AVANC News HCG ELISA

N° 8 Octubre 2012

AVANCE

AVANCE Publicación de contenido científico editada por GT Laboratorio S.R.L. Necochea 3274 Rosario

Para la determinación de Gonadotrofina Coriónica Humana en orina, plasma o suero.

Método ELISA visual.

HCG ELISA

GT Lab lleva desde hace varios años produciendo un kit para la detección de gonadotrofina coriónica humana (hCG) basado en un enzimo inmuno ensayo (ELISA) directo.

Desde su lanzamiento, el kit tuvo un rápido éxito por su excelente performance.

No obstante, GT Lab está permanentemente revisando sus productos según su política de mejora permanente. En el caso de la tecnología ELISA, mucho ha evolucionado en lo referente a la preparación de los componentes de los reactivos que se emplean.

Así, podemos señalar el fuerte desarrollo producido en la fabricación de materiales plásticos empleados en la preparación de la fase sólida (microcubetas), lográndose procesos productivos que hacen que los anticuerpos empleados en la sensibilización de las mismas queden adheridos con mucha más fuerza, lo que redunda en mejoras en la sensibilidad y estabilidad de los reactivos.

Igualmente, se ha avanzado mucho en los métodos de purificación de proteínas, lo que ha redundado en anticuerpos y conjugados mucho más puros, en mejoras en la especificidad y, nuevamente, en su estabilidad.

Igualmente, debemos señalar mejoras productivas en la preparación misma de los reactivos componentes del kit en cuanto a la obtención de insumos de mayor pureza y una evolución lógica de la tecnología de producción.

Así se obtienen importantes resultados en la producción de reactivos; robustos, de alta calidad de resultados; y con una excelente constancia de lote a lote.

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HCG ELISA

AVANCE INTRODUCCIÓN Gonadotropina Coriónica Humana (hCG) La hCG es una hormona glicoproteica producida en el embarazo, fabricada por el embrión en desarrollo poco después de la concepción y más tarde por el sincitiotrofoblasto (parte de la placenta). Su función es evitar la desintegración del cuerpo lúteo del ovario y, por ende, mantener la producción de progesterona que es fundamental para el embarazo en los seres humanos. (1,2,3) La hCG puede tener funciones adicionales; por ejemplo, se cree que afecta a la tolerancia inmunológica del embarazo.

Las pruebas de embarazo más precoces se basan en la detección de hCG. (1,2,3) Debido a que la hCG es producida también por algunos tipos de tumores, es un importante marcador tumoral, pero no se sabe si esta producción es una causa o un efecto de la tumorigénesis. (4,5).

Al igual que otras gonadotropinas, la hCG se puede extraer de la orina de mujeres embarazadas, que es la fuente más usual y abundante, o por recombinación genética. (6)

cen un aumento en la apoptosis de las células T. Estos resultados sugieren que la hCG puede ser un enlace en el desarrollo de la tolerancia inmunológica peritrofoblástica, puediendo facilitar la invasión del trofoblasto, un proceso que acelera el desarrollo fetal en el endometrio. También se ha sugerido que los niveles de hCG están vinculados con la gravedad de los mareos matinales en mujeres embarazadas. (3) Debido a su similitud con la hormona luteinizante (LH), la hCG también puede usarse clínicamente para inducir la ovulación en los ovarios, así como la producción de testosterona en los testículos. (7,8) La hCG también juega un papel en la diferenciación y proliferación celular, y puede activar la apoptosis. (3) Pruebas de Gonadotropina Coriónica Humana Los niveles de hCG pueden medirse en la sangre o la orina. (9) Con mayor frecuencia, se hace como una prueba de embarazo, destinada a indicar la presencia o ausencia de un embrión implantado. También pueden hacerse pruebas de hCG para el diagnóstico o seguimiento de células germinales y tumores trofoblásticos.

La mayor parte de las pruebas emplean un anticuerpo monoclonal (MAb) específico de la subunidad β de la hCG (βhCG).

Este procedimiento se emplea para asegurar que las pruebas no dan falsos positivos por interferencia de la LH y la FSH en la determinación. Tanto la LH como la FSH están siempre presentes en diferentes niveles, mientras que la presencia de hCG casi siempre indica el embarazo. (9)

Estructura de la hCG La hCG es una glicoproteína compuesta de 244 aminoácidos, con un peso molecular de 36,7 kDa. Sus dimensiones totales son de 75×35×30 angstroms (7,5×3,5×3 nanómetros).

