Tesis / 0024 / I.AG. by MAOSABO

EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LAS CONDICIONES DE SECADOSOBRE EL RENDIMIENTO Y COMPOSICIÓN FITOQUÍMICA DEL EXTRACTO OBTENIDO DE LAS HOJAS DE EUCALIPTO (Eucaliptus globulus Labill) EN MICRO EMULSIÓN CON ACEITE DE JATROPHA PARA EL CONTROL ANTIFÚNGICO.

ANDRES FELIPE CASAS CORTES

Trabajo de grado para optar al título de Ingeniero Agroindustrial

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA AGRARIA DE COLOMBIA INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL BOGOTÁ 2016

ANDRES FELIPE CASAS CORTES

Trabajo de grado para optar al título de Ingeniero Agroindustrial

Director: Mauricio Aníbal Sierra Ingeniero Químico MSc. Docente Coordinador de Investigaciones del programa de Ingeniería Agroindustrial

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA AGRARIA DE COLOMBIA INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL BOGOTÁ 2016

Nota de aceptaciรณn

_________________________________________ _________________________________________ _________________________________________

________________________________________ Presidente del jurado

________________________________________ Jurado

Bogotรก, 12 de julio de 2016

DEDICATORIA

A la vida: Por darme la oportunidad de realizar uno de mis mayores sueĂąos y la sabidurĂa para hacer buenas elecciones, mil gracias.

A mis padres: Octaviano y Marta, por sus enseĂąanzas, amor, paciencia y por confiar siempre en mi. Los amo, que Dios los bendiga.

A mis hermanos: Por su amor, paciencia y por estar conmigo en todo momento, que Dios los bendiga.

AGRADECIMIENTOS

A mi tutor: Mauricio Aníbal Sierra. Por su tiempo, apoyo, comprensión y paciencia; por haberme guiado en la realización de este trabajo hasta llevarlo a buen fin.

A Diana Pineda: Por su buena crítica y apoyo, las cuales ayudaron a mejorar este trabajo.

A la Ingeniera Adriana Mejía Terán directora del programa de Ingeniería Agroindustrial de la UNIAGRARIA, por su apoyo en el desarrollo de la investigación.

Al Programa de Ingeniería Agroindustrial por su apoyo financiero, sin el cual este proyecto no hubiese sido posible.

A la Doctora Olga Marín Mahecha, Jefe de Laboratorios de la UNIAGRARIA por toda su disposición y colaboración incondicional en todo momento de este trabajo experimental.

A todo el personal de Laboratorio en especial a Maira por su apoyo.

A la Fundación Universitaria Agraria de Colombia - UNIAGRARIA y sus docentes, por ser nuestro segundo hogar, porque además de formarnos como profesionales, nos formaron como seres humanos.

TABLA DE CONTENIDO

INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 3 1.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y OBJETIVOS DE INVESTIGACIÓN .............. 4

1.1.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA........................................................ 4

1.2.

OBJETIVOS .............................................................................................. 5

Objetivo General ............................................................................................... 5 Objetivos Específicos ....................................................................................... 5 2.

MARCO TEÓRICO .................................................................................................... 6

2.1.

GENERALIDADES DEL EUCALIPTO (Eucaliptus globulus Labill) ........... 6

2.1.1. Características sobresalientes y descripción de la especie (Eucaliptus globulus Labill) .................................................................................................. 6 2.1.2. Localización geográfica de la especie (Eucaliptus globulus Labill) ...... 7 2.1.3. Descripción taxonómica de la especie (Eucaliptus globulus Labill) ...... 7 2.1.4. Principales sustancias en extracto etanólico de las hojas de la especie (Eucaliptus globulus Labill) ............................................................................... 8 2.1.5. Biopesticidas a partir de extractos de eucalipto ................................... 8 2.1.5.1. Mecanismo de acción del extracto etanólico de la especie (Eucaliptus globulus Labill) como antifúngico................................................ 9 2.2. GENERALIDADES Y TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN DE LOS ACEITES O EXTRACTOS ESENCIALES .............................................................................. 10 2.2.1. Métodos de obtención de aceites y extractos esenciales................... 10 2.2.1.1. Arrastre con vapor ....................................................................... 10 2.2.1.2. Destilación agua-vapor ................................................................ 10 2.2.1.3. Hidrodestilación ........................................................................... 11 2.2.1.4. Hidrodestilación asistida por microondas .................................... 11 2.2.1.5. Extracción con solventes volátiles ............................................... 12 2.2.1.6. Expresión ..................................................................................... 12 2.2.1.7. Enfleurage ................................................................................... 12 2.2.1.8. Extracción con fluidos supercríticos ............................................. 12 2.2.1.9. Extracción con solvente método soxhlet ...................................... 12 2.2.2. Técnicas de secado de material vegetal ............................................ 13 2.2.2.1. Secado por convección ............................................................... 13 2.2.2.2. Secado por conducción ............................................................... 13

