Abordagens Moleculares em Veterinária by Grupo Lidel

16,7cm x 24cm

22mm

Moleculares em Veterinária

Como desvendar a etiologia e a epidemiologia da infeção

As doenças infeciosas dos animais têm um elevado impacto económico, ambiental e societal. A rapidez e a fiabilidade do apoio analítico prestado no âmbito do diagnóstico microbiológico, quando complementado com o diagnóstico molecular, são essenciais para a vigilância ativa e passiva das doenças infeciosas, possibilitando a deteção precoce de agentes patogénicos emergentes e a monitorização de epizootias, enzootias e/ou zoonoses. A obra Abordagens Moleculares em Veterinária apresenta uma visão integrada das ferramentas de biologia molecular disponíveis, e em desenvolvimento, para a deteção e caracterização de agentes patogénicos com relevância em saúde animal. É dado especial enfoque aos fundamentos das técnicas, aos protocolos experimentais e suas potenciais aplicações, usando modelos selecionados de agentes infeciosos, mas extrapoláveis para outros sistemas.

O conteúdo encontra-se organizado em três partes: na parte I é feita uma introdução ao diagnóstico laboratorial e às abordagens moleculares em veterinária através de um conjunto de revisões práticas sobre os fundamentos da deteção e análise de ácidos nucleicos e sobre o processamento de amostras biológicas, biossegurança, boas práticas laboratoriais, controlo de qualidade e validação de testes moleculares, e o fluxograma analítico característico para a análise de dados. A parte II inclui uma resenha histórica e um conjunto de revisões atualizadas sobre a integração e a relevância das estratégias moleculares para desvendar a etiologia e a epidemiologia da infeção em contexto veterinário, bem como a utilização de métodos bayesianos para inferir o padrão de dispersão de agentes patogénicos. Na parte III são apresentados procedimentos operacionais estandardizados de deteção e caracterização de alguns agentes etiológicos de doenças de reconhecida importância.

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Esta obra abrange uma gama ampla e diversificada de abordagens moleculares, das mais simples e acessíveis às mais sofisticadas e emergentes, que antevemos úteis para médicos veterinários e profissionais de diagnóstico, investigadores na área da saúde animal e saúde pública, e para estudantes de ciências biológicas e de medicina veterinária. Estamos certos de que os leitores interessados encontrarão nesta obra conteúdos que lhes vão permitir ter uma visão mais global e integrada da utilidade das abordagens moleculares em veterinária.

João Inácio: Doutorado em Microbiologia pela Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa. Senior Lecturer da School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, Universidade de Brighton, Reino Unido. Investigador do Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária IP, Portugal (2008-2013).

ISBN 978-989-752-034-1

9 789897 520341

Mónica V. Cunha João Inácio

Mónica V. Cunha: Doutorada em Biotecnologia pelo Instituto Superior Técnico. Professora Auxiliar Convidada da Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa e investigadora do Centro de Biologia Ambiental (CBA/Ce3C) da mesma universidade. Investigadora do Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária IP, Portugal (2009-2014).

www.lidel.pt

Abordagens Moleculares em Veterinária

Abordagens

16,7cm x 24cm

Abordagens

Moleculares em Veterinária Como desvendar a etiologia e a epidemiologia da infeção

Coordenação:

Mónica V. Cunha João Inácio

Autores

Coordenação/Autoria Mónica V. Cunha1 Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, Centro de Biologia Ambiental (CBA/Ce3C), Lisboa, Portugal; Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária I. P., Unidade Estratégica de Investigação e Serviços em Produção e Saúde Animal, Lisboa, Portugal.

João Inácio School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, University of Brighton, Brighton, Reino Unido; Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária I. P., Unidade Estratégica de Investigação e Serviços em Produção e Saúde Animal, Lisboa, Portugal.

Autoria Adriana Cortez Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade de Santo Amaro (UNISA), São Paulo, Brasil.

Alain Boulangé Centro de Biotecnologia, Faculdade de Veterinária, Universidade Eduardo Mondlane, Maputo, Moçambique; CIRAD, UMR INTERTRYP, Montpellier, França.

Alexandra Müller Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Departamento de Clínicas Veterinárias, Universidade do Porto, Portugal; Centro de Estudos de Ciência Animal (CECA-ICETA), Universidade do Porto, Portugal.

Ana Amaro Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária I. P., Unidade Estratégica de Investigação e Serviços em Produção e Saúde Animal, Lisboa, Portugal.

Ana Botelho Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária I. P., Unidade Estratégica de Investigação e Serviços em Produção e Saúde Animal, Lisboa, Portugal.

Ana Canto Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária I. P., Unidade Estratégica de Investigação e Serviços em Produção e Saúde Animal, Lisboa, Portugal.

Ana Cláudia Coelho

Departamento das Ciências Veterinárias, Centro de Estudos de Ciência Animal e Veterinária, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal.

Ana Cristina Ferreira Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária I. P., Unidade Estratégica de Investigação e Serviços em Produção e Saúde Animal, Lisboa, Portugal.

1 A coordenadora da obra e autora dos capítulos 8, 9 e 27 agradece o apoio financeiro da Fundação para a Ciência e a Tecnologia no âmbito do programa Ciência 2008 e do projeto PTDC/CVT/117794/2010.

Abordagens moleculares em veterinária

Ana Cristina Matos Escola Superior Agrária, Instituto Politécnico de Castelo Branco, Portugal; Centro de Estudos de Ciência Animal e Veterinária, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal.

Ana Duarte Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade de Lisboa, Portugal.

Ana Margarida Henriques Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária I. P., Unidade Estratégica de Investigação e Serviços em Produção e Saúde Animal, Lisboa, Portugal.

Ana Pelerito Departamento de Doenças Infeciosas, Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, I. P., Lisboa, Portugal.

Ana Sofia Ferreira Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto, Portugal; Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária I. P., Unidade Estratégica de Investigação e Serviços em Produção e Saúde Animal, Lisboa, Portugal.

Ana Sofia Santos Centro de Estudos de Vetores e Doenças Infeciosas Dr. Francisco Cambournac, Departamento de Doenças Infeciosas, Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge I. P., Águas de Moura, Portugal.

