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Impacto de las prácticas de acuicultura en los perfiles bacterianos intestinales del camarón patiblanco del Pacífico Litopenaeus vannamei

Teniendo en cuenta el papel crucial del microbioma intestinal en la salud y la nutrición de los animales, las soluciones a los desafíos de la acuicultura del camarón, como mejorar la resistencia a las enfermedades y optimizar el crecimiento con alimentos de menor costo, pueden residir en la manipulación de sus simbiontes microbianos. Sin embargo, lograr este objetivo requerirá una comprensión más profunda de las comunidades microbianas del camarón y cómo su composición se ve influenciada por la formulación de la dieta, las condiciones ambientales y los factores del huésped. En este contexto, el presente estudio investigó las comunidades bacterianas intestinales del camarón patiblanco del Pacífico (Litopenaeus vannamei), el camarón más cultivado en acuicultura en todo el mundo, criado en instalaciones acuícolas interiores y sistemas de estanques al aire libre. Si bien las muestras mostraron perfiles de comunidades bacterianas intestinales muy consistentes dentro de cada sistema de producción, se descubrieron diferencias importantes entre las dos prácticas. De hecho, las bacterias afiliadas a Rhodobacteraceae (Proteobacteria) y Actinobacteria fueron significativamente más abundantes en muestras de interior (84,4% frente a 5,1%; 3,0% frente a 0,06%, respectivamente), mientras que Vibrionaceae (Proteobacteria), Firmicutes, Fusobacteria y Cyanobacteria fueron predominantes en muestras de estanques (0,03% frente a 44,8%; 0,7% frente a 36,0%; 0,0% frente a 7,9%; 0,001% frente a 1,6%, respectivamente). En consecuencia, se encontró que la abundancia de 11 de las 12 Unidades Taxonómicas Operativas (OTU) más prominentes era estadísticamente diferente entre los dos entornos de producción. Palabras clave: acuicultura, microbioma intestinal, camarón patiblanco del Pacífico

Introducción

El camarón es uno de los productos del mar más importantes, comercializados en todo el mundo, con más de 3,4 millones de toneladas comercializadas cada año a un precio mayorista estimado que oscila entre $ 3800 y $ 8800 USD por tonelada [1]. A medida que la población humana mundial sigue creciendo, la oferta de camarón deberá duplicarse en los próximos 20 años para satisfacer la demanda futura [2]. A medida que la captura silvestre se ha estancado [3], la acuicultura se ha convertido en la alternativa más viable para satisfacer las demandas actuales y futuras del mercado del camarón [2]. De hecho, el 55% del suministro mundial anual de camarón en 2018 fue producido por la cría [4], lo que sugiere que la acuicultura tiene la capacidad de proporcionar a los consumidores un suministro constante y confiable de productos [5]. Aunque todavía está en su infancia, el cultivo de camarón ha mostrado un gran potencial para una alta productividad a costos reducidos. Por ejemplo, el camarón criado en acuicultura ha mostrado el doble de tasas de crecimiento que las poblaciones silvestres, lo que indica un gran potencial para aumentar aún más la producción [6]. Debido a su tolerancia a una amplia gama de salinidades y temperaturas, el camarón patiblanco (Litopenaeus vannamei), también conocido como camarón blanco del Pacífico o langostino, es el camarón más cultivado en todo el mundo [7 , 8]. Los estanques al aire libre con acceso cercano al agua del océano representan el diseño más popular y básico para el cultivo de camarón. Los intercambios regulares con agua del océano se utilizan tanto para reponer las fuentes de alimento para el cultivo de camarones como para evacuar los desechos de los estanques. Las variaciones entre los sistemas de producción son típicamente una función de la densidad de población, que afecta principalmente a las entradas de agua del océano necesarias para mantener la calidad del agua [9]. Dado que requieren insumos mínimos para asegurar el crecimiento, los estanques representan un sistema de producción atractivo y de bajo costo [10]. Sin embargo, el impacto de la producción en estanques sobre el medio ambiente, así como los riesgos de brotes de patógenos, son motivo de preocupación. El efluente de los estanques de producción de camarón es una fuente importante de contaminantes químicos y biológicos en las aguas oceánicas que pueden dañar los hábitats acuáticos naturales que son sensibles a cargas excesivas de nutrientes [2 , 5]. La naturaleza expuesta de los estanques abiertos significa que normalmente tienen una protección limitada contra la exposición a patógenos, y los estanques de alta densidad tienen un mayor riesgo de experimentar brotes como resultado del aumento de la contaminación y las condiciones de estrés [6 ]. Las grandes pérdidas en la producción de camarón debido a enfermedades han sido históricamente una característica definitoria de esta industria [11], particularmente de patógenos de la Familia de enterobacterias, que incluye especies afiliadas a Pseudomonas, Flavobacterium, Escherichia, Aeromonas, Vibrio, Rickettsia, Shewanella y Desulfovibrio [ 12]. Una vez infectados, los estanques mismos presentan un riesgo de contaminar a las poblaciones silvestres que residen en las aguas nativas cercanas [11]. El tratamiento del agua de los estanques con antibióticos es una estrategia común para mitigar el riesgo de enfermedades, pero esta práctica puede llevar a la selección de cepas microbianas resistentes que podrían transferirse al suministro de alimentos para humanos [13], así como las aguas naturales circundantes. La tendencia hacia regulaciones de antibióticos más estrictas en todo el mundo en la producción ganadera también indica que se necesitarán

