EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LAS CONDICIONES DE SECADO SOBRE EL RENDIMIENTO Y COMPOSICIÓN FITOQUÍMICA DEL EXTRACTO OBTENIDO DE LAS HOJAS DE LA PLANTA Piper cumanense Kunth.
DIANA MARCELA PINEDA PULIDO
FUNDACIÓN UNIVERSITARIA AGRARIA DE COLOMBIA “UNIAGRARIA” PROGRAMA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL BOGOTÁ 2016
EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LAS CONDICIONES DE SECADO SOBRE EL RENDIMIENTO Y COMPOSICIÓN FITOQUÍMICA DEL EXTRACTO OBTENIDO DE LAS HOJAS DE LA PLANTA Piper cumanense Kunth.
DIANA MARCELA PINEDA PULIDO
TRABAJO PARA OPTAR AL TÍTULO DE INGENIERO AGROINDUSTRIAL
DIRECTOR MAURICIO SIERRA INGENIERO QUIMICO MSC DOCENTE PROGRAMA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
FUNDACIÓN UNIVERSITARIA AGRARIA DE COLOMBIA “UNIAGRARIA” PROGRAMA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL BOGOTÁ 2016
NOTA DE ACEPTACIร N
FIRMA DEL PRESIDENTE DEL JURADO
FIRMA DEL JURADO
FIRMA DEL JURADO
Bogotรก, D.C ____ de ___________ de 2016
AGRADECIMIENTOS
El autor expresa sus agradecimientos a: Dios y mis padres por apoyarme y estar conmigo en cada etapa de mi vida, así como ser ejemplo de valor, paciencia y confianza. Ingeniera ADRIANA MEJIA TERAN, directora del programa de Ingeniería Agroindustrial de la UNIAGRARIA por su apoyo en el proceso de formación. Doctora OLGA MARIN MAHECHA, jefe de Laboratorios de la UNIAGRARIA por toda su disposición y colaboración incondicional en todo momento del trabajo experimental. A todo el personal de Laboratorio en especial a Maira por su apoyo. Agradezco a todos aquellos que me dedicaron su tiempo y su trabajo, a mi alma mater Fundación Universitaria Agraria de Colombia - UNIAGRARIA, a la facultad y a los profesores que la integran, especialmente al Ingeniero Químico MAURICIO SIERRA por ser el promotor de la investigación y brindar aportes y conocimientos a lo largo de la investigación además de inculcarme seriedad, honradez y ética en mis proyectos.
DEDICATORIA Dedico esta tesis a Dios, quien me ha dado la fuerza y pasión para realizar todos mis proyectos. La realización de este documento, no hubiera sido posible sin el apoyo categórico de mis padres, a ellos, gracias por todo, por su gran capacidad de amar, por su fuerza y su gran apoyo. A mis hermanos, quienes, a pesar de las molestias, me inspiraron e impulsaron desde mi infancia hasta hoy, a mis amigos, quienes me brindaron su compañía es todo este proceso académico.
RESUMEN El presente estudio permitió evaluar el efecto de las condiciones de secado sobre el rendimiento y composición fitoquímica del extracto obtenido de las hojas de la planta Piper cumanense Kunth. Se realizaron tratamientos variando la temperatura y tiempo de secado posteriormente se efectuó una extracción solido líquido usando etanol como solvente. Se efectuó un análisis fitoquímico preliminar para establecer la presencia de metabolitos de interés tales como flavonoides, taninos, quinonas y carotenoides. Según los resultados obtenidos el tratamiento que presento mayores compuestos activos en el extracto fue el de secado por 6 horas a una temperatura de 45°C y el de mayor rendimiento de extracto fue a un secado de 4 horas a una temperatura de 45°C. Posteriormente se efectuó una evaluación del potencial antifungico del extracto en el hongo Fusarium oxysporum por el método de dilución en caldo en concentraciones de 0.5%, 1% y 1.5%. Lográndose un porcentaje de inhibición del 53% para las concentraciones de 1% y 1.5%.
Palabras claves Piper cumanense Kunth, Extracto vegetal, Fusarium oxysporum, Secado
ABSTRACT This study allowed us to evaluate the effect of drying conditions on yield and phytochemical composition of the extract obtained from the leaves of the plant Piper cumanense Kunth. Treatments were performed by varying the temperature and drying time subsequently a solid-liquid extraction using ethanol as a solvent was performed. a phytochemical preliminary analysis to establish the presence of metabolites of interest such as flavonoids, tannins, quinones and carotenoids was made. According to the results the treatment showed higher active compounds in the extract was dried for 6 hours at a temperature of 45 ° C and higher yield of extract was to drying 4 hours at a temperature of 45 ° C. An evaluation of potential antifungal extract Fusarium oxysporum by the broth dilution method at concentrations of 0.5%, 1% and 1.5% was subsequently undertaken. Achieving a percent inhibition of 53% for concentrations of 1% and 1.5%. Keywords Piper cumanense Kunth, Fusarium oxysporum, plant extract, drying.
TABLA DE CONTENIDO 1. INTRODUCCIÓN. ............................................................................................. 3 1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA. .............................................................. 5 2. OBJETIVOS...................................................................................................... 6 2.1.
Objetivo General ........................................................................................... 6
2.2.
Objetivos Específicos .................................................................................... 6
3. MARCO TEÓRICO ........................................................................................... 7 3.1.
GENERALIDADES DE GÉNERO PIPER...................................................... 7
3.1.1.
Características taxonómicas de la planta. ................................................. 8
3.1.2.
Clasificación taxonómica del género Piper cumanense Kunth. ................. 9
3.1.3.
Actividad antimicrobiana a partir del género Piper. ................................. 10
3.1.4.
Mecanismo de acción del extracto vegetal .............................................. 11
3.1.5.
Tipos de metabolitos encontrados en las hojas del genero Piper. ........... 12
3.1.5.2.
Pironas ................................................................................................. 12
3.1.5.3.
Lignanos y neolignanos. ...................................................................... 13
3.1.6. Kunth. 3.2.
Tipos de metabolitos encontrados en las hojas de Piper cumanense ................................................................................................................ 14 PROCESOS DE OBTENCIÓN DE EXTRACTOS ....................................... 15
3.2.1.
Técnicas de obtención de extractos vegetales ........................................ 15
3.2.2.
Influencia del tipo de solvente en el rendimiento del extracto.................. 16
3.2.3.
Influencia de las condiciones de secado en la obtención del extracto ..... 18
3.3. CONTROL IN VITRO DE MICROORGANISMOS A PARTIR DE EXTRACTO NATURALES ..................................................................................... 19 3.3.1.
Generalidades de los hongos Fitopatógenos .......................................... 19
3.3.2.
Hongo Fusarium oxysporum. ................................................................... 20
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL ................................................................... 22 4.1.
MATERIALES ............................................................................................. 22
4.2.
MÉTODOS. ................................................................................................. 22
4.2.1.
Lugar de ejecución del proyecto .............................................................. 22
4.2.2.
Descripción del material vegetal. ............................................................. 23
4.2.3.
Pretratamiento del material vegetal. ........................................................ 24
4.2.4.
Reducción de tamaño y secado de la materia prima. .............................. 24
4.2.5.
Obtención del extracto etanólico. ............................................................ 24
4.2.6.
Pruebas fisicoquímicas. ........................................................................... 25
4.2.6.1.
Densidad. ............................................................................................. 25
4.2.6.2.
Índice de refracción. ............................................................................. 26
4.2.7.
Pruebas fitoquímicas preliminares ........................................................... 26
4.2.8.
Análisis de taninos. .................................................................................. 26
4.2.9.
Análisis de flavonoides. ........................................................................... 27
4.2.10. Análisis de quinonas ................................................................................ 29 4.2.11. Análisis de saponinas .............................................................................. 30 4.2.12. Análisis de carotenoides- isoprenoides ................................................... 31 4.2.13. Determinación del contenido de clorofila. ................................................ 31 4.3.
Actividad antifúngica ................................................................................... 32
4.3.1.
Mantenimiento del hongo. ....................................................................... 32
4.3.2.
Inoculación de microorganismo. .............................................................. 33
4.4. 4.4.2.
Diseño experimental ................................................................................... 34 Análisis estadístico .................................................................................. 36
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................................... 38 5.1.
Análisis de curvas de secado. ..................................................................... 38
5.2.
Análisis de rendimientos de los extractos etanólicos. ................................. 39
5.3.
Análisis Fisicoquímico ................................................................................. 41
5.4.
Análisis fitoquímico preliminar de los extractos Piper cumanense Kunth. ... 41
5.4.1.
Identificación de flavonoides en los extractos. ......................................... 42
5.4.2.
Identificación de Quinonas en los extractos. ........................................... 45
5.4.3.
Identificación de Saponinas en los extractos. .......................................... 46
5.4.4.
Identificación de carotenoides en los extractos ....................................... 47
5.4.5.
Identificación de taninos en los extractos. ............................................... 48
5.5.