(1,2,3). La Figura 1 ofrece una visión esquematizada de su estructura.

Es heterodimérica, con una subunidad β (beta) que es específica de la hCG, y con una subunidad α (alfa) idéntica a la de la hormona luteinizante (LH), la hormona folículo-estimulante (FSH), y la hormona estimulante del tiroides (TSH). La subunidad α (alfa) tiene 92 aminoácidos de largo y unas dimensiones de 60×25×15 angstroms (6×2,5×1,5 nm).

La subunidad β de la hCG contiene 145 aminoácidos y unas dimensiones de 6,5×2,5×2 nm, codificados mediante seis genes muy homólogos que están dispuestos en tándem y en pares invertidos en el cromosoma 19q 13.3 - CGB (1, 2, 3, 5 , 7, 8).

Las dos subunidades crean un pequeño núcleo hidrófobo rodeado por una gran superficie con una proporción área volumen 2,8 veces mayor que la de una esfera. La gran mayoría de los aminoácidos exteriores son hidrófilos.

Prueba en orina La prueba de orina puede ser un inmunoanálisis de distinto fundamento (aglutinación de látex, ELISA, cromatográfico, etc.). Los umbrales de detección van de 20 a 100 mUI/ml (mili unidades internacionales por mililitro), dependiendo del reactivo y el método empleado.

La realización del test sobre la primera orina matinal cobra mayor importancia cuanto más temprano es el embarazo a detectar, ya que dicha micción es más concentrada. Cuando la orina es más diluida, con gravedad específica inferior a 1.015, la concentración de hCG puede resultar fisiológicamente baja quedar por debajo de la sensibilidad del método, dando eventuales falsos negativos.

Funciones de la hCG La hCG interactúa con el receptor LHCG y promueve el mantenimiento del cuerpo lúteo durante el comienzo del embarazo, haciendo que éste secrete la hormona progesterona. La progesterona enriquece el útero con un grueso revestimiento de vasos sanguíneos y capilares, de manera que pueda sostener el crecimiento del feto. Debido a su alta carga negativa, la hCG puede repeler las células inmunitarias de la madre, protegiendo al feto durante el primer trimestre. También se ha formulado la hipótesis de que la hCG placentaria puede ser un vínculo para el desarrollo de la inmunotolerancia maternal.

Por ejemplo, las células endometriales tratadas con hCG indu-

Prueba de suero La prueba en suero o plasma es típicamente un inmunoanálisis quimioluminiscente, ELISA o fluorimétrico, que puede detectar niveles de βhCG tan bajos como 5 mUI/ml y permite la cuantificación de la concentración de βhCG. La determinación cuantitativa de βhCG es útil en el seguimiento de células germinales y tumores trofoblásticos, el seguimiento después del aborto involuntario, y el diagnóstico y seguimiento después de tratar un embarazo ectópico. La ausencia de un feto visible en la vagina por ultrasonido después de que la βhCG haya alcanzado niveles de 1500 UI/ml es muy indicativo de un embarazo ectópico.

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HCG ELISA

AVANCE Una enfermedad trofoblástica gestacional, como las molas hidatidiformes (“embarazo molar”), o el coriocarcinoma, pueden producir altos niveles de βhCG (debido a la presencia de sincitioltrofoblastos, parte de las vellosidades que componen la placenta), a pesar de la ausencia de un embrión.

Los altos niveles de hCG también son un componente del triple test, una prueba de detección para determinadas anormalidades cromosómicas fetales y defectos de nacimiento.

En todos estos casos, un ensayo cualitativo por un método sensible y confiable como el ELISA, permite tener un dato preliminar, a menudo suficiente para el diagnóstico, antes de recurrir a métodos más costosos como la cuantificación.

