Tesis0296ia

HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE QUESO CAMPESINO Y DOBLE CREMA PARA LA PRODUCCIÓN DE AROMAS LÁCTEOS

DAVID FRANCISCO BERNAL RODRÍGUEZ

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA AGRARIA DE COLOMBIA (UNIAGRARIA) FACULTAD DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS BOGOTÁ D.C. 2014

HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE QUESO CAMPESINO Y DOBLE CREMA PARA LA PRODUCCIÓN DE AROMAS LÁCTEOS

DAVID FRANCISCO BERNAL RODRÍGUEZ

Tesis de grado para optar al título de Ingeniero de Alimentos

Directora Gloria Helena González Blair Ingeniera Química

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA AGRARIA DE COLOMBIA (UNIAGRARIA) FACULTAD DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS BOGOTÁ D.C. 2014

Nota de aceptaci贸n:

Firma del presidente del Jurado

Firma del Jurado

Firma del Jurado

Bogot谩, 26 de Junio de 2014

Dedicatoria

A Dios, a la Virgen MarĂ­a, a mis padres, a mi hermano y a toda mi familia.

Agradecimientos

A Dios por ser la guía y el motor que impulsa mis acciones, por haberme dado la vida, una familia hermosa y por todos los dones que me ha dado, entre ellos, la oportunidad de estudiar.

A la Virgen, por tanto cariño, guía, protección y amor.

A mis padres Jairo Augusto y María Lucía, por ser los padres que cualquier hijo quiere tener, por su amor, apoyo y consejo en todos los momentos de mi vida.

A mi hermano Juan Alejandro, por siempre escucharme, apoyarme y animarme a ser mejor.

A mi novia Laura, por devolverme la alegría y mostrarme que el amor verdadero espera.

A mis tías Cecilia e Isabel, mis primos Javier y Andrés, mis abuelos Eudoro, Hilda y María, por su apoyo y amor incondicional.

A toda mi familia, gracias por siempre confiar y creer tanto en mi.

A todos mis profesores, especialmente a la profesora Gloria González, por tenerme tanta paciencia, confianza e impulsarme a mejorar siempre.

A mis amigos Andrés, Andrea, Lizete, Paola, Johana, Oscar, Michael, Néstor, Luisa, gracias por todos los momentos que hemos vivido juntos y que ojalá Dios nos regale muchos más.

A Oscar Ramírez por su apoyo incondicional, tanto académico como personal durante todo este proceso, por su confianza, consejo y amistad.

CONTENIDO

Pág.

INTRODUCCIÓN ........................................................................................................... 1 OBJETIVOS .................................................................................................................. 4 OBJETIVO GENERAL .............................................................................................................4 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................................4 1. MARCO TEÓRICO ................................................................................................... 5 1.1 AROMAS ...................................................................................................................5 1.1.1 Definición ...........................................................................................................5 1.1.2 Generalidades e historia ....................................................................................5 1.1.3 Clasificación ........................................................................................................6 1.1.3.1 De acuerdo con las sensaciones generales ..................................................6 1.1.3.2 De acuerdo con la fuente alimentaria .........................................................8 1.1.3.3 Según su origen ............................................................................................8 1.1.4 Composición de los aromas ...............................................................................9 1.1.4.1 Esencias líquidas ..........................................................................................9 1.1.4.2 Aromas en polvo ........................................................................................10 1.1.4.2 Especias y condimentos .............................................................................10 1.1.4.2 Oleoresinas y aceites esenciales ................................................................11 1.1.4.2 Condimentos solubles ................................................................................11 1.1.4.2 Compuestos puros aislados .......................................................................11 1.1.4.2 Saborizantes procesados o de reacción .....................................................12 1.1.4.2 Acentuadores de sabor ..............................................................................12 1.1.5 Materias primas usadas en aromas .................................................................12

1.1.6 Aplicaciones ......................................................................................................14 1.2 HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA ........................................................................................15 1.2.1 Hidrólisis enzimática de proteínas ...................................................................15 1.2.1.1 Etapas de la hidrólisis enzimática ..............................................................17 1.2.1.2 Condiciones de la hidrólisis ........................................................................19 1.2.1.3 Grado de hidrólisis .....................................................................................19 1.2.1.4 Determinación de los grupos α amino libres ............................................20 1.2.1.5 Determinación de nitrógeno soluble .........................................................21 1.2.1.6 Determinación de los protones liberados mediante potenciometría .......21 1.2.2 Hidrólisis enzimática de lípidos ........................................................................22 1.2.1.1 Grado de hidrólisis .....................................................................................23 1.3 QUESOS MODIFICADOS ENZIMÁTICAMENTE (EMC) .............................................24 1.3.1 Generalidades ..................................................................................................24 1.3.2 Producción de EMC .........................................................................................25 2. MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................... 30 2.1 MATERIAS PRIMAS .................................................................................................30 2.2 EQUIPOS E INSTALACIONES ....................................................................................30 2.3 ENSAYOS PRELIMINARES ........................................................................................32 2.4 ENSAYOS FINALES ...................................................................................................35 2.4.1 Índice de Acidez ...............................................................................................36 2.4.2 Humedad .........................................................................................................38 2.4.3 pH .....................................................................................................................39 2.4.4 Análisis sensorial ..............................................................................................39 2.4.5 Diseño experimental ........................................................................................40

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................... 42 3.1 ENSAYOS PRELIMINARES ........................................................................................42 3.2 ENSAYOS FINALES ...................................................................................................43 3.3 ÍNDICE DE ACIDEZ ...................................................................................................44 3.4 HUMEDAD ..............................................................................................................48 3.5 pH ...........................................................................................................................50 3.6 ANÁLISIS SENSORIAL ..............................................................................................57 4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ................................................................ 64 BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................................................65 ANEXOS ................................................................................................................................70

LISTA DE TABLAS Pág.

TABLA 1. Clasificación de los aromas por sensaciones generales ..........................................7 TABLA 2. Clasificación de los aromas de los alimentos ..........................................................8 TABLA 3. Algunas de las proteasas disponibles comercialmente en grado alimenticio ......16 TABLA 4. Algunas de las lipasas disponibles comercialmente producidas por la empresa Nova Nordisk .........................................................................................................................23 TABLA 5. Características de equipos utilizados ....................................................................31 TABLA 6. Formulación para ensayos preliminares ..............................................................33 TABLA 7. Nueva formulación para ensayos finales con 40% de sustrato inicial ..................34 TABLA 8. Nueva formulación para ensayos finales con 60% de sustrato inicial ..................35 TABLA 9. Cantidad de materia prima establecida para los ensayos finales .........................36 TABLA 10. Formulación usada para la hidrólisis de los cinco ensayos preliminares ............42 TABLA 11. Índice de Acidez (mgKOH/g) ................................................................................45 TABLA 12. Porcentaje de ácidos grasos libres ......................................................................45 TABLA 13. ANOVA para índice de acidez ..............................................................................48 TABLA 14. Porcentaje de humedad ......................................................................................49 TABLA 15. ANOVA para porcentaje de humedad .................................................................51 TABLA 16. Valores de pH ......................................................................................................52 TABLA 17. ANOVA para pH ...................................................................................................53 TABLA 18. Valores de intensidad de cada muestra de acuerdo a la nota de sabor .............57 TABLA 19. Comentarios de los panelistas.............................................................................61

LISTA DE FIGURAS Pág.

FIGURA 1. Consumo global de sabores de acuerdo con la categoría del producto en 2009 .2 FIGURA 2. Mecanismo catalítico de una proteasa ...............................................................17 FIGURA 3. Teoría de Linderstrom - Lang ..............................................................................18 FIGURA 4. Proceso de una etapa para la obtención de EMC ...............................................27 FIGURA 5. Proceso de dos etapas para la obtención de EMC ..............................................28 FIGURA 6. Equipos utilizados durante el desarrollo del proyecto.......................................32 FIGURA 7. Diagrama de flujo para los ensayos preliminares ...............................................33 FIGURA 8. Medición del índice de acidez para determinación de ácidos grasos libres .......37 FIGURA 9. Prueba de preferencia .........................................................................................40 FIGURA 10. Proceso de hidrólisis para los ensayos finales...................................................43 FIGURA 11. Producto final EMC obtenido ............................................................................46 FIGURA 12. Índice de acidez (mgKOH/g) ..............................................................................46 FIGURA 13. Porcentaje de ácidos grasos libres ....................................................................47 FIGURA 14. Porcentaje de humedad ....................................................................................49 FIGURA 15. pH del producto final .........................................................................................52 FIGURA 16. Correlación humedad-acidez.............................................................................54 FIGURA 17. Correlación humedad-pH ..................................................................................55 FIGURA 18. Correlación acidez-pH .......................................................................................56 FIGURA 19. Intensidad de las muestras de acuerdo a las notas de sabor ...........................58 FIGURA 20. Intensidad de las dos mejores muestras de acuerdo a las notas de sabor .......59

FIGURA 21. Puntaje sensorial para el sabor de queso Gouda ..............................................59 FIGURA 22. Extruidos con los sazonadores aplicados (10% EMC) .......................................60 FIGURA 23. Extruido con sazonador aplicado ......................................................................61 FIGURA 24. Porcentaje de preferencia de las muestras .......................................................63 FIGURA 25. Promedio de las calificaciones de preferencia de las muestras .......................64

LISTA DE ANEXOS Pág.

ANEXO A. Fichas técnicas de las enzimas usadas en el proyecto.........................................71

INTRODUCCIÓN La industria global de sabores puede ser caracterizada como altamente tecnificada, especializada e innovadora. Esta industria es muy competitiva y concentrada, comparada con otras categorías de productos dentro del mercado de alimentos y bebidas. Las ventas alcanzadas por la industria de aromas y fragancias fueron de US $20,3 billones en 2009 (Gleasom-Allured, 2010), de las cuales la mayor parte provienen del sector de alimentos.

El mercado mundial de sabores creció hasta casi 1,2 millones de toneladas en 2009 y se espera que crezca a una tasa anual de crecimiento (CAGR) por sus siglas en inglés, de 2% anual hasta el año 2014. Norte América, Europa y Asia, cuentan con aproximadamente el 80% de las ventas globales (Madden, 2010).

De acuerdo con datos de uno de los líderes de la industria, Givaudan, el futuro crecimiento de este campo vendrá de mercados emergentes de los países del grupo BRICMIST (Brasil, Rusia, India, China, México, Indonesia, Sur África y Turquía) (Gleasom-Allured, 2010).

En total, el sector de bebidas es el dominador del mercado mundial de sabores, teniendo aproximadamente el 61% del total del volumen en 2009, mientras que los alimentos empacados representan el 31% y productos para el cuidado oral el 3%. Las bebidas permanecen como uno de los sectores con mayores posibilidades de crecimiento para los sabores. El consumo de sabores a través de bebidas de frutas saborizadas, se espera que incremente alrededor de un 75% para el período comprendido entre los años 2009-2014 (Madden, 2010).

Hidrólisis enzimática de queso campesino y doble crema para la producción de aromas lácteos

Figura 1.

Consumo global de sabores de acuerdo con la categoría del producto en 2009 (% de participación en volumen)

Refrescos Bebidas Alcohólicas Productos lácteos Alimentos secos procesados Tabaco Confitería Productos de panadería Higiene Oral Helados Bebidas calientes Otros

Fuente: (Namiesnowski, K. 2010.)

