N° 13 Junio 2014
AVANCE Publicación de contenido científico editada por GT Laboratorio S.R.L.
TP Liquid Plus
Determinación de Tiempo de Protrombina (tiempo de Quick)
GT Lab ha desarrollado un nuevo reactivo para la determinación del Tiempo de Protrombina (tiempo de Quick) empleando una tromboplastina de alta sensibilidad (ISI cercano a 1). El reactivo se provee en forma líquida, listo para usar y con larga vida útil. La técnica es simple y adaptable tanto al uso manual como a coagulómetros con detección mecánica u óptica del punto final.
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INTRODUCCIÓN (controles preoperatorios, etc.) es totalmente válida la recomendación de la OMS. Dentro de las recomendaciones para llevar a cabo este método está utilizar patrones de referencia que posean una constante internacional de calibración (CIC), la cual proviene de preparaciones internacionales o una tromboplastina que la posea y haya sido determinada de manera estadística adecuada (12); además que se lleve a cabo con tromboplastinas que provengan de la misma especie, o sea, una tromboplastina combinada de origen humano deberá calibrarse con respecto a una preparación internacional de referencia de origen humano, (NIBSC 67/40).
El tiempo de protrombina (TP) es la principal determinación utilizada en el control del tratamiento anticoagulante oral. La prolongación del TP depende de reducciones en tres de los factores de la coagulación dependientes de la vitamina K (II, VII y IX). Los cambios observados en el TP durante los primeros días del tratamiento con warfarina/acenocumarol se deben principalmente a reducciones en los factores VII y IX, que son los que tienen una semivida más corta (6 y 24 horas, respectivamente). La anticoagulación oral tiene como objetivo principal prevenir los problemas trombóticos con el mínimo riesgo de sangrado (1); esta terapia ha demostrado ser efectiva en la profilaxis, en el tratamiento del tromboembolismo venoso y en la prevención del embolismo generalizado de origen cardíaco (3), aunque su papel en el infarto agudo del miocardio es todavía controversial (3, 4, 16, 17). La terapia de anticoagulación oral es controlada en la mayoría de los casos a través de la medición del tiempo de protombina (TP); sin embargo los niveles terapéuticos óptimos han sido objeto de importantes debates a través de más de 45 años (1,3). Quick, describió el método hace 55 años y recomendó mantener el TP del paciente con anticoagulación oral entre 1,5 y 2,5 veces el valor normal; este concepto fue cuestionado y se abandonó desde 1985 (1,3). El hecho de que se utilicen diferentes tejidos y de diferentes especies como fuente de tromboplastina para la prueba del TP, los cuales difieren en su grado de sensibilidad al defecto hemostático inducido por los anticoagulantes orales, ha sido la principal controversia que han planteado los expertos sobre la utilidad de esta prueba en la terapéutica de la anticoagulación. En los últimos años, se han realizado modificaciones importantes tanto en la técnica como en la interpretación, referidas al problema de la sensibilidad de la tromboplastinas (3,5,11). Los valores Quick medidos con distintas tromboplastinas no se pueden comparar directamente unos con otros ya que, por ejemplo, puede que difiera la sensibilidad a los factores de la coagulación. Para hacer que los tiempos de coagulación fueran lo más comparables posible, la OMS aprobó en 1983 una tromboplastina estándar de referencia. Todos los fabricantes de tromboplastina deben calibrar su reactivo frente al estándar de la OMS. El valor obtenido se conoce como “índice de sensibilidad internacional” (ISI). Esto permite conocer las distintas sensibilidades de las tromboplastinas y se utiliza para calcular el RIN. La Organización Mundial de la Salud (OMS) recomienda que el ISI sea inferior a 1.7. En muchos países, se prefiere un ISI tan próximo a 1,0 como sea posible (5, 6, 13). Tal como veremos más adelante, las preparaciones con ISI bajo (cercanos a 1.0) son las adecuadas para el seguimiento de las terapias con anticoagulantes, mientras que para otros usos diagnósticos