métodos alternativos en la acuicultura en un futuro próximo. A diferencia de los estanques, las instalaciones interiores para el cultivo de camarón permiten un control de bioseguridad más estricto y ayudan a reducir la huella ambiental de la acuicultura. Si bien requieren inversiones más costosas en infraestructura, como sistemas de recirculación de agua, las instalaciones interiores pueden minimizar drásticamente la exposición a patógenos ambientales, proporcionar un mejor control de la calidad del agua con un impacto reducido en el medio ambiente y proporcionar productos del mar más seguros que no contienen contaminantes [ 2]. Además de los costos de las instalaciones, la otra desventaja principal de la acuicultura en interiores es la necesidad de formular dietas que optimicen el crecimiento del camarón a costos reducidos. Los ingredientes se han derivado tradicionalmente de subproductos de pescado como la harina de pescado y los aceites de pescado, pero el mayor costo de estos alimentos y otras fuentes de proteínas animales ha motivado el uso de proteínas de origen vegetal [12, 14]. Sin embargo, debido a que los productos vegetales no son componentes naturales de las dietas de camarón y contienen altos niveles de carbohidratos y factores antinutricionales que los camarones no han evolucionado para digerir, los niveles altos de inclusión pueden resultar en un crecimiento sub-óptimo y mala salud [12]. Teniendo en cuenta la importancia primordial del microbioma intestinal en la salud y la nutrición de los animales [15], la manipulación de las comunidades microbianas beneficiosas en el intestino del camarón puede proporcionar soluciones para mejorar la resistencia a los patógenos sin el uso profiláctico de antibióticos, así como para optimizar el crecimiento en fuentes alternativas de proteínas. La investigación hasta la fecha ha encontrado que el perfil bacteriano intestinal en camarones sanos consiste principalmente en Proteobacteria, consistente con los peces marinos [16], que contrasta con el microbioma de los animales terrestres en los que Firmicutes y Bacteroides son típicamente dominantes [17]. De hecho, hasta ahora se ha descubierto que estos últimos filos son componentes menores del microbioma intestinal del camarón, y su abundancia parece depender en gran medida de las condiciones ambientales locales y la composición de la dieta [12]. Existe un conocimiento limitado hasta la fecha sobre el efecto de las prácticas de acuicultura en el microbioma intestinal del camarón [15]. Por ejemplo, las medidas de bioseguridad para prevenir brotes de patógenos también pueden reducir o prevenir inadvertidamente la colonización de camarones criados en interiores con bacterias beneficiosas que se encuentran en entornos naturales [15]. Dado que los primeros eventos de colonización microbiana intestinal pueden afectar el rendimiento o la productividad futuros de un animal, el desarrollo adecuado del microbioma puede verse alterado de forma perjudicial en el camarón criado en acuicultura [14]. Por el contrario, se ha demostrado que las comunidades bacterianas intestinales del camarón se adaptan a las dietas formuladas comercialmente, lo que indica que el microbioma del camarón se puede manipular a través de ingredientes dietéticos [14]. Dado que la dieta y la genética del hospedador, así como una serie de condiciones ambientales como la temperatura del agua, la salinidad y las concentraciones de sulfuro, pueden afectar la composición del microbioma intestinal del camarón patiblanco [12], planteamos la hipótesis de que las comunidades bacterianas intestinales de esta especie acuática altamente cultivada diferirían entre los dos tipos principales de sistemas de acuicultura. Con este fin, el estudio presentado en este informe comparó el perfil bacteriano intestinal de camarones patiblancos criados en una instalación interior con individuos de la misma especie recolectados de dos sistemas de estanques. Dentro de cada sistema de producción, que fue operado bajo sus respectivas prácticas normales, las muestras mostraron perfiles taxonómicos y estructuras de comunidades bacterianas intestinales muy consistentes. Sin embargo, se descubrieron diferencias importantes en las afiliaciones taxonómicas y los perfiles de la Unidad Taxonómica Operativa (OTU) entre los camarones criados en una instalación interior y los camarones criados en estanques.

2.- Materiales y métodos 2.1. Recolección de mues tras y recolección de teji do intestinal de camarón

Los camarones se capturaron en tres entornos de producción diferentes (como se describe a continuación). Se recogió tejido intestinal de cada animal usando el siguiente procedimiento. El telson se retiró con unas tijeras distal al sexto segmento abdominal, luego se levantó el extremo posterior del caparazón para exponer el hepatopáncreas, y el extremo proximal del intestino.

A continuación, se extirpó el intestino con pinzas estériles comenzando en el hepatopáncreas hasta el intestino posterior. Cada muestra consistió en tejido intestinal combinado de cinco camarones individuales de la misma población (ver descripción a continuación) para asegurar que hubiera suficiente material disponible para la extracción de ADN. Todas las muestras de tejido intestinal recolectadas se almacenaron a -20 ° C hasta la extracción del ADN. 2.2. Sitio de estudio para camarones criados en interiores

