Tesis / 0021 / I.AG. by MAOSABO

OBTENCIÓN DE COLORANTE NATURAL DE LA SEMILLA DE AGUACATE EN DOS VARIEDADES (Lorena y Hass), COMO ALTERNATIVA PARA LA AGROINDUSTRIA.

NESTOR OCTAVIO DUEÑAS SARMIENTO

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA AGRARIA DE COLOMBIA PROGRAMA DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL BOGOTÁ D.C. 2016

NESTOR OCTAVIO DUEÑAS SARMIENTO

TRABAJO DE GRADO PRESENTADO COMO REQUISITO PARA OPTAR AL TÍTULO DE INGENIERO AGROINDUSTRIAL

DIRECTOR ING. DEIVIS SUÁREZ RIVERO INGENIERO AGRÓNOMO MÁSTER EN BIOLOGÍA VEGETAL

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA AGRARIA DE COLOMBIA PROGRAMA DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL BOGOTÁ D.C. 2015

Nota de aceptaci贸n: ______________________________ ______________________________ ______________________________ ______________________________ ______________________________

_____________________________________ Firma del presidente del jurado

_____________________________________ Firma del jurado

Bogot谩, D.C. ___________de ______________de 2015 III

DEDICATORIA.

A Dios por iluminarme y darme fuerzas cada día de mi vida, a mis familiares y amigos pero en especial a mi madre, padre y hermanos que a lo largo de mi vida han velado por mi bienestar y educación siendo mi pilar fundamental.

¡Gracias!

AGRADECIMIENTO

El autor expresa su agradecimiento a:

A ti Dios, que me diste la vida y esta gran oportunidad, a ti que has sabido guiarme por el buen camino, darme las fuerzas para seguir adelante y no declinar en los problemas que se presentaban, enseñándome a enfrentar las adversidades sin perder nunca la dignidad ni desfallecer en el intento, que has sido mi guía y me permitiste haber llegado hasta este momento tan importante de mi formación profesional. Con mucho cariño a mis padres que me dieron la vida y han estado apoyándome en todo momento. Mamá, no me equivoco si digo que eres la mejor mamá del mundo; gracias por tu apoyo, tu gran esfuerzo, comprensión, la confianza que depositaste en mí y haberme sabido guiar con valores durante toda mi vida. A mi papá, quien cada día que llegaba me preguntaba cómo me había ido, me escuchaba y siempre tuvo un consejo para guiarme en las diferentes circunstancias de esta vida. A mis hermanos Oscar, Sandra y Jorge, que de una u otra manera son la razón por la cual me vi en este punto de mi vida, a puertas del título profesional tan anhelado. Al Ingeniero Deivis Suárez, al cual deseo reconocer su trabajo y dedicación permanente y continua al presente trabajo de investigación, así como sus sugerencias y observaciones siempre inteligentes y oportunas. A la Fundación Universitaria Agraria de Colombia, en especial a la dirección del programa de Ingeniería Agroindustrial y todos los docentes que la componen por haberme brindado conocimientos y apoyo durante mi proceso de formación.

El tiempo de Dios es perfecto, y este es mi momento.

CONTENIDO Pรกgina

RESUMEN

ABSTRACT

INTRODUCCION

1. PROBLEMA

2. OBJETIVOS

3. MARCO TEORICO

3.1. GENERALIDADES MORFOLOGICAS DEL AGUACATERO.

3.2. VARIEDADES Y PRINCIPALES CARACTERISTICAS.

3.3. TEORIA DE LOS COLORANTES.

3.4. CARACTERISTICAS QUIMICAS DE LOS COLORANTES.

3.5. FLAVONOIDES.

3.6. ANTOXIANINAS

3.7. METODOS DE EXTRACCION

3.7.1. Extracción mediante maceración dinámica con reflujo.

3.7.2. Extracción Soxhlet.

3.7.3. Arrastre con vapor

3.7.4. Extracción con fluidos súper críticos.

3.7.5 Pulverización del colorante.

3.8. ESPECTOFOTOMETRIA.

4.8.1. Fundamento del proceso.

4.8.2. Ley de Beer.

4. MATERIALESY MÉTODOS.

4.1. LOCALIZACION DE ESTUDIO.

4.2. MATERIALES.

4.2.1. Descripción del material vegetal.

4.2.2 Descripción del material de laboratorio.

4.2.3. Reactivos.

4.3. EQUIPOS.

4.4. MÉTODOS.

4.4.1. Preselección de la semilla.

VII

4.4.2. Desinfección de las semillas.

4.4.3. Reducción de tamaño.

4.4.4. Preparación del solvente.

4.4.5. Extracción del colorante.

4.4.6. Filtración.

4.4.7. Destilación.

4.4.8. Secado.

4.4.9. Análisis Espectrofotométrico.

4.5. DISEÑO EXPERIMENTAL

4.5.1. Contexto del diseño experimental.

4.5.2. Variables.

4.5.3. Factores de estudio.

4.5.4. Tratamientos

4.5.5. Análisis estadístico de los datos.

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

5.1. PRETRATAMIENTOS APLICADOS A LA SEMILLA DEL AGUACATE (Persea americana L.).

5.1.1. Pretratamiento de la semilla de aguacate (Persea americana L. var. Lorena y var. Hass).

5.2. EFECTO DEL TIPO DE SOLVENTE Y ESTADO DE LA SEMILLA SOBRE EL RENDIMIENTO DEL EXTRACTO EN (Persea americana L. var. Lorena y var. Hass).BAJO DIFERENTES CONDICIONES DE EXTRACCION.

5.2.1. Cantidad y rendimiento de extracto obtenido de la semilla de Aguacate (Persea americana L. var. Lorena y var. Hass).

5.2.2. Análisis por métodos cualitativos de la concentración del extracto obtenido de las semillas Persea americana L. var. Lorena y var. Hass.

5.3. IDENTIFICACION TEORICA DEL USO POTENCIAL DE LOS COLORANTES OBTENIDOS PARTIENDO DE SU COMPOCICION QUIMICA. VIII

CONCLUCIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFIA

LISTA DE TABLAS IX

Página

Tabla 1. Clasificación taxonómica de la planta de Persea americana Mill.

Tabla 2. Principales características por tipo de variedad de aguacate.

Tabla 3. Características químicas de los colorantes naturales.

Tabla 4. Descripción de materiales de laboratorio.

Tabla 5. Factores de estudio.

Tabla 6. Tratamiento de estudio.

Tabla 7. Extracción del colorante de la semilla de aguacate

Tabla 8. Peso de la semilla obtenida.

Tabla 9. Resumen estadístico para el peso (g) de las semillas empleadas para los procesos de extracción Tabla 10. Rendimientos del colorante.

26 27

Tabla 11. Resumen estadístico para el rendimiento (%) del colorante

Tabla 12. Mediciones de absorbancia.

Tabla 13. Resumen estadístico para la absorbancia.

Tabla 14. Concentración del colorante.

Tabla 15. Resumen estadístico para la concentración del colorante.

Tabla 16. Correlación existente entre las variables en estudio.

LISTA DE FIGURAS Página

Figura 1. Estructura química de los flavonoides.

Figura 2. (a). Estructura básica de las antocianinas. (b). Estructura de los monosacáridos más comunes encontrados en las estructuras de las antocianinas.

Figura 3. Equipo de Extracción con Maceración Dinámica con reflujo.

Figura 4 Esquema de extracción sachet

Figura 5. Diagrama general de destilación por arrastre con vapor a escala laboratorio

Figura 6. Diagrama general de un proceso de extracción con SCF.

Figura 7. Localización del estudio, Fundación Universitaria Agraria de Colombia

Figura 8. Proceso de adecuación y desinfección de la materia prima.

Figura 9. Proceso de reducción del tamaño de partículas.

Figura 10. Sistema de reflujo para la extracción de colorantes.

Figura 11. Proceso de extracción por método Reflujo Directo.

Figura 12. Pretratamiento semilla Variedad Lorena.

Figura 13. Pretratamiento semilla variedad Hass.

Figura 14. GrĂĄfico de medias que expresa los resultados de la prueba de rangos mĂşltiples con un nivel de significancia del 95%.

Figura 15. Promedios de rendimiento de extracciĂłn de semilla de aguacate (Persea americana L. var. Lorena y var. Hass) con un nivel de significancia del 95%.

Figura 16. Concentraciones del extracto obtenido de las semillas de Persea americana L. var. Lorena y var. Hass con un nivel de significancia del 95%.

XII

RESUMEN

El fruto del aguacate un producto agrícola de gran valor nutricional. Estudios han demostrado que aproximadamente un 20% del peso total corresponden a semillas y piel (exocarpo). Este porcentaje, principalmente considerado desecho por la industria transformadora y por parte de los consumidores directos se constituye en una fuente de materia prima de alto valor agroindustrial. Es por lo anterior que esta investigación pretendió determinar el rendimiento del colorante natural proveniente de la semilla en dos variedades de Persea americana L. var. Lorena y var. Hass bajo diferentes condiciones de extracción. Para ello se establecieron tres factores de estudio, cada uno con dos niveles, siendo estos la variedad del aguacatero (Lorena y Hass), el tipo del solvente (Etanol y Éter de Petróleo) y el estado de presentación de la semilla (fresca y seca). Los resultados obtenidos indican que los mejores resultados en cuanto a rendimiento del extracto se presentaron para semillas frescas cuando se empleó el etanol como solvente, indistintamente de la variedad. Por su parte, se evidenció que la mayor concentración de colorante se reporta para la variedad Hass, en estado seco indistintamente del solvente. El mayor uso de estos colorantes ha sido reportado para la industria textil, lo que incrementaría el valor agroindustrial de la cadena productiva del aguacatero. Palabras Claves: Semilla, aguacate, colorante, extracción, concentración y solventes.