2.2.2.3. Secado por radiación ................................................................... 13 2.2.3. Efecto del secado sobre el rendimiento y características fitoquímicas del extracto ..................................................................................................... 14 2.2.4. Influencia del tipo de solvente en las características y rendimiento del extracto ........................................................................................................... 14 2.3. CONTROL IN VITRO DE HONGOS FITOPATÓGENOS A PARTIR DE EXTRACTOS VEGETALES ............................................................................... 15 2.3.1. Generalidades de los hongos fitopatógenos ...................................... 15 2.3.2. Generalidades del hongo Fusarium oxysporum Dianthi ..................... 16 2.3.2.1. Clasificación taxonómica ............................................................. 16 2.3.2.2. Características morfológicas de Fusarium oxysporum Dianthi .... 16 2.3.2.3. Sintomatología ............................................................................. 17 2.4.

GENERALIDADES DE LAS MICROEMULSIONES ................................ 17

2.4.1. Clasificación de las microemulsiones ................................................. 18 3.

MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................... 19

3.1.

MATERIALES .......................................................................................... 19

3.2.

MÉTODOS .............................................................................................. 19

3.2.1. Localización del estudio ..................................................................... 19 3.2.2. Descripción del material vegetal......................................................... 20 3.2.3. Pretratamiento del material vegetal .................................................... 20 3.2.3.1. Reducción de tamaño y secado de la materia prima ................... 20 3.2.4. Obtención del extracto etanólico de las hojas de Eucalipto. .............. 21 3.2.5. Análisis fitoquímico preliminar ............................................................ 22 3.2.5.1. Análisis de flavonoides ................................................................ 22 3.2.5.1.1. Prueba de Shinoda ................................................................ 22 3.2.5.1.2. Prueba de Rosenhein ............................................................ 23 3.2.5.1.3. Prueba de ácido sulfúrico ...................................................... 24 3.2.5.1.4. Prueba de leucoantocianidinas ............................................. 24 3.2.5.2. Análisis de fenoles-taninos .......................................................... 25 3.2.5.2.1. Prueba de cloruro férrico ....................................................... 25 3.2.5.2.2. Prueba de acetato de plomo ................................................. 25 3.2.5.3. Análisis de Quinonas ................................................................... 26 3.2.5.4. Análisis de carotenoides-isoprenoides ........................................ 26 3.2.5.5. Análisis de saponinas .................................................................. 27

3.2.5.5.1. Reacción de espuma con NaOH ........................................... 27 3.2.5.5.2. Reacción de espuma con HCl ............................................... 27 3.2.5.6. Análisis de alcaloides- reacción de Wagner ................................ 28 3.2.5.7. Determinación de contenido de clorofila-método de la acetona al 80%. 28 3.2.5.8. Preparación de la microemulsión del extracto de (Eucaliptus globulus Labill). ........................................................................................... 29 3.2.6. Análisis antifúngico............................................................................. 30 3.2.6.1. Técnica de difusión en agar ........................................................ 31 3.2.6.2. Análisis antifúngico extracto puro ................................................ 32 3.2.6.3. Análisis antifúngico de la microemulsión ..................................... 32 3.2.7. Análisis por cromatografía de gases .................................................. 33 3.2.8. Diseño Experimental: ......................................................................... 33 3.2.8.1. Diseño experimental del proceso de secado de las hojas de Eucalipto (Eucaliptus globulus Labill). ......................................................... 33 Análisis estadístico ...................................................................................... 34 4.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS .................................................. 35

4.1.

