierro almacenada . El Gráfico 1 demuestra la correlación entre la concentración de hierro hepático y la concentración de ferritina sérica, sirviendo de sustento para validar el uso de la última en la estimación del contenido de hierro corporal(5).

Indudablemente, el patrón de oro es la determinación del hierro tisular, especialmente trabajando sobre biopsia hepática al ser el hígado el principal reservorio del exceso de hierro. No obstante, este procedimiento es invasivo y no siempre realizable, por lo cual la ferritina se ha transformado en el parámetro más confiable, sencillo y eficaz para determinar la cantidad total de hierro almacenada en el organismo permitiendo su vigilancia periódica.

Sin embargo, hay varias situaciones que pueden modificar la relación entre los niveles de ferritina sérica y las reservas de hierro del organismo.

Los niveles bajos de ferritina siempre indican una deficiencia de hierro, pero concentraciones elevadas pueden deberse a una variedad de razones, tales como disfunción hepática, tumores o inflamación crónica, causando siempre una elevación de la concentración de hierro en el organismo. Los gestantes, dadores de sangre, pacientes en hemodiálisis, adolescentes y niños son grupos especiales de riesgo.

Los niveles de ascorbato y el aumento de la eritropoyesis también modulan los niveles de ferritina circulante.(6) Siendo la ferritina es una proteína de fase aguda, la inflamación aguda y crónica, y las infecciones, influyen notablemente en sus niveles.(7) La hepatitis también pueden afectar a los niveles de ferritina sérica, por lo tanto los resultados deben interpretarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos disponibles. Las variaciones entre un día y otro son especialmente evidentes cuando hay una carga de hierro importante.

Por lo tanto, los datos deben ser cuidadosamente interpretados como marcador biológico de almacenamiento de hierro, tal como se indica en la Tabla I.

METABOLISMO DEL HIERRO El hierro es un metal esencial para el organismo, participando en la síntesis de la hemoglobina en los eritrocitos, en reacciones de oxido reducción y en la proliferación celular. Pero su acumulación excesiva causa disfunciones.

El sofisticado balance entre el metabolismo del hierro, su transporte y almacenamiento, es regulado por varios factores incluyendo el péptido recientemente descubierto: la hepticidina.

La cantidad total de hierro en el organismo es de unos 3-4 gramos, dos tercios de los cuales están en los glóbulos rojos y en el hierro reciclado por la destrucción de los mismos. El resto es almacenado bajo dos formas: una forma soluble, movilizable, que es la unida a la ferritina, y la fracción insoluble, como hemosiderina.

Solamente 1-2 mg son absorbidos en el tracto intestinal y circula en la sangre(1), usualmente unido a la transferrina. Si bien no está claro su rol en el transporte, la ferritina también está presente en el torrente sanguíneo.

Como no existe un mecanismo pasivo de excreción de hierro, éste puede acumularse ante una carga exógena por factores hereditarios, transfusiones repetidas vinculadas a anemias genéticas, como talasemia, anemia falciforme, sindrome de Diamond-Blackfan, fallas de médula ósea como la anemia aplástica y síndromes mielodisplasicos.

El hierro libre, no ligado a transferrina, el hierro débilmente ligado del plasma y en el citoplasma celular son responsables de desarrollar toxicidad, provocando fallas en hígado y corazón.

FERRITINA La estructura proteica de la ferritina está compuesta por 24 subunidades y un núcleo de fosfato de óxido férrico (Figura 1). De esta manera se dispone de hierro no reactivo necesario para la eritropoyesis y procesos celulares. (2) Hay dos tipos de subunidades de la ferritina: las cadenas ligera (L) y pesada (H), que dan lugar a una multitud de posibles isoformas de la ferritina.

Se encuentra en altas concentraciones en hepatocitos, células del sistema retículo endotelial del hígado, bazo y médula ósea.