ABSTRACT

It is the fruit of the avocado an agricultural product of great nutritional value, except that studies have shown that approximately 20% of the total weight of seeds and skin (excerpt) corresponds. This percentage mainly considered waste by the processing industry and by direct consumers it constitutes a source of raw material high agribusiness value. Itâ&#x20AC;&#x2122;s for this that this research sought to determine the performance of natural dye from seed in two varieties of Persea americana L. var. Lorena and var. Hass under different extraction conditions. For this study three factors, each with two levels, these being the variety of avocado (Lorena and Hass), the type of solvent (ethanol and petroleum ether) and the status of submission of the seed (fresh and dry settled). The results indicate that the best results in terms of performance of the extract were submitted for fresh seeds when ethanol was used as solvent, regardless of the variety. Meanwhile, to analyze the concentration of the dye, it was shown that the highest concentration reported for the variety Hass, dry regardless of the solvent. The increased use of these dyes has been reported for the textile industry, which would increase the value of agribusiness production chain avocado.

Keywords: Seed, avocado, color, extraction, concentration and solvents.

INTRODUCCIÓN

Existe una tendencia tanto en Colombia como alrededor del mundo respecto a la demanda de productos naturales y orgánicos, como consecuencia de los efectos de hiperactividad y alergias encontradas en algunos consumidores que, según estudios realizados por entidades europeas y americanas, son ocasionadas por algunos aditivos sintéticos entre los que se encuentran: Rojo allurra AC (Red 40), Ponceau 4R, Tartracina (Amarillo 5), amarillo ocaso FCF/ amarillo anaranjado S (Yellow6), Amarillo de quinoleína y Carmoisina (Gaviria Mejía, 2012). Estudios realizados por la Universidad de Pennsylvania en el 2010, indican que después de procesar y dejar oxidar la semilla de aguacate, se obtiene un colorante naranja que puede ser utilizado en la industria de alimentos además de brindar beneficios adicionales como antioxidante, actividad anti cancerígena y antiinflamatoria (Dabas, 2011). Esto, representa una oportunidad de negocio para los actores de la cadena agroindustrial del fruto, para quienes lo procesan y obtienen como desperdicio la semilla que representa un 16% de su peso y no tiene aún ningún uso industrial. Mundialmente se ha incrementado el consumo de aguacate, que marca una senda creciente de forma constante previniéndose un amento del mismo hasta llegar a superar los 2.400 millones de dólares en 2029 especialmente en países como Estados Unidos que absorbe más del 40% del total , Francia, Alemania y España el restante. Los principales 20 países productores de aguacate, produjeron 3.5 millones toneladas (mt). México se destaca como el principal productor con 1.2 mt. Cantidad que representa el 35% de la producción de este grupo. Chile es el segundo país productor, su producción alcanza 328 mil toneladas. Destaca también Indonesia y Republica Dominicana como importantes productores (Subsecretaria de fomento a los agronegocios, 2011). En Colombia hay sembradas 21.801 hectáreas de aguacate distribuidas de la siguiente manera: nativos o criollos 10.645 hectáreas que corresponden al 49% del área, 5.695 hectáreas de Hass que corresponden al 26% y 5.460 hectáreas de aguacates piles verdes que hacen el 25% restante (Consejo nacional del aguacate en Colombia, 2011). Dado lo anterior, el presente proyecto de investigación pretendió contribuir al aprovechamiento de una subproducto hasta ahora desechado, añadiéndole valor agregado a la cadena productiva del aguacatero (Persea americana L. var. Lorena y Hass). Adicionalmente, este proyecto consolida las bases para la producción de colorantes de origen vegetal con fuentes de materia prima de bajo costo y sin 3

competir con la alimentación humana. Otro aspecto a resaltar es la importancia que esto reviste en los planes de manejo ambiental para las empresas procesadoras, puesto que con metodologías como las aplicadas en este, no solo podrán mejorar sus ingresos con cadenas alternativas de producción, sino que reducirán la emisión de residuos sólidos al medio ambiente.

1. PROBLEMA

Tomando como referente lo indicado anteriormente y teniendo en cuanta que no se han evidenciado los rendimientos en colorante para las dos variedades en evaluación cuando se varían las condiciones de extracción y el estado de presentación de las semillas, esta investigación se propuso dar respuesta a la siguiente pregunta científica:

¿Qué influencia ejercen las condiciones de extracción (tipo de solvente y estado de la semilla) y la variedad de aguacate sobre el rendimiento en colorantes naturales obtenidos de semillas de aguacatero?

2. OBJETIVOS

Para dar solución a la pregunta científica, el objetivo general a desarrollar en este trabajo es:

Determinar el rendimiento del colorante natural proveniente de la semilla en dos variedades de Persea americana L. var. Lorena y Hass bajo diferentes condiciones de extracción por el método de reflujo directo.

Para lo cual se plantean los siguientes objetivos específicos:



Evaluar el efecto del tipo de solvente y el estado de la semilla sobre el rendimiento del extracto en Persea americana L. var. Lorena y Hass.



Analizar por métodos cualitativo la concentración del extracto obtenido de las semillas de Persea americana L. var. Lorena y Hass.



Identificar teóricamente el uso potencial de los colorantes obtenidos partiendo de su composición química.

3. MARCO TEORICO

Con el fin de puntualizar el marco en el que se desarrolla el proyecto para la determinación del rendimiento del colorante natural en dos variedades con diferentes condiciones de extracción, a continuación se describen aspectos específicos concernientes al contexto general y al proceso experimental del mismo. 3.1. GENERALIDADES BIOLÓGICAS DEL AGUACATERO El aguacate es una fruta que tiene un alto potencial, gracias a su aceptado consumo en fresco y las cualidades que tiene para su procesamiento agroindustrial. Actualmente se cultiva en 59 países tropicales y regiones subtropicales (Bernal & Cipriano, 2008). México ocupa el primer lugar en plantaciones comerciales con 49% del área total cultivada en el mundo, seguido de Colombia con el 13%, posterior se encuentran Chile con 10% y Estados Unidos con 7%; otros países productores son Sud África, Israel, Perú, Australia, España, Kenia, entre otros, los cuales suman el 21% restante (Guerrero et al., 2011; Mejía, 2010). El aguacate pertenece a la familia de las Lauráceas (ver clasificación taxonómica en la tabla 1), que está formada por 52 géneros y cerca de 3.500 especies; esta es una de las familias más primitivas de las dicotiledóneas. En esta familia hay especies de gran importancia económica, productoras de aceites esenciales, como el alcanfor (Cinnamomun camphora) y de especias como la canela (Cinnamomun zeylanicum Ness) y maderas finas. El género Persea está formado por 150 especies distribuidas, en las regiones tropicales y subtropicales, especialmente en Asia, Islas Canarias y América, donde existen 80 especies. El género está formado por árboles de hojas coriáceas y aromáticas; inflorescencias axilares o subterminales, dispuestas en panículas corimbosas o racimosas; flores pediceladas o sésiles, hermafroditas, con ovario globoso y subgloboso, estilo delgado, estigma triangular peldado; frutos en bayas globosas o elípticas. (Tecnologías para el cultivo del aguacate. Pág. 15) Tabla 1. Clasificación taxonómica de la planta de Persea americana Mill. Reino Sub- reino Filo Clase Sub-clase Orden Familia Género Especie

Plantae (Phytae) Tracheobionta Magnoliophita Magnoliopsida (Magnoliatae) Magnoliidae Laurales Lauraceae Persea Persea americana Miller Fuente: (IIAP, 2001)

La semilla por su parte, está compuesta por una cubierta seminal que en frutos inmaduros es blanca gruesa y carnosa y, cuando se marchita, deja de crecer pues no hay abastecimiento de nutrientes hacia ella. La semilla, a su vez se deriva del tegumento interno y externo, en los cuales se encuentran células irregulares llenas de taninos; y por un embrión que es multicelular y esférico. (Barrientos Priego, García Villanueva, & E., 1996) Las semillas de aguacate contienen alcoholes polihidroxilados, azúcares poco encontrados en la naturaleza, avocatina y ácidos grasos. De ella se extrae un colorante, una antocianina que sirve para teñir tejidos naturales y alimentos. Cumplen el papel de reducir enfermedades coronarias, cáncer, diabetes, además tienen efectos antinflamatorios, que brindan valor agregado a quienes los consumen (Guerreo Escobar, 2010). La semilla del aguacate representa casi el 16% en relación al peso del fruto y es totalmente subutilizada en las industrias alimenticias que trabajan con el aguacate (García Fajardo, 1999), por lo que es una razón adicional para sacar provecho de su procesamiento para productos derivados y de altos atributos que representen mejoras en el sector industrial y ambiental como es el caso de los colorantes para alimentos (Barrientos Priego, García Villanueva, & E., 1996). Según estadísticas de la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (2011), en los últimos años el consumo de aguacate a nivel mundial ha tenido un crecimiento significativo, pasando de 482 gramos por habitante/año en 2001, a 675 gramos por habitante/año en 2011. Lo anterior significa que el consumo de la fruta tuvo un crecimiento del 39,9% en tan solo 10 años, lo cual lo sitúa en un importante lugar tanto en consumo como en producción, exportación e importación a nivel mundial. 3.2. VARIEDADES Y PRINCIPALES CARACTERÍSTICAS. Actualmente y acorde a la clasificación de Wilson Popenoe (1934), existen tres taxones o subespecies distintas de aguacate: la mexicana, la guatemalteca y la antillana o de las tierras bajas. Este autor reconoció que estas ya habían sido identificadas y diferenciadas anteriormente por Fray Bernabé Cobo en 1653, en su “Historia del Nuevo Mundo”. En la Tabla 2 se analizan las principales características de cada una de estas subespecies

Tabla 2. Principales características por tipo de variedad de aguacate Raza

Altura

Antillana

Menor a 1.000 msnm

Guatemal teca

Entre 1.000 y 2.000 msnm

Mexicana

De más de 1.700 msnm

Temperatura

Altitud

Peso

Entre 18 ºC y 26 ºC

Entre 75mm y 250 mm

Entre 250gr y 2.500 gr

Entre 75mm y 250mm

Entre 120 gr y 1500 gr

Entre 30mm 80mm

Entre 80gr y 250 gr

Entre 19ºC

4ºC

Hasta 2.2 ºC

Contenido Graso

Entre 5% y 15 %

Entre el 5% y 15%

Hasta el 30%

Contenido Azúcar

Variedad

Lorena, Peterson,Wilson,S immonds, Booth y Catalina, Criollo

Choquete,Hass, Simpson, Guatemala, Linda, Reed, Itzama,Fujikawa, Hall

Azteca, Fuerte, Nabal, Ettinger,Bacon, Duke,Wurtz

Fuente: Modificado de Smith et al, 1992.