El Tr‐ Shrimp Innovation Center (330 3rd Street, Balaton, MN, EUA; 44.2 ° N 95.8 ° W) es un campus de investigación diseñado para industrializar técnicas de acuicultura en interiores para la producción de camarón. La instalación contiene cerca de 200 tanques de investigación de agua clara y biofloc, así como otros tanques de producción comercial de varios tamaños y configuraciones. Los camarones criados en interiores se mantuvieron a 28 ± 1 ° C en tanques con temperatura controlada. La gestión del agua se llevó a cabo utilizando sistemas de recirculación de acuicultura en interiores separados, uno para cada tanque, utilizando agua dulce procesada por ósmosis inversa y luego mezclada a 28 g de Marinemix (Marine Enterprises International, LLC., Baltimore, MD, EE. UU.) A un litro de agua de producción. Los niveles de nitrógeno amoniacal total (TAN) se mantuvieron por debajo de 3,0 mg / ml, los niveles de nitrito por debajo de 4,5 mg / ml y los niveles de nitrato nunca superaron los 100 mg / ml. El agua evaporada se reemplazó con agua dulce según fuera necesario para mantener la salinidad a 28 ppt. Las densidades de población se mantuvieron en el rango estándar de los sistemas de producción intensiva de 30 a 60 camarones por metro cúbico, con alimento ofrecido continuamente. Todos los tanques de cultivo se complementaron con una mezcla comercial de bacterias probióticas (BioWish 3P, BioWish Technologies, Cincinnati, OH, EE. UU.) Que contenía Pediococcus acidilactici, P. pentosaceus, Lactobacillus plantarum y Bacillus subtilis. El probiótico se proporcionó en una dosis diaria de 0,025 g / 100 L, que se administró manualmente durante un período de 24 h. Se obtuvieron catorce muestras saludables de acuicultura criadas en interiores de seis tanques de producción alimentados con tres dietas separadas en tres

Tabla 1 Asignación del tanque de cultivo, dieta, puntos de tiempo, longitud promedio y peso de los camarones muestreados en la instalación de producción interior.

a la Formulación de todas las dietas presentadas en esta tabla son patentadas. b Fuente primaria de ingredientes proteicos en la dieta: animal marino (m), vegetal (p). Tabla 2 Contenido parcial de nutrientes de las dietas acuícolas a. Los valores se expresan como porcentaje (%).

momentos diferentes (ver tabla 1para obtener una descripción de la muestra). Todas las dietas alimentadas contenían un 35% de proteína cruda y consistían en Producción 35% (Rangen Inc., Buhl, ID, EE. UU.), HyperIntensive 35 (Zeigler Bros. Inc. Gardners, PA, EE. UU.) Y tSC (tSC 35%, tSC Grow Out, Balaton, MN, EE. UU.). Los datos de la composición parcial de nutrientes de las dietas utilizadas se presentan en la Tabla 2. Como no requirieron transporte a larga distancia, no se agregó ningún conservante a las muestras de tejido intestinal de camarones criados en interiores, y se almacenaron inmediatamente a -20 ° C después de la disección.

2.3. Camarones En Estanque

Se obtuvieron muestras de camarones sanos criados en estanques de dos granjas. Se recolectaron diez muestras de una granja camaronera ubicada en la costa de la bahía de Kino (Sonora, México; muestras etiquetadas como 'KB-'), y otras cinco muestras se obtuvieron de una granja ubicada cerca de Obregón (Sonora, México; muestras etiquetadas 'Ob- '). Los estanques tenían una profundidad promedio de 1,5 metros, con densidades de siembra mantenidas dentro de un rango típico de los sistemas de producción intensiva (30-60 camarones / m 3). Se realizaron pruebas de química del agua semanalmente para monitorear los niveles de TAN, nitrito, nitrato y alcalinidad. Estos parámetros se utilizaron para determinar las tasas de intercambio de agua para mantener la calidad del agua, que oscilaron entre 0% y 20%. Ambos sitios alimentados con la misma dieta comercial (Bumper Crop, Vimifos SA de CV, Guadalajara, Jalisco, México; los datos de la composición parcial de nutrientes se presentan en Tabla 2), y los estanques de

la granja de Obregón reciben una dosis diaria de fitoquímicos como suplemento dietético. La alimentación se ofreció en horarios programados durante el día (5 am, 12 pm y 5 pm). Los camarones muestreados en estanques se recolectaron aproximadamente a los 80 días de edad y luego se disecaron en el sitio. Las muestras intestinales se conservaron en etanol al 100% para su transporte y luego se almacenaron a -20 ° C al llegar al laboratorio anfitrión. 2.4. Camarones silvestres

Es muy difícil obtener camarones capturados en la naturaleza que no se degraden por los métodos de almacenamiento o conservación en un barco de pesca. Por lo tanto, solo se pudo obtener una muestra capturada en el medio silvestre (cinco camarones de la misma captura) de alta calidad para este estudio. Estos camarones de edad indeterminada y dietas naturales fueron capturados en el Golfo de California (34 a 36 ppt de salinidad). Las muestras intestinales disecadas se conservaron en etanol al 100% para su transporte y luego se almacenaron a -20 ° C al llegar al laboratorio anfitrión. Debido a que una sola muestra aumenta el riesgo de sesgo potencial, la composición del microbioma de la muestra capturada en la naturaleza solo se utilizó como referencia cualitativa.