FORMAS DE EXPRESION DE RESULTADOS Tiempo de Protrombina: Se expresa en segundos, como el promedio de los tiempos registrados en la determinación del TP. Porcentaje de Actividad Protrombínica: Se expresa como porcentaje, con relación a una Curva de Calibración obtenida procesando diluciones de un pool de plasmas normales, a los que se asigna un valor de 100% de actividad. El Porcentaje de Actividad del paciente se obtiene por interpolación de su TP en dicha curva. Cociente Calibrado Internacional (CCI): Su uso fue recomendado por la Organización Mundial de la Salud (OMS) en 1977 para la estandardización del control de la terapia con anticoagulantes orales, independizando los resultados obtenidos de la tromboplastina empleada, seria limitación de las expresiones anteriores. A partir del Patrón Primario (Preparación Internacional de Referencia 67/40), se obtuvieron Patrones Secundarios con los que se pudieron valorar las tromboplastinas usadas y se llegó a la siguiente fórmula: (r-1) CCI = 1 + ----------CIC Donde: CCI = Cociente Calibrado Internacional del plasma ensayado CIC = Constante Internacional de Calibración de la tromboplastina usada r = cociente entre los TP del plasma del paciente y del pool de plasmas normales, medidos en segundos. Razón Internacional Normalizada (RIN): Su uso fue recomendado por la OMS para el control del tratamiento con anticoagulantes basados en cumarina con posterioridad al referido CCI, hoy en desuso, a los efectos de que los resultados informados por distintos laboratorios que usaran diferentes tromboplastinas resultaran comparables. Su cálculo se hace aplicando la siguiente formula: 2
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RIN = RISI Donde: R = cociente entre los Tiempos de Protrombina determinados para el plasma cumarinizado y para los plasmas normales. ISI = Indice de Sensibilidad Internacional del lote de reactivo usado, determinado con relación a la Preparación Internacional de Referencia 67/40. (14) Una vez determinados el tiempo de protrombina del paciente y conociendo el correspondiente a un pool de plasmas normales, determinado previamente, se busca en una tabla el tiempo correspondiente al pool en el encabezamiento de las columnas y el del paciente en los valores de dicha columna. Para dicho valor, la tabla indicará el Porcentaje de Actividad Protrombínica, el R y el RIN del paciente. La referida tabla debe ser suministrada por el fabricante del reactivo; los valores varían con cada lote según su ISI. (7, 12, 13) Cuanto más prolongado es el tiempo de coagulación del paciente, más elevado es el RIN. A pesar de la introducción del RIN, en muchos casos los resultados del TP no son homogéneos. Esto no sólo es debido a variaciones en la sensibilidad del reactivo, sino también a la relación que existe entre el método de detección del punto final de la determinación (manual o automatizada). (11)
bral, profilaxis en la enfermedad valvular cardíaca, prevención de los episodios embólicos en la fibrilación auricular con o sin valvulopatía reumática, tratamiento de la enfermedad arterial periférica y profilaxis en los reemplazamientos valvulares totales. Se han descripto valores máximos de CCI recomendados ante diferentes procedimientos diagnósticos. Los mismos se describen en la Tabla I (1). A mediados de los años 80, distintas sociedades científicas y grupos de consenso postularon diversos rangos de anticoagulación, que se podrían resumir en (Tabla II). ESTABILIDAD DE LAS PREPARACIONES DE TROMBOPLASTINA
Tradicionalmente, uno de los problemas enfrentados por la estadarización de la determinación del TP ha sido la limitada estabilidad de las preparaciones de tromboplastina. Diferentes preparaciones han sido empleadas: de cerebro humano, de cerebro de mono, de pulmón o plancenta humanos, etc. Todas estas preparaciones probaron tener una estabilidad limitada, recurriéndose a la liofilización para lograr una preparación más estandarizada y estable. Aun así, la forma de reconstitución de los liofilizados introduce variables que afectan a los resultados, tales como la calidad del agua a emplear en la reconstitución y eventuales errores en la medición del reconstituyente. De todas maneras, las tromboplastinas así reconstituidas tienen una estabilidad muy limitada que, en el mejor de los casos llega a la semana. El recurso de congelar las preparaciones deja, a su vez, a las mismas sujetas a los efectos de la velocidad de congelamiento y descongelamiento, eventuales cortes de energía que descongelan el reactivo, etc. Por otra parte, tanto las preparaciones liofilizadas como las congeladas tienen el inconveniente de que se desperdician porciones no usadas dentro del corto período de validez establecido.