3.3. TEORÍA DE LOS COLORANTES Los colorantes son sustancias que dan color a los alimentos, drogas, cosméticos, textiles y hasta al mismo cuerpo humano; son los responsables de hacer a estos productos atractivos e informativos, mejorando su aspecto visual y dando respuesta a las expectativas del consumidor. (IESN, 2011). Se pueden diferenciar entre pigmentos (que mantienen su estructura cristalina) y tintes (que pierden la estructura cristalina cuando se disuelven o vaporizan).El colorante extraído de la semilla de aguacate es un tanino que además de cumplir la función de pigmento también puede curtir pieles. (Guerreo Escobar, 2010) Los aditivos para alimentos, dotados o no de valor nutritivo, son agregados intencionalmente bajo la mínima cantidad necesaria a los alimentos con el fin de impedir alteraciones, mantener, conferir o intensificar su aroma, color o sabor, modificar o mantener su estado físico general o ejercer cualquier función necesaria para una buena tecnología de fabricación del alimento (Decreto 2106/83 del Ministerio de Salud de la República de Colombia). 3.4. CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS DE LOS COLORANTES NATURALES. Los colorantes naturales pueden ser clasificados, según su naturaleza química en diversos grupos (ver tabla 3). Como fuentes naturales de estos colorantes se pueden considerar las plantas superiores, las algas, hongos y líquenes, algunos insectos, así como algunos organismos marinos invertebrados. La función de 9

diversos pigmentos que se encuentran en forma natural en plantas y animales es muy variada, tal es el caso de algunos fenoles que absorben la luz ultravioleta y pueden desempeñar la función de guiar a los insectos a las flores para realizar la polinización. Las quinonas (compuestos fenólicos) pueden actuar como sustancias tóxicas para defensa, (Domínguez, 2002). Tabla 3. Características químicas de los colorantes naturales. COLORANTE

GRUPO Flanovol Flavonona Colorante flavonoides Calcano Antocianina Caroteno Colorantes carotenoides Xentofilia Colorantes tipo Antroquina quinona Naftoquinona Derivados del indol Derivados de Delfinidina Derivados de Dihidropilano Grupo Betaleina Grupo Xantonas Grupo clorofila

COLOR Amarillo Crema amarillo Rojo y amarillo Rojo y violeta Anaranjado Amarillo Rojo Violeta Azul Azul Rojo y violeta Rojo Amarillo Verde

PROCEDENCIA Bidens Perejil Cártamo tinantía Zanahoria Achiote Rubia cochinilla Henna Añil Hierba de pollo Palo de Brasil Betabel Líquenes Plantas verdes

Fuente de información:(Domínguez, 2002)

3.5. FLAVONOIDES Los flavonoides son sustancias polifenólicas de bajo peso molecular que comparten el esqueleto común de difenil piranos (Figura1): dos anillos bencénicos (A y B) unidos a través de un anillo pirona o pirán heterocíclico (C) (MartínezValverde et al., 2002). Esta estructura permite una multitud de sustituciones y variaciones en el anillo pirona, dando lugar a múltiples compuestos incluyendo antiocianinas, flavonoles, flavonas, flavononas y flavanoles. A la fecha, más de 5000 flavonoides han sido identificados en la naturaleza, generalmente se encuentran distribuidos en forma de glucósidos, pudiendo encontrarse además agliconas (Dykes y Rooney, 2007; García- Salas et al., 2010). Del tipo, concentración y localización de flavonoides varía de acuerdo a la especie y etapa de desarrollo de la planta y puede ser modulado o por señales medioambientales (Lepiniec et al., 2006); dentro de sus funciones destaca la protección de las plantas de la radiación UV y frente al ataque de patógenos, constituyen moléculas señalizadores en la interacción microrganismo- planta, contribuyen a la pigmentación azul, rojo y naranja de las hojas, flores y frutos participando así en la atracción de polinizadores, entre otras ( Iwashina et al., 2006; García Salas et al.,2010). 10

Figura 1. Estructura química de los flavonoides.

Fuente: http://www.ehu.eus/biomoleculas/hc/sugar33c4.htm

3.6. ANTOCIANINAS Las antocianidinas (agliconas) son la estructura básica de las antocianinas (Figura 2a). Constan de un anillo aromático (A) unido a un anillo heterocíclico (C) que contiene oxígeno, el cual está unido por un enlace carbono-carbono a un tercer anillo aromático (B). El esqueleto básico de las antocianinas es el 2fenilbenzopirilio de la sal de flavilio con diferentes sustituciones (Sousa, 2005) Cuando las antocianidinas están en su forma glicosidada se conocen como antocianinas. Los monosacáridos comúnmente encontrados son D-glucosa, Lramnosa, D-arabinosa y D-xilosa (Figura 2b) aunque también pueden contener oligosacáridos como gentobiosa, rutinosa y soforosa. Normalmente los monosacáridos se unen con los grupos hidroxilo de la posición 3 de la antocianidina, mientras que los disacáridos sustituyen los hidroxilos 3 y 5 o los de la posición 3 y 7. Figura 2. (a). Estructura básica de las antocianidinas. (b). Estructura de los monosacáridos más comunes encontrados en las estructuras de las antocianinas.

Fuente: (Santacruz Cifuentes, 2011).

3.7. METODOS DE EXTRACCIÓN. Algunas investigaciones demuestran métodos de extracción de colorantes provenientes de las semillas del aguacate en forma exitosa, empleando solventes químicos, a continuación se describen las extracciones más relevantes en extracción del colorante a partir de la semilla del aguacate. 3.7.1 Extracción mediante maceración dinámica con reflujo. En este método de extracción las dos fases son móviles. Se coloca la materia prima dentro de un matraz y se pone en contacto directo con la solución extractora, debido a que la temperatura de ebullición del solvente es baja (refiriéndose a un rango de gradientes de temperatura entre 77° C y 94° C) y su presión de vapor es alta Al sistema se acopla un condensador de Allihn o de bolas, al llegar a la temperatura de ebullición del solvente la presión de vapor aumenta, por lo que el uso de un condensador de Allihn se hace más necesario para que se logre llevar a cabo el reflujo ( ver figura 3). Ambas fases se someten a un proceso de agitación con un agitador magnético logrando de esta manera la transferencia de momentum para acelerar la transferencia de masa, durante 180 minutos en contacto materia prima, solvente y así poder llegar a un proceso eficiente en la extracción (Labin Gómez, 2011). Figura 3. Equipo de Extracción con Maceración Dinámica con reflujo.

Fuente: Food Analysis Laboratory Manual.

3.7.2. Extracción Soxhlet. La extracción por método Soxhlet es una extracción del tipo sólido-líquido. Esta se refiere al procedimiento consistente en poner en contacto un sólido triturado con un disolvente de extracción en el que son solubles algunas de las sustancias que incorpora el sólido en su composición. Del proceso se obtiene un sólido agotado y una disolución formada por el disolvente y las sustancias disueltas en él (Ortuño, 2006). Como tal el método Soxhlet (ver figura 4) consiste en calentar un disolvente el cual se volatiliza y condensa goteando sobre la muestra la cual queda sumergida en el disolvente. Posteriormente este es sifonado al matraz de calentamiento para empezar de nuevo el proceso. El contenido de extracto se cuantifica por diferencias de pesos (Nielsen, 2003). Figura 4. Esquema de extracción soxhlet.

Fuente: Food Analysis Laboratory Manual

3.7.3. Arrastre con vapor. Este tipo de extracción utiliza el agua como solvente, cuando el vapor entra en contacto con el material vegetal, hace que los compuestos aromáticos, que generalmente poseen un punto de ebullición más bajo que el agua, se vaporicen y sean arrastrados junto con el vapor hasta el condensador, donde se condensan junto con el vapor de agua. También la temperatura del vapor hace que las células y las estructuras vegetales se rompan y liberen más compuestos esenciales. Esta técnica (ver figura 5), funciona para extraer aceites esenciales en general, pero no para aislar un compuesto determinado. Además pueden encontrarse algunos compuestos que puedan degradarse con la temperatura del vapor. Así que a medida que la industria de los aceites esenciales se fue especializando, el arrastre con vapor ha sido dejado de lado a favor de tecnologías que funcionen a 13

menor temperatura y pueda extraerse la mayor cantidad de compuestos esenciales (Ortiz, 2012). Figura 5. Diagrama general de destilación por arrastre con vapor a escala laboratorio

Fuente: http://www.chembook.co.uk/chap23.htm

3.7.4 Extracción con fluidos supercríticos. Los fluidos supercríticos son utilizados para remplazar a los solventes en distintas aplicaciones como extracción, medio de reacción o secado. Una de las sustancias más ampliamente estudiadas como fluidos supercríticos es el dióxido de carbono, que tiene las ventajas de tener una temperatura critica relativamente baja (cerca de 30 °C), su baja toxicidad y alta disponibilidad (Ortiz, 2012). Este método de extracción (ver figura 6) tiene ventajas frente a otras técnicas gracias a la posibilidad de modificar las propiedades del fluido de modo casi ilimitado, con lo cual se puede focalizar en extraer una serie de compuestos sin afectar a los demás. Además después de realizar la extracción el fluido se descomprime, haciendo que las sustancias extraídas queden libres para su uso, sin necesidad de una posterior purificación y/o recuperación del solvente (Ortiz, 2012). La principal limitación que poseen los procesos basados en fluidos supercríticos es el costo. Como las presiones a manejar son altas, los equipos involucrados deben tener la suficiente resistencia mecánica para poder soportar tales presiones y en caso de reacciones oxidativas en medio supercríticos, también es necesario que resistan un alto poder corrosivo que exhiben este tipo de reacciones (Ortiz, 2012).