Determinación del contenido de clorofilas ................................................... 50
5.6. Actividad del Fusarium oxysporum frente al extracto Piper cumanense Kunth. .................................................................................................................... 51 6. CONCLUSIONES ........................................................................................... 54 7. RECOMENDACIONES. .................................................................................. 55 8. REFERENCIAS .............................................................................................. 56 9. ANEXOS ......................................................................................................... 63 Anexo A. ................................................................................................................ 63 Anexo B. ................................................................................................................ 64 Anexo C. ................................................................................................................ 65
TABLA DE FIGURAS Figura 1. Distribución geográfica del genero Piper a nivel mundial. ........................ 8 Figura 2. Foto de partes aéreas del genero Piper.................................................... 9 Figura 3. Estructura de strobopinina y estructura linderatona respectivamente. ... 12 Figura 4.Estructura de Yangonina ......................................................................... 13 Figura 5. Estructura de metisticina y estructura dihidrometisticina respectivamente. ............................................................................................................................... 13 Figura 6. Estructura de eupomatenoide-3 y estructura de eupomatenoide-5 respectivamente..................................................................................................... 13 Figura 7. Estructura del ácido cumanensico. ......................................................... 14 Figura 8. Estructura del ácido cumenico ................................................................ 14 Figura 9. Localización del estudio, Fundación Universitaria Agraria de Colombia. 23 Figura 10. Esquema Metodológico para la construcción de curva de secado de hojas Piper cumanense Kunth. ........................................................................................ 24 Figura 11. Esquema metodológico para la obtención del extracto etanólico de Piper cumanense Kunth. ................................................................................................. 25 Figura 12. Determinación de densidad. ................................................................. 26 Figura 13. Análisis con cloruro férrico. ................................................................... 27 Figura 14. Análisis con acetato de plomo. ............................................................. 27 Figura 15. Análisis Shinoda. .................................................................................. 28 Figura 16. Análisis de Rosenhein. ......................................................................... 28 Figura 17. Análisis para leucoantocianidinas. ........................................................ 29
Figura 18. Análisis con ácido sulfúrico concentrado. ............................................. 29 Figura 19. Análisis ante un ácido y un donador de electrones. .............................. 30 Figura 20. Procedimiento para la reacción de espuma. ......................................... 31 Figura 21. Análisis de carotenoides ....................................................................... 31 Figura 22. Procedimiento para determinar el contenido de clorofila. ..................... 32 Figura 23. Preparación del medio de cultivo .......................................................... 33 Figura 24. Inoculación de Fusarium oxysporum .................................................... 33 Figura 25. Método de difusión en agar. ................................................................. 34 Figura 26: Curvas de secado de las hojas Piper cumanense Kunth. ..................... 38 Figura 27. Rendimientos del extracto Vs tratamiento. ........................................... 39 Figura 28. Análisis estadístico de medias. ............................................................. 40 Figura 29. Análisis de tratamientos por la prueba Shinoda. ................................... 43 Figura 30. Análisis de tratamientos por la prueba Rosenhein. ............................... 44 Figura 31. Análisis de tratamientos por la prueba de leucoantocianidinas. ........... 44 Figura 32. Análisis de tratamientos por reacción con ácido sulfúrico..................... 45 Figura 33. Análisis de tratamientos por reacción ante un ácido y un donador de electrones. ............................................................................................................. 46 Figura 34. Determinación de saponinas por el método de espuma. ...................... 46 Figura 35. Análisis de tratamientos para la identificación de carotenoides. ........... 47 Figura 36. Análisis de tratamientos para la identificación de taninos con acetato de plomo. .................................................................................................................... 48 Figura 37. Análisis de tratamientos para reconocimiento de taninos por reacción con cloruro férrico. ........................................................................................................ 49
Figura 38. Comportamiento del hongo Fusarium oxysporum frente al extracto de las hojas de Piper cumanense Kunth. ......................................................................... 51 Figura 39. Porcentaje de inhibición del hongo Fusarium oxysporum frente a la concentración del extracto. .................................................................................... 52 Figura 40.Muestra después de secado. ................................................................. 65 Figura 41.Indice de refracción extracto Piper cumanense Kunth. .......................... 65 Figura 42. Obtención de los extractos por método soxhlet. ................................... 66 Figura 43. Siembra de hongo Fusarium oxysporum. ............................................. 66
LISTA DE TABLAS
Tabla 1.Taxonomía Piper cumanense Kunth. .......................................................... 9 Tabla 2. Taxonómica Fusarium oxysporum. .......................................................... 20 Tabla 3. Modelo experimental la extracción de las hojas de la planta Piper cumanense Kunth por triplicado............................................................................. 36 Tabla 4. Análisis químico cualitativo realizado a los diferentes tratamientos de Piper cumanense Kunth. ................................................................................................. 42 Tabla 5. Resultados de determinación de clorofila y carotenoides. ....................... 50 Tabla 6. Tabla Anova ............................................................................................. 63 Tabla 7. Pruebas de múltiples rangos .................................................................... 63 Tabla 8. Lectura de Absorbancia para las hojas de Piper cumanense Kunth. ....... 64
1. INTRODUCCIÓN. En la actualidad, para el control de plagas y enfermedades en los cultivos, se han desarrollado grandes avances tecnológicos donde en la mayoría de casos se utilizan plaguicidas químicos. En países en desarrollo como Colombia el control de plagas y enfermedades se realiza con productos en su mayoría de origen petroquímico (Avila et. al, 2011). No obstante, los beneficios aportados por los productos petroquímicos han ido acompañados por una serie de perjuicios, algunos de ellos tan graves que ahora representan una amenaza para la supervivencia a largo plazo de importantes ecosistemas, como consecuencia de la perturbación de las relaciones depredadorpresa y la pérdida de biodiversidad (FAO, 1997). Un ejemplo es el Benomil, fungicida que perjudica organismos benéficos, como los insectos polinizadores, y para lo cual los patógenos ya han desarrollado resistencia. Otro aspecto a considerar son los efectos nocivos que tienen los plaguicidas de origen petroquímico en la salud humana (Mendoza , 2015). Como lo enuncia la FAO “Existen alternativas que no utilizan productos químicos y son menos tóxicas y en muchos casos el manejo integrado de plagas puede ofrecer una solución adecuada más sostenible y que reduce el uso de plaguicidas” (FAO, 2016). El estudio fitoquímico del genero Piper ha permitido reconocerlo como el género más bio-activo de la familia Piperaceae por contener una serie de compuestos biológicamente activos, como alcaloides, amidas, propenilfenoles, lignanos, neolignanos, terpenos, esteroides, piperolidos, chalconas, dehidrochalconas, flavonas y flavononas (Aricapa, 2012). Teniendo en cuenta lo anterior en varias especies del genero Piper se han reconocido estudios de actividad biológica importantes encontrando reportes como en Piper amalago L, Piper enlogatum Vah L y Piper Rusby C los cuales poseen actividad insecticida gracias a que están constituidos por compuestos como peramidas (Svetaz et. al, 2010); También se ha encontrado que la Piper imperiale posee actividad antioxidante (Beltran, 2013); adicionalmente la especie Piper adumcum, Piper dispyrifolium, Piper holtonii y Piper cumanense presentan un efecto contra enfermedades tropicales como la leshmaniasis (Cardozo M. A., 2012), la esquitosomiasis (Sanchez et. al, 2010) y la malaria (Rojas et. al, 2012). Estudios sobre el efecto fungicida y bactericida de la especie Piper describen la actividad antibacterial del extracto metanolico obtenido de la inflorescencia de Piper lungum y su actividad contra bacterias gram-positivas y moderadamente activo 3
contra Bacterias gram-negativas (Celis et. al, 2008) también se ha evaluado extractos etanólicos de Piper hispidum y Piper peltatum activos para combatir el hongo Mycosphaerella fijiensis causante de la sigatoka negra en los plátanos y bananos (Parmar, 1997). Por otra parte, se ha encontrado que el efecto del tiempo y temperatura de secado permite incrementar el rendimiento y calidad del extracto como se evidencia en la investigación de (Gomez, 2007) donde se pudo evidenciar que en la obtención del extracto de Lippia alba (Mill) a medida que aumentaron las temperaturas (40 a 80 ºC), los tiempos de secado y de extracción (30 a 75 min), se presenció un aumento en el rendimiento del aceite y de los extractos. De igual manera un aumento de concentraciones relativas de compuestos como neral y geranial y encontró una disminución de geraniol y nerol debido a la oxidación de estos a sus respectivos aldehídos. De acuerdo con lo anterior se hace necesario el continuar evaluando el efecto del pretratamiento en el rendimiento y calidad del extracto, así como el potencial fungico de esta especie promisora en la obtención de extractos benéficos para el control de plagas en el sector agroindustrial.
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1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA. Piper cumanense Kunth, comúnmente conocida como cordoncillo es una planta que crece en la zona tropical de América. Es un arbusto nudoso con hojas lanceoladas, sus inflorescencias son en forma de espigas sensibles. Sobre la Piper cumanense Kunth existen algunas investigaciones enfocadas a su actividad citotóxica (Sanchez et. al, 2010), leshmaniacida (Rojas et. al, 2012) antimalarica (Cardozo M. A., 2012) siendo estas afecciones de tipo tropical donde, se demostró una actividad moderada frente a estas enfermedades. Por otro lado, en estudios efectuados por la universidad nacional de Colombia donde se evaluó la actividad antifungica de la Piper cumanense Kunth, se utilizó la inflorescencia y las hojas que se dejaron secar al aire libre y se realizó una extracción por maceración para su posterior estudio fitoquímico de los extractos etanólicos donde se descubrieron dos compuestos derivados del ácido benzoico llamados ácidos cumenico y ácido cumanensico. De los extractos etanólicos de hojas e inflorescencias se demostró un efecto inhibitorio sobre el crecimiento del hongo Fusarium oxysporum y Botrytis cinérea. (Mendoza , 2015). Estudios previos han demostrado la importancia del secado de la materia prima en la composición y rendimiento del extracto de especies naturales que han llegado a sobrepasar el 80 % con respecto al contenido del extracto sin un proceso de secado (FAO, 1997). Por lo anterior y en vista de la poca investigación en relación con el efecto de secado sobre los compuestos del extracto de la planta y tomando como referente lo mencionado anteriormente, con esta propuesta se pretende dar respuesta a la siguiente pregunta. ¿Qué influencia ejerce las condiciones de secado en el rendimiento y la composición fitoquímica del extracto de interés agroindustrial proveniente de las hojas de la planta Piper cumanense Kunth?
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2. OBJETIVOS 2.1.