CALCULO DEL ISI La calibración de una tromboplastina debe ser hecha contra una preparación de referencia de la misma especie. Se determinan los TP por duplicado para cada una de las preparaciones y se calculan los promedios de cada par. Tradicionalmente, esto se efectúa sobre 20 plasmas normales y 60 muestras provenientes de pacientes que hayan estado bajo tratamiento con anticoagulantes por, al menos, 6 semanas. Las determinaciones deben repetirse cuando haya diferencias de más del 10% entre duplicados. Los promedios representados en un gráfico log-log colocando los datos del reactivo de referencia en el eje Y y los del reactivo en estudio sobre el eje X. El uso de gráficos log-log evita tener que calcular los logaritmos de los promedios obtenidos. La pendiente de la recta resultante es el valor del ISI del reactivo en ensayo. (Gráfico 1). Una forma simple de calcular tal pendiente es con la fórmula:
IMPORTANCIA DEL VALOR DEL ISI Tal como se ha indicado más arriba, la sensibilidad de las preparaciones de tromboplastina es fundamental para un diagnóstico y adecuado seguimiento de la terapéutica. Dicha sensibilidad es tanto mayor cuanto menor es el valor del ISI, prefiriéndose por lo tanto preparaciones con un ISI cercano a 1 para pacientes bajo terapia anticoagulante. El efecto del valor del ISI en la sensibilidad de una preparación se ve aún cuando los valores de dicho parámetro no sean tan diferentes. Así, en la Tabla II se comparan los datos de una preparación con ISI = 1.07 con los obtenidos con las mismas muestras para otra preparación con un ISI = 1.38, generalmente aceptado como bueno para los conceptos de la OMS, que recomienda trabajar con ISI inferiores a 1.7. (13) Se nota rápidamente que para variaciones de TP de un segundo, el RIN calculado para la preparación de ISI = 1.38 varía mucho más que cuando se emplea la preparación de
A-C ISI = pendiente = -----B-C Donde A, B y C son los valores tomados del Gráfico 1. INDICACIONES Y RANGOS DE ANTICOAGULACIÓN Las principales indicaciones para el uso de los anticoagulantes orales son: profilaxis y tratamiento de la trombosis venosa profunda y del embolismo pulmonar, prevención y tratamiento del infarto de miocardio, prevención del embolismo cere3
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ISI = 1.07. Esto redunda en que un ligero error en la determinación del TP introduce una indicación de anticoagulación mucho más diferente cuanto mayor es el ISI del reactivo. Evidentemente, ésto trae como consecuencia que el uso de preparaciones de menor ISI otorguen una seguridad muy superior, particularmente cuando los valores de TP son más elevados, es decir, en el caso de terapias anticoagulantes. La importancia del uso de preparaciones de tromboplastina de bajo ISI queda aun más clara cuando los datos de la Tabla II se grafican (Gráfico 1). El empleo de tromboplastinas de alta sensibilidad (ISI cercanos a 1) solamente era posible mediante el uso de cerebro humano como fuente de la preparación, de disponibilidad muy limitada. La obtención del factor tisular necesario para la preparación de reactivos a partir de la recombinación genética ha permitido la obtención de la parte proteica expresada en Escherichia coli. Una vez obtenido el factor tisular, éste debe ser relipidado en forma adecuada a los efectos de obtener el reactivo. La preparación resultante posee un ISI bajo y, además, una gran estabilidad, permitiendo disponer de un reactivo líquido listo para usar, estable y, por lo tanto, superando las limitaciones descriptas más arriba en cuanto a reproducibilidad de la preparación, errores de reconstitución y desperdicio de reactivo por vencimiento del reconstituido.
