Fructosamina newsletter

AVANCE

N° 12 Agosto 2013

AVANCE Publicación de contenido científico editada por GT Laboratorio S.R.L. Necochea 3274 Rosario

FRUCTOSAMINA

Método colorimétrico para determinar Fructosamina en suero

GT Lab ha introducido un método colorimétrico directo con una técnica que emplea un reactivo de trabajo único de sencilla preparación. Su preparación se hace por disolución de un polvo en el buffer provisto listo para usar. El reactivo de trabajo es estable 7 días a temperatura ambiente o 30 días refrigerado.

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FRUCTOSAMINA

AVANCE INTRODUCCIÓN

presta gran atención en la actualidad al control y prevención de las complicaciones que, a largo plazo, se desarrollan con esta enfermedad es fundamental tener en cuenta el mantenimiento del nivel de glucosa en sangre lo más cercano posible a la normalidad.

Medir diariamente la glucosa, no es con frecuencia, una vía práctica para establecer el control diabético (7), aunque continúa siendo el “estándar de oro” por el cual deben juzgarse otros parámetros.

Con la idea de encontrar marcadores a más largo plazo del control glucémico, se desarrollaron en la década de los 70 numerosas técnicas para evaluar la hemoglobina glucosilada, proteína modificada covalentemente por la formación de un aducto (base Schiff) con la glucosa. Algunas de estas técnicas han sido introducidas en las mediciones clínicas de rutina y han suministrado una indicación retrospectiva de los niveles de glucosa en sangre durante varias semanas (4-6 semanas) (8).

El descubrimiento de que otras proteínas séricas sufrían una glucosilación tal como la hemoglobina (9), fomentó el interés por investigar su significado clínico. La albúmina glucosilada se ha propuesto como un índice de control glucémico durante un período de 2-3 semanas (10), período considerablemente menor que la hemoglobina glucosilada, por lo cual se ha postulado como un marcador a mediano plazo (11,12).

El término fructosaminas fue introducido en 1982 por Johnson et al. (13) para referirse de manera general a las proteínas glucosiladas del suero, pero en la práctica este refleja básicamente la concentración de albúmina glucosilada.

Las reacciones de glucosilación comienzan en todos los casos con la adición nucleofílica de la glucosa al grupo amino terminal de las proteínas para formar una base Schiff. La base Schiff lábil rápidamente alcanza un nivel de equilibrio in vivo que refleja la concentración de glucosa existente. Estos productos sufren reordenamientos de Amadori (isomerización de aldosilamina a 1-amino-1 deoxy-2-cetosa) para formar una fructosamina estable (14,15) que permanece en el organismo durante el tiempo de vida media de la proteína en cuestión.

Ya en 1984 se demostró que la fructosamina es un marcador más sensible que la determinación de HbA1c, la glucosuria (24 horas) o la glucosa en ayunas, en la detección del deterioro del control glucémico después de la suspensión de los hipoglucemiantes orales en diabéticos tipo II (16). El mismo estudio, realizado con 2 321 trabajadores de mediana edad, mostró una sensibilidad y especificidad para el diagnóstico de 84,9 % y 97 %, respectivamente, como método de despistaje para detectar individuos con diabetes mellitus no diagnosticada.

Igualmente se ha postulado medir los niveles de fructosaminas para evaluar el control de glucemia en pacientes diabéticas gestantes. Éste debe ser especialmente útil para lograr una evaluación objetiva del control a mediano plazo de pacientes que son incapaces de realizar el monitoreo de la glucosa en su casa, aquéllos que lo hacen sin exactitud o quienes tienen trastornos en la vida media de los eritrocitos, en los cuales la

UTILIDAD CLÍNICA La prevalencia de la diabetes mellitus, en especial la tipo 2, está en aumento en todo el mundo. Esto es atribuido a los nuevos estilos de vida que impulsan el desarrollo de factores de riesgo para esta enfermedad como el hábito de fumar (aun cuando la incidencia disminuye en países desarrollados), la obesidad, los malos hábitos alimenticios y el sedentarismo (los que afectan también a países desarrollados). (1) Asimismo, preocupa el inicio temprano de la diabetes tipo 2 y que esta enfermedad genético–ambiental lleva a una importante morbimortalidad con los consecuentes altos costos sociales y económicos para los sistemas de salud.

La diabetes mellitus es la causa principal de nefropatía en Europa y Estados Unidos, donde el 40% de los casos nuevos de insuficiencia renal corresponden a personas diabéticas (2).