La ferritina extracelular presente en el suero y en los líquidos corporales suele tener poco hierro, y su estructura varía en los diferentes líquidos corporales. En el suero humano, la ferritina está compuesta por subunidades L-glicosiladas. Parte de la ferritina circulante puede provenir del daño tisular, pero la presencia de subunidades específicamente glucosiladas y la regulación de la ferritina circulante en respuesta al hierro y a distintos procesos inflamatorios indican que la mayor parte se secreta activamente En 1972, Jacobs y colaboradores(3, 4) reportaron que la ferritina esta presente en suero en cantidades muy pequeñas y solo representa una pequeña proporción del hierro en el

METODOLOGÍA DE ANÁLISIS Se han desarrollado diferentes métodos para el dosaje de ferritina sérica: ELISA, quimioluminiscencia, electroquimioluminiscencia e inmunoturbidimetría.

La Tabla II muestra las ventajas y los inconvenientes de la determinación de la ferritina sérica.

UTILIDAD CLÍNICA DE LA DETERMINACIÓN DE FERRITINA

Los estudios clínicos sobre la relación entre las transfusiones de sangre y la concentración de ferritina sérica mostraron una correlación positiva entre la cantidad de transfusiones y la elevación de ésta en pacientes talasémicos(8, 9).

En pacientes talasémicos existe una correlación entre el contenido hepático de hierro y la cantidad de transfusiones realizadas. Se observó que el riesgo de disfunción hepática está aumentado para concentraciones de hierro superiores a 7 mg/ Kg de tejido húmedo mientras que niveles superiores a 15 2

FERRITINA Inmunoquant

AVANCE un valor diana menor o igual a 1000 µg/l.(7) La Tabla II muestra los niveles umbral de ferritina sérica.

mg/Kg húmedo aumentan la incidencia de muerte por falla cardíaca temprana por deposición de hierro en el miocardio.

Paralelamente, se demostró un descenso de niveles de hierro hepático al disminuir la concentración de ferritina sérica.

También se ha demostrado una correlación entre la ferritina sérica y la FeH en distintas situaciones de sobrecarga de hierro por transfusiones, como la drepanocitosis y los síndromes mielodisplásicos (SMD).(10, 11) La relación entre la ferritina sérica y el FeH es más compleja en los pacientes con talasemia no dependiente de transfusiones, como la ß-talasemia intermedia, en la que los niveles de ferritina sérica son significativamente más bajos para un FeH dado, que en los pacientes con ß-talasemia mayor.(12) Se considera que la variabilidad entre pacientes se debe principalmente a cambios en el estado inflamatorio.(13) Pacientes con anemia aplástica y anemia sideroblástica que había recibido transfusiones de sangre tenían niveles de ferritina sérica mayores a 1000 µg/l, mientras aquellos sin transfusiones mostraban concentraciones menores. Los datos obtenidos sugerían que los pacientes con eritropoyesis insuficiente sin ayuda de transfusiones podía mantener niveles de ferritina sérica menores a 1000 µg/l aunque un aumento adaptativo de absorción intestinal era notorio(13). Así, la interpretación de valores de ferritina sérica para la estimación del hierro corporal se simplificó cuando otras condiciones tales como la inflamación y los procesos malignos eran excluidos por otros métodos.

Además, la concentración de hierro en el corazón aumenta para niveles de ferritina superiores a 1800 µg/l, siendo la prevalencia de eventos cardíacos significativamente mayor para concentraciones superiores a 2500 µg/l(14, 15).

El uso de quelantes de hierro provee una forma de resolver los problemas planteados por el exceso de hierro, dando una buena perspectiva a los pacientes que presentan disfunciones de ese origen.

Se ha recomendado un umbral de 1000 µg/l a partir del cual comenzar a aplicar terapia con quelantes(16).

Se están llevando a cabo estudios para identificar otros marcadores que puedan utilizarse en combinación con los niveles de ferritina sérica para predecir la carga de hierro en el organismo. En la talasemia, la hormona hepática hepcidina se ha identificado como un posible marcador de la sobrecarga de hierro en combinación con la ferritina sérica.(17) Las transfusiones regulares reducen la actividad eritropoyética y aumentan la sobrecarga de hierro. En respuesta, la expresión de hepcidina aumenta y modera la absorción de hierro alimentario, aumenta la retención de hierro en los macrófagos y esto, a su vez, aumenta la ferritina sérica. (17)

PAUTAS PARA LA QUELACIÓN ß-talasemia mayor Las pautas recomendadas para iniciar el tratamiento quelante del hierro son similares para varias enfermedades. En los pacientes con ß-talasemia mayor, la práctica actual consiste en iniciar la quelación cuando el nivel de ferritina sérica aumente por encima de 1000 µg/l (o después de 10-20 transfusiones de sangre).

