Fundamentos de Imunologia (2ª Edição) by Grupo Lidel

2.ª Edição

Fundamentos de

IMUNOLOGIA Coordenação

Fernando A. Arosa / Elsa M. Cardoso / Francisco C. Pacheco

Fernando A. Arosa Licenciou-se em Ciências Biológicas pela Universidade de Valência (Espanha) em 1988. Entre 1990 e 2004 foi investigador na área da Imunologia Celular e Molecular Humana nos laboratórios de Maria de Sousa (ICBAS e IBMC, Porto), Christopher E. Rudd (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, EUA), David N. Posnett (Cornell University Medical College, Nova Iorque) e Sándor Damjanovich (University of Debrecen, Debrecen). Doutorou-se em Ciências Biomédicas pela Universidade do Porto em 1999. Entre 2005 e 2009 foi diretor do grupo de investigação Biologia de Linfócitos no IBMC. Em 2009 aceitou a posição de Professor Auxiliar Convidado no Instituto Superior de Ciências da Saúde – Norte (CESPU), em Gandra, onde coordena a linha de investigação em Imunologia Integrativa Humana.

Elsa M. Cardoso Licenciou-se em Química Aplicada, ramo de Biotecnologia, pela Universidade Nova de Lisboa em 1995. Entre 1995 e 2000 foi investigadora na área da Imunologia Humana nos laboratórios de Maria de Sousa (ICBAS e IBMC, Porto) e Rolf Hultcrantz (Instituto Karolinska, Estocolmo). Doutorou-se em Ciências Biomédicas, especialidade de Imunologia, pela Universidade do Porto em 2000. Desde 2001 é Professora Auxiliar no Instituto Superior de Ciências da Saúde – Norte (CESPU), em Gandra, onde coordena o Grupo de Biologia Molecular e Celular.

Francisco C. Pacheco Licenciou-se em Medicina pela Faculdade de Medicina da Universidade do Porto; especialista em Imuno-Hemoterapia, Patologia Clínica e Hematologia Clínica pela Ordem dos Médicos; Diretor do Serviço de Imuno-Hemoterapia do Centro do Porto do Instituto Português de Oncologia (jubilado); Professor Auxiliar Convidado de Imunologia no Instituto Superior de Ciências da Saúde – Norte (CESPU) (jubilado), tendo integrado, durante 20 anos, o corpo docente do Curso de Oncologia Básico do Instituto Português de Oncologia (Centro do Porto).

Fundamentos de Imunologia 2.ª edição atualizada e aumentada

Coordenação

Fernando A. Arosa Elsa M. Cardoso Francisco C. Pacheco

Lidel – edições técnicas, lda.

Índice Lista de Autores ........................................................................................................................................

Prefácio à 2.ª edição ................................................................................................................................

Prefácio à 1.ª edição .................................................................................................................................

XVII

Nota do Editor ............................................................................................................................................

XIX

Legenda dos Símbolos............................................................................................................................

XXI

Lista de Siglas/Abreviaturas ..................................................................................................................

XXIII

1 Perspetiva histórica da Imunologia.....................................................................................................

Francisco C. Pacheco • • • • • •

Os primeiros passos: o primado da Imunologia humoral e a vacinação........................ A teoria celular da imunidade ......................................................................................................... Uma visão unificada da resposta imunológica ......................................................................... A heterogeneidade dos fenómenos imunológicos: a descoberta de novos caminhos Da imunogenética aos desafios do futuro ................................................................................. Imunologia em Portugal ....................................................................................................................

1 7 10 14 17 22

2 Visão global do sistema imunológico ...............................................................................................

Elsa M. Cardoso • As células do sistema imunológico................................................................................................. • Ontogenia das populações hematopoiéticas .............................................................................. • Os órgãos do sistema imunológico ................................................................................................

33 37 40

3 Imunidade inata e inflamação ..............................................................................................................

Francisco C. Pacheco, Elsa M. Cardoso • Imunidade inata ou natural ............................................................................................................... • O sistema do complemento .............................................................................................................. • A reação inflamatória e o estabelecimento da resposta imunológica adaptativa ................

60 77 93

4 Desenvolvimento linfocitário: o conceito de tolerância .............................................................. Fernando A. Arosa, Elsa M. Cardoso

103

EDIÇÕES TÉCNICAS

• • • •

Tolerância imunológica........................................................................................................................ Linfócitos B: desenvolvimento .......................................................................................................... Linfócitos T: desenvolvimento ........................................................................................................... Linfócitos NK: desenvolvimento .......................................................................................................

104 105 110 116

5 Complexo major de histocompatibilidade ....................................................................................... Fernando A. Arosa

121

• • • • • •

Identificação dos genes de MHC: perspetiva histórica ........................................................... Organização génica do MHC ............................................................................................................ Estrutura das moléculas de MHC classe I .................................................................................... Estrutura das moléculas de MHC classe II ................................................................................... Expressão das moléculas de MHC................................................................................................... Endocitose de moléculas de MHC ..................................................................................................

122 123 126 128 130 132

VI Fundamentos de Imunologia • • • • •

Funções imunológicas das moléculas de MHC clássicas na superfície celular .................. Moléculas de MHC classe I solúveis ............................................................................................... Estrutura e expressão das moléculas de MHC classe I não-clássicas ................................ Estrutura e expressão das moléculas de MHC classe II não-clássicas ............................... Funções não imunológicas das moléculas de MHC classe I .................................................

133 136 137 141 142

6 Processamento e apresentação de antigénios ...............................................................................

147

Fernando A. Arosa, Elsa M. Cardoso • Processamento e apresentação de proteínas por moléculas de MHC classe I: a via citosólica ................................................................................................................................................... • Processamento e apresentação de proteínas por moléculas de MHC classe II: a via endocítica ................................................................................................................................................. • Apresentação de péptidos lisossomais por moléculas de MHC classe I: apresentação cruzada ...................................................................................................................................................... • Processamento e apresentação de lípidos por moléculas de CD1 ..................................... • As células apresentadoras de antigénios...................................................................................... 7 Células dendríticas ....................................................................................................................................

148 153 157 159 164 171

Maria Teresa Cruz, Maria Celeste Lopes • • • • • •

Células dendríticas: origem, diferenciação e distribuição nos tecidos do organismo Reconhecimento e captação de antigénios pelas células dendríticas ............................... Processamento de antigénios pelas células dendríticas ......................................................... Maturação das células dendríticas .................................................................................................. Migração das células dendríticas ..................................................................................................... Interação das células dendríticas com linfócitos T: o papel das moléculas coestimuladoras ....................................................................................................................................................... • Eventos biológicos após a interação das células dendríticas com linfócitos .................. • Células dendríticas: aplicação em estratégias imunoterapêuticas .......................................

172 176 181 183 184

8 Imunoglobulinas.........................................................................................................................................

195

187 188 191

Elsa M. Cardoso • • • • • • • •

Estrutura das imunoglobulinas ......................................................................................................... Tipos de imunoglobulinas .................................................................................................................. Estrutura dos genes das imunoglobulinas ................................................................................... Mecanismos de rearranjo somático dos genes das imunoglobulinas ............................... Mecanismos responsáveis pela diversidade das imunoglobulinas ...................................... Mecanismo de mudança ou comutação no isotipo ou classe das imunoglobulinas .. Imunoglobulina membranar versus imunoglobulina segregada.......................................... Imunoglobulina IgM versus IgD .......................................................................................................

195 199 204 207 211 213 214 214

9 Linfócitos B ..................................................................................................................................................

219

Elsa M. Cardoso, Francisco C. Pacheco • • • • • • •

Estrutura do recetor do linfócito B ................................................................................................. Correcetores dos linfócitos B ............................................................................................................ Subpopulações de linfócitos B ......................................................................................................... Respostas humorais independentes dos linfócitos T ............................................................... Respostas humorais dependentes dos linfócitos T ................................................................... Conversão de respostas TI-2 em respostas TD: vacinas conjugadas ................................. Mecanismos efetores dos linfócitos B ...........................................................................................

219 220 221 222 223 227 227

Índice VII 10 Linfócitos T ..................................................................................................................................................

237

Fernando A. Arosa, Elsa M. Cardoso • • • • • • • • •

Identificação do TCR: breve perspetiva histórica....................................................................... Estrutura e função do complexo TCR/CD3: o sinal de ativação 1 ...................................... Regulação da expressão do complexo TCR/CD3 ....................................................................... Organização genómica dos genes do TCR: mecanismos de rearranjo e diversidade Tipos de linfócitos TCR ! com origem no timo: características e recetores .................. Fases de uma resposta imunológica mediada por linfócitos TCR ! convencionais .... Diferenciação de linfócitos T convencionais: o papel das células dendríticas ............... Diferenciação de linfócitos T CD4+ convencionais induzida por células dendríticas ... Diferenciação de linfócitos T CD8+ convencionais induzida por células dendríticas ...

237 238 240 241 244 251 256 258 261

11 Linfócitos NK ...............................................................................................................................................

269

Fernando A. Arosa, Elsa M. Cardoso Breve perspetiva histórica: a hipótese do missing self ........................................................... Recetores de citotoxicidade natural ou NCR .............................................................................. CD16 E CD56 ........................................................................................................................................... Recetores KIR .......................................................................................................................................... LILR.............................................................................................................................................................. SIGLEC ........................................................................................................................................................ CEACAM .................................................................................................................................................... DAP12 e DAP10 ...................................................................................................................................... CD94 e NKG2 .......................................................................................................................................... NKG2D ....................................................................................................................................................... Recetores de citocinas ......................................................................................................................... Outros recetores NK ............................................................................................................................. Ativação e função de linfócitos NK ................................................................................................ Transmissão de sinais intracelulares pelos recetores NK .......................................................

269 271 272 273 276 277 278 278 278 279 279 280 280 282

12 Linfócitos NKT .............................................................................................................................................

287

• • • • • • • • • • • • • •

Fernando A. Arosa, Elsa M. Cardoso • Linfócitos NKT: breve perspetiva histórica ................................................................................... • Linfócitos NKT-1 ..................................................................................................................................... • Linfócitos NKT-2 .....................................................................................................................................

287 289 294

13 Citocinas .......................................................................................................................................................

301

Manuel Santos Rosa, Anabela Mota Pinto, Ana Todo-Bom, Helena Oliveira Sá

EDIÇÕES TÉCNICAS

• • • •

Características gerais das citocinas na resposta imunoinflamatória................................... Citocinas associadas à resposta inflamatória e alérgica ......................................................... Outras citocinas com ação proinflamatória ................................................................................. Citocinas com ação anti-inflamatória e reguladora (IL-10, TGF-!) e regulação da ação proinflamatória das citocinas ............................................................................................................ • Citocinas como fator determinante da polarização Th na resposta adaptativa/Th1, Th2, Th17, Treg ....................................................................................................................................... 14 Mecanismos de transdução de sinais em linfócitos.....................................................................

302 303 312 313 315 321

Fernando A. Arosa, Elsa M. Cardoso • • • •

Função Função Função Função

das sequências ITAM e ITIM na transmissão de sinais ........................................... dos domínios SH nas associações moleculares .......................................................... reguladora das cinases ........................................................................................................ reguladora das fosfatases ...................................................................................................

322 324 326 331

VIII Fundamentos de Imunologia • Segundos mensageiros: DAG e IP3 ................................................................................................. • Proteínas adaptadoras: amplificadores do sinal......................................................................... • Microdomínios ou rafts: regiões membranares ricas em glicoesfingolípidos e colesterol ............................................................................................................................................................ • Exemplos de transdução de sinais em populações linfocitárias ..........................................

333 335 335 337

15 Autoimunidade ...........................................................................................................................................

343

Luís Graça, Luís Delgado • • • • • •

Tolerância imunológica........................................................................................................................ Etiopatogenia da autoimunidade .................................................................................................... Espectro clínico das doenças autoimunes .................................................................................... Mecanismos imunopatogénicos ....................................................................................................... Os autoanticorpos no diagnóstico das doenças autoimunes ............................................... Terapêutica imunológica nas doenças autoimunes ..................................................................