En los últimos años, los productos perecederos, sobre todo los lácteos, se han vuelto muy importantes para la industria de sabores, con un estimado adicional de 27000 toneladas de sabores que van a ser consumidos por este tipo de productos en 2014, en comparación al año 2009 (Madden, 2010). Sabores exóticos, texturas y aditivos únicos son estrategias usadas para atraer la atención de los consumidores, sobre todo hoy en día debido a la recesión económica mundial, la cual ha causado que las personas busquen experiencias únicas en los alimentos que se consumen a diario, debido a que su costo es más bajo.

Los sabores que se le agregan como aditivo

a los diferentes productos

alimenticios conllevan consigo varios beneficios para los productores, los consumidores y el alimento en sí.

Las siguientes son algunas ventajas de usar sabores como aditivos (Ramírez, 2009):

2

David Francisco Bernal Rodríguez



Caracterización de un producto: Confieren valor agregado al acentuar o

modificar su sabor. 

Estandarización de un producto: Confiere al producto características que

lo diferencian de productos similares dentro del mercado. 

Mejoramiento de un producto: Alarga la vida útil del mismo, optimiza su

textura o color. 

Costos: Reduce los gastos durante la producción al no tener que agregar

otro tipo de aditivos para resaltar el sabor o color. 

Mercadeo: Los sabores se pueden aplicar a una gran variedad de

productos, lo que hace que sean fácilmente comercializados dentro de las diferentes industrias productoras de alimentos o bebidas.

Como se puede observar los sabores tienen un amplio mercado a nivel mundial y varias ventajas al usarlos, lo cual les confiere un gran campo de acción dentro del emergente mercado latinoamericano de este tipo. Debido a lo anterior, el presente trabajo de grado nace de la oportunidad que hay actualmente en el mercado local, para la inclusión de nuevos aromas en un mercado emergente como el de Colombia y llegar a convertirse en una muy buena opción para su aplicación por parte de las empresas del sector.

El estudio evalúa la producción de aromas lácteos tipo EMC (Queso modificado enzimáticamente) usando la hidrólisis enzimática de queso campesino y doble crema con dos tipos diferentes de enzima (proteasa y lipasa) para determinar cuál de éstas es la más apropiada para su producción.

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Hidrólisis enzimática de queso campesino y doble crema para la producción de aromas lácteos

Consecuentemente los objetivos del presente estudio son:

OBJETIVO GENERAL Hidrolizar enzimáticamente queso campesino y doble crema para la producción de aromas lácteos.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS 

Determinar, entre la proteasa y una combinación de proteasa/lipasa y, de acuerdo con las condiciones de la hidrólisis y las características del aroma final, cuál es la mejor opción para su uso en la misma.



Evaluar sensorialmente el aroma obtenido para validar la aceptación de sus características, aplicado en un producto final tipo snack.

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David Francisco Bernal Rodríguez

1. MARCO TEÓRICO

1.1

AROMAS

1.1.1

Definición

El aroma se puede referir a una percepción biológica, pues es la sensación producida por un alimento tomado por la boca, o se puede referir a una característica del alimento que se ha percibido. Este atributo es el agregado de las propiedades del alimento responsable de la sensación de aroma. Es percibido principalmente por los receptores de la nariz y por los receptores del gusto de la boca. Sin embargo, los descriptores como caliente, picante, ardiente y cortante, también se aplican a las sensaciones recibidas por los receptores generales del dolor, táctiles y de temperatura existentes en la boca, la nariz y los ojos.(Zuidam N; Heinrich E.; 2010)

1.1.2

Generalidades e historia

El uso de saborizantes para mejorar el gusto de los alimentos, es tan antiguo como la historia del ser humano. Algunas cosas como la sal, cítricos, grasas, miel, hierbas, humo y otros elementos que aportan valores significativos de sabor a los alimentos, ya eran conocidos por las civilizaciones primitivas.

Algunos no solo conferían sabor sino que transmitían otros conceptos, como culto religioso, medicina, estatus social, riqueza, belleza, etc.

Hubo una época en que las especias tenían un valor superior al oro y por ellas se crearon y destruyeron alianzas y reinos, se encontraron nuevas rutas comerciales y se descubrieron nuevos mundos. Hacia el final del siglo XIX e inicio del Siglo

XX se inició la identificación de las estructuras químicas

responsables por el aroma de los alimentos y no fue sino hasta el año 1874, que

se dedujo la fórmula de la Vainillina y se encontró la forma de 5

Hidrólisis enzimática de queso campesino y doble crema para la producción de aromas lácteos

sintetizarla a partir de la savia de las coníferas, siendo éste el descubrimiento precursor para la extracción de compuestos utilizados en la elaboración de sabores. (Ramírez, O. 2009.)

Hoy día, el gusto particular de cada región es parte importante de la cultura de los pueblos. Los alimentos industrializados pertenecen actualmente a los hábitos de consumo tanto de adultos como de jóvenes y niños y el sabor es parte determinante en la aceptación y calidad de estos productos. Los saborizantes

aportan

valor

agregado

a

los

productos

alimenticios,

posibilidades de nuevos desarrollos, placer, mejor calidad de vida, preservan la naturaleza y la salud y confieren calidad estandarizada. (Ramírez, O. 2009.)

1.1.3

Clasificación

1.1.3.1 De acuerdo con las sensaciones generales

Hay varias formas de clasificar los aromas, una de ellas, es de acuerdo con las sensaciones generales que el individuo experimenta cuando come diferentes alimentos.

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David Francisco Bernal Rodríguez

Tabla 1.

Clasificación de los aromas por sensaciones generales PARTE DEL CUERPO

TIPO DE AROMA

DESCRIPTOR Ácido Verde Floral Tostado Madera Azufre Frío Salado Dulce Amargo Acido Umami

Nariz

Olor

Lengua

Sabor

Boca

Trigeminal

1

Astringente Picante Frío

Fuente: (Zuidam N; Heinrich E.; 2010)

El aroma se debe a tres sensaciones diferentes: el gusto, trigeminal y aroma.

Las sensaciones gustativas se dividen en cuatro categorías principales: salina, dulce, ácida y amarga. Sin embargo, algunos científicos japoneses también incluyen

una

quinta

categoría

denominada

umami

que

puede

estar

representada por el sabor del glutamato. Las sensaciones trigeminales proporcionan los descriptores de astringencia, pungencia y frío. Tanto las sensaciones gustativas como las trigeminales ocurren con el contacto del alimento en la boca, pues la mayoría de las sustancias que producen estos aromas son polares y solubles en el agua y no volátiles. Para que ocurra una sensación aromática del compuesto correspondiente tiene que ser lo suficientemente volátil para que se pueda detectar a distancia. La interacción física entre el compuesto volátil y el receptor correspondiente ocurre en las vías nasales. Aquellas moléculas que alcanzan los receptores olfatorios bien por la vía nasal u oral desencadenan las sensaciones olorosas. (Baylos M.; 2010.)

Trigeminal o trigémino: También conocido como quinto par craneal o V par, es un nervio craneal mixto cuya función es transmitir diferentes impulsos sensitivos, faciales y de la cabeza, hacia el cerebro.

1

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Hidrólisis enzimática de queso campesino y doble crema para la producción de aromas lácteos

1.1.3.2

De acuerdo con la fuente alimentaria

Los aromas de los alimentos ordinariamente se clasifican de acuerdo con la fuente alimentaria en la que normalmente se detectan.

Tabla 2.

Clasificación de los aromas de los alimentos TIPO DE AROMA

SUBDIVISIÓN

EJEMPLO

Aromas frutas

Cítricos (Terpenos) No cítricos (No terpenos)

Naranja, Limón, Manzana, Frambuesa, Fresa

Aromas hortalizas

Frescas, Secas Aromático, Lacrimógeno, Ardiente

Lechuga, Apio, Tomate, Tabaco Canela, Menta, Cebolla, Ajo Pimiento, Jengibre Zumos, Leche, Vino, Cerveza, Te, Bebidas no alcohólicas, Refrescos Vacuno, Cordero, Cerdo, Salmón, Pollo, Pavo Aceite de Oliva, Girasol Mantequilla, Sebo Caldo de carne, Guisantes, Papas Mermelada, Jalea Jamones, Carnes procesadas Café, Snack, Cereales para el desayuno, Pan

Aromas especias Aromas bebidas

No fermentadas, Fermentadas Preparadas Mamífero, Pescado, Ave

Aromas carnes Aromas grasos

Vegetal Animal Caldo, Hortalizas, Frutas

Aromas cocinados Aromas empireumáticos

Ahumado, Asado parrilla, Frito Asado Horno, a la brasa, tostado

Aromas desagradables

Fermentados, Oxidados

Queso Azul, Pescado Podrido

Fuente: Fisher, C. y Scott, T.R.; (2013).

1.1.3.3Según su origen 

Aromas Naturales: Productos puros de estructura química definida, concentrado o no, que tiene características saporíferas y son obtenidos por un proceso físico, microbiológico o enzimático a partir de productos de origen vegetal o animal.



Aromas Idénticos a los Naturales: Aquellos productos obtenidos por procesos físicos, microbiológicos, enzimáticos, de síntesis

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David Francisco Bernal Rodríguez

química o de aislamiento por procesos químicos, cuya formulación incluye componentes idénticos a los existentes en la naturaleza. 

Aromas Artificiales: Son aquellos productos que en su formulación incluyen, en una proporción cualquiera, componentes que no se encuentran naturalmente en productos animales o vegetales y son obtenidos por síntesis química.

En algunos casos se realizan formulaciones mixtas en las cuales se parte de un aroma natural y se refuerza artificialmente para potenciarlo o para alargarle su vida útil. (Fisher, C.; et al. 2013.)

1.1.4

Composición de los aromas

Los aromas están compuestos por una gran variedad de elementos, los cuales pueden presentarse en distintas formas, siendo las más comunes las mencionadas a continuación:

1.1.4.1

Esencias líquidas

Las esencias líquidas son mezclas de productos aromáticos, disueltos generalmente en un solvente que puede variar según el alimento en que se va a aplicar y característica que se desee del saborizante, como solubilidad o resistencia a altas temperaturas.

Son muchos los solventes usados en la formulación de un aroma pero entre los más usados se encuentran: 

Alcohol etílico



Propilenglicol



Glicerina



Alcohol bencílico 9

Hidrólisis enzimática de queso campesino y doble crema para la producción de aromas lácteos



Triacetina



Aceite vegetal

Los solventes se utilizan fundamentalmente para tres efectos: 

Para disolver los componentes aromáticos y dar una forma homogénea al

saborizante. 

Para determinar la solubilidad del saborizante, así, si la esencia debe ser

hidrosoluble, debe llevar un solvente que sea miscible con el agua como alcohol etílico, propilenglicol o glicerina y si se requiere que sea oleosoluble, puede llevar triacetina, aceite vegetal u otro solvente permitido que sea miscible con el componente graso. 

Para permitir una dosificación adecuada del saborizante. (Karmelic, J.;

2012.)

1.1.4.2

Aromas en polvo

Los aromas en polvo, son las mismas esencias líquidas a las cuales se les elimina o disminuye el solvente y se encapsulan generalmente en goma arábiga, maltodextrina, dextrina u otras sustancias encapsulantes. Para tal efecto, las esencias emulsionadas con el agente encapsulante son secadas por atomización. Los saborizantes en polvo se aplican en los alimentos preparados en polvo como, sopas, postres o refrescos instantáneos y en productos de horneo ya que al estar encapsulados, se volatilizan menos con las altas temperaturas de horneo. (Karmelic, J.; 2012.)