RESULTADOS DEL SECADO ................................................................ 35

4.1.1. Curvas de secado .............................................................................. 35 4.1.2. Rendimiento en la extracción ............................................................. 36 4.1.3. Análisis de varianza ........................................................................... 37 4.2.

RESULTADOS DEL ANÁLISIS FITOQUÍMICO PRELIMINAR ................ 39

4.2.1. Cuantificación de clorofilas a, b y carotenoides. ................................ 43 4.3.

RESULTADOS DE LA CROMATOGRAFÍA DE GASES ......................... 45

4.4.

RESULTADOS DEL ANÁLISIS ANTIFÚNGICO IN VITRO ..................... 46

CONCLUSIONES .................................................................................................... 48

RECOMENDACIONES ............................................................................................ 49

BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................ 50 ANEXOS ......................................................................................................................... 55

TABLA DE FIGURAS

Figura 1. Eucaliptus Globulus Labill ......................................................................... 7 Figura 2. Obtención de extractos por arrastre con vapor, agua-vapor e hidrodestilación. ..................................................................................................... 11 Figura 3. Localización del estudio, Fundación Universitaria Agraria de Colombia. 20 Figura 4. Esquema metodológico para establecer las curvas de secado en las hojas de Eucalipto. .......................................................................................................... 21 Figura 5. Esquema metodológico de la obtención del extracto presente en las hojas de Eucalipto ........................................................................................................... 22 Figura 6. Esquema metodológico para el análisis de flavonoides-Prueba de Shinoda. ................................................................................................................. 23 Figura 7. Esquema metodológico para el análisis de flavonoides-Prueba de Rosenhein. ............................................................................................................. 23 Figura 8. Esquema metodológico para el análisis de flavonoides-Prueba de ácido sulfúrico. ................................................................................................................ 24 Figura 9. Esquema metodológico para el análisis de flavonoides-Prueba de Leucoantocianidinas. ............................................................................................. 24 Figura 10. Esquema metodológico para el análisis de Fenoles-Taninos-Prueba de Cloruro férrico. ....................................................................................................... 25 Figura 11. Esquema metodológico para el análisis de Fenoles-Taninos-Prueba de acetato de plomo. .................................................................................................. 25 Figura 12. Esquema metodológico para el análisis de Quinonas. ......................... 26 Figura 13. Esquema metodológico para el análisis de Carotenoides. ................... 26 Figura 14. Esquema metodológico para el análisis de Saponinas- Prueba de espuma con NaOH. ............................................................................................... 27 Figura 15. Esquema metodológico para el análisis de Saponinas- Prueba de espuma con HCl. ................................................................................................... 27 Figura 16. Esquema metodológico para el análisis de Alcaloides- Reacción de Wagner. ................................................................................................................. 28 Figura 17. Esquema metodológico para la determinación de clorofilas a y b. ....... 29 Figura 18. Esquema metodológico para la preparación de la microemulsión. ....... 30 Figura 19. Esquema metodológico para el análisis antifungico- técnica de difusión en agar. .................................................................................................................. 31 Figura 20. Esquema metodológico para el análisis antifungico con extracto puro. 32 Figura 21. Esquema metodológico para el análisis antifungico con la microemulsión. ............................................................................................................................... 32 Figura 22. Curvas de secado de las hojas de (Eucaliptus globulus Labill) a diferentes tiempos y temperaturas. ........................................................................................ 35 Figura 23. Rendimiento en la extracción en función de los diferentes pretratamientos. ..................................................................................................... 36