descarte ya que NO POSEE materiales potencialmente infectivos. El producto es exclusivamente para uso “in vitro”. La caja y los envases contenidos en este producto no deben ser reusados, debiendo descartarse como residuos peligrosos una vez empleados, de acuerdo a la legislación vigente. El personal que manipula los mismos debe ser debidamente capacitado para su manejo y descarte por la institución o laboratorio que lo emplea.
MATERIALES NECESARIOS PERO NO PROVISTOS - Material volumétrico para medir los volúmenes indicados en ENSAYO. - Baño termostatizado a 37ºC. - Cronómetro o reloj alarma. - Tubos de hemólisis. - Papel milimetrado: para la curva de calibración. - Lámpara - Coagulómetro (opcional)
REACTIVOS NECESARIOS PERO NO PROVISTOS Solución fisiológica (cloruro de sodio 8.5 %) para la curva de calibración.
PRINCIPIO DE ENSAYO MUESTRA Plasma citratado: Se recomienda el uso de Anticoagulante para Coagulación y Eritrosedimentación GT Lab (cat. 48120), el que deberá usarse en proporción 0.1 ml de anticoagulante para 0,9 ml de sangre. La muestra de sangre debe extraerse evitando estasis y trauma. El plasma debe separarse dentro de los 30 minutos de extraída la sangre. Condiciones de conservación de las Muestras El plasma puede conservarse refrigerado (2-8ºC) durante 4 horas o congelado a -20 ºC durante un mes. En caso de emplear plasma congelado, descongelar rápidamente en baño de 37ºC. Sustancias interferentes La hemólisis dificulta la medición. La heparina y el EDTA son causa de resultados inválidos. Siendo los mecanismos de coagulación un encadenamiento de reacciones enzimáticas, deben contemplarse los procedimientos usuales en enzimología, tales como lavado de material, conservación de la muestra, control de temperatura y tiempo de preincubación y de reacción. Manipulación y descarte Las muestras de pacientes deben manipularse considerándolas potencialmente infecciosas, al igual que el material descartable y los utilizados en el ensayo, que hayan estado en con-
La técnica se basa en determinar el tiempo de coagulación de una mezcla de plasma y un exceso de tromboplastina cálcica obtenida de la relipidación de un factor tisular humano recombinante obtenido de Escherichia coli, incubados a 37ºC. Composición de los Reactivos Provistos Factor tisular humano recombinante..........................9.5 mg/l Cloruro de calcio..................................................12.5 mmol/l Cloruro de sodio...................................................130 mmol/l Fosfolípidos activadores............................................143 mg/l El reactivo se provee listo para usar. Conservación y estabilidad Conserve refrigerado sin congelar (2-8ºC). La estabilidad alcanza la fecha de vencimiento indicada en la caja. Una vez abierto, el reactivo es estable un mes refrigerado (2-8ºC). El reactivo debe mantenerse refrigerado, retirándolo del refrigerador únicamente para su uso y restituyéndolo al mismo tan pronto como sea posible.
PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS SOBRE SU USO El producto no posee riesgos especiales de manipulación y 4
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tacto con las mismas, incluido el papel absorbente. El descarte debe hacerse de acuerdo a las buenas prácticas de laboratorio y a las regulaciones locales. Un procedimiento sugerido para descartarlos es el autoclavado a 121ºC durante una hora y el tratamiento de los líquidos residuales con hipoclorito de sodio durante una hora a una concentración final del 5%.