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1.1.4.3

Especias y condimentos

Son aquellas sustancias vegetales de intenso sabor y aroma utilizadas generalmente como saborizantes, en vista de sus cualidades aromáticas y de preservación (antioxidantes naturales). Son los saborizantes más usados desde la antigüedad. Tienen las desventajas de ser poco estandarizados y de presentar en algunos casos diferentes grados de contaminación microbiológica e impurezas. (Moré E.; et al. 2013).

1.1.4.4

Oleoresinas y aceites esenciales

Las oleoresinas y aceites esenciales pueden usarse como saborizantes propiamente o como materia primas aromáticas dentro de la formulación de un saborizante. Las oleoresinas provienen de la extracción con solvente de diferentes partes de la planta como pueden ser semillas, cortezas, raíces, hojas o tallos, con posterior remoción del solvente de extracción, quedando un producto pastoso con bajo contenido de volátiles, ya que al evaporar el solvente, estos son arrastrados por el mismo. Los aceites esenciales están constituidos por una mezcla de una gran variedad de productos volátiles con fuertes propiedades saporíferas, que son extraídos principalmente por destilación con arrastre de vapor de agua. En el caso de los cítricos especialmente, también se obtienen por prensado o expresión. (Castro E.; et al 2013.)

1.1.4.5

Condimentos solubles

Los condimentos solubles están constituidos por los aceites esenciales u oleorresinas de las especias y condimentos, los cuales son adsorbidos en sal u otro vehículo inerte o bien son encapsulados al igual que los saborizantes en polvo. (Moré E.; et al. 2013).

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1.1.4.6

Compuestos puros aislados

Dentro de esta categoría se encuentran los ácidos orgánicos permitidos; alcoholes, algunos de los cuales son componentes de esencias como el geraniol, citronelol, linol, mentol y el alcohol bencílico; aldehídos, ya sea saturados (acético-enantico), no saturados (citral), aromáticos (benzoico, cinámico) y heterocíclicos (furfural); cetonas (metil-amil-acetona del queso Roquefort y de frutas y el diacetilo de mantequilla, vinagre y café); algunos ésteres (metilanisol y anetol) y más de 200 ésteres alifáticos y aromáticos.

(Karmelic, J.; 2012.)

1.1.4.7

Saborizantes procesados o de reacción

Los saborizante procesados o de reacción son aquellos basados en la reacción de Maillard y que son obtenidos por calentamiento de una sustancia nitrogenada (aminoácido) con un azúcar reductor, a 180 ºC por no más de 15 minutos. Se usan casi exclusivamente en sabores cárnicos y el aminoácido más comúnmente usado para este efecto es la cisteína. Entre los azúcares más empleados están la glucosa, la xilosa y la arabinosa. (Kerler, J.; et al. 2010.)

1.1.4.8

Acentuadores de sabor

Estos productos no son saborizantes propiamente dichos sino se usan para intensificar o potenciar otros sabores. Los más característicos son el glutamato monosódico (GMS), los nucleótidos, inosin monofosfato (IMP) y guanidin monofosfato (GMP) y los extractos de levadura, empleados en los saborizantes salados. Como potenciador de los sabores dulces figura el maltol y el etil maltol.

(Karmelic, J.; 2012.)

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1.1.5

Materias primas usadas en los aromas

Los aromas están constituidos por sustancias aromáticas primarias que son las que otorgan el sabor y vehículos o solventes, además de otros aditivos alimentarios opcionales como antioxidantes, colorantes, etc.

Los materiales aromáticos pueden ser de origen natural o sintético. Entre los principales productos naturales usados en la formulación de un saborizante están: 

Aceites esenciales



Oleoresinas



Extractos



Tinturas



Concentrados de fruta



Bálsamos

Entre los numerosos productos aromáticos se distinguen tres tipos:  Los de origen natural, aislados o producidos principalmente por vía microbiológica.  Los que existen en la naturaleza como componentes de los aromas naturales pero que por razones de precio y disponibilidad, son producidos por síntesis química. Estos constituyen la gran mayoría de los químicos aromáticos usados en la formulación de aromas.  Los que no existen en la naturaleza pero, por sus propiedades saporíferas2, son empleados en la formulación de los saborizantes.

Tal es el caso del etil maltol y de la etil vainillina que son

2

Saporífero/ra: (Del lat. sapor, -oris, sabor, y fero- llevar). adj. p. us. Que causa o da sabor.

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Hidrólisis enzimática de queso campesino y doble crema para la producción de aromas lácteos

ampliamente usados en la formulación de los aromas. (Fisher, C.; et al. 2013.)

1.1.6

Aplicaciones

Los aromas tienen un amplio rango de uso dentro de la industria de alimentos y bebidas. Los niveles de aplicación de los saborizantes son en extremo variables. Los más corrientes se encuentran entre 0,05-0,1 % del peso total del alimento, pero hay casos en que el nivel va desde 0,01 hasta 2 %. Debido a la variación en la composición de los diferentes alimentos y bebidas y a diferencias en las preferencias individuales o regionales un mismo saborizante puede tener diferentes grados de aplicación en distintos productos.

A continuación se enumeran algunos de los productos más comunes en los que se aplican aromas:  En bebidas: Té, cola, bebidas carbonatadas, café, jugos, bebidas funcionales, soya, bebidas lácteas, bebidas en polvo, bebidas alcohólicas.  En alimentos dulces: Chicles, dulces / caramelos, postres, horneados, cereales, helados, yogurt, quesos, postres, rellenos.  En alimentos salados: Snacks (Papas fritas, Doritos, etc.), grasas / aceites, cárnicos, sopas, salsas, caldos, cubos, especias, condimentos, comidas congeladas, gourmet, quesos. (Taylor, A. et al. 2010)

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1.2

Es

HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA

el

tipo

de

hidrólisis que

se

produce

mediante

un

grupo

de enzimas llamadas hidrolasas. Éstas enzimas ejercen un efecto catalítico hidrolizante, es decir, producen la ruptura de enlaces por agua según: H-OH + R-R’ → R-H + R’-OH. (Macarulla, J.; 2007.)

En el presente trabajo se tiene especial interés por la hidrólisis enzimática de proteínas y de lípidos ya que al realizar la hidrólisis en el queso ésta rompe las cadenas peptídicas de las proteínas del mismo, obteniéndose como resultado aminoácidos y, adicionalmente cuando se incluye lipasa, también se obtiene como resultado la liberación de ácidos grasos los cuales mejoran las características del hidrolizado debido a que se realiza una hidrólisis simultánea de la grasa.

1.2.1

Hidrólisis enzimática de proteínas

La hidrólisis proteica se realiza normalmente en un reactor, con control de agitación, pH, temperatura y tiempo de proceso. El sustrato se disuelve o resuspende en agua hasta que el pH y la temperatura se estabilizan; a continuación se agrega la proteasa dando inicio a la hidrólisis. A medida que ésta progresa se produce una disminución del pH debido a la rotura de los enlaces peptídicos. En los casos de hidrólisis enzimática el pH debe ser mantenido en el óptimo de la enzima mediante la adición de base diluida.

Para finalizar la hidrólisis proteica, la enzima puede ser inactivada con calor, mediante una disminución del pH o con una combinación de ambos. O también puede ser retirada del medio mediante filtración y la proteína finalmente precipitada.

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Hidrólisis enzimática de queso campesino y doble crema para la producción de aromas lácteos

Las enzimas que se encuentran involucradas dentro de la hidrólisis de las proteínas se denominan proteasas. Actualmente se encuentran disponibles comercialmente muchas proteasas grado-alimenticio (Tabla 3).

Estas proteasas pueden ser clasificadas, por su origen, (animal, vegetal, bacteriano o fúngico), por su modo de acción catalítica (endo- o exoactividad) o con base en su sitio catalítico. Las endoproteasas hidrolizan enlaces amídicos dentro de la cadena de la proteína. Las exoproteasas, por el contrario, eliminan aminoácidos terminales de las proteínas o péptidos. La naturaleza del centro catalítico de las proteasas difiere de acuerdo con los aminoácidos y otros ligandos que intervienen en la formación del complejo enzima-sustrato. El centro activo contiene aminoácidos o bien cationes metálicos que promueven la catálisis, denominándose serinproteasas, cisteinproteasas, aspartato proteasas, según intervengan los aminoácidos serina, cisteína o ácido aspártico. (Benítez, R.; et al. 2008.)

Tabla 3.

Algunas de las proteasas disponibles comercialmente en grado alimenticio.

Fuente: (Benítez, R.; et al. 2008.)

16

David Francisco Bernal Rodríguez

En las metalo-proteasas la actividad está promovida por un catión metálico, siendo el más frecuente el zínc. Todas las serinproteasas tienen actividad endo.

Contrariamente, las metalo- proteasas son sobre todo exo-proteasas. Las primeras enzimas proteolíticas utilizadas en la industria alimentaria fueron proteasas pancreáticas de origen animal, si bien cada vez están adquiriendo mayor importancia las de origen bacteriano o fúngico. (Benítez, R.; et al. 2008.)

1.2.1.1

Etapas de la hidrólisis enzimática

La hidrólisis proteolítica no se desarrolla en una sola reacción. Se trata de un conjunto de reacciones simultáneas de ruptura de enlaces, con distintas especies cargadas en equilibrio, lo que genera una gran complejidad a este tipo de procesos. Primero, se da la formación de un complejo enzima-sustrato (proteína), y después la rotura del enlace amídico dando como resultado la liberación de un péptido. Finalmente, el péptido restante se separa de la enzima después de un ataque nucleofílico de una molécula de agua. El proceso puede reiniciarse sobre los dos nuevos péptidos o sobre uno solo de ellos.

Figura 2.

Mecanismo catalítico de una proteasa.

Fuente: (Figueroa O., et al, 2012)

Para la hidrólisis, la unión sustrato-enzima es esencial. En el caso de proteínas globulares, la mayoría de los enlaces peptídicos están localizados en el interior de la proteína y no son accesibles para la enzima, por esto, se considera que para proteínas globulares es necesario efectuar la desnaturalización de la 17

Hidrólisis enzimática de queso campesino y doble crema para la producción de aromas lácteos

proteína

antes

de

proceder

a

hidrolizarla,

ya

que

después

de

la

desnaturalización estarán expuestos más enlaces peptídicos. En solución, las proteínas en estado plegado (nativo) y no plegado (desnaturalizadas) están en equilibrio.

Solamente las moléculas no plegadas son

susceptibles a

degradación por enzimas proteolíticas, como se representa en la Figura 3.

(Benítez, R.; et al. 2008.)

Figura 3.

Teoría de Linderstrom-Lang

Fuente: (Benítez, R.; et al. 2008.)

