AVANCE
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Publicación de contenido científico editada por GT Laboratorio S.R.L. Necochea 3274 Rosario
CREATININA U.V. Liquid One Step
Método Enzimático U.V. para determinar creatinina en suero, plasma y orina.
GT Lab ha introducido un método enzimático U.V. para la determinación de creatinina en fluidos biológicos que, no emplea ácido pícrico en su composición. Desde los trabajos de Jaffé hace más de 130 años (1), el uso del ácido pícrico para la determinación de creatinina en líquidos biológicos ha sido ampliamente usado. Jaffé había encontrado que la creatinina reaccionaba en medio fuertemente alcalino con ácido pícrico originando un compuesto (complejo de Janovski) de color rojo, cuya concentración es directamente proporcional a la concentración de creatinina en la muestra. Este hallazgo permitió el desarrollo de un amplio abanico de determinaciones basadas en la formación de este complejo y su medición espectrofotométrica. No obstante, no pocos son sus inconvenientes, tanto desde el punto de vista de su especificidad como de cuestiones prácticas. En efecto, existen muchas sustancias, además de la creatinina, que reaccionan con el ácido pícrico en las condiciones de reacción habituales, las que se denominan “sustancias Jaffé positivas”. Entre ellas podemos mencionar al ácido ascórbico, glucosa, piruvato, acetona, proteínas, ácido acetoacético, ácido úrico y antibióticos cefalosporinas. Para evitar la interferencia de las proteínas se empleó inicialmente la desproteinización de las muestras, lo cual resultaba engorroso y no impedía la interferencia de otras sustancias Jaffé positivas no precipitables. Se buscó superar estos inconvenientes estudiando la diferente velocidad de reacción entre la creatinina y las otras sustancias Jaffé positivas. Así, se desarrollaron diferentes variantes de métodos cinéticos con relativo éxito, ya que aun en estas condiciones las interferencias suelen ser importantes. Pero en cualquiera de las variantes en que se intentó superar el problema de la inespecificidad intrínseca de la reacción de Jaffé, persistían los problemas prácticos, principalmente el uso de un reactivo fuertemente alcalino y corrosivo y la presencia del mismo ácido pícrico con su alto poder de tinción sobre los elementos del laboratorio incluida la vestimenta del operador. Estas limitaciones se hicieron aun más importante con el advenimiento del uso de sistemas automatizados, a los que el laboratorista se resiste a deteriorar con el uso de un reactivo tan agresivo. Consecuentemente, la búsqueda de una alternativa enzimática que superara estos cuestionamientos a los antiguos métodos químicos y que fuera compatible con el uso de analizadores automáticos se hizo una necesidad. Creatinina UV Liquid One Step
AVANCE INTRODUCCIÓN
PRINCIPIO
La creatinina es generada por el metabolismo a partir de la creatina, en un mecanismo fundamental de provisión de energía muscular. Aproximadamente el 2% de la creatina corporal es convertido en creatinina cada día, la que es excretada en la orina. La creatinina ha sido tomada como un indicador muy confiable de la función renal. Cuando el riñón tiene algún tipo de compromiso, el nivel sérico de creatinina aumenta, advirtiendo sobre un mal funcionamiento incluso antes de que el paciente reporte síntomas. Esto lleva a la conveniencia de dosar creatinina en sangre y en orina dentro de la rutina del laboratorio. Los valores normales de creatinina son aproximadamente 0.51.2 mg/dl. Individuos jóvenes o de edad media musculosos pueden tener valores mayores, mientras los ancianos tienden a tener valores menores. Por su lado, en la infancia la creatininemia puede oscilar alrededor de 0.2 mg/dl, dependiendo del desazrrollo muscular. Pacientes con un solo riñón suelen tener normalmente niveles de 1.8-1.9 mg/dl. Niveles de 2.0 mg/dl en bebés y de 10.0 mg/dl en adultos pueden indicar necesidad de diálisis. (3) Ciertas drogas pueden provocar valores anormalmente altos de creatinina, por lo que conviene consultar los trabajos de D. Young (2), entre otros. Los niveles de creatinina también aumentan después de ciertas ingestas, como carnes asadas. Hay una gran variedad de patologías que producen hipercreatininemia: anemia hemolítica autoinmune, leucemias, infarto de miocardio, glomerulonefritis aguda posestreptocócica, pielonefritis, falla renal, embolismo, trombosis, amiloidosis, endocarditis bacteriana, hipertrofia prostática, diferentes carcinomas, diabetes, pre-eclampsia, falla hepática, leptospirosis, etc, Disminuciones de creatininemia se observan en anorexia nerviosa, eclampsia, hipertiroidismo y cirrosis. Por su parte, la excreción de creatinina en orina es constante durante el día y proporcional a la masa muscular, produciéndose aumentos fisiológicos tras ingestión de alimentos que aumentan su nivel sérico. Las patologías que aumentan la creatininuria son acromegalia, gigantismo, hipotiroidismo, infección e hipertensión renovascular. Disminución de creatininuria puede observarse en una amplia variedad de patologías, como dermatomiosis activa, enfermedades renales (antes del nivel final de fallo renal), demencia tipo Alzhemier, esclerosis amiotrófica, anemia, hipertiroidismo, leucemia, distrofia muscular, parálisis, preeclampsia, distrofia muscular progresiva y malnutrición. La concentración sérica de creatinina y la depuración (clearance) de creatinina endógena (D.C.E.) son índices aceptados de la velocidad de filtración glomerular y son usados en el laboratorio clínico para evaluar la función renal.
