ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
PROGRAMAZIOA
1. MIKROBIOLOGIA
Mikrobiologiaren kontzeptua eta historia Izaki bizidunen sailkapena Zelulak: motak eta egitura Célula prokariotoa Birusak eta beste izaki ez-zelularrak Monera Erreinua Protista Erreinua
2. METABOLISMO MIKROBIANOA
Mikroorganismoen metabolismoa: mantenu erreakzioak Biosintesia, polimerizazioa eta muntaketa Mkroorganismoen hazkuntza
3. MIKROBIOLOGIA APLIKATUA
Mikroorganismoen baliagarritasuna Populazio mikrobianoa Mikroorganismoen controla Familia esanguratsuenak
4. PRAKTIKAK
Zelulen behaketa Hazkuntza-inguruen prestaketa Laborategiko giroko mikroorganismoak Hazkuntza puruak lortzeko teknikak Mikroorganismo bizigarriak berreskuratzea Hazkuntza-inguru hautagarriak eta bereizgarriak prestaketa Bakterio-tindaketak Ezezagun morfologiko baten tindaketen bitarteko ezagutzea Mikroorganimoen zenbaketa Ingurumen baldintzen eragina bakterioen hazkundean Onddoen (lizunak eta legamiak) kultiboa Urokultiboa Koprokultiboa
Entseiu mikrobiologikoak
1
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Esne gordinaren azterketa mikrobiologikoa Uraren analisi mikrobiologikoa Elikagaien analisi mikrobiologikoa Antibiogramak
Entseiu mikrobiologikoak
2
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
1. Unitatea: MIKROBIOLOGIAREN KONTZEPTU ETA HISTORIA
A. Definizioa: Mikrobiologia mikroorganismoak aztertzen dituen zientzia da. Beraz, Biologiaren atala da. Zer dira mikroorganismoak? Zentzu orokorrean, begiz ikustezinak diren bizidunak. Objetu bat 0,1 mm bat baino txikiagoa bada, begiak ezin du kusi, eta 1 mm izanda ere detaile gutxi igarri daiteke. Beraz, 1 mm edo gutxiago duten bizidunak mikroorganismoak dira eta mikrobiologiaren eremuan sartzen dira. Mikroorganismoak: animalia batzuk, protista, monera, alga asko, bakterioak eta birusak dira. Ondorio bezala, mikroskopioa behar beharrezkoa da bizidun hauek aztertzeko, beraz mikrobiologiak ezinbestekoa du mikroskopia. B. Mikrobiologiaren garapena. 1632-1723:
Antony van Leeuwenhoek. (1. deskribapena)
1664:
Robert Hooke (zelula hitza 1. aldiz erabili)
1665:
Francesco Redi, zizareak okelan.
XVIII mendea:
Testua 1
Testua 2
Lazzaro Spallanzani, infusioak, berotu eta itxi
XIX mendea: Franรงois Appert, elikagaiak kontserbatu. XIX mendearen erdialdean, zientifiko batzuk konturatzen hasiak zieren erlazio kausala dagoela mikroorganismoen garapena infusioetan eta infusio hauek jasastzen dituzten aldaketak; hau da, mikroorganismoek aldaketa kimikoak sortzen dituzte infusioetan. 1861: zuen.
Louis Pasteur (1822-1895), mikroorganismoak airean zeudela frogatu Irudia 3
1870:
John Tyndall, bakterioen faseak: tyndalizazioa.
1876: Robert Koch (1843-1910), mikroorganismo batek gaixotasun bat (tuberkulosia). 1880:
Ferdinand Cohn, endosporak.
Entseiu mikrobiologikoak
3
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA 1884: H.C. Gram-ek tindaketa teknika bat asmatu zuen. Gaur egun ere oraindik erabiltzen dena. Teknika horri esker bakterioak bi taldetan sailkatzen dira: Gram + eta Gram – 1920-1935: Bizidun guztion prozesu metabolikoak antzekoak dira, hau da “biokimikaren batasuna” 1934: Mikroskopio elektronikoaren sorrerak mikroorganismoen barne egituraren ezagupenean bultzada handia eman zuen. Ordurarte mikrobiologia aparteko zientzia bezala hartzen bazen ere, aldi honetan gainontzeko zientzien garapenean lagungarri bihurtu zen. Genetikan adibidez, ekarpen handiak eman ziren: 1944: Avery, McLeod eta McCarthy-k eraldaketa bakterianoa DNA-k eragiten duela frogatu zuten 1953: Watson eta Crick, DNA-ren egitura eta molekula horren bikoizketa eta funtzionamendua. C. Mikroorganismoak eta prozesu kimikoak Infusioetan gertatzen diren prozesu kimikoak bi motatakoak dira nagusiki:
Ustelketa: Eraldaketa hauetan usain txarra duten gaiak sortzen dira, eta okela gertatzen da proteinak deskonposatzerakoan Hartzidura: Prozesu honetan alkoholak edota azido organikoak sortzen dira gluzidoak –landare eta fruituen osagai nagusiak- deskonposatzerakoan.
1837an hondakin hauek ikertu ziren eta bertan zelula biziak zeudela konturatu ziren biologoak. Kimikariek, berriz elementu inorganikoak zirela pentsatzen zuten- Pasteurek frogatu zuen hondakin hauek bizirik zirela, legamiak, hain zuzen. 1857-1876an Pasteurek hartzidura laktikoa eta alkoholikoa bereizi eta aztertu zituen. Hartzidura mota bakoitzak gai kimiko eta mikroorganismo bereziak zituela ikusi zituen:
Mikroorganismo batzuk aerobioak (oxigenoaren beharra) zirela eta beste batzuk anaerobioak. Hartzidura arnasketa baino efizientzia energetiko txikiagoa zuela
Ingurumenaren mikrobiologiaren gurasoak ondoko bi hauek ditugu: S. Winograsky (1856-1953) eta M. Beijerinch (1851-1931)
Entseiu mikrobiologikoak
4
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA Mtaeria organikoa zoruan eraldaketak sortzen zituela behatu zuten eta egoera eta baldintza desberdinetara egokitzen zirela konturatu ziren. Adibidez, materia organikoa deskonposatzen zen lekuetan NO3-ak agertzen zirela konturatu ziren. Orduan, hondakin urak NO3-tan aberatsak zirela ikusi zuten. Suposatu zuten mikroorganismoek NH4 NO3ra eraldatzen zutela. Hortik aurrera beste zenbait eraldaketa ikusi ziren, guztietan ziklo biokimikoak parte hartzen dutelarik. S2- --------------------- S Fe2+ --------------------> Fe3+ H2 -------------------- HN2 ------------------- NH4 Ziklo biokimikoak. D. Mikroorganismoak eta gaixotasunak
1793: Hunter-ek bi gizakiren arteko gaixotasun (gonorrea) kutsakorraren transmisioa frogatu zuen. 1840: J.L. Schönlein-ek frogatu zuen gizakion larruaren zenbait gaixotasun onddo batzuk sortzen zituztela Semmelweis-ek “fiebre perperal” izeneko gaixotasuna ospitaleko langileek transmititzen zietela ameei frogatu zuen. Henle-k mikroorganismo konkretu bat eta gaixotasun konkretu baten arteko erlazioa frogatzeko beharrezkoa zela mikroorganismoa isolatzea frogatu zuen. 1864: Lister-ek kirurgia antiseptikoa aurrera eramateko prozedurak prestatu zituen eta hasiera batean harrera oso ona ez bazuten izan ere, denboraz emaitzek lortu zituen euren onarpena. Euskarri teorikorik gabe bazen ere, prozedura hauek nahiko froga ez-zuzenak eman zizkioten “zenbait gaixotasun mikroorganismoek sortzen zutela” zioen teoriari. 1876: Robert Koch-ek karbunkoa bakterio batzuk sortzen zutela frogatu zuen. Erakutsi zuen osasuntsu ziren arratoiak kutsatzen zirela gaixorik zeudenen odola hartuz gero. Ondoren, bakterioak hazi zituen, eta hazkundea behatzen orduz ordu, ikusi zuen baziloak zuntz luze bihurtzen zirela. Euren barruan gorputz obalatu eta errefringenteak agertzen ziren eta hauek beste inguru batetara pasatuz gero zuntzak berriro agertzen zirela.
Entseiu mikrobiologikoak
5
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA Koch-ek egindako esperientziak bat zetozen Henl-k proposaturiko irizpideekin, erlazioa lortzeko mikroorganismo eta gaixotasunaren artean. Irizpideak hauek dira (Koch-en postulatuak):
Mikroorganismoak gaixorik dauden indibiduoengan agertu behar du beti eta ez ondo dauden indibiduoengan. Mikroorganismoa gaixoarengandik lortu eta isolatu behar da hazkuntza puruan. Gaixotasuna agertu behar da garbia den hazkuntza batetik lortutako mikroorganismoa sartzen denean ostalari gaitzikor eta osasuntsu batean. Mikrrorganismoa berriro isolatu behar da esperimentuen bitartez kutsaturiko gaixoarengandik
Koch lehena izan zenez irizpide hauek praktketan jartzen gaur egun Koch-en postulatuak deitzen ditugu. Irudia 4
Urte batzuk pasatuta Pasteur eta Joubert karbunko aztertzari ekin zioten, Kochen lanen berri izan gabe, eta antzeko emaitzak lortu zituzten. Ezer berri ez bazuten gehitu ere, Kochen lanak baieztatu zituzten eta zenbait froga gehitu zituzten erakusteko bazilo hori eta ez besterik karbunkoaren kausa zela. Hurrengo urteetan, Pariseko eta Berlingo institutuak munduko antzindariak bihurtu ziren. Alemaniako eskolak, Kochen zuzendaritzapean, gizakiaren gaixotasun kutsakor garrantzitsuen eragileen isolaketa, kultibo eta ezagupena aztertzeko erabil zuen denbora eta bitartekoak. Frantsesek, beriz, Pasteuren zuzendaritzapean, arazo latzagoari heldu zion: nola gertzen da gaixotasuna animaliaren gorputzean eta nola izaten da osaketa eta nola lortzen du inmunitatea. 25 urtetan, gizakion gaixotasun garrantzitsuen eragileak aurkitu eta ezagutu zituzten eta, beste aldetik, gaixotasunei aurre egiteko metodoak garatu ere. 1892: D. Iwanowsky-k, bakterio baino xikiagoak ziren eragile infekziosoak aurkitu zituen, birusak. Ez zekien zer ziren, baina argi zegoen bizidun talde berezia osatzen zutela, guztiz desberdina bai egitura bai garatzeko era ordurarte ezagutzen zituzten izaki zelularrak
Entseiu mikrobiologikoak
6
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA Irakurgaiak eta irudiak
1. Irakurgaia
Entseiu mikrobiologikoak
7
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA 2. Irakurgaia
Entseiu mikrobiologikoak
8
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA Irudia 3
Entseiu mikrobiologikoak
9
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA 4. Irakurgaia
Entseiu mikrobiologikoak
10
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Entseiu mikrobiologikoak
11
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Entseiu mikrobiologikoak
12
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
mente la madre la que cuenta como primer autor. También, todo lo que alcanza a la mujer -infecci6n, intoxicación, desórdenes nerviosos- tiene el riesgo de que se continúe a través de la descendencia, mucho más que en el caso del hombre. De lo que le resultan a la mujer responsabilidades y deberes par- ticulares hacia sí misma, hacia su propia integridad. En cambio, y por la misma razón, la sociedad tendrá hacia la mujer deberes de protección, de sal- vaguardia y vigilancia. Si es verdad -como decfa Ju1liot de La Moran- diere- que la evolución del papel jurídico de la mujer encuentra tal vez una explicación en el progreso de la biología, está permitido esperar que esta evolución no haya llegado a su término. Sin ir hasta reivindicar para la mujer una primacía que respondería a su prevalencia biológica, estimamos que una igualdad en todos los campos es lo menos que se le debe. La verdad biológica ya ha servido a la causa del sexo femenino; debe servirle todavía.