Si la velocidad de desnaturalización (V0 = V+0 - V-0) es menor que V1, la etapa de desnaturalización es la etapa limitante de la velocidad de hidrólisis y cada proteína desnaturalizada será rápidamente hidrolizada hasta los productos finales. El hidrolizado resultante, además de contener ambas proteínas intactas, contendrá los productos finales, aunque serán deficientes en péptidos de tamaños intermedios. Este tipo de reacción está designada como una reacción ‘en etapas sucesivas’. Si, además, la desnaturalización de la proteína es más rápida que la hidrólisis (V1<V0), las moléculas de la proteína serán degradadas a intermedios pero posteriormente se convertirán lentamente en productos finales. Este tipo de reacción es llamada de “cremallera”, obteniéndose un hidrolizado que contiene principalmente péptidos de tamaño intermedio. Ambos mecanismos de hidrólisis están implicados en la mayoría de las reacciones proteolíticas. Si la proteína se desnaturaliza irreversiblemente antes de la hidrólisis, el número de enlaces de péptidos disponibles se incrementa notablemente y la degradación de la proteína debería proceder de acuerdo con un tipo de reacción “cremallera”. Para estas proteínas desnaturalizadas otros 18

David Francisco Bernal Rodríguez

factores tales como la disminución de la solubilidad media influyen en la velocidad de reacción inicial. (Himonides A., et al, 2011).

1.2.1.2

Condiciones de la hidrólisis

Debe establecerse la relación [proteína]/[proteasa] una vez que se ha efectuado un posible pretratamiento de la proteína, si es necesario. A continuación, deben ser definidas las condiciones de la reacción del proceso de hidrólisis. Las principales variables que determinan el resultado de la reacción son temperatura, pH, relación enzima-sustrato y el tiempo de reacción. Los primeros 3 factores determinan la velocidad de reacción y pueden influir en la especificidad de la enzima.

El tiempo de reacción solamente determina el grado final de hidrólisis. Los efectos interactivos entre los parámetros de la hidrólisis también influyen en la composición del hidrolizado. Si el proceso de hidrólisis no se controla, el pH de la solución cambiará después del inicio de la hidrólisis debido a la formación de grupos aminos nuevos, los cuales son capaces de liberar o aceptar protones, dependiendo del pH de la hidrólisis. A un pH bajo todos los grupos amino están protonados y solamente parte de los grupos carboxilo están desprotonados, resultando en una captación neta de protones por cada enlace peptídico roto, causando un incremento del pH. A pH neutro y alcalino la hidrólisis resulta en una disminución de pH, pues todos los carboxilos están desprotonados y solamente parte de los grupos amino están protonados. (Benítez, R.; et al.

2008.)

1.2.1.3

Grado de Hidrólisis

El grado de hidrólisis es el parámetro clave para el seguimiento y control de las reacciones de hidrólisis de proteínas. Representa la proporción de enlaces peptídicos hidrolizados sobre el número total de enlaces. Se calcula de acuerdo 19

Hidrólisis enzimática de queso campesino y doble crema para la producción de aromas lácteos

con la ecuación 1, donde h es el número de enlaces peptídicos hidrolizados y htot el número total de enlaces peptídicos presentes en la proteína nativa.

Ambos h y htot son expresados en meq/g. (Mburu S. y Lu R., 2011).

Ecuación 1. Grado de Hidrólisis

Los métodos para medir el DH se basan en: la determinación de los grupos αamino libres, la determinación de nitrógeno soluble tras precipitar la proteína con ácido tricloroacético y la valoración del protón liberado tras la ruptura de un enlace peptídico a determinados valores de pH.

1.2.1.4

Determinación de los grupos α-amino libres

La cantidad de grupos α-amino liberados puede ser medida usando reactivos que reaccionen específicamente con grupos amino, produciendo derivados que pueden ser detectados espectrofotométricamente. Se utilizan reactivos como ninhidrina, ortoftaldialdehído (OPA) y ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS), que reaccionan con los grupos amino libres. La técnica más antigua es la de reacción con ninhidrina, de gran sensibilidad, que presenta el inconveniente de la larga duración de los ensayos y la interferencia del amonio, además de dar como resultado valores mucho más bajos de DH, cuando se compara con OPA y TNBS, los cuales correlacionan bien. (Robinson M., 2010)

El método del TNBS el cual se basa en la reacción de grupos amino primarios con el ácido trinitrobencenosulfónico, ha sido utilizado por diferentes autores para el análisis de hidrolizados de proteínas. Después de la incubación de las muestras con tiempos entre 15 y 60 minutos y a temperaturas entre 30 y 50 °C se mide la absorbancia a 420 nm. Entre los inconvenientes de este método pueden mencionarse la inestabilidad del reactivo, el riesgo de explosión, el alto 20

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valor de los blancos, la contaminación del reactivo con ácido pícrico, la interferencia de azúcares reductores y amonio, la no reactividad de prolina e hidroxiprolina así como la alteración de los resultados por la reacción de los grupos α-amino de lisina con el reactivo. Algunos autores prefieren el método de la OPA al método de TNBS tanto por su rapidez como por su seguridad. Sin embargo, estos autores midieron el derivado de la OPA por absorción UV inmediatamente después de la adición de los

reactivos.

Posteriores

investigaciones demostraron que la absorción de la OPA fue estable solamente durante 20 min. Además, este método tiene el inconveniente de no reaccionar con prolina y sólo parcialmente con cisteína. (Robinson M., 2010)

1.2.1.5

Determinación de nitrógeno soluble

En este caso las técnicas más usuales son el método Kjeldhal, la reacción de Biuret o la determinación espectrofotométrica en la región UV de péptidos con grupos aromáticos. (Benítez, R.; et al. 2008.)

1.2.1.6

Determinación

de

los

protones

liberados

mediante

potenciometría

Algunas veces se monitorea el DH adicionando una base (o un ácido, dependiendo del pH inicial de la hidrólisis), para mantener el pH de la hidrólisis constante. La cantidad de base empleada es proporcional al DH. Sin embargo, este consumo no está relacionado de una forma simple con el grado de hidrólisis alcanzado, siendo necesario para establecer esta relación el conocimiento del pK medio de los grupos α-amino liberados en la hidrólisis. El método sólo es aplicable a la hidrólisis enzimática de proteínas a pH neutro, alcalino o fuertemente ácido (pH≤3). (Benítez, R.; et al. 2008.)

21

Hidrólisis enzimática de queso campesino y doble crema para la producción de aromas lácteos

1.2.2

Hidrólisis enzimática de lípidos

Comúnmente conocida como lipólisis, es la hidrólisis de los lípidos. En la lipólisis que tiene lugar durante la maduración del queso, los triglicéridos, principales lípidos de la leche, son hidrolizados por enzimas lipolíticas (lipasas y esterasas), dando lugar a ácidos grasos libres (AGL), mono- y diglicéridos. La liberación y acumulación de AGL, tiene gran importancia en el desarrollo del sabor de los quesos. Las enzimas lipolíticas responsables de la hidrólisis pueden provenir de diferentes fuentes como la leche, enzimas de la pasta del cuajo, enzimas microbianas procedentes de cultivos iniciadores y no iniciadores, y lipasas añadidas, en el caso que se añadan en la fabricación.

Dependiendo de la extensión y de la especificidad de la hidrólisis, la grasa modificada enzimáticamente, proveniente de la leche, exhibirá diferentes notas de sabor; a una baja extensión, la lipólisis puede impartir notas sensoriales ricas en ácido; y a una extensión relativamente alta, adquiere notas bien sea a mantequilla, crema o queso. (Regado M.; et al, 2010)

La grasa de leche hidrolizada, se ha vuelto un ingrediente importante en la industria de los alimentos. Hay varias y potenciales aplicaciones, como lo son: 

Como aditivo para productos de panadería (pan, galletas)



Cereales (Hojuelas)



Productos lácteos (Blanqueadores de café, cremas de relleno, productos espreados y untables de queso y mantequilla)



Otros productos (sazonadores para popcorn, salsas, productos tipo snacks)

Bajo condiciones específicas de procesamiento, las grasas hidrolizadas de leche exhiben un intenso sabor a queso; por lo cual son usualmente producidas en los quesos modificados enzimáticamente (EMC). Las grasas hidrolizadas de 22

David Francisco Bernal Rodríguez

la leche pueden ser vistas, bien como un vehículo de los sabores de queso o como productos de la modificación enzimática de sustratos lácteos. Durante la manufactura de grasa hidrolizada de leche, específicamente la obtenida a partir de cuajada de queso, el sustrato es mezclado con sales emulsificantes y se añaden tanto enzimas proteolíticas como lipolíticas.

Las lipasas empleadas en la manufactura, pueden ser de fuentes animales o microbianas; la escogencia de las mismas es crítica, ya que de ellas depende el perfil final de los ácidos grasos liberados y consecuentemente el sabor del producto final (Regado M.; et al, 2010)

En la tabla 4 se presentan algunas lipasas usadas comercialmente.

Tabla 4.

Algunas de las lipasas disponibles comercialmente producidas por la empresa Nova Nordisk.

MARCA

MECANISMO

APLICACIÓN

Lipopan®

Industria de panificación

Lipozyme®

Hidrólisis y consumo de oxígeno Interesterificación

Novazym ® 27007 Palatasa Novozyme ® 871

Hidrólisis Hidrólisis Emulsificación

Industria de aceites y grasas Pastas Industria láctea Comida para mascotas

Fuente: (Aravindan R.; et al, 2007)

1.2.2.1

Grado de hidrólisis

El grado de hidrólisis es el parámetro más importante para medir la eficiencia de la lipólisis. Este se define como el número de miligramos de KOH necesarios para neutralizar los ácidos grasos libres en un gramo de grasa; es expresado como mg KOH/g, lo que viene siendo igual al índice de acidez, basado en el procedimiento descrito por la Federación internacional de la leche (IDF), por sus siglas en inglés. (Khoshgozaran, S.; et al, 2011) En el capítulo 2 se describe el método para obtener el índice de acidez.

23

Hidrólisis enzimática de queso campesino y doble crema para la producción de aromas lácteos

1.3

QUESOS MODIFICADOS ENZIMÁTICAMENTE (EMC)

1.3.1

Generalidades

Los sabores de queso concentrados producidos enzimáticamente a partir del queso, de la cuajada inmadura o de otros sustratos lácteos, son comúnmente conocidos como quesos modificados enzimáticamente (EMC) por sus siglas en inglés. Los EMC son usados como una fuente rentable de sabores de queso en un amplio rango de alimentos procesados, se encuentran disponibles en una gama de sabores que difieren en la intensidad deseada y en sus atributos los cuales resaltan el sabor de queso ya existente de los productos o les confieren características específicas de los quesos, en general las que hacen referencia a su sabor y olor. (Moosabi - Nasab M.; et al. 2010.)

Las principales aplicaciones de los EMC son en queso procesado, quesos para untar, alimentos tipo snacks, sopas, salsas, galletas y alimento para mascotas. Sus principales ventajas sobre otros ingredientes saborizantes de queso son (Tamime A. Y.; 2011): 

Bajos costos de producción



Consistencia



Alta intensidad del sabor



Amplio rango de sabor



Extensa vida útil



Bajos costos de almacenamiento



Incrementa la funcionalidad

La producción comercial de EMC generalmente envuelve simultáneamente la hidrólisis de la cuajada de queso por acción de enzimas proteolíticas y 24

David Francisco Bernal Rodríguez

lipolíticas. Este proceso es relativamente poco sofisticado y no se encuentra caracterizado para cualquier tipo de enzima específica, lo cual puede resultar en la digestión de la enzima proteolítica por acción de la lipolítica, o viceversa.

Adicionalmente, la calidad del producto final es impredecible debido a la variación en las propiedades tanto bioquímicas, como composicionales del sustrato.

Para producir un producto EMC consistente, se hace necesario el tener un alto control del proceso, por lo tanto, las reacciones enzimáticas que ocurren bajo las condiciones usadas, deben ser entendidas en su totalidad antes de realizar cualquier intento para producir EMC’s. (Kilcawley, K.N.; et al. 2006.)