345 347 351 352 353 354

16 Imunologia tumoral ..................................................................................................................................

363

Sara Maia, Ângelo A. Cardoso • • • • • • • • •

Células tumorais: estranho, próprio ou perigo?......................................................................... Vigilância imunológica antitumoral ................................................................................................ Mecanismos de escape ao sistema imunológico: a tolerância imunológica ................... Antigénios tumorais .............................................................................................................................. Antigénios tumorais: metodologias para a sua identificação ............................................... Antigénios tumorais: classificação ................................................................................................... Imunoterapia antitumoral ................................................................................................................... Terapia génica ......................................................................................................................................... Métodos usados para detetar linfócitos T específicos antitumorais ..................................

363 364 365 372 374 375 376 383 383

17 Imunodeficiências ......................................................................................................................................

391

Eugénia C. Miranda Santos, Júlia Vasconcelos, Esmeralda Neves, João Castro e Melo • Imunodeficiências primárias .............................................................................................................. • Imunodeficiências secundárias..........................................................................................................

391 409

18 Imunologia da infeção ............................................................................................................................

427

Ricardo Silvestre, Anabela Cordeiro-da-Silva • • • • • • •

Resposta imunológica a infeções virais......................................................................................... Resposta imunológica a infeções por bactérias extracelulares ............................................ Resposta imunológica a infeções por bactérias intracelulares ............................................. Resposta imunológica a infeções por fungos ............................................................................. Resposta imunológica a infeções por protozoários ................................................................. Resposta imunológica a infeções por helmintas ....................................................................... Vacinas .......................................................................................................................................................

429 432 436 439 442 447 449

19 Hipersensibilidades ...................................................................................................................................

455

Luís Taborda Barata • • • • •

Hipersensibilidade do tipo I (imediata) ......................................................................................... Hipersensibilidade do tipo II (citotóxica) ...................................................................................... Hipersensibilidade do tipo III (por complexos imunes) .......................................................... Hipersensibilidade do tipo IV (retardada) .................................................................................... Tratamento das hipersensibilidades ...............................................................................................

457 461 467 471 485

Índice IX 20 Imunologia de transplantação ..............................................................................................................

493

Ana J. Coito, Hélder Trindade • • • • • • • •

Vocabulário em transplantação ........................................................................................................ Conceitos básicos em Imunologia de transplantação ............................................................. Lesão por isquemia/reperfusão ........................................................................................................ Diferentes tipos de rejeição ............................................................................................................... Tolerância.................................................................................................................................................. Terapias imunossupressoras em transplantação ........................................................................ Xenotransplantação............................................................................................................................... Doença do enxerto contra o hospedeiro .....................................................................................

494 494 497 498 501 502 502 503

21 Imunologia e nutrição .............................................................................................................................

507

Maria Cristina Guimarães • • • • • •

O sistema imunológico perante o aporte alimentar ................................................................ Tolerância, intolerância e alergia alimentar ................................................................................. Imunonutrição ......................................................................................................................................... Desequilíbrios nutricionais e comportamento imunológico .................................................. Casos particulares .................................................................................................................................. Notas finais ..............................................................................................................................................

508 510 512 514 515 517

22 Imunologia da cavidade oral ................................................................................................................

523

Francisco C. Pacheco • • • • • • • • • • •

Ontogenia da resposta imunológica da cavidade bocal ........................................................ Bases estruturais e caracterização dos mecanismos efetores da imunidade oral......... Consequências imunológicas da formação da placa bacteriana dentária ....................... Reações imunológicas na doença periodontal ........................................................................... Proteção imunológica contra a cárie dentária: tentativas de imunização ....................... Aspetos imunológicos da doença pulpar ..................................................................................... Imunologia das infeções orais .......................................................................................................... Manifestações orais das situações de imunodeficiência......................................................... Manifestações orais da infeção pelo VIH ..................................................................................... Manifestações orais de doenças sistémicas mediadas por mecanismos imunológicos Imunologia tumoral oral .....................................................................................................................

524 526 531 534 542 545 548 551 553 553 557

23 Técnicas de Imunologia ..........................................................................................................................

565

Fernando A. Arosa, Elsa M. Cardoso

EDIÇÕES TÉCNICAS

• • • • • •

Isolamento de células mononucleares do sangue periférico ................................................ Culturas de células ................................................................................................................................ Análise de proteínas: técnicas imunológicas de diagnóstico ................................................ Imunoprecipitação de proteínas ...................................................................................................... Microscopia .............................................................................................................................................. Citometria de fluxo ...............................................................................................................................

565 567 572 580 583 589

Soluções às questões para revisão ....................................................................................................

599

Índice remissivo .........................................................................................................................................

605

Lista de Autores Coordenadores

Fernando A. AROSA Professor Auxiliar Convidado do Instituto Superior de Ciências da Saúde - Norte, CESPU, Gandra; Coordenador do Laboratório de Imunologia Humana Integrativa, Centro de Investigação em Ciências da Saúde, Instituto Superior de Ciências da Saúde - Norte, CESPU, Gandra.

Elsa M. CARDOSO Professora Auxiliar do Instituto Superior de Ciências da Saúde - Norte, CESPU, Gandra; Coordenadora do Grupo de Biologia Celular e Molecular, Centro de Investigação em Ciências da Saúde, Instituto Superior de Ciências da Saúde - Norte, CESPU, Gandra.

Francisco C. PACHECO Licenciado em Medicina e Patologista; Diretor do Serviço de Imuno-hemoterapia jubilado. Coautores

Ângelo A. CARDOSO

Instructor em Medicina e Investigador, Dana-Farber Cancer Institute, Harvard Medical School, Boston, EUA; Professor Auxiliar, Melvin and Bren Simon Cancer Center, Indiana University Medical School, Indiana, EUA.

João CASTRO E MELO Diretor do Departamento de Patologia Laboratorial do Hospital Geral de Santo António, Porto, jubilado.

Ana J. COITO

Professora do Departamento de Cirurgia da University of California, Los Angeles (UCLA) David Geffen School of Medicine, The Dumont-UCLA Transplant Center, EUA.

Anabela CORDEIRO-DA-SILVA

EDIÇÕES TÉCNICAS

Professora Associada com Agregação da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto; Diretora de Investigação do Grupo de Doenças Parasitárias do Instituto de Biologia Molecular e Celular (IBMC).

Maria Teresa CRUZ Professora Auxiliar da Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra; Investigadora do Centro de Neurociências e Biologia Celular da Universidade de Coimbra.

Luís DELGADO Professor Associado com Agregação de Imunologia da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto; Diretor do Serviço e do Laboratório de Imunologia da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto.

XII Fundamentos de Imunologia

Luís GRAÇA Professor Auxiliar da Facudade de Medicina da Universidade de Lisboa; Diretor da Unidade de Imunologia Celular do Instituto de Medicina Molecular.

Maria Cristina GUIMARÃES Professora Auxiliar de Imunologia da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto; Assistente Hospitalar Graduada de Imunologia do Centro Hospitalar de São João, EPE, Porto.

Maria Celeste LOPES Professora Catedrática da Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra; Investigadora do Centro de Neurociências e Biologia Celular da Universidade de Coimbra.

Sara MAIA

Investigadora, Dana-Farber Cancer Institute, Harvard Medical School, Boston, EUA.

Eugénia C. MIRANDA SANTOS Diretora do Serviço de Imunologia do Hospital Geral de Santo António, Porto, jubilada.

Anabela MOTA PINTO Professora Associada com Agregação de Fisiopatologia; Diretora do Laboratório de Patologia Geral da Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra.

Esmeralda NEVES Assistente Hospitalar de Imunologia do Serviço de Imunologia do Hospital Geral de Santo António, Centro Hospitalar do Porto.

Helena OLIVEIRA SÁ Professora Auxiliar Convidada da Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra; Assistente Hospitalar Graduada em Nefrologia no Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra.

Manuel SANTOS ROSA Professor Catedrático de Imunologia e Diretor do Laboratório de Imunologia, Citometria de Fluxo e Separação Celular da Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra.

Ricardo SILVESTRE

Investigador Auxiliar do Grupo Parasite Disease do Instituto de Biologia Molecular e Celular (IBMC).

Luís TABORDA BARATA Professor Associado do Departamento de Ciências Médicas da Faculdade de Ciências da Saúde (FCS) da Universidade da Beira Interior; Presidente da FCS; Diretor do Serviço de Imunoalergologia do Centro Hospitalar Cova da Beira, EPE, Covilhã.

Ana TODO-BOM Professora Auxiliar Convidada da Faculdade de Medicina de Coimbra; Assistente Hospitalar Graduada em Imunoalergologia no Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra.

Índice XIII

Hélder TRINDADE Professor Catedrático do Departamento de Imunologia da Faculdade de Ciências Médicas de Lisboa; Presidente do Instituto Português do Sangue e da Transplantação.

Júlia VASCONCELOS

EDIÇÕES TÉCNICAS

Assistente Hospitalar Graduada de Imunologia do Serviço de Imunologia do Hospital Geral de Santo António, Centro Hospitalar do Porto.

Prefácio à 2.ª edição Perguntaram, um dia, ao sábio Linus Pauling (Prémio Nobel da Química): – “O que é preciso para ganhar um Prémio Nobel de Ciência”? Depois de uma breve hesitação, Pauling deu esta resposta: – “Olhe, é preciso ter muitas ideias e ter coragem de as deitar quase todas fora”. Entre nós, a reedição de uma obra científica em língua portuguesa – testemunho do interesse com que o público recebeu a primeira edição de Fundamentos de Imunologia – é um acontecimento de assinalar e que premeia o esforço posto pelos autores dos textos e pelos editores no lançamento de uma obra desta natureza, naturalmente destinada a um público restrito. Como referimos no prefácio da primeira edição, a Imunologia é a ciência que estuda o conjunto complexo de mecanismos integrados (o sistema imunológico) que tem como uma das suas funções a discriminação entre o “próprio”, o “próprio alterado” e o “alheio”. Porém, a Imunologia transformou-se numa ciência contraditória e de compreensão mais complexa. As suas diferentes manifestações forçaram, assim, a uma profunda revisão de conceitos. Esta é uma razão essencial para justificar o enorme interesse e importância de que hoje se reveste o conhecimento imunológico. Ciência em constante mutação, ao penetrar, cada vez mais profundamente, nos mecanismos genéticos e moleculares das reações imunológicas, as dúvidas e as perguntas multiplicam-se incessantemente, transformando-se substrato de uma investigação ativa, servida por meios técnicos cada vez mais sofisticados e rigorosos, revelando-nos a complexidade crescente daquilo que, há alguns anos, se aceitava transitoriamente como satisfatório mas simultaneamente tão misterioso como fascinante. Foi nesse espírito e com essa intenção que este livro foi escrito e, agora, revisto e atualizado.