Entseiu mikrobiologikoak
13
2. Unitatea: IZAKI BIZIDUNEN SAILKAPENA A. Sarrera Izaki bizidun guztiek hiru ezaugarri komun dituzte:
Konposizio berdina Metabolismo desberdinan izan arren, helburuak berdinak dituzte: i. Materia konplexuak (makromolekulak) sintetizatzea (proteinak, DNA,...) ii. Energia lortzea Oinarrizko egitura finkoa: organismo guztiak zelulez osatuta daude
Hiru ezaugarri hauen salbuespena birusak dira, zelularik ez dituztelako. Bestalde, izaki bizidunak hiru taldetan bana daitezke: izaki zelulabakarrak, zelulanitzak eta egitura zenozitikoak B. Antolaketa maila Izaki zelulabakarra: Izaki mikroskopikoak, bakterio gehienak, zenbait alga eta onddo
Izaki zelulanitzak: o Bereizketa gabekoa: Zelula gutxi dituzte Zelula guztiak berdinak dira Koloniak osatzen dituzte Onddo eta alga batzuk o Berezitakoak: Zelula askoz osaturik Zelula desberdinak Zelulak taldeka elkartuta, ehunak osatzen dituzte eta hauek organoak eta hauek aparatuak Egitura zenozitikoa: Organismoa ez dago zelulaz osaturik. Mugarik gabeko masa da. Zelula baten erdibiketatik sortzen da. Erdibiketa nuklearra egoten da, baina ez da ehunik sortzen. Talde garrantzitsuenak mixomizetoak (onddo batzuk) dira.
C. Izaki bizidunen sailkapenerako irizpideak Aristotelen denboretan izaki bizidunak bi erreinutan banatzen ziren: Animalia eta landare erreinuak. Bi erreinuak elkarren artean oso desberdinak ziren, batzuk energia lortzeko materia organikoa eta besteek materia inorganikoa erabiltzen zuten; batzuen mugimendua eta besteen mugimendu eza; klorofila izatea ala ez; karbono iturri desberdina izatea,... XVIII-XIX. mende haseran animalikuluen (mikroorganismoak) aurkikuntzarekin batera beste sailkapen bat egitera bultzatu zuten. Mikroorganismo asko animalia (protozoo) eta landare erreinutan sartu zituzten.
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA Baina mikroorganismo gehiago ezagutzearekin batera beste sailkapen batzuk egin zituzten:
Flagelatu fotosintetikoak o Fotosintesia o Mugimendua Onddo mukiduna o Onddoak o Mugimendua
Taula 1
Esfuerzo final (hacia 1860) para asignar los microorgasnismos a los reinos vegetal o animal
Vegetales
Grupos discutidos
Algas (fotosintéticas) Formas inmóviles Hongos (no fotosintéticos) Bacterias
Animales
Flagelados fotosintéticos Hongos mucosos
Pequeños metazoos Roíferos Nematodos (algunos) Artrópodos (algunos) Protozoos Flagelados no fotosin. Protozoos ameboides
1866an Haeckel-ek hiru erreinutako sailkapena proposatu zuen, hirugarren erreinuan protista izeneko mikroorganismoak sartzen zituelarik. Bereiztu gabeko zelulaz osatutako mikroorganismo zelulanitz eta zelula bakarrak sartu zituen. Taula 2 Grupos que componen los tres reinos de organismos propuestos por Haeckel (1866) Propiedades Vegetales Multicelulares; diferenciación profunda Plantas con semillas de las células y tejidos Helechos
Unicelulares, cenocíticos, o multicelulares; estos últimos con poca o ninguna diferenciación de células y tejidos
Animales Vertebrados Invertebrados
Musgos y hepáticas Protistas Algas, Protozoos, Hongos y bacterias
D. Izaki bizdunen taldeen ezaugarriak Monera erreinua. Organismo prokariotoak dira soilik, beraz, antolaketa zelular prokariotoa duten zelulabakarrak dira denak. Nutrizio mota guztiak
Entseiu mikrobiologikoak
15
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA dituzte, asexualki ugaltzen dira, nahiz eta, material genetikoaren truke soilak bezalako sexualitate-modu oso primitibo batzuk agertu. Bakterioak, zianofizeoak eta mikoplasmak sartzen dira bertan.
Protista erreinua. Organismo zelulabakar eukariotoak dira eta ehun antolaketarik ez duten izaki kolonialez osatuta dago; landareetatik eta animalietatik bereizten dira garapenik ez dutelako, ezta ehunik ere, eta onddoetatik, berriz, beren bizitzako etaparen batean zilioak eta flageloak dituztelako. Erreinu honetan protozooak, beste organismo urtar, eta nahiko ezezagunak diren parasito batzuk eta algak sartzen dira.
Onddoen erreinua (Fungi). Organismo eukariotoak dira, esporaz ugaltzen dira, ez dute garapen enbrionariorik, beren bizi-zikloaren etapa guztietan ez dute ziliorik ezta flagelorik ere eta denek nutrizio heterotrofoa dute. Legamiak bezalako onddo zelulabakarrak eta lizuna eta perretxikoak bezalako onddo zelulanitzak biltzen ditu, baita likenak ere.
Animalia erreinua (Metazooak). Organismo zelulanitz eukariotikoak dira, nutrizio heterotrofoa dute, ugalketa sexuala eta ondoren garapen enbrionarioa; garapen horretan zehar blastula izeneko egoera bat izaten da beti. Erreinu honetan eskuarki animali zelulanitz bezala kontsideratuak izan diren organismoak sartzen dira.
Plantae erreinua (Metafitoak). Organismo zelulanitz eukariotoak dira, nutrizio autotrofo fotosintetikoa dute, ugalketa sexuala eta garapen enbrionario bakuna (ez da blastula egoerara iristen). Belaunaldi alternantzia izan ohi da bi ugalketa-motekin. Goroldioak, iratzeak, gimnospermoak (haziak agerian) eta angiospermoak (haziak estalita – loreak) biltzen ditu.
3. Unitatea: ZELULAK: MOTAK ETA EGITURAK
Entseiu mikrobiologikoak
16
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA 1. Sarrera Izaki bizdunok osatzen gaituen egiturarik txikiena zein den jakiteak jakinmina eragin du historian zehar. Antzinako Grezian hasi ziren arazoei erantzuna emateko teoriak pentsatzen. XVII. Mendera arte oso gutxi aurreratu zuten, proposatutako hipotesiak frogatzeko baliabiderik ez zutelako. 1950. urtean Zacahry eta Francis Janseen-ek lehen mikroskopio konposatua asmatu zuten, tutu batean bi lente ganbil jarrita. Handik urte batzuetara, Robert Hooke-k (1635-1703) mikroskopio konposatua erabiliz, kortxozko xafla mehe batzuk behatu zituen 1665. urtean, eta ikusitakoa deskribatzerakoan hitz ezin egokiagoak erabili zituen: “...argi eta garbi ikusi ahal izan dut xafla zulatuta dagoela erabat, poroz beteta dagoela, abaraska baten antzera. Poro edo zelula horiek ez dira batere sakonak, baina ugariak bai, oso ugariak dira...” Hooke izan zen egitura biologiko bat deskribatzeko zelula hitza erabili zuen lehena. Garai hartan, mikroskopiogileak ziren objetu txikiak behatzen ibiltzen zirenak. Antony van Leeuwenhoek-ek (1632-1723) adibidez, mikroskopi bakun eta garatu gabeak, baina bereizmen handikoak erabiliz, makina bat mikroorganismo aurkitu zituen: infusorioak, algak, onddoak, bakterioak, etab. Malpighi-k (1628-1694) ere hamaika behaketa desberdin egin zituen, kapilarrak, intsektuak, landareak, etab. Brisseau de Mirbel eta Jean Baptiste de Lamarck-ek 1809. urtean eta Henri Dutrochet-ek 1837an, izaki bizidunok zelulaz eratuta geundela esan zuten, eta zelula horiek bizi-funtzio independienteak zituztela. Urte haietan, 1831 inguruan, Robert Brown-ek egindako ikeerketen ondorioz, beste ororkortze nagusi batera iritsi ziren, zelulen barruan nukleoa dagoela aurkitu baitzuten. Teoria zelularra finkatzeko bidea, beraz, eginda zegoen, berandu baino lehen etorriko zena bi biologi alemanen –Matthias Jakob Schleiden (1804-1881) eta Theodor Schwann (1810-1882) biologoen – lanaren ondorioz. Schleidenek landareen zelularen jatorriari buruzko lana argitaratu zuen 1838. urtean eta nukleoak zelularen garapenaren duen zereginari buruzko hipotesia plazaratu zuen. Schawnn bere aldetik, animaliak aztertu zituen. Berak egindako behaketak eta Schleindenek egin zizkion oharrak kontuan hartuta “izaki bizidun guztien oinarrizko zatiak zelulaz osatuta daude” esan zuen 1839. urtean. Schleinden eta Schwannek emandako oinarrizko ideia hori da, hain zuzen, teoria zelularra gauzatu zuena:
Entseiu mikrobiologikoak
17
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA “Animaliak nahiz landareak, independienteki, baina aldi berean batera funtzinatzen duten zelulez eratuta daude”. Zelularen jatorriari buruzko teoria zuzenak agertzeko mikroskopioak hobetu eta tindaketa-metodoetan aurreratu ahala, zatiketa zelulararen nondik norakoaren berri izaten hasi ziren. R. Virchow 1855. urtean “omnis cellula ex cellula” esan zuen. Gaur egun egia unibertsaltzat dugun teoria zelularrak denbora luzea behar izan zuen zientifikoen artean onartua izateko. Walter Flemming-ek zelularen zatiketa-prozesuak ikusi zituen 1879. urtean. Kromosomen kopurua beti berdina dela aurreratu zuen eta zelularen zatiketaz hitz egiteko mitosi hitza erabiltzen hasi zen. Handik urte gutxi batzuetara animali eta landare-zelulen meiosia beste batzuek deskribatu zuten. 1880-1900 urtealdian mikroskopio optikoz ikus zitezkeen organulurik gehienak ikusi zituzten; izan ere, orduantxe hasi baitziren teknikak berriak erabiltzen: tindaketa, ebakidurak, etab. Garai horretan ere, Ramon y Cajal-ek neuronari buruzko teoria plazaratu zuen eta ondorioz, teoria zelularra ehun guztietara zabaldu zen. XX. mendeanren haseran zelularen funtzionamendu ikertzeari ekin zioten. 19301940. hamarkadatik aurrera aurrerapauso handia egin zuten zelularen ezagutzan, tresna berri baten erabilerari esker: mikroskopio elektronikoa. Egitura zelularra ezezik ultraegitura ere ikus zitekeen, hau da, organulu zelularren xehetasun guztiak. Mendearen erdialdean zelularen azterketa biokimikoek eurenganatu zituzten eta gaur egun prozesu zelular guztiak ezagutzen ditugu.