Figura 24. Comparación de medias estadísticas con respecto a los diferentes pretratamientos. Medias y 95.0% de Fisher LSD. .................................................. 38 Figura 25. Dispersión según diferentes pretratamientos. ....................................... 38 Figura 26. Análisis fitoquímico prueba de Shinoda ................................................ 40 Figura 27. Análisis fitoquímico prueba de Rosenhein ............................................ 40 Figura 28. Análisis fitoquímico prueba de leucoantocianidinas .............................. 41 Figura 29. Análisis fitoquímico prueba de ácido sulfúrico ...................................... 41 Figura 30. Análisis fitoquímico prueba de cloruro férrico ....................................... 42 Figura 31. Análisis fitoquímico reconocimiento de isoprenoides ............................ 42 Figura 32. Porcentaje de inoculación por tratamiento en 7 días. ........................... 46 Figura 33. Hoja de Eucaliptus globulus Labill ........................................................ 55 Figura 34. Árbol adulto de Eucaliptus globulus Labill............................................. 55 Figura 35. Árbol joven de Eucaliptus globulus Labill .............................................. 56

LISTADO DE TABLAS

Tabla 1. Descripción taxonómica Eucaliptus globulus Labill .................................... 7 Tabla 2. Clasificación taxonómica del hongo Fusarium oxysporum Dianthi .......... 16 Tabla 3. Modelo experimental de la etapa de laboratorio para la extracción de solución del extracto de las hojas de Eucalipto (Eucaliptus globulus Labill). ......... 34 Tabla 4. Resumen estadístico................................................................................ 37 Tabla 5. Compendio de pruebas fitoquímicas efectuadas a los diferentes extractos. ............................................................................................................................... 39 Tabla 6. Cuantificación de Clorofilas a, b y carotenoides presentes en las hojas de (Eucaliptus globulus Labill). ................................................................................... 43 Tabla 7: Identificación presuntiva y cantidad relativa (%) de los componentes presentes en la muestra de Extracto de Eucalipto con pretratamiento (45C6H) y sin pretratamiento ........................................................................................................ 45

LISTADO DE ANEXOS

Anexo A. (Eucaliptus globulus Labill) ..................................................................... 55 Anexo B. Hojas de (Eucaliptus globulus Labill) secas .......................................... 56 Anexo C. Montaje soxhlet por triplicado para extracción, condensación extracto/etanol. ...................................................................................................... 57 Anexo D. Resumen estadístico .............................................................................. 57 Anexo E. Tabla ANOVA ......................................................................................... 57 Anexo F. Cuantificación de clorofila a, b y carotenoides ........................................ 58 Anexo G. Siembra del hongo Fusarium oxysporum Dianthi .................................. 58 Anexo H. Análisis antifúngico................................................................................ 59 Anexo I. Diámetro de crecimiento del hongo Fusarium oxysporum Dianthi ........... 59 Anexo J. Porcentaje de crecimiento del hongo Fusarium oxysporum Dianthi ....... 60

RESUMEN

Los extractos vegetales forman parte muy importante en la agroecología, ya que estos benefician al medio ambiente, combatiendo organismos fitopatógenos, sin recurrir a agentes químicos. El objetivo principal de este estudio fue evaluar el efecto del pre tratamiento de secado sobre el rendimiento y composición fitoquímica del extracto obtenido de las hojas de eucalipto (Eucaliptus globulus Labill) y el efecto antifúngico del extracto puro y en microemulsión sobre el hongo (Fusarium oxysporum Dianthi). El estudio se llevó a cabo en el laboratorio de Ingredientes Naturales del programa de Ingeniería Agroindustrial de la Fundación Universitaria Agraria de Colombia. En esta investigación se realizó un secado a las hojas de (Eucaliptus globulus Labill) a dos tiempos (4-6 horas) y dos temperaturas (35-45 C°). Posteriormente se efectuó una extracción sólido-líquido usando etanol como solvente. A los extractos se les realizó una evaluación fitoquímica preliminar con el fin de determinar la presencia de metabolitos secundarios de interés agroindustrial. Se realizó un análisis preliminar antifungico in-vitro por el método de difusión en agar con muestras de extracto puro y microemulsión de extracto/Jatropha. El pretratamiento que presento mayor rendimiento fue el de 45°C y 4 horas (49%). Del análisis fitoquímico no se evidenció un efecto significativo del secado encontrando metabolitos de tipo fenólico, flavonoides y carotenoides en todas las muestras. El análisis antifúngico in-vitro revelo que los extractos de (Eucaliptus globulus Labill) en su estado puro y en microemulsión con aceite de Jatropha presentan un efecto inhibidor de crecimiento en concentraciones de 0,5%-1%-1,5% y 1%-2% respectivamente frente al hongo fitopatógeno (Fusarium oxysporum Dianthi).