Ana Tenreiro Centro de Biodiversidade, Genómica Integrativa e Funcional (BioFIG), Faculdade de Ciências, Universidade de Lisboa, Portugal.

Ângela Xufre DNAtech – investigação científica e análises moleculares, Lisboa, Portugal.

Carina Luísa Carvalho Instituto de Ciências Agrárias e Ambientais Mediterrânicas (ICAAM), Escola de Ciências e Tecnologia, Universidade de Évora, Portugal; Departamento de Doenças Infeciosas, Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge I. P., Lisboa, Portugal.

Carlos Fernandes Centro de Biologia Ambiental (CBA), Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, Portugal.

Constança Pomba Laboratório de Resistência aos Antibióticos e Biocidas, Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal (CIISA), Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade de Lisboa, Portugal.

Diogo Guerra Instituto de Parasitologia, Universidade de Zurique, Suíça.

Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade de Lisboa, Portugal.

Elsa Leclerc Duarte Instituto de Ciências Agrárias e Ambientais Mediterrânicas (ICAAM) & Escola de Ciências e Tecnologia, Departamento de Medicina Veterinária, Universidade de Évora, Portugal.

XII

Elisabete Silva

Autores

Fátima Loja Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária I. P., Gabinete de Qualidade e Segurança, Oeiras, Portugal.

Fernando M. A. Bernardo Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade de Lisboa, Portugal.

Francisco Vieira-e-Brito Centro de Ciência Animal e Veterinária, Vila Real, Portugal; Departamento de Ciências Veterinárias, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal.

Gabriela Santos-Gomes Centro de Malária e outras Doenças Tropicais, Instituto de Higiene e Medicina Tropical, Universidade Nova de Lisboa, Portugal.

Gertrude Thompson Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Departamento de Clínicas Veterinárias, Universidade do Porto, Portugal; CIBIO – Centro de Investigação em Biodiversidade e Recursos Genéticos/InBIO Laboratório Associado, Universidade do Porto, Portugal.

Gonçalo M. Rosa Durrell Institute of Conservation and Ecology, School of Anthropology and Conservation, University of Kent, Canterbury, Reino Unido; Institute of Zoology, Zoological Society of London, Reino Unido; Centro de Biologia Ambiental, Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, Portugal.

Ilda Santos Sanches Departamento de Ciências da Vida, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade Nova de Lisboa (FCT/UNL), Portugal; Centro de Recursos Microbiológicos (CREM), Universidade Nova de Lisboa, Portugal.

Inês Batista e Guinote Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária I. P., Unidade Estratégica de Investigação e Serviços em Produção e Saúde Animal, Lisboa, Portugal; Instituto de Tecnologia Química e Biológica, Universidade Nova de Lisboa, Oeiras, Portugal.

Isabel Couto Grupo de Micobactérias, Unidade de Microbiologia Médica, Instituto de Higiene e Medicina Tropical, Universidade Nova de Lisboa, Portugal; Centro de Recursos Microbiológicos (CREM), Universidade Nova de Lisboa, Portugal.

Isabel Lopes de Carvalho Departamento de Doenças Infeciosas, Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge I. P., Lisboa, Portugal.

Isabel Pereira da Fonseca Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal, Departamento de Sanidade Animal, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade de Lisboa, Portugal.

Jacinto Gomes Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária I. P., Unidade Estratégica de Investigação e Serviços em Produção e Saúde Animal, Lisboa, Portugal; Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal, Departamento de Sanidade Animal, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade de Lisboa, Portugal.

XIII

Abordagens moleculares em veterinária

Jane Megid Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP), São Paulo, Brasil.

Jorge Rodrigues Centro de Estudos de Ciência Animal e Veterinária, Vila Real, Portugal.

José Soares Ferreira Neto Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, Brasil.

Karina L. Silva-Brandão Laboratório de Melhoramento de Plantas, Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA), Universidade de São Paulo, Piracicaba, Brasil.

Lélia Chambel Centro de Biodiversidade, Genómica Integrativa e Funcional (BioFIG), Faculdade de Ciências, Universidade de Lisboa, Portugal.

Lenea Campino Unidade de Ensino e Investigação de Parasitologia Médica, Instituto de Higiene e Medicina Tropical, Universidade Nova de Lisboa, Portugal; Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, Faro, Portugal.

Leonor Orge Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária I. P., Unidade Estratégica de Investigação e Serviços em Produção e Saúde Animal, Lisboa, Portugal.

Líbia Zé-Zé Departamento de Doenças Infeciosas, Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge I. P., Lisboa, Portugal.

Luís A. B. Bassetti Laboratório de Ecologia Isotópica, Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA), Universidade de São Paulo, Piracicaba, Brasil.

Luís M. Rosalino Centro de Biologia Ambiental (CBA), Faculdade de Ciências, Universidade de Lisboa, Portugal; Laboratório de Ecologia Isotópica, Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA), Universidade de São Paulo, Piracicaba, Brasil.

Luís Madeira de Carvalho Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade de Lisboa, Portugal.

Luis Neves

Luís Tavares Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade de Lisboa, Portugal.

XIV

Centro de Biotecnologia, Faculdade de Veterinária, Universidade Eduardo Mondlane, Maputo, Moçambique; Department of Veterinary Tropical Diseases, Faculty of Veterinary Sciences, University of Pretoria, South Africa.

Autores

Luisa Mateus Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade de Lisboa, Portugal.

Luiz Max F. de Carvalho Programa de Computação Científica (PROCC), Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brasil.

Manuela Oliveira Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade de Lisboa, Portugal.

Marcos Bryan Heinemann Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, Brasil.

Maria das Neves Paiva-Cardoso Departamento de Ciências Veterinárias, Centro de Investigação e Tecnologias Agro-Ambientais e Biológicas, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal.

Maria de Lurdes Pinto Departamento das Ciências Veterinárias, Centro de Estudos de Ciência Animal e Veterinária, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal.

Maria Inácia Corrêa de Sá Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária I. P., Unidade Estratégica de Investigação e Serviços em Produção e Saúde Animal, Lisboa, Portugal.

Maria Lúcia Rossetti Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde, Centro de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Porto Alegre, Brasil.