Figura 6. Diagrama general de un proceso de extracción con Fluidos súper críticos (SCF).

Fuente: http://www.pharmainfo.net/reviews/review-supercritical-fluid-extraction-technology.html

3.7.5. Pulverización del colorante. El extracto concentrado se somete al proceso de pulverización en la unidad de secado por atomización. La cámara de aire caliente tiene una temperatura en la parte superior de 230º C y la parte inferior la temperatura disminuye a 90º - 100º C. El disco dispersor gira a una velocidad variable entre 5000 y 35000 rpm, la cual se modifica según la viscosidad del material. Para seleccionar esta velocidad se deben hacer ensayos previos hasta lograr que la solución se disperse en una nube que produzca partículas secas de un tamaño que sea adecuado para el uso propuesto. El polvo obtenido se almacena en bolsas cerradas herméticamente para evitar que se humedezcan (Pineda, 2012).

3.8. ESPECTOFOTOMETRÍA. 3.8.1. Fundamento del proceso Un método espectrofotométrico está basado en la medida directa de la absorción de radiación electromagnética por parte de una muestra, cuantificable a través de la absorbancia, y la correlación de esta variable con la concentración de la especie de interés en dicha muestra. Todo analito molecular tiene la capacidad de absorber ciertas longitudes de onda características de la radiación electromagnética. En este proceso, la radiación es transferida temporalmente a la molécula y, como consecuencia, disminuye la 15

intensidad de la radiación. Dicha disminución, debida a la absorción experimentada por el analito, puede ser cuantificada utilizando diversas magnitudes, siendo la absorbancia A, la más comúnmente utilizada en la espectrofotometría de UV-VIS (Díaz Abril, 2011). Dicha absorbancia se define por la expresión:

Donde A es la Absorbancia, P0 la potencia del haz de radiación incidente y P la potencia de dicho haz tras atravesar la muestra. 3.6.2. Ley de Beer De acuerdo con la ley de Beer, la absorbancia está relacionada linealmente con la concentración de la especie absorbente, c, y con la longitud de la trayectoria de la radiación en el medio absorbente o camino óptico, b. Esto es:

Dónde: a es una constante de proporcionalidad llamada asertividad. Cuando la concentración c se expresa en moles por litro, y b en centímetros, la constante de proporcionalidad se denomina asertividad molar, y se designa por el símbolo ε, y, puesto que la absorbancia es una magnitud adimensional, tendrá unidades del cm-1 mol-1 (Ruiz Bárcena, 2001). En este caso, la ley de Beer adquiere la forma:

4. MATERIALES Y METODOS

Con base a las metodologías presentadas en el marco teórico, se realizó un extracción para determinar el rendimiento y concentración del colorante obtenido a partir de Persea americana L. var. Lorena y Hass. Para dicha extracción se presentan los materiales y métodos a continuación. 4.1. LOCALIZACION DE ESTUDIO. El proyecto de investigación se realizó en la Universidad Agraria de Colombia con dirección Calle 170 No 54A -10 en Bogotá (Colombia), localizado en las coordenadas a 4°45´70´´N y a 74°03´12´´ O , una elevación 2650 m sobre el nivel del mar, una humedad relativa del 94% y una temperatura anual promedio de 14°C. El procedimiento de adecuación, pre tratamiento de las materias primas y extracciones se realizaron en el laboratorio de Ingredientes naturales de la Fundación Universitaria agraria de Colombia. En la figura 7 se observa donde se encuentra localizada la universidad. Figura 7. Localización del estudio, Fundación Universitaria Agraria de Colombia

Fuente: Google Earth.

4.2. MATERIALES. 4.2.1. Descripción del material vegetal. El material del estudio son semillas de Aguacate Persea americana L. var. Lorena y var. Hass provenientes de la central de abastos (Corabastos) de la ciudad de Bogotá D. C., Colombia. Esta fue recopilada tres meses antes para obtener la semilla seca y durante la investigación para las semillas frescas. 17

4.2.2. Descripción del material de laboratorio. En la siguiente lista (ver tabla 4) se detallan los materiales de laboratorio que se utilizaron para el desarrollo de los diferentes procesos de extracción: Tabla 4. Descripción de materiales de laboratorio. Materiales Probetas Pipetas Termómetro Matraz Aforado Lunas de reloj Balón Beaker Condensador Pinzas Mortero y Pistilo Varilla de agitación

Cantidades 100 mililitros 20 mililitros 1 50 mililitros 60 mm 250 mililitros 50 mililitros 200 mm 1 100 mm 50 cm

Fuente: El autor.

4.2.3. Reactivos. Para llevar a cabo la extracción del colorante se usaron los siguientes reactivos: Éter de petróleo cuya calidad fue certificada por la empresa RODA QUÍMICOS LTDA, Etanol al 99.9 % – UNIAGRARIA así como el agua destilada y el hipoclorito de sodio al 1% (empleado en la desinfección de la materia prima) requeridos para los procesos. 4.3 EQUIPOS. En cuanto a los equipos, se empleó: Horno de secado por convección forzada LabTech, balanza analítica modelo XT120A con capacidad de 120 g y una precisión de 0,0001 g, agitador magnético con calefacción MSH 130 y un espectrofotómetro Benchtop modelo Vis 100. 4.4. METODOS. 4.4.1. Preselección de la semilla. Para la preselección de la semilla se tuvo en cuenta criterios como el costo del fruto, el tamaño de la misma y el origen. La variedad Hass tiene un costo mayor ya 18

que es considerada mejor calidad que la variedad Lorena, variedad esta última la única variedad obtenida en Colombia (se generó en la finca Lorena del departamento del Valle). 4.4.2. Desinfección de la semilla. La desinfección de la semilla se realizó con hipoclorito de sodio al 1% durante 15 minutos. El procedimiento de efectuó para las semillas de ambas variedades por igual para reducir los errores experimentales. A continuación, la figura 8 refleja el diagrama del proceso para la desinfección de las semillas. Figura 8. Proceso de adecuación y desinfección de la materia prima. Fruto de Aguacate

Exocarpo, Mesocarpio yendocarpio

Semilla

Se retiran residuos de tierra y partículas extrañas bajo agua a presión.

En agua acidificada con HCl (en proporción de tres gotas por litro de agua).

Se desecha

Inmersión durante 15 min.

Fuente: Guerrero Escobar, 2011.

4.4.3. Reducción de tamaño. Utilizando un molino de discos se procedió a la reducción del tamaño de las partículas, para posteriormente facilitar los procesos de extracción, previamente cortadas con cuchillo. A continuación, la figura 9 refleja el diagrama del proceso para la reducción de tamaño de las semillas.

Figura 9. Proceso de reducción del tamaño de partículas. Semilla Después de desinfectado y secado

Trituración en molino de disco tradicional

Hasta pulverizar

Envasado bolsas ziploc Fuente: El autor.

4.4.4. Preparación del solvente. Se utilizó éter de petróleo cuya calidad fue certificada por la empresa RODA QUIMICOS LTDA como solvente el cual tiene un punto de ebullición bajo (35 a 70ºC) lo que facilita los tiempos de extracción. Con ayuda de una pipeta se midió 200 ml del solvente para luego depositarlo en un balón de 250 mL que se tomará como depósito base para la extracción mediante reflujo directo. De igual manera se realizó con el etanol al 99.9% de pureza, esto para cada uno de los tratamientos. 4.4.5. Extracción del colorante. Se utiliza el método de Reflujo directo (ver figura 10) para la obtención de principios activos de los vegetales. La relación de materia prima / solvente es de 1:10, Para el proceso de extracción se empleó un balón de 250 mL en el que se colocaron 20 g de la muestra problema molida junto con 200 mL del solvente. Para finalizar se procedió a calentarlo durante 90 minutos con la ayuda de plancha de calentamiento. A continuación, la figura 11 refleja el diagrama del proceso para la preparación de los solventes. Figura 10. Sistema de reflujo para la extracción de colorantes.

Fuente: http://www.rabfis15.uco.es/labquimica/tutorial/marco_inferior.htm

Figura 11. Proceso de extracción por método Reflujo Directo. Método reflujo directo

Solvente: Etanol y Éter de petróleo, relación 1:10(w: v), semillasolvente

Pesar 20 gr de semilla

Extracció n Filtración Solvente

Destilació n

Extracto Fuente: El autor

4.4.6. Filtración. Posterior al proceso de extracción, la solución resultante queda con partículas de la materia prima incluidas las que deben ser retiradas para mejorar su calidad. Para eliminar estas se utilizó una tela de porosidad mínima, se filtró y de esta manera se eliminaron los sólidos. 4.4.7. Destilación. Se llevó a cabo una destilación para remover el solvente para esto se realizó una destilación simple, lo que ocurre en este proceso es que se calienta el líquido en un recipiente (un matraz destilación) hasta que se evaporiza; el vapor paso por un refrigerante donde se convierte de nuevo en líquido y se recoge luego en un recipiente recolector. Es utilizada para separar líquidos con puntos de ebullición inferiores a 150ºC como en este caso se quería destilar los solventes (Éter de petróleo y etanol) los cuales tienen puntos de ebullición de entre 30ºC-40º y 78ºC respectivamente (Guerrero Escobar, 2010). 4.4.8. Secado. Después de realizadas las actividades de extracción, filtración y destilación se obtuvo una masa pastosa. Dicha masa fue colocada en lunas de vidrio para ser 21

trasladadas a estufa de secado a una temperatura de 80 º C por un tiempo de 12 h. Luego del secado se retiraron las muestras de la estufa y se maceraron con la ayuda del mortero en porcelana para obtener el producto en polvo, el cual se procedió a pesar para obtener el rendimiento. El rendimiento obtenido del método de extracción se calculó con la siguiente fórmula:

4.4.9. Análisis Espectrofotométrico. Para el análisis espectrofotométrico se disolvieron 0.025 g de cada tratamiento en 15 ml de agua (concentración aproximada de 600 ppm). Se tomó la lectura en el espectrofotómetro a 530 nm (Guerrero Escobar, 2010). Mediante la siguiente ecuación de Beer Lambeer se calculó la concentración del colorante extraído.