SÍNDROMES MIELODISPLÁSICOS (SMD) De igual forma, las directrices para los pacientes con SMD recomiendan iniciar el tratamiento quelante del hierro cuando los niveles de ferritina sérica alcancen valores de 1000-2500 µg/l (o cuando el paciente haya recibido más de 20-40 transfusiones de concentrados de hematíes o dependa de las transfusiones).

PARA LA DREPANOCITOSIS En los pacientes con drepanocitosis, los valores de ferritina sérica superiores a 1000 µg/l son una indicación para el tratamiento quelante del hierro.

Durante el tratamiento con un quelante de hierro, lo ideal es vigilar las tendencias de la ferritina sérica al menos cada 3 meses.

PRINCIPIO DEL ENSAYO El método desarrollado por GT Lab se basa en que la ferritina de la muestra reacciona con anticuerpos anti-ferritina unidas a partículas de látex del reactivo, provocando una turbidez que es proporcional a su concentración, la que puede cuantificarse fotométricamente.

COMPOSICIÓN DE LOS REACTIVOS PROVISTOS Los reactivos se proveen listos para usar.

R1: buffer tris 20 mmol/l, pH= 8,2.

R2: partículas de látex recubiertas con anticuerpos anti ferritina, pH, 7.4.

Multicalibrador Proteínas: la composición varía entre lotes. La concentración de ferritina del Multicalibrador está referenciada al 2nd International Reference for Ferritine (80/578, 1992, OMS).

CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD Conserve los reactivos refrigerados (2-8ºC) sin congelar. La estabilidad alcanza la fecha de vencimiento indicada en la caja.

FERRITINA SÉRICA: NIVELES UMBRAL EN LA ß-TALASEMIA MAYOR En la ß-talasemia mayor, se ha demostrado que un nivel constante de ferritina sérica menor a 2500 µg/l reduce el riesgo de complicaciones cardiacas. No obstante, se recomienda

PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS SOBRE SU USO Los reactivos R1 y R2 no presentan riesgos biológicos de manipulación y descarte ya que no poseen en su composición materiales potencialmente infectivos.

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FERRITINA Inmunoquant

AVANCE El calibrador es de origen humano. Pese a haber sido ensayado como negativo para HIV, hepatitis B y C y sífilis e inactivado por calor, debe tratarse como potencialmente infectivo, tal como cualquier muestra objeto de análisis.

Los reactivos son para uso IN VITRO. La caja y los envases contenidos en este producto no deben ser reusados, debiendo descartarse como residuos peligrosos una vez empleados, de acuerdo a la legislación vigente. El personal que manipula los mismos debe ser debidamente capacitado para su manejo y descarte por la institución o laboratorio que lo emplea.

Es recomendable procesar siempre un punto del calibrador como control del sistema. En tres cubetas de lectura marcadas S (Calibrador), D (desconocido) y C (control) agregue: M

S

C

R1

800 µl

800 µl

800 µl

R2

200 µl

200 µl

200 µl

Multicalibrador

100 µl

----

----

Muestra

----

100 µl

----

Control

----

----

100 µl

Mezcle y lea a 540 nm la absorbancia A1 inmediatamente contra agua destilada y A2 exactamente tras 8 minutos de mezclar.

MATERIALES NECESARIOS PERO NO PROVISTOS 1. Espectrofotómetro o turbidímetro 2. Cubetas de lectura.

3. Pipetas y micropipetas para los volúmenes citados en PROCEDIMIENTO. 4. Cronometro o reloj alarma.

5. Agua destilada o deonizada.

6. Solución fisiológica (cloruro de sodio 8.5 g/l).

CALIBRACION El método debe ser recalibrado con cada lote de reactivos y, al menos, una vez por mes o cuando los controles estén fuera de las especificaciones.

CURVA DE CALIBRACIÓN: Prepare las siguientes diluciones del calibrador usando solución fisiológica como diluyente.

MUESTRA Suero fresco. Debe separarse dentro de los 30 minutos de extraída la muestra.