En el varón, las inyecciones de hCG se utilizan para estimular las células de Leydig que sintetizan la testosterona. La testosterona intratesticular es necesaria para la espermatogénesis en las células de Sertoli. Los usos típicos de la hCG en los hombres son el hipogonadismo y los tratamientos de fertilidad. (11,12) Durante los primeros meses de embarazo, la transmisión del VIH-1 de la mujer al feto es extremadamente rara. Se ha sugerido que esto se debe a la alta concentración de hCG, y que la subunidad beta de esta proteína es activa contra el VIH-1. (13) - para la pérdida de peso Un uso polémico de la hCG es como complemento de una dieta ultra-baja en calorías desarrollada por el endocrinólogo británico ATW Simeons (14). Esta técnica permitiría perder grasa con una dieta muy baja en calorías sin perder tejido muscular, combatiendo así la obesidad. Sin embargo, el uso de la hCG para perder peso se considera ineficiente e inseguro por la comunidad científica. (15,16,17)

Concentraciones usuales de hCG La Tabla I indica los niveles de hCG típicamente encontrados en suero para una población normal. Cada mujer puede tener valores que escapen de estos rangos. La Tabla I indica los niveles de hCG típicamente encontrados en suero para una población normal. Cada mujer puede tener valores que escapen de estos rangos.

- en combinación con esteroides anabolizantes En el mundo de las drogas que aumentan el rendimiento deportivo, la hCG se utiliza cada vez más en combinación con varios ciclos de esteroides anabólizantes androgénicos (EAA).

En los hombres, la hCG imita a la hormona luteinizante y ayuda a restaurar y mantener la producción de testosterona en los testículos. Debido a esto, la hCG se utiliza comúnmente durante y después de los ciclos de esteroides para mantener y restaurar el tamaño testicular, así como la producción de testosterona endógena. Sin embargo, si la hCG se utiliza durante demasiado tiempo y en una dosis demasiado alta (con el consiguiente aumento de la testosterona natural), eventualmente inhibirá su propia producción a través de retroalimentación negativa sobre el hipotálamo y la hipófisis. (18)

Aplicaciones de la determinación de hCG En general excede la necesidad de determinar su presencia en relación al embarazo.

Efectivamente, existen varias situaciones vinculadas a diferentes patologías y tratamientos donde la determinación de hCG adquiere importancia.

- como marcador tumoral La subunidad β de la gonadotropina coriónica humana también es secretada por algunos tipos de cáncer como el coriocarcinoma, los tumores de células germinales, la formación de mola hidatidiforme, el teratoma con elementos de coriocarcinoma (es raro), y los islotes de células tumorales. Por esta razón, un resultado positivo en hombres puede ser una prueba de cáncer. El rango normal para los hombres es de 0-5 UI/ml, aunque no debería sospecharse que hay cáncer si el nivel es menor de 30 UI/ml. (4,5)

Principio del ensayo Se trata de un ensayo ELISA que emplea anticuerpos monoclonales y policlonales específicos para subunidad βhCG, permitiendo una determinación específica, rápida y sensible.

La hCG eventualmente presente en la muestra es capturada por anticuerpos policlonales adsorbidos en la superficie interna de los pocillos de una micro policubeta. Estas moléculas de hCG así retenidas, reaccionan simultáneamente con un anticuerpo monoclonal anti-beta hCG conjugado con peroxidada, reteniendo así una actividad enzimática proporcional a la cantidad de hormona presente.

Tras lavar el exceso de muestra y conjugado, se podrá revelar la activad de peroxidasa retenida en el pocillo mediante la acción de la tetrametilbenzidina. La aparición de un color celeste a azul será indicador de una reacción positiva.

- en tratamientos de fertilidad La hCG se utiliza ampliamente como medicación parenteral en tratamientos de fertilidad en lugar de la hormona luteinizante. En presencia de uno o más folículos ováricos maduros, la ovulación puede ser activada mediante la administración de hCG. Como la ovulación ocurrirá unas 36-48 horas después de la inyección de hCG, se pueden programar procedimientos para tomar ventaja de esta secuencia temporal. Por lo tanto, las pacientes que siguen una fertilización in vitro, en general, reciben hCG para desencadenar la ovulación, pero tienen sus óvulos recuperados en unas 36 horas después de la inyección (unas pocas horas antes de lo que los óvulos serían liberados normalmente en el ovario). (7,8) La administración de hCG también se utiliza, en determinadas circunstancias, para aumentar la producción de progesterona. (10)

Composición de los Reactivos Provistos Los reactivos son provistos listos para usar.

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HCG ELISA

AVANCE Pocillos sensibilizados: 48 pocillos separables individualmente con anticuerpo policlonal anti-hCG adsorbidos en su superficie.