Objetivo General
Evaluar el efecto de las condiciones de secado sobre el rendimiento y composición fitoquímica del extracto obtenido de las hojas de la planta Piper cumanense Kunth. 2.2.
Objetivos Específicos
Analizar el efecto de la temperatura y el tiempo de secado sobre el rendimiento y composición fitoquímica del extracto.
Evaluar el efecto de extracto de mejores características fitoquímicas como agente fungicida sobre el hongo Fusarium oxysporum.
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3. MARCO TEÓRICO 3.1.
GENERALIDADES DE GÉNERO PIPER.
La familia Piperaceae es originaria del suroeste de la India y es una de las especies más antiguas. Posee un número extenso de arbustos, frutos y hierbas que se encuentran distribuidas por todo el mundo. El género Piper es el más extenso de la familia Piperaceae y cuenta con aproximadamente 1000 especies que se distribuyen en regiones tropicales y subtropicales. La mayor diversidad de la especie se encuentra en los trópicos americanos entre ellos Colombia seguida de Asia del sur, estas especies son generalmente herbáceas, a veces arbustos y rara vez árboles pequeños, de sexualidad hermafrodita. Sus tallos tienen forma de nudos abultados, sus hojas segregan aceites esenciales gracias a que poseen unas células secretoras, sus flores son pequeñas y sus inflorescencias son en forma de espigas flexibles, poseen un ovario unicelular con un ovulo que se desarrolla en forma de fruto en baya (Jaramillo & Manos, 2001). Entre las especies más conocidas, usadas y cultivadas se encuentra la Piper nigrum llamada comúnmente como pimienta es utilizada como condimento en las comidas. (Jaramillo & Manos, 2001). En Colombia las especies de este género se conocen como anises y son utilizadas para el tratamiento de enfermedades como diarrea, disentería, dolores de estómago, caries dentales y cicatrizantes. Tribus indígenas como los motilones en el Norte de Santander y los Embera en el Choco las utilizan como analgésicos, antiinflamatorios y contra picaduras de serpientes (Beltran, 2013).
7
Fuente: (Jaramillo & Manos, 2001).
Figura 1. Distribución geográfica del genero Piper a nivel mundial. 3.1.1. Características taxonómicas de la planta. El género Piper es el más extenso de la familia Piperaceae y cuenta con aproximadamente 1000 especies que se distribuyen en regiones tropicales y subtropicales. Sus características principalmente son hojas simples, enteras, con glándulas que contiene esencia de olor picante y peciolos que abrazan el tallo, inflorescencias, presentan el tejido vascular primario en 2 o más anillos; el fruto es una drupa o baya, y consta de una semilla (Albarracion & Gallo , 2003).
8
Fuente: (Beltran, 2013)
Figura 2. Foto de partes aéreas del genero Piper. Sus tallos tienen forma de nudos abultados y sus hojas segregan aceites esenciales gracias a que poseen unas células secretoras, sus flores son pequeñas y sus inflorescencias son en forma de espigas flexibles, poseen un ovario unicelular con un ovulo que se desarrolla en forma de fruto en baya (Jaramillo & Manos, 2001). 3.1.2. Clasificación taxonómica del género Piper cumanense Kunth. Piper cumanense Kunth es un arbusto que crece en algunos países de américa (Brasil, Costa rica, Colombia y Ecuador) En la tabla 1, se puede observar la descripción taxonómica de la especie Piper cumanense Kunth. Tabla 1.Taxonomía Piper cumanense Kunth. Nombre Científico Reino Phylum Clase Orden Familia Género Epíteto Específico Autor Epíteto Específico
Piper cumanense Plantae Magnoliophyta Magnoliopsida Piperales Piperaceae Piper Cumanense Kunth
Fuente: (Herbario nacional colombiano, 2016)
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3.1.3. Actividad antimicrobiana a partir del género Piper. Las plantas son una fuente importante de sustancias útiles en la agricultura, pues producen diversos metabolitos secundarios que han sido utilizados desde hace muchos años empíricamente por el hombre como agentes de protección de cultivos (Abad et. al, 2007). Ejemplo de esto son las especies vegetales pertenecientes al género Piper, ampliamente utilizadas de manera tradicional en la protección de cultivos y como fuente de fito-medicamentos (Regnault, 2003). Existen diferentes estudios que han comprobado la actividad antimicrobiana de plantas del género Piper. A continuación, se nombran algunos:
Un ejemplo de ello es la planta Piper septuplinervium con la cual se realizó la obtención de dos compuestos tipo flavonoide activos contra dos cepas de hongos fitopatogenos Fusarium oxysporum y Botrytis cinérea (Ávila et. al, 2011).
En una investigación reciente realizada por (Correa et. al, 2015) se evaluó la actividad antioxidante y antifungica de ocho especies del genero Piper donde se evidencio mayor actividad antifungica de Piper pesaresanum C y Piper eriopodon C contra el hongo Fusarium solani.
(Pineda et.al, 2012) Investigaron la eficacia de dos aceites esenciales de Piper auritum Kunth y Piper holtonii C.DC. en la inhibición del crecimiento de importantes patógenos de pos cosecha de frutas (Colletotrichum acutatum, gloeosporioides y theobromae), los resultados mostraron un buen control a los tres patógenos.
En estudio realizado por (Ruiz & Roque, 2009) se evaluó la actividad antimicrobiana de cuatro plantas una de ellas Piper lineatum está la cual tuvo la mejor actividad bactericida contra staphylococcus aureus, staphylococcus epidermidis, pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis y Escherichia coli; y actividad antifungica contra Candida albicans, Aspergillus niger y Microsporum canis.
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Investigación realizada por varias universidades de Latinoamérica sobre la actividad antifungica de varias especies del genero Piper (Piper adumcum, Piper amalago L, Piper elongatum Vahl, Piper heterophyllum Ruiz & Pav, Piper jacquemontianum Kunth, Piper holtonii y Piper barbatum) se evidencio actividad antifungica contra (Candida albicans, Aspergillus flavus, Trichophyton rubrum, Epidermophyton floccosum, Aspergillus niger, Candida tropicalis y Trichophyton mentagrophytes), respectivamente (Svetaz et. al, 2010).
En el aceite esencial de Piper adumcum se demostró actividad inhibitoria frente a Fusarium solani y Phytophthora sp (Scalvenzi et. al, 2016).
3.1.4. Mecanismo de acción del extracto vegetal Las plantas tienen el potencial de ser una fuente importante de sustancias útiles debido a que los metabolitos secundarios que son usados por la planta como defensa química se pueden usar en el sector industrial y en la protección de cultivos agrícolas. Las especies vegetales del genero Piper se han usado ampliamente de manera tradicional en la protección de cultivos y como fuente de fitomedicamentos (Avila et. al, 2011). Los extractos vegetales actúan contra los microorganismos de diversas maneras afectando su estructura morfológica, inhibiendo la síntesis de la pared celular, de las proteínas, y de ácidos nucleicos, alterando la permeabilidad celular (Calvo & Martinez , 2009). Algunos metabolitos secundarios como las fitoanticipinas y las fitoalexinas defienden a la planta de infecciones por agentes fitopatogenos. (Taylor, 1998) Además otros metabolitos que producen las plantas son defensivas, con naturaleza péptida y ricas en cisteína inhiben el crecimiento de hongos produciendo en ellos cambios morfológicos y daño en la estructura celular (Agrios, 2005). Además, encontramos diferentes metabolitos tipos flavonoide que colaboran con la inhibición de diferentes hongos fitopatogenos (Avila et. al, 2011).
11
3.1.5. Tipos de metabolitos encontrados en las hojas del genero Piper. 3.1.5.1.
Flavonoides
Estos metabolitos secundarios están ampliamente distribuidos en el género Piper, dentro de los principales tipos se encuentran las flavonas, flavanonas, chalconas y dihidrochalconas. Su actividad biológica es variada ya que presentan actividad antibacteriana, antifungica y antioxidante (Masuoka et. al, 2003). De la especie P. hostmannianum var. Berbicense, se han aislado dos flavonas conocidas como strobopinina y linderatona.
Fuente: (Masuoka et.al, 2003)
Figura 3. Estructura de strobopinina y estructura linderatona respectivamente. 3.1.5.2.
Pironas
Compuestos de tipo α-Pironas conocidos como kavapironas o kavalactonas, a este tipo de compuestos se le debe el efecto relajante de la bebida comercializada como kava-kava, preparada desde la antigüedad de las raíces de esta especie. Las kavapironas son δ-lactonas con sustituyentes estiril o dihidroestiril, han sido aisladas principalmente de P. methysticum. Cerca de 18 kavapironas han sido encontradas, estando en mayor proporción las denominadas yangonina, metisticina y dihidrometisticina (Dewik, 2009).
12
Fuente: (Dewik, 2009)
Figura 4.Estructura de Yangonina
Fuente: (Dewik, 2009)
Figura 5. Estructura de metisticina y estructura dihidrometisticina respectivamente.
3.1.5.3.
Lignanos y neolignanos.
Los lignanos y neolignanos hacen parte de los metabolitos secundarios representativos del genero Piper. De la especie P. regnellii se han aislado neolignanos denominados eupomatenoide-3 y eupomatenoide-5 con actividad antifungica frente a Trichophyton rubrum (Parmar, 1997).
Fuente: (Parmar, 1997)
Figura 6. Estructura de eupomatenoide-3 y estructura de eupomatenoide-5 respectivamente. 13
3.1.5.4.
Terpenos.