Egitura zelularrari buruzko ezagutzaren kronologia
Aurrerapen teknikoa
Entseiu mikrobiologikoak
Urtea
Ideien aurrerapena
18
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA Mikroskopio konposatua
Malpighi eta Leeuwwenhoek-en lanak Mikroskopio bidezko behaketa Nukleoa ikustea Dolland-ek lente akromatikoak asmatu
Lehen mikroskopio konposatu akromatikoa
1590 1665 1670 1680 1750 1760 1780
Zuntz-teoria
1827
Teoria zelularraren aitzindari izango diren lehen ideiak Brown-ek nukleoa deskribatu
1833 1838 1839 1840
Abbe-k mikroskopioari zenbait hobekuntza Teknika mikroskopikoen aurrerakada handia Zeiss-ek lente berriak asmatu Lehen mikroskopio elektronikoa Fase-kontaste bidezko mikroskopioa Teknika berrien garapena: zentrifugazioa, zitokimika,... “Microscopio electrĂłnico de barridoâ€? Kriohausturako mikroskopio elektronikoa Teknika berriak.....
Entseiu mikrobiologikoak
Hook-ek zelula deskribatu Espermatozoideak deskribatzeko animalkulu hitza erabili
1855 1879 1880 1900 1931 1933
Besikula-teoria
Schawnn eta Schleiden-ek teoriazelularra formulatu Purkinje-k proptoplasma terminoa erabiltzen hasi Virchow-ek zelula oro beste zelula batetik datorrela esan Flemming-ek mitosia deskribatu Plastoak, mitokondriak eta Golgiren aparatua deskribatu Sutton-ek gen-kromosoma harremana ezarri Organulu berriak deskribatu Organulu desberdinen funtzioa
1955 1965
Mintz plasmatikoaren eredua
1979 1980 1990
Organuluen ultraegitura
19
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA ZELULA EUKARIOTA: a.- Organuloak: Eukariotak diren zeluletan DNA mintzez inguraturik dago, nukleoa eratuz. Zitoplasma organulo zelular desberdinetan oso aberatsa eta ugaria da. Era honetako antolaketa ondorengo erreinuetan agertzen zaigu: Protista, Fungi, Landare eta Animalia.
Argazkiak konparatu Ondorengo irudiak kontutan hartuz erantzun itzazu ondoko galderak:
A
1.-
Zein da handiena?
2.-
Zein da konplexuena?
3.-
Zeinek dauka nukleoa?
4.-
Zein da zelulabakarra?
5. 6.-
B
Zer organismo izan daiteke A argazkikoa? Bakterioa Beste izakiren bat
Zer organismo izan daiteke B argazkikoa? Bakterioa Beste organismoren bat
Zelula eukariotak bizi forma eta mota (landare eta animalia) guztietan komunak diren organuloak dituzte:
Entseiu mikrobiologikoak
20
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Animalia eta Landare zeluletan agertzen diren organuloak Organuloa
Irudia
Funtzioa
Mintz Plasmatikoa
Proteina eta fosfolipidoz osaturiko geruza da. Kanpo eta barne inguruak bereizten ditu eta elkartrukeak kontrolatu egiten ditu.
Zitoplasma
Zelularen barne medioa da. Bertan, metabolismo zelularra eta molekulen mugimendua burutzen da.
Nukleoa
Mintzez inguraturiko zonaldea nukleoplasma eta DNAz osaturik nagusiki.
DNA (Kromosoma)
Kondentsatutako DNA genetikoa biltzen dute.
Mitokondria
Arnasketa zelularra egiten dute. Materia organikoa ATPan bilakatzen dute (energia)
Entseiu mikrobiologikoak
zuntzak
dira.
Informazio
21
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Erribosoma
Proteinak sintetizatzen dituzte (itzulpena).
Erretikulu endoplasmatikoa
Erribosometan sortutako proteinak garraiatu eta bildu egiten dute. Baita ere, lipidoak sintetizatzen ditu, eta, mintz nuklearra eratzen dute.
Golgi aparatua
Erretikulu endoplasmatikotik jasotako proteinak bildu eta sailkatu egiten ditu. Pareta zelularra eratzen du. Lisosomak sortzen ditu.
Besikulak
Golgi eta Erretikuloan jatorria duten eta sustantzia biltzen dituzten esfera txikiak dira
Lisosomak
Digeri entzimak biltzen dituzten mintzez inguraturiko esfera txikiak. Eurei esker elikagaiak digeritu egiten dira.
Pareta Zelularra
Landare zelulari babesa, euskarria eta egitura mantentzen laguntzen dio. Zelulosaz osaturiko mintzez egina dago.
Kloroplastoa
Fotosintesia egiten duen organuloa: materia inorganikoa materia organikoan bilakatzen da.
Entseiu mikrobiologikoak
22
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Zentrioloak
Zilioa eta flageloak eratzen dituzten mikrotubulo zilindrikoen multzoa. Animali zeluletan zatiketa zelularrean parte hartzen du.
Amiloplastoak
Fotosintesia sortutako almidoia biltzen duen organuloa.
Zilioak Flageloak
eta
Bakuolak
Forma
Mugimendu zelularra eragiten duten organuloak dira.
Erreserba sustantziak edo hondakinak biltzen ditu. Animalietan aldakorra eta landareetan prismatikoa.
b.- Animali eta landare zelula:
Entseiu mikrobiologikoak
23
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Aurrekoaren laburpen gisa zera esan dezakegu: Landare zelulak erregularragoa eta prismatikoagoa den forma erakusten duela, animali zelulak oso aldakorrak diren formak agertzen duten neurrian. Organuloak ere desberdinak dira: landareak kloroplastoak, pareta zelularra, amiloplastoak eta zitoplasmaren bolumenaren gehiena okupatzen duen bakuola handi bat dute. Animali zelulak aurreko organulorik ez du eta bai ordea zentrioloak eta lisosomak.
PRAKTIKETAKO PROGRAMA Entseiu mikrobiologikoak
24
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Segurtasun neurriak mikrobiologiako laborategian araudia PRAKTIKAK Kultibo-medioen prestaketa Mikroorganismoen ereinketa eta kultiboa Mikroorganismoak ingurugiroan Mikroorganismoen isolaketa eta identifikazioa lagin batetatik Mikroorganismoen behaketa
MIKROBIOLOGIA LABORATEGIAN JARRAITU BEHARREZKO ARAU OROKORRAK
Entseiu mikrobiologikoak
25
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA 1. Liburu, poltsa eta arropa guztia lan-eremutik at egon behar dute. Lan-eremuan, lanerako beharrezkoak diren gauzak soilik egon daitezke (koadernoak, protokoloak, lanerako tresnak), eta ahal bezain garbi, ordenatu eta huts mantenu behar da lan-eremua. 2. Bata eraman beharra dago, era hortan gu eta gure arropak babestuko baititugu (bai kontaminazioa eta bai koloratzaile eta substantzia kimikoen ekintza). Ez irten laborategitik laborategiko batarekin (kafea hartzera, hitzegitera, klasera...). 3. Laborategian jatea (txiklea mastekatzea barne), edatea edo erretzea debekatuta dago. Ekiditu eskuak zein beste edozein objektu ahoratzea. Ez haginka egin boligrafoari. Ez ikutu aurpegia, begiak etabar. 4. Ezer egin baino lehen, protokoloa irakurri. Zer egin behar den eta nola egin behar den aurrez jakiteak istripuak gutxitzen ditu eta denbora hobeto erabiltzea baimentzen du. 5. Praktika egun bakoitzaren hasieran azalpen labur bat emango da. Ez hasi lanean azalpenak eta protokoloa irakurri baino lehen. Metodoa edo esperimentuaren helburua ulertzen ez duzunean, galdetu irakasleari. 6. Praktika hazterakoan desinfektatu lan-eremua desinfetatzailearekin (desinfektatzailea paperezko toaila batekin zabaldu mahai gainean eta lehortzen utzi). Prozedura bera errepikatu lana amaitutakoan. Praktika amaitzean mahaia txukundu. 7. Erabilitako gauza guztiak izen, talde, data eta experimentuarekin errotulatu, era hortan materilaren erabilera ez-zuzena ekidituko baitugu. 8. Lanean zehar, kontaminazioak erraz ditzaketen aire korrenteak ekiditu . Saio-hodi esterilak edo kultibodunak gradilatan bertikalki mantendu behar dira. Sekula ez mahai gainean etzanda. 9. Praktiketan egindakoaren ohar guztiak laborategiko koadernoan idatzi. 10.Kontuz metxeroekin , batez ere metxeroaren bestaldean dagoen zerbait hartu nahi
Entseiu mikrobiologikoak
26
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA denean. Istripuak ekiditzeko, itzali metxeroak beharez direnean. 11.Kontaminatutako materiale guztia eta erabiliko ez diren kultibo guztiak garbitu edo bota baino lehen, esterilizatu beharra dago. Esterilizatu beharreko materialea ontzi egokietan utzi. Pipetak, portak eta kubreak mahaietan dauden lixibiadun untxietara botako dira. 12.Paperak, poxpoloak eta beste material ez kutsagarriak sakar-ontzira botako dira. Inoiz ere ez, harraskara. 13.Laborategitik atera baino lehen, bai aldi batez edo behin-betiko, eskuak xaboi germizidaz garbitu behar dira. 14. Edozein istripu edo arazoren aurrean (ebaketak, erredurak, kultiboen isurketak...), irakasleari jakinarazi berehala dagokion neurriak har daitezen.