Enzima-Conjugado: un frasco gotero con 2.5 ml de anticuerpo monoclonal anti-βhCG conjugado con peroxidasa. El reactivo posee un colorante rosado en su composición para facilitar la visualización de su agregado en cada pocillo.

Reactivo A: un frasco gotero conteniendo 4 ml de solución de peróxido de hidrógeno.

Reactivo B: un frasco gotero conteniendo 4 ml de solución de tetrametilbenzidina en buffer fosfatos-citrato 50 mmol/l, pH = 5.0 Control Negativo: un frasco gotero conteniendo 1 ml de una solución proteica de, aproximadamente, 25 mUI/ml hCG Control Positivo: un frasco gotero conteniendo 1 ml de una solución proteica de reaccón negativa para hCG Solución lavadora: 2 frascos goteros conteniendo, cada uno, 60 ml de solución salina tamponada a pH = 7.4 Accesorios: Un soporte para los pocillos.

vadores. La muestra a analizar debe ser límpida; centrifugue antes de ensayar si fuera necesario.

Condiciones de conservación de las muestras.

Las muestras deben ser preferentemente frescas.

Suero/Plasma: 24 horas en refrigerador (2-8ºC) o 30 días congelada (-20ºC).

Orina: 48 horas en refrigerador (2-8ºC).

Sustancias interferentes Hemólisis y bilirrubinemia moderadas, no interfieren. La hemoglobina, glucosa, acetaminofeno, ácido acetilsalicílico, ácido ascórbico, atropina, cafeína, ácido gentísico y otras drogas en elevadas concentraciones pueden provocar falsos positivos o falsos negativos, por lo que siempre es importante conocer si el paciente está recibiendo alguna medicación. Nunca se debe dejar de tomar un medicamento sin hablar primero con el médico.

Manipulación y descarte Las muestras de pacientes deben manipularse considerándolas potencialmente infecciosas, al igual que el material descartable y los utilizados en el ensayo, que hayan estado en contacto con las mismas, incluido el papel absorbente. El descarte debe hacerse de acuerdo a las buenas prácticas de laboratorio y a las regulaciones locales.

Un procedimiento sugerido para descartarlos es el autoclavado a 121ºC durante una hora y el tratamiento de los líquidos residuales con hipoclorito de sodio durante una hora a una concentración final del 5%.

Conservación y estabilidad Conserve los reactivos refrigerados (2-8ºC) sin congelar. La estabilidad alcanza la fecha de vencimiento indicada en la caja.

Precauciones y advertencias sobre su uso Los reactivos son para uso IN VITRO exclusivamente.

Mantenga los Pocillos Sensibilizados protegidos de la humedad. No exponga los reactivos a la luz directa. No introduzca pipetas o tips en los reactivos.

Debe tenerse especial cuidado en no intercambiar las tapas de los frascos, que están identificadas con un código de color.

La caja y los envases contenidos en este producto no deben ser reusados, debiendo descartarse como residuos peligrosos una vez empleados, de acuerdo a la legislación vigente. El personal que manipula los mismos debe ser debidamente capacitado para su manejo y descarte por la institución o laboratorio que lo emplea.

ENSAYO: Antes de proceder a la ejecución del ensayo, tanto los reactivos como las muestras deben ser llevados a una temperatura ambiente no inferior a los 20ºC. Homogeneice antes de usar.

Procedimiento de análisis: Coloque en el soporte la cantidad de pocillos necesarios para los Controles y las muestras a ensayar.

Pocillos sensibilizados

REACTIVOS NECESARIOS PERO NO PROVISTOS No son requeridos.

REACTIVOS NECESARIOS PERO NO PROVISTOS Suero, plasma u orina Suero/plasma: Obtenga de la manera usual, libre de hemólisis. En caso de usar plasma, recoja con EDTA o heparina como anticoagulante.

Separe el paquete globular por centrifugación dentro de los 30 minutos de obtenida la muestra.

Orina: Es conveniente emplear la primera orina de la mañana, la que al ser más concentrada provee mayor sensibilidad a la determinación. Recoja en recipiente limpio, seco y sin conser-

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Control Negativo

1 gota

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Control Positivo

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1 gota

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Muestra

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1 gota

1 gota

1 gota

1 gota

Enzima-Conjugado

Mezcle por movimientos laterales del pocillo.