La determinación de creatinina por el método enzimático ultravioleta se basa en la siguiente reacción: CDI Creatinina + H2O ---------> N-metilhidantoína + NH3 GlDH NH3 + 2-oxoglutarato + NADH ---------> glutamato + NAD+ La creatinina es hidrolizada por la Creatinin Deiminasa (CDI), con producción de N-metihidantoína y amoníaco. Este, a su vez, reacciona con el 2-oxoglutarato del medio por acción de la glutamato dehidrogenasa (GlDH) con consumo de NADH, produciendo NAD y glutamato. La disminución de lectura a 340 nm mide el descenso de concentración del NADH en el medio, siendo éste directamente proporcional a la concentración de creatinina en la muestra. (4)
REACTIVOS PROVISTOS R1: solución lista para usar. R2: solución lista para usar. Enzima 1: reactivo en polvo para disolver en el frasco de R1. Enzima 2: reactivo en polvo para disolver en el frasco de R2. Estándar: solución lista para usar. COMPOSICIÓN FINAL DE LOS COMPONENTES EN EL MEDIO GIDH……… 900 U/l CDI………… 1500 U/l NADH…0.24 mmol/l
Tris……… 50 mmol/l, pH = 8.2 2-oxoglutarato de sodio.4.8 mmol/l Cloruro de magnesio… 3.0 mmol/l
CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD DE LOS REACTIVOS DE TRABAJO Conservación: Refrigerador (2-8º C). Proteger de la luz. Estabilidad: 1 mes.
MUESTRA Suero o plasma heparinizado o con EDTA: Debe separarse dentro de los 30 minutos de extraída la muestra. Orina: puede trabajarse con orina de 2 ó de 24 horas. Debe recogerse en recipiente limpio y mantenerse en refrigerador. Use el sobrenadante límpido. Diluya 1:50 con agua deionizada libre de amonio, antes de ensayar. Condiciones de conservación de las muestras Refrigerador (2-8ºC): estable 24 horas. Congelador (-20ºC): estable 3 meses. Sustancias interferentes No se han detectado interferencias por componentes usuales de los líquidos biológicos objeto de ensayo. Se recomienda la lectura del trabajo de D.S. Young mencionado en BIBLIOGRAFIA.
PROCEDIMIENTO 2
Creatinina UV Liquid One Step
AVANCE Condiciones de reacción: Espectrofotómetro a 340 nm (Hg 334 ó 366 nm) Temperatura: 30-37ºC PREVIAMENTE, ATEMPERE EL REACTIVO DE TRABAJO. En dos tubos marcados E (estándar) y D (desconocido) agregue: E
D
R1 de Traba jo
300µl
300µl
Estándar
50µl
------
Muestra
50µl -----Mezcle. Incube exactamente 5 minutos a 30° ó a 37°C y obtenga las lecturas finales E2 y D2 en espectrofotómetro a 340nm.