2.5. Aislamiento de ADN microbiano y amplificación por PCR

Se aisló ADN microbiano de muestras intestinales de camarón utilizando el método repetido de batir perlas más columna, como lo describen Yu y Morrison [18]. La región V1-V3 del gen de ARNr 16S bacteriano se amplificó mediante PCR utilizando 27F directo [19] y 519R inverso [ 20] par de cebadores. Las reacciones de PCR se realizaron con ADN polimerasa Phusion Taq (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) En las siguientes condiciones: inicio en caliente (4 min, 98 ° C), seguido de 35 ciclos de desnaturalización (10 s, 98 ° C), recocido (30 s, 50 ° C) y extensión (30 s, 72 ° C), y luego termina con un período de extensión final (10 min, 72 ° C). Los productos de la PCR se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se escindieron amplicones del tamaño esperado (~ 500 pb) para la purificación en gel utilizando el kit de extracción en gel QiaexII (Qiagen, Hilden, Alemania). Para cada muestra, se enviaron aproximadamente 400 ng de ADN amplificado a Molecular Research DNA (MRDNA, Shallowater, TX, EE. UU.) Para secuenciarlo con la plataforma Illumina MiSeq 2X300 para generar lecturas finales emparejadas superpuestas.

2.6. Análisis computacional de secuencias de amplicones de ARNr 16S generadas por PCR

A menos que se especifique, el análisis de datos de secuencia se realizó utilizando scripts de Perl escritos personalizados (disponibles a pedido). Molecular Research DNA proporcionó las secuencias de amplicón del gen V1 – V3 del ARNr 16S bacteriano crudo como ensamblados de lecturas de extremos emparejados MiSeq (2X300) superpuestas de los mismos grupos de células de flujo. Luego, las lecturas se seleccionaron para cumplir con los siguientes criterios: presencia de secuencias de nucleótidos del cebador 27F (directo) y 519R (inverso) intactas, longitud entre 400 y 580 nt y un umbral de calidad mínimo de no más del 1% de nucleótidos con un Phred Puntuación de calidad inferior a 15. Después de las pantallas de calidad, las lecturas de secuencia se alinearon y luego se agruparon en Unidades Taxonómicas Operativas (OTU) a un límite de distancia genética del 5% de disimilitud de secuencia [21]. Si bien el 3% es el límite de agrupación más utilizado para el ARNr 16S, originalmente se recomendó para secuencias de longitud completa y puede no ser adecuado para el análisis de subregiones específicas, ya que la variabilidad de la secuencia de nucleótidos no es constante en toda la longitud del gen del ARNr 16S. En este contexto, si el 3% es un límite de agrupamiento comúnmente aceptado para las regiones V4 o V4-V5, que son la menor variable de las regiones hipervariables, entonces se debe usar un límite más alto para la región V1-V3, ya que V1 es la región más variable del gen ARNr 16S. Estas y otras consideraciones sobre el uso del 5% como límite de agrupación de OTU se pueden encontrar en materiales y métodos complementarios. Las OTU se examinaron para detectar artefactos de secuencia de ADN utilizando los siguientes métodos. Las secuencias quiméricas se identificaron por primera vez con los comandos chimera, uchime y chimera slayer del paquete de software de código abierto MOTHUR [22]. En segundo lugar, se evaluó la integridad de los extremos 5 'y 3' de las OTU utilizando un enfoque basado en la búsqueda de alineación de la base de datos; en comparación con su coincidencia más cercana de longitud de secuencia igual o más larga de la base de datos NCBI nt, según lo determinado por BLAST [23], las OTU con más de cinco nucleótidos faltantes del extremo 5 'o 3' de sus respectivas alineaciones se descartaron como artefactos. Finalmente, las OTU de lectura única se eliminaron del análisis.

Después de eliminar las quimeras de secuencia, los artefactos y las OTU singleton, la asignación taxonómica de las OTU se determinó mediante una combinación de RDP Classifier [24] y BLAST [ 23 ]. También se consultó la Lista de nombres procariotas con posición en la nomenclatura (LPSN http://www.bacterio.net) para obtener información sobre especies válidas pertenecientes a taxones de interés [ 25 ]. 2.7. Análisis computacional para la diversidad alfa y beta Utilizando scripts de Perl personalizados, cada conjunto de datos se enrareció aleatoriamente a 5000 lecturas, con las 50 iteraciones creadas para cada muestra utilizada para crear archivos formateados de tipo "compartido". Todos los pasos posteriores se realizaron utilizando comandos en MOTHUR [22]. Los índices de Chao1, Shannon y Simpson, así como las OTU y la cobertura observadas, se determinaron a partir de los archivos compartidos utilizando summary.single. Las curvas de rarefacción se pueden encontrar en la Figura complementaria S1. Para el análisis de coordenadas principales (PCoA), las distancias de BrayCurtis se determinaron primero utilizando summary.shared, que luego se utilizaron como entrada para el comando. Los Componentes Principales 1 (PC1) y 2 (PC2), que representan el nivel más alto de variación, fueron graficados usando Microsoft® Excel. El análisis jerárquico de conglomerados se realizó mediante la herramienta en línea iDEP.81 (http://bioinformatics. sdstate.edu/idep) para producir un mapa de calor visual. 2.8. Análisis estadístico Se utilizó una prueba t independiente para comparar la abundancia relativa de grupos taxonómicos bacterianos y OTU entre diferentes sistemas de producción, respectivamente (GraphPad Software, https://www.graphpad. com/quickcalcs/ttest1.cfm) Se consideró que las medias de dos grupos eran significativa-

mente diferentes cuando P ≤ 0,05.