Donde A: Absorbancia. ε: Absortividad molar (7,47*10-4 cm-1 ppm) dato bibliográfico. b: cm-1. c: concentración (ppm).

4.5. DISEÑO EXPERIMENTAL. 4.5.1. Contexto del diseño experimental. Es un diseño factorial 23, donde tres son los factores que intervinieron en el proceso, 2 sus niveles en cada caso. Lo anterior muestra que en total se realizaron 8 tratamientos con 3 repeticiones por cada uno, para un total de 24 ensayos. 4.5.2. Variables. En el diseño experimental se tendrán en cuanta las siguientes variables: Variables Independientes: Variedad de la semilla, Tipo de solvente y Estado de maduración de la semilla. 22

Variables dependientes. Rendimiento y Concentración.

4.5.3. Factores de estudio. Los factores en estudio pueden evidenciarse en la tabla 5. Tabla 5. Factores de estudio. FACTORES A. Variedades del aguacatero B. Tipo de solvente C. Estado de la semilla

CODIFICACIONES a0 a1 b0 b1 c0 c1

NIVELES Lorena Hass Éter de Petróleo Etanol Fresca Seca

Elaborado por: El autor.

4.5.4. Tratamientos. La tabla 6 muestra los tratamientos formulados dada la interacción entre cada uno de los factores y sus niveles. Tabla 6. Tratamiento de estudio. Nº Semilla Codificación 1 2 3 4 5 6 7 8

a0b0c0 aob0c1 a0b1c0 a0b1c1 a1b0c0 a1b0c1 a1b1c0 a1b1c1

Variedad Semilla Lorena Lorena Lorena Lorena Hass Hass Hass Hass

Tipo de Solvente

Estado Semilla

Éter de petróleo Éter de petróleo Etanol Etanol Éter de petróleo Éter de petróleo Etanol Etanol

Fresca Seca Fresca Seca Fresca Seca Fresca Seca

Elaborado por: El autor.

4.5.5. Análisis Estadístico de los datos. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) simple entre las medidas de las muestras por tratamiento con un nivel de significancia del 95% (α=0,05) para establecer si existen diferencias significativas para las variables en evaluación. En caso de no presentarse diferencias significativas entre las muestras se realizó una 23

prueba de rasgos múltiples empleando el paquete estadístico Statgraphics Centurion.

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Con el fin de sustentar los resultados obtenidos del proceso experimental planteado en la metodología a continuación se presentan los registros de cada etapa del proceso así como su análisis, interpretación y discusión. En el desarrollo general de la investigación se escogieron dos variedades de Persea americana L. var. Lorena y Hass, que cumplían con las características de madurez e inocuidad previamente nombradas. 5.1. PRETRATAMIENTOS APLICADOS A LA SEMILLA DEL AGUACATAE (Persea americana L. var. Lorena y var. Hass). A continuación se detallan los resultados físicos de los pretratamientos aplicados a las dos variedades de la semilla del aguacate (Persea americana L. var. Lorena y Hass). 5.1.1. Pretratamiento de la semilla de aguacate (Persea americana L. var. Lorena y var. Hass). Las condiciones de extracción a las que fueron expuestas las muestras de semilla se puede ver en la tabla 7 en las dos variedades. Dichas condiciones se seleccionaron por diferentes estudios que revelan mejores condiciones para la extracción. Tabla 7. Extracción del colorante de la semilla de aguacate. Cantidad (g) Solvente Tiempo(min) Temperatura ºC 20 Éter de Petróleo 90 80 20 Etanol 99% 90 80 Fuente: El autor.

Se realizaron extracciones con dos tipos de solventes en dos estados de la semilla (fresca y seca) y con dos variedades diferentes mencionadas anteriormente, manteniendo las mismas condiciones de extracción (cantidad, tiempo y temperatura) en los diferentes tratamientos al final se obtienen colorantes de color café y otro de color naranja. Después de haber obtenido los extractos estos se 24

secan a una temperatura de 80 º C por 12 horas para obtener el colorante en polvo como se había propuesto inicialmente.

Figura 12. Pretratamiento semilla Variedad Lorena.

Fuente: El autor.

Figura 13. Pretratamiento semilla variedad Hass.

Fuente: El autor.

5.2. EFECTO DEL TIPO DE SOLVENTE Y EL ESTADO DE LA SEMILLA SOBRE EL RENDIMIENTO DEL EXTRACTO EN (Persea americana L. var. Lorena y var. Hass) BAJO DIFERENTES CONDICIONES DE EXTRACCION. A continuación se presentan los resultados obtenidos en el rendimiento de cada uno de los tratamientos propuestos en la investigación como su porcentaje concentración. 5.2.1. Cantidad y rendimiento de extracto obtenido de la semilla de Aguacate (Persea americana L. var. Lorena y var. Hass). Posterior a la extracción en cada uno de los tratamientos empleando los dos tipos de solventes en los diferentes estados de las semillas y en las variedades mencionadas anteriormente se pesan cada una de las muestras obtenidas las cuales se reflejan en la tabla 8 así como el resumen estadístico para dicha variable (ver tabla 9).

Tabla 8. Peso de la semilla obtenida. Peso (g) Nº

TRATAMIENTOS

Promedio

a0b0c0

3.7

3.9

3,6

3.7

aob0c1

4.1

4.0

3.9

4.0

a0b1c0

6,7

6,2

6,4

a0b1c1

4,6

5.0

4,1

4,6

a1b0c0

6,4

6,8

5,9

6,4

a1b0c1

4.0

4,5

4,9

4,5

a1b1c0

6,8

7.0

6,9

a1b1c1

4,1

4.0

4,2

4,1

Fuente: El autor

Tabla 9. Resumen estadístico para el peso (g) de las semillas empleadas para los procesos de extracción. ESTADÍSTICOS Recuento Promedio Desviación Estándar Coeficiente de Variación Mínimo Máximo Rango Sesgo Estandarizado

aob0c1 3 3.73333 0.152753 4.09% 3.6 3.9 0.3 0.6613

a0b0c0 3 4 0.1 2.50% 3.9 4.1 0.2 0

TRATAMIENTOS a0b1c1 a1b0c0 a1b0c1 a1b1c0 a1b1c1 3 3 3 3 3 3 6.43333 4.56667 6.36667 4.46667 6.9 4.1 0.251661 0.450925 0.450925 0.450925 0.1 0.1 3.91% 9.87% 7.08% 10.10% 1.45% 2.44% 6.2 4.1 5.9 4 6.8 4 6.7 5 6.8 4.9 7 4.2 0.5 0.9 0.9 0.9 0.2 0.2 0.41407 -0.233933 -0.233933 -0.233933 0 0

a0b1c0

Fuente: El autor.

La (tabla 9) muestra el resumen estadístico para cada una de las variables seleccionadas. Incluye medidas de tendencia central, de variabilidad, y de forma. De particular interés aquí es el sesgo estandarizado, la cual puede usarse para determinar si la muestra proviene de una distribución normal. Valores de estos estadísticos fuera del rango de -2 a +2 indicando que no existen desviaciones significativas de la normalidad, las cuales tenderían a invalidar muchos de los procedimientos estadísticos que se aplican habitualmente a estos datos. Es de 26

resaltar que la presencia de un coeficiente de variación inferior al 20% evidencia que existió homogeneidad en la toma de datos, elemento este que disminuye la posibilidad de error experimental.A continuación, mediante gráfico de medias se pueden apreciar en la figura 14 los valores obtenidos para la prueba de rangos múltiples. Figura 14. Gráfico de medias que expresa los resultados de la prueba de rangos múltiples con un nivel de significancia del 95%.

Fuente: El autor.

La figura anterior refleja que el peso de las semillas empleadas en los procesos de extracción resultó ser heterogéneo entre grupos más no dentro de los mismos grupos o tratamientos. Las semillas con un mayor peso al inicio de los procesos de extracción resultaron ser las A1B1C0, las que difieren del resto de los tratamientos exceptuando el tratamiento A0B1C0.Dicho esto el tratamiento que resulto mejor en la obtención del colorante en cuanto al rendimiento fue en el que se utilizó la semilla de la variedad Hass en estado utilizando como solvente el etanol fresca con un 34.5 % como se refleja en la tabla 11. Los valores de peso más bajos se presentaron en las semillas del tratamiento A0B0C0. Se observa además que los tratamientos A0B1C0 Y A1B1C1 no representan una diferencia significativa entre ellos. Por otra parte, después de aplicada la Ecuación 4 para el cálculo del rendimiento se obtuvieron los valores que se reflejan en la tabla 10. Estos resultados fueron adicionalmente analizados estadísticamente y su resumen aparece en la tabla 11. Tabla 10. Rendimientos del colorante.