Las especies del género Piper presentan terpenos en sus aceites esenciales, en su mayoría de tipo monoterpenos y sesquiterpenos de núcleos variados. Los monoterpernos y monoterpenoides como el canfeno, mirceno, limoneno, linalol, y sesquiterpenos y sesquiterpenoides como β- cariofileno, germacreno D, cubebol, entre otros, son comunes en los aceites esenciales de varias especies (Parmar, 1997). 3.1.6. Tipos de metabolitos encontrados en las hojas de Piper cumanense Kunth. En estudios recientes se ha descubierto la presencia de dos metabolitos derivados del ácido benzoico que tienen en común una función de defensa y resistencia a agente externo. Además de algunos compuestos comunes como campesteron, estigmasterion, ß–sitosterol y oxido cariofileno (Mendoza, 2015).
Fuente: (Mendoza , 2015)
Figura 7. Estructura del ácido cumanensico.
Fuente: (Mendoza , 2015)
Figura 8. Estructura del ácido cumenico
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Respecto de la actividad antimalarica de la Piper cumanense Kunth se encontraron también flavonoides como vitexina, orientina, isovetexina además de terpenos, monoterpenos y algunas chalconas (Cardozo M. A., 2012).
3.2.
PROCESOS DE OBTENCIÓN DE EXTRACTOS
La extracción es utilizada por el hombre desde hace muchos años, se obtiene mediante la separación de porciones biológicamente activas presentes en los tejidos de las plantas, con el uso de solventes (Etanol, agua u otros solventes selectivos) y un proceso de extracción adecuado. Los procesos de obtención de extractos también pueden definirse como la separación de un componente de una mezcla en un medio disolvente (Cardozo M. , 2001). 3.2.1. Técnicas de obtención de extractos vegetales En la obtención de extractos vegetales se usan diferentes técnicas de separación en las que tanto el tipo de compuesto de interés como el solvente usado juegan un papel importante en la selección del proceso de extracción a aplicar. Es necesario y de especial importancia el conocer el ò los compuestos de intereses, así como la naturaleza de la materia prima a usar de tal forma que permita seleccionar el proceso de extracción para una alta recuperación del metabolito de interés y la estabilidad del o los componentes químicos del extracto (Meireles, 2009). 3.2.1.1.
Destilación con vapor.
Este proceso se usa para la extracción de materiales sensibles a la temperatura. Se usa en aquellos casos donde los componentes a ser separados presentan volatilidades tan bajas que el uso de procesos ordinarios de destilación tendría como consecuencia la degradación de compuestos termolábiles (compuestos sensibles a la temperatura). Dentro de este tipo de metabolitos termolábiles se encuentran los llamados aceites esenciales compuestos por sustancias volátiles como terpenoides, compuestos fenólicos y sus derivados, moléculas no terpenicas y menos frecuente por compuestos heterocíclicos (Stashenko E. E., 2009). Dentro de esta técnica de extracción se encuentran: La destilación por arrastre con vapor, la hidrodestilación y la hidrodestilación asistida por microondas. 15
3.2.1.2.
Extracción por hidrodestilación.
El principio de la hidrodestilación es llevar a estado de ebullición una suspensión acuosa de un material, con el fin de que se pueda condensar el vapor resultante y colectarlo, para posteriormente separar el agua del aceite esencial obtenido (Albarracion & Gallo , 2003). 3.2.1.3.
Extracción por hidrodestilacion asistida por microondas.
Este método consiste en la utilización de un extractor cerrado donde se sumerge el disolvente y el material, dentro de un horno microondas conectado a un condensador. El horno microondas crea un campo eléctrico que produce calor y brinda un calentamiento homogéneo a toda la muestra lo que lleva a la ruptura de la pared celular y liberación de los aceites esenciales de la planta (Golmakani, 2007). 3.2.1.4.
Técnica solido-liquido por el método SOXHLET.
Esta técnica se usa en la obtención de extractos que no son termolábiles y que tienen cierta afinidad debido a su polaridad por un solvente determinado. La selección del solvente debe considerar aspectos tales como la selectividad y capacidad de disolver el soluto, viscosidad, tensión superficial y costo (Meireles, 2009). En esta técnica la materia seca se sitúa en una cámara central, la cual se acopla a un recipiente inferior que contiene el solvente el cual se evapora, el vapor de este asciende al condensador y gotea sobre la materia vegetal. Por reflujo, el extracto del material vegetal y el solvente evaporado se condensa y vuelve a mezclase con el material vegetal. Con la recirculación de los vapores condensados se arrastran los principios activos del material vegetal (Lizcano & Vergara, 2008). 3.2.2. Influencia del tipo de solvente en el rendimiento del extracto Como lo nombra (Caldas , 2012) se debe seleccionar un solvente que ofrezca el mejor balance de varias características deseables; estabilidad química en las condiciones del proceso, baja viscosidad, baja presión de vapor, capacidad para 16
extraer los compuestos de interés sin afectar la calidad, alto límite de saturación y selectividad respecto al soluto por extraer, facilidad y economía de recuperación de la corriente el extracto y bajo costo. El factor más importante en los procesos de extracción, es la calidad del solvente empleado. El solvente ideal puede ser: selectivo, químicamente inerte, que tenga bajo punto de ebullición, de bajo costo, que se pueda evaporar sin dejar residuos y que tenga un punto de ebullición uniforme. Los solventes orgánicos habitualmente tienen bajo punto de ebullición y pueden ser reutilizados luego de la destilación (Calderon A, 2008). 3.2.2.1.
Solventes polares
Son sustancias en las que la distribución de la nube electrónica se caracteriza por su asimetría y que contiene moléculas con polo tanto positivo como negativo. Algunos solventes polares conocidos son: el agua, alcoholes de bajo peso molecular como el etanol (Bottani et. al, 2006). 3.2.2.2.
Solventes apolares
Por lo general se trata de sustancias orgánicas, en las que la distribución de la nube electrónica no es asimétrica. Esto trae como consecuencia la falta de polaridad, y la posterior generación de un dipolo permanente (Bottani et. al, 2006). Dentro de la configuración geométrica de la molécula se hallan los enlaces polares. Estos solventes disuelven las sustancias apolares por interacciones entre dipolos inducidos. Compuestos como el dietiléter, tolueno, cetonas o ciclohexano, hexano, benceno son claros ejemplos de solventes apolares (Bottani et. al, 2006). En el presente trabajo se usó como disolvente el etanol, teniendo en cuenta que las investigaciones previas de este proyecto evidenciaron que el etanol es más eficiente en cuanto a la extracción de metabolitos secundarios, además de su disponibilidad y costo (Caldas , 2012).
17
3.2.3. Influencia de las condiciones de secado en la obtención del extracto El secado generalmente se puede definir como la remoción del líquido presente en un sólido hasta un nivel donde el crecimiento microbiano y las reacciones químicas que puedan causar deterioro del material sean minimizados (Gomez, 2007). Existen diferentes razones por las cuales se realiza un secado en las plantas, las principales son:
Inhibir la destrucción enzimática, fenómeno que puede alterar sustancialmente la calidad del material vegetal por descomposición de sus componentes. Se reduce el contenido de humedad hasta porcentajes entre 5% y 14% según sea el caso. (Stashenko et al.,1996)
Estabilizar el olor, color, textura y/o composición química. En este caso se pretende potencializar la composición de metabolitos secundarios, aunque se deben encontrar condiciones óptimas de tiempo y temperatura para evitar la pérdida de metabolitos por estas condiciones (Gomez, 2007).
Reducir fletes, costos de embalaje y almacenamiento (Gomez, 2007)
3.2.3.1.
Parámetros del secado
La elección del método de secado depende fundamentalmente, de la calidad del producto que se quiere lograr y del objetivo que se quiere encontrar con el secado, en el caso de este proyecto se tuvo en cuenta temperaturas y tiempos de secado para la mayor extracción de metabolitos secundarios presentes en la planta Piper cumanense Kunth. Los parámetros más importantes que se deben tener en cuenta son.
Tipo de producto: las semillas y raíces tiene menor contenido de humedad (70-75%), comparado con las hojas y flores (75-85%). 18
Tamaño del material: cuando las partes del material vegetal a secar son muy pequeñas, deben emplearse sistemas que otorguen una gran superficie de evaporación y, a su vez, el producto deberá dispersarse sobre una capa mucho más fina, facilitando el secado de los estratos inferiores.
Estabilidad de los principios activos: cuando el material posee una esencia muy volátil, el proceso se hace crítico, y para llegar a la humedad final requerida, puede ser mejor prolongar el proceso, pero usando aire menos caliente. Es probable apreciar variaciones en la calidad del extracto en materiales desecados, debido, tal vez, a la descomposición de los terpenos oxigenados, originalmente presentes en la planta en forma de glicósidos.
Influencia de la luz en la estabilidad vegetal: normalmente, para la obtención de un buen producto, es necesario trabajar con bajos niveles de luminosidad, evitando así el factor lumínico como un generador de descomposiciones del producto (Gomez, 2007).
3.3.
CONTROL IN VITRO DE MICROORGANISMOS A PARTIR DE EXTRACTO NATURALES
3.3.1. Generalidades de los hongos Fitopatógenos En la agricultura mundial los hongos fitopatogenos son causantes de enfermedades en diferentes tipos de cultivos, siendo estos responsables de pérdidas económicas cuantiosas que ocasionan pérdidas de producción biológica, es decir, la alteración que existe entre el crecimiento y el desarrollo de las plantas hospedantes atacadas por esos microorganismos (Agrios, 2005). Según lo descrito por (Alfonso & Sandoval, 2008) se sabe que más de 8,000 especies de hongos pueden causar enfermedades en las plantas. Todas las plantas corren el riesgo de ser infectadas y dañadas por más de una especie de hongo fitopatogenos, Las pérdidas en las cosechas debido a enfermedades fúngicas pueden estar cercanas al 12% en el mejor de los casos; los países en desarrollo pueden superar este valor (Avila et. al, 2011).