Incube a temperatura ambiente NO INFERIOR a 20ºC Elimine el contenido de los pocillos por inversión y sacudiendo enérgicamente para favorecer el vaciado. Lave 5 veces con la Solución Lavadora provista. Escurra el contenido remanente en los pocillos sobre papel absorbente.

Reactivo A

1 gota

1 gota

1 gota

Reactivo B

1 gota

1 gota

1 gota

Mezcle por movimientos laterales del pocillo. Mantenga a temperatura ambiente NO INFERIOR a 20ºC.

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AVANCE GT Elisa (1)

(*) Para evitar contaminaciones cruzadas entre pocillos, es conveniente colocarlos separados entre sí en el soporte. El agregado de la Solución Lavadora debe hacerse gota a gota SIN QUE REBALSE su contenido para evitar contaminación cruzada.

Para lograr un total escurrimiento del líquido de lavado, golpee varias veces el pocillo invertido sobre el papel absorbente.

Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg ± + ++ +++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ +++

TIEMPOS DE LECTURA DE RESULTADOS Compare el color desarrollado por las muestras con los de los Controles entre los 2 y los 5 minutos después del agregado del Reactivo B. INTERPRETACION DE RESULTADOS CONTROL DE CALIDAD Se recomienda procesar juntamente con las muestras a ensayar, muestras positivas y negativas conocidas para controlar el desempeño del ensayo.

Cada Laboratorio debe diseñar su propio sistema de Control de Calidad Interno y establecer las medidas correctivas si se superan los límites de tolerancia aceptables.

Aglutinación Directa (2) Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg ± ++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++

Teórico (quimioluminiscencia) Neg (<5) Neg (<5) Neg (<5) Neg (<5) Neg (<5) Neg (<5) Neg (<5) Neg (<5) 15 25 50 125 250 300 500 1000 1500 2000 4000 8500 17000 170000 1.7x106 3.4x106

(1) Las cruces indican intensidad del color desarrollado, considerando el máximo como ++++.

(2) Las cruces indican intensidad de aglutinación observada, considerando el máximo como ++++.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMENTO Para concentraciones elevadas de hCG, la intensidad del color desarrollado no es directamente proporcional a la concentración hormonal.

b- Sensibilidad: La sensibilidad es de aproximadamente 25 mUI/ml. c- Especificidad: No se han observa do reacciones cruzadas con otras hormonas, tales como FSH, TSH y d- Reproducibilidad: Tratándose de una determinación visual cualitativa, la reproducibilidad solamente puede evaluarse por comparación de observaciones efectuadas por un mismo operario y entre distintos operarios. No se observaron diferencias de criterio en ninguno de ambos casos, tanto al observar resultados dentro de una misma corrida como entre diferentes corridas.

NOTA Si tras lo 5 minutos de incubación se desarrollara un tenue color celeste, cuya intensidad fuera menor a la del Control Positivo, esto podría deberse a: - Lavado defectuoso.

- Baja concentración de hCG en la muestra - Presencia de sustancias interferentes Se sugiere repetir el ensayo y, si el resultado se repite habiendo presunción de embarazo, repita la determinación sobre una nueva muestra obtenida tras 72 horas.

SUSTANCIAS DE REFERENCIA En la calibración del método se ha empleado el 2do Estándar Internacional IRP WHO 75/537

PRESENTACION Código 380048: 48 determinaciones EVALUACION DE DESEMPEÑO a- Comparación con otros métodos: En el desarrollo del producto se efectuaron comparaciones de muestras contra métodos comerciales aprobados por ANMAT y tomados como referencia: un método colorimétrico importado de igual fundamento técnico y un método instrumental por ión selectivo. Los resultados se muestran seguidamente y en los Graficos 1 y 2.

Figura 1

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AVANCE Tabla I Casos

11- Lunenfeld B, Olchovsky D, Tadir Y, Glezerman M. Treatment of male infertility with human gonadotrophins: selection of cases, management and results. Andrologia. 1979 Sep-oct;11(5):331-6.