EDIÇÕES TÉCNICAS

Nesta segunda edição, para além da revisão e atualização da maior parte dos capítulos que integravam a edição anterior deste livro, sentiram os coordenadores a necessidade de acrescentar outros que reunissem informação atualizada e suficientemente detalhada sobre a importância das células dendríticas nos mecanismos imunológicos bem como um outro dedicado especialmente às citocinas, área de complexidade crescente e sujeita, tal como as células dendríticas, a ativa investigação, no sentido de tentar esclarecer e sistematizar, de uma forma mais integrada, a multiplicidade de interações e sinergias, por elas veiculadas, que poderão clarificar alguns aspetos da biologia celular, base indispensável à compreensão dos mecanismos imunológicos. Dois outros novos capítulos, um dedicado à importância da nutrição na integridade funcional do sistema imunológico e um outro, de caráter prático, sobre as técnicas imunológicas que apoiam as áreas de diagnóstico e de investigação laboratorial completam a nova versão desta segunda edição de Fundamentos de Imunologia, alargando a um campo mais vasto de leitores e estudiosos uma perspetiva mais atualizada do conhecimento imunológico. Porto, junho de 2012 Os Coordenadores

Nota do Editor A publicação da segunda edição do livro Fundamentos de Imunologia vem confirmar o espírito inicial dos coordenadores de preencher uma lacuna na bibliografia disponível em português nesta área biomédica. Muitas das características da obra foram pensadas para orientar os estudantes do ensino superior universitário e politécnico na área da Imunologia e conduzir a uma melhor compreensão dos assuntos mais complexos do funcionamento do sistema imunológico. Para além da revisão e atualização da maioria dos capítulos que integravam a edição anterior, que veio a revelar-se um êxito editorial, nesta obra acrescentaram-se novos capítulos dedicados às células dendríticas, às citocinas, à nutrição e ainda um último sobre as técnicas imunológicas que apoiam as áreas de diagnóstico e de investigação laboratorial. Sempre que pertinente foram introduzidos destaques clínicos que despertam o Leitor para aspetos clínicos e laboratoriais de tópicos científicos atuais. Em linha com a edição anterior, houve a preocupação de modernizar e uniformizar a terminologia científica utilizada ao longo de toda a obra, sendo que foi já adotado o novo Acordo Ortográfico. Esta nova edição foi ainda profusamente ilustrada a cores, sendo essa uma mais-valia em relação à edição anterior. As figuras são originais, com uma linha gráfica uniforme e de elevado rigor científico. Houve aliás grande preocupação em manter os traços e cores nos elementos que se repetem ao longo do livro. As discrepâncias que ocorrem são propositadas e têm fundamento (veja-se o caso do citoplasma que por vezes surge com cores diferentes dependendo da célula representada). Ao longo do livro o Leitor encontrará vários elementos que complementam o conteúdo de cada capítulo: • SUMÁRIO: No início de cada capítulo, fornece um resumo do texto e uma visualização rápida de toda a matéria abordada. Permite ao Leitor reter os tópicos essenciais. “Ao longo deste capítulo, vão-se analisando alguns passos isolados da evolução histórica da Ciência, o alcance gradual de novas etapas, a sua consolidação teórica e a progressiva admissão de conceitos mais abrangentes, que acabariam por transformar essas observações biológicas surpreendentes num ramo integrado do conhecimento científico que viria a ser designado por (...)”

EDIÇÕES TÉCNICAS

• CAIXAS DE DESTAQUE: Apresentam definições importantes. São um complemento e não uma extensão do texto, motivo pelo qual só aparecem na parte básica do livro. Dada a importância do seu conteúdo, foi realçada a sua apresentação gráfica de forma a destacar a informação. Anticorpos ou imunoglobulinas solúveis são proteínas segregadas pelos plasmócitos (linfócitos B diferenciados), que viajam pelo sangue e fluidos tecidulares à procura de moléculas an génicas especíÞcas (que induziram a síntese desses mesmos an corpos), às quais se ligam para desencadearem uma série de respostas imunológicas, com vista à destruição do agente transportador desse an génio.

XX Fundamentos de Imunologia

• DESTAQUES CLÍNICOS: Desenvolvem de uma maneira sucinta e didática aspetos clínico-laboratoriais de tópicos científicos atuais, desde o impacto das vacinas em doenças infeciosas até à utilização de novas terapias imunológicas para o tratamento de doenças autoimunes e oncológicas.

DESTAQUE CLÍNICO APLICA ÍES CLêNICAS DAS CÉLULAS ESTAMINAIS HEMATOPOIÉTICAS A célula estaminal hematopoié ca ou HSC (do inglês Hematopoie c Stem Cell) é uma célula precursora mul potente, capaz de se autorrenovar (passar por vários ciclos de divisão celular, mantendo o estado indiferenciado) e de regenerar todas as células sanguíneas.

• ENDEREÇO(S) DE INTERESSE NA INTERNET: Permitem ao Leitor aceder a informações complementares sobre a matéria abordada.

ENDEREÇO!S" DE INTERESSE NA INTERNET h#p://www.hwicancerresearch.org/data/conten$iles/File/pdf/Dendri c_Mono.pdf De Meyer, ES, Baar, J. “Dendritic cells: the Sentry cells of the immune System”.

• QUESTÕES PARA REVISÃO: Permitem testar a memorização e a compreensão da matéria dada no capítulo. As SOLUÇÕES são apresentadas no fim do livro.

QUESTÕES PARA REVISÃO 1. Diga se é verdadeira ou falsa cada uma das seguintes aÞrmações: 1.1. Os linfócitos naïve migram para os órgãos linfoides secundários, onde Þcam re dos até que sejam es mulados por um an génio. 1.2. Em geral, os linfócitos passam do sangue para os tecidos atravessando as arteríolas.

Agradecemos a todos (professores, estudantes e restantes leitores) que com as suas sugestões contribuíram para lançarmos esta segunda edição. Esperamos que seja útil para a formação dos estudantes e dos profissionais de saúde que a leiam.

Capítulo

IMUNIDADE INATA E INFLAMAÇÃO Francisco C. Pacheco / Elsa M. Cardoso

A imunidade inata consiste na ação concertada de variados tipos celulares, recetores, sistemas de sinalização e mecanismos efetores. Em primeiro lugar, as barreiras epiteliais têm um papel fundamental na proteção do organismo contra a invasão de agentes patogénicos externos. Depois, o reconhecimento direto de diferentes agentes agressores (sejam eles bacterianos, víricos ou outros) induz a imunidade inata que constitui a primeira linha de defesa do organismo. Dentro dos vários mecanismos estudados, o sistema do complemento e a fagocitose constituem dois dos meios de defesa mais importantes, humorais e celulares, respetivamente. Porém a imunidade inata tem também um papel fundamental no encetar e no controlo da imunidade adaptativa. A inflamação, que tratamos com algum detalhe, é um bom exemplo da passagem de uma imunidade inata para o estabelecimento de uma resposta imunológica adaptativa. A imunidade adaptativa ocupará a maior parte do conteúdo deste livro.

O sistema imunológico tem a capacidade de responder a agressões externas, nomeadamente de natureza antigénica, quer seja um microrganismo ou uma macromolécula (proteínas ou polissacáridos) que sejam estranhos (non-self) ao organismo, defendendo-o, assim, das agressões exteriores (infeciosas ou outras). Pode, assim, definir-se a imunidade como o somatório de todos os mecanismos de defesa de que o nosso organismo dispõe para nos proteger das agressões que o ameaçam, como são, entre outras, as doenças infeciosas. Este processo de reação do sistema imunológico pode sistematizar-se em dois tipos de respostas inter-relacionadas e funcionalmente definidas: a resposta imunológica inata ou natural com uma especificidade de largo espectro e a resposta imunológica adaptativa ou adquirida com uma especificidade restrita. Nalguns casos, pode verificar-se uma resposta adaptativa excessiva ou exagerada (traduzindo-se por lesões tecidulares) ou deprimida (fa-

vorecendo, por exemplo, o desenvolvimento de infeções persistentes). Esta reatividade do sistema imunológico, desviada em intensidade ou localização, a antigénios próprios (autoantigénios) ou alheios, é o domínio do estudo da Imunopatologia. Mas o sistema imunológico pode não mostrar qualquer tipo de resposta a um determinado estímulo antigénico, tal como se verificaria em qualquer indivíduo normal e da mesma espécie, situação que se designa por tolerância imunológica (Figura 3.1). Em todas as suas formas de reatividade, o sistema imunológico é controlado por diversos mecanismos reguladores, responsáveis pelo equilíbrio da Imunostasia (o braço imunológico da Homeostasia), que fazem com que o sistema recupere o estado de equilíbrio e de capacidade reativa que existia antes do estímulo antigénico (motivador de uma resposta imunológica), o que lhe permite responder prontamente a

96 Fundamentos de Imunologia

migração dos linfócitos ativados para os focos inflamatórios depende da expressão à sua superfície de moléculas de adesão capazes de se ligarem a outras moléculas de adesão que são expressas à superfície das células endoteliais das vénulas e capilares. Mecanismo idêntico regula a migração dos fagócitos, como vimos. Tais moléculas de adesão pertencem a famílias estruturalmente relacionadas. A família das moléculas de adesão das células ou CAM (do inglês Cell Adhesion Molecules), das selectinas e das integrinas.

Expansão clonal

FIGURA 3.13. Expansão clonal de linfócitos especíÞcos para um determinado an génio. A Þgura representa uma célula dendrí ca num gânglio linfá co a apresentar um an génio (diamante, associado a uma molécula do complexo major de histocompa bilidade do po II) a um linfócito T auxiliar que possui um recetor à super!cie, que é especíÞco para esse an génio. Este linfócito é então es mulado a proliferar, obtendo-se uma população clonal de linfócitos especíÞcos para esse an génio. Note que existem outros linfócitos T auxiliares que não se dividem por apresentarem recetores especíÞcos para outros an génios e, por isso, não foram es mulados a proliferar. Note ainda que os recetores não estão na mesma escala que as células.

acabarem por entrar na circulação (recirculação dos linfócitos, ver Capítulo 2). Numa infeção, esta abundante proliferação celular origina um aumento do volume dos gânglios linfáticos regionais que pode ou não ser observado externamente. A partir do sangue periférico, a

Existem três grandes famílias de moléculas de adesão: • A maior parte das moléculas de adesão endoteliais pertence à superfamília das imunoglobulinas, de que são exemplo: a molécula de adesão intercelular do po 1 ou ICAM-1 (do inglês Intercelular Adhesion Molecule-1), ICAM-2, molécula de adesão das células vasculares ou VCAM-1 (do inglês Vascular Cell Adhesion Molecule-1), etc; • Por sua vez, os leucócitos expressam outras moléculas de adesão designadas por integrinas que têm par cular aÞnidade para se ligarem a moléculas expressas pelos endotélios e, também, pela matriz extracelular de que são exemplos: an génio funcional dos linfócitos do po 1 ou LFA-1 (do inglês Lymphocyte Func on-associated An gen-1), LFA-2, LFA-3, etc; • Finalmente, as selec nas são um grupo de moléculas de adesão existente tanto nos leucócitos (selec nas L), como nos endotélios a vados (selec nas E) e plaquetas (selec nas P, também encontradas nas células endoteliais) e que tendem a ligar-se a componentes carboidratados de outras moléculas.

Nas células endoteliais, estas moléculas podem ser induzidas por citocinas. Aliás, muitas células contêm consideráveis reservas intracelulares de moléculas de adesão, dentro de vesículas, as quais podem ser expressas à superfície da membrana celular dentro de minutos, processo que é desencadeado pela sua ativação por determinadas citocinas. Outras moléculas poderão ser sintetizadas e, depois, expressas à superfície da célula, num processo consideravelmente mais demorado. Naturalmente que todos estes mecanismos variam com o tipo de célula envolvida

Capítulo 3 - Imunidade Inata e Inßamação 97

(população celular), bem como com o seu estádio de diferenciação e de ativação. Atente-se que uma determinada molécula de adesão pode ligar-se a mais do que um tipo de ligante, uma vez que possui diferentes tipos de ligação. De um modo geral, a migração celular processa-se em quatro tempos: o primeiro é a fixação das células circulantes ao endotélio vascular e rolamento sobre este; o segundo é a ativação; o terceiro a adesão mais firme às células endoteliais, e, finalmente, o quarto é a travessia desse endotélio, pelas células, atraídas para o foco inflamatório sob o efeito de estímulos quimiotáticos ali gerados (ver Figura 3.12).