Maria Luiza Carrieri Instituto Butantan, Secretaria de Estado da Saúde, Governo do Estado de São Paulo, Brasil.

Maria Manuela Matos Departamento de Genética e Biotecnologia, Centro de Genómica e Biotecnologia, Instituto de Biotecnologia e Bioengenharia, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal.

Maria Sofia Núncio Departamento de Doenças Infeciosas, Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge I. P., Lisboa, Portugal.

Miguel Viveiros Grupo de Micobactérias, Unidade de Microbiologia Médica, Instituto de Higiene e Medicina Tropical, Universidade Nova de Lisboa, Portugal; Centro de Malária e Outras Doenças Tropicais/LA, Instituto de Higiene e Medicina Tropical, Universidade Nova de Lisboa, Portugal.

Natacha Couto

Laboratório de Resistência aos Antibióticos e Biocidas, Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal (CIISA), Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade de Lisboa, Portugal.

Nuno Santos Instituto de Investigação em Ciências da Vida e da Saúde, Universidade do Minho, Braga, Portugal.

Nuno Silva Centro de Ciência Animal e Veterinária, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal.

Abordagens moleculares em veterinária

Patrícia Poeta Centro de Ciência Animal e Veterinária, Vila Real, Portugal; Departamento de Ciências Veterinárias, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal.

Patrick Freire Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária I. P., Unidade Estratégica de Investigação e Serviços em Produção e Saúde Animal, Lisboa, Portugal.

Paula Macucule Centro de Biotecnologia, Faculdade de Veterinária, Universidade Eduardo Mondlane, Maputo, Moçambique.

Pedro Eduardo Almeida da Silva Laboratório de Micobactérias e Biologia Molecular, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio Grande – FURG, Rio Grande, RS, Brasil.

Ricardo Bexiga Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade de Lisboa, Portugal.

Rogério Tenreiro Centro de Biodiversidade, Genómica Integrativa e Funcional (BioFIG), Faculdade de Ciências, Universidade de Lisboa, Portugal.

Rui Seixas Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade de Lisboa, Portugal.

Sandra Chaves Centro de Biodiversidade, Genómica Integrativa e Funcional (BioFIG), Faculdade de Ciências, Universidade de Lisboa, Portugal.

Sílvia Santos Barros Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária I. P., Unidade Estratégica de Investigação e Serviços em Produção e Saúde Animal, Lisboa, Portugal; Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade Nova de Lisboa, Portugal.

Sofia Cortes Unidade de Ensino e Investigação de Parasitologia Médica, Instituto de Higiene e Medicina Tropical, Universidade Nova de Lisboa, Portugal; Centro de Malária e Outras Doenças Tropicais, Instituto de Higiene e Medicina Tropical, Universidade Nova de Lisboa, Portugal.

Teresa Fagulha Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária I. P., Unidade Estratégica de Investigação e Serviços em Produção e Saúde Animal, Lisboa, Portugal.

Tiago Luís

Virgílio Almeida Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade de Lisboa, Portugal.

Vivianne Cambuí Figueiredo Rocha Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, Brasil.

XVI

Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária I. P., Unidade Estratégica de Investigação e Serviços em Produção e Saúde Animal, Lisboa, Portugal.

Princípios básicos da deteção e análise de ácidos nucleicos Ana Tenreiro, Sandra Chaves, Rogério Tenreiro

Sumário Apesar do diagnóstico serológico e microbiológico convencional continuar a ser usado em rotina, as técnicas moleculares têm-se mostrado cada vez mais relevantes na área do diagnóstico veterinário, possibilitando maior especificidade e maior rapidez na comunicação de resultados. Neste capítulo sobre deteção e análise de ácidos nucleicos, são apresentados os fundamentos, os aspetos metodológicos e as limitações das técnicas que têm tido maior aplicação no diagnóstico molecular e na caracterização de agentes patogénicos. Estas incluem a reação de polimerase em cadeia (PCR) convencional e algumas das suas variantes, a reação de polimerase em cadeia em tempo real (qPCR), que hoje em dia tem um papel particularmente relevante no diagnóstico, a hibridação in situ com sondas de DNA fluorescentes (FISH) e a sequenciação de DNA.

Introdução Durante as últimas décadas, o diagnóstico microbiológico clínico e veterinário tem sido baseado na caracterização morfológica e fisiológica de microrganismos após isolamento em cultura pura. No entanto, muitos organismos não são cultiváveis ou são de cultura difícil e fastidiosa, provavelmente por incapacidade de adaptação às condições laboratoriais1, limitando o sucesso e a rapidez de resposta do diagnóstico. A par com os métodos serológicos, e tendo em conta a universalidade dos ácidos nucleicos, o desenvolvimento de métodos “independentes de cultura” e a sua aplicação nesta área vieram abrir novas perspetivas, permitindo redefinir o nível de informação disponível para programas de vigilância e controlo de saúde animal e maior celeridade e especificidade do diagnóstico, com a possibilidade de processamento

de grande número de amostras. Sem dúvida que a técnica molecular com maior variedade e potencialidade de aplicação na deteção e identificação de agentes infeciosos de animais é a técnica de PCR, sobretudo tendo em conta as suas variantes2, e em particular as metodologias de PCR em tempo real (ou PCR quantitativa). Outra técnica que tem tido alguma relevância é a hibridação in situ com sondas de DNA fluorescentes, que possibilita a deteção do organismo-alvo com base em sequências específicas, mantendo a estrutura celular intacta e permitindo a sua quantificação na amostra. Este capítulo descreve algumas das técnicas de análise e deteção de ácidos nucleicos mais usadas em diagnóstico e que já são aplicadas com alguma frequência em laboratórios de rotina. Refere ainda algumas metodologias que, a médio prazo, poderão tornar-se importantes no diagnóstico veterinário. 3

Recolha e processamento de amostras biológicas para análises moleculares Ana Pelerito, Maria Sofia Núncio

Sumário Neste capítulo, é realizada uma introdução ao processamento de amostras biológicas, visando uma disponibilização eficiente dos ácidos nucleicos (DNA e RNA) dos agentes patogénicos, com o objetivo de potenciar o sucesso das análises moleculares subsequentes. Os tópicos a considerar incluem o transporte e a manutenção de produtos biológicos para análises moleculares, as diferentes estratégias de extração de ácidos nucleicos, vantagens e limitações das várias abordagens tendo em consideração o tipo de amostra e os agentes a detetar, compostos inibitórios das reações e estratégias para a sua remoção, reagentes facilitadores das reações, controlo de qualidade dos ácidos nucleicos extraídos e seu armazenamento.