19
Las enfermedades causadas por hongos producen en sus hospederos una amplia variedad de síntomas. Entro otros los hongos fitopatogenos pueden producir manchas cloróticas y necróticas, tizones, podredumbres húmedas o secas, abolladuras y marchitamientos (Espinoza, 2001). Para el control de los hongos fitopatogenos se emplean fungicidas sintéticos, tratamientos térmicos y en mínimos casos aceites esenciales y extractos naturales de otras plantas. (Avila et. al, 2011). 3.3.2. Hongo Fusarium oxysporum. Esta especie crece dando una colonia blanca que produce un pigmento de distintos tonos violeta a morado oscuro, se caracteriza por producir colonias de crecimiento rápido (Bolaños, 2013). Tabla 2. Taxonómica Fusarium oxysporum. Phylum Clase Orden Familia Genero Especie
Ascomycota Sordariomycetes Hyphomycetes Nectriaceae Fusarium Fusarium oxysporum Fuente: (Bolaños, 2013)
3.3.2.1.
Sintomatología
Los síntomas de la enfermedad aparecen de forma unilateral; se acompaña de un amarillamiento parcial de las hojas además de brotes; a su vez se observa enanismo y disminución en el crecimiento de la planta, los síntomas avanzan lentamente por la planta hacia arriba hasta causar un marchitamiento generalizado y la muerte (Arias & Jerez , 2008).
20
3.3.2.2.
Localización
Fusarium oxysporum penetra la epidermis de las raíces, la corteza y endodermos, finalmente entra a los vasos del xilema, colonizando el sistema vascular, en el cual el fitopatogeno produce compuestos complejos que interfieren con la capacidad de la planta para la toma de agua y nutrientes; ocasionando así la degradación de tejidos y la muerte (Arias & Jerez , 2008). El hongo penetra directamente ò a través de heridas hechas de forma mecánica o por insectos, El patógeno coloniza el xilema de las plantas por crecimiento del micelio o por medio del transporte pasivo de las microconidias los cual contribuye a la colonización no uniforme, generalmente a un lado de la planta; el hongo deteriora los tejidos por medio de enzimas que degradan la pared celular como xilanasas entre otras y se comienzan a formar cavidades en las hojas y paredes del tallo (Arias & Jerez , 2008).
21
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL 4.1.
MATERIALES
Los materiales utilizados en la investigación: Cajas Petri, dedal celulósico/vidrio, equipo soxhlet, condensador, beaker (50-100-250 ml), regla, asa (recta-curva), tubos de ensayo, pipeta, micro pipeta, cuchillo, tabla de picar, probeta, pera, mangueras, pinzas, papel filtro, gradilla, recipientes ámbar, mechero, mortero y pistilo, tubos falcón, gotero. Los reactivos utilizados en la investigación se usaron conforme se presentaron sin ningún tratamiento adicional: etanol etílico anhidro (99.8%) de CISPROQUIM lote 20940331E, magnesio en polvo (100%) de CARLO EBRA, ácido clorhídrico (36,538%) de JT BAKER lote B31C00, alcohol amílico (98%) de JT BAKER lote 0000035325, ácido sulfúrico (95-98%) de CHEMI lote 040601-2081, cloruro férrico en polvo (100%) de CARLO EBRA, acetato de plomo en polvo (100%) de MERK, zinc en polvo (100%) de CARLO EBRA, éter de petróleo (95%) de RODA QUIMICOS, hidróxido de sodio (100%) de PANREAC lote 305535E5, acetona (80%) de PANREAC lote 0000459239, agar PDA (100%) de SCHARLAU lote 103699. Los equipos usados en la investigación: horno de secado BINDER-ED23UL, horno de convección LABTECH-LDO 080F, balanza analítica PRECISA-XT 120A, plancha de calentamiento SCI FINETECH, espectrofotómetro JP SELECTRA, vortex GEMMY-VM 300P, centrifuga INDULAB, incubadora QUINCY LAB 12-140, freezer HAIER-BIOMEDICAL, cámara de flujo laminar LABTECH, baño termostatado LAUDA-011, pH metro HANNA PH21, autoclave ALLAMERILAN, comba sumergible HJ-1141. 4.2.
MÉTODOS.
4.2.1. Lugar de ejecución del proyecto El proyecto de investigación se realizó en la Fundación Universitaria Agraria de Colombia – UNIAGRARIA. La cual esta está ubicada en la Calle 170 No 54A -10 en la ciudad de Bogotá (Colombia). Se encuentra a 2650 msnm, con una humedad relativa del 94% y temperatura anual promedio de 14°C. 22
En el laboratorio de fitoquímica de la UNIAGRARIA se efectuó el procedimiento de adecuación, pre tratamiento de las materias primas y obtención de los extractos etanólicos. En la figura 4 se puede apreciar un mapa en el que se localiza la institución.
Fuente: Google Maps
Figura 9. Localización del estudio, Fundación Universitaria Agraria de Colombia.
4.2.2. Descripción del material vegetal. Las muestras vegetales de Piper cumanense Kunth se tomaron de plantas silvestres del municipio Carmen de Apicala del departamento de Tolima, Colombia y determinada por comparación morfológica por un espécimen que reposa en el Herbario Nacional Colombiano de la Universidad Nacional de Colombia. Las muestras vegetales de Piper cumanense Kunth se transportaron a temperatura ambiente y fueron almacenadas en el Laboratorio de Fitoquímica de la universidad UNIAGRARIA.
23
4.2.3. Pretratamiento del material vegetal. Para garantizar la inocuidad de las muestras se realizó un lavado de agua mezclada con hipoclorito de sodio al 5%. 4.2.4. Reducción de tamaño y secado de la materia prima. El material vegetal se cortó en pequeños cuadros de 1cm2 y se llevó a un Horno de convección forzada marca LABTECH para su deshidratación a diferentes temperaturas y tiempos, todo esto con el fin de construir curvas de secado y poder evaluar el rendimiento del extracto y el cambio de composición fitoquímica.
CAJA PETRI 30 gr de hojas de Piper cumanense Kunth Horno de convección forzada
Registrar pesos cada hora
Llevar a 45ºC, 35ºC por 4h y 6h Producto deshidratado con humedad ligada
Llevar a Horno de convección natural a 105ºC Producto totalmente deshidratado
Fuente: Grupo de Investigación e Innovación Agroindustrial-GINNA.
Figura 10. Esquema Metodológico para la construcción de curva de secado de hojas Piper cumanense Kunth. 4.2.5. Obtención del extracto etanólico. Después de haber realizado el pretratamiento la extracción se llevó a cabo empleando el método soxhlet para cada una de las muestras y uno adicional con el material fresco (muestra patrón), se utilizó un equipo soxhlet de 100 ml de capacidad usando como solvente etanol al 99.8% con 7 ciclos de extracción. 24
DEDAL Hojas deshidratadas con humedad ligada Extractor soxhlet Pesar el balón.
Incorporar balón al extractor soxhlet. Adicionar aprox 70 ml de etanol al 99.8%
Llevar a temperatura de ebullición del solvente Realizar 7 ciclos de extracción.
Destilación
Rendimiento en extracto por diferencia de peso
Fuente: Grupo de Investigación e Innovación Agroindustrial-GINNA.
Figura 11. Esquema metodológico para la obtención del extracto etanólico de Piper cumanense Kunth. 4.2.6. Pruebas fisicoquímicas. 4.2.6.1.
Densidad.
Para la determinación de densidad se realizó el método del picnómetro.
25
Picnómetro Pesar el Picnómetro Pesar el Picnómetro más agua (Fluido de referencia). Pesar picnómetro más muestra Determinar
Fuente: (Huerta, 2011)
Figura 12. Determinación de densidad. 4.2.6.2.
Índice de refracción.
La prueba de índice de refracción se determinó con un Refractómetro ABBE 98.490 4.2.7. Pruebas fitoquímicas preliminares A los cuatro (4) extractos obtenidos del tratamiento experimental, así como al extracto de control se le efectuaron las pruebas fitoquímicas preliminares que se describen a continuación. 4.2.8. Análisis de taninos. Para el análisis de taninos se realizaron dos pruebas las cuales se mencionan a continuación. 4.2.8.1.
Prueba con cloruro férrico.
Con este ensayo se puede reconocer polímeros de polifenoles comúnmente denominados taninos. Los taninos reaccionan dando una coloración azul, si son taninos derivados del ácido gálico o coloración verde si son derivados del ácido protocatequico. Se empleó acido tánico al 5% como solución patrón para comparar resultados. 26
Prueba de cloruro férrico 1 gota de cloruro férrico
Adicionar 0,2 ml de extracto
Observar resultados
Fuente: (Bilbao, 1997)
Figura 13. Análisis con cloruro férrico. 4.2.8.2.
Prueba con acetato de plomo.
Los taninos reaccionan con acetato de plomo produciendo turbidez o precipitado blanco. Prueba de acetato de plomo 1 ml de acetato de plomo al 10%
Adicionar 1 ml de extracto
Observar resultados
Fuente: (Bilbao, 1997)
Figura 14. Análisis con acetato de plomo. 4.2.9. Análisis de flavonoides. Para el análisis de flavonoides se realizaron cuatro pruebas que se mencionan a continuación. 4.2.9.1.
Prueba de Shinoda
27
Los flavonoides con anillo de gamma benzopirona reacción con esta prueba dando como resultado colores rosado, anaranjado o fresa. Prueba Shinoda
1 ml de extracto etanólico Gotas de ácido clorhídrico
0,2 grm magnesio en polvo Observar resultados
Fuente: (Bilbao, 1997)
Figura 15. Análisis shinoda. 4.2.9.2.
Prueba de Rosenhein
Los flavonoides con estructura de flavilo dan prueba positiva con cambio de color que va desde carmesí hasta rosado claro. Prueba de Rosenhein 1 ml Extracto Etanólico 0.5 ml de Ácido Clorhídrico. Calentar a 90°C por 10 min. Enfriar 0.5 ml Alcohol amílico. Decantar
Observar resultados
Fuente: (Bilbao, 1997)
Figura 16. Análisis de Rosenhein. 28
4.2.9.3.