Nº

TRATAMIENTOS

RENDIMIENTO (%) R2 R3 Promedio

R1 27

1 2 3 4 5

a0b0c0 aob0c1 a0b1c0 a0b1c1 a1b0c0

18,5 20,5 33,5 23.0 32.0

Nº 6 7 8

TRATAMIENTOS a1b0c1 a1b1c0 a1b1c1

19.5 18,0 20,0 19.5 31.0 32.0 25.0 20,5 34.0 29,5 RENDIMIENTO (%)

R1 20.0 34.0 20,5

R2 22,5 35.0 20.0

18,7 20.0 32,2 22,8 31,8

R3 Promedio 24,5 22,3 34,5 34,5 21.0 20,5

Fuente: El autor Fuente: El autor

Tabla 11. Resumen estadístico para el rendimiento (%) del colorante. ESTADÍSTICOS Recuento Promedio Desviación Estándar Coeficiente de Variación Mínimo Máximo Rango Sesgo Estandarizado

aob0c1 3 18.6667 0.763763 4.09% 18 19.5 1.5 0.6613

a0b0c0 3 20 0.5 2.50% 19.5 20.5 1 0

TRATAMIENTOS a0b1c1 a1b0c0 a1b0c1 a1b1c0 a1b1c1 3 3 3 3 3 3 32.1667 22.8333 31.8333 22.3333 34.5 20.5 1.25831 2.25462 2.25462 2.25462 0.5 0.5 3.91% 9.87% 7.08% 10.10% 1.45% 2.44% 31 20.5 29.5 20 34 20 33.5 25 34 24.5 35 21 2.5 4.5 4.5 4.5 1 1 0.41407 -0.233933 -0.233933 -0.233933 0 0 Fuente: El autor

a0b1c0

La tabla 11 evidencia el resumen estadístico para la variable seleccionada y sus diferentes tratamientos. Incluye medidas de tendencia central, de variabilidad, y de forma. Valores de estos estadísticos fuera del rango de -2 a +2 indican desviaciones significativas de la normalidad, las cuales tenderían a invalidar muchos de los procedimientos estadísticos que se aplican habitualmente a estos datos. Es de resaltar que la presencia de un coeficiente de variación inferior al 20% evidencia que existió homogeneidad en la toma de datos, elemento este que disminuye la posibilidad de error experimental. Para evidenciar el efecto del tipo de solvente y el estado de la semilla sobre el rendimiento del extracto se presentan los promedios de los diferentes tratamientos mediante gráfico de medias y nivel de significancia estadística según prueba de rangos múltiples (ver figura 15). Figura 15. Promedios de rendimiento de extracción de semilla de aguacate (Persea americana L. var. Lorena y var. Hass) con un nivel de significancia del 95%.

Fuente: El autor

Con base a los resultados presentados de la figura 15, directamente se puede evidenciar que existe una diferencia significativa de la semilla en estado fresco y en estado seco en el rendimiento. Todo parece indicar que la semilla en estado fresco muestro valores más altos en sus diferentes tratamientos, los que se corresponden con los tratamientos en terminaciones c0 para ambas variedades de aguacatero (Lorena y Hass). En cuanto al tipo de solvente en el rendimiento se evidencia que los mejores tratamientos fueron a1b1c0 y a0b1c0, los cuales fueron extraídos con Etanol al 99.9%, lo cual representa una diferencia significativa con respecto al éter de petróleo ya que en cuestión de rendimiento los tratamientos utilizados con este solvente tienen los valores más bajos exceptuando el tratamiento a 1b0c0 utilizando la semilla en estado fresca. Aunque la variedad que muestra mayor rendimiento matemático es la variedad Hass, esta no muestra diferencia significativa estadísticamente significativa con la variedad Lorena en algunos de sus tratamientos. 5.2.2. Análisis por métodos cualitativos de la concentración del extracto obtenido de las semillas Persea americana L. var. Lorena y var. Hass. Se determinó la concentración del colorante extraído (una antocianina) y se realizaron las diluciones de cada muestra para luego medir la absorbancia en el espectrofotómetro. Los resultados de las mediciones se presentan en la tabla 12, con el dato obtenido bibliográficamente de la absortividad molar, se despeja la concentración en la ecuación (3) de Lambeer Beer la cual nos permitió obtener la concentración del colorante que se presenta en la tabla 14. Por su parte, en las tablas 13 y 15 se presenta un resumen estadístico para las variables en estudio. Tabla 12. Mediciones de absorbancia. ABSORBANCIA Nº

TRATAMIENTOS

R2 29

Promedio

1 2 3 4 5 6 7 8

a0b0c0 aob0c1 a0b1c0 a0b1c1 a1b0c0 a1b0c1 a1b1c0 a1b1c1

0,25 0,26 0,34 0,29 0,18 0,41 0,28 0,37

0,23 0,23 0,33 0,26 0,15 0,42 0,31 0,39

0,28 0,22 0,36 0,25 0,14 0,40 0,29 0,38

0,30 0,20 0,30 0,30 0,20 0,40 0,30 0,40

Fuente: El autor

Esta tabla evidencia que los mayores resultados de absorbancias se presentaron en las soluciones provenientes de la variedad Hass en semillas secas, indistintamente del solvente empleado. Los resultados más bajos desde el punto de vista matemático resultaron ser para soluciones provenientes de semillas en estado fresco indistintamente de la variedad y para el solvente Éter. Tabla 13. Resumen estadístico para la absorbancia. ESTADÍSTICOS Recuento Promedio Desviación Estándar Coeficiente de Variación Mínimo Máximo Rango Sesgo Estandarizado

aob0c1 3 0.236667 0.0208167 8.80% 0.22 0.26 0.04 0.914531

a0b0c0 3 0.253333 0.0251661 9.93% 0.23 0.28 0.05 0.41407

TRATAMIENTOS a0b1c1 a1b0c0 a1b0c1 a1b1c0 a1b1c1 3 3 3 3 3 3 0.343333 0.266667 0.16 0.41 0.293333 0.38 0.0152753 0.0208167 0.02 0.01 0.0152753 0.01 4.45% 7.81% 12.50% 2.44% 5.21% 2.63% 0.33 0.25 0.14 0.4 0.28 0.37 0.36 0.29 0.18 0.42 0.31 0.39 0.03 0.04 0.04 0.02 0.03 0.02 0.6613 0.914531 0 0 0.6613 0

a0b1c0

Fuente: El autor

Al analizar la tabla 13 puede evidenciarse que los diferentes tratamientos presentan coeficientes de variación muy bajos (inferiores al 20%), por lo que se puede asumir que los grupos evaluados son homogéneos. Posterior a la determinación de la absorbancia y despejando la Ecuación (3) para la determinación de la concentración de los colorantes se obtiene los resultados expuestos en la tabla 14. Al igual que para el análisis de los resultados de la absorbancia los mayores valores de concentración se presentan en la variedad Hass en semillas secas, indistintamente del solvente empleado. Los valores más bajos de concentración se presentan cuando los procesos de extracción se realizan con el empleo del Éter y como fuente inicial semillas frescas indistintamente de la variedad Tabla14. Concentración del colorante. CONCENTRACION ppm 30

Nº 1 2 3 4 5 6 7 8

TRATAMIENTOS a0b0c0 aob0c1 a0b1c0 a0b1c1 a1b0c0 a1b0c1 a1b1c0 a1b1c1

R1 334,67 348,06 455,15 388,22 240,96 548,86 374,83 495,31

R2 307,90 307,90 441,77 348,06 200,80 562,25 414,99 522,09

R3 Promedio 374,83 339,13 294,51 316,82 481,93 459,62 334,67 356,98 187,42 209,73 535,48 548,86 388,22 392,68 508,70 508,70

Fuente: El autor

De acuerdo con Chala (2003) la coloración que se produce a partir de la semilla de Genipa americana (Jagua) y Persea americana (aguacate) respectivamente presenta un mayor nivel en la concentración cuando presentan bastante madurez. A continuación la tabla 15 evidencia el resumen estadístico para la concentración de los colorantes obtenidos. Es de señalar que al igual que en los casos anteriores, una vez más se evidencia que los grupos trabajados resultaron ser homogéneos. Tabla 15. Resumen estadístico para la concentración del colorante. ESTADÍSTICOS Recuento Promedio Desviación Estándar Coeficiente de Variación Mínimo Máximo Rango Sesgo Estandarizado

aob0c1 3 316.823 27.8679 8.80% 294.51 348.06 53.55 0.91441

a0b0c0 3 339.133 33.6875 9.93% 307.9 374.83 66.93 0.414187

TRATAMIENTOS a0b1c1 a1b0c0 a1b0c1 a1b1c0 a1b1c1 3 3 3 3 3 3 459.617 356.983 209.727 548.863 392.68 508.7 20.4492 27.8679 27.8639 13.385 20.4481 13.39 4.45% 7.81% 13.29% 2.44% 5.21% 2.63% 441.77 334.67 187.42 535.48 374.83 495.31 481.93 388.22 240.96 562.25 414.99 522.09 40.16 53.55 53.54 26.77 40.16 26.78 0.661872 0.91441 0.914775 0.00079242 0.661014 0

a0b1c0

Fuente: El autor

Según lo reportado por (Santacruz Cifuentes, 2011) a medida que la semilla se seca sufre cambios bioquímicos que dan lugar a las modificaciones en la composición de ciertos compuestos, en este caso la concentración de antocianinas aumenta. Para demostrar mejor la concentración del extracto obtenido de las semillas de Persea americana L. var. Lorena y var. Hass, se presenta la figura 16. Esta se obtiene mediante una prueba de rangos múltiples con un nivel de significancia del 95%.

Figura 16. Concentraciones del extracto obtenido de las semillas de Persea americana L. var. Lorena y var. Hass con un nivel de significancia del 95%.

Fuente: El autor

La anterior figura (figura 16) muestra que los tratamientos con mayor concentración estadísticamente significativas resultan ser las provenientes de var. Hass para semillas secas, superando las 500 ppm. Estos tratamientos considerados estadísticamente los mejores son el a1b0c1 y el a1b1c1 sin presentar diferencias estadísticamente significativas entre ellos. Adicionalmente se puede acotar que los rendimientos más bajos se mostraron también en la variedad Hass para semilla fresca y cuando se empleó como solvente el Éter. La tabla 16 muestra las correlaciones momento producto de Pearson, entre cada par de variables. El rango de estos coeficientes de correlación va de -1 a +1, y miden la fuerza de la relación lineal entre las variables. El número en cada bloque de la tabla es un valor-P que prueba la significancia estadística de las correlaciones estimadas. Valores-P por debajo de 0.05 indican correlaciones significativamente diferentes de cero, con un nivel de confianza del 95.0%. Tabla 16. Correlación existente entre las variables en estudio. (Valores-P abajo de 0.05 indican correlaciones significativamente diferentes de cero, con un nivel de confianza del 95.0%).