1.3.2

Producción de EMC

La base de la producción de EMC es la utilización de enzimas específicas, bajo condiciones óptimas, para producir rápidamente sabores de queso intensos a partir de sustratos lácteos (usualmente la cuajada de queso). La tecnología fue desarrollada a finales de los años 60, en la que se usaba cuajada fresca y una solución de NaCl; éstas se mezclaban para hacer una emulsión de aproximadamente 40% de sólidos. Enzimas y conservantes se añadían a la mezcla y ésta era incubada con condiciones controladas, bajo las cuales, los sabores a queso se desarrollaban. Esta tecnología demostró el potencial de generar sabores de queso intensos en un período corto de tiempo, a partir de sustratos lácteos, mediante la modificación de los parámetros del proceso, como temperatura y pH de la mezcla.

Muchos procedimientos comerciales están basados en principios similares y en general, la producción involucra la incubación de queso maduro o inmaduro con enzimas exógenas específicas y/o microorganismos, terminando el proceso con un tratamiento de calor y estandarizando el producto final a la intensidad deseada de sabor y composición.

25

Hidrólisis enzimática de queso campesino y doble crema para la producción de aromas lácteos

Los EMC generalmente son producidos bien sea por un proceso de una etapa (Figura 4), en el cual la hidrólisis de la grasa y de la proteína ocurre simultáneamente, o por uno de dos etapas (Figura 5), donde varios componentes del sabor son creados separadamente y después se mezclan. El proceso de varios componentes permite una gran flexibilidad, lo que facilita la obtención de una gran diversidad de productos. (Kilcawley, K.N.; et al. 2006.)

26

David Francisco Bernal Rodríguez

Figura 4.

Proceso de una etapa para la obtención de EMC

SUSTRATO (Queso, cuajada)

Agua

Emulsificantes

MEZCLA

PASTEURIZACIÓN

10 min.

72 oC

Enzima(s) Potenciadores de sabor (opcional)

Calor

HIDRÓLISIS

INACTIVACIÓN

12 - 72 h.

30 - 45 oC 5 - 7 pH

85 oC 15 - 20 seg.

FORMULACIÓN

EMC

Fuente: (Kilcawley, K.N.; et al. 2006.)

27

Hidrólisis enzimática de queso campesino y doble crema para la producción de aromas lácteos

Figura 5.

Proceso de dos etapas para la obtención de EMC SUSTRATO (Queso, cuajada)

SUSTRATO (Grasa Láctea)

Agua Emulsificantes

Agua Emulsificantes

MEZCLA

PASTEURIZACIÓN

Proteasa ó Peptidasa Potenciadores de sabor (opcional)

Calor

10 min.

72 oC

INACTIVACIÓN

10 min.

72 oC

PASTEURIZACIÓN

Lipasa ó Estearasa

12 - 72 h.

30 - 45 oC 5 - 7 pH

HIDRÓLISIS

MEZCLA

85 oC 15 - 20 seg.

Calor

FORMULACIÓN

12 - 72 h.

30 - 45 oC 5 - 7 pH

HIDRÓLISIS

Potenciadores de sabor (opcional)

85 oC 15 - 20 seg.

INACTIVACIÓN

FORMULACIÓN

EMC 1

EMC 2 MEZCLA FINAL

Fuente: (Kilcawley, K.N.; et al. 2006.)

EMC 3

28

David Francisco Bernal Rodríguez

Las condiciones actuales del proceso se usan bajo la dependencia de muchos factores y se encuentran directamente relacionadas con las enzimas que son usadas. En general, los EMC son producidos de 12 a 72 horas con un rango de temperaturas de 30 - 45°C, y entre un pH de 5 – 7. Una vez que se haya obtenido el producto, éste puede ser formulado para alcanzar la composición deseada, dependiendo de su aplicación final. (Tamime A. Y.; 2011).

El

pH

puede

ser

alterado

para

mejorar

la

estabilidad

durante

el

almacenamiento, o mejorar el aroma, también se pueden añadir vehículos para incrementar el rendimiento, obtener la intensidad de sabor deseada o facilitar un posterior secado en spray dried. (Moosabi - Nasab M.; et al. 2010.)

29

Hidrólisis enzimática de queso campesino y doble crema para la producción de aromas lácteos

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1

Materias primas

Materias primas: Se usó queso marca Colanta, tanto campesino como doble crema, el cual fue adquirido en el supermercado Éxito.

La proteasa y la lipasa,

marca Novozyme fueron suministradas por la

empresa Symrise Ltda. Las fichas técnicas de las mismas se pueden encontrar en el Anexo A.

Reactivos: NaOH 0,1 mol/L, indicador fenolftaleína, etanol 5 %.

2.2

Equipos e instalaciones

Para lograr el desarrollo de la investigación se trabajó con equipos propiedad de Symrise Ltda. En la tabla número 5 se hace referencia a dichos equipos y a sus características de, capacidad, marca y modelo; las cuales se presentan en la figura 6.

30

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Tabla 5.

Características de equipos utilizados

Equipo

Características

Agitador de hélice

IKA RW20 Digital 100-115 V 50-60 Hz 200-2500 rpm

Plancha de Calentamiento con sensor de temperatura

Heidolph Instruments MR Hei-Tec AC 115 V 50-60 Hz o 0-300 C 100-1400 1/min

Balanza analítica

Mettler Toledo ML40023/01 Max=4200 g d=0,01 g 1,2 V

Balanza de humedad

Redwag Ref.215326 Rango (0-48) Máx 50 g d=0,1mg

Potenciómetro

Hanna Instruments HI4211/HI4212 -2000 a 20000 pH ±2000.0 mV

Titulador automático

Mettler Toledo DL50 Rondolino HR ≤ 80 % o o T 5-40 C

31

Hidrólisis enzimática de queso campesino y doble crema para la producción de aromas lácteos

FIGURA 6.

Equipos utilizados durante el desarrollo del proyecto

Agitador de hélice / Plancha de calentamiento con sensor de temperatura

Titulador automático

2.3

Balanza de humedad

Potenciómetro

Balanza analítica

Ensayos preliminares

Para realizar la hidrólisis enzimática se realizaron ensayos preliminares utilizando el método descrito en la Figura 7. La tabla 6 presenta la formulación usada para estos ensayos con el fin de determinar la cantidad necesaria de

32

David Francisco Bernal Rodríguez

materia prima (cantidad de queso y enzimas) para realizar las hidrólisis enzimáticas finales.

Tabla 6.

Formulación para los ensayos preliminares

Materia prima

Cantidad (g)

Queso

300

Enzima

0,95

Agua

199,05

Figura 7.

Diagrama de flujo para los ensayos preliminares

SUSTRATO (Queso)

Agua

MEZCLA

Enzima(s) Agitación n

Calor

HIDRÓLISIS

INACTIVACIÓN

12 - 72 h.

35 - 40 oC 5 - 7 pH

20 seg.

85 oC

EMC

33

Hidrólisis enzimática de queso campesino y doble crema para la producción de aromas lácteos

 Mezcla: En esta etapa del proceso se realiza una mezcla del queso previamente cortado en trozos y licuado, con agua dentro de un recipiente con constante agitación.  Hidrólisis: En esta reacción se agrega la enzima o enzimas necesarias para la hidrólisis y se lleva la mezcla a una temperatura de 37 ± 3 oC y un pH de 6 ± 1, durante 72 horas. Es la etapa más influyente del proceso dado que en ella se forman las características del producto final. (Moosabi- Nasab.; et al. 2000)  Inactivación: En esta etapa se inactivan las enzimas mediante calor, llevando la mezcla hasta 85ºC por 20 seg.

La realización de las pruebas preliminares permitió establecer que transcurridas 24 horas de la hidrólisis el producto empezaba a presentar olor fétido y formación de coágulos, independientemente de la enzima, tipo de queso y rango de pH y temperatura usados, características que indicaron rancidez del mismo. Debido a lo anterior se hizo necesario incluir en la formulación NaCl y fosfato de sodio como agentes conservantes y que al mismo tiempo brindan características de sabor al producto final.

En las tablas 7 y 8 se relacionan las nuevas formulaciones tomando como referencia la cantidad inicial de sustrato.

34

David Francisco Bernal Rodríguez

Tabla 7.

Nueva formulación para ensayos finales con 40% de sustrato inicial.

Materia prima

Cantidad (g)

Queso

200

Enzima

0,65

Agua

248,35

Fosfato de sodio

11

NaCl

40

Tabla 8.

Nueva formulación para ensayos finales con 60% de sustrato inicial

2.4

Materia prima

Cantidad (g)

Queso

300

Enzima

0,95

Agua

148,05

Fosfato de sodio

11

NaCl

40

Ensayos finales

La tabla No. 9 relaciona la cantidad de materia prima usada en cada ensayo, de acuerdo con lo establecido por formulación y partiendo del contenido en sólidos del sustrato inicial; todas las pruebas se realizaron intercalando la temperatura entre 35ºC y 40ºC, adicionalmente, se varió entre cada prueba el valor inicial de pH de 6 ± 1. Para cada prueba se realizó su respectiva réplica.

El producto final se empacó en recipientes plásticos y se etiquetó de acuerdo a las condiciones usadas para cada uno de los ensayos.

35

Hidrólisis enzimática de queso campesino y doble crema para la producción de aromas lácteos

Tabla 9.

Cantidad de materia prima en gramos establecida para los ensayos finales3

# Prueba MATERIA PRIMA (g) 1

Campesino Queso Doble Crema

40% sólidos 60 % sólidos 40 %sólidos 60 % sólidos

200

2

3

4

X

300 200

5

6

7

8

X X

X

X

X

300

X

X

Lipasa

0,45

0,65

X

X

X

X

Proteasa

0,2

0,3

X

X

X

X

X

X

X

X

Fosfato de sodio

11

11

X

X

X

X

X

X

X

X

Sal

40

40

X

X

X

X

X

X

X

X

Agua

248,35

148,05

X

X

X

X

X

X

X

X

Enzima

A continuación se relacionan los parámetros analizados:

2.4.1

Índice de Acidez

Se realizó el análisis para medir el porcentaje de ácidos grasos libres en el producto terminado y así determinar el grado de hidrólisis de los lípidos obtenido durante el proceso. El método usado es el descrito en la Figura 8 y adicionalmente se usó un titulador automático para verificar los resultados.

3

Para los ensayos realizados solamente con proteasa, se añadieron en total 0,65 g de la misma.

36

David Francisco Bernal Rodríguez

Figura 8.

Medición del índice de acidez para determinación de ácidos grasos libres.

ETANOL

0,5 mL de fenolftaleína

50 mL Calor

CALENTAR

Ebullición (+70oC)

NaOH 0,1 mol/L

NEUTRALIZAR

MEZCLA

Calor

CALENTAR

Muestra hidrolizado

Ebullición (+70oC)

NaOH 0,1 mol/L

NEUTRALIZAR

CALCULAR % DE ACIDEZ

Usando la ecuación número 2

Fuente: ICONTEC (1999)

Los datos se expresaron en miligramos de KOH por gramo, mediante las ecuaciones 2 y 3 (ICONTEC. 1999): 37

Hidrólisis enzimática de queso campesino y doble crema para la producción de aromas lácteos

Ecuación 2. Porcentaje de Acidez

Donde: V : Es el volumen, en mililitros, de la solución volumétrica normalizada de hidróxido de sodio. c : Es la concentración exacta, en moles por litro, de la solución normalizada de hidróxido de sodio.