1

2

3

4

5

6

Calibrador (μl)

----

10

25

50

75

100

Solución fisiológica (μl)

100

90

75

50

25

----

0

0.1

0.25

0.5

0.75

1.0

Dilución

ADITIVOS No es necesario el agregado de aditivos.

Factor Concentración resultante (*)

CONDICIONES DE CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS Refrigerador (2-8ºC): estable 7 días.

Congelador (-20ºC): estable 3 meses.

(*) Para calcular las concentraciones de cada dilución, multiplique la concentración del calibrador por el factor indicado en la tabla.

Procese las diluciones como indica PROCEDIMIENTO. Calcule la diferencia de lecturas (A2 - A1) obtenidas para los diferentes puntos y construya la curva de calibración con los valores obtenidos y las respectivas concentraciones del calibrador.

SUSTANCIAS INTERFERENTES Las muestras con restos de fibrina deben centrifugarse antes de ensayar. No emplee muestras groseramente hemolisadas o lipémicas. La bilirrubina (20 mg/dl), hemoglobina (10 g/l) y lípidos (10 g/l) no interfieren.

MANIPULACIÓN Y DESCARTE Todas las muestras deben considerarse como potencialmente infectivas, así como el material que haya estado en contacto con ellas. El tratamiento y eliminación de las mismas debe efectuarse de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio y las regulaciones locales. Un método sugerido es el autoclavado a 121ºC durante una hora. Los líquidos pueden ser inactivados dejándolos en hipoclorito de sodio 5% durante una hora.

CALIBRACION El método debe ser recalibrado con cada lote de reactivos y, al menos, una vez por mes o cuando los controles estén fuera de las especificaciones.

CURVA DE CALIBRACIÓN: Prepare las siguientes diluciones del calibrador usando solución fisiológica como diluyente.

CALCULOS La concentración en la muestra se obtiene por interpolación en la curva de calibración del dato de (A2-A1) obtenido con ella.

ENSAYO: Procedimiento: PREVIAMENTE, ATEMPERE EL REACTIVO. En tres tubos marcados B (blanco), E (estándar) y D (desconocido) agregue: Condiciones de reacción: Longitud de onda: 540 nm Temperatura: 37ºC Procedimiento: PREVIAMENTE, ATEMPERE LOS REACTIVOS.

ESTUDIO DE COMPARACIÓN En el desarrollo del producto se efectuaron comparaciones de muestras contra reactivos comerciales de igual fundamento técnico y aprobados por ANMAT, tomados como referencia.

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FERRITINA Inmunoquant

AVANCE national Reference for Ferritine (80/578, 1992, OMS).

Los resultados se muestran en la Tabla IV y en los Gráficos 2 y 3, expresados en µg/l.

SENSIBILIDAD La sensibilidad en espectrofotómetro a 540 nm, leyendo en cubetas de caras paralelas con un paso de luz de 1 cm, es aproximadamente 10 µg/l.

GRAFICO 1

LINEALIDAD La reacción cumple con la ley de Lambert & Beer hasta 450 µg/l. Muestras con valores mayores deben re ensayarse previa dilución con solución fisiológica. El resultado obtenido debe multiplicarse por la dilución efectuada..

Ferritina (µg/l)

EFECTO PROZONA: No se observa hasta valores de 6800 µg/l.

RECUPERACIÓN La recuperación obtenida por agregado de cantidades conocidas de LDL Colesterol a muestras biológicas estuvo entre el 98,2 y el 100,4%, dentro del rango de linealidad.

Hierro hepático (µmol/g tejido húmedo)

ESTUDIO DE PRECISIÓN Se procesaron pooles de muestras de personas caucásicas, adultas, sin antecedentes de patologías y sin medicación para el caso del nivel “normal”, y de las mismas características etáreas con antecedentes de valores anormales. Las muestras se conservaron congeladas a -20ºC en alícuotas durante todo el tiempo entre ensayos.

Los resultados son mostrados en las Tablas V y VI. Debe tenerse en cuenta que resultados incorrectos pueden obtenerse si no se respetan estrictamente las indicaciones dadas en el Manual de Instrucciones sobre Procedimientos de Uso, Calidad de la Muestra, etc.

GRAFICO 2

EVALUACIÓN DE DESEMPEÑO DE FERRITINA INMUNOQUANT ADAPTACIONES PARA AUTOMATIZACION El método es adaptable a analizadores automatizados.