Introdução A obtenção de amostras puras de ácidos nucleicos é o passo inicial do processamento do material biológico, permitindo a aplicação posterior de técnicas de biologia molecular, incluindo a técnica de reação de polimerase em cadeia (PCR), sequenciação (incluindo sequenciação de nova geração) e hibridação com sondas complementares. A qualidade dos ácidos nucleicos obtidos de amostras biológicas depende de diversos fatores, tais como a qualidade e a quantidade das amostras biológicas originais, bem como as condições de transporte e armazenamento das mesmas, o método de extração utilizado e as condições de armazenamento do produto extraído. A rutura das membranas celulares origina a libertação de uma grande variedade de enzimas que causam danos aos ácidos nucleicos, ou até mesmo a sua degradação total. Para se obter um ácido nucleico em excelentes condições, a amostra original tem de ser manipulada de

modo a minimizar a degradação dessas moléculas. Várias questões de segurança surgem quando está em causa a manipulação humana de materiais biológicos, pelo que devem ser tomadas precauções em todas as fases do trabalho. As amostras colhidas de animais são potencialmente infeciosas e, uma vez que, frequentemente, podem estar contaminadas com agentes zoonóticos, devem sempre ser manipuladas com as devidas precauções. Os responsáveis pela colheita, transporte e processamento destas amostras devem ser treinados para respeitar todas as precauções de segurança necessárias para a sua própria proteção e para a proteção de outros envolvidos em todo o processo. 1. Recolha de amostras biológicas A interação entre os técnicos que fazem a colheita do material biológico e os técnicos 33

Otimização, validação e controlo de qualidade de testes moleculares de diagnóstico Miguel Viveiros, Isabel Couto, Maria Lúcia Rossetti, Pedro Eduardo Almeida da Silva

Sumário Este capítulo descreve os processos de otimização, validação e controlo de qualidade de ensaios moleculares como exames complementares de diagnóstico médico-veterinário. Baseado nos princípios e boas práticas de diagnóstico in vitro utilizados em saúde animal, aborda os fundamentos, conceitos, metodologias analíticas e avaliativas para a determinação da precisão ou exatidão de um ensaio molecular na perspetiva de desenvolvimento, otimização, validação e posteriormente utilização na rotina do diagnóstico laboratorial médico-veterinário. São também abordadas as melhores práticas laboratoriais para a garantia da qualidade deste tipo de ensaios após a sua implementação em rotina, bem como os aspetos a avaliar regularmente para assegurar a excelência e utilidade dos resultados obtidos.

Introdução O diagnóstico molecular de agentes infeciosos é hoje um importante complemento ao diagnóstico clínico em medicina veterinária, alicerçado na avaliação da sintomatologia do animal, em associação com técnicas culturais, histopatológicas e serológicas. Os métodos moleculares são baseados na análise de sequências de ácidos nucleicos específicas que auxiliam na identificação e diferenciação dos microrganismos. A elevada especificidade e sensibilidade destes métodos, associada à rapidez na obtenção de resultados, quando comparados com os métodos convencionais, permitem abreviar o tempo entre a suspeita clínica e a identificação do agente causal da doença infeciosa, o que proporciona enormes benefícios no diagnóstico, tratamento e prevenção da disseminação do agente infecioso. Neste capítulo, apresentam-se os fundamentos científicos sobre os quais assentam

os procedimentos analíticos de validação dos métodos de diagnóstico molecular e quais as suas aplicações e limitações para o diagnóstico microbiológico médico-veterinário. Apesar das evidentes diferenças de aparência macroscópica e estilo de vida, os organismos vivos apresentam fortes semelhanças a nível molecular. As estruturas moleculares e as atividades metabólicas que estão na base da unidade estrutural de todos os seres vivos – a célula – dependem de um conjunto de biomoléculas universais. De entre as biomoléculas universais, os ácidos nucleicos destacam-se ao garantir que, apesar das semelhanças moleculares, os seres vivos sejam significativamente diferentes uns dos outros e que possam transmitir essas diferenças de geração em geração. Compostos por uma base azotada, uma pentose e um grupo fosfato, os ácidos nucleicos estão envolvidos em quase todos os aspetos da vida celular. Os seus polímeros, os ácidos nucleicos, ácido desoxirribonucleico (DNA) 51

Instalações, biossegurança e procedimentos operacionais no laboratório de diagnóstico molecular Leonor Orge, Fátima Loja

Sumário A técnica de reação de polimerase em cadeia (PCR) e outras técnicas de amplificação in vitro que produzem múltiplas cópias por amplificação de quantidades reduzidas de ácidos nucleicos são fortemente suscetíveis de contaminações que podem originar erros grosseiros ou mesmo inviabilizar a conclusão dos ensaios efetuados por estas técnicas. Para a adoção dos procedimentos operacionais adequados à correta realização deste tipo de reações, é necessário um conhecimento detalhado de todas as etapas do ensaio e uma avaliação de risco dos potenciais fatores de erro, de modo a determinar as medidas preventivas relacionadas com as potenciais interferências das instalações, do ambiente e de outros materiais. Este capítulo é dedicado às especificidades das instalações, equipamentos e materiais de um laboratório de diagnóstico molecular. Os procedimentos operacionais sobre estes temas visam normalizar as condições de instalação e de operação para garantir a qualidade dos resultados.