2.9. Números de acceso para datos de secuencia -

análisis, con un promedio de 22,698 ± 1744 lecturas por

Figura 1.- Diagrama de Venn que muestra el número de OTU compartidas y únicas del intestino de camarones de pata blanca criados en interiores, criados en estanques y capturados en la naturaleza. También se muestra la proporción de lecturas de secuencia para cada categoría.

a los valores mostrados representan la media y el error estándar de la media, respectivamente. # las medias de las muestras de interior y estanques fueron estadísticamente diferentes (p <0.05).

Tabla 3 Abundancia relativa (%) de los principales grupos taxonómicos bacterianos en el tracto intestinal del camarón patiblanco criado en dos sistemas de producción diferentes y de una población silvestre.

ción de próxima generación muestra para las muestras de Los datos de secuencia sin proce- camarones criados en interiosar están disponibles en el archivo res, 24,796 ± 4223 lecturas de lectura de secuencias de NC- por muestra para las muestras BI bajo Bioproject PRJNA522274 del estanque y 9539 lecturas y acceso a SRA SRP185856. Los para la muestra silvestre. Un números de acceso para mues- total de 6988 lecturas de setras individuales se proporcionan cuencia, que oscilan entre 22 en la Tabla complementaria S1. y 1025 lecturas por muestra, se designaron como "no cla3.-Resultados sificadas" porque no podían 3.1. Análisis comparativo por asignarse a un filo conocido.

composición taxonómica

Se encontró que las comuniSe utilizaron un total de 699,259 dades bacterianas intestinales lecturas de alta calidad y sin de camarones patiblancos de quimeras / artefactos para el interior y de estanque eran muy diferentes (P <0,05) en los perfiles taxonómicos. Las proteobacterias fueron en general el filo más dominante en todas las muestras analizadas, pero se encontraron niveles significativamente más altos en las muestras de interior (88,6%) en comparación con los estanques (51,8%) (Tabla 3). Se observaron diferencias más perceptibles entre los dos ambientes de acuicultura a nivel familiar, ya que las comunidades bacterianas de las muestras de interior estaban compuestas principalmente por miembros de la familia Rhodobacteraceae (84,4%), mientras que se encontró que las Vibrionaceae eran las más abundantes en las muestras de estanques (44,8%)). Además, Firmicutes, Fusobacteria y Cyanobacteria se encontraron en una abundancia mucho mayor en muestras de estanques (36.0%, 7.9% y 1.6%, respectivamente) en comparación con muestras de interior (0.7%, 0.0% y 0.001%, respectivamente), en contraste con Actinobacteria, que estuvieron más representados en las muestras de interior (3,0% frente a 0,06%). Si bien el número limitado de muestras capturadas en la naturaleza no permitió una comparación basada en estadísticas, tabla 1, Figura 1).

3.2. Análisis comparati vo de diversidad alfa y beta

Para explorar más las diferencias en la composición de la comunidad bacteriana entre los entornos de cultivo de camarón investigados, realizamos un análisis de diversidad alfa. No se encontró que las comunidades bacterianas intestinales de camarones cultivados en interiores y en estanques fueran estadísticamente diferentes en términos de número de OTU observadas o índices de diversidad como chao1, as, Shannon o Simpson (Cuadro 4). Sin embargo, PCoA usando distancias de Bray-Curtis basadas en la disimilitud composicional de OTU mostró claras diferencias entre las comunidades bacterianas intestinales de camarones criados en interiores y aquellos de camarones cultivados en estanques (Figura 2). Con la excepción de la muestra de Ob1, hubo una clara separación entre los respectivos conjuntos de muestras. De manera similar, el análisis de conglomerados jerárquicos también indicó que las muestras de interiores y estanques (con la excepción de la muestra de Ob-1) se agruparon por separado en función de su composición OTU (figura 3).

cada una puede haber representado una cepa de su respectivo pariente más cercano. Por el contrario, dos de las OTU afiliadas a Firmicutes que eran prominentes en camarones criados en estanques (SD_Shr-00003 y SD_Shr-00008) mostraron una identidad muy limitada con su respectivo taxón validado más cercano, lo que indica que pueden haber correspondido a miembros de un linaje filogenético bacteriano. que aún está por caracterizar, lo que indica que cada uno puede haber representado una cepa de su respectivo pariente más cercano. Por el contrario, dos de las OTU afiliadas a Firmicutes que eran prominentes en camarones criados en estanques (SD_Shr-00003 y SD_Shr-00008) mostraron una identidad muy limitada con su respectivo taxón validado más cercano, lo que indica que pueden haber correspondido a miembros de un linaje filogenético bacteriano que aún está por caracterizar, lo que indica que cada uno puede haber representado una cepa de su respectivo pariente más cercano. Por el contrario, dos de las OTU afiliadas a Firmicutes que eran prominentes en camarones criados en estanques (SD_Shr00003 y SD_Shr-00008) mostraron una identidad muy limitada con su respectivo taxón validado más cercano, lo que indica que pueden haber correspondido a miembros de un linaje filogenético bacteriano que aún está por caracterizar.