ENSAYO (Nota 1) Procedimiento de análisis: PREVIAMENTE, ATEMPERE LOS REACTIVOS. La muestra de plasma debe preincubarse a 37 ºC durante 2-3 minutos, pero no más de 10 minutos. Procese por duplicado. En un tubo de hemólisis agregue: Reactivo
200 µl
Incube 2-3 minutos a 37ºC (nunca más de 10 minutos) Plasma preincubado
100 µl
Mezcle y dispare simultáneamente el cronómetro. Cerca de los 10 segundos, mueva el tubo inclinándolo 1-2 veces por segundo, observándolo bajo la lámpara. Detenga el cronómetro cuando se observe la formación del coágulo y anote el tiempo observado ADAPTACIONES PARA AUTOMATIZACION El reactivo puede emplearse en coagulómetros, siguiendo las instrucciones del fabricante
EVALUACIÓN DE DESEMPEÑO DE TP Liquid Plus a- Comparación con otros métodos: Se aplicaron las pautas recomendadas por la American Association of Blood Banks (AABB). Technical Manual.8° Ed.1985. y la Organización Mundial de la Salud /Comité de Expertos en Normalización Biológica. Boletín Nº 33-1983. La siguiente es una comparación efectuada sobre muestras de plasmas congelados comparando el método en ensayo con un kit comercial debidamente aprobado por la Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología Médica (A.N.M.A.T.) (Innovin) con ISI semejante.
Plasma
Método referencia
GT Lab en ensayo
ISI
1.03
1.07
3648 478 2901 2720 4661 5488 4170 3969 4985 4450 8174 3827 711 4908 1757 9639 1737 2673 2503 6048 6162 2181 9950 751 8165
10,15 10,41 10,47 10,51 10,78 10,79 11,03 11,30 11,33 11,65 11,93 12,23 12,52 12,82 12,85 13,00 13,12 13,29 13,44 13,70 13,70 14,03 14,11 14,19 14,41
9,97 10,62 11,19 9,69 10,69 11,33 10,60 10,71 11,60 11,91 11,95 12,08 11,99 13,19 13,12 13,07 13,24 12,99 13,34 13,35 13,39 13,84 13,59 13,52 13,98
Plasma
Método referencia
GT Lab en ensayo
ISI
1.03
1.07
4242 4993 9187 541 6512 5064 418 963 8830 4788 5517 9466 1160 8170 2100 7531 3403 7304 5843 1109 4302 8387 6179 8805 7857
14,74 14,74 15,00 15,16 15,41 25,20 25,43 25,50 25,81 25,98 26,23 26,56 26,87 27,12 27,20 27,47 27,79 32,21 32,45 32,52 32,82 33,13 33,28 33,29 33,39
14,78 14,82 14,19 14,86 14,84 25,73 25,30 26,35 25,83 26,21 25,93 26,29 26,50 27,00 27,27 28,21 28,05 32,42 32,02 33,13 32,73 33,50 32,42 33,11 32,68
b- Sensibilidad: La sensibilidad del ensayo está dada por la agudeza visual del observador o por la sensibilidad del coagulómetro empleado, 5
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siendo generalmente 0,1 segundo. c- Especificidad: Pese a que el nombre Tiempo de Protrombina orientaba inicialmente a la evaluación de la actividad del Factor II, la determinación es también sensible a otros factores de coagulación tales como V, VII y X, por lo que el método es una evaluación global de los mecanismos de la vía extrínseca. d- Reproducibilidad: Resultados incorrectos pueden obtenerse si no se respetan estrictamente las indicaciones del Manual de Instrucciones sobre Procedimientos de Uso, Calidad de la Muestra, uso de anticoagulante, etc. Siendo los mecanismos de coagulación un encadenamiento de reacciones enzimáticas, deben contemplarse cuidados propios de la enzimología, (lavado de material, conservación de la muestra, control de temperatura y tiempo de preincubación y de reacción. La reproducibilidad inter ensayo, basada en el procesamiento de 5 muestras, es: Promedio D.S. C.V 11.5 seg. ± 0.4 3.5 % 31,0 seg. ± 0,7 2,3 %
TABLA 2 Indicaciones
British Society of Hematology
Leuven Consensus Group
Leiden Thrombosis Centre
Profilaxis perioperatoria
2,0-2,5
1,5-2,5
1,5-2,5
Tratamiento T.V.P. y E.P.