Prueba para leucoantocianidinas.
Los flavonoides del tipo leucoantocianidinas reaccionan en esta prueba dando como resultado una coloración rojo intenso. Las catequinas producen color caféamarillo. Prueba leucoantocianidinas 1 ml de extracto etanólico 1 ml de ácido clorhídrico
Calentar a 90°C por 20 minutos Observar resultados
Fuente: (Bilbao, 1997)
Figura 17. Análisis para leucoantocianidinas. 4.2.9.4.
Prueba con ácido sulfúrico concentrado
Las flavonas y flavonoles presentan un color amarillo intenso. Las chalconas y auroras rojo guinda a rojo azuloso. Prueba Ácido sulfúrico 1 ml extracto etanólico
1 ml de ácido sulfúrico Observar resultados
Fuente: (Bilbao, 1997).
Figura 18. Análisis con ácido sulfúrico concentrado. 4.2.10.
Análisis de quinonas
29
4.2.10.1. Comportamiento en presencia de un ácido y un donador de electrones. Las quinonas tienden a dar colores amarillos, rojos o purpuras, en presencia de ácidos o álcalis concentrados. Prueba de reconocimiento 0,2 ml de extracto 0,2 grm de zinc en polvo
Gotas de ácido clorhídrico Observar resultados
Fuente: (Bilbao, 1997)
Figura 19. Análisis ante un ácido y un donador de electrones. 4.2.11.
Análisis de saponinas
4.2.11.1. Reacción de espuma Las saponinas y los cardiotónicos disminuyen la tensión superficial del agua produciéndose espuma en altura de 2 cm que permanece hasta media hora.
Prueba de espuma
Reacción Acida
Reacción Base
1 ml extracto etanólico
1 ml extracto etanólico
1 ml de Hidróxido de sodio pH13
1 ml ácido clorhídrico pH 1
Observar resultados
Observar resultados
30
Fuente: (Bilbao, 1997)
Figura 20. Procedimiento para la reacción de espuma. 4.2.12.
Análisis de carotenoides- isoprenoides
Para su detección se utiliza una solución de éter de petróleo en ácido sulfúrico al 85%, formándose en la zona de separación de ambas capas un color azul. Prueba de reconocimiento de carotenoides 1 ml extracto de extracto etanólico 1 ml de éter de petróleo Agitación en vortex Observar resultados
Fuente: (Bilbao, 1997)
Figura 21. Análisis de carotenoides 4.2.13.
Determinación del contenido de clorofila.
Para la determinación de pigmentos en el extracto se utilizó la metodología descrita en la figura 22. Evaluando la absorbancia a diferentes longitudes de onda del extracto clorofílico
31
Determinación de clorofilas a y b Hojas frescas 10 ml de acetona al 80% Macerar Oscuridad durante 2 minutos
Centrifuga 3000 rpm por 15 minutos 0,2 ml sobrenadante 2 ml de acetona al 80% Medir la absorbancia en 663, 646 y 470 nm. Empleando como blanco Acetona al 80 %
Fuente: (Lichtenthaler, 1987)
Figura 22. Procedimiento para determinar el contenido de clorofila. 4.3.
Actividad antifúngica
El análisis preliminar se realizó para conocer el efecto de la concentración del extracto en el control antifungico de Fusarium oxysporum se eligió el extracto con mejores características tanto en rendimiento como en análisis preliminar de compuestos. Para medir la actividad antifungica se utilizó la cepa Fusarium oxysporum, facilitadas por los investigadores de un trabajo anterior de control antifungico (David & Lopez, 2015). Estas cepas se replicaron en cajas de Petri usando como medio de cultivo PDA (Agar papa dextrosa) para hongos. 4.3.1. Mantenimiento del hongo. La cepa Fusarium oxysporum de propago en agar PDA bajo condiciones asépticas con el fin de mantener el cultivo puro en todo el proceso experimental.
32
4.3.2. Inoculación de microorganismo. 4.3.2.1.
Preparación del caldo nutritivo PDA (Agar papa dextrosa).
Formulación del medio de cultivo para hongos: Siguiendo la base de cultivos del laboratorio proveedor SCHARLAU sugiere que se suspenda 39 gramos de polvo (PDA) en 1 litro de agua destilada. Con esta información se realizan los cálculos necesarios para las cajas petri que se vallan a necesitar (en cada caja de Petri caben aproximadamente 25 ml agar). Adicionar 250 ml de agua destilada. 8,58 gramos de PDA Homogenizar mediante calor.
Fuente: Autor
Llevar a autoclave a una temperatura 121 ºC a 15 psi de presión.
Fuente: (David & López, 2015)
Figura 23. Preparación del medio de cultivo A continuación de describe el proceso de inoculación de Fusarium oxysporum. Fusarium oxysporum Asa previamente esterilizada Se toma una porción Se introduce el asa en caldo nutritivo Llevar Fuente: a la incubadora Autor a una temperatura de 25ºC, de3-4 días
Fuente: (David & López, 2015)
Figura 24. Inoculación de Fusarium oxysporum 33
4.3.2.2.
Método de difusión en agar. Difusión en Agar
Servir agar PDA en cada caja Petri
Adicionar a cada uno las concentraciones
0,5% 1%
1,5%
Dejar solidificar
Perforar pozos
Sembrar el hongo en los pozos
Incubar 1-2 semanas a 27°C
Medición del halo de inhibición
Fuente: (Duque, 2008)
Figura 25. Método de difusión en agar. 4.4.
Diseño experimental
El diseño experimental se realizó para evaluar el efecto de la temperatura y tiempo de secado, sobre el rendimiento del extracto obtenido de las hojas de la planta Piper cumanense Kunth.
34
4.4.1. Hipótesis del diseño experimental. Hipótesis nula La temperatura y tiempo de secado no afectan significativamente el rendimiento fitoquímica del extracto Piper cumanense Kunth. Hipótesis alternativa del diseño experimental La temperatura y tiempo de secado afectan significativamente el rendimiento fitoquímico del extracto Piper cumanense Kunth. Variables En el diseño experimental se tuvieron en cuenta las siguientes variables: Variables independientes: Temperatura de secado, tiempo de secado. Variables dependientes: Rendimiento del extracto Para estas variables se utiliza un Modelo factorial de 2k de la siguiente forma: Factor A: Tiempo de secado. a1= 4 Horas a2= 6 Horas Factor B: Temperatura de secado. b1= 35 °C b2= 45 °C A continuación, se describe el diseño de experimentos planteado:
35
Tabla 3. Modelo experimental la extracción de las hojas de la planta Piper cumanense Kunth por triplicado.
Temperatura (C)
Tiempo (H)
35C 4H35C 6H35C
4H 6H
45C 4H45C 6H45C
Fuente: Autor
Se efectuaron 4 tratamientos con dos niveles por tratamiento y tres repeticiones por nivel para un total de 12 ensayos, es decir, 12 mediciones de la variable respuesta (Rendimiento de la extracción). 4.4.2. Análisis estadístico El modelo estadístico utilizado para el diseño general de 2 factores es: Yijl =+ i +j+()i j + ijl Para ij l i = 1,2,....,a j = 1,2,….,b l = 1, 2…, n Dónde: Yij es la respuesta observada (Rendimiento de la extracción) cuando el factor A esta al i em, y el factor B esta al j em, es el efecto conjunto del total de las medias, i es el efecto i emnivel del factor fila A, j es el efecto del j em nivel factor columna B, () ij es el efecto de la interacción entre i y j y ijl es el componente aleatorio del error. Las hipótesis a probar se refieren a los efectos de los factores en las variables de respuesta Yij. Ho: C = Ci; Ho: H = Hj; Ho: CH =CH ij Ha: C Ci;
Ha: H Hj;
Ha: CH CH ij 36
Para el analisis de los resultados experimentales se efectuó un análisis de varianza (ANOVA) y en caso de no existir diferencias significativas entre las medias de los tratamientos se hará una prueba de rangos múltiples. Para lo anterior se empleará el programa Statgraphics.
37
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5.1.
Análisis de curvas de secado.
Se realizaron curvas de secado para diferentes temperaturas y tiempo de secado con el objetivo de verificar el punto de equilibrio de remoción de humedad del material para esto se determinó la fracción de humedad y posteriormente la humedad libre.
3,5
Humedad Libre (Gramos)
3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
‐0,5
6H35C
4H35C
Tiempo (Horas) 4H45C
6H45C
Fuente: Autor
Figura 26: Curvas de secado de las hojas Piper cumanense Kunth. En la Figura 26 se presentan las curvas de secado de las hojas de la planta Piper cumanense Kunth, para temperaturas de 35°C y 45°C. Donde se representa el cambio a través del tiempo, del peso del material vegetal. Como se puede observar luego de 1.5 horas de secado se consigue llegar al equilibrio de los tratamientos con temperatura de 45°C y a las 3 horas para el proceso de secado a 35°C. Los resultados aquí encontrados son similares a los descritos por (Gomez, 2007) para un quimiotipo de Lippia alba. Según este autor, se puede conseguir el equilibrio de secado para partes aéreas de la planta en condiciones de secado de entre 3 a 4 horas y temperaturas de entre 35°C a 50°C 38
5.2.
Análisis de rendimientos de los extractos etanólicos.
Después del pretratamiento que se realizó a las muestras en diferentes temperaturas y tiempos de secado, se realizó la extracción por triplicado utilizando el método soxhlet efectuando una extracción inicial a una muestra sin secado como valor de control. Posterior a la extracción se destilo el solvente y obtuvo un extracto etanólico que se usó en la determinación del rendimiento.