CÁLCULOS Creatinina sérica (plasmática) D1 – D2 ------- x 2,0 = mg/dl creatinina E1 – E2 Creatinina urinaria Muestra de 24 horas: D1 – D2 2,0 50 ------- x ---- x ---- x diuresis (ml) = g creatinina/24 h E1 – E2 1000 100 D1 – D2 ------- x diuresis (l) = g creatinina/24 h E1 – E2 Muestra de 2 horas: D1 – D2 2,0 50 ------- x ---- x ---- x volumen (ml) x 12 = g creatinina/24 h E1 – E2 1000 100 D1 – D2 ------- x volumen (l) x 12 = g creatinina/24 h E1 – E2 Depuración de creatinina endógena g creatinina en orina/24 h DCE = ------------------------------- x 69,4 = ml/min mg creatinina en suero/dl Para obtener los datos de concentración en unidades µmol/l, multiplique el dato expresado en mg/dl por 88.5.
EVALUACIÓN DE DESEMPEÑO DEL MÉTODO a- Comparación con otros métodos: En el desarrollo del producto se efectuaron comparaciones de muestras contra reactivos comerciales aprobados por ANMAT, tomados como referencia. Los resultados se muestran en la TABLA I, expresados en mg/dl de creatinina. Estos datos están representados en los GRAFICOS 1 a 3.
En base a los datos de dicha tabla se obtuvieron las siguientes ecuaciones de regresión: Contra GT Lab Jaffé Cinético: Ecuación de regresión: y= 0,6759 x + 0,1682 Coeficiente de correlación: 0,9863 Contra método Jaffé cinético comercial origen nacional: Ecuación de regresión: y= 0,6521 x + 0,2459 Coeficiente de correlación: 0,9842 Contra método enzimático UV comercial origen europeo: Ecuación de regresión: y= 1,0209 x - 0,0254 Coeficiente de correlación: 0,9982 b- Sensibilidad: La sensibilidad en espectrofotómetro a 340 nm, leyendo en cubetas de caras paralelas con un paso de luz de 1 cm, es aproximadamente 0,02 mg/dl. c- Especificidad: Los métodos químicos habitualmente usados, basados en la reacción de Jaffé con picrato alcalino, dan reacción con otras sustancias Jaffé positivas además de la creatinina. El método enzimático está libre de tal interferencia. En este método, el amoníaco endógeno es eliminado en la primer incubación, con lo que el método resulta específico para creatinina. d- Linealidad: La reacción cumple con la ley de Lambert & Beer entre 0 y 10 mg/dl (900 µmol/l). e- Recuperación: La recuperación obtenida por agregado de cantidades conocidas de creatinina a muestras biológicas estuvo entre el 99,0 y el 103,1%, dentro del rango establecido en d-. f- Reproducibilidad: Se procesaron pooles de muestras de personas caucásicas, adultas, sin antecedentes de patologías que no fueran las asociadas con valores anormales de creatinina. Las muestras se conservaron congeladas a -20ºC durante todo el tiempo entre ensayos. Los resultados para los estudios intra e interensayo se muestran en la TABLA II y en la TABLA III. g- Inexactitud e Imprecisión: El tratamiento estadístico de la inexactitud e imprecisión están desarrollados más arriba en “Comparación con otros métodos” y en “Reproducibilidad”. Resultados incorrectos pueden obtenerse si no se respetan estrictamente las indicaciones dadas en el Manual de Instrucciones sobre Procedimientos de Uso, Calidad de la Muestra, uso de anticoagulante, etc.
SUSTANCIAS DE REFERENCIA Y /O PATRONES EMPLEADOS El Estádar empleado tiene trazabilidad al Standard Reference Material #909b (National Institute of Standards and Technology, EEUU): suero humano liofilizado.
3 Creatinina UV Liquid One Step
AVANCE CONTROL DE CALIDAD
VALORES DE REFERENCIA
Se recomienda procesar juntamente con las muestras, sueros control normal y anormal para controlar el desempeño del ensayo. Se aconseja el uso de Qualiset Sueros Control Nivel 1 y 2 GT Lab (Códigos 602105 y 602205) Cada Laboratorio debe diseñar su propio sistema de Control de Calidad Interno y establecer las medidas correctivas si se superan los límites de tolerancia aceptables.
Suero o plasma: 0.5-1.2 mg/dl Orina: 0.8-2.0 g/24 hs D.C.E.: 80-140 ml/min en adultos hasta 60 años Cada laboratorio debe determinar su propio rango de acuerdo a la población involucrada.
USO EN AUTOMATIZACIÓN La TABLA IV indica los parámetros a usar en la aplicación de la técnica a instrumentos automatizados. Están disponibles adaptaciones para diferentes auto analizadores. Solicítelos a infoprofesional@gtlab.com.ar.