2,0-3,0
2,0-3,0
2,0-4,0
Prevención de embolismo arterial
3,0-4,5
2,0-4,0
3,0-4,5
Prótesis valvulares
3,0-4,5
3,0-4,5
3,5-5,0
GRÁFICO 1 Obtención de ISI de un reactivo
TABLA 1 Valores máximos de C.C.I. recomendados para realizar procedimientos selectivos Procedimientos diagnóstico
CCI
Aspirado de médula ósea, paracentésis doméstica,
2,5
angioplustía transluminal, angiografía femoral Angiografía carótidea, biopsia muscular, laparosco-
2,0
pía sin biopsia, endoscopía o broncospía, biopsia de hueso, toracocentesis diagnóstica, punción lumbar, mielografía, electromiografía Biopsia ciega de cualquir órgano parenquimatoso,
1,0
endoscopia con biopsia, colangiografía percutánea, colangiopancreatografía retrógrada, toracoscopía, toracocentesis terapeutica y artroscopía con biopsia Extracción dental
2,5
Implante de marcapasos
1,5
GRÁFICO 2 Comparacion reactivos de distinto ISI 9,0 8,0 7,0
Fuente: Aguilar et. al (1) RIN
6,0 5,0
ISI=1,07
4,0
ISI=1,38
3,0 2,0 1,0 0,0 0,01
0,02
0,03
0,04 TP (seg)
6
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0,05
0,06
0,0
TABLA 3 Plasma
MĂŠtodo referencia
GT Lab en ensayo
28,8
2,6
3,3
12,0
1,0
1,0
29,4
2,6
3,4
2,7
3,5
12,2
1,0
1,0
30,0
12,4
1,0
1,0
31,2
2,8
3,7
12,6
1,1
1,1
32,4
2,9
3,9
12,7
1,1
1,1
33,6
3,0
4,1
12,8
1,1
1,1
34,8
3,1
4,4
13,2
1,1
1,1
36,0
3,2
4,6
13,3
1,1
1,2
37,2
3,4
4,8
13,6
1,1
1,2
38,4
3,5
5,0
13,8
1,2
1,2
39,6
3,6
5,2
14,0
1,2
1,2
40,8
3,7
5,4
14,2
1,2
1,3
42,0
3,8
5,6
14,4
1,2
1,3
43,2
3,9
5,9
14,6
1,2
1,3
44,4
4,1
6,1
14,9
1,2
1,3
45,6
4,2
6,3
15,0
1,3
1,4
46,8
4,3
6,5
15,1
1,3
1,4
48,0
4,4
6,8
15,4
1,3
1,4
49,2
4,5
7,0
15,6
1,3
1,4
50,4
4,6
7,2
15,8
1,3
1,5
51,6
4,8
7,5
16,1
1,4
1,5
52,8
4,9
7,7
16,2
1,4
1,5
54,0
5,0
8,0
16,4
1,4
1,5
16,6
1,4
1,6
16,8
1,4
1,6
17,0
1,5
1,6
17,2
1,5
1,6
17,4
1,5
1,7
17,6
1,5
1,7
17,8
1,5
1,7
18,0
1,5
1,8
18,2
1,6
1,8
18,4
1,6
1,8
18,6
1,6
1,8
19,2
1,7
1,9
20,4
1,8
2,1
21,0
1,8
2,2
21,6
1,9
2,3
21,8
1,9
2,3
22,2
1,9
2,3
22,8
2,0
2,4
23,4
2,0
2,5
2,4
2,1
2,6
24,6
2,2
2,7
25,2
2,2
2,8
25,8
2,3
2,9
26,4
2,3
3,0
27,0
2,3
3,0
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28,2
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BIBLIOGRAFIA
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