Están disponibles adaptaciones para diferentes instrumentos.

En la Tabla III se indican los parámetros genéricos a emplear en automatización.

VALORES DE REFERENCIA Hombres: 30-220 µg/l Mujeres: 20-110 µg/l Cada laboratorio debe establecer los valores normales correspondientes a la población que atiende.

SUSTANCIAS DE REFERENCIA Y/O PATRONES EMPLEADOS La calibración del método ha sido referenciada al 2nd Inter5

FERRITINA Inmunoquant

AVANCE FIGURA 1 Estructura de la Ferritina

Valores normales según el sexo:

Hombre

Mujer

Está claro que valores de ferritina inferiores a 12 µg/l indican usualmente deficiencia de hierro.

Situaciones con aumento de ferritina independientes de la incorporación de hierro • inflamación crónica (por efecto de las citokinas de inflamación) • daño hepático (liberación por destrucción de hepatocitos) • liberación por destrucción de tumores

TABLA II Ventajas e inconvenientes de medir la ferritina sérica Ventajas • Económica y fácil de determinar

• Determinación indirecta de la carga de hierro

• Permite una vigilancia frecuente

• Requiere determinaciones seriadas y/o la combinación con otros indicadores de sobrecarga de hierro

• Correlación positiva con la

(el original está en:

morbimortalidad

http://www.ironhealthalliance.com/es/diagnostics/serum-ferritin-

Inconvenientes

measurement.jsp )

TABLA I Consideraciones necesarias en el uso de la ferritina sérica como marcador para la evaluación del contenido de hierro corporal

El uso diagnóstico diferencial de la ferritina sérica depende de su concentración Elevación leve (250-500µg/l) Procesos malignos, daño hepático crónico, inflamación crónica, sobrecarga leve de hierro Elevación menor (500-1000 µg/l) Primer estadío de sobrecarga de hierro, eritpoyesis inefectiva (talasemia, etc.)

Elevación moderada (1000-5000 µg/l) Sobrecarga de hierro, enfermedad de Still del adulto, sindrome hemofagocítico Elevación severa (> 5000 µg/l) Sobrecarga de hierro (hemocromatosis)

6

FERRITINA Inmunoquant

• Los niveles dependen de muchos factores, incluidas la infección y la inflamación

AVANCE TABLA III Par谩metros para automatizaci贸n

7

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AVANCE Tabla VI Reproducibilidad inter ensayo

Tabla IV Comparación con otros métodos

Conc µg/l MUESTRA

1

2

3

52,7 49,2 52,3 54,1 54,6 50,2 52,3 53,1 50,5 50,1

288,0 289,0 275,0 290,0 294,2 280,2 296,0 280,2 280,7 279,1

456,0 452,3 440,4 448,4 454,9 449,6 447,4 425,6 456,2 445,6

51,9

285,3

447,6

SD µg/l ±

1,820

7,12

9,21

C.V.

3,51

2,50

2,06

Método A

GT Lab Inmunoquant

Método B

74

72

69

115

119

115

121

120

122

108

107

108

125

119

121

367

352

347

404

409

427

PROMEDIO µg/l

282

274

276

101

97

100

171

175

174

31

29

30

188

193

201

288

299

285

51

54

56

409

392

385

81

85

86

223

215

208

379

388

386

335

336

325

200

191

193

107

107

105

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

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CONTRA METODO A Ecuación de regresión y= 0,99 x + 0,61 Coeficiente de correlación: 1,00

CONTRA METODO B Ecuación de regresión y= 1,00 x - 0,34 Coeficiente de correlación: 0,999

Tabla V Reproducibilidad intra ensayo Conc µg/l MUESTRA

1

2

3

50,6 50,8 53,0 54,0 52,6 52,0 52,7 53,1 51,1 49,7

281,2 285,3 291,2 274,3 288,5 288,4 278,8 280,8 282,3 288,7

429,3 428,3 428,4 427,7 428,6 429,6 430,0 427,1 425,7 425,4

52,0

284,0

428,0

SD µg/l ±

1,341

5,329

1,564

C.V.

2,58

1,88

0,37

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

PROMEDIO µg/l

%±

%±

8

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