Palabras clave: Eucaliptus globulus Labill, soxhlet, antifúngico, pretratamiento, fitoquímico, Fusarium oxysporum Dianthi.

ABSTRACT

The plant extracts are very important in the agro ecology, since they benefit the environment, battling phytopathogenic organisms without resorting to chemical agents. The main objective in this study was to evaluate the effect of pretreatment on the efficiency and phytochemical composition of the extract obtained from the eucalyptus leaves (Eucaliptus globulus Labill), the antifungal effect of pure extract and micro emulsion on the fungus (Fusarium oxysporum Dianthi). The study was carried out in the laboratory of Natural Ingredients of Agro-industrial Engineering program at the Fundación Universitaria Agraria de Colombia. In this research was carried out the drying cycle to eucalyptus leaves (Eucaliptus globulus Labill) at different times (4-6 hours) and temperatures (35-45 C°), afterward, it was made a solid-liquid extraction using ethanol as solvent. The extracts underwent to a phytochemical preliminary assessment in order to determine the presence of secondary metabolites of agro industrial interest. Then, it was made an antifungal analysis in vitro by the agar diffusion method with samples of pure extract and extract/Jatropha micro-emulsion. The biggest pretreatment performance was 45 ° C and 4 hours (49%). The phytochemical analysis did not show a significant effect on the drying in which was found: metabolites of phenolic, flavonoids and carotenoids types on all the samples. The antifungal analysis in vitro showed that the extracts of eucalyptus leaves (eucaliptus globulus Labill) in its pure state and Jetropha oil microemulsion presented an inhibitor effect on growth concentration of 0,5%-1%-1,5% and 1%-2%, respectively against the plant pathogenic fungus (Fusarium oxysporum Dianthi).

Keywords: Eucaliptus globulus Labill, soxhlet, antifungal, phytochemical composition, Fusarium oxysporum Dianthi. .

pretreatment,

INTRODUCCIÓN En la agricultura mundial los hongos fitopatógenos dentro de ellos el Fusarium oxysporum Dianthi (Arbeláez, 2000), son causales de enfermedades de pre y post cosecha en cultivos de cereales, frutales y hortalizas, siendo estos responsables de pérdidas económicas cuantiosas, el daño que ocasiona no solo se refiere a las pérdidas de producción económica sino también a las pérdidas de producción biológica, es decir, a la alteración que existe en el crecimiento y desarrollo de las plantas hospedantes atacadas por estos microorganismos (Agrios, 2005). Garces de Granada (1992) afirma que generalmente el ataque de hongos, se controla con dosis altas y continuas de fungicidas, lo cual incrementa los costos de producción y crea además un desequilibrio ecológico al aumentar los niveles tóxicos en el ambiente eliminando los microorganismos benéficos del suelo y del agua (Díaz et. al , 1998). Como alternativa a estos fúngicos, numerosos estudios (Cázar et. al, 2015, Moreno, 2011) se han enfocado en la búsqueda de sustancias procedentes de las plantas, que puedan dar un resultado efectivo en el tratamiento de hongos patógenos. Buscando así una alternativa que respete el equilibrio biológico del ecosistema y brinde a las plantas cualidades tales como mecanismos de defensa contra microorganismos y herbívoros. Los extractos de Eucalipto (familia Myrtaceae) presentan una buena opción, ya que las diversas especies de esta planta son ampliamente conocidas por producir sustancias con actividad biosida frente a hongos, bacterias, insectos e incluso oomicetes (Pardo, 2013). La gran mayoría de los estudios efectuados respecto de la obtención de extractos de las hojas de eucalipto se han llevado a cabo sin un pretratamiento de secado del material fitogenético (Murillo et. al, 2012) aspecto que es de gran importancia en el rendimiento del extracto, como lo evidencia estudios de investigación por Gómez (2007) respecto del efecto que presenta el tiempo y temperatura de secado en rendimiento y calidad del extracto de (Lippia alba Mill) mostrando que a medida que aumentaron las temperaturas (40 a 80 ºC), los tiempos de secado y de extracción (30 a 75 min), se presentó un aumento en el rendimiento del extracto. De igual manera obtuvieron un aumento de concentraciones relativas de compuestos de interés industrial. En esta investigación se seleccionaron hojas de eucalipto (Eucaliptus globulus Labill) las cuales se sometieron a pretratamiento de secado a dos tiempos y dos temperaturas (35°C-4h, 35°C-6h, 45°C-4h, 45°C-6h). Al material seco se le realizó extracción por solvente método soxhlet y se determinó el mayor rendimiento, posteriormente se realizó un análisis fitoquímico preliminar a todas las muestras para establecer la muestra que mayor contenido de metabolitos secundarios 3