KULTIBO MEDIOEN PRESTAKETA Kultibo-medioak: laborategian mikroorganismoak hazteko erabili daiteken edozein sustantzia (solido edo likidoa) da; Kultibo medioaren konposaketan sustratu natural bat (odol plasma edo esnea adibidez) edota gatz eta sustantzia kimikoen kontzentrazio ezagunak parte har dezakete. Jatorriaren arabera kultibo-medioak talde desberdinetan sailka daitezke: Konplexua: honen konposaketan liseritutako konposatuak, landare edo animali ehunen estraktuak, kaseina... auki daitezke. Mikroorganismoak hazteko beharrezko dituzten elementu guztiak egongo dira, nahiz eta konposaketa eta kontzentrazio
zehatzak
ez
ezagutu.
Definitua : kontzentrazio ezagunean aurkitzen diren sustantzia kimiko puruez osatutako kultibo medioa. Hazkuntzarako beharrezko diren konposatu guztiak egongo dira, hauek desberdinak izan daitezkeelarik mikroorganismoaren behar
Entseiu mikrobiologikoak
27
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA nutrizional konkretuen arabera. Guztiek eskeintzen dute ura, energi iturria (adibidez karbohidratoak eta gatz ezorganikoak), konposatu nitrogenatuak eta hazkuntzarako beste faktore batzuk.
Kultibo medioa solidoa bada, solidifikatzaile bezala agarra erabiltzen da (nahiz eta beste batzuk ere erabil daitezken agarra ez denean egokia, adibidez, mikroorganismoak agarra erabiltzeko ahalmena duenean). Ezin formula daieteke mikroorganismo guztien hazkuntza baimen dezakeen kultibomedioa. Hala ere, Mueller-Hinton agarra bezalako kultibo medio konplexuetan bakterio askok hazteko gaitasuna dute eta horregatik sarritan erabiltzen dira. Mikroorganismoen isolaketa eta identifikaziorako kultibo-medio hautakorrak edota bereizgarriak erabiltzen dira. Medio hautakorren konposaketan parte hartzen duten konposaturen bat edo gehiago zenbait mikroorganismoren hazkuntza inhibitzeko ahalmena izango dute, eta ondorioz, mikroorganismo edo mikroorganismo-talde konkretuen hazkuntza soilik gertatuko da. Hauen artean ditugu: MacConkey agarra, Manitol agarra eta beste asko. Kultibo-medioetan hazi ondoren mikroorganismoen itxuraren arabera (kolonien tamaina, kolorea, distira, ertzaren izaera...) espezie ezberdinak daudela antzeman dezakegu. Hala ere, mikroorganismo askok kolonia desberdinezinak ematen dituzte. Kultibo-medio bereizgarrietan ordea, nahiz eta koloniaren itxura berdintzua izan, kolonien arteko bereizketa lortuko dugu. Medio bereizgarri hauetan, hazkuntzan zehar, erreakzioren batek koloniaren kolorea edo beste ezaugarriren bat aldaerazi dezake erreakzio positiboa eta negatiboa duten koloniak bereiztuko ditugularik. Kultibo-medio solidoen prestaketa Medio deshidratu batetatik abiatuz prozedura orokora honako hau litzateke: 
Medio deshidratatua pisatu
Entseiu mikrobiologikoak
28
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Ur destilatua gehitu
Nahasketa irakin
Autoklabatu
Hontzietan banadu
Agarra duen kultibo-medioa Petri kutxatiletan prestatu nahi badugu, prosedura aipaturikoa litzateke. Medioa saiodietan nahi dugunean, nahasketa irakin eta autoklabatu baino lehen saiodietan banaduko dugu. Agarra ez duten medioek normalki ez dute irekin beharrrik.
Laborategiko balantza arrunta
Irabiagailu magnetikoa duen plaka
Kultibo-medioaren pH-a finkatzeko,
Entseiu mikrobiologikoak
29
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA batzutan pHmetroa erabili beharko dugu.
Kultibo medio solidoak prestatzeko medioa saiodiaren barruan dagoela esterilizatzen da autoklabean, eta ondoren erdi etzanda solidifikatu arte utziko dugu. Era hortan ereintza-azalera handiagoa izango da.
MIKROORGANISMOEN EREINKETA ETA KULTIBOA Laborategian mikroorganismo baten azterketarako, beharrezkoa izaten da gehienetan mikroorganismoa kopuru handitan lortzea, hau da, mikroorganismoaren hazkuntza kultibo-medioan lortzea. Behin kultibo-medio egokia aukeratu ondoren, mikroorganismoa bertan ereingo dugu. Honetarako, inokulazioa egiten denean, teknika aseptikoa erabili behar da, era hortan kutsadurak ekidingo direlarik. Erabili beharreko tresna guztiak aldez aurretik esterilizatu egin behar dira
eta
prozesu
osoa
suaren
ondoan
egin
behar
da.
Mikroorganismoen transferentzia ereintza-euskarri bati loturiko platino edo kromo-nikelezko alanbre batekin egin daiteke. Alanbre honek diametro txikiko kiribila izango du muturrean. Ereinketa
Kutsadura ekiditzeko maiz fluxu laminarreko kanpaietan egiten da lana.
ziztadaren bidez egiten bada, ordea, kiribilik ez da egongo eta ereintz-euskarriaren alanbrea zuzena izango da.
Entseiu mikrobiologikoak
30
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Ereinketa Ereinketa saiodietan edo Petri kutxatiletan egin daiteke. Saiodien kasuan kultibo-medio solido edo likidoa erabil daiteke. Solidoa deneko kasuan, lortu nahi dugun helburuaren arabera, ziztadaren bidezko ereinketa edo azalekoa erabiliko da. Azken kasu honetan agar inklinatua duten saiodiak erabiltzen dira. .
Ereintza-euskarria suaren gainean ia bertikalki jarri behar da gori-gori jarri arte. Honela euskarriaren luzera osoa esterilizaturik geratuko da.
Esterilitate baldintzak ez galtzeko beti suaren ondoan egin beharko dugu lan. Saiodi batean mikroorganismoen kultiboa izango dugu, hau ezkerreko eskuarekin hartu, eskubiko eskuko atzamar txikiarekin tapoia kendu eta suaren ondoan mantendu behar da. Saiodiaren ahoa suaren gainetik pasatu, esterilizatutako ereintza-euskarria saiodian sartu eta segundu batzuz, beirarekin kontaktuan dagoela, hozten utziko da. Behin hotzituta, inokuloa hartuko dugu, euskarria saioditik etara eta berriro ere saiodiaren ahoa sutatik
Entseiu mikrobiologikoak
31
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA pasatu eta itxi egingo dugu. .
Inokulatu nahi dugun saiodia hartu, ireki, ahoa sutatik pasatu eta zelulak dituen ereintza-euskarria saiodiaren hondoraino sartu behar da. Ondoren, euskarria ateratzen gaudenean zigi-zaga egingo dugu kultibomedioaren azalean. Amaitzeko, hodiaren ahoa sutatik pasatu eta tapatu egingo dugu. Ereintza-euskarria ere sutatik pasatu behar da bertan dauden mikroorganismoak hiltzeko
Ereinketa Petri kutxatilan egitean pausu berdinak jarraitu behar dira. Kutxatilak suaren ondoan ireki beharko dira esterilitatea mantentzeko. Kultibo-medioa likidoa denean inokuloa (euskarrian dauden zelulak) medioan murgildu beharko da. Ereinketa egiteko beste modu batzuk: 1. Ziztadaren bidezko ereinketa. Zenbait teknika diagnostikotan erabiltzen da. Eukarriaren alanbrea zuzena izango da eta medioa ziztatzeko erabiliko da.
Entseiu mikrobiologikoak
32
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Ereintza-euskarri arrunta eta ziztadaren teknikan erabiltzen dena; lehenak kiribil bat du puntan, eta bigarrenean alanbrea zuzena da
2. Kutxatiletan ildoango ereinketa. Kultibo-medio likido zein solido batetatik abiatuz inokuloa euskarrirekin hartu eta Petri kutxatilak zigi-ziga eginez inokulatuko ditugu.
Ereinketa egiterakoan ereintza-euskarriarekin zigi-zaga mugimenduak egiteko euskarria ahal bezain horizontalen erabiliko dugu, era hortan agarraren apurketa gutxitu egingo baita.