Introdução Na instalação e organização de um laboratório de diagnóstico molecular, o principal objetivo é a prevenção e o controlo das contaminações introduzidas no ambiente laboratorial por procedimentos inadequados na manipulação de produtos de amplificação de ácidos nucleicos, que facilmente se dispersam em aerossóis para novas amostras e/ou reagentes, através dos vários materiais utilizados (luvas, micropipetas, suportes, canetas, papel). Este tipo de contaminações representa um sério problema para o laboratório, sendo algumas situações difíceis de eliminar. Daí que as medidas de controlo adotadas sejam no sentido de as evitar1. O desenho do laboratório é um fator determinante nesta prevenção, não obstante ser

requerido o cumprimento rigoroso das boas práticas laboratoriais associadas aos procedimentos operativos de limpeza e segurança por parte de todo o pessoal envolvido nas técnicas adotadas, desde o pessoal de limpeza ao investigador1. A planta deste tipo de laboratório deverá contemplar as áreas de pré-PCR, onde se inclui a preparação de reagentes, o processamento de amostras e a extração de ácidos nucleicos, e as áreas de PCR, onde se realizam as reações de amplificação e análise dos seus produtos. Estas duas áreas são distintas e desenhadas de modo a evitar que todos os materiais utilizados na área de PCR, incluindo os de proteção individual, sejam introduzidos na área pré-PCR2. A introdução de brancos nos ensaios, sem a inclusão dos ácidos nucleicos molde no controlo, constitui uma forma de monitorizar a 65

Análise de dados moleculares: introdução aos métodos de taxonomia numérica Lélia Chambel, Rogério Tenreiro

Sumário A aplicação de métodos moleculares na classificação, identificação, diferenciação e tipificação de microrganismos produz geralmente grandes conjuntos de dados, quer qualitativos (binários) quer quantitativos, que exigem uma análise por métodos de taxonomia numérica. Os estudos de taxonomia numérica seguem um fluxograma analítico característico que envolve a colheita de dados (e eventual codificação), a análise computacional, a apresentação e interpretação dos resultados e a descrição de grupos. Em termos de abordagens metodológicas de análise computacional, além da dualidade dos espaços taxonómicos (atributos versus indivíduos) e das medidas de associação (semelhança versus distância), podem utilizar-se métodos de classificação hierárquica ou métodos de ordenação. Embora os métodos hierárquicos sejam mais frequentes, sendo maioritariamente aplicados para agrupar os indivíduos num espaço de atributos e gerar um diagrama em árvore (dendrograma) como representação final, os métodos não-hierárquicos permitem visualizar simultaneamente as relações entre indivíduos e entre atributos e traduzem-se por diagramas a duas ou três dimensões. Neste capítulo, descreve-se o fluxograma analítico usado na análise computacional dos dados de taxonomia numérica e discutem-se as principais variantes usadas nas diversas etapas, em particular as medidas de associação e de aglomeração dos métodos hierárquicos e a análise não-hierárquica em componentes principais.

Introdução Por definição, o método científico consiste nos princípios e processos empíricos de descoberta e demonstração considerados característicos ou necessários para a investigação científica; geralmente envolve a observação dos fenómenos, a formulação de uma hipótese sobre os fenómenos, a experimentação para demonstrar a verdade ou falsidade da hipótese, e uma conclusão que valida ou modifica a hipótese. Em biologia, a hipótese deverá ser

testada com base em experiências laboratoriais controladas e obtidos dados relevantes que serão analisados de forma a apoiar ou refutar a hipótese. Assim, podemos afirmar que toda e qualquer experiência científica deve iniciar-se por um delineamento experimental e terminar na análise dos dados produzidos. O delineamento experimental e os métodos de análise a aplicar estão dependentes dos objetivos do estudo, diferentes tipos de dados requerendo diferentes tipos de análise. Os modelos matemáticos conferiram precisão às teorias biológicas, 77

Guia para a resolução de problemas na deteção, amplificação e análise de ácidos nucleicos Inês Batista e Guinote, Patrick Freire

Sumário A análise de ácidos nucleicos permitiu ultrapassar limitações dos métodos clássicos de diagnóstico. No entanto, trata-se de uma ferramenta de implementação complexa e dependente de vários fatores. Este capítulo elenca os pontos-chave da técnica, as causas principais de insucesso e como solucionar os problemas na sua execução, visando assim facilitar o processo de otimização.

Introdução Os testes baseados na amplificação de DNA ou RNA aumentaram a rapidez, a sensibilidade e a especificidade dos resultados, independentemente do operador ou estrutura de apoio. Permitem a identificação de espécies, mas vão mais além, chegando ao detalhe de nível infraespecífico, permitindo a identificação de indivíduos via tipificação genómica, possibilitando assim a realização de estudos epidemiológicos, de expansão temporal e geográfica. Entre outros, são exemplos de métodos moleculares de identificação de microrganismos baseados na amplificação de DNA: a análise de polimorfismos dos fragmentos de restrição do DNA genómico (RFLP), que avalia a variabilidade de tamanho dos fragmentos originados por restrição do DNA de loci polimórficos (por exemplo, do gene gyrB); e a reação de polimerase em cadeia (PCR) de sequência específica que, usando oligonucleótidos iniciadores (primers) que hibridem em regiões polimórficas, permite detetar produto(s) amplificado(s) exclusivamente na presença de complementaridade. Com a vulgarização das técnicas de sequenciação de ácidos nucleicos,

procede-se cada vez mais à identificação e tipificação através da análise de sequências completas de genes e de outras regiões genómicas. Adicionalmente, métodos baseados em PCR permitem hoje a deteção e quantificação de espécies pouco abundantes de RNA, através da utilização de sondas e estratégias de deteção colorimétricas, quimioluminescentes ou fluorescentes1, possibilitando também o estudo da expressão génica2. São vários os cuidados a ter inicialmente com a colheita de amostras e a extração de ácidos nucleicos, mas também na sua análise, assegurando a exatidão e confiança no resultado final. Neste capítulo, são apresentados sumariamente os problemas em que podem incorrer as técnicas moleculares baseadas na análise de ácidos nucleicos e os cuidados a ter ao longo do processo (Figura 6.1). 1. Causas técnicas subjacentes à falha na análise de ácidos nucleicos A ausência de um resultado no fim de uma análise como, por exemplo, um produto de amplificação de ácidos nucleicos com a dimensão 89

Evolução e importância do diagnóstico laboratorial no controlo, vigilância e erradicação das doenças dos animais Fernando M. A. Bernardo