Esto repercute en un incremento en el costo del manejo y tratamiento de esta enfermedad. Allí se ha determinado que este riesgo es más frecuentes en hispanos, nativos americanos y en africanos.(3) Por otra parte, la insuficiencia renal crónica en pacientes con diabetes mellitus tipo 2 está asociada a un peor pronóstico.

(4,5) La esperanza de vida de un paciente con diabetes mellitus tipo 2 que necesita un transplante renal o diálisis por insuficiencia renal crónica es 30% menor que un paciente no diabético. El 50% de los pacientes tipo 2 ya tienen complicaciones vasculares al diagnóstico de su diabetes lo que les lleva a una reducción de un 25% en la longevidad. (6) El estudio prospectivo de diabetes tipo 2 del Reino Unido, ha proporcionado un mayor conocimiento acerca de la relación entre enfermedad coronaria y los distintos factores de riesgo como lo son el aumento del LDL-colesterol, la disminución del HDL-colesterol, la hipertensión, la hiperglucemia y el tabaquismo.

La glucosa reacciona en forma no enzimática con las proteínas de la sangre dando lugar a proteínas glicoxiladas por formación de bases de Schiff inestables. Estas bases se estabilizan por un reordenamiento interno (conversión de Amadori) dando lugar a cetoaminas estables. Las glucoproteínas resultantes incluyen glucohemoglobina, glucoalbúmina y proteínas totales glucosiladas.

Se ha aceptado emplear el término fructosamina para describir a tanto a la glucoalbúmina como a las glucoproteínas totales glucosiladas. Como el tiempo de vida media de estas proteínas es de 2 a 3 semanas, su concentración refleja el promedio de la concentración de glucosa en ese lapso, siendo un dato importante en el monitoreo del control diabético.

Este dato se complementa con la determinación puntual de la glucemia y la glucosuria y con la concentración de la glucohemoglobina, que provee información de plazos mayores, dado que la vida media de la hemoglobina es de 6 a 8 semanas.

Dado que, para el tratamiento de la diabetes mellitus, se le 2

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evaluación de la HbA1c no es válida (17).

Una a validación clínica de la segunda generación de la prueba de fructosamina (18), que utiliza muestras de pacientes clasificados sobre la base de los valores de glicohemoglobina, pudieron discriminar entre no diabéticos, diabéticos con control bueno/moderado (HbA1 < 10 %) y diabéticos con pobre control (HbA1 ≥ 10 %). Además, evaluaron la validez de la prueba para determinar el control a corto plazo en 23 pacientes diabéticos no insulinodependientes que participaban en un programa de 10 semanas para la normalización rápida de su perfil glucémico. Los resultados se correlacionaron significativamente con los valores promedio de glucosa en sangre capilar obtenidos en 1 y 3 semanas.

La determinación de fructosamina presenta ventajas al compararla con la de HbA1c, tal como la factibilidad de automatización, menor costo, la rapidez con que indica cambios en el equilibrio diabético y su metodología utilizable en cualquier laboratorio. No obstante, debe tenerse en cuenta que presenta, como desventaja, interferencias por algunas sustancias (bilirrubina, hemoglobina) y variaciones con la concentración total de proteínas.

Pese a haberse demostrado su utilidad clínica, parece importante utilizarla determinación juntamente con las de HbA1 o la glucemia en ayunas.

PRINCIPIO DE LA DETERMINACIÓN La reacción se basa en la propiedad de las cetoaminas de reducir las sales de tetrazolium en medio alcalino, formando complejos coloreados denominados formazán. La velocidad de formación del formazán, medida espectrofotométricamente, es directamente proporcional a la concentración de fructosamina en la muestra.

REACTIVOS PROVISTOS Composición R1: Solución de 100 mmol/l carbonato de sodio, pH= 10.3.

Listo para usar.

R2: 6.27 µmoles nitroblue tetrazolium (NBT) en polvo.

Calibrador: pool de sueros humanos conteniendo fructosamina en concentración variable de lote a lote. Liofilizado.

Indicios de inestabilidad o deterioro de los reactivos Turbiedad o formación de precipitados de los reactivos líquidos y formación de grumos por humectación de los reactivos sólidos son indicios de deterioro.

Conservación y estabilidad de los reactivos provistos Conserve refrigerado sin congelar (2-8ºC) y protegido de la luz.

La estabilidad alcanza la fecha de vencimiento indicada en la caja.

Precauciones y advertencias sobre el uso de reactivos El producto es exclusivamente para uso Diagnóstico “IN VITRO”.