Ereinketa hontatik abiatuz murrizketa bidezko ereinketa egin daiteke. Kasu hontan asmoa kolonia isolatuak lortzea litzateke. Murrizketa bidezko ereinketa: 1. Inokuloa ildoango ereinketaren bidez kutxatilaren albo batetan erein (marra gorriak). Ondoren euskarria esterilizatu. 2. Euskarri esterilarekin ildoango teknikaren bidez marra urdinak egin. Asmoa marra gorrietako microorganismo batzuk (marra urdinekin ikustzen ditugunak) azalera handiago batetan sakabanatzea da. 3. Prozedura berdina jarraituz marra laranjak eta urdin argiak egin
Entseiu mikrobiologikoak
33
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA (euskarria esterilizatu marra berriak egin baino lehen). 4. Kutxatila tenperatura egokian inkubatu hondoren hazkuntza gertatuko da eta kolonia isolatuak garatuko dira.
3. Hedadura bidezko ereinketa. Kasu hontan mikroorganismoak likidoan suspendituta egongo dira eta Petri kutxatilen gainazal osoa inokulatuko dugu likido horrekin. Pipeta esterilak erabili behar dira, hauen bidez, mikroorganismoak dituen likidoaren bolumen jakina (0.1-0.2ml) hartu ahal izateko. Hartutako bolumena kutxatilako agarraren gainean kokatuko dugu. Inokulua beirazko euskarri batekin heda daiteke (Digradsky euskarriarekin). Beirazko euskarria esterilizatzeko alkoholarekin buzti eta euskarria sugarretik igaroko dugu alkohola erre dadin (esterilitatea ziurtatzeko hiru aldiz erreko dugu). Ereinketa metodo honek lagineko mikroorganismo bizien kopurua ezagutzeko balio du (kolonia formatzaileen unitateak edo ufc). 4. Sakonerako ereinketa. Laginaren bolumen jakin bat (mililitro bat adibidez) agarra duen eta baina solidifikatu gabeko kultibo-medioarekin (demagun 15 mililitro) nahastuko dugu (agar duen kultibomedioa autoklabean esterilizatu ondoren tenperatura hortan likido egoeran aurkituko dugu. Tenperatura jeistean agarra solidifikatu egingo da). Nahasketa irabiatu eta Petri kutxatila esteriletara botako dugu. Ondoren mahai gainean zortzi itsurako mugimenduak egingo ditugu apur batez (nahastu eta kutxatila osoan heda dadin). Agarra solidifikatzean mikroorganismoak agarraren barruan hasi eta kolonien kontaketa egin ahal izango da. 5. Suspentsioaren bidezko ereinketa, ingurune likido batetik beste ingurune likido batetara.
Entseiu mikrobiologikoak
34
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA Inkubazioa Kultiboak, aztertzen ari garen mikroorganismoaren tenperatura optimoan inkubatu behar dira hazkuntza egokia lortu ahal izateko. Petri kutxatilak inkubatzean alderantzizko posizioan jarri behar dira, horrela kondentsatziorik ez baita gertatuko goikaldean eta kondentsazioko tantak ez dira kultiboaren gainean eroriko. Tenperaturaz aparte, mikroorganismoen oxigeno beharra kontutan hartu behar da. Mikroorganismoa anaerobio bada, esterila den parafinarekin estali daiteke.
Berogailuak mikroorganismoen inkubazioa tenperatura egokian egiteko erabiliko dira.
Berogailuaren barruan Petri kutxatilak agarra goialdean dutela inkubatuko dira.
Entseiu mikrobiologikoak
35
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
MlKROORGANISMOAK INGURUGIROAN Laborategia, beste edozein girotan bezala, mikroorganismo askorekin kolonizatuta dago. Mikroorganismo hauek airean edo gainazaletan itsatsiak egon daitezke. Mikrobiologoek, kontutan hartu behar dute ingurugiroko kutsadura lanerako erabiltzen dituzten materialak kutsatu ez daitezen. Lehenengo praktikan, gure lan postuan dauden ingurugiroko baldintzak aztertuko ditugu. Materiala: 1. TSA edo CPA agar elikagarria duten Petri kutxatilak 2. Hisopo edo torundak Prozedura:
Bi kutxatila erabiliko ditugu: o
Bata mahaiaren gainean zabalik utxiko dugu 30 minutuz. Ondoren kutxatila itxi eta berogailuan inkubatuko dugu. Airean mikroorganismoak dauden detektatzeko erabiliko dugu proba hau.
o
Torunda bat mahaiaren gainazaletik igaroko dugu (100 cm2 inguru) eta bigarren kutxatila hedaduraz inokulatzeko erabiliko dugu (kontuz ibili agarraren hausketa ekiditzeko).
Kutxatilak 37° C-tan 18-24 orduz inkubatuko ditugu
Kutxatilak aztertu eta kolonien tamaina, itxura eta kolorea deskribatu. Lortutako kolonia kopurua UFC edo Kolonia Eratzaileen Unitateen Kopuru dela esango dugu.
Kolonia batzuren GRAM tindaketa egin morfologia aztertzeko.
Entseiu mikrobiologikoak
36
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Torundarekin laginaren ereinketa egiten.
MIKROORGANISMOEN ISOLAKETA ETA IDENTIFIKAZIOA LAGIN LIKIDO BATETATIK ABIATUZ Ingurugirotik hartutako lagin gehienek, mikroorganismoen populazio mixtoak dituzte. Lagin hoietan dauden mikroorganismoen ezaugarri espezifikoak aztertu baino lehen, beharrezkoa da, populazio mixto hoietan dauden espeziek kultibo puruan isolatzea. Behin mikroorganismoak isolatuta daudenean, zenbait proba biokimikoren bidez identifikatuko ditugu.
ISOLAKETA
Isolaketarako beharko dugun materialea honako hau da: MacConkey eta Manitol agarra kultibo-medio hautakorrak dituzten plakak. Agar nutritibo ez selektiboa
Entseiu mikrobiologikoak
37
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA (TSA edo CPA) dituzten
Lanpostuan aurkituko ditugu behar ditugun materialeak
plakak. Kultibo mixtoa duen lagin problema.
Entseiu mikrobiologikoak
38
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Entseiu mikrobiologikoak
39
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA Jarraitu beharreko metodoa:
Mikroorganismoen suspentzio bat izango dugu, eta suspentzio hortan aurkitzen diren mikroorganismo desberdinak isolatzeko bi kultibo medio inokulatuko ditugu. Bikote bakoitzak honako hauek izango ditu: Mikroorganismoen suspentzio bat (lagin-problema), 2 Petri kutxatila McConkey kultibo-medioarekin eta 2 Petri kutxatila Gatz-manitol kultibo-medioarekin Murrizketa bidezko ereinketaren bidez kultibo medio hautakorra duten kutxatilak ereingo dira , eta tenperatura egokian inkubatu 24 orduz Kultibo puruak ditugula baieztatzeko normalean berrereinketak hiruzpalau aldiz egin behar izaten dira, baina gure kasuan McConkey-an bi berrereinketa egongo ditugu (ez bait dugu denborarik berrereinketa gehiago egiteko): 
Esperimentuaren lehen egunean mikroorganismoen suspentziorekin bi McConkey kutxatila inokulatuko ditugu.

Inkubazioaren ondoren, bigarren egunean, bi motatako koloniak egertu beharko lirateke: kolonia laktosa positiboak eta kolonia laktosa negatiboak . Lortutako bi kolonia isolatuak aukeratu (kolonia bat laktosa positiboa eta bestea laktosa negatiboa) eta berrereinketa egingo dugu McConkey kutxatila berri banetan murrizketa bidezko ereinketaren teknikaren bidez.
Gatz-manitolean kasuan kultibo bakarra egingo da. Normalean ereinketa bakarrarekin ez genuke isolaketa ziurtatuko, baina mikroorganismoen suspentzioa irakaslearentzat ezaguna da, eta kontutan izanik suspentzioa osatzen duten mikroorganismoak, kontaminaziorik ez badago ez litzateke arazorik egon beharko kultibo bakarrean isolaketa lortzeko (gainerako mikroorganismo motak ez lirateke haziko). Medio hontan ez da
Entseiu mikrobiologikoak
40
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA berrereinketarik egingo mikroorganismoen suspentziotik abiatuz haz daitezkeen mikroorganismoek hazkuntza geldoa aurkezten dutelako (48 orduz inkubatu beharko ditugu kutxatilak), eta ondorioz ez genukeelako denborarik izango berrereinketak egiteko.
Isolaketa prosesuaren ondoren, experimentuaren hirugarren egunean honako kultibo hauek izan beharko genituzte: Bi MacConkey Petri kutxatila Bata kolonia laktosa positiboak dituena Bestea kolonia laktosa negatiboekin
Bi Gatz-Manitol kutxatila koloniekin.
McConkey Agarra Kultibo-medio hautakorra eta bereizgarria da. Petri kutxatiletan izango dugu. Medioaren konposagaien artean honako hauek ditugu: Gatz biliarrak eta kristal-bioleta : bakterio Gram positiboen hazkuntza) eta zenbait Gram negatibo sentikorrena) inhibitzen du. Ondorioz, Gram negatiboak hasiko dira. Laktosa eta Glukosa 10:1 proportzioan. Mikroorganismo gehienek glukosa erabiltzeko gaitasuna dute, eta gutxi batzuk laktosa ere erabili dezakete. Mikroorganismoek glukosa soilik erabiltzen badute glukosaren hartzidura egitean konposagai azido gutxi ekoiztuko dituzte. Aldiz, glukosa eta laktosa erabiltzen badute, hartziduran konposatu azido asko ekoiztuko
Entseiu mikrobiologikoak
41
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA dituzte. pH indikatzailea. Koloniak azido asko ekoizten badituzte kolore gorria izango dute (hots, laktosa erabiltzen dutenean). Ekoiztutako azido kopurua txikia denean koloniak zuriak izango dira.
MacConkey agarrean hazitako koloniak. Kolonia zuriak laktosa negatiboak dira, eta kolonia gorriak laktosa positiboak.
Manitol-gatz agarra Kultibo-medio hautakorra eta bereizgarria da. Petri kutxatiletan izango dugu. Medioaren konposagaien artean honako hauek ditugu: Kloruro sodikoaren kontzentrazio altua (7.5%). Gatz kontzentrazio altua jasan dezaketen mikroorganismoak soilik haziko dira. Manitola. Manitolaren hartzidura ematen bada azidoak ekoiztuko dira kopuru handitan. pH indikatzailea. Medioa berez gorrizka da, eta manitol positiboak diren kolonien inguruan halo horia ikusi ahal izango dugu (azidoen ekoizpenaren ondorioz).