TABLA I
comparación con métodos como referencia (resultados expresados en mg/dl)
Muestra N°
Creatinina Jaffe cinético GT Lab
Método UV Enzimático GT Lab En ensayo
Método Jaffe Cinético Comercial Origen Nacional
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
0,618 0,539 1,975 0,097 0,984 1,758 1,188 1,634 1,088 0,271 1,396 0,805 0,457 0,520 1,376 1,676 1,548 0,945 1,856 1,518 0,238
0,414 0,331 1,384 0,098 0,742 1,272 0,780 1,078 0,669 0,198 1,014 0,511 0,341 0,444 0,901 1,226 1,011 0,638 1,129 1,188 0,183
0,612 0,544 2,074 0,099 1,014 1,846 1,236 1,601 1,153 0,287 1,368 0,789 0,475 0,536 1,417 1,676 1,579 0,992 1,949 1,579 0,233
4 Creatinina UV Liquid One Step
Método Enzimático UV Comercial Origen Europeo 0,418 0,315 1,357 0,095 0,734 1,247 0,741 1,089 0,682 0,192 0,974 0,490 0,345 0,457 0,928 1,164 1,042 0,606 1,107 1,129 0,176
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TABLA II
Reproducibilidad intra ensayo Estándar =0,106
Muestra 1
Muestra 2
Muestra 3
Muestra
Lectura
mg/dl
Lectura
mg/dl
Lectura
mg/dl
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0,0653 0,0657 0,0682 0,0711 0,0673 0,0717 0,0681 0,0714 0,0666 0,0668
1,23 1,24 1,29 1,34 1,27 1,35 1,28 1,35 1,26 1,26
0,2295 0,2369 0,2323 0,2405 0,2301 0,2224 0,2308 0,2379 0,2411 0,2401
4,33 4,47 4,38 4,54 4,34 4,20 4,35 4,49 4,55 4,53
0,5292 0,5272 0,5217 0,5252 0,5069 0,5037 0,5058 0,5133 0,5371 0,5190
0,5292 0,5272 0,5217 0,5252 0,5069 0,5037 0,5058 0,5133 0,5371 0,5190
Promedio
1,29
4,42
9,79
SD mg/dl C.V. %+
0,045 3,5
0,115 2,6
0,212 2,2
+
TABLA III
Reproducibilidad inter ensayo Muestra 1
Muestra 2
Muestra 3
Día
Estandar
Lectura
mg/dl
Lectura
mg/dl
Lectura
mg/dl
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0,0980 0,1044 0,1067 0,0981 0,1017 0,1047 0,1043 0,1037 0,0973 0,1061
0,0666 0,0664 0,0682 0,0703 0,0653 0,0704 0,0684 0,0657 0,0688 0,0658
1,36 1,27 1,28 1,43 1,28 1,34 1,31 1,27 1,41 1,24
0,2456 0,2298 0,2471 0,2347 0,2382 0,2275 0,2387 0,2468 0,2355 0,2362
5,01 4,40 4,63 4,78 4,68 4,35 4,58 4,76 4,84 4,45
0,5013 0,4970 0,5008 0,5024 0,5014 0,5013 0,4965 0,4958 0,4913 0,4949
10,23 9,52 9,39 10,24 9,86 9,58 9,52 9,56 10,10 9,33
Promedio
1,32
4,65
9,73
SD mg/dl C.V. %+
0,065 4,9
0,210 4,5
0,347 3,6
+
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TABLA IV
Par谩metros para automatizaci贸n
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GRﾃ：ICO I
GRﾃ：ICO II
GRﾃ：ICO III
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Referencias Biográficas 1- Jaffe M: Über den Niederschlag welchen Pikrinesäure in normalen Harn Erzeugt und über eine neue Reaktion des Kreatinins. Z.Physiol.Chem. 10:391-400;1880 2- Young DS: Effects of disease on Clinical Lab. Tests. 4th Ed. AACC Press, 2001 3- Perrone RD, Madias NE, Levey AS: Serum creatinine as an index of renal function; new insights into old concepts. Clin Chem 38:1933-53; 1992. 4- Sontagg O, Büttner J: Evaluation of an UV method for the determination of creatinine compared with Ektachem 700 and Fuller’s earth method. Clin.Chem. 36/6:1179;1990.
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