Sumário Os animais afetados por doenças causadas por agentes infeciosos constituem uma fonte de problemas de diversas ordens: sanitariamente, essas doenças são uma ameaça à vida e ao desenvolvimento dos animais atingidos, provocando-lhes sofrimentos de diferentes intensidades (impactos biológicos); por vezes, são também uma ameaça à saúde humana, porque alguns daqueles agentes são transmissíveis ao Homem (impactos sociais) e, no caso de os animais atingidos serem espécies pecuárias, então transformam-se em prejuízos materiais, por falência do sistema de expectativa de rendimento (impacto económico). Todos estes aspetos negativos decorrentes da ocorrência de doenças transmissíveis têm sido alvo de atenção humana há alguns milénios e nem sempre foi possível encontrar justificações racionais ou equilibradas para caracterizar estas afeções. Sem dúvida que o ponto de partida primordial para melhor compreender e conseguir contrariar os diferentes impactos dessas doenças é a existência de metodologias de diagnóstico concisas e confiáveis.

Introdução As doenças dos animais que são causadas por agentes microbianos e parasitários transmissíveis têm uma enorme relevância social, sanitária e económica. Para se conseguirem combater eficazmente, é imprescindível que exista uma forma rigorosa de as diagnosticar ou de as detetar em tempo útil, de preferência antes de se difundirem e se transformarem num surto ou numa panzootia. A importância social daquelas doenças decorre do facto de muitos animais serem utilizados pelo Homem para seu benefício (trabalho, desporto, consumo, lazer), estabelecendo-se, por essas vias, contactos muito próximos entre os seres humanos e os animais. É evidente que os animais de companhia, os bovinos, os

equinos, os pequenos ruminantes, os suínos, as aves de capoeira, as abelhas, os peixes, os moluscos e os crustáceos só podem proporcionar benefícios à espécie humana quando se encontram em perfeito estado de saúde. Aqueles animais, uma vez atingidos por uma doença infeciosa ou parasitária, não conseguem cumprir as funções para que estavam destinados: a realização de trabalho (tração, desporto, guarda), a produção de géneros alimentícios (leite, carne, ovos, produtos da pesca, mel) e de outros bens essenciais como a lã, os couros, as peles, a seda ou gorduras industriais (biocombustíveis e sabões). Não é possível alcançar rendimentos de trabalho adequados, boa companhia, ou obter géneros alimentícios a partir de animais doentes. Dos animais doentes só resultam 103

Visão geral e aplicação das tecnologias moleculares no diagnóstico laboratorial de doenças infeciosas Mónica V. Cunha, João Inácio

Sumário Os avanços científicos e a evolução tecnológica que se verificaram após a Segunda Guerra Mundial tiveram um impacto considerável no diagnóstico laboratorial, com implicações claras na vigilância ativa e passiva de agentes infeciosos que afetam animais domésticos e selvagens, bem como o Homem. Os métodos moleculares de diagnóstico, cujo desenvolvimento foi notável nas últimas duas décadas, exploram as características genotípicas dos microrganismos, em contraste com os chamados métodos clássicos ou convencionais, que se baseiam na análise das suas características fenotípicas. Este capítulo realça os principais aspetos e aplicações dos métodos moleculares, evidenciando os consequentes benefícios na saúde e bem-estar animal, na transação de animais e de produtos de origem animal, e na proteção da saúde pública, e discute os desafios e as oportunidades que se lhes colocam no contexto do diagnóstico microbiológico veterinário.

Introdução A vigilância ativa e passiva de doenças infeciosas em espécies pecuárias e em animais selvagens possibilita a deteção de agentes patogénicos (re)emergentes, a deteção de epizootias, a monitorização de doenças endémicas e/ou zoonóticas, e, em última instância, apoia os vários stakeholders, suportando as políticas nacionais e internacionais que visam salvaguardar a saúde e o bem-estar animal, a segurança alimentar e a saúde pública, bem como regular o comércio de animais e de produtos de origem animal. Os planos de vigilância epidemiológica, de controlo e de erradicação geridos pelas autoridades veterinárias nacionais, sendo complexos pela integração de várias vertentes, dependem enormemente de um apoio laboratorial rápido, fiável e eficiente.

O principal objetivo de um laboratório de diagnóstico microbiológico veterinário consiste em prestar o apoio analítico necessário à monitorização de doenças de origem infeciosa em espécies domésticas, selvagens, em animais de cativeiro (por exemplo, em parques zoológicos) e em animais de companhia, pela deteção, identificação e caracterização dos microrganismos patogénicos eventualmente presentes numa gama diversificada de amostras biológicas, tais como tecidos, sangue, urina e outros fluidos recolhidos de animais suspeitos. A observação direta ao microscópio ótico de amostras biológicas a fresco, normalmente coradas por diferentes processos (por exemplo, coloração de Gram, de Ziehl-Neelsen ou de endósporos), ou de amostras fixadas em formol, seguidas da inclusão em parafina e coloração por hematoxilina-eosina, e eventualmente complementada por outras colorações 119

Análise de polimorfismos dos ácidos nucleicos para elucidar a epidemiologia de agentes infeciosos Mónica V. Cunha

Sumário A epidemiologia molecular de doenças infeciosas interseta os princípios e as técnicas experimentais da biologia molecular com as ferramentas empíricas e analíticas usadas em epidemiologia, que resultam de abordagens observacionais, experimentais e quantitativas. Neste capítulo, são revistos os fundamentos e aspetos metodológicos de algumas das técnicas de genotipagem mais utilizadas na caracterização intraespecífica de agentes patogénicos, as quais têm por base a análise de polimorfismos dos ácidos nucleicos existentes no genoma microbiano e parasitário. Elencam-se algumas ferramentas disponíveis para a análise de dados biológicos que emergem neste âmbito e discute-se sobretudo o potencial destas abordagens para responder a questões epidemiológicas de relevo em saúde animal e saúde pública.