Entseiu mikrobiologikoak
42
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Hazkuntzaren ondoren kolonia manitol positiboen inguruan halo horia eratuko da. Halo horiaren hedapena gerta daiteke kutxatila osoa hori gera daitekeeelarik.
Entseiu mikrobiologikoak
43
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
IDENTIFIKAZIOA Identifikaziorako, lehenengo aztertu egingo ditugu gure kultiboak puruak diren beieztatzeko.
Gram tintaketaren bidez, kolonien morfologia zelularra aztertuko dugu. 
Kolonia isolatu bana aukeratuko dugu McConkey agarrean kutxatila bakoitzetik. Kolonia hori zelula bakarraren hazkuntzaren ondorioa izanik, kolonia hortan agertuko diren organismo guztiak berdinak izan beharko lirateke. Horrela izanik kolonia bakarraren Gran tindaketa egiten badugu zelula guztiek Gram tindaketarekiko emaitza berdina eman beharko da (zelula guztiak edo Gram positibo edo Gram negatibo izango dira), eta morfologia berdina aurkeztuko dute (denak bazilo, koko edo beste morfologiaren bat izango dute, baina denak morfologia bakarra izango dira). Horrela ez balitz, berereinketak egin beharko genituzke.

Gauza berdina gertatu bejarko litzateke Gatz-manitol agarrarekin.
Kultibo puruak ditugula baieztatu ondoren, proba biokimikoak egingo ditugu. McConkey agarreko koloniak proba biokimikoak egin baino lehen kultibo medio ez selektiboan kultibatuko ditugu (TSA edo CPA). Arrazoia oso simplea da: kultibo-medio hautakorretatik abiatuz egiten baditugu proba biokimikoak, gerta daiteke proba biokimikoen emaitzak aldatzea (baldintza ez estandarrak erabiltzen ditugulako).
Lagin probleman dauden bakteria mota ezberdinak isolatu eta medio ez-hautakorrean hazi ondoren, identifikaziorako beharrezkoak diren froga biokimikoen bateriak egingo dira. Zein proba egingo den erabakitzeko dagokion eskema jarraitu.
Entseiu mikrobiologikoak
44
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA Honako proba biokimiko hauek egin ditzakegu:
Katalasaren proba. Karbohidratoen metabolismo oxidatzaile aerobikoan amaierako produktuetariko bat ur oxigenatua da (H2O2). Produktu hau toxikoa izanik, mikroorganismoek konposatu hau suntsitzeko metodoak dituzte, hauen artean katalasa entzimaren ekintza dagoelarik. Katalasak honako erreakzioa burutuz ur oxigenatua suntzitu egingo du: H2O2 ---------> H2O + 1/2 O2 Katalasa mikroorganismo aerobio eta aukerazko anaerobioetan egoten da, eta ez dugu aurkituko aerotoleratzaileetan (azido laktikoaren bakterioak) eta anaerobioetan.
Proba hau egiteko, porta baten gainean eta ur tantakarik gabe, aztertu nahi ditugun mikroorganismoak jarriko ditugu (ereintza-euskarria erabiliko dugu Petri kutxatilatik portara mikroorganismoen transferentzia egiteko). Ondoren ur oxigenatuaren diluzioa gehituko dugu mikroorganismoen gainean. Burbuilak azalduko balira adierazitako erreakzioa ematen dela esango genuke, hots, mikroorganismoak katalasa entzima daukala.
Oxidasaren proba. Arnasketa kate aerobioan c zitokromoa duten mikroorganismoak identifikatzeko erabiltzen da (enterobakterioek ez dute, eta Pseudomona-k bai).
Proba hau egiteko jadanik prestatuta dauden erreaktibo kometzialak erabiliko ditugu. Ereintza-euskarriarekin mikroorganismoen kolonia bat hartuko dugu eta erreaktiboak dituen paperrraren gainean jarriko ditugu (urik gabe). Paperaren kolorea zuria izatetik urdina izatera igarotzen bada proba positiboa dela esango dugu (mikroorganismoa
Entseiu mikrobiologikoak
45
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA oxidasa positiboa dela).
Koagulasaren proba. Odolean fibrinogenoa dago, eta mikroorganismo batzuk fibrinogenoa polimerizatu eta fibrina sortzen duten entzimak dituzte. Proba hontan entzima hori duten mikroorganismoak identifikatuko ditugu. Proba komertziala izango da, eta kontrol positiboa eta negatiboa izango ditu. Koagulasa entzimaren presentzia birulentzia faktorea da.
Proba hontan latex bolatxoak izango ditugu fibrinogenoarekin estalita. Mikroorganismoa kultibo-medio solidotik ereintza euskarriarekin hartu eta dagokion tanpoiaren tanta batetan suspendituko dugu. Ondoren latex bolatxoen tanta bat gehituko ditugu. Mikroorganismoa eta bolatxoak nahastu eta minutu pare batez mugitu egingo ditugu (errotazio mugimendua). Mikroorganismoaren paretan koagulasa entzima egonik latex bolatxoak bildu egingo dira eta bikorrak azalduko dira.
Koagulasaren proba komertziala: Goian ezkerrean, kontrol positiboa. Goian eskuman, kontrol negatiboa. Behean ezkerrean, lagin positibo bat. Behean eskuman, hutsik.
Entseiu mikrobiologikoak
46
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Proba biokimikoen bateria saiodietan. Inokulatu gabeko saiodiak. Ezkerretik eskumara: indolaren proba, urearen proba, Metilo gorriaren proba, Vorgues-proskauer proba, Zitratoaren proba, KIA multi-proba medioa.
Entseiu mikrobiologikoak
47
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
IMViC. Lau proba biokimikoz osoturiko proba da eta enterobakterioen desberdintzapenerako erabiltzen da. Probak honako hauek dira:
Indolaren proba (I).
Proba hau egiteko behar den kultibo-medio likidoa (salda) saiodian izango dugu. Medio inokulatu eta berogailuan inkubatuko dugu 37째C-tan 24 orduz. Ondoren Kovacs erreaktiboa gehituko dugu kontu handiz kultibo medioaren gainean kokatuko delarik erreaktiboa (erreaktiboa oliotsua baita). Interfasean eraztun gorria eratzen bada mikroorganismoak medioan dagoen triptofanoaren degradazioz indola ekoiztu duela adieraziko du. Kolore aldaketarik ez bada ematen proba negatiboa izango da.
Metilo gorriaren proba (M).
Saiodian MR-VP salda (Metilo gorria-Vorgues-Proskauer salda) izango dugu. Indolarekin bezala inokulatu, inkubatu eta irakurketa egiteko MR erreaktiboa gehituko dugu. Erreakzio gorria izanik proba posiboa izango da. Negatiboan ez da kolore aldaketarik emango.
Vorgues-Proskauer proba (V).
Saiodian MR-VP salda izango dugu (Metilo gorriaren proban ere medio berdina da). Inkubazioaren ondoren VP1 eta VP2 Erreaktiboak gehituko dira eta proba positiboa izanik kolore gorria emango du. Negatiboan ez da kolore aldaketarik emango Metilo gorriaren proban eta Vorgues-Proskauerren proban enterobakteriak burutu
Entseiu mikrobiologikoak
48
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA dezakeen hartzidura mota aztertzen da. Hatzidura bi motatakoa izan daiteke: hartzidura azido-mixtoa edo hartzidura butilenglikolikoa. Lehen kasuan azidoen ekoizpen garrantzitsua gertatzen da eta ondorioz Metilo gorriaren proba positiboa irtetzen da (azidotasun aldaketa bortitsa detektatzen da). Hartzidura butilenglikolikoan ez da azidoen ekoizpen garrantzitsurik ematen eta besteak beste, azetoina ekoizten da. VorguesProskauerren proban erreaktiboak gehitzean azetoinaren presentzia detektatuko dugu. Metilo gorriaren proba eta Vorgues-Proskauer proba ezin dira biak batera positibo izan.
Zitratoaren proba (C).
Saiodian zitratoa duen medioa solidoa daukagu. Jatorriz medioa orlegia da eta inokulazioaren eta inkubazioaren ondoren mikroorganismoak zitratoa erabiltzeko gaitasuna badu kolore aldaketa emango da (medioa urdina bilakatuko da).
Entseiu mikrobiologikoak
49
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Urearen proba. Salda hontako kultibo-medioak urea izango du (NH2-CO-NH2 ). Mikroorganismoak urea erabiltzeko gaitasuna izanik, amonioa askatuko da eta ondorioz pH aldaketa emango da (pH-a gehitu egingo da nabarmenki, eta medioaren kolorea gorria bilakatuko da). Kolore aldaketa ematen bada proba positiboa dugula esango dugu.
KIA (Kligler Iron Agar) muti-proba kultibomedioa. KIA medioa multi-proba medioa dela esango dugu zenbait gauza desberdin jakiteko erabili ahal daitekeen medioa delako. Medio solidoa da eta siodietan izango dugu (argazkian, inolkulatu gabeko medioa ezkerraldekoa da).
Medioa ziztadaz inokulatu eta ondoren zigi-zaga egingo dugu medioaren azalean.
Besteak beste, medioko osagaien artean honako hauek daude:
sulfato ferrosoa
glukosa kontzentrazio baxuan
laktosa kontzentrazio handitan
pH indikatzailea daude.
KIA
Mikroorganismoak sulfatoa elektroi hartzaile bezala erabiltzeko gai bada arnasketa anaerobioaren bidez, sulfidrikoa ekoiztuko da, eta
Entseiu mikrobiologikoak
50
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA medioan burdin ferroso ioia dagoenez, FeS eratuko da. Sulfuro ferrosoa eratu eta prezipitatzean prezipitatu beltza ikus daiteke.
Mikroorganismoaren metabolismo hartzitzailearen ondorioz CO2 ekoizten bada, medioa ziztatutako lekuan burbuilak agertuko dira. Batzutan, gasaren produkzioaren ondorioz medioak gora egin edo apurtu egin daiteke (argazkian eskumako saiodian gertatzen den bezala).