Los reactivos no presentan riesgos biológicos de manipulación y descarte ya que NO POSEEN en su composición MATERIALES POTENCIALMENTE INFECTIVOS. El Calibrador fue preparado con sueros humanos no reactivos para HBsAg, HCV e HIV, pero siempre debe ser tratado como potencialmente infectivo.

La caja y los envases contenidos en este producto no deben ser reusados, debiendo descartarse como residuos peligrosos una vez empleados, de acuerdo a la legislación vigente. El personal que manipula los mismos debe ser debidamente capacitado para su manejo y descarte por la institución o laboratorio que lo emplea.

MÉTODOS DE LABORATORIO Se han desarrollado diferentes métodos para medir proteínas glucosiladas, incluyendo la cromatografía de afinidad (19,20) métodos espectrofotométricos basados en la reacción del ácido tiobarbitúrico (21) la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (22) métodos inmunorradiométricos (23) etc.

Cada uno de estos métodos es capaz de brindar buenos resultados en manos experimentadas, sin embargo, son generalmente caros o muy engorrosos para su uso en los laboratorios de química clínica.

En 1982, Johnson et al. (13) describieron un ensayo para fructosaminas basado en la habilidad de estas cetoaminas de reducir al colorante azul de nitrotetrazolio (NBT) en medio alcalino. Debido a la facilidad con que esta determinación pudo ser automatizada y los excelentes coeficientes de variación mostrados, se convirtió rápidamente en una prueba atractiva para monitorear la diabetes mellitus(16). A pesar de estas ventajas, los problemas para calibrar y optimizar las condiciones de reacción, han limitado su aceptación como un índice de control de la diabetes.

Se ha encontrado que el método del NBT correlaciona no sólo con la concentración de glucosa sanguínea y la hemoglobina glucosilada sino también con las proteínas glucosiladas determinadas por el método del ácido tiobarbitúrico y cromatografía de afinidad (24).

MATERIALES NECESARIOS PERO NO PROVISTOS - Material volumétrico de acuerdo a los volúmenes indicados en PROCEDIMIENTO. - Baño De 37ºC - Espectrofotómetro o fotocolorímetro - Timer REACTIVO DE TRABAJO Preparación Reactivo de Trabajo (RT): A un frasco de R2, agregue el volumen de R1 indicado en el rótulo. Tape y mezcle suavemente hasta disolución.

Calibrador: Agregue 1 ml de agua desmineralizada. Tape y 3

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AVANCE mezcle suavemente hasta disolución.

Composición RT: Nitroblue tetrazolium 0.57 mol/l en carbonato de sodio 100 mmol/l pH =10.3.

Calibrador: La concentración está indicada en el rótulo del frasco.

Conservación y estabilidad El Reactivo de Trabajo es estable 7 días a temperatura ambiente (15-25ºC) o 30 días refrigerado (2-8ºC).

Proteger de la luz.

El Calibrador, una vez preparado, es estable 15 días refrigerado (2-8ºC) o 2 meses a -20ºC. Indicios de inestabilidad o deterioro La aparición de turbiedad o sedimento es indicio de deterioro.

La absorbancia del blanco de Reactivo de Trabajo debe superar 0.3 D.O., leída a 550 nm

Muestra Calibrador Reactivo de Trabajo

C

D

-

50 µl

50 µl

-

1,0 ml

1,0 ml

Mezcle. Incube 10 minutos a 37ºC y lea en espectrofotómetro a lectura A1. Incube otros 5 minutos a 37ºC y proceda a leer la lectura A2.

CALCULOS Calcule las diferencias ∆A = A2 – A1, para los tubos C (∆Ac) y D (∆Ad). ∆AD -------- x concentración Calibrador = µmol/l fructosamina ∆AC VALORES DE REFERENCIA 161 – 287 µmol/l Se recomienda que cada laboratorio determine los valores normales correspondientes a su población.

MUESTRA Suero: Obtener de la manera usual evitando la hemólisis y la éstasis venosa. Separe el paquete globular por centrifugación dentro de los 30 minutos de obtenida la muestra.

Condiciones de conservación de las muestras Estable 7 días a 2-8ºC. No es recomendable el congelamiento.

Aditivos No son necesarios.

Sustancias interferentes La hemólisis puede causar resultados falsamente aumentados porque la glucohemoglobina reacciona como fructosamina.

Algunas drogas y medicamentos pueden provocar interferencias, según índica el trabajo de Young (vea cita bibliográfica).

Manipulación y descarte Las muestras de pacientes deben manipularse considerándolas potencialmente infecciosas, al igual que el material descartable y los utilizados en el ensayo, que hayan estado en contacto con las mismas, incluido el papel absorbente. El descarte debe hacerse de acuerdo a las buenas prácticas de laboratorio y a las regulaciones locales.