EDIÇÕES TÉCNICAS

Os padrões de migração celular são complexos: dependem não só da variabilidade das suas moléculas de superfície como da natureza e densidade das moléculas expressas pelas células endoteliais. Assim, por exemplo, as células endoteliais das chamadas vénulas de alto endotélio (presentes nos órgãos linfoides secundários e uma das vias de acesso privilegiada de linfócitos a estes órgãos) são, como vimos no Capítulo 2, muito diferentes das células endoteliais encontradas nos tecidos não linfoides. Sintetizando, a expressão de novas moléculas de adesão, ou o aumento da sua densidade, nas células endoteliais, sob a influência de citocinas produzidas no foco inflamatório, é, assim, um fenómeno que acompanha o processo inflamatório em geral. Para além da migração celular, participam, ativa e decisivamente no processo inflamatório, as moléculas que aqui chegam por transudação do plasma, determinada, sobretudo, pelo aumento da permeabilidade vascular. É assim possível, como já referimos, a grandes moléculas como anticorpos (se eventualmente já formados), componentes do complemento e moléculas de outros sistemas enzimáticos do plasma afluírem ao foco inflamatório. Assim se geram fatores quimiotáticos, como os resultantes da ativação do complemento (C3a e, particularmente, C5a) ou de macrófagos e mastócitos (como o leucotrieno B4), para além de moléculas geradas pela ativação dos sistemas da coagulação (fibrinopéptido B), fibrinolítico (plasmina) ou das cininas (bradicinina) ou dos monócitos que libertam

interleucina-8 (IL -8) que é um fator quimiotático para neutrófilos e basófilos, gerando-se, ainda, várias citocinas de baixo peso molecular designadas por quimiocinas.

As funções quimiotá ca e quimiociné ca são diferentes: a primeira traduz-se por uma migração direcional condicionada por um gradiente de concentração de uma molécula quimiotá ca, ao passo que a segunda é não-direcional, favorecendo, apenas, o seu movimento para o foco inßamatório. Os seus efeitos são, contudo, complementares e sinérgicos.

É assim essencial ao desenvolvimento do processo inflamatório o fenómeno da vasodilatação que constitui, por assim dizer, o primum movens da inflamação. É sobretudo desencadeada pela libertação de aminas vasoativas, histamina e 5-hidroxitriptamina (serotonina), libertadas por desgranulação dos basófilos e mastócitos tecidulares e plaquetas, nomeadamente sob o efeito ativador do fragmento C5a do complemento, gerado localmente pela ativação da via alternativa. A histamina, cujo efeito é dominante, tem um importante efeito vasodilatador pois promove a contração das fibras musculares lisas de alguns esfíncteres capilares e venulares, o que favorece o aumento da permeabilidade vascular e a passagem de plasma para o espaço extravascular (ver Figura 3.12). Este processo de ativação celular, desencadeado por alguns fragmentos do complemento e a génese de algumas citocinas, leva à libertação de outros importantes mediadores da inflamação, de ação mais lenta e sustentada, sobretudo devido à ativação do ácido araquidónico das membranas celulares, que vai originar leucotrienos e prostaglandinas que também participam nos efeitos da contração da musculatura lisa e da vasodilatação, potenciando os efeitos da histamina. Estes mediadores da inflamação, juntamente com outros sistemas de enzimas plasmáticos, consolidam o processo inflamatório que tende a localizar, limitar e neutralizar o agente agressor. Referimo-nos aos sistemas da coagulação, fibrinolítico e das cininas e, naturalmente, ao

98 Fundamentos de Imunologia

sistema do complemento cujo papel é fundamental (ver efeitos biológicos do complemento). Na verdade, o sistema do complemento, essencial nos mecanismos da imunidade inata, coopera nos mecanismos celulares e humorais que levam à formação de anticorpos, atuando como um elo de ligação fundamental entre o processo inflamatório inicial e os mecanismos imunológicos adaptativos. Por sua vez, as células que intervêm no processo inflamatório produzem citocinas cujo papel é particularmente importante na sinalização e interação celular. Inicialmente, citocinas como a interleucina-1 (IL -1) e a interleucina-6 (IL -6) podem ser libertadas pelas células do próprio tecido onde se localiza o processo inflamatório. Depois, as células mononucleares e linfócitos que, entretanto, vão sendo atraídos ao foco inflamatório (sempre que se verifica um processo de transição para a reatividade imunológica adaptativa) são ativadas pelos antigénios presentes (bacterianos, víricos ou outros), passando, por sua vez, a libertar as suas próprias citocinas (IL -1,IL -2, IL -4, TNF - , IFN-!, etc.) que, por seu turno, favorecem e potenciam a migração e ativação de determinadas células mais diretamente envolvidas na reação imunológica.

A reação imunológica adquirida é, assim, iniciada pelos antigénios, cuja eliminação ou neutralização não foi conseguida pela resposta imunológica natural, os quais são, então, reconhecidos pelos linfócitos como estranhos ou não-próprios. Neste contexto, a resposta imunológica implica a ativação de mecanismos do sistema imunológico específicos para o agente agressor. Difere, assim, do conceito de imunidade ou resistência a um antigénio particular, o que pressupõe a existência prévia de células de memória específicas de determinado antigénio, células estas que se formam no decurso do processo de desenvolvimento da resposta imunológica. Aqui, o termo específico refere-se ao reconhecimento de determinado epitopo de uma molécula antigénica pelo linfócito T através dos seus recetores específicos para o antigénio. O estudo mais detalhado da resposta imunológica adaptativa, bem como da sua regulação, ocupará a maior parte dos capítulos deste livro. As principais diferenças entre a imunidade inata e adaptativa estão assinaladas na Tabela 3.5. Epitopo ou determinante an génico é o local an génico (estrutura molecular) que é reconhecido por uma imunoglobulina ou an corpo.

TABELA 3.5. CARACTERÍSTICAS DAS RESPOSTAS IMUNOLÓGICAS INATA E ADAPTATIVA COMPONENTES DA RESPOSTA IMUNOLÓGICA

RESPOSTA IMUNOLÓGICA INATA OU NATURAL

RESPOSTA IMUNOLÓGICA ADAPTATIVA OU ADQUIRIDA

Ocorrência temporal

Imediata

Tardia (2 a 5 dias)

Barreira !sica e química

Células fagocí cas

Células NK/NKT

Linfócitos T

" (+, linfócitos !# T)

Linfócitos B

" (+, linfócitos B-1)

An corpos

" (+, naturais)

Complemento

Citocinas

Tipo de especiÞcidade

Largo espectro: estruturas conservadas e, portanto, semelhantes em vários pos de agentes patogénicos

Restrita: an génios par culares a um determinado agente patogénico; detalhes na estrutura (secundária)

Memória imunológica

AmpliÞcação

+ (clonal)

+ presente; – ausente

Capítulo 3 - Imunidade Inata e Inßamação 99

DESTAQUE CLêNICO

EDIÇÕES TÉCNICAS

A PROTEÍNA C REATIVA DESEMPENHA UM PAPEL NA REAÇÃO INFLAMATÓRIA E NO DESENVOLVIMENTO DA ATEROSCLEROSE, CONSTITUINDO UM MARCADOR DE RISCO DA DOENÇA CARDIOVASCULAR A designação da proteína C rea va (CRP – do inglês, C Reac ve Protein) – uma das proteínas de fase aguda – deriva da sua aÞnidade para se ligar ao polissacárido C do Streptococcus pneumoniae. Trata-se de uma proteína pertencente à família das pentraxinas, cujo gene está localizado no braço longo do cromossoma 1 (1q23), sendo cons tuída por cinco pép dos não glicosilados de 206 aminoácidos, pesando cada um 23 KDa, dispostos numa estrutura pentamérica $pica das pentraxinas. Cada subunidade tem um sí o de ligação para a fosfa dilcolina, enquanto no lado oposto do pentâmero há um sí o de ligação para o C1q. sinte zada pelos hepatócitos após es mulação por citocinas proinßamatórias como a IL-1 e a IL-6. Uma vez que a sua concentração plasmá ca não é afetada pela dieta ou variações circadianas e a sua síntese não é inßuenciada por doenças (exceto do foro hepá co), a CRP é considerada um marcador signiÞca vo da reação inßamatória. Por outro lado, a CRP é um importante efetor da imunidade inata, uma vez que é capaz de se ligar a um grande número de agentes patogénicos (fungos, bactérias e leveduras), células lesadas, croma na, histonas e células apoptó cas, a vando desta forma a cascata do complemento pela sua ligação ao C1q e favorecendo o processo de fagocitose. Além disso, foi evidenciado que, mesmo na ausência de complemento, a CRP pode facilitar a fagocitose de Staphilococcus aureus, Klebsiella aerogenes e Echerichia coli pelos leucócitos, interagindo com o recetor ! para o fragmento Fc (FcR!I e II) expresso nessas células. Todas estas funções, para além da a vação de neutróÞlos e monócitos, mediada pela CRP, explicam o seu importante papel na resposta imunológica inata. No adulto jovem, os níveis plasmá cos médios de CRP são da ordem dos 0,8 mg/L, podendo variar, sob a inßuência de um es$mulo inßamatório, de 50 mg/L a 500 mg/L. O seu doseamento é uma medida par cularmente ú l para o diagnós co e monitorização da resposta terapêu ca às infeções e reações inßamatórias. A CRP, tal como o C1q, pode es mular a depuração ou eliminação de restos celulares derivados da apoptose, ligando-se à fosfa dilcolina das membranas celulares de uma forma cálcio-dependente, par cipando, desta forma, nos mecanismos de regulação homeostá ca das células da imunidade. A sua ligação ao amiloide P do soro (SAP) reforça a sua capacidade de a vação do complemento. Foi demonstrado que a CRP representa um risco nega vo para eventos cardiovasculares, tanto nos indivíduos aparentemente saudáveis como nos portadores de doença coronária. Ora só as infeções causam mais mortes que a doença cardiovascular sendo a causa mais frequente a aterosclerose, isto é, a acumulação de lípidos e elementos Þbrosos nas artérias. Sabe-se que areação inßamatória tem um papel importante no desenvolvimento e progressão da aterosclerose, embora alguns aspetos deste processo complexo não estejam ainda completamente esclarecidos. Estudos realizados em animais subme dos a uma dieta indutora de aterosclerose permi ram concluir que, nestes animais, os leucócitos aderiam fortemente e em grande número à parede das artérias, o que não se veriÞcava nos animais controlo (subme dos

Capítulo 3 - Imunidade Inata e Inßamação 101 Disease, 2004; 6th Edition, Garland Publishing, New York. • Klein, J. Immunology, 1990. Blackwell Scientific Publications, Boston. • Prodinger, WM, Würzner, R, Stoiber, H and Dierich, MP. Complement. In: Paul, WE editor. Fundamental immunology, 2003; 5th Edition. Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia.

• Roitt, I, Male, D, Brostoff, J. Immunology, 2001; 6th Edition. Mosby. • Turvey, SE, Hawn, TR. Towards subtlety: understanding the role of Toll-like receptor signaling in susceptibility to human infections. Clinical Immunology, 2006; 120:1-9.

ENDERE O S! DE INTERESSE NA INTERNET h"p://www.blink.biz/immunoanima#ons/index1.html

QUESTÕES PARA REVISÌO 1. Dos fatores enunciados a seguir todos intervêm na imunidade inata exceto um. Indique-o A) Células NK e fagócitos B) Pele e membranas mucosas C) Interferão e complemento D) Linfócitos T auxiliares e citotóxicos 2. Dos componentes da resposta imunológica referidos, só um é caracterís#co da resposta imunológica especíÞca. Indique qual. A) Fagocitose B) Células NK C) Complemento D) Memória imunológica

EDIÇÕES TÉCNICAS

3. Das células da imunidade referidas a seguir, quais as que podem adquirir funções de células de memória? A) Só os linfócitos T B) Células NK C) Linfócitos T e B D) Só os linfócitos B 4. A a#vação do complemento pela via da lec#na é: A) Um dos mecanismos da resposta imunológica inata (natural) B) Um dos mecanismos da resposta imunológica adquirida (adapta#va) C) comum aos dois #pos de resposta D) Não par#cipa na resposta imunológica adquirida (adapta#va) 5. Dos fatores do complemento a seguir referidos, qual ou quais têm propriedades anaÞlatóxicas, a#vando os mastócitos tecidulares e levando à sua desgranulação (com libertação de histamina)?