%
∗ 100 E.C.:1
En la figura 27 se puede observar la relación entre el rendimiento obtenido del extracto Vs tratamiento
60 50
% DEL EXTRACTO
40 30 20 10 0 6H35C
4H35C
4H45C
6H45C
TRATAMIENTO
Fuente: Autor
Figura 27. Rendimientos del extracto Vs tratamiento. 39
BLANCO
De la figura 27 se puede observar que los tratamientos efectuados a una temperatura de 45°C presentaron un mayor rendimiento de extracto respeto de los evaluados a la temperatura de 35°C y la muestra control. A continuación, se presentan el gráfico de análisis de medias. En esta figura 28 se aplica un procedimiento de comparación múltiple para determinar cuáles medias son significativamente diferentes de otras, como se puede observar al igual que en la figura anterior existe una diferencia en el rendimiento 4H45C pero no es una diferencia significativa. Tanto en el ANOVA como en la prueba de múltiples rangos se pudo evidenciar que no existen diferencias significativas entre los tratamientos con un nivel de confianza del 95% (ver Anexo A). Con resultados de rendimientos, el análisis ANOVA y sabiendo que la diferencia en los rendimientos no es significativa se puede utilizar el extracto sin realizar un secado lo que se puede ver reflejado en una disminución de costos si se pretende realizar una producción industrial.
Fuente: Statgraphics. Figura 28. Análisis estadístico de medias.
40
5.3.
Análisis Fisicoquímico
Con relación a la caracterización del extracto etanólico de las hojas de Piper cumanense Kunth en sus propiedades fisicoquímicas se determinó que el índice de refracción para el extracto sin pretratamiento fue de 1,376 a 19ºC, (Muñoz, 2014) reporta un índice de refracción de Piper peltatum con un valor de 1,372 presentando valores similares a nuestros resultados. Además, teniendo en cuenta que el índice de refracción es mayor en comparación con el del agua 1.333, puede presentar sustancias disueltas. Por otra parte, se evaluó la densidad del extracto sin pretratamiento siendo este de 0,8623 g/ml a 19 ºC, la densidad reportada por (Muñoz, 2014) fue de 0,8740 g/ml para el extracto etanólico Piper peltatum teniendo resultados en rangos similares a la densidad del extracto obtenido. Comparando la densidad del solvente empleado para la extracción siendo de 0.789g/ml indica que en el extracto existen sustancias en disolución por tener una densidad mayor. 5.4.
Análisis fitoquímico preliminar de los extractos Piper cumanense Kunth.
De acuerdo a la metodología planteada, se realizaron diferentes pruebas para determinar la presencia de metabolitos de interés industrial en el extracto etanólico de las hojas de Piper cumanense Kunth en la tabla 4 se observa los resultados cualitativos. Los extractos etanólicos que se obtuvieron presentaron gran coloración de clorofila por lo que se realizó una dilución a cada muestra de 110 para evitar la interferencia por el pigmento fotosintético y realizar las pruebas satisfactoriamente.
41
Tabla 4. Análisis químico cualitativo realizado a los diferentes tratamientos de Piper cumanense Kunth. Compuestos Flavonoides Quinonas Saponinas Carotenoides Taninos Alcaloides
6H35C
4H35C
6H45C
4H45C
Control
+++ + -+ ++ -
+++ + -+ ++ -
++++ + -+ ++ -
+++ + -+ ++ -
+++ + -+ ++ -
+ Presencia del metabolito en el extracto evaluado por diferentes pruebas. - Ausencia del metabolito en el extracto Fuente: Autor
5.4.1. Identificación de flavonoides en los extractos. Para determinar la presencia de flavonoides en el extracto se realizaron cuatro pruebas, mencionadas en la metodología. La prueba Shinoda dio un resultado positivo para los cuatro tratamientos y la muestra de contraste en la figura 29 se puede observar las evidencias del análisis. Como lo menciona (Bilbao, 1997) los flavonoides con anillo de gama-benzopirona reaccionan en presencia de ácido clorhídrico y magnesio dando tonalidades entre rosado, anaranjado o fresa. Los resultados para todos los tratamientos fueron muy homogéneos por lo que se determina que, sin importar el tiempo de secado y la temperatura, existe presencia de compuestos tipo flavonoide en el extracto. Los resultados obtenidos concuerdan con (Arroyo et. al, 2012) donde realizando la prueba de shinoda obtuvo una presencia importante de flavonoides en el extracto etanólico de Piper aduncum.
42
4H45C
Fuente: Autor
CONTROL
Figura 29. Análisis de tratamientos por la prueba shinoda. Respecto de la prueba de Rosenhein para la detección de flavonoides y como se evidencia en la figura 30 en el tratamiento 6H45C se puede observar un cambio en la coloración desde un color verde a uno carmesí dando positivo para flavonoides por lo que trabajando en estas condiciones según la prueba permite evidenciar este tipo de compuestos. Así mismo los flavonoides con esqueleto de flavilo dan positiva en esta prueba, por tener un anillo C y un sistema dieno conjugado.
4H45C
CONTROL
43
Fuente: Autor
Figura 30. Análisis de tratamientos por la prueba Rosenhein. En la figura 31 se puede observar los resultados para la detección de leucoantocianidinas este tipo de compuestos son pigmentos que se hallan en las células vegetales y otorgan colores rojos, purpura o azul a las hojas, flores y frutos. Aunque los resultados fueron negativos al identificar antocianinas esta prueba también dio resultados positivos para catequinas para lo cual se detectó un cambio en la coloración a café-amarillo.
Prueba - Muestra
Muestra-prueba
Prueba - Muestra
4H45C
CONTROL
Fuente: Autor
Figura 31. Análisis de tratamientos por la prueba de leucoantocianidinas.
La última prueba que se efectuó para la identificación de flavonoides fue la reacción con ácido sulfúrico concentrado. En la figura 32 se puede observar un cambio a una coloración rojo guinda dando positivo para chalconas y auroras y negativo para flavonas y flavonoles (cambio en el color a un amarillo intenso).
44
4H45C
CONTROL
Fuente: Autor
Figura 32. Análisis de tratamientos por reacción con ácido sulfúrico. Según (Beltran, 2013) los flavonoides son compuestos que se caracterizan por poseer un esqueleto de tipo C6C3C6 y en el género Piper se ha encontrado la presencia del tipo chalconas, flavanonas y dihidrochalconas además de tener un grande potencial en la actividad antifungica y anti bactericida. 5.4.2. Identificación de Quinonas en los extractos. Para la identificación de quinonas en los tratamientos se efectuó la prueba realizada por (Bilbao , 1997) donde se estudia el comportamiento ante un ácido y un donador de electrones y su respuesta por el cambio de color. En la tabla 4 se observa los resultados obtenidos, se evidencia que los tratamientos 4H45C y 4H35C dan positivo para quinonas presentando un color rosado claro y un color rojo respectivamente que tal como se observa en la figura 33 además los tratamientos 6H35C, 6H45C y el contraste dan positivo para antraquinonas que tienden a dar colores amarillos en presencia de ácidos. Lo anterior concuerda con la investigación realizada por (Lizarazo, 2013) donde se obtuvieron cambios en la 45
coloración del extracto a tonos amarillos reportando la presencia de quinonas en la especie Piper eriopodon.
4H45C
CONTROL
Fuente: Autor
Figura 33. Análisis de tratamientos por reacción ante un ácido y un donador de electrones. 5.4.3. Identificación de Saponinas en los extractos.
Fuente: Autor
Figura 34. Determinación de saponinas por el método de espuma.
46
Para la determinación de saponinas en los tratamientos se realizó la prueba de espuma, para lo cual se emplearon soluciones acidas y básicas de pH 1 y 13 respectivamente (Bilbao , 1997), todos los tratamientos dieron negativos por no generar espuma al estar en contacto con estas soluciones. Lo anterior concuerda con estudios previos (Beltran, 2013) donde no se reporta la presencia de saponinas en la especie Piper imperiale. 5.4.4. Identificación de carotenoides en los extractos
Como se evidencia en la tabla 4 y figura 35 la reacción de reconocimiento de carotenoides dio positiva para todos los tratamientos, la prueba consiste en hacer reaccionar el extracto en una solución de ácido sulfúrico al 85%. La prueba da positiva por la generación de una zona de separación de tono azul.
4H45C
CONTROL
Fuente: Autor
Figura 35. Análisis de tratamientos para la identificación de carotenoides.
47
5.4.5. Identificación de taninos en los extractos. En la identificación de taninos se llevó por medio de dos pruebas: Prueba de acetato de plomo y de cloruro férrico. Para la prueba de acetato de plomo como se evidencia en la figura 36 se obtuvo una turbidez y un precipitado amarillo, indicando de esta forma la presencia de taninos (Bilbao, 1997).
4H45C
CONTROL
Fuente: Autor Figura 36. Análisis de tratamientos para la identificación de taninos con acetato de plomo. En la prueba de cloruro férrico se obtuvo coloración verde como se evidencia en la figura 37, lo cual indica que el extracto de las hojas de Piper cumanense Kunth presenta taninos derivados del ácido protocatequico.
48
4H45C
CONTROL
Fuente: Autor
Figura 37. Análisis de tratamientos para reconocimiento de taninos por reacción con cloruro férrico. En estudios previos (Plazas, 2001), demuestra que el cloruro férrico permite identificar la presencia de grupos fenólicos por el desarrollo de coloraciones verdes o azules. El grupo fenol es característico de los taninos, pero también está presente en diferentes tipos de metabolitos secundarios como flavonoides, cumarinas, quinonas, lignanos entre otros. Como presenta en sus resultados (David & Lopez, 2015) las coloraciones azules y verdes obtenidas indican presencia de compuestos fenólicos.
49
5.5.