Introdução A história natural das doenças infeciosas tem vindo a ser compreendida, não ao nível do indivíduo, mas através do estudo da sua distribuição numa população ou em diferentes populações, permitindo aferir com maior plenitude o impacto de uma dada doença e a eficácia das campanhas de controlo. A palavra “epidemiologia” tem origem semântica no grego antigo, sendo composta pelos termos “epi” (entre), “demos” (povo), “logos” (estudo), e refere-se ao estudo da distribuição e dos determinantes de doença numa dada população ou comunidade, com vista a uma possibilidade ou oportunidade de intervenção no curso natural da doença, quer ao nível da prevenção quer ao nível do controlo1. Apesar do termo epidemiologia ser usado indiscriminadamente para pessoas e animais, aquele que mais rigorosamente descreve o estudo da

doença e dos fatores que determinam a sua ocorrência exclusivamente em animais é a epizootiologia (do grego, “zoion” [animal]). São cinco os principais objetivos da epidemiologia1: >> Determinação da origem de uma doença cuja causa é conhecida. >> Investigação e controlo de uma doença cuja causa é desconhecida ou pouco compreendida. >> Compilação de informação sobre a ecologia e história natural de uma doença. >> Planeamento, monitorização e avaliação de programas de controlo de doença. >> Avaliação dos efeitos económicos causados por uma determinada doença e estimativa dos custos e benefícios subjacentes a programas de controlo alternativos; no contexto animal, esta análise económica é essencial no estabelecimento de programas de saúde animal eficientes. 137

Impacto das abordagens moleculares de larga escala e plataformas de elevado rendimento na deteção e caracterização de agentes infeciosos relevantes em saúde animal e saúde pública Nuno Silva, Jorge Rodrigues, Francisco Vieira-e-Brito, Patrícia Poeta

Sumário Durante as últimas décadas, o rápido desenvolvimento e a ampla aplicação de técnicas de biologia molecular têm resultado em avanços sem precedentes no conhecimento e no diagnóstico de doenças em animais. As técnicas de larga escala – “ómicas” – como a transcritómica, a proteómica e a metagenómica, permitem analisar, em simultâneo, milhares de genes e proteínas, em plataformas de elevado rendimento. O objetivo deste capítulo é apresentar informações gerais sobre estas abordagens moleculares, que compreendem também a análise bioinformática de dados em larga escala, usadas na deteção e caracterização de agentes infeciosos relevantes em saúde animal. Pretende-se abordar as potencialidades e aplicações destas metodologias na identificação de novos biomarcadores para aplicações de diagnóstico em medicina veterinária, na investigação de novas vacinas e fármacos, e no estudo da resistência a antimicrobianos.

Introdução Os modernos conceitos de produção animal levaram ao desenvolvimento de plataformas de diagnóstico rápido e uniformização de tecnologias de deteção de agentes patogénicos, com vista ao melhoramento da saúde animal. A globalização tem contribuído para o aumento da circulação internacional de pessoas e bens, incluindo animais e seus produtos derivados. Consequentemente, o risco de transferência de agentes patogénicos tende a aumentar entre países e, mesmo, entre continentes. Por outro lado, eventualmente também relacionado com alterações climatéricas globais, doenças endémicas em certas áreas, tais como a febre catarral ovina, ou a peste suína africana, entre outras, têm mostrado uma tendência de disseminação para novas áreas geográficas. Assim, a intensificação da produção

animal requer diferentes abordagens relacionadas com medidas de prevenção, diagnóstico e controlo de patologias, preparadas também para lidar com agentes infeciosos ainda desconhecidos ou emergentes numa dada área ou região. Durante as últimas décadas, o rápido desenvolvimento e ampla aplicação de técnicas moleculares, com base em abordagens de larga escala, vulgarmente apelidadas de “ómicas”, têm resultado em avanços sem precedentes no diagnóstico clínico e no conhecimento sobre as patologias, com vista ao melhoramento da saúde animal. Em 1995, foi totalmente sequenciado o primeiro genoma bacteriano, de Haemophilus influenzae, utilizando a tecnologia de sequenciação automatizada de Sanger1. Desde então, mais de 12 000 projetos de sequenciação de genomas bacterianos foram concluídos (www.genomesonline.org). A possibilidade de 157

Integração e importância das estratégias moleculares na monitorização do estado de saúde em animais de companhia Ângela Xufre

Sumário Neste capítulo, são discutidas as vantagens de se complementar o diagnóstico tradicional das doenças infeciosas em animais de companhia com maior expressão em Portugal, tais como a leishmaniose, a febre da carraça, a dirofilariose, a peritonite infeciosa felina e as imunodeficiências felinas, com novas abordagens moleculares, tanto no processo de rastreio como na confirmação e seguimento dessas doenças. São evidenciadas as estratégias potencialmente mais adequadas ao diagnóstico em cada situação específica considerando a sintomatologia do animal.

Introdução As doenças infeciosas em medicina veterinária podem ser causadas por vários agentes patogénicos, incluindo vírus, bactérias, protozoários e fungos. A sua transmissão é feita por vetores, tais como, mosquitos (por exemplo, dirofilariose), flebótomos (por exemplo, leishmaniose), carraças (por exemplo, erliquiose), ou através do contacto direto com animais infetados (por exemplo, peritonite infeciosa felina – PIF). Algumas destas doenças são subclínicas e outras potencialmente fatais, podendo desenvolver-se após longos períodos de incubação e com manifestações clínicas inespecíficas que dificultam o diagnóstico. A análise laboratorial com vista ao despiste e confirmação de doenças infeciosas é fundamental para desencadear um tratamento adequado. Apesar do desenvolvimento científico e tecnológico que se tem registado nos últimos anos na área do diagnóstico laboratorial veterinário, ainda não existem técnicas absolutamente sensíveis e específicas, pelo que o diagnóstico requer muitas vezes uma abordagem

integrada. Esta pode incluir um exame físico, testes hematológicos, parâmetros bioquímicos e outras técnicas laboratoriais específicas dirigidas para o microrganismo suspeito. No entanto, tendo em consideração a complexidade associada ao diagnóstico veterinário e a sintomatologia, muitas vezes sindrómica, do animal, é natural que surjam dúvidas sobre a escolha da técnica mais adequada, bem como na interpretação dos resultados subjacentes. O objetivo deste capítulo é rever e avaliar as principais técnicas parasitológicas e imunológicas disponíveis e discutir a utilidade de se apoiar o diagnóstico tradicional com novas abordagens moleculares, tanto no processo de rastreio como na confirmação de doenças infeciosas. Incidindo nas doenças infeciosas com maior expressão em animais de companhia em Portugal, pretende-se, assim, evidenciar as técnicas que potencialmente serão mais ajustadas ao diagnóstico em cada situação específica considerando a sintomatologia do animal.