Capítulo

HIPERSENSIBILIDADES Luís Taborda Barata

As reações de hipersensibilidade podem ser divididas em quatro grandes grupos. As reações de hipersensibilidade tipo I são imediatas e envolvem a produção de IgE e a participação direta de mastócitos. As reações de hipersensibilidade tipo II desenvolvem-se mais lentamente, em horas a dias, e envolvem anticorpos geralmente IgG, dirigidos contra antigénios adsorvidos ou expressos em membranas celulares de células circulantes ou em tecidos. As reações de hipersensibilidade tipo III também decorrem de horas a dias, também envolvem geralmente anticorpos IgG, mas há formação de complexos imunes entre estes anticorpos e antigénios circulantes, que se vão depositar em diversos tecidos. Tanto nas hipersensibilidades de tipo II como nas de tipo III há ativação do sistema do complemento e participação de neutrófilos no processo imunopatológico. As hipersensibilidades tipo IV têm vários subtipos. Assim, há uma forma tuberculínica, que envolve quer linfócitos T CD4+ tipo Th1 quer linfócitos T CD8+ e que, em casos extremos, pode dar origem a um subtipo de hipersensibilidade granulomatosa. Há também uma forma de hipersensibilidade tipo IV de contacto, cujo exemplo mais conhecido é o das dermatites alérgicas de contacto. Também neste caso há participação de linfócitos T CD4+ Th1 e CD8+. Finalmente, uma outra forma de hipersensibilidade tipo IV envolve linfócitos T CD4+ Th2 e está intimamente ligada às reações de hipersensibilidade imediata. As reações de hipersensibilidade tipos II, III e IV tuberculínica também podem, em algumas circunstâncias, estar envolvidas na imunoaptologia de doenças autoimunes. O tratamento das diversas formas de hipersensibilidade tem aspetos específicos mas, de forma global, envolve frequentemente a utilização de inibidores de inflamação como os glucocorticoides.

As reações de hipersensibilidade foram descritas, ao longo do tempo, por vários autores e de formas diferentes. Contudo, em 1963, P.G.H. Gell e R.R.A. Coombs idealizaram uma classificação dos diferentes tipos de hipersensibilidades (HS), de acordo com a mediação imunopatológica. Posteriormente, diversos autores efetuaram algumas modificações nos conceitos de HS, particularmente no que diz respeito a subtipos de hipersensibilidade retardada, do tipo IV. Em termos globais, as HS tipos I a III têm uma mediação essencialmente humoral (anticorpos), enquanto que a HS tipo IV

tem uma participação essencialmente celular (linfocitária T). Contudo, esta subdivisão, embora seja didática e reflita os diferentes tipos de imunopatologia em termos mecânicos e lesionais, não reflete a complexidade orgânica, na qual vários destes mecanismos funcionam em simultâneo. A Tabela 19.1 reflete uma classificação globalmente aceite dos diferentes tipos de hipersensibilidade, embora haja outras subclassificações possíveis das HS tipo IV.

470 Fundamentos de Imunologia Membrana basal do vaso sanguíneo

Neutrófilo

6 1 5 FcR C3a

C5a 4

Antigénio

7 Enzimas proteolíticas 3 C3b

O2-

H2O2

Célula endotelial

FIGURA 19.5. Mecanismos de lesão celular na hipersensibilidade po III. Complexos imunes, compostos por an génios ligados a an corpos (geralmente IgG) depositam-se no endotélio de alguns vasos sanguíneos (1). Estes complexos a vam o sistema do complemento, pela via clássica (2), com deposição de C3b nas células endoteliais (3) (o que pode, em determinadas circunstâncias, levar ao desenvolvimento de complexos de ataque à membrana e à lise de células endoteliais no local) e libertação de C3a (e de C5a)(4), que são fatores quimiotá cos para neutróÞlos (5). Os neutróÞlos ligam-se às frações Fc de an corpos IgG presentes nos complexos imunes (6) e Þcam a vados, libertando enzimas proteolí cas e radicais livres de oxigénio (7), que são lesivas das células endoteliais.

DIAGNÓSTICO E CLêNICA As suspeitas clínicas de HS tipo III, nomeadamente no caso de doença do soro, poderão ser confirmadas em termos laboratoriais. CIC podem ser identificados através de duas técnicas laboratoriais: • Análise da sua afinidade para C1q; • Análise de solubilidade em polietilenoglicol (PEG). No caso dos estudos de afinidade para C1, são utilizadas técnicas de radioimunoensaio. Sumariamente, este teste usa uma placa com

fase sólida revestida com C1q. Seguidamente, adiciona-se o soro do doente com suspeita de doença do soro. Caso haja CIC, estes vão-se ligar a C1q. Por último, adicionam-se anticorpos anti-IgG radiomarcados e faz-se a leitura da quantidade de radioatividade presente na placa, após lavagem, num contador gama. A análise de solubilidade em PEG consiste na adição desta susbtância a um tubo que contenha o soro do doente com suspeita de doença do soro, no qual se quer avaliar a presença de CIC. Quando a concentração de PEG atinge 2%, os complexos imunes precipitam, ficando

Capítulo 19 - Hipersensibilidades 471

apenas IgG livre em solução. Centrifuga-se seguidamente o tubo de ensaio, ficando as moléculas de IgG livres no sobrenadante e havendo precipitação dos CIC. Estes precipitados são lavados, redissolvidos e a quantidade de IgG presente é medida por técnicas como a nefelometria, radioimunoensaio ou outra.

HIPERSENSIBILIDADE DO TIPO IV !RETARDADA" A HS tipo IV envolve respostas lentas, que se estabelecem no decurso de dois a quatro dias, e que envolvem sempre linfócitos T CD4+ tipo Th1 e linfócitos T CD8+ citolíticos como agentes imunopatológicos diretos. Consiste em dois subtipos principais: • Hipersensibilidade do tipo tuberculínico; • Hipersensibilidade de contacto. Contudo, a hipersensibilidade retardada ligada a respostas alérgicas, e que envolve linfócitos T CD4+ tipo Th2 também é uma forma de HS tipo IV. Os linfócitos T CD4+ tipo Th1 geralmente levam à ativação de macrófagos

e/ou células dendríticas, e estão na base de respostas a alergénios de contacto, bem como a antigénios de microrganismos com ciclo de vida total ou parcialmente intracelular. Dois importantes aspetos que caracterizam este tipo de reações são o facto de: • Poderem ser transferidas entre animais através da transferência de linfócitos T e não de anticorpos (ao contrário do que acontece com as reações de HS tipos I a III); • Para além disso, imunodeficiências que impeçam o funcionamento normal de linfócitos T (como a SIDA) inibem o desenvolvimento deste tipo de reações. Por outro lado, pode haver dois tipos de desequilíbrio envolvendo respostas de HS tipo IV: • Quando há um défice de resposta, que não consegue eliminar os agentes responsáveis pela libertação de antigénios com os quais estas respostas têm de lidar, podem surgir formas de HS tipo IV com a formação de granulomas; • Quando as respostas de hipersensibilidade tipo IV são claramente excessivas, podem condicionar situações de patologia autoimune.

HIPERSENSIBILIDADE TIPO IV – TUBERCULêNICA Membrana basal do vaso sanguíneo

Neutrófilo

6 1 5 FcR C3a

C5a 4 7 Enzimas proteolíticas

3 C3b

EDIÇÕES TÉCNICAS

Célula endotelial

O2-

H2O2

CASO CLÍNICO

C.R.F., 65 anos de idade, agricultor. Refere, desde há três meses, perda de peso, emagrecimento, astenia e anorexia progressivas, febrículas vesper nas diárias e tosse produ va diária, tendo do dois episódios recentes de expetoração hemoptoica. Recorreu aos serviços de saúde, tendo sido efetuada uma prova tuberculínica, exames de expetoração (direto e cultura), bem como telerradiograÞa torácica. A prova tuberculínica foi francamente posi va, com uma reação cutânea papular eritematosa de 30 mm. As culturas de expetoração foram posi vas para bacilos ácido-alcóol resistentes (BAAR) e o Rx do tórax mostrou várias lesões parenquimatosas pulmonares, nomeadamente uma lesão cavitária no lobo superior direito. Foi iniciado tratamento com an bacilares, com boa resposta à terapêu ca.

474 Fundamentos de Imunologia

FIGURA 19.6. Principais aspetos da imunopatologia das reações de hipersensibilidade po IV tuberculínica. Os an génios micobacterianos (por exemplo, PPD) são reconhecidos e endocitados (1) por fagócitos, ao que se segue apresentação an génica por parte destas células, no contexto de moléculas do MHC classe II a linfócitos T CD4+ Th1 (2). Contudo, também há apresentação cruzada de an génios, no contexto de moléculas do MHC classe I, a linfócitos T CD8+ (3). Estas células T CD8+, bem como os linfócitos T CD4+ Th1 produzem níveis elevados de IFN- (4), que o miza a a vação da célula fagocí ca apresentadora de an génios micobacterianos, bem como aumenta o potencial microbicida destas células. Os linfócitos T CD4+ Th1 também produzem níveis elevados de IL-2 (5), o que, para além de ser um fator de proliferação autócrina, vai também permi r a diferenciação dos linfócitos T CD8+ em células funcionalmente citolí cas (6), que irão lisar células que subsequentemente lhes apresentem an génios micobacterianos. Os fagócitos a vados também produzem TNF-!, IL-1 e quimiocinas, que vão contribuir para a migração transendotelial de monócitos e de neutróÞlos (7) e a var células dendrí cas residentes (8). Estas, bem como os monócitos recém-chegados ao local de hipersensibilidade retardada, produzem IL-12 e TNF-!, o que pode contribuir para uma posterior formação de granulomas (9). Para este po de reação granulomatosa também poderão contribuir citocinas como IL-17 e IL-23 (dados ob dos em modelos animais), produzidas por linfócitos T po Th17. Finalmente, quer neutróÞlos quer monócitos podem secretar enzimas proteolí cos e radicais livres de oxigénio (10). Parte das reações descritas ocorre não só nos tecidos periféricos mas também, de forma crucial, nos gânglios linfá cos drenantes.

Capítulo 19 - Hipersensibilidades 475

• Numa zona de baixa prevalência de infeção pelo M. tuberculosis, uma prova tuberculínica/prova de Mantoux (Figura 19.7) positiva é indicativa de provável infeção atual por este. Pelo contrário, numa zona geográfica de moderada a elevada prevalência de infeção pelo M. tuberculosis, um teste positivo à

tuberculina pode significar quer infeção ativa quer apenas exposição passada e só é interpretável quando tem uma dimensão superior a determinado valor. De facto, o tamanho acima do qual se considera que uma prova de tuberculina é positiva depende de diversos fatores, conforme definido pelo Center for Disease Control (EUA) (Tabela 19.3); B

FIGURA 19.7. Prova da tuberculina/Teste de Mantoux. A prova da tuberculina é efetuada através da injeção intradérmica de 0,1 ml de derivado proteico de tuberculina puriÞcado (PPD do inglês Protein PuriÞed Deriva ve) na face interna do antebraço. A. A injeção deve ser efetuada com uma seringa apropriada, com o bisel para cima; B. A reação cutânea (pápula) deve ser lida entre 48 a 72 horas após a administração. A interpretação do signiÞcado da reação depende do tamanho desta, bem como do risco do doente estar infetado com tuberculose e de progredir para doença caso esteja infetado.

TABELA 19.3. CLASSIFICAÇÃO

DA REAÇÃO DA TUBERCULINA, DE ACORDO COM CARACTERÍSTICAS PESSOAIS E DE

EXPOSIÇÃO DE UM INDIVÍDUO TESTADO (DE ACORDO COM O

TAMANHO DA REAÇÃO (PÁPULA) ÀS 48 HORAS

CONSIDERADA POSITIVA NAS SEGUINTES SITUAÇÕES

" 5 mm

Indivíduos infetados pelo VIH Contacto recente com indivíduo com tuberculose doença Indivíduos com alterações Þbró cas no Rx tórax, compa!veis com tuberculose pulmonar prévia Doentes com órgãos transplantados Doentes que estejam sob imunossupressão por outras razões (por exemplo, administração prolongada de > 15 mg/dia de prednisona, administração de antagonistas do TNF-!)