Determinación del contenido de clorofilas Tabla 5. Resultados de determinación de clorofila y carotenoides. /
,
/
, /
, /
,
Fuente: Autor
Los resultados de la determinación de clorofila se muestran en la tabla 5 los cuales se efectuaron (ver Anexo B) por duplicado de la lectura de absorbancia de las hojas de la planta Piper cumanense Kunth. Los resultados que se obtuvieron son muy similares a los determinados por (Ventorim, 2014) utilizando el mismo procedimiento y lecturas de absorbancia dicho estudio reporto que en las hojas de Piper adumcum los resultados para la clorofila a fueron de (1.780 µg/ml), para clorofila b (1.0 µg/ml) y para chla+b (2.78 µg/ml) en esta investigación se evaluó el nivel de radiación al cual fue sometida la planta con respecto a su composición fitoquímica y a sus niveles de clorofila, reportando que el mayor nivel de clorofila se encontraba con un 70% de radiación. El contenido de carotenoides reportado por (Ventorim, 2014) es de 0.76 µg/ml mayor en comparación con el resultado de esta investigación 0.514 µg/ml. La comparación de resultados en el contenido de clorofila y carotenoides demuestra que las plantas del genero Piper cambian sus características fotosintéticas y contenidos de clorofila por el tiempo de madurez y su exposición a la radiación. (Lopez et. al, 2010).
50
5.6.
Actividad del Fusarium oxysporum frente al extracto Piper cumanense Kunth.
Se realizaron pruebas de la actividad antifungica de los extractos de Piper cumanense Kunth sobre el hongo Fusarium oxysporum. En la figura 38 se puede observar el efecto de la concentración del extracto obtenido sin pretratamiento sobre el halo de crecimiento del hongo. Se realizó la prueba de actividad antifungica con el extracto sin pretratamiento debido a que las diferencias en rendimiento y composición de compuestos no son altamente significativas y se puede trabajar de esta manera reduciendo así los costos.
Piper 0.5%
Sin Extracto
Piper 1%
Piper 1.5%
Fuente: Autor
Figura 38. Comportamiento del hongo Fusarium oxysporum frente al extracto de las hojas de Piper cumanense Kunth. Se determinó el % de inhibición con la siguiente ecuación:
51
%
∗
Como se puede observar de la figura 39 el mayor efecto en el crecimiento del hongo se logró por la aplicación de concentraciones del extracto de entre 1 a 1.5% con un porcentaje de inhibición de un 53% en varias concentraciones. El porcentaje de inhibición a 0.5% de extracto fue menor con un 27 %.
60
% DE INHIBICION
50 40 30 20 10 0 0,5
1
1,5
% DE EXTRACTO
Fuente: Autor
Figura 39. Porcentaje de inhibición del hongo Fusarium oxysporum frente a la concentración del extracto. Lo anterior corrobora lo encontrado en estudios recientes por (Mendoza , 2015) en donde el metabolito secundario llamado ácido cumanensico encontrado en las hojas de la planta Piper cumanense Kunth presento un efecto de inhibición en el crecimiento del hongo Fusarium oxysporum. También (Avila et. al, 2011) evidenciaron una importante actividad antifungica de flavonoides aislados de las hojas de Piper septuplinervium sobre el microorganismo Fusarium oxysporum. Un estudio realizado por (Neves, 2014) evaluó la actividad antifúngica in vitro de aceites esenciales de especies de Piper frente a Fusarium sp. La inhibición del 52
crecimiento en una concentración de 5-1 mg.mL arrojo diferentes resultados, para Piper aduncum fue menor (20,3%) y Piper krukoffii (31,4%); moderada para Piper calloso (55,7%) y Piper marginado (70,3%) y una alta inhibición para Piper divaricatum (93,3%). (Correa et.al, 2015), utilizaron cinco plantas del genero Piper (Piper eriopodon, Piper umbellatum L, Piper pesaresanum C, Piper crassinervium Kunth y Piper glanduligerum) obtenidas en Colombia con el objetivo de evaluar su actividad fúngica frente a Fusarium oxysporum donde se obtuvo una reducción promedio de 15% a un 44 % en el crecimiento del hongo antes mencionado, los resultados de este estudio señalaron un mayor porcentaje de inhibición para Piper pesaresanum en un 44 % y Piper eriopodon en un 33%. Estos resultados demostraron que el género Piper es promisorio para el ataque de este tipo de patógeno. A demás de demostrar que Piper cumanense Kunth tiene un porcentaje importante de inhibición. Recientes avances han demostrado que Fusarium Oxysporum es un hongo que ha dado resultados positivos a controles donde se ha aplicado productos de origen botánico. Extractos acuosos de diferentes plantas han exhibido algunos niveles de actividad antifungica (Ogechi & Agbenin, 2006). Los metabolitos secundarios están presentes como mezclas de compuestos y los hongos pueden ser afectados por compuestos individuales o por mezclas de determinadas concentraciones presentes en diferentes extractos de plantas (Garcia, 2001).
53
6. CONCLUSIONES El pre tratamiento del material filogenético permitió concluir que se puede alcanzar un equilibrio en el secado a partir de 1.5 a 3 horas por lo que no es necesario exponer las muestras a unos tiempos superiores debido a que la perdida de humedad a partir de este tiempo no es significativa y en el caso de escalar el proceso a nivel industrial se incrementarían los costos de servicios de proceso. El diseño experimental permitió confirmar la hipótesis nula teniendo en cuenta que la temperatura y tiempo de secado no afectan significativamente el rendimiento del extracto Piper cumanense Kunth. Con respecto a los análisis fitoquímicos cualitativos de los extractos se concluye que el tratamiento que permitió detectar la mayor presencia de compuestos de interés industrial fue el de 6H45C. Respecto del rendimiento de extracción se pudo evaluar que la temperatura de 45°C permitió obtener los más altos porcentajes, mejorando la acción del solvente en la extracción.
El extracto de las hojas Piper cumanense Kunth se puede utilizar sin secado del material vegetal debido a que su composición fitoquímica y rendimiento no tienen una variación relevante, siendo este un beneficio a la hora de una producción industrial debido a que se disminuirán los costos energéticos en el proceso. El extracto obtenido de la planta Piper cumanense Kunth tiene un efecto positivo en el control de crecimiento del hongo Fusarium oxysporum en concentraciones de 1 y 1.5% con un porcentaje de inhibición de 53%.
54
7. RECOMENDACIONES. Evaluar la composición a diferentes temperaturas y tiempo de secado con técnicas cromatografías y patrones propios del género. Aislar compuestos de interés con diferentes técnicas para ser empleados de forma más efectiva en el ataque de microorganismos. Evaluar el potencial antioxidante de las plantas Piper cumanense Kunth. Se deben continuar estudios enfocados en el manejo integrado de enfermedades, ya que los resultados obtenidos y la bibliografía demuestran que la planta Piper cumanense Kunth es promisoria para este campo.
55
8. REFERENCIAS
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Tese apresentada para posgraduacao em agronomia. Universidade federal de lavras, Lavras.
62
9. ANEXOS
Anexo A. Análisis Estadístico, Rendimiento - Tiempo Comparación de Varias Muestras (Blanco) Tabla 6. Tabla Anova Fuente
Suma de Gl Cuadrados 631.555 3 1343.18 8 1974.74 11
Entre grupos Intra grupos Total (Corr.)
Cuadrado Razón-F Valor-P Medio 210.518 1.25 0.3532 167.898
Fuente. Statgraphics
La tabla ANOVA descompone la varianza de los datos en dos componentes: un componente entre-grupos y un componente dentro-de-grupos. La razón-F, que en este caso es igual a 1.25385, es el cociente entre el estimado entre-grupos y el estimado dentro-de-grupos. Puesto que el valor-P de la razón-F es mayor o igual que 0.05, no existe una diferencia estadísticamente significativa entre las medias de las 4 variables con un nivel del 95.0% de confianza. Tabla 7. Pruebas de múltiples rangos Método: 95.0 porcentaje LSD
6H35C 4H35C 6H45C 4H45C
Casos
Media
3 3 3 3
35.48 37.2167 44.8267 53.83
Grupos Homogéneos X X X X
Fuente. Statgraphics
Esta tabla aplica un procedimiento de comparación múltiple para determinar cuáles medias son significativamente diferentes de otras. La mitad inferior de la salida 63
muestra las diferencias estimadas entre cada par de medias. No hay diferencias estadísticamente significativas entre cualquier par de medias, con un nivel del 95.0% de confianza. El método empleado actualmente para discriminar entre las medias es el procedimiento de diferencia mínima significativa (LSD) de Fisher. Con este método hay un riesgo del 5.0% al decir que cada par de medias es significativamente diferente, cuando la diferencia real es igual a 0. Anexo B.
Determinación de clorofila. Tabla 8. Lectura de Absorbancia para las hojas de Piper cumanense Kunth. Masa (g) Absorbancia Promedio
A663 nm 0,141 0,200 0,170
A646 nm 0,055 0,138 0,096
A470 nm 0,160 0,255 0,207
Fuente: Autor
En la determinación de clorofila a y b, así como carotenoides se utilizaron las siguientes expresiones (Lichtenthaler, 1987)
/
12,25 663
2,79 646 EC: .2
/
12,50 646
5,10 663 EC: .3
7,15 663
EC: .4
18,71 646
/
,
,
/
12,25 0,170
2,79 0,096
/
21,50 0,096 7,15 0,170
5,10 0.170 1,197 18,71 0,096 3,011
/
64
1,814
EC: .5
1000 0,207 Anexo C.
1,82 1,814
85,02 1,197
198
0,514
Fotográficas de ensayos experimentales
Fuente: Autor
Figura 40.Muestra después de secado.
Fuente: Autor
Figura 41.Indice de refracción extracto Piper cumanense Kunth.
65
Fuente: Autor
Figura 42. ObtenciĂłn de los extractos por mĂŠtodo soxhlet.
Fuente: Autor
Figura 43. Siembra de hongo Fusarium oxysporum.
66