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Contributo das metodologias moleculares para a vigilância epidemiológica de doenças infeciosas na fauna selvagem Nuno Santos, Gonçalo M. Rosa, Alexandra Müller, Diogo Guerra, Luís Madeira de Carvalho, Virgílio Almeida

Sumário A circulação de agentes patogénicos na fauna selvagem tem conduzido a implicações graves na saúde pública, na saúde e no bem-estar animal, e na conservação da Natureza como o atestam as pandemias de síndrome respiratória aguda severa (SARS) e de gripe aviária altamente patogénica (HPAI, associada aos subtipos H5N1 e H7N9) registadas na primeira década do século xxi. As particularidades inerentes à vida livre da fauna selvagem dificultam o estudo e a vigilância epidemiológica dos agentes infeciosos e parasitários, e inviabilizam, muitas vezes, o recurso a métodos convencionais de diagnóstico. As técnicas moleculares apresentam inúmeras vantagens, pois permitem gerar informação epidemiológica que, de outra forma, se manteria desconhecida. Neste capítulo, apresentam-se três estudos de caso sobre agentes tão diversos como fungos, vírus e helmintes em diferentes espécies de hospedeiros, que ilustram o potencial das técnicas moleculares de diagnóstico em epidemiovigilância, gestão e conservação de espécies selvagens.

Introdução

Uma só Saúde O conceito de “Uma só Saúde” consolidou-se no início do século xxi, a partir da tomada de consciência da interdependência entre a saúde humana, a saúde e o bem-estar animal e a saúde ambiental. Visa a melhoria da qualidade de vida e do bem-estar de todas as espécies e do planeta em geral, através de colaborações interdisciplinares entre a medicina humana, a medicina veterinária e as ciências ambientais1. Para essa tomada de consciência, foi essencial a constatação de que a maior parte das doenças infeciosas que afetam o Homem tem origem nos animais. De facto, estima-se que mais de 70% das doenças emergentes tenham origem em animais e

que, para a maioria, a fauna selvagem constitua o principal reservatório2. Entre outros fatores, o aumento da população humana nos países em desenvolvimento, a destruição e ocupação das zonas naturais, bem como o desenvolvimento dos meios de transporte e crescente facilitação da circulação de pessoas e mercadorias, e a proteção e o consequente incremento das populações de espécies selvagens nos países desenvolvidos, ampliam a interface de contactos viáveis e de trocas de agentes patogénicos entre a fauna selvagem, os animais domésticos e o Homem2. O papel da fauna selvagem na ocorrência e na persistência de doenças nas espécies pecuárias pode ter impactos económicos muito grandes, como foi recentemente demonstrado com os anatídeos selvagens na pandemia de gripe aviária3 e com o javali nos focos de peste suína clássica 189

A ecologia molecular como ferramenta na gestão e conservação de espécies silvestres Luís M. Rosalino, Luis A. B. Bassetti, Karina L. Silva-Brandão, Carlos Fernandes

Sumário Os crescentes desafios que a gestão e conservação da biodiversidade enfrentam atualmente, impostos pela contínua alteração das paisagens e da estrutura das comunidades naturais, têm aumentado a necessidade de aquisição de dados bioecológicos sólidos. Para colmatar algumas lacunas de conhecimento, os gestores e conservacionistas têm vindo a recorrer a técnicas de ecologia molecular, baseadas na análise comparativa intra e interespecífica de marcadores moleculares, como complemento às ferramentas de monitorização ecológica mais tradicionais. Uma vez que os fatores populacionais e genéticos estão envolvidos na perda da biodiversidade a vários níveis, com a consequente extinção de espécies e/ou de populações, este tipo de abordagem é, cada vez mais, crucial. Com o presente capítulo, pretendemos demonstrar, ilustrar e sublinhar a importância de se incluir a vertente de ecologia molecular como mais uma ferramenta na gestão e conservação de espécies silvestres. Será abordada a utilidade do uso de marcadores neutrais, microssatélites, sequências de DNA mitocondrial, entre outras técnicas de ecologia molecular, na aquisição de dados ecológicos. Finalmente, serão apresentados exemplos concretos onde estas técnicas se têm mostrado úteis na gestão de populações silvestres.

introdução A gestão da fauna silvestre visa essencialmente a manutenção de espécies ou populações a níveis demograficamente compatíveis com objetivos específicos e de uma forma sustentável. Estes objetivos podem ser muito díspares, correspondendo a interesses, por vezes, considerados antagónicos, como sejam a conservação de espécies ou populações; a sua manutenção, de modo a que a exploração comercial (por exemplo, através da caça ou pesca) não faça perigar a sua existência na Natureza; ou o controlo de pragas, i.e., espécies nativas ou introduzidas que, em determinada

região ou período temporal, atingem efetivos populacionais anormalmente elevados, podendo causar prejuízos ecológicos e económicos1. Esta gestão baseia-se frequentemente em dados obtidos utilizando ferramentas de cariz ecológico (por exemplo, transectos lineares, captura/recaptura), centradas em estimativas de presença/ausência, abundância relativa (número de animais ou deteções da espécie/unidade de amostragem) ou densidade (número de animais/unidade de área). No entanto, esta abordagem clássica pode ser redutora, uma vez que nada diz acerca das adaptações evolutivas e funcionais, ou das especificidades genéticas e demográficas das 205

16,7cm x 24cm

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Moleculares em Veterinária

Como desvendar a etiologia e a epidemiologia da infeção

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ISBN 978-989-752-034-1

9 789897 520341

Mónica V. Cunha João Inácio

www.lidel.pt

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Coordenação:

Mónica V. Cunha João Inácio