Un procedimiento sugerido para descartarlos es el autoclavado a 121ºC durante una hora y el tratamiento de los líquidos residuales con hipoclorito de sodio durante una hora a una concentración final del 5%.

EVALUACIÓN DE DESEMPEÑO a- COMPARACIÓN CON OTROS MÉTODOS Se efectuaron comparaciones de muestras contra reactivos comerciales de reconocida trayectoria en el mercado local y similar fundamento técnico, uno importado y otro de fabricación nacional. Los resultados se muestran en la Tabla I, expresados en µmoles/l, encontrándose graficados en los Gráficos 1y2 b- SENSIBILIDAD En espectrofotómetro a 550 nm, la sensibilidad es de 1 μmol/l. c- LINEALIDAD Hasta 1000 μmol/l. Para valores superiores diluir adecuadamente la muestra con solución fisiológica. Repetir el ensayo.

Multiplicar el resultado obtenido por la dilución efectuada. d- RECUPERACIÓN La recuperación obtenida por agregado de cantidades conocidas de calcio a muestras biológicas estuvo entre el 99,7 y el 102,4%, dentro del rango establecido en b-.

ENSAYO Condiciones de Ensayo: Long de Onda: 520 nm (490 – 550 nm) Temperatura: 37ºC Procedimiento: PREVIAMENTE, ATEMPERE EL REACTIVO DE TRABAJO. En dos tubos marcados C (Calibrador) y D (desconocido) agregue:

e- REPRODUCIBILIDAD: Los datos de los experimentos de reproducibilidad están representados en las Tablas II y III. CONTROL DE CALIDAD Las buenas prácticas de fabricación y control recomiendan procesar diariamente muestras control normales y patológicas.

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AVANCE ADAPTACIONES A INSTRUMENTOS AUTOMÁTICOS Están disponibles adaptaciones para diferentes analizadores automatizados. Consulte al departamento de atención al cliente para mayores datos (infoprofesional@gtlab.com.ar) TABLA II Reproducibilidad intra ensayo

TABLA I Comparación con métodos comerciales Equipo Importado colorimétrico D.O.

mmol/l

GTLab Ensayo D.O.

Muestra

1

2

3

1

299

520

924

mmol/l

2

290

496

921

3

297

492

877

4

300

500

867

5

301

495

923

6

309

517

927

7

301

499

856

8

308

518

843

9

291

491

918

10

303

521

880

Método por Ión selectivo

mmol/l

0,222

BR

0,101

BR

BR

0,102

Std

0,098

Std

Std

0,077

95,0

0,077

97,6

102,7

0,041

49,7

0,040

50,4

53,6

0,098

120,5

0,094

120,1

121,9

0,080

97,6

0,080

102,3

100,4

0,067

81,5

0,065

83,3

88,8

0,048

59,0

0,048

61,0

60,3

0,095

116,1

0,092

117,7

116,7

0,077

94,9

0,074

94,0

90,6

0,073

89,2

0,068

87,0

86,3

0,051

62,9

0,047

60,4

59,6

0,078

95,7

0,074

94,8

94,8

0,063

77,1

0,063

80,0

80,9

0,097

119,5

0,092

117,2

119,4

0,100

122,7

0,092

117,4

118,8

0,077

94,7

0,074

94,2

93,6

0,087

106,3

0,080

101,6

100,5

0,077

94,2

0,075

96,1

99,2

0,073

88,9

0,074

94,6

93,8

0,081

98,8

0,082

104,4

103,9

0,088

108,3

0,085

108,1

110,8

0,070

86,2

0,070

89,4

89,8

Muestra

300

505

894

SD mmol/l ±

6,11

12,3

32,2

C.V. % ±

2,03

2,43

3,61

1

2

3

1

308

503

829

2

317

511

913

3

309

527

851

4

290

519

832

5

295

500

861

6

307

527

842

7

318

506

888

8

312

527

870

9

291

494

911

10

292

503

904

Muestra

304

512

870

SD mmol/l ±

10,9

12,4

32,0

C.V. % ±

3,59

2,42

3,70

TABLA III Reproducibilidad inter ensayo Muestra

Contra reactivo importado Ecuación de regresión y= 1,070x + -0,171 Coeficiente de correlación: 0,000 Contra reactivo de origen nacional Ecuación de regresión y= 0,896 x + 0,669 Coeficiente de correlación: 0,920

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AVANCE GRAFICO 1

GRAFICO 2

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