M: Es la masa molar, en gramos por mol, del ácido escogido para la expresión de los resultados (ácido oleico en este caso). m: es la masa, en gramos, de la porción de ensayo.

Índice de acidez = % de acidez (expresado como ácido oleico) X 1,99 Ecuación 3. Índice de Acidez

2.4.2

Humedad

Para el cálculo de la humedad, se pesaron 2 g de cada muestra en la balanza de humedad y se secaron a temperatura de 105ºC hasta alcanzar un peso constante. Luego se enfriaron en un desecador durante 15 min y se pesaron nuevamente, para registrar el peso de la muestra seca. La diferencia de peso permitió calcular la humedad de las muestras mediante la ecuación 4:

Ecuación 4. Porcentaje de Humedad

38

David Francisco Bernal Rodríguez

Donde:

Pi= Peso inicial Pf= Peso final

Los datos obtenidos se graficaron en función del tiempo.

2.4.3

pH

Se midió el pH de cada muestra con un potenciómetro para verificar el cambio del mismo posterior a la hidrólisis.

Los resultados se graficaron de acuerdo a las condiciones de la hidrólisis establecidas para cada muestra

2.4.4

Análisis sensorial

Se realizó un análisis preliminar de las 8 muestras para escoger aquellas con las mejores propiedades sensoriales para su aplicación en un producto tipo snack (chitos), en donde se evaluó el perfil de sabor de cada una. Se evaluaron las notas de los 5 gustos básicos y adicionalmente se evaluaron 12 notas de sabor características de este tipo de productos, para un total de 17, usando una escala hedónica de 10 puntos, donde 0 es el valor mínimo de intensidad y 10 el máximo.

Posterior al análisis preliminar, se realizó una prueba de preferencia con un panel sensorial compuesto por 10 panelistas entrenados, en donde se evaluaron las dos muestras con mejores características sensoriales obtenidas a partir del análisis preliminar, aplicadas en un producto tipo snack (chitos),

39

Hidrólisis enzimática de queso campesino y doble crema para la producción de aromas lácteos

usando una escala hedónica de 3 puntos, siendo 1 el de más preferencia y 3 el de menos preferencia

El formato usado para el panel sensorial se muestra en la figura 9.

Figura 9.

Prueba de preferencia.

2.4.5

Diseño experimental

Se usó un diseño factorial 23, con dos repeticiones, donde se evaluaron 3 factores cuantitativos cada uno con dos niveles:  pH (5 y 7)  Temperatura (35 y 400C) 40

David Francisco Bernal Rodríguez

 Concentración del sustrato (40 y 60%) Adicionalmente, se evaluaron dos factores cualitativos:  Tipo de enzima (Proteasa o mezcla de proteasa/lipasa)  Tipo de queso (Campesino o doble crema)

Las variables criterio fueron estos dos últimos factores, ya que de ellos dependen, en su gran mayoría, las características del producto final; siendo estas características determinantes para poder establecer cuáles son las mejores condiciones para la hidrólisis.

En general los datos obtenidos se analizaron estadísticamente utilizando medidas de tendencia central, dispersión, asociación y varianza (ANOVA) con un nivel de significancia del 95% (α=0.05%).

41

Hidrólisis enzimática de queso campesino y doble crema para la producción de aromas lácteos

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En este capítulo se presentan los resultados obtenidos después de realizar los diferentes experimentos sobre las muestras elaboradas y analizadas en las instalaciones de Symrise Ltda.

Posteriormente se adjunta la discusión de los mismos.

3.1

Ensayos preliminares

En esta etapa del estudio se realizaron varios ensayos preliminares para determinar la formulación necesaria para la hidrólisis final. Tras 24 horas de iniciado el proceso de hidrólisis, se observó que el producto empezaba a presentar olor fétido y formación de coágulos, independientemente de la enzima, tipo de queso y rango de pH y temperatura usados, características que indicaron rancidez del mismo. Por lo anterior, se concluyó que era necesaria la inclusión de fosfato de sodio y sal como agentes conservantes dentro de la nueva formulación para los ensayos finales para evitar esta situación y al mismo tiempo obtener a partir de estos materiales características que generan mayor intensidad de sabor al producto final.

La tabla 10 presenta la formulación usada para los 5 ensayos realizados en esta etapa.

Tabla 10.

Formulación usada para la hidrólisis de los 5 ensayos preliminares.

Materia prima

Cantidad (%)

Queso

60

Enzima

0,19

Agua

39.81

42

David Francisco Bernal Rodríguez

3.2

Ensayos finales

Para estos ensayos se usó la nueva formulación obtenida luego de los ensayos preliminares, descrita en el capítulo anterior y se aplicó a cada una de las muestras siguiendo el procedimiento descrito en la figura 10.

Figura 10.

Proceso de Hidrólisis para los ensayos finales

SUSTRATO (Queso)

Agua

MEZCLA

Enzima(s) Agitación )

Calor

HIDRÓLISIS

INACTIVACIÓN

72 h.

35 - 40 oC 5 - 7 pH

20 seg.

85 oC

EMC

Cada muestra se empacó en recipientes plásticos y se almacenó bajo refrigeración hasta el momento de realizar los análisis de las mismas. El producto obtenido y el empaque de los mismos se muestran en la figura 11.

43

Hidrólisis enzimática de queso campesino y doble crema para la producción de aromas lácteos

Figura 11.

Producto final EMC obtenido

3.3

Índice de Acidez

Los resultados que se muestran a continuación corresponden al análisis del índice de acidez de todas las muestras y sus réplicas, teniendo en cuenta que las muestras No. 1- 4 se realizaron con la mezcla de proteasa/lipasa y las muestras 4 - 8 solo con proteasa.

La tabla 11 presenta los valores del índice de acidez en mgKOH/g para cada tratamiento y sus respectivas réplicas. Adicionalmente, la tabla 12 presenta el porcentaje de ácidos grasos libres para cada una de las muestras.

44

David Francisco Bernal Rodríguez

Tabla 11. Índice de Acidez (mgKOH/g). % DE

TEMPERATURA

TIPO DE

SUSTRATO

(O C)

ENZIMA (S)

1

40

35

2

40

40

3

60

4

RÉPLICA 1

RÉPLICA 2

X

Desv.

Estándar

6.28

6.14

6,21

0,10

Lipasa y Proteasa

4.49

4.61

4,55

0,08

35

Lipasa y Proteasa

5.39

5.16

5,28

0,16

60

40

Lipasa y Proteasa

6.15

6.28

6,22

0,09

5

40

35

Proteasa

3.30

3.05

3,18

0,18

6

40

40

Proteasa

3.74

3.48

3,61

0,18

7

60

35

Proteasa

4.73

4.13

4,43

0,42

8

60

40

Proteasa

4.21

4.38

4,30

0,12

TRATAMIENTO

Lipasa y Proteasa

Tabla 12. % Ácidos grasos libres

TEMPERATURA

TIPO DE

(O C)

ENZIMA (S)

RÉPLICA 1

RÉPLICA 2

X

Desv.

Estándar

3,15

3,08

3,12

0,05

Lipasa y Proteasa

2,25

2,31

2,28

0,04

35

Lipasa y Proteasa

2,7

2,59

2,65

0,08

60

40

Lipasa y Proteasa

3,09

3,15

3,12

0,04

5

40

35

Proteasa

1,65

1,53

1,59

0,08

6

40

40

Proteasa

1,87

1,74

1,81

0,09

7

60

35

Proteasa

2,37

2,07

2,22

0,21

8

60

40

Proteasa

2,11

2,2

2,16

0,06

TRATAMIENTO

% DE SUSTRATO

1

40

35

2

40

40

3

60

4

Lipasa y Proteasa

45

Hidrólisis enzimática de queso campesino y doble crema para la producción de aromas lácteos

En la figura 12 Y 13 se muestran los resultados del índice de acidez promedio y del cálculo del porcentaje de ácidos grasos libres promedio, observándose que su valor es mayor en aquellas muestras en las que se usó la mezcla lipasa/proteasa dentro de la formulación y en aquellas en las que la hidrólisis se llevó a cabo bajo 40ºC de temperatura, dando lugar a una mayor liberación de ácidos grasos debido a la lipólisis de la grasa, lo cual se encuentra acorde con lo expresado por Delgado F; et al, (2009) en un estudio de los cambios presentados en cuanto a ácidos grasos y oxidación se refiere, durante la maduración del queso suave español, mejor conocido como ‘Torta del Casar’ y por El-Hofi M.; et al, (2011) en un estudio sobre la revisión del uso y aplicaciones industriales de la lipasa en la manufactura de queso.

Figura 12. Índice de Acidez (mgKOH/g).

ÍNDICE DE ACIDEZ 7,00

6,21

6,21

6,00

5,28 4,55

mgKOH/g

5,00 4,00

3,18

4,43

4,30

7

8

3,61

3,00 2,00 1,00 0,00 1

2

3

4

5

6

Tratamiento

En promedio, los tratamientos que presentan el índice de acidez más alto son el numero 1 y el número 4 y el valor más bajo es el número 5. Se puede observar que los que tienen el valor más alto de índice de acidez, son los tratamientos que incluyen lipasa dentro de su formulación, independientemente de la temperatura usada, lo que contrasta con el tratamiento que tiene el valor 46

David Francisco Bernal Rodríguez

más bajo, en cuya formulación solo se empleó proteasa. Al existir ausencia de lipasa dentro de la formulación, el índice de acidez disminuye, debido a que se hidrolizan menor cantidad de lípidos y por otro lado, aumenta la generación de aminoácidos por acción de la proteasa.

Es importante resaltar que el tratamiento 4, cuyo índice de acidez fue el más alto, incluyó en su formulación 60% de sustrato inicial y 40ºC de temperatura dentro del proceso, lo cual indica que bajo estas condiciones se obtiene una liberación importante de ácidos grasos, lo cual influye significativamente en el producto final, destacándose notas butíricas y lácteas, lo cual concuerda con lo expuesto por El-Hofi M.; et al, (2011).

Figura 13. % de Ácidos grasos libres

ÁCIDOS GRASOS 3,50

3,12

3,12

% Porcentaje

3,00

2,65 2,28

2,50 2,00

1,59

2,22

2,16

7

8

1,81

1,50 1,00 0,50 0,00 1

2

3

4

5

6

Tratamiento

El porcentaje de ácidos grasos libres, es directamente proporcional al índice de acidez presentado anteriormente; éste nos da una idea de la cantidad total de ácidos grasos presentes en el producto final, los cuales en su gran mayoría son ácidos grasos de cadena corta y media (C4:0–C12:0), los cuales son los responsables de contribuir al aroma característico del producto final.

47

Hidrólisis enzimática de queso campesino y doble crema para la producción de aromas lácteos

La tabla 13 presenta el ANOVA realizado para el índice de acidez: Tabla 13.