12- Kamischke A and Nieschlag E. Analysis of medical treatment of male infertility Human Reproduction Vol 14, (Suppl. 1), pp. 1-23, 1999 13- Lee-Huang S, Huang PL, Sun Y, Huang PL, Kung HF, Blithe DL, Chen HC (March 1999). “Lysozyme and RNases as anti-HIV components in beta-core preparations of human chorionic gonadotropin”. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (6): 2678–81.

14- Simeons ATW. The action of chorionic gonadotropin in the obese. Lancet II:1954: 946-947 15- Rivlin RS.. Therapy of obesity with hormones. N Engl J Med. 1975 Jan 2;292(1):26-9 16- Birmingham CL. et al.. Human chorionic gonadotropin is of no value in the management of obesity. Can Med Assoc J. 1983 May 15;128(10):1156-7 17- Young RL et al. Chorionic gonadotropin in weight control. A double blind crossover study. JAMA 1976 Nov 29;236(22):2495-7 18- van Breda E, Keizer HA, Kuipers H, Wolffenbuttel BH (April 2003). “Androgenic anabolic steroid use and severe hypothalamic-pituitary dysfunction: a case study”. Int J Sports Med 24 (3): 195–6. doi:10.1055/s-2003-39089. PMID

Concentración hCG

Mujeres no embarazadas

<5.0 mUI/ml

Mujeres embarazadas (después último período menstrual) 3 semanas 4 semanas 5 semanas 6 semanas 7-8 semanas 9-12 semanas 13-16 semanas 17-24 semanas 25-40 semanas Mujeres postmenopáusicas

5-50 mUI/ml 5-426 mUI/ml 18-7340 mIU/ml 1080- 56500 mUI/ml 7650-229000 mIU/ml 25700-288000 mUI/ml 13300-254000 mUI/ml 4060-165400 mUI/ml 3640-117000 mUI/ml <9.5 mUI/ml

BIBLIOGRAFIA 1- Birken S.. Chemistry of human choriogonadotropin. Ann Endocrinol (Paris). 1984;45(4-5):297-305 2- Birken S. et al.. Isolation and amino acid sequence of COOH-terminal fragments from the beta subunit of human choriogonadotropin. J Biol Chem. 1977 Aug 10;252(15):5386-92 3- Zondek B. Sulman F. The mechanism of action and metabolism of gonadotrophic hormones in the organism. Vit Horm 1945 3:297-336 4- Bigbee W, Herberman RB. Tumor markers and immunodiagnosis. In: Kufe DW, Pollock RE, Weichselbaum RR, Bast RC, Gansler TS, Holland JF, Frei E III, eds. Cancer Medicine. 6th ed. Hamilton, Ontario: BC Decker; 2003: 209-220.

5- Takamitsu Fujimaki, Kazuhiko Mishima, Akio Asai, Ken Tabuchi, Miyuki Kobayashi, Ichiro Suzuki and Takaaki Kirino.

Levels of β-human Chorionic Gonadotropin in Cerebrospinal Fluid of Patients with Malignant Germ Cell Tumor Can Be Used to Detect Early Recurrence and Monitor the Response to Treatment . Jpn. J. Clin. Oncol. (2000) 30 (7): 291-294.

6- Hesham Al-Inany, Mohamed A. Aboulghar, Ragaa T. Mansour and Michelle Proctor. Recombinant versus urinary gonadotrophins for triggering ovulation in assisted conception Hum. Reprod. (August 2005) 20 (8): 2061-2073.

7- Grimmett JB, Perkins NR. Human chorionic gonadotropin (hCG): the effect of dose on ovulation and pregnancy rate. N Z Vet J. 2001 Jun;49(3):88-93.

8- Ibarra Chavarria V, Mota Gonzalez M, Carballar Lopez G, Espinosa de los Monteros A, S Karchmer. 1993. “Inducción de ovulación con gonadotropinas menopáusicas humanas en disfunción hipotálamo-hipofisiaria”. Ginecología Y Obstetricia De México. 61: 195-200.

9- Cole LA.. Immunoassay of human chorionic gonadotropin. Its free subunit and metabolites. Clin Chem. 1997 Dec;43(12):2233-43 10- CORNELIA P. CHANNING and OM P. BAHL. Role of Carbohydrate Residues of Human Chorionic Gonadotropin in Stimulation of Progesterone Secretion by Cultures of Monkey Granulosa Cells Biology of Reproduction June 1, 1978 vol. 18 no. 5 707-711 6

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