Mikroorganismoak glukosa erabilitzeko ahalmena badu baina laktosa erabiltzekoa ez, hartzidura egitean azido kopuru txikia eratuko da. Azidoaren ekoizpenak medioaren kolore aldaketa erakarriko du saiodiaren hondoan (gorritik horira), baina azalean oxigenoaren prezentziaren ondorioz eta medioan dagoen peptonaren erabileraren ondorioz amonioa ekoiztu eta pH-a altuagoa izango da, kolore aldaketarik ez delarik nabarituko medioaren gikaldean. Beraz, mikroorganismoak glukosaren hartzidura egiteko gai bada, baina laktosarena ez, medioaren gainazala gorria izango da eta hondoa horia.
Mikroorganismoak bai glukosa eta bai laktosa erabiltzeko gai bada, hartziduraren ondorioz azido asko ekoiztuko dira eta amonioaren ekoizpenak ezingo du medio osoaren azidifikatzea ekiditu. Ondorioz medio bere osotasunean gorritik horira pasatuko da (argazkian eskumako saiodian gertatzen den bezala).
Entseiu mikrobiologikoak
51
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Proba biokimikoen bateria komertziala. Guk API 20E (Biomerieux, France) proba biokimikoen bateria komertziala erabiliko dugu.
Plastikozko tiratxo batetan hodi eta kupula anitz izango ditugu eta hodi bakoitzean deshidrataturik dagoen substratoa dago. Mikroorganismoen suspentzioa prestatu eta proba komertziala inokulatzen (mikroorganismoa dagokion tanpoioan suspenditu eta hodi eta kupula hoiek fabrikatzaileak adierazten duen eran inokulatuko ditugu) badugu deshidratatutako konposatuak disolbatu eta mikroorganismoek erabiliko dituzte edo ez. Hodi konkretu batetako konposatuen erabilera ematen bada, orduan medioan kolore aldaketa emango da.
Inkubazio aldia (24 ordu) igaro ondoren kolore aldaketak emango dira. Aldaketa hoiek proba positiboa den edo ez adieraziko dute. Kasuren batzutan erreaktiboak erabili beharko ditugu erreakzioaren emaitza ezagutzeko.
API 20E proba biokimikoen bi bateria komertzial. bakoitza mikrooorganismo batekin inokulatua izanda, eta ondorioz proba desberdinen emaitzak desberdinak dira (kolore desberdinak ematen dituzte).
Entseiu mikrobiologikoak
52
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
MIKROORGANISMOEN BEHAKETA. MIKROSKOPIOAREN ERABILERA 1. Objetiboak,
okulareak
eta
kondentsadorea
garbiak daudela ziurtatu. Ez baleude kontu handiarekin garbitu. 2. Lagina 10X objektiboarekin fokatu. Fokatzeko hasieran torloju makrometrikoa erabiltzen da. Fokatze finagoa lortzeko torloju mikrometrikoa erabiliko dugu. 3. Ondoren, 40X objektiboa jarri eta fokatzeko torloju mikrometrikoa erabili (makrometrikoa ez litzateke beharrezko izan beharko). 4. Laginaren gainean olio tanta bat jarri eta 100X objektibora pasatu. Objektibo hau erabiltzeko olioa beharrezkoa da, era hortan difrakzio arazoak ekiditzen baitira. Fokatzeko torloju mikrometrikoa erabili 5. Beharrezkoa izanik, argi kopurua kontrolatzeko, diafragmaren bidez argiaren sarrera kontrolatu 6. Behaketa
guztiak
amaitu
ondoren
eta
mikroskopioa gorde aurretik objektiboak garbitu egin beharko dira (batez ere 100X objektiboa olioa kentzeko). Bukatzerakoan estalkia jarri. 7. Mikroskopioa erabiltzen ez den bitartean argiiturria itzalita mantendu.
Entseiu mikrobiologikoak
53
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
TINDAKETEN PRESTAKETA Mikroskopioarekin mikroorganismoak behatzeko, hauek portatan jarri beharko ditugu. Horretarako portatan bakterioen hedapena prestatu beharko dira. Kasu guztietan portan oso garbi egon beharko dira. Bakterio hedapenaren prestaketa
1. Ereintza-euskarriarekin ur tanta bat jarri portaren erdian. 2. Suaren
gainean
euskarria
bertikalki
jarriz
esterilizatu gori jarri arte bere luzera osoan. 3. Bakterioen kultiboa duen hodia hartu, suaren ondoan ireki eta sutatik pasa, tapoia sutatik gertu mantenduz. Esterilizatutako euskarria hodian sartu, hoztu beirarekin kontaktuan eta zelula kantitate txiki bat hartu. Euskarria hoditik atera, hodia sutatik pasatu eta hodia itxi. 4. Euskarriarekin hartutako zelulak portan dagoen ur tantan suspenditu eta ondoren hedatu portaren azalera zehar kapa fin eta homogeneo bat lortuz. 5. Euskarria esterilizatu. 6. Prestaketa lehortu arte itxaron. 7. Zelulak portaren azalean finkatzeko, porta bi aldiz sutatik pasatu. Honela bakteriak portan geratzea lortuko dugu. Azkenengo hau lortzeko alkohola eta zenbait konposatu kimiko ere erabili daitezke, baina beroa da erabiliena.
Entseiu mikrobiologikoak
54
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Medio likido batetik abiatzen bagara, pauso berdinak jarraitu behar dira, baina ur tantarik ez dugu behar izango
(mikroorganismoen
suspentsioa
jadanik
badaukagulako).
Entseiu mikrobiologikoak
55
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
BEHAKETA FRESKUAN Muntai hezea Legamia, onddo eta algak behatzeko erabiltzen den prestaketa mota. Bakterio biziak ikusteko ere erabili daiteke. Mikroorganismoaren tanta bat portan jartzen da eta kubreobjektuarekin estali (aire burbuilak
ekiditu
beharko
dira).
Ondoren
mikroskopioan
behatzen
da.
Zintzilikaturiko Tanta Kultibo-medio likido batetan hazten ari diren mikroorganismoak ikusteko erabiliko dugu teknika hau. 1. Kubreobjektu baten lau izkinetan baselina pixka bat jarriko dugu. 2. Ereintza-euskarrierekin kultiboaren tanta bat hartuko dugu eta kubreobjektoaren erdian jarriko dugu. 3. Kubreobjektuari buelta eman eta induzturiko porta baten sakonaldearen gainean kokatuko dugu laginaren tanta.
Mikroorganismoaren tanta Behaketarako, mikroskopioaren lOX objektiboarekin tantaren ertza fokatuko dugu (ertza itsura ondulatudun lerro bat bezala ikusiko da). Ondoren 40X objektiboa jarri, berriz ere ertza fokatu, eta azkenez lOOX objetiboa jarriko dugu (olioarekin). Tantaren ertzean bakterioak ikusiko ditugu. Bakterio hauek, baldin eta flageloak badituzte mugitzen ikusiko ditugu. Experimentu hontan, behaketa mikroskopikoa egitean, bakterioak ez daudenez tindatuta, behaketa zaila izango da. Behar beharrezkoa izango da kondentzadoretik
Entseiu mikrobiologikoak
56
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA sartzen zaigun argi kopurua oso ondo kontrolatzea mikroorganismoak ikusi ahal izateko.
TINDAKETA BEREIZGARRIAK Tindaketa berezgarriak bakterioak sailkatzeko edo bereizteko erabili daitezke bakterioek tintatzeko orduan erakusten dituzten propietateen arabera.
GRAM tintaketa
Bakterioen azterketarako erabiltzen den tintaketa bereizgarri garrantzitsuena da. Tintaketa honek bakterioak bi taldetan banatzen ditu, bakterioen pareta zelularraren ezaugarrien arabera: GRAM positiboak eta GRAM negatiboak. Tindaketa egiteko mikroorganismoaren hedapen bat egingo da porta batetan, sugarrean finkatu, eta ondoren tindatu: 1. Lagina kristal bioteta koloratzaile basikoarekin estali (minutu bat) 2. Urarekin garbitu
Gram tindaketa: Bazilo Gram negatiboak
3. Lugolarekin estali (1 minutu). Lugola, iodoa duen fixatzailea da (Kristal bioletaren finkapena baimentzen du). 4. Urarekin garbitu 5. Alkohol-azetonarekin dekoloratu (30 segundu). Gram negatiboetan, pausu honek kristal bioleta kendu egingo du. Gram positiboetan ez da dekolorazioa emango. 6. Urarekin garbitu 7. Safraninarekin edo fuktsinarekin tindatu (1 minutu). Kontraste tindaketa da hau. Gram negatiboek kolore larrosa hartuko dute, eta Gram positiboek kristal bioleta dutenez, azken koloratzaile hau ez da
Entseiu mikrobiologikoak
Gram tindaketa: Koko Gram positiboak
57
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA antzemango. 8. Urarekin garbitu 9. Sikatu 10. Behaketa mikroskopikoa.
Beraz, kolore urdinak direnak GRAM positibok direla esango dugu, eta kolore larrosadunak GRAM negatiboak, eta normalki tindaketaren emaitza paretaren izaerarekin erlaziona dezakegu. Dena den, GRAM positibo edo negatiboak izateak tindaketa baten ondorioz
Gram tindaketa: lortzen dugun kolorea adierazten du (urdina edo larrosa), eta ez derrigorrez Koko Gram positiboak eta pareta zelularraren izaera. Hala ere, mikroorganismo askorentzat, eta batez ere bazilo Gram negatiboak guretzat
garrantzitsuak
izan
daitezkeen
mikroorganismo
askorentzat,
tindaketaren emaitza eta paretaren izaera erlazionatzea posible da.
Tindatzaileak gehitu ondoren, porta urarekin garbitzen
Entseiu mikrobiologikoak
Tindaktea ondoren porta sikatzen utziko dugu.