" 10 mm

Imigrantes que tenham vindo recentemente (há < 5 anos) de países com elevada prevalência de tuberculose Toxicómanos que usem drogas injetáveis Residentes e funcionários de prisões e outros locais de congregações humanas de risco Pessoal de laboratório que lide com micobactérias Indivíduos cujas situações clínicas sejam de elevado risco para contrair tuberculose Crianças < 4 anos de idade Lactentes, crianças e adolescentes expostos a adultos que pertençam a grupos de alto risco

" 15 mm

É considerada como uma reação posi va em qualquer indivíduo, mesmo sem fatores de risco conhecidos para tuberculose

EDIÇÕES TÉCNICAS

CENTER FOR DISEASE CONTROL)

490 Fundamentos de Imunologia

BIBLIOGRAFIA • Aster, RH, Bougie, DW. Drug-induced immune thrombocytopenia. New Engl J Med, 2007; 357: 580-587. • Boyce, JA, Broide, D, et al. Advances in mechanisms of asthma, allergy, and immunology in 2008. J. Allergy Clin Immunol, 2009; 123: 569-574. • Brown, RS. Autoimmune thyroid disease: unlocking a complex puzzle. Curr Opin Pediatrics, 2009; 21: 523-528. • Cooper, AM. Cell mediated responses in tuberculosis. Annu Rev Immunol, 2009; 27: 393-422. • Hofmann, AM, Abraham, SN. New roles for mast cells in modulating allergic reactions and immunity against pathogens. Curr Opin Immunol, 2009; 21: 679-686.

• Gao, H, et al. Regulation of lung inflammation in the model of IgG immune complex injury. Annu Rev Pathol Mech Dis, 2006; 1: 215-242. • Nangaku, M, Couser, WG. Mechanisms of immune deposit formation and the mediation of immune renal injury. Clin Exp Nephrol, 2005; 9: 183-191. • Saunders, BM, Britton, WJ. Life and death in the granuloma: immunopathology of tuberculosis. Immunol Cell Biol, 2007; 85: 103-111. • Urbaniak, SJ. Noninvasive approaches to the management of RhD hemolytic disease of the fetus and the newborn. Transfusion, 2008; 48: 2-5. • Vocanson, M, et al. Effector and regulatory mechanisms in allergic contact dermatitis. Allergy, 2009; 64: 1699-1714.

Membrana basal do vaso sanguíneo

Neutrófilo

6 1 5 FcR C3a

C5a 4 7 Enzimas proteolíticas

3 C3b

Célula endotelial

O2-

H2O2

ENDERE O"S# DE INTERESSE NA INTERNET

h p://www.worldallergy.org Global Allergy Information Network – Página com informações variadas acerca de doenças alérgicas e alergénios. h p://www.aaaai.org American Academy of Allergy, Asthma and Immunology. Página com informações para profissionais de saúde e doentes acerca dos vários aspetos clínicos e terapêuticos das doenças alérgicas. h p://www.spaic.pt Sociedade Portuguesa de Alergologia e Imunologia Clínica – Página nacional orientada para médicos especialistas e para doentes, com informações acerca dos vários aspetos das doenças alérgicas. h p://www.eaaci.net/site/homepage.php European Academy of Allergology and Clinical Immunology – Página com informações variadas acerca de doenças alérgicas e alergénios. h p://www.escd.org/educa!on/ European Society of Contact Dermatitis – Página com alguns documentos e informações relativas a reuniões desta sociedade. h p://www.fda.gov/ Food and Drug Administration. Página com informação acerca de vários aspetos ligados a reações a medicamentos, nomeadamente reações alérgicas (hipersensibilidade do tipo I), citotóxicas (tipo II) ou outras.

Capítulo 19 - Hipersensibilidades 491 Membrana basal do vaso sanguíneo

Neutrófilo

6 1 5 FcR C3a

C5a 4 7 Enzimas proteolíticas

3 C3b

EDIÇÕES TÉCNICAS

Célula endotelial

O2-

H2O2

QUESTÍES PARA REVISÌO

1. Em relação à hipersensibilidade imediata, qual das seguintes aÞrmações é correta? A) Há formação de novo de histamina em mastócitos B) Os macrófagos podem libertar triptase e histamina C) Minutos após contactarem com um an!génio, os linfócitos B sofrem mudança de iso!po e começam a produzir IgE D) Os leucotrienos são lentamente produzidos pelos mastócitos e promovem a contração do músculo dos brônquios E) O entrecruzamento de duas moléculas de IgE ligadas aos seus recetores na super$cie de eosinóÞlos leva à sua desgranulação imediata 2. Em relação às reações de hipersensibilidade !po II, qual das seguintes aÞrmações é correta? A) São normalmente causadas por an!corpos IgG ou IgA B) A célula-alvo é opsonizada por imunoglobulinas que a!vam a via alterna do complemento C) A célula-alvo é lisada pelo complemento ou é destruída por citotoxicidade celular dependente de an!corpos D) Os fagócitos que intervêm nestas reações são eosinóÞlos que produzem radicais livres de oxigénio E) As plaquetas formam um trombo que ajuda à Þxação dos complexos an!génio-an!corpo 3. Numa criança com déÞce gené!co de produção de interferão-gamma (IFN- ), que !po de hipersensibilidade (HS) Þca essencialmente afetada? A) As HS de !po III, porque os neutróÞlos deixam de funcionar sob a ação do IFNB) As HS de !po I, porque deixa de haver produção de IgE, para a qual é crucial o IFNC) As HS de !po IV Th2, porque os linfócitos Th2 e os eosinóÞlos dependem do IFND) As HS de !po IV Th1, porque os linfócitos Th1 e os macrófagos dependem do IFNE) As HS de !po II, porque alguns dos fatores do sistema do complemento dependem do IFN4. Em relação às hipersensibilidades de !po celular, qual das seguintes aÞrmações NÌO é correta? A) Nas hipersensibilidades !po IV com linfócitos T citotóxicos, a administração de an!corpos an!-IL4 inibe a ação dos linfócitos envolvidos B) Nas hipersensibilidades !po IV de células !po Th2, os an!génios são solúveis C) Na hipersensibilidade !po IV com linfócitos T citotóxicos, o an!génio é expresso a nível celular D) Nas hipersensibilidades !po IV de células Th1 – tuberculínica, a administração de an!corpos an!-IFN- inibe a ação dos linfócitos envolvidos E) Nas hipersensibilidades !po IV de células !po Th2, a administração de an!corpos an!-IL4 inibe a ação dos linfócitos envolvidos 5. Escolha a opção que contém as associações corretas: A) Mastócitos

1. Hipersensibilidade !po II

B) Complexos imunológicos

2. Hipersensibilidade de !po IV com células Th2

C) Linfócitos T citotóxicos

3. Hipersensibilidade de !po I

D) IL-4, IL-5 e IL-13

4. Hipersensibilidade de !po III

E) A!vação ou bloqueio de recetor de membrana 5. Hipersensibilidade de !po IV com linfócitos T CD8+

Capítulo

TÉCNICAS DE IMUNOLOGIA Fernando A. Arosa / Elsa M. Cardoso

Este capítulo tem como objetivo principal apresentar algumas das técnicas mais importantes usadas em Imunologia para isolar e estudar os diferentes tipos celulares que constituem o sistema imunológico, nomeadamente linfócitos, monócitos e células dendríticas, assim como os mediadores biológicos que produzem. Não pretende ser um manual de laboratório, mas antes um guia que ajude à compreensão de algumas das principais técnicas imunológicas utilizadas em investigação e diagnóstico. O capítulo incidirá, sobretudo, em técnicas imunológicas mais avançadas utilizadas na investigação biomédica e que foram desenvolvidas graças ao progresso nas áreas da bioquímica e da biofísica (por exemplo, imunoprecipitação de proteínas, microscopia de fluorescência e citometria de fluxo), referindo mais sucintamente técnicas imunológicas clássicas de deteção e quantificação de antigénios (por exemplo, imunoensaios). Todavia, em primeiro lugar serão abordadas as técnicas de isolamento e cultura de populações de células mononucleares do sangue.

ISOLAMENTO DE CÉLULAS MONONUCLEARES DO SANGUE PERIFÉRICO O sangue periférico é a principal fonte de células linfoides e mieloides para investigação do sistema imunológico em humanos. O método mais comum é fazer o isolamento de células mononucleares do sangue periférico humano ou PBMC (do inglês Peripheral Blood Mononuclear Cells) centrifugando o sangue sobre soluções comerciais como o Lymphoprep, Ficoll-Hypaque ou Percoll. Estas soluções são uma mistura de polissacáridos e de um composto de alta densidade, o diatrizoato de sódio, que permitem separar os diferentes tipos celulares presentes de acordo com a sua densidade, os quais, após centrifugação, distribuem-se em camadas de acordo com a sua densidade. Assim,

os glóbulos vermelhos sedimentam na parte inferior do tubo e os granulócitos sedimentam formando uma camada na zona imediatamente superior. Na parte central do tubo aparece um anel formado pelas células mononucleares (que pode ser removido com o auxílio de uma pipeta Pasteur) e na região superior do tubo encontram-se o plasma e as plaquetas (Figura 23.1). Esta técnica é conhecida como centrifugação em gradiente de densidade e é também usada para isolar células mononucleares de sangue de cordão umbilical e de recém-nascidos. Porém, nestes casos as células mononucleares obtidas costumam conter células imaturas, nomeadamente eritroblastos, pelo que a sua remoção utilizando técnicas suplementares torna-se necessária. Uma vez isoladas as células mononucleares, poderá proceder-se à purificação dos diferentes tipos presentes: monócitos, linfócitos B, linfócitos T e linfócitos NK, assim como

576 Fundamentos de Imunologia Eletoforese das proteínas

Imunoeletroforese A imunoeletroforese combina uma eletroforese convencional, que serve para separar proteínas de uma amostra (por exemplo, soro ou urina) num gel, e subsequente precipitação dos complexos Ag-Ac. Uma das aplicações mais frequentes desta técnica é o estudo dos diferentes isotipos de imunoglobulinas, permitindo identificar expansões monoclonais ou policlonais de imunoglobulinas. No caso da caracterização de gamopatias monoclonais as proteínas são primeiro separadas por uma eletroforese, e numa segunda etapa procede-se à fixação e precipitação das proteínas separadas: aplica-se um fixador e os antissoros diretamente sobre o gel, ao nível das pistas de migração. Estes últimos difundem-se no gel, o fixador precipita todas as proteínas e os anticorpos precipitam os antigénios correspondentes. As proteínas solúveis, não-precipitadas, são removidas do gel por lavagem e adsorção com papel de filtro. As proteínas precipitadas ficam retidas no interior da matriz do gel. Por fim faz-se a coloração das proteínas e comparação da posição das bandas imunoprecipitadas com as bandas anómalas, observadas após eletroforese das proteínas (Figura 23.8). As gamopatias podem ser detetadas através do uso de anticorpos com especificidades para as diferentes cadeias das imunoglobulinas: anticadeia pesada (IgG), !" (IgA), e (IgM), ou anticadeias leves # e $.

Proteína 1

Anticorpo antiproteína n

Lavagem

FIGURA 23.8. Esquema ilustra vo da técnica de eletroforese e imunoÞxação. As proteínas são separadas por eletroforese e, depois, imunoprecipitadas com an corpos especíÞcos (neste exemplo na pista “n” do gel, u lizou-se um an corpo an proteína n). As proteínas não precipitadas são removidas do gel por lavagem. As proteínas precipitadas Þcam re das no interior da matriz do gel. Após a imunoÞxação as proteínas são coradas com violeta ácido.