Fuente: El autor

Adicionalmente y teniendo descrito los criterios anteriores, la tabla 16 evidencia correlaciones lineales fuertes entre las variables Concentración y Absorbancia respecto al Peso y Rendimiento y viceversa. Cabe resaltar que el análisis mostró que no existe correlación lineal del Peso sobre el Rendimiento (y viceversa) así como tampoco se mostró correlación lineal entre la absorbancia y la concentración (y viceversa). Es de señalar que la significancia estadística de un coeficiente debe tenerse en cuenta conjuntamente con la relevancia del fenómeno que estudiamos ya que coeficientes de 0.5 a 0.7 tienden ya a ser significativos como muestras pequeñas (6). Dado lo anterior predomina entre las variables correlacionadas una correlación del tipo lineal positiva. 5.3 IDENTIFICACIÓN TEÓRICA DEL USO POTENCIAL DE LOS COLORANTES OBTENIDOS PARTIENDO DE SU COMPOSICIÓN QUÍMICA. Diferentes investigaciones han demostrado que se puede extraer un colorante a partir de la semilla del aguacate (Persea americana L), el cual es una antocianina, que presenta un valor importante para el uso del sector agroindustrial, en especial para empresas del sector textil, cosméticos, y de alimentos, las antocianinas son de interés particular para la industria de los colorantes alimenticios debido a su capacidad para impartir colores atractivos (Konczack y Zhang, 2004). Lo que representa un mayor interés para el sector agroindustrial por ser un residuo no aprovechable con un gran potencial por explotar. A continuación se relacionan los diferentes componentes hallados por diferentes autores en sus investigaciones: A. Propiedades funcionales de las antocianinas halladas en semillas de aguacate. El interés en los pigmentos antociánicos se ha intensificado recientemente debido a sus propiedades farmacológicas y terapéuticas (Astrid, 2008). Durante el paso del tracto digestivo al torrente sanguíneo de los mamíferos, las antocianinas permanecen intactas (Miyazawa et al., 1999) y ejercen efectos terapéuticos conocidos que incluyen la reducción de la enfermedad coronaria, efectos anticancerígenos, antitumorales, antiinflamatorios y antidiabéticos; además del mejoramiento de la agudeza visual y del comportamiento cognitivo. Los efectos terapéuticos de las antocianinas están relacionados con su actividad antioxidante. Estudios con fracciones de antocianinas provenientes del vino han demostrado que estas son efectivas en atrapar especies reactivas del oxígeno, además de inhibir la oxidación de lipoproteínas y la agregación de plaquetas (Ghiselli et al., 1998). Por todo lo anterior, las antocianinas gradualmente están siendo incorporadas dentro de productos alimenticios y bebidas como colorantes, alimentos funcionales o suplementos alimenticios. El aumento en el contenido de antocianinas con 33

mayor estabilidad y vida de anaquel prolongada incrementará las aplicaciones alimenticias, el consumo total y con ello incrementar su efecto benéfico en la salud humana (Shipp y AbdelAal, 2010). B. Uso Potencial de los colorantes naturales obtenidos de la semilla de Persea americana L. 

Como tinte

El colorante obtenido a partir de la semilla del aguacate se emplea para teñir fibras textiles de poliamida y de algodón, usando mordientes vegetales, con resultados que satisfacen las Normas Icontec para textiles (Cruz, 2004). Se aplicó el colorante sobre las telas utilizando el procedimiento de tintura por agotamiento, en este proceso las fuerzas de afinidad entre el colorante y fibra, hace que el colorante pase del baño a la fibra hasta saturarla y quedar fijada en él, la relación baño que se utilizó fue 1:20, es decir la tela peso 10 g y se colocó 200 mL de agua, se utilizó el 2% de colorante en relación de la tela, y se utilizó auxiliares textiles, estas sustancias se agregan al baño de tintura para mejorarla, pueden ayudar a la transferencia del colorante al baño, mejorar la igualación, dispersión, penetración etc. Los resultados obtenidos, aplicando el colorante sobre la tela fueron satisfactorios para el algodón ya que el algodón tiene gran capacidad de absorción lo que significa que el tinte se adhiere bien al hilo. (Guerrero Escobar, 2011).  Como colorante en alimentos. Leche y sus derivados. Se colorea leche con el pigmento y se obtiene una completa estabilidad y una buena suspensión del colorante. En quesos la respuesta es similar, luego de colorear la leche, la suspensión comienza a precipitar en conjunto con el colorante, y el resultado es un queso de color parejo. Es de subrayar que el colorante no afecta el sabor del queso. Harinas. Se colorea la masa a partir de harina de trigo para obtener productos de panadería, con estabilidad y buen color. Para obtener el colorante apropiado para usar en alimentos se disuelve en etanol el producto obtenido con la solución diluida de KOH, y luego se filtra para obtener un producto en polvo por evaporación del solvente. (Devia Pineda, 2004).  Cosméticos y medicinales. El colorante se puede añadir a cosméticos, mezclado con las cremas apropiadas. Y en cuanto a medicina los efectos terapéuticos de los componentes pueden ser retenidos por el colorante, procurando así la apropiada reunión de los regímenes medicinales (Eck, 1991).

CONCLUSIONES

A partir de la semilla del aguacate se puede extraer un colorante, para la obtención del colorante natural se recurrió a un equipo de destilación simple, utilizando como solventes Éter de petróleo y Etanol al 99.9 % y una vez procesado el extracto se obtuvo el colorante en polvo. El valor más alto de rendimiento del colorante fue al utilizar el Etanol al 99.9%, en la variedad Hass en estado fresca con 34.5%, mientras que el rendimiento más bajo fue para el tratamiento donde se utilizó como solvente éter de petróleo con la semilla de variedad Lorena en estado fresca con 18.7 %, esto evidencia que el tipo de solvente y la variedad de la semilla influyen significativamente en el rendimiento del extracto. De las extracciones realizadas en los diferentes tratamientos se evidencio que el mejor tratamiento en cuanto a la concentración fue en donde se utilizó como solvente el éter de petróleo en la variedad Hass en estado seca y tratamiento con menos nivel de concentración fue el realizado con éter de petróleo en variedad Hass en estado fresca, estos resultados evidencia que existe una diferencia significativa en cuanto a la concentración del colorante por el estado de la semilla. A partir de lo mencionado en los párrafos anteriores se reconoce que tanto en el rendimiento como en la concentración del colorante es afectado por el estado de la semilla, ya que para el rendimiento es recomendado usar la semilla en fresco y para una mayor concentración es mejor el estado seco.

Con la ayuda de métodos sencillos, material y equipo mínimo necesario se puede lograr obtener colorante de la especie vegetal de Persea americana L. var. Lorena y Hass siendo de gran utilidad y de mucha ayuda en la agroindustria.

Desde el punto de vista económico la obtención del colorante de la semilla del aguacate es de bajo costo por ser un subproducto, utilizando un proceso de extracción sencillo comparado con la obtención de otros colorantes naturales; dado que el fruto se cultiva en el país.

RECOMENDACIONES

Realizar un estudio más afondo sobre los estado de la semilla, ya que para extraer este colorante a nivel industrial existe una contradicción en esta variable porque en el rendimiento es mejor en estado fresca y en la concentración en seca. Para la extracción industrial de este colorante se sugiere que se realice con en estado seca por su nivel de concentración, aunque en fresca es mejor su rendimiento es de recordar que se extrae el colorante de un subproducto al cual no le dan ningún uso a nivel industrial. Concientizar a las empresas como a los consumidores acerca de los beneficios que trae el uso de colorantes naturales. En la parte del filtrado se alcanza a perder cierta cantidad de solidos que son partículas del colorante, se podría ver la posibilidad que estos solidos sean recuperados para luego incorporarlo a un proceso de secado en bandejas para aumentar así el rendimiento del colorante. Realizar estudios de estabilidad al colorante, que proporcione información sobre la vida útil. Incitar a la realización de nuevas investigaciones a utilizar otras materias orgánicas desechadas de las que se pueda extraerse otros colorantes, disminuyendo con ello el efecto que pueda causar en el medio ambiente la obtención de colorantes sintéticos.

Estos dos solventes se podrían utilizar en diferentes etapas, el éter en un primer proceso para remover los ácidos grasos presentes en las semillas del aguacate que podría llegar a intervenir en la extracción del colorante y posterior efectuar la extracción con el etanol para remover el colorante presente en la semilla del aguacate.

BIBLIOGRAFIA

ACTA. (2012). Alimentos procesados: Asociación colombiana de ciencia y tecnología para alimentos. Recuperado el Octubre de 2012, de http://portal.acta.org.co/. ASOCIACIÓN AGRÍCOLA DE PRODUCTORES DE AGUACATE DE URAPÁN MICHOACÁN. El aguacate en el mercado internacional [online]. Available: http://www.aproam.com/inter.htm. [Citado 18 de noviembre de 2011]. ASTRID, G. G. 2008. Las antocianinas como colorantes naturales y compuestos bioactivos: revisión. Acta Biológica Colombiana, 13(3), 27-36. BARCENA, Ruiz. 2001. Caracterización cinética de la fosfatasa alcalina. Departemento de bioquímica. Córdoba. Universidad de rabanales. BARRIENTOS Priego, A.F; GARCIA Villanueva, 1996. Anatomía del fruto del aguacate, ¿drupa o baya?, Universidad Autónoma de Chapingo, México. BERNAL A & Cipriano A (2008) generalidades del cultivo de cultivo. En Tecnología para el cultivo de Aguacate. Corporación Colombiana de investigación Agropecuaria, CORPOICA, Centro de investigación La Selva, Ríonegro, Antioquia, Colombia. Manual Técnico 5. Editado por Corpoica. 241p. CÁCERES, Armando, 1996, “extracción de colorantes de plantas” Colección Monografías, Volumen 1. Guatemala.