ANOVA para índice de acidez Grados

Fuentes de

Suma de

Variación

Cuadrados

Temperatura (A)

0,0441

1

pH (B)

1,782225

Concentración del sustrato (C)

11,3569

AB AC BC ABC Error Total

1,030225 0,2601 0,366025 2,512225 5 22,3518

Cuadrado

Fc

Ft

α

0,0441

0,07056

5,32

0,05

1

1,782225

2,85156

5,32

0,05

1

11,3569

18,17104

5,32

0,05

1

1,030225

1,64836

5,32

0,05

1 1 1 8 15

0,2601 0,366025 2,512225 0,625

0,41616 0,58564 4,01956

5,32 5,32 5,32

0,05 0,05 0,05

de libertad

medio

De acuerdo a lo anterior se puede observar que el factor C, que corresponde a la concentración de sustrato, influye significativamente en el índice de acidez, lo cual concuerda con Delgado F; et al, (2009), ya que al usar mayor concentración de sustrato, mayor es también el contenido de grasa que puede ser hidrolizado por la lipasa, generando una liberación mayor de ácidos grasos, lo que afecta directamente al índice de acidez.

48

David Francisco Bernal Rodríguez

3.4

Humedad

La tabla 14 y la figura 14 presentan los valores de la humedad obtenidos para cada tratamieto y sus respectivas réplicas.

Tabla 14. % de Humedad TEMPERATURA (O

TIPO DE ENZIMA

C)

(S)

RÉPLICA 1

RÉPLICA 2

X

Desv.

Estándar

24,03

23,87

23,95

0,11

Lipasa y Proteasa

37,67

37,14

37,41

0,37

35

Lipasa y Proteasa

43

42,82

42,91

0,13

60

40

Lipasa y Proteasa

30,93

30,76

30,85

0,12

5

40

35

Proteasa

58,97

59,11

59,04

0,10

6

40

40

Proteasa

55,81

54,46

55,14

0,95

7

60

35

Proteasa

52,97

52,43

52,70

0,38

8

60

40

Proteasa

48,73

49,31

49,02

0,41

TRATAMIENTO

% DE SUSTRATO

1

40

35

2

40

40

3

60

4

Lipasa y Proteasa

Figura 14.

Porcentaje (%) de Humedad

HUMEDAD 70,00

59,04

% de Humedad

60,00 50,00 37,41

40,00 30,00

55,14

52,70

6

7

42,91

49,02

30,85 23,95

20,00 10,00 0,00 1

2

3

4

5

8

Tratamiento

49

Hidrólisis enzimática de queso campesino y doble crema para la producción de aromas lácteos

Se puede observar que el mayor porcentaje de humedad se presenta en el tratamiento 5 y el menor en el 1. Todos los tratamientos que incluyeron lipasa dentro de la formulación, presentan en promedio un porcentaje de humedad bajo, mientras que en los tratamientos en los que se usó solamente proteasa, se observa un porcentaje de humedad alto, siendo los valores más altos dentro de de este grupo de tratamientos, aquellos en los que se usó 40% de sustrato inicial. Estos resultados muestran una posible influencia de la enzima usada dentro del proceso en el porcentaje de humedad final del producto, sin embargo, es posible que el contenido de humedad dentro del procesamiento de los 8 tratamientos, se haya visto afectado por las condiciones del mismo, al no haberlos realizados en un reactor cerrado, por lo cual, factores ambientales pudieron influir en la temperatura de hidrólisis, produciendo una mayor o menor pérdida de agua, afectando las características del producto final.

Aminifar y Emam-Djomeh, (2014), en un estudio que evaluó los cambios de textura, microestructutura y contenido de ácidos grasos libres durante una maduración acelerada de queso lighvan con lipasa, exponen que el porcentaje de humedad del producto final no es una medida de las características sensoriales del mismo, más si lo es, el porcentaje de humedad del sustrato inicial, ya que afecta la actividad enzimática de la enzima usada dentro del proceso.

Otro aspecto que se expone en este estudio es que, naturalmente, el queso pierde humedad a medida que madura pero mantiene propiedades como el contenido de grasa y proteína intactas; entonces, de acuerdo a lo anterior, se puede concluir que el porcentaje de humedad bajo, presentado en los tratamientos realizados con proteasa y lipasa, se debe a la acción de la las enzimas, sumada a la pérdida natural de humedad del sustrato y a los factores ambientales que pudieron influir dentro del proceso y finalmente, que la humedad, es un aspecto que influye en las características finales del producto, al afectar la actividad enzimática, dentro del proceso de hidrólisis. Estos resultados concuerdan con lo expuesto por Aminifar y Emam-Djomeh, (2014), 50

David Francisco Bernal Rodríguez

quienes concluyen que la humedad, junto con otras características como el contenido de grasa, proteína y pH, son determinantes en la liberación de ciertos componentes volátiles, entre ellos, varios ácidos grasos libres, que como ya se había mencionado anteriormente, son en su mayoría los responsables de la generación de aroma en el producto final.

A continuación la tabla 15 presenta el ANOVA realizado para la humedad: Tabla 15.

ANOVA para el porcentaje de humedad Grados

Fuentes de

Suma de

Variación

Cuadrados

Temperatura (A)

9,59450625

1

pH (B)

0,00075625

Concentración del sustrato (C)

Cuadrado

Fc

Ft

α

9,59450625

15,35121

5,32

0,05

1

0,00075625

0,00121

5,32

0,05

1631,554056

1

1631,554056

2610,48649

5,32

0,05

de libertad

medio

AB

159,9592563

1

159,9592563

255,93481

5,32

0,05

AC BC ABC

20,13765625 154,4427563 165,7012563

1 1 1

32,22025 247,10841 265,12201

5,32 5,32 5,32

0,05 0,05 0,05

Error

5

8

20,13765625 154,4427563 165,7012563 0,625

Total

2146,390244

15

De acuerdo al ANOVA se puede concluir que el porcentaje de humedad depende de varios factores influyentes dentro del proceso, como la temperatura usada, las características iniciales del sustrato, las enzimas usadas y de la interacción entre los mismos, más no depende de factores puntuales como la concentración y la temperatura.

3.5

pH

En la tabla 16 y en la figura 15 se presentan los resultados de pH para cada tratamiento con sus respectivas réplicas.

51

Hidrólisis enzimática de queso campesino y doble crema para la producción de aromas lácteos

Tabla 16.

Valores de pH TEMPERATURA (O

TIPO DE ENZIMA

C)

(S)

RÉPLICA 1

RÉPLICA 2

X

Desv.

Estándar

6

5,93

5,97

0,05

Lipasa y Proteasa

6,22

6,32

6,27

0,07

35

Lipasa y Proteasa

5,94

5,88

5,91

0,04

60

40

Lipasa y Proteasa

5,68

5,74

5,71

0,04

5

40

35

Proteasa

6,26

6,02

6,14

0,17

6

40

40

Proteasa

6,17

6,29

6,23

0,08

7

60

35

Proteasa

6,07

6,14

6,11

0,05

8

60

40

Proteasa

5,85

5,8

5,83

0,04

TRATAMIENTO

% DE SUSTRATO

1

40

35

2

40

40

3

60

4

Lipasa y Proteasa

Figura 15. pH del producto final

pH 6,40

6,27 6,14

Valor de pH

6,20 6,00

5,96

6,23 6,10

5,91

5,82 5,71

5,80 5,60 5,40 5,20 1

2

3

4

5

6

7

8

Tratamiento

Se puede observar que el pH

final se encuentra entre 5 y 7,

independientemente de las condiciones usadas en la hidrólisis, sin embargo, cabe anotar que en todas las muestras el valor de pH tiende a 6, valor que sería el adecuado para realizar la hidrólisis; adicionalmente, en todos los 52

David Francisco Bernal Rodríguez

tratamientos se produjo una reducción del pH, esto debido a la ruptura de los enlaces peptídicos por acción de la proteasa, lo que está en concordancia con lo expuesto por Benítez, R.; et al, (2008) en un estudio realizado sobre los procesos y las aplicaciones de los hidrolizados de proteína.

El pH de las muestras, no se ve afectado significativamente por ninguno de los otros dos factores involucrados dentro del proceso, ni por las interacciones entre los mismos, tal y como se puede observar en la tabla 16 de ANOVA para el pH, presentando el valor más bajo Fc la temperatura, seguida por la concentración del sustrato. Lo anterior está de acuerdo con lo expuesto por Aminifar y Emam-Djomeh, (2014), en su estudio que evaluó los cambios de textura, microestructutura y contenido de ácidos grasos libres durante una maduración acelerada de queso lighvan con lipasa.

Tabla 17.

ANOVA para el pH Grados

Fuentes de

Suma de

Variación

Cuadrados

Temperatura (A)

0,00180625

1

pH (B)

0,27825625

Concentración del sustrato (C)

Cuadrado

Fc

Ft

α

0,00180625

0,00289

5,32

0,05

1

0,27825625

0,44521

5,32

0,05

0,04950625

1

0,04950625

0,07921

5,32

0,05

AB

0,19140625

1

0,19140625

0,30625

5,32

0,05

AC BC ABC Error Total

0,02175625 0,00765625 0,00455625 5 5,55494375

1 1 1 8 15

0,02175625 0,00765625 0,00455625 0,625

0,03481 0,01225 0,00729

5,32 5,32 5,32

0,05 0,05 0,05

de libertad

medio

De acuerdo a lo anterior se puede concluir que el pH se encuentra directamente relacionado con la ruptura de enlaces peptídicos en el caso del uso de proteasa durante la hidrólisis, por lo tanto se puede deducir que a una reducción alta de pH, la formación de aminoácidos es alta durante la hidrólisis.

53

Hidrólisis enzimática de queso campesino y doble crema para la producción de aromas lácteos

En el caso de uso de lipasa, ésta no representa un cambio significativo dentro de la hidrólisis, en cuanto al valor de pH se refiere, por lo que su uso se encuentra más relacionado a la liberación de ácidos grasos libres para la formación de sabor en el producto final.

Para culminar con los análisis de las mediciones efectuadas, las figuras 16, 17 y 18 presentan la correlación existente entre cada una de las mismas: Figura 16.

Correlación Humedad – Índice de acidez

Correlación Humedad - Acidez 70,00

% de humedad

60,00 50,00 40,00 30,00

R² = 0,858

20,00 10,00

0,00 0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

Índice de acidez (mgKOH/g)

A pesar de que se observa que a medida que el índice de acidez aumenta, el porcentaje de humedad disminuye, el coeficiente obtenido dentro de los análisis de R2=0,858 es muy bajo, lo que indica que no existe correlación entre las variables. Por lo tanto, estas variables son independientes y sus valores dependen de otro tipo de factores usados dentro del proceso.

54

David Francisco Bernal Rodríguez

Figura 17.

Correlación Humedad – pH

Correlación Humedad - pH 70,00

% de humedad

60,00 50,00 40,00

R² = 0,1939

30,00 20,00 10,00 0,00 5,60

5,70

5,80

5,90

6,00

6,10

6,20

6,30

pH

En este caso, nuevamente se obtuvo un coeficiente R 2= 0,1939 todavía más bajo que en el caso anterior, por lo que se puede concluir que el pH no presenta correlación con el porcentaje de humedad, lo cual se encuentra acorde con Aminifar y Emam-Djomeh, (2014). Estas variables, al igual que en el caso anterior, se ven afectadas por otro tipo de factores, por ejemplo, la liberación de aminoácidos por acción de la proteasa, en el caso del pH y por la temperatura en el caso del porcentaje de humedad.

55

Hidrólisis enzimática de queso campesino y doble crema para la producción de aromas lácteos

Figura 18.