Nefelometria 90 ºC Luz

Imunoensaios de dispersão da luz Estes métodos baseiam-se também no princípio de formação de complexos Ag-Ac que, quando precipitam, têm a capacidade de dispersar a luz que passe na amostra onde eles se encontram. Deste modo, a concentração destes complexos em solução (meio líquido e não gel como nos métodos acima estudados) pode ser determinada medindo a dispersão da luz (Figura 23.9). Quando é determinada a redução de luz que passa pela solução, ou seja, é avaliada a dispersão para a frente chama-se ao método Turbidimetria. Quando a deteção da luz é feita num ângulo de 90 ºC (dispersão lateral) chama-se ao método Nefelometria.

Proteína n

Turbidimetria 180 ºC

Amostra

FIGURA 23.9. Imunoensaios de dispersão da luz. Enquanto a Nefelometria mede a luz dispersa pelos imunocomplexos solúveis, num ângulo de 90 °C, a Turbidimetria mede a redução de luz num ângulo de 180 °C (à frente).

Aglu nação A técnica de aglutinação permite “agregar” antigénios que estejam fixos a um suporte, seja este suporte uma membrana celular ou partículas de látex. Enquanto na primeira situação a aglutinação das células indicar-nos-á a presença de um recetor de superfície, na segunda situação

Capítulo 23 - Técnicas de Imunologia 577

a aglutinação das partículas de látex indicar-nos-á a presença de um fator solúvel. Assim, a técnica de aglutinação é muito utilizada para quantificar quer antigénios membranares (recetores) quer antigénios solúveis (anticorpos, imunocomplexos). Entre as muitas aplicações da técnica de aglutinação cabe referir duas: a determinação dos grupos sanguíneos eritrocitários (Figura 23.10) e a pesquisa do fator reumatoide no soro de doentes com doenças artríticas (Figura 23.11). Uma aplicação específica da técnica de aglutinação é o Teste de Coombs, muito utilizado para diagnosticar doenças hemolíticas causadas por autoanticorpos que se ligam às membranas dos eritrócitos. Consiste na utilização de anticorpos produzidos noutra espécie (coelho, cabra, etc.) específicos contra os autoanticorpos humanos. No caso em que se queira pesquisar a presença de eritrócitos revestidos de autoanticorpos utiliza-se o Teste de Coombs direto, onde a uma suspensão de eritrócitos de um

Anti-A Anti-B

Grupo sanguíneo

Partícula de látex Fator reumatoide

+ IgG

Aglutinação

FIGURA 23.11. Método de aglu nação indireta. Neste exemplo, utiliza-se o método de aglutinação indireta para pesquisar o fator reumatoide (IgM an -IgG). Primeiro liga-se IgG humanas a par!culas de látex, que são incubadas com o soro do paciente. Na presença do fator reumatoide ocorrerá aglu nação com formação de agregados visíveis.

Tipo A

Tipo B

EDIÇÕES TÉCNICAS

Tipo AB

Tipo O

FIGURA 23.10. Método de aglu nação direta na determinação dos grupos sanguíneos ABO. O sangue é misturado com an corpos an -A e an -B. Quando ocorre aglu nação (agregados representados por círculos pequenos cinzentos) signiÞca que o sangue possui esses an génios (A e/ou B).

paciente suspeito de doença hemolítica autoimune é-lhe adicionada as anti-imunoglobulinas (anti-Igs) humanas. Caso os eritrócitos estejam revestidos de autoanticorpos os anti-Igs estabelecem as pontes necessárias para induzir a formação de agregados (Figura 23.12). No caso em que se queira pesquisar a presença dos autoanticorpos no soro do paciente suspeito de sofrer uma doença autoimune utiliza-se o Teste de Coombs indireto, onde uma suspensão de eritrócitos O+Rh% de uma pessoa saudável é primeiro incubada com o soro do paciente suspeito. De seguida, adicionam-se as anti-Igs humanas. Caso o soro do paciente possua autoanticorpos, este irão ligar-se aos eritrócitos e a subsequente adição das anti-Igs estabelecem as pontes necessárias para induzir a formação de agregados (Figura 23.12).

578 Fundamentos de Imunologia

Teste de Coombs direto

+ Anti-IgG Eritrócitos do sangue do paciente revestidos com anticorpos

Aglutinação dos eritrócitos

Teste de Coombs indireto

+ Eritrócitos

Soro do paciente (que contém anticorpos anti-eritrócitos)

Anti-IgG Eritrócitos revestidos com anticorpos

Aglutinação dos eritrócitos

FIGURA 23.12. Teste de Coombs direto e indireto. No teste de Coombs direto usa-se o sangue do paciente. Se os eritrócitos se encontrarem reves dos de an corpos an -eritrócitos o an -IgG promove a aglu nação dos eritrócitos. No método indireto, usa-se o soro do doente, que se incuba com eritrócitos, seguido de um procedimento semelhante ao do método direto.

ELISA E ELISPOT Para otimizar a quantificação de proteínas, foram desenvolvidas técnicas que fazem uso de uma enzima conjugada ao anticorpo e que permitem detetar quantidades de proteínas solúveis ou presentes em membranas muito pequenas, não detetadas pelos métodos atrás referidos. Apesar de serem utilizadas em grande medida na investigação, é cada vez mais frequente a sua utilização também no diagnóstico. Um dos ensaios com enzimas mais utilizado é a técnica de ELISA (do inglês Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). Existem algumas variantes deste método

consoante a aplicação em causa sendo, contudo, a mais utilizada a ELISA sandwich. O ensaio sandwich é muito utilizado na quantificação de citocinas numa amostra. Assim, em microplacas especiais são imobilizados anticorpos específicos para o antigénio a dosear, seguido da adição da amostra, que contém uma quantidade de antigénio desconhecida, assim como a aplicação de soluções-padrão de diferentes concentrações conhecidas de antigénio. Segue-se a lavagem que remove o antigénio não-ligado e a adição de um anticorpo secundário contra o antigénio sob estudo, para um epitopo diferente ao qual se ligou o anticorpo primário, conjugado com

Capítulo 23 - Técnicas de Imunologia 579

uma enzima como a peroxidase. A deteção é feita pela adição de um substrato ou cromogénio que é degradado pela enzima, originando um produto de reação com cor (Figura 23.13A). Quanto mais antigénio existir na amostra ou na solução-padrão, maior será o desenvolvimento de cor que será posteriormente quantificado num espectrofotómetro. Através da elaboração de uma curva de calibração, com base nos resultados obtidos para diferentes concentrações da solução-padrão, poderá ser extrapolada a concentração de antigénio na amostra. Outra

aplicação muito importante desta técnica é a quantificação de anticorpos em amostras de pacientes, como indicadores de infeção (anticorpos específicos para proteínas do vírus da imunodeficiência humana ou vírus da hepatite B), utilizando-se a técnica de ELISA clássica. Nesta situação, o antigénio é primeiro imobilizado num suporte sólido, ao qual é adicionado a amostra. Após lavagens adiciona-se um anticorpo secundário, conjugado com uma enzima. A intensidade de cor será quantificada num espectrofotómetro (Figura 23.13B).

B Placa revestida com anticorpo (Ac)

Ac Adição da amostra

Lavagem e adição do anticorpo secundário conjugado com uma enzima

Adição da amostra

Lavagem e adição do anticorpo secundário conjugado com uma enzima

Agente colorimétrico

EDIÇÕES TÉCNICAS

Agente colorimétrico

Placa revestida com antigénio (Ag)

FIGURA 23.13. Método de ELISA. Na técnica de ELISA sandwich a placa está reves da com an corpos especíÞcos contra um an génio presente em amostras biológicas (A). Na técnica de ELISA clássica a placa está reves da com um an génio reconhecido por an corpos, cuja presença em amostras biológicas pretende-se determinar (B).

588 Fundamentos de Imunologia

QUADRO 23.2. ALGUMAS

FRET

DAS APLICAÇÕES DA

TECNOLOGIA

• Estudar a estrutura e conformação de recetores, proteínas e ácidos nucleicos • Estudo de interações moleculares entre recetores presentes em células diferentes (trans-interac ons) • Estudo de interações moleculares entre recetores presentes na mesma célula (cis-interac ons) • Distribuição e movimento de recetores e lípidos em membranas biológicas • Determinação de a vidades proteolí cas

Dador Aceitador

α2

FRET

α1 IL-15R

α3 β2m

Membrana plasmática

FIGURA 23.22. Esquema representando a transferência de energia de ßuorescência por ressonância. A imagem ilustra o FRET entre um ßuorocromo dador conjugado a um an corpo que reconhece um primeiro recetor (aqui representado por uma molécula de MHC classe I); e um ßuorocromo aceitador conjugado a um an corpo que reconhece um segundo recetor (aqui representado pelo recetor para a IL-15), e que está a uma distância entre 1-10nm do primeiro recetor, isto é, em contacto !sico.

informação dos fatores do meio ambiente que afetam o tempo de vida do fluorocromo, como, por exemplo, a concentração de iões, a hidrofobicidade, a concentração de oxigénio, assim como determinar interações moleculares através do FRET. Por outro lado, a técnica FRAP (do inglês Fluorescence Recovery After Photobleaching) utiliza o fenómeno da recuperação da fluorescência de um determinado fluorocromo após perda total por excitação. No FRAP, uma célula é iluminada com luz de forte intensidade numa pequena área de interesse durante um

interações moleculares em diferentes compartimentos celulares ou de tecidos com um grande poder de resolução, quando em comparação com técnicas de microscopia de fluorescência clássicas. Algumas das aplicações da tecnologia FRET estão sumarizadas no Quadro 23.2. De entre estas, cabe destacar a determinação de associações moleculares entre recetores presentes na membrana plasmática (Figura 23.23). Este tipo de estudos está a ser muito desenvolvido dada a sua importância no desenvolvimento de drogas específicas contra recetores envolvidos no crescimento de células tumorais. Além do FRET propriamente dito, existem numerosas variantes que constituem, por si só, técnicas avançadas de microscopia e dos quais cabe ressaltar aquelas que fazem uso da perda de emissão de fluorescência. A técnica FLIM (do inglês, Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) permite captar imagens com base no tempo de vida dos fluorocromos, proporcionando

FIGURA 23.23. Imagens de microscopia confocal mostrando a existência de FRET em linfócitos T. As imagens foram tomadas de cortes ó cos de 0.8"m gravados por um microscópio confocal laser (Zeiss LSM 510 MTA) e mostram a existência de FRET (calculado usando so!ware especíÞco). A escala de FRET está indicada. (Arosa FA e Vámos, G. unpublished results)

Capítulo 23 - Técnicas de Imunologia 589

curto espaço de tempo, de forma a provocar uma extinção localizada da fluorescência ou photobleaching, processo durante o qual os fluorocromos perdem rapidamente o seu tempo de vida. Nesta fase é possível visualizar a área de interesse como um ponto escuro. Depois é analisado o reaparecimento da fluorescência na zona em estudo devido à difusão e redistribuição das sondas circundantes marcadas que ainda têm a capacidade de emitir fluorescência. Esta técnica é utilizada para observar e medir o movimento intracelular ou membranar de moléculas e recetores, assim como a integridade da membrana. Por exemplo, o FRAP tem sido utilizado na medição da velocidade com que determinadas proteínas são transferidas do seu local de síntese, o retículo endoplasmático, ao seu local de maturação, o aparelho de Golgi. Também é uma técnica com aplicação na medição da velocidade de difusão lateral de proteínas na membrana. Finalmente, existe a técnica FLIP (do inglês Fluorescence Loss in Photobleaching), a qual utiliza repetidamente o photobleaching com o objetivo de eliminar toda emissão de fluorescência num determinado compartimento celular, e pode ser usada para determinar, por exemplo, a continuidade dos limites membranares de organelos intracelulares como o Golgi, assim como determinar as propriedades de difusão de componentes desses organelos.