58
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
TINDAKETA SELEKTIBOA Kapsularen tintaketa Bakteria asko lodiera desberdina izan dezakeen kapsula batez inguraturik daude; kapsula hauek zelula baino intentsitate txikiagoarekin tintatzen dira, eta ondorioz, tindaketa arruntekin ez dira nabarmentzen. Kapsula hauek behatzeko tindaketa mota egokia tindaketa negatiboa da. Tindaketa hontan koloratzaile azidoak erabiltzen dira (koloratzaile azidoetan kolorea gatzaren ioi negatiboan oinarrituta dago, eta zelula gehienak kanpoaldean karga negatiboa dutenez, ez dute koloratzailea hartzen eta koloratzailea zelula inguratzen dagoen likidoan geratuko da). Portaren izkina batetan tinta txina edo negrosina tanta bat jartzen dugu. Ereintza euskarriarekin mikroorganismoen kopuru txiki bat hartuko dugu eta koloratzailearen tantan suspendituko ditugu. Ondoren, beste porta baten ertzarekin eta koloratzailearen tantatik hasita frotis bat egiten da portaren luzeran zehar. Era hontan koloratzailearen kapa fin bat lortzen da, kapa fin hortan mikroorganismoak egongo direlarik. Lagina airean lehortzen usten da, eta ondoren mikroskopioan behatzen da. Bakterioak dauden lekuan kolore argia izango dugu (koloratzailerik gabe). Tindaketa mota hau bakterioen morfologia ikusteko ere erabili daiteke.
Kapsulen tindaketa: hutsune zuriak kapsulen presentzia adierazten dute
Entseiu mikrobiologikoak
59
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA Endosporen tintaketa Bacillus
eta
Clostridium
generoetako
espezieek
ingurune
baldintzekiko
oso
erresistenteak diren egiturak eratzen dituzte: endosporak. Endosporak, zelula begetatiboak ez bezala, denbora epe luzetan baldintza desfaboragarrietan iraun dezakete. Egitura hauek, tintatzaileekiko ere erresistentzia erakusten dute, tintaketa mota gehienetan ez direlarik koloreztatzen. Hala ere, tintatu ondoren, koloratzailea kentzea oso zaila da. Endosporak tintatzeko tintatzaile kontzentratuak berotan erabiltzen dira. Endosporen tindaketa: Wirtz metodoa Endospora asko dituen bakterio kultibo zahar baten tanta bat portan jarri eta lehortzen utzi (Bacillus subtilis, Bacillus megaterium). Beroarekin fixatu. Malakita berdearekin estali eta berotu lurrina irten arte. Horrela mantendu hiru minutuz. Urarekin garbitu eta kontrastea lortzeko fuksina koloratzailea gehituko diogu minutu batez. Esporak kolore berdea hartuko dute eta zelulek larrosa.
Endoporen tindaketa: endosporak kolore orlegi argia azaltzen dute, eta zelula begetatiboak larrosa. Endosporak zelula begetatiboen barruan edo aske ager daitezke.
Gorputz metakromatikoen tindaketa Bakterio batzuk polifosfatoz osoturiko bikorrak dituzte (gorputz metakromatikoak edo bolutina bikorrak). Bikor hauek koloratzaile basikoekin tindatu eta koloratzailearen argi xurgapenaren ezaugarriak alda ditzakete (horregaitik deritze metakromatikoak). Egitura hauek lehenengo aldiz Spirillum volutans espezien aurkitu ziren (horregaitik bolutina
Entseiu mikrobiologikoak
60
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA bikorrak izena). Lactobacillus generoan ere agertzen den egitura da (yogurta egiteko Lactobacillus vulgaricus eta Streptococcus thermophilus erabiltzen dira) Egitura zelular gehienak koloratzaile basikoekin tintatzen dira hauen inguruko pH-a puntu isoelektrikoaren gainetik dagoenean (5 baino handiagoa). Bolutina osagai azidoez osatua dagoenez, koloratzaile basikoekin tindatu ahal izateko medioaren azidotasuna jeitsi egin beharko da bolutina bikorren eta koloratzaile basikoaren arteko afinitatea lortzeko (pH <4). Albert tintaketa
1. Lactobacillus kultiboaren (yogurta) hedapena portan egin eta airean lehortu. 2. Albert tintatzailearekin 5 minutuz estali. 3. Tintatzailea kendu, lugola gehitu minutu batez, urarekin garbitu, lehortu eta 100X objektiboarekin mikroskopioan behatu.
Gorputz metakromatikoak orlegi-urdin kolorez tintaturik ikusten dira, bakterioaren gainontzeko zatiak orlegi argiak. Lactobacillus zelulen barruan puntotxoen segida bat bezala azalduko dira gorputz metakromatikoak.
Yogurteko Lactobacillus -en barruan gorputz metakromatikoen tindaketa. Gorputz metakromatikoak hiladatan agertzen dira baziloen barruan aurkitzen dutelarik, eta batzutan kokoen hiladak dirudite.
Entseiu mikrobiologikoak
61
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Entseiu mikrobiologikoak
62
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Entseiu mikrobiologikoak
63
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS TEMA: Recuento de hongos en un alimento balanceado de marca comercial para pollos OBJETIVO: Determinar la presencia y recuento de hongos en un alimento TÉCNICA: Método de las diluciones sucesivas y siembra en superficie de Agar FUNDAMENTO: El presente análisis permite determinar la presencia de hongos contaminantes, sean éstos ambientales o propios del alimento por contaminación durante o después de su elaboración. DESARROLLO: Pesar exactamente 10 gr del alimento a analizar cuya población fúngica se desea estudiar. Añadir la muestra de alimento a 90 ml de H2O d/e (agua destilada estéril contenida en un erlenmeyer, agitar hasta alcanzar la mayor disolución posible. El contenido del erlenmeyer (agua más alimento) constituye la “suspensión madre” . Tener preparado 10 tubos de ensayos estériles con 9 ml de H2O d/e cada uno y 10 placas de Petri estériles con 0,1 ml de Rosa de Bengala (colorante), 0,1ml de Clorenfenicol (antibiótico inhibidor de crecimiento bacteriano) y 10 ml de Agar papa dextrosa (o Saboraud Glucosa). Colocar en el primer tubo 1 ml de la suspensión madre , de esta forma obtendremos así la primera dilución de la muestra, esto equivale a la dilución 1:10 que es lo mismo 10-1. Colocar 1 ml de la dilución 1:10 al segundo tubo, obtendremos así la segunda dilución, esto equivale a la dilución 1:100 que es lo mismo 10-2. Colocar 1 ml de la dilución 1:100 al tercer tubo, obtendremos así la tercera dulución, esto equivale a la dilución 1:1000 que es lo mismo 10-3. Colocar 1 ml de la dilución 1:1000 al cuarto tubo, obtendremos así la cuarta dilución, esto equivale a la dilución 1:10000 que es lo mismo 10-4. Colocar 1 ml de la dilución 1:10000 al quinto tubo, obtendremos así la quinta dilución, esto equivale a la dilución 1:100000 que es lo mismo 10-5. En todos los casos se hace por duplicado (utilizando de esta manera los 10 tubos estériles con 9 ml de H2O d/e. Nota: cuando se preparen las placas de Petri colocar en la placa estéril el colorante y
Entseiu mikrobiologikoak
64
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA Nota: cuando se preparen las placas de Petri colocar en la placa estéril el colorante y antibiótico y luego agregar el Agar estéril a una temperatura que pueda ser soportado por la mano. (tener cuidado que solidifica muy rápidamente). Una vez agregado el Agar agitar la placa por movimientos giratorios sobre la mesada.
En cada una de las placas de Petri se colocará 0,1 ml de cada uno de los tubos (utilizar por cada una de las diluciones una pipeta estéril distinta) Tendremos así 5 placas originales y 5 duplicados. Proceder a sembrar la muestra sobre la superficie del Agar con espátula de Drigalsky estéril (flameado sobre la llama y enfriada sobre la tapa de la placa). Dejar secar sobre mesada y luego proceder a incubar las 10 placas previo rótulo con la dilución que contiene, en forma invertida en estufa de cultivo a 27ºC durante 5 días. Al cabo del 5º día de incubación proceder al realizar el recuento de colonias.
RECUENTO Generalmente las placas que contienen las diluciones 1:10 y 1:100 (primeras dos diluciones no se tienen en cuenta por la gran cantidad de colonias. Se comienza la lectura de la última dilución hacia atrás. Contar las colonias crecidas en cada una de las placas originales (se supone que tiene que se idético al contaje en su duplicado). El total de colonias se multiplica por 10 por el factor de dilución, es decir: p. ej.: en la placa 5 cuya dilución es de 1:100000 lo que equivale a 10-5 se contaron 8 colonias, tendremos: 8 X 10 X 105 = 800.000 UFC/gr de alimento Cuanto mayor sea la dilución, menor será el númeo de colonias que se tienen que contar. Nota: cuidado que no se multiplica p. ej.:X 10-5 sino por 105)
Entseiu mikrobiologikoak
65
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA (Ver esquema de trabajo)
ESQUEMA DE TRABAJO:
MUESTRA ALIMENTO
10 grs.
90 ml agua destilada estĂŠril 1 ml
1 ml
9 ml agua d/e
dil. 1:10
01 ml
1 ml
1 ml
9 ml agua d/e
9 ml agua d/e
dil. 1:100
dil. 1:1000
0.1 ml
0.1 ml
1 ml
9 ml agua d/e
dil. 1:10000
0.1 ml
9 ml agua d/e
dil. 1:100000
0.1 ml
0.1 ml Atb
0.1 ml Atb
0.1 ml Atb
0.1 ml Atb
0.1 ml Atb
0.1 ml color.
0.1 ml color.
0.1 ml color.
0.1 ml color.
0.1 ml color.
10 ml Agar
10 ml Agar
10 ml Agar
10 ml Agar
10 ml Agar
Entseiu mikrobiologikoak
66
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Entseiu mikrobiologikoak
67
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Entseiu mikrobiologikoak
68
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Entseiu mikrobiologikoak
69
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Entseiu mikrobiologikoak
70
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Entseiu mikrobiologikoak
71
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Entseiu mikrobiologikoak
72
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Entseiu mikrobiologikoak
73
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Entseiu mikrobiologikoak
74
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Entseiu mikrobiologikoak
75
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Entseiu mikrobiologikoak
76
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Entseiu mikrobiologikoak
77
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Entseiu mikrobiologikoak
78
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Entseiu mikrobiologikoak
79
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Entseiu mikrobiologikoak
80
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Entseiu mikrobiologikoak
81
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Entseiu mikrobiologikoak
82
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Entseiu mikrobiologikoak
83
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Entseiu mikrobiologikoak
84
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Entseiu mikrobiologikoak
85
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Entseiu mikrobiologikoak
86
ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK
Egitaraua
ANALISIA ETA KONTROLA
Entseiu mikrobiologikoak
87