4.- Discusión

En este estudio, se investigaron las comunidades bacterianas intestinales del camarón patiblanco criado en diferentes sistemas de producción acuícola. Teniendo en cuenta la escasez de datos disponibles de camarones criados en interiores, se recolectaron muestras de animales alimentados con diferentes dietas en varias etapas de su desarrollo en un esfuerzo por ser representativos de la variabilidad potencial en los perfiles bacterianos. Sorprendentemente, las muestras

Figura 2 Comparación de las comunidades bacterianas intestinales del camarón patiblanco mediante el análisis de coordenadas de principios (PCoA). (A) Análisis comparativo entre camarones criados en dos sistemas de producción diferentes y de una población silvestre. (B) Comparación entre muestras de camarones de patas blancas criados en un sistema de interior bajo tres dietas diferentes. Los ejes xey corresponden a los Componentes Principales 1 (PC1) y 2 (PC2), que explicaron el nivel más alto de variación.

3.3. Análisis comparati vo de OTU prominentes

Para obtener más información, se investigaron con más detalle las OTU bacterianas más abundantes identificadas en este estudio (se proporciona una tabla completa de OTU en la Tabla complementaria (2). Como se esperaba de la composición taxonómica y los análisis de diversidad beta presentados anteriormente, el perfil de las principales OTU bacterianas del intestino de los camarones criados en interiores fue muy diferente del camarón cultivado en estanques, con la abundancia de 11 de las 12 OTU más prominentes que se encontraron estadísticamente diferente entre los dos entornos (Cuadro 5). Las cuatro OTU prominentes de camarones criados en interiores (SD_Shr-00001, SD_Shr-00002, SD_Shr-00006 y SD_Shr-00009) estaban afiliadas a la familia Rhodobacteraceae (filo Proteobacteria), y juntas representan un promedio del 72.2% de las bacterias identificadas en estas muestras, en contraste con 4.1% en camarones criados en estanques. Otras seis OTU principales fueron dominantes en camarones criados en estanques, y estaban afiliados a Vibrionaceae del filo Proteobacteria (SD_Shr-00004 y SD_Shr-00005), Firmicutes (SD_Shr-00003 y SD_ Shr-00008), así como Fusobacteria (SD_Shr- 00007 y SD_Shr-00015). Curiosamente, cinco de las OTU del estanque principal no se detectaron en camarones criados en interiores. Los camarones capturados en la naturaleza también mostraron un perfil OTU distinto, con predominio de SD_Shr-00005 y SD_Shr-00046, que se encontraron en una abundancia mucho mayor en esta muestra en comparación con los camarones de interior o de estanque. Se encontró que todas las OTU principales afiliadas a Proteobacteria estaban muy estrechamente relacionadas con una especie conocida, con valores de identidad de secuencia que oscilaban entre el 98,5% y el 99,6%, lo que indica que

Figura 3 Análisis de conglomerados jerárquico basado en las 200 OTU más abundantes de las comunidades bacterianas intestinales del camarón patiblanco.

Cuadro 4 Índices de diversidad alfa y cobertura de las comunidades bacterianas intestinales del camarón patiblanco criado en dos sistemas de producción diferentes.

cultivadas en interiores mostraron una composición taxonómica bacteriana intestinal y estructuras comunitarias muy homogéneas, independientemente de la dieta y la etapa de crecipotencial metabólico, las bacterias típicamente representan el grupo más diverso de microorganismos en los ambientes intestinales de los animales. La relación entre un huésped y sus

a Los valores mostrados representan la media y el error estándar de la media, respectivamente. # Las medias de las muestras de in terior y estanques fueron estadísticamente diferentes (P <0.05).

Cuadro 5 Abundancia relativa (%) de las principales Unidades Taxonómicas Operativas (UTO) en el tracto intestinal del camarón patiblanco criado en dos sistemas de producción diferentes y de una población silvestre.

miento, como lo demuestra mejor el bacterias simbióticas es el resultado de análisis de PCoA (Figura 2). Si bien los la coevolución entre las dos entidades, perfiles de bacterias intestinales de los ya que se seleccionan adaptaciones camarones criados en estanques no mutuamente beneficiosas para favoreestaban tan estrechamente relacio- cer su asociación [12]. El desarrollo de nados entre sí como las muestras de comunidades microbianas intestinales interior, eran consistentes como grupo en crías o animales recién nacidos imy muy distintos de los de los camaro- plica oleadas sucesivas de colonizanes criados en interiores. En particular, ción y sucesión, concurrentes con el 11 de las OTU más abundantes fueron desarrollo, la maduración y los hábitos significativamente diferentes entre los alimentarios de su huésped. El desados tipos de muestras, lo que sugiere rrollo del microbioma intestinal en el un efecto de los sistemas de produc- camarón patiblanco comienza duranción en las comunidades bacterianas te la quinta etapa del nauplio, cuando intestinales del camarón patiblanco. el poro anal inicia el movimiento del En términos de filogenia, genética y líquido a través del intestino, seguido más tarde por cambios importantes en la mysis y en las primeras etapas post-larvarias que se producen como resultado de la alimentación de invertebrados como Artemia y Rotifera spp. después de la eclosión [12]. Las comunidades de bacterias intestinales durante todas las etapas del desarrollo consisten principalmente en Proteobacteria, Bacteroidetes y Actinobacteria [14], con la representación de cada grupo fluctuando en respuesta a los cambios en la dieta y el desarrollo de su anfitrión. Otros factores, como la salinidad, el estrés, la respuesta inmune del huésped, la exposición a antibióticos y las condiciones ambientales pueden afectar la composición de las comunidades microbianas intestinales [15]. En consecuencia, estos factores tienen una gran influencia en la capacidad de los microbiomas intestinales para contribuir a la salud y nutrición de su huésped antes y durante las etapas productivas de su ciclo de vida. Si bien muchos de los mecanismos involucrados aún no se han resuelto, un amplio cuerpo de investigación centrado en humanos y modelos animales ha indicado que el tipo de microorganismos a los que está expuesto un animal joven puede afectar la composición de su microbioma a medida que madura. En los sistemas acuáticos naturales, los camarones están expuestos a microorganismos del agua y sedimentos que proporcionan un estanque o fuente de simbiontes potenciales que pueden colonizar su tracto intestinal en diversas etapas de su desarrollo [15]. De hecho, se ha encontrado que al menos noventa géneros se comparten entre los sedimentos de los estanques, el agua de los estanques y el tracto intestinal de los camarones, encontrándose la mayoría de las similitudes entre los sedimentos y los perfiles intestinales [26]. Debido a que Lactobacillus, Streptococcus y Bacillus son los géneros compartidos más abundantes en el tracto intestinal del camarón (1,0%, 0,93% y 0,37%, respectivamente) [ 12], y que ya se utilizan como probióticos en humanos y otros animales de consumo, han sido una fuente importante de probióticos en la industria de la acuicultura del camarón. Si bien su abundancia tiende a ser baja (<1%) en el ambiente intestinal del camarón, se ha descubierto que su uso como probióticos es beneficioso para la inmunidad del huésped y su eficiencia en la digestión de dietas comerciales [14]. En este estudio actual, sin embargo, se encontraron en niveles mucho más bajos, con Lactobacillus identificado en solo una muestra de camarón de estanque (0.01%), Streptococcus en tres muestras de camarón de interior y una muestra de camarón de estanque (0.02% o menos), y Bacillusno detectado en ninguna de las muestras de camarón analizadas. Sin embargo, es posible que estas especies probióticas puedan afectar la composición de las comunidades bacterianas en el intestino de los camarones criados