Correlación Acidez – pH

Correlación Acidez - pH 7,00

Índice de Acidez

6,00 5,00 4,00 3,00

R² = 0,424

2,00 1,00 0,00 5,60

5,70

5,80

5,90

6,00

6,10

6,20

6,30

pH

Se puede observar que no existe correlación entre las variables. Se obtuvo un coeficiente R2=0,424 bajo, lo que indica la no correlación entre las mismas, sin embargo, se observa una tendencia del pH a subir, cuando el índice de acidez baja, lo cual está acorde con Benítez, et al (2008). El índice de acidez se ve afectado únicamente por la actividad enzimática de la lipasa y la posterior liberación de ácidos grasos y, de otro lado, el pH se ve afectado por la actividad enzimática de la proteasa y la posterior liberación de aminoácidos.

56

David Francisco Bernal Rodríguez

3.6

Análisis Sensorial

Los resultados del análisis sensorial se dividen en dos partes: El análisis preliminar para la escogencia de las 2 muestras con mejores características sensoriales para su aplicación en snack (chitos), realizado por 2 panelistas entrenados y por el autor y la prueba de preferencia realizada por 10 panelistas entrenados.

La tabla 18 muestra los resultados de intensidad obtenidos para cada nota de sabor durante el análisis preliminar de los 8 tratamientos: Tabla18.

Valores de intensidad de cada muestra de acuerdo a la nota de sabor Muestra Nota

1

2

3

4

5

6

7

8

7,0

7,0

7,0

7,0

7,0

7,0

7,0

7,0

5,0

5,5

5,5

5,0

5,5

5,0

5,5

5,0

8,5

7,5

7,5

8,5

7,5

8,5

7,5

8,5

7,5

7,0

7,0

7,5

7,0

7,5

6,5

8,0

4,0

4,0

4,0

4,0

5,0

4,5

5,0

4,0

8,0

7,8

7,8

8,0

7,8

8,0

7,5

8,0

6,5

7,0

7,0

6,5

7,0

6,5

7,0

6,5

8,5

8,0

8,0

8,5

8,5

8,8

8,2

8,5

7,0

6,0

6,0

7,0

6,0

7,0

6,0

7,0

5,0

4,0

4,0

5,0

4,0

5,0

4,5

5,0

4,0

5,0

5,0

4,0

5,0

4,0

5,0

4,0

5,0

5,0

5,0

5,0

5,0

5,0

5,0

5,0

4,0

4,0

4,0

4,0

4,0

4,0

4,0

4,5

6,0

3,0

3,0

6,0

3,0

6,0

3,0

6,0

8,5

7,8

8,0

8,0

7,8

8,5

7,6

8,5

8,5 9,5

7,9 8,0

8,0 8,0

8,0 8,5

7,9 8,5

8,5 9,2

7,5 8,0

8,5 9,0

OTA

Salado Dulce Ácido Umami Amargo Butírico Lácteo Lactónico Frutal Maduro Suero Grasoso Mantequilla Fermentado Impacto Sensación bucal Sabor residual

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Hidrólisis enzimática de queso campesino y doble crema para la producción de aromas lácteos

Las figuras 19 y 20 muestran los resultados de los perfiles de sabor de las muestras y el perfil de las dos mejores muestras, en cuanto a características sensoriales se refiere y de acuerdo a las notas exhibidas por cada una de ellas, en comparación con una muestra identificada como referencia (Ref.) que no contiene el producto terminado; y la figura 21 muestra los perfiles de sabor caracterizados por Van Leuven, et al; (2008), en un estudio sobre la caracterización del aroma de queso tipo gouda y con el cual se pueden comparar los resultados obtenidos, observando los resultados expuestos en el mismo, transcurridas 6 semanas de maduración.

Figura 19.

Intensidad de las muestras de acuerdo a las notas de sabor

58

David Francisco Bernal RodrĂ­guez

Figura 20.

Intensidad de las dos mejores muestras de acuerdo a las notas de sabor

Figura 21.

Puntaje Sensorial para el sabor de queso Gouda, despuĂŠs de 6 semanas, 4 y 10 meses de maduraciĂłn.

Fuente: Van Leuven, et al; (2008).

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Hidrólisis enzimática de queso campesino y doble crema para la producción de aromas lácteos

De acuerdo a las anteriores gráficas se puede concluir que las muestras presentan un marcado perfil de notas lactónicas, butíricas, lácteas, mantequillosas y cremosas, de un alto nivel de sabor residual, impacto y sensación bucal, lo cual se encuentra en concordancia por lo expuesto por Miri M. y Habibi Najafi M. (2010), en un estudio sobre el efecto en las propiedades sensoriales y de textura al añadir queso modificado enzimáticamente en cremas de queso con bajo y alto contenido de grasa y también con Van Leuven, et al; (2008).

A partir del análisis preliminar, y de acuerdo al perfil obtenido de las muestras, se observó que las muestras que presentaban mejores características sensoriales fueron las muestras número 1 y 2, las cuales fueron obtenidas con la mezcla de las dos enzimas, cada una con un tipo diferente de queso usado como sustrato en una proporción del 40% y bajo 40ºC de temperatura. Con estas muestras se procedió a realizar la aplicación en un producto tipo snack, en este caso un extruido de maíz, que en el país se le conocen comúnmente como ‘chitos’, usando una dosis estándar de aplicación de un sazonador para este tipo de productos de 8% + 0.5 de NaCl, el cuál incluía dentro de su formulación 10 % del EMC obtenido. Las figuras 22 y 23 muestran el extruido con los sazonadores aplicados y una tercera con un sazonador que no contiene el producto terminado.

Figura 22.

Extruidos con los sazonadores aplicados (10% EMC)

60

David Francisco Bernal Rodr铆guez

Figura 23.

Extruido con sazonador aplicado

A continuaci贸n, la tabla 19 muestra los comentarios realizados por los panelistas entrenados luego de la aplicaci贸n de la prueba de preferencia y el ranking escogido por cada uno de ellos, siendo 1 el de m谩s preferencia y 3 el de menos.

61

Hidrólisis enzimática de queso campesino y doble crema para la producción de aromas lácteos

Tabla 19.

Comentarios de los panelistas

Panelista 1

2

3

4 5 6 7 8 9 10

Código muestra4

Preferencia

Comentarios

380

1

494

2

117

3

712

1

803

2

629

3

380

1

494

2

117

3

712

1

629

2

803

3

803 712 629 117 494 380 803 712 629 380 117

1 2 3 3 2 1 2 1 3 2 3

494

1

803

1

629 712 629 803 712

2 3 3 1 2

No tiene notas extrañas (rancias) Tiene una nota pesada a grasa algo rancia Nota grasa fuerte, cauchosa Es un poco más ácida pero el residual cremoso lácteo Nota butírica de queso maduro grasoso Más butírica menos nota cremosa láctea de fondo Tiene más sal, más cremoso, nota queso cheddar Más impacto de la base, menos sal, queso madurado Impacto en base, pico de queso madurado, isovalérico Sabor característico, buen sabor residual Más cremoso pero se pierde rápido Nota butírica elevada, sabor residual agrio Notas a caramelo, lácteas Más ácido, más dulce Sabor débil, rancio, notas de caprino Nota butírica, lactónica Rancio, grasoso Nota láctea, queso, crema Queso madurado, láctico Más ácido, cremoso Nota butírica, menos cremoso Más salado, cremoso Queso madurado, lactónico Menos salado, queso madurado, caproico Mucha nota butírica, agrio, sabor residual fuerte Cremoso, sabor residual débil Queso, dulce, lácteo cremoso Nota caprinica, rancio Notas lácteas, cremosas, dulces Más ácido, butírico

Como se puede observar, en general los comentarios de los panelistas tienden a describir notas lácteas, butíricas, rancias, ácidas y lactónicas, en las dos muestras que contienen el sazonador con EMC. Lo anterior se encuentra acorde a la proporción de liberación de ácidos grasos de cadena corta y media 4

Códigos 380/712: Sazonador sin EMC 494/803: Sazonador con EMC de queso campesino al 10% 117/629: Sazonador con EMC de queso doble crema al 10%

62

David Francisco Bernal Rodríguez

(butírico, láctico, caproico) los cuales generan en su gran mayoría el sabor característico del queso. Lo anterior se encuentra de acuerdo con los resultados expuestos por Delgado F.; et al, (2009), en un estudio sobre los cambios en la oxidación y contenido de ácidos grasos libres del queso suave español, conocido como ‘Torta del casar’, durante su maduración y con Van Leuven I.; et al, (2008), en un estudio sobre la caracterización del aroma de queso tipo Gouda.

La figura 24 muestra la preferencia de los panelistas, de acuerdo a los resultados obtenidos en el panel sensorial.

Figura 24. % de preferencia de las muestras

Preferencia (%)

30

EMC Q. Campesino EMC Q. Doble crema

60 10

Sin EMC

De acuerdo a la gráfica, se puede observar que más de la mitad de los panelistas prefieren la muestra que no contiene el sazonador con EMC, sobre las que sí lo incluyen. Lo anterior puede deberse a la cultura propia del país con respecto al sabor usual para este tipo de productos, debido a que la población en general no se encuentra acostumbrada a sabores tan intensos y fuertes como los exhibidos por las muestras que contienen el EMC, los cuales son típicos de quesos madurados, como por ejemplo, el queso azul, los cuales 63

Hidrólisis enzimática de queso campesino y doble crema para la producción de aromas lácteos

no son consumidos en grandes cantidades en el país. Puede concluirse que de acuerdo a estos resultados, los productos obtenidos no serían recomendables para su aplicación usando la dosis establecida en las mismas, para este tipo de productos; sin embargo, puede realizarse una evaluación posterior bajando la dosis de aplicación y así poder verificar la respuesta de un nuevo panel sensorial.

La figura 25 muestra los promedios de preferencia de las muestras evaluadas.

Figura 25.

Promedio de las calificaciones de preferencia de las muestras

Evaluación Sensorial 6 Nivel esperado Nivel de disgusto

5 4 3 2 1

0 EMC Q. Campesino

EMC Q. Doble crema

Sin EMC

Se observa que la muestra que más se acerca al nivel esperado de 1 es la que no tiene EMC con un valor promedio de 1,5 seguida de la muestra de EMC de queso Campesino con un valor de 1,8 y por último se encuentra la muestra de EMC de queso doble crema con un valor de 2,8. Con esto se puede afirmar que la muestra sin EMC es la que tiene mayor preferencia y la que tendría una mejor aceptación por el consumidor.

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David Francisco Bernal Rodríguez

4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES Del presente trabajo de grado se pueden sacar las siguientes conclusiones y recomendaciones:

1. De acuerdo a las características finales del producto, la mezcla entre lipasa y proteasa es la mejor para su uso dentro de la hidrólisis.

2. De acuerdo a la percepción sensorial del producto, es necesario realizar nuevas aplicaciones a dosis más bajas para verificar nuevamente su aceptabilidad.

3. Con respecto al análisis sensorial, los mejores perfiles de sabor se obtuvieron con las muestras procesadas a 40º C y con 40% de sustrato inicial.

4. Las muestras que más gustaron a los panelistas fueron las que no contenían el producto terminado dentro de la formulación del sazonador aplicado.

5. Los factores más influyentes dentro del proceso de hidrólisis son la temperatura y la concentración del sustrato.

6. Se recomienda realizar el proceso de hidrólisis dentro de un reactor cerrado, bajo condiciones controladas, para evitar que factores externos afecten la eficiencia del proceso.

7. Se recomienda realizar estudios en cuanto a la vida útil y cambios de textura del producto tipo snack con el producto final aplicado.

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Hidrólisis enzimática de queso campesino y doble crema para la producción de aromas lácteos

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Anexo A

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