CRUZ, D. y Palomino, C. (2004). Selección de un método para teñir textiles con las semillas del Achiote y del Aguacate. Trabajo de grado. Ingeniería de procesos. Medellín : Universidad EAFIT. DABAS, D. (29 de Noviembre de 2011). Colored avocado seed extract with antioxidant, anti-carcinogenic and anti-inflammatory effects. Recuperado el 5 de Octubre de 2012 de http://foodscience.psu.edu/. DEVIA, J. E., & SALDARRIAGA, D. F. (2005). Proceso para obtener colorante a partir de la semilla del aguacate. Revista Universidad EAFIT, 41 (137), 36-43. DIKES, L. y Rooney, L.W.2007. Phenolic compoundsin cereal grains and their health benefits. Cereal Foods World.52:105-111. DOMÍNGUEZ, Jorge.2010 “MÉTODOS DE INVESTIGACIÓN FITOQUÍMICA” Editorial Limusa, México. Eck, G (1991). Process for producing luminescent dyestuffs from plant materials. Patente US 5, 042,989 (27/8/1991). FAO. 1995 Organización De Las Naciones Unidas Para La Agricultura Y La Alimentación.http://www.fao.org/docrep/003/v6800s/v6800s00.htm. FAOSTAT. (2010). FAOSTAT. Recuperado el Marzo de 2012, de http://www.faostat.fao.org/. FLORES, L., LING, F., 1990. “EXTRACCIÓN DE COLOREANTES NATURALES” México. GARCÍA Fajardo, J. A. (1999). Estructura de la semilla del aguacate y cuantificación de la grasa extraída por diferentes técnicas. Chapingo- Serie Horticultura, 123- 128. GARCIA Salas, P., MORALES Soto, A., SEGURA Carretero, A. y FERNANDEZ Gutiérrez, A. 2010. Sistema fenólico compuesto de extracción de muestras de frutas y verduras. Moleculas.15 (12): 8813-8826. GARZÓN Astrid. (2008), Las antocianinas como colorantes naturales y compuestos biactivos. Departamento de química. Universidad Nacional de Colombia. Bogotá Colombia. GAVIRIA, M. y MEJIA, Evaluación de la extracción de colorantes de la semilla de aguacate como negocio para la región Antioqueña. Tesis (Ingeniera Mecatronica) Envigado. Escuela de Ingeniería de Antioquia, Facultad mecatronica, 2012.99 h. GHISELLI A., Nardini M., Baldi A. y Scaccini C. 1998. Antioxidant activity of different phenolic fractions separted from an Italian red wine. Journal Agricultural and Food Chemistry, 46(2),361-367. 38

GUERRERO, Escobar, Diana Paulina. Extracción y evaluación de un colorante natural a partir de la pepa de aguacate para el teñido de las fibras de algodón y poliéster. Tesis (Ingeniero en Bioquímica). Ambato, Ecuador. Universidad Técnica de Ambato. Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos. 2011.97 h. GUIROLA, C. (2010). Tintes naturales su uso en Mesoamérica desde la época prehispánica. Asociación FLAAR Mesoamérica. Guatemala: Asociación FLAAR Mesoamérica. IBAÑEZ C., Francisco, TORRE, Paloma, IRIGOYEN, Aurora. Aditivos Alimentarios, Universidad Pública de Navarra, Área de Nutrición y Bromatología, febrero 2003.10h. IESN. (Agosto de 2011). Lista de aditivos alimentarios: Instituto de estudios salud natural de chile. Recuperado el Julio de 2012. IWASHINA, T., Bentez, E. R., y Takahashi, R. 2006. Analisys of flavonoids in pubescence of soybean near-isogenic lines for pubencense color loci. Journal of Heredity.97(5):438-443. KLINGER, W., PINZÓN, A., PACHÓN, M., ROJAS, L., ARAGÓN, J., 2002. “ESTUDIO DE LAS ESPECIES PROMISORAS PRODUCTORAS DE COLORANTES EN EL TRAPECIO AMAZONICO”. Centro de Investigación y Desarrollo Científico, Universidad Distrital Francisco José de Caldas. Bogotá. LABIN, Gómez, José Enrique. Obtención natural de tinte natural del exocarpo del coco (Cocus Nucefera L) mediante lixiviación por maceración dinámica utilizando muestra seca y fresca. Tesis (Ingeniero química). Guatemala. Universidad San Carlos de Guatemala. Facultad de Ingeniería en química. 2011.113 h. LEPINIEC, L., DEBEAUJON, I., ROUTABOL, J.M. 2006. La genética y la bioquímica de los flavonoides de semillas. Revisión anual de la biología de las plantas. LYNDE, D. S. (2011). Poda del aguacate en Colombia. Queensland: Congreso Mundial del Aguacate 2001. MARTINEZ Valverde, PERIAGO María, ROS Gaspar. Significado nutricional de los compuestos fenólicos de la dieta, Universidad de Murcia, Facultad de Veterinaria, marzo 2002. MEJÍA Hernández, A. E. (2011). Cadena productiva del aguacate en Colombia. Consejo nacional del aguacate. Consejo Nacional de Aguacate.

MINISTERIO DE AGRICULTURA Y DESARROLLO RURAL. (s.f.). Políticas y programas misionales: Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural. Recuperado el 20 de Octubre de 2012, dehttps://www.minagricultura.gov.co Ministerio de Salud y Agricultura. (1983). Ley 2106. Bogotá: Ministerio de Salud y Agricultura. MIYAZAWA, T., Nakagawa, K., Kudo, M., Muraishi, K. & Someya, K. (1999). Direct intestinal absorption of red fruit anthocyanins, cyaniding-3-glucoside and cyaniding-3,5-diglucoside, into tracts and humans. Journal Agricultural and Food Chemistry, 47, 1083-1091. MORTON, J.F. 1987. Lauraceae.(En línea). In Frutas de climas calientes. Florida, FL. p. 91 – 102. NIELSEN, Suzanne. Análisis de los alimentos. Manual de laboratorio. [En línea] Nueva York: Plenum Publishers, 2003. 170 p. ISBN: 9788420010595. <http://cst.ur.ac.rw/library/Food%20Science%20books/batch1/Food%20Analysis% 20Laboratory%20Manual%20Second%20Edition.pdf> [citado en 25 de Mayo de 2014]. NUÑEZ, C. (2008). Sitio Personal de Carlos Eduardo Núñez. Recuperado el 2012, de http://www.cenunez.com.ar. OLAETA J.A. (2003). Industrialización del aguacate: Estado actual y perspectivas futuras. Facultad de Agronomía Pontificia Universidad Católica de ValparaísoChile. ORTIZ Aguilera, (2011). Propiedades funcionales de las antocianinas. Facultad de ciencias químicas. Universidad de Juárez del Estado de Durango. ORTIZ Rojas, Yamid. Técnicas de extracción y concentración. En: Química de aromas. Base de datos en línea). 401552 (Noviembre. 2012); Capitulo 4 (citado en 05 de junio de 2014) Disponible en DATATECA UNAD. ORTUÑO SÁNCHEZ, Manuel. Manual práctico de aceites esenciales, aromas y perfumes. [Base de datos en línea]. Primera Edición, (2006); p. 275 [citado en 1 de Abril de 2014] Disponible en SlideShare. PARRA Ortega, Verónica Paz. Estudio comparativo en el uso de colorantes naturales y sintéticos en alimento, desde el punto de vista funcional y toxicológico. Tesis (Licenciado en Ciencias de los Alimentos). Santiago de chile. Universidad Astral, Facultad de Ciencias Agrarias, 2004.80 h. PÉREZ López, O. A. (14 de Mayo de 2001). Cinética y extracción de colorantes naturales para la industria textil. Puebla, México: Universidad de Las Américas Puebla. 40

PINO W., GUERRERO J., CASTRO A., CASTRO A., PALACIOS J. y CASTRO A., 2003, Extracción artesanal de colorantes naturales, una alternativa de aprovechamiento de la diversidad biológica del chocó, Colombia, <http://www.virtual.unal.edu.co/revistas/actabiol/PDF's/V8N2/Art9V8N2.pdf> POPENOE, W. (1920) Manual of Tropical and Subtropical Fruits. Macmillan, London, 524 pp. PROEXPORT- SIPPO. (2010). Crecimiento de la capacidad comercial hacia los países EFTA: Inteligencia de mercados para Colombia- Ingredientes naturas. Bogotá: Proexport Colombia. RAMOS M., Moreno A., CHAMORRO G. y GARDUÑO L., 2002 “ESTUDIO DE LAS PROPIEDADES DE LA SEMILLA DE AGUACATE (Persea americana) Variedad Hass, para el Aprovechamiento Integral del Fruto. SALDARRIAGA. (2002). Diseño del proceso de extracción industrial del colorante de la semilla del aguacate. Medellín: Ingeniería de procesos: Universidad EAFIT. SANTACRUZ, Cifuentes. (2011). Análisis químico de las antocianinas en frutos silvestres Colombianos. Bogotá: Departamento de química: Universidad Nacional de Colombia. SHIPP J. y Abdel-Aal S. M. 2010. Food Applications and Physiological Effects of Anthocyanins as Functional Food Ingredients. The Open Food Science Journal, 4:7-22. SOUSA, E .; PESSANHA, M .; ALVES, R .; COLLEEN, C .; CLEVIDENCE, Y .; NOVOTNY, J. Las antocianinas presentes en frutas tropicales seleccionadas: acerola, jambolão, jussara y guajiru. 2005. J. Agric. Food Chem. YABRUDY Vega, Javier. El aguacate en Colombia: Estudio de caso de los Montes de María, en el Caribe Colombiano. Documentos de trabajo sobre Economía Regional. 171(35): Agosto, 2012.