en interiores, incluso si no parecen establecerse en ese entorno. Como se sugirió en otra parte [12], quizás las formulaciones probióticas para la producción de camarón deberían incluir cepas bacterianas beneficiosas que son nativas del intestino del camarón.

Una serie de problemas de salud animal en el camarón pueden ser causados por una mala nutrición, ya que conduce a individuos débiles o subdesarrollados que se vuelven más susceptibles a las enfermedades [17]. El riesgo de estos problemas de nutrición puede ser mayor con las formulaciones dietéticas comerciales, ya que la industria está pasando de la harina y los aceites de pescado a los ingredientes de origen vegetal para reducir los costos operativos [12]. Aunque los camarones muestreados de los tanques de producción interiores se obtuvieron de distintas poblaciones de tanques, tenían fuentes de agua y manejo independientes, y cada uno recibió uno de los tres tratamientos dietéticos, sus perfiles de bacterias intestinales fueron notablemente similares (Figura 1 y Figura 2). Debido a que las dietas de interior se formularon utilizando diversas combinaciones de fuentes de proteínas de origen animal y vegetal, estos resultados indicarían que, si bien los perfiles bacterianos del intestino del camarón están muy influenciados por los ingredientes dietéticos, como se muestra en la comparación entre camarones criados en interiores y criados en estanques en este informe, la composición bacteriana puede no ser tan sensible a las variaciones en las formulaciones con el mismo conjunto de ingredientes. Las fuentes de proteínas de origen vegetal en las dietas comerciales de camarones tienden a incluir también polisacáridos y factores antinutricionales, que el tracto intestinal del camarón y el microbioma natural no han evolucionado para digerir de manera efectiva. Curiosamente, mientras que los miembros del filo Bacteroidetes generalmente se consideran los principales usuarios de polisacáridos vegetales en la mayoría de los entornos intestinales, (Tabla 3). Si bien se requerirán investigaciones futuras para dilucidar los mecanismos involucrados, tal vez las bacterias de otros phyla permitan que los camarones cultivados utilicen de manera efectiva ingredientes proteicos derivados de plantas. Los posibles candidatos incluirían SD_Shr-00001, SD_Shr-00002, SD_Shr-00006 y SD_ Shr-00009, que eran OTU afiliadas a Rhodobacteraceae que eran mucho más abundantes en camarones criados en interiores en comparación con las poblaciones de estanques o capturadas en la naturaleza. Curiosamente, se ha informado de Firmicutes en mayor abundancia en el intestino de los camarones patiblancos alimentados con almidón de maíz en comparación con los camarones alimentados con glucosa y sacarosa [27]. Además de la dieta, la exposición al estrés u otras perturbaciones puede alterar la composición de los microbiomas intestinales, lo que da como resultado un estado de disbiosis que puede brindar una oportunidad para que las bacterias patógenas prosperen y provoquen enfermedades [ 17 ]. Durante el ciclo de producción de camarón, el estrés puede ser inducido por el hacinamiento o cambios en la salinidad y calidad del agua [ 12 ]. Si bien su efecto puede ser indetectable en condiciones agrícolas normales, se cree que los patógenos oportunistas son omnipresentes en el microbioma de individuos sanos [ 14 ]. Los principales patógenos bacterianos que pueden infectar al camarón incluyen miembros de los géneros Pseudomonas, Flavobacterium, Escherichia, Aeromonas ,Vibrio, Rickettsia, Shewanella y Desulfovibrio [ 12 ]. Entre estas, las secuencias afiliadas a Vibrio fueron, con mucho, las más abundantes en este estudio, particularmente OTU SD_Shr-00004, con una abundancia media del 26,8% en muestras de estanques (Cuadro 4). Por el contrario, no se identificaron secuencias afiliadas a Flavobacterium, Escherichia, Aeromonas o Rickettsia entre las 30 muestras analizadas, mientras que las secuencias para Desulfovibrio (0.02% o menos en tres muestras de estanques, 0.3% en la muestra capturada en la naturaleza), Shewanella (0.003% o menos en dos muestras de estanques) y Pseudomonas (una muestra de interior y una de estanque al 0,003% o menos, respectivamente) solo se encontraron con una representación muy baja. En particular, SD_Shr-00004 estaba muy relacionado con