EDIÇÕES TÉCNICAS

CITOMETRIA DE FLUXO A citometria de fluxo é uma tecnologia de análise avançada que utiliza o principio da dispersão da luz e da emissão de fluorescência de fluorocromos conjugados a moléculas especificas para identificar, analisar e/ou purificar populações de células de origem animal ou vegetal, assim como fragmentos dessas células (por exemplo, vesículas, exossomas) e outras partículas de menor tamanho (por exemplo, nanopartículas). Os citómetros de fluxo que apenas realizam identificação e análise denominam-se citómetros analíticos ou Analyzers. Aqueles que além de identificar e analisar conseguem

também purificar e separar populações específicas denominam-se citómetros separadores ou Sorters. Devido a esta terminologia o citómetro que consegue analisar e separar denomina-se FACS (do inglês Flow Activated Cell Sorter). Esta última denominação tem-se associado erroneamente à técnica de citometria de fluxo quando apenas se refere ao aparelho. O processo começa com a passagem de uma população de células em suspensão num meio isotónico, através de uma corrente (fluxo) contínua onde as células são analisadas pelo citómetro através da incidência de uma fonte de luz proveniente de um ou mais lasers (Figura 23.24). A análise da dispersão da luz pelas células juntamente com a emissão de fluorescência proporcionam ao citómetro informação pormenorizada sobre as propriedades das células em estudo. A dispersão frontal de uma fonte de luz laser é captada por um detetor que converte os dados num sinal elétrico que, posteriormente, será digitalizado para gerar um parâmetro conhecido como FSC (do inglês Forward Scatter Characteristics) e que dá informação sobre o tamanho/ /forma celular (Figura 23.25). Por outro lado, a dispersão lateral de uma fonte de luz laser é captada por um detetor que converte os dados num sinal elétrico que, posteriormente, será digitalizado para gerar um parâmetro conhecido como SSC (do inglês, Side Scatter Characteristics) e que da informação sobre a granulosidade/ /complexidade celular (Figura 23.25). Sendo o tamanho (FSC) e a complexidade (SSC) características únicas para cada tipo de célula, o seu estudo combinado permite identificar diferentes populações de células, nomeadamente os diferentes tipos de leucócitos isolados do sangue (Figura 23.26). Além dos detetores de dispersão de luz, o citómetro de fluxo possui filtros dicroicos, que funcionam como espelhos que refletem um determinado comprimento de onda da fluorescência emitida pelo fluorocromo, deixando passar o resto, e detetores de fluorescência ou PMT (do inglês Photo Multiplier Tubes) que captam a emissão de fluorescência refletida (ver Figura 23.24). Fluorocromos diferentes (por

590 Fundamentos de Imunologia

Filtros

PMT (FL4) Filtros

PMT (FL3)

PMT (FL2)

PMT (FL1)

Laser

SSC

488 nm FSC

Computador

Lentes

Amostra marcada

FIGURA 23.24. Esquema do funcionamento global de um citómetro de ßuxo. Um citómetro de ßuxo está cons tuído por um sistema de ßuidos que permitem o passo de células e um sistema de deteção que permite captar dois pos de informação: uma proveniente da dispersão da luz (detetores FSC e SSC) e outra proveniente da emissão de ßuorescência (detetores PMT). Esta informação é depois transformada num sinal eletrónico que será digitalizado para gerar parâmetros de tamanho (FSC), complexidade (SSC) e intensidade de ßuorescência (FL) que serão mostrados na forma de gráÞcos. (Ver texto principal para uma descrição mais pormenorizada). Dispersão lateral (SSC)

Laser Dispersão frontal (FSC)

FIGURA 23.25. Esquema ilustrando os parâmetros de dispersão frontal e lateral da luz num citómetro de ßuxo. (Ver texto principal para uma descrição mais pormenorizada).

exemplo, FITC, PE, PerCP, APC) emitirão fluorescência a diferentes comprimentos de onda, os quais, por sua vez, serão separados em diferentes cores por filtros óticos e enviados

para os detetores PMT, que convertem a fluorescência num sinal eletrónico que será digitalizado para gerar parâmetros de intensidade de fluorescência (Figura 23.27). Os citómetros de fluxo mais convencionais estão equipados com um laser de 15 mW de potência que emite luz a 488 nm, sendo capazes de analisar três parâmetros de fluorescência diferentes em simultâneo, sendo designados como citómetros de fluxo de três cores. Contudo, citómetros mais recentes estão equipados com mais um laser de 9 mW de potência que emite luz a 635 nm, que lhes permite analisar quatro parâmetros de fluorescência diferentes em simultâneo, sendo designados como citómetros de fluxo de quatro cores. Citómetros mais avançados conseguem analisar simultaneamente até 12 parâmetros diferentes. Através da utilização de programas de

Capítulo 23 - Técnicas de Imunologia 591

SSC

102

Granulócitos

Monócitos

Número de células

Histograma

101

Intensidade de fluorescência

Linfócitos (T, B, NK)

Dot-plot 103 FSC

FIGURA 23.26. GráÞco ilustrando os pos principais de leucócitos de acordo com os parâmetros de dispersão frontal (FSC, tamanho) e dispersão lateral (SSC, complexidade) da luz. (Ver texto principal para uma descrição mais pormenorizada).

análise específicos, quer os dados de FSC/SSC quer os dados de emissão de fluorescência são utilizados para gerar gráficos que mostram as propriedades e características das células estudadas. Estes gráficos podem mostrar um único parâmetro, sendo denominado histograma; ou dois parâmetros em simultâneo, sendo denominados neste caso dot-plot, contour-plot ou density-plot (Figura 23.27).

EDIÇÕES TÉCNICAS

APLICAÇÕES DA CITOMETRIA DE FLUXO A citometria de fluxo é uma tecnologia de uso crescente em áreas tão diversas do conhecimento como a Biologia, Bioquímica, Microbiologia e Biomedicina, e mais recentemente na área da descoberta de novas drogas e fármacos. Através do uso de anticorpos fluorescentes e devido à capacidade de analisar múltiplos parâmetros ao mesmo tempo, a citometria de fluxo permite identificar populações específicas de células, mediadores biológicos, assim como os seus recetores. Por outro lado, através do uso de sondas fluorescentes específicas, a técnica permite estudar variados processos fisiológicos como, por exemplo, divisão celular, vias meta-

Intensidade de fluorescência

102

Intensidade de fluorescência

FIGURA 23.27. Tipos de gráÞcos u lizados para representar a informação de intensidade de emissão de ßuorescência. O histograma mostra a intensidade de ßuorescência de um dado recetor detetado através da u lização de an corpo especíÞco, conjugado com um ßuorocromo (linha a negrito). A intensidade de ßuorescência basal é determinada através da u lização de an corpo irrelevante conjugado com um ßuorocromo (linha tracejada). O dot-plot mostra a intensidade de ßuorescência de dois recetores diferentes, detetados através da u lização de an corpos especíÞcos conjugados com ßuorocromos que emitem a comprimentos de onda diferentes. Esta análise permite iden Þcar e quan Þcar células que expressam um dos recetores (representadas nos quadrantes inferior direito e superior esquerdo), células que expressam os dois recetores simultaneamente (representadas no quadrante superior direito) e as células que não expressam nenhum dos recetores (representadas no quadrante inferior esquerdo).

bólicas, abertura de canais iónicos e pH intracelular. Estas determinações são extremamente importantes para interpretar e entender os efeitos de drogas específicas na fisiologia celular. O desenvolvimento de reagentes fluorescentes altamente específicos, que permitem estudar uma variedade de moléculas diferentes, desde pequenos metabolitos como os radicais de oxigénio e o cálcio, passando por moléculas

596 Fundamentos de Imunologia

ENDERE O S! DE INTERESSE NA INTERNET h"p://www.currentprotocols.com Página de Internet com uma vasta lista de protocolos utilizados em Imunologia, e que incluem culturas de células, microscopia, imunofluorescência, citometria de fluxo e análise de proteínas. h"p://www.cytometry.org/ Página da Internet da International Clinical Cytometry Society (EUA). www.le.ac.uk/microbiology/website/lecturespage.htm Undergraduate Immunology Lectures at the University of Leicester. h"p://www.cyto.purdue.edu/ Página da Internet de Citometria da Universidade de Purdue (EUA). Site de consulta obrigatória.

QUESTÍES PARA REVISÌO 1. Diga se é verdadeira ou falsa cada uma das seguintes aÞrmações: 1.1. Algumas interações an#génio-an#corpo podem ser detetadas pela precipitação de complexos Ag-Ac 1.2. O método de imunoßuorescência direta permite a deteção de autoan#corpos 1.3. A síntese de ADN pode ser usada como um marcador de proliferação linfocitária 1.4. O isolamento de linfócitos por gradiente de densidade permite separar os linfócitos T dos linfócitos B 1.5. A precipitação máxima de complexos Ag-Ac ocorre quando existe um excesso de an#corpos 1.6. O CFSE é um composto ßuorescente 1.7. A tecnologia FRET permite a visualização de interações moleculares 1.8. Um an#corpo monoclonal apresenta especiÞcidade para diferentes epitopos de uma dada proteína 1.9. A microscopia confocal permite obter imagens seriadas de uma mesma célula 1.10. A análise de tetrâmeros permite iden#Þcar populações individuais de células T com base na especiÞcidade de ligação do complexo MHC:pép#do ao BCR 2. As células de mieloma usadas na produção de hibridomas de linfócitos B têm três caracterís#cas que as tornam parceiras de fusão apropriados. Enumere essas propriedades e explique porquê essas caracterís#cas são necessárias para a produção de hibridomas de linfócitos B que segregam an#corpos? 3. Estabeleça a correspondência entre os seguintes termos e a deÞnição apropriada:

Fundamentos de

IMUNOLOGIA

A publicação da segunda edição do livro Fundamentos de Imunologia vem confirmar o espírito inicial dos coordenadores de preencher uma lacuna na bibliografia disponível em português nesta área biomédica. Pensada essencialmente para orientar os estudantes do ensino superior universitário e politécnico na área da Imunologia e conduzir a uma melhor compreensão dos assuntos mais complexos do funcionamento do sistema imunológico, esta obra interessará também a médicos ou outros profissionais de saúde. Para além da revisão e atualização da maioria dos capítulos que integravam a edição anterior, que veio a revelar-se um êxito editorial, nesta obra acrescentaram-se novos capítulos que reúnem informação atualizada e suficientemente detalhada sobre a importância das células dendríticas nos mecanismos imunológicos, bem como um novo capítulo dedicado especialmente às citocinas, área de complexidade crescente e sujeita, tal como as células dendríticas, a ativa investigação. E ainda dois outros novos capítulos, um dedicado à importância da nutrição na integridade funcional do sistema imunológico, e um último, de caráter prático, sobre as técnicas imunológicas que apoiam as áreas de diagnóstico e de investigação laboratorial. Sempre que pertinente foram introduzidos destaques clínicos que despertam o leitor para aspetos clínicos e laboratoriais de tópicos científicos atuais. Em linha com a edição anterior, houve a preocupação de modernizar e uniformizar a terminologia científica utilizada ao longo de toda a obra, sendo que foi já adotado o novo Acordo Ortográfico. Esta nova edição foi ainda profusamente ilustrada a cores, sendo essa uma mais-valia em relação à edição anterior. As figuras são originais, com uma linha gráfica uniforme e de elevado rigor científico. Houve aliás grande preocupação em manter os traços e cores nos elementos que se repetem ao longo do livro. As discrepâncias que ocorrem são propositadas e têm fundamento (veja-se o caso do citoplasma que por vezes surge com cores diferentes dependendo da célula representada). Agradecemos a todos (professores, estudantes e restantes leitores) que, com as suas sugestões, contribuíram para lançarmos esta segunda edição. Esperamos que seja útil para a formação dos estudantes e dos profissionais de saúde que a leiam.

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Novidades da 2.ª edição: Revisão e atualização de todos os capítulos; Novo layout; Dezenas de novas figuras; Totalmente impresso a 4 cores; Inclusão de novos capítulos; Inclusão de destaques clínicos; Uniformização e modernização da terminologia.

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ISBN 978-972-757-856-6

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