Vibrio alginolyticus, un patógeno oportunista que puede causar enfermedades en condiciones de estrés [ 28 , 29 ].V. alginolyticus, así como V. parahaemolyticus, V. harveyi, V. vulnificus y V. damsel , están comúnmente presentes en los sistemas de producción acuícola [ 28 , 29]. Si bien los niveles de SD_Shr00004 fueron mucho más bajos en los camarones criados en interiores en comparación con los camarones cultivados en estanques, su presencia detectable en animales criados en un ambiente controlado sugiere que puede ser un residente normal en el intestino del camarón. Quizás una abundancia mucho mayor, como se observa en los camarones de estanque, podría ser indicativo de un estado de disbiosis. Sin embargo, dado que los camarones capturados con altos niveles de SD_Shr-00004 en este estudio no mostraron signos o síntomas obvios de enfermedad, quizás sería necesaria una proliferación mucho mayor de SD_Shr-00004 para alcanzar un estado de enfermedad o la OTU identificada en este estudio es no es una cepa de V. alginolyticus. Curiosamente, las Actinobacterias, que recientemente han sido reportadas como un filo bacteriano clave en el intestino del camarón patiblanco que permite el crecimiento en condiciones de baja salinidad y previene el crecimiento descontrolado de patógenos [ 12 ], fue en promedio 50 veces más abundante en camarones cultivados en interiores en comparación con los criados en estanques. camarones en este estudio actual. En conjunto, los resultados presentados en este informe indican que las prácticas de acuicultura influyen en gran medida en el perfil bacteriano intestinal del camarón patiblanco y, además, sugieren que las comunidades bacterianas de este crustáceo de importancia económica podrían manipularse eficazmente en el futuro utilizando la composición de la dieta o factores ambientales como las condiciones del agua. Si bien la investigación futura es necesaria para dilucidar los mecanismos involucrados, también abre la posibilidad de que exista el mismo potencial de modulación del microbioma en otras especies de camarón de importancia económica, como el camarón tigre gigante / camarón tigre asiático (Penaeus monodon), camarón blanco chino / Camarón oriental / Langostino carnoso (Fenneropenaeus chinensis), Langostino tigre marrón (Penaeus penicillatus) y langostino banana (Penaeus merguiensis). Materiales complementarios, es tán disponibles en línea en https:// www.mdpi.com/2076-2607/7/4/93/s1 Contribuciones de autor Conceptualización, AL, BS-P., MB y WG; metodología, AL, BS-P., MR-L., MB, WG; software, BS-P.; validación, BS-P., MB y WG; análisis formal, AL, BS-P .; investigación, AL, MR-L .; recursos, AL, BS-P., MR-L., MB, WG; curación de datos, AL, BS-P .; redacción — preparación del borrador original, AL, BS-P .; redacción: revisión y edición, AL, BS-P., MB y WG Fondos: La financiación de la investigación presentada en este informe fue proporcionada por The trû Shrimp Company. Conflictos de interés: Angela Landsman y Misael Rosales-Leija son empleados de The trû Shrimp Company. Angela Landsman, 1, 2, * Benoit St-Pierre , 3 Misael Rosales-Leija , 1, 4 Michael Brown , 4 y William Gibbons 2 1 Trû Shrimp Innovation Center, The trû Shrimp Company, 330 3rd Street, Balaton, MN 56115, EE. UU. moc. ynapmocpmirhsurt@selasoR.leasiM 2 Departamento de Biología y Microbiología, Universidad Estatal de Dakota del Sur, Alfred Dairy Science Hall, Box 2104A, 1224 Medary Avenue, Brookings, SD 57007, EE. UU.; ude.etatSDS@snobbiG.mailliW 3 Departamento de Ciencia Animal, Universidad Estatal de Dakota del Sur, Complejo de Ciencia Animal, Box 2170, Brookings, SD 57007, EE. UU.; ude.etatSDS@erreiP-tS.tioneB 4 Departamento de Gestión de Recursos Naturales, Universidad Estatal de Dakota del Sur, Edgar S. McFadden Biostress Lab, Box 2140B, 1390 College Avenue, Brookings, SD 57007, EE. UU.; ude.etatSDS@nworB.leahciM

* Correspondencia: moc.ynapmocpmirhsurt@namsdnaL.alegnA Tel.: + 1-507-337-6924 Copyright © 2019 por los autores. Licenciatario MDPI, Basilea, Suiza. Este artículo es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos y condiciones de la licencia Creative Commons Attribution (CC BY) (http://creativecommons. org/licenses/by/4.0/). Los artículos de microorganismos se proporcionan por cortesía del Instituto Multidisciplinario de Publicaciones Digitales (MDPI).