presentaba, esta se usó como agente fungicida in-vitro para el control fitopatógeno del hongo Fusarium oxysporum Dianthi.

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y OBJETIVOS DE INVESTIGACIÓN 1.1.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Estudios previos han demostrado la importancia del secado de la materia prima en la composición y rendimiento del extracto de especies naturales que han llegado a sobrepasar el 80 % con respecto al contenido del extracto sin un proceso de secado (Gómez, 2007). Barbosa et. al (2006) en su estudio sobre extracto de Citral obtenido a partir de Capim-limao demostraron que la concentración del principio activo aumento significativamente cuando las hojas se sometieron al tratamiento de secado con respecto a la concentración obtenida a partir de hojas frescas. Lima (2005) en su estudio realizado sobre el efecto del secado en el rendimiento de la extracción de aceites de dos variedades de Eucalipto afirma que una incorrecta forma de secado y pretratamiento aumenta más la cantidad de productos de degradación sin valor industrial y terapéutico, perdiendo así el principio activo y su calidad. Por lo anterior se hace necesario evaluar el efecto del pretratamiento en el rendimiento y calidad del extracto así como el potencial fungicida de esta especie promisora en la obtención de extractos benéficos para el control de plagas en el sector agroindustrial, con este fin la presente propuesta busca dar respuesta a la siguiente pregunta: ¿Qué efecto tiene el pre tratamiento de secado del material vegetal sobre el rendimiento y composición fitoquímica del extracto obtenido de las hojas de Eucalipto (Eucaliptus globulus Labill) en microemulsión con aceite de Jatropha para el control de hongos fitopatógenos?

1.2.

OBJETIVOS

Objetivo General

Determinar el efecto de las condiciones de secado sobre el rendimiento, composición fitoquímica y acción antifúngica del extracto obtenido de las hojas del Eucalipto (Eucaliptus globulus Labill). Objetivos Específicos 

Evaluar el efecto de la temperatura y tiempo de secado de las hojas del Eucalipto sobre el rendimiento del extracto.



Evaluar cualitativamente el efecto del secado sobre los componentes del extracto por medio de un análisis fitoquímico preliminar.



Establecer el efecto antifúngico in vitro del extracto y la microemulsión (extracto de Eucalipto/aceite de Jatropha) obtenida.

2. MARCO TEÓRICO 2.1.

GENERALIDADES DEL EUCALIPTO (Eucaliptus globulus Labill)

2.1.1. Características sobresalientes y descripción de la especie (Eucaliptus globulus Labill) Eucaliptus globulus Labill es la especie de eucalipto más conocida y plantada en el mayor número de países en el mundo. Es fácil de establecer, de rápido crecimiento y resiste los vientos y heladas. Es un árbol de buen porte y forma, usado como ornamental por su follaje plateado, fácilmente reconocible por el penetrante olor a alcanfor de las hojas al estrujarlas. La madera produce leña de buena calidad y muy utilizada en zonas altas de américa del sur. Es muy susceptible a sequias fuertes y prolongadas, así como a suelos profundos o muy compactos (Costa Rica, 1986). Es un árbol de elevada talla, que llega a alcanzar los 70 m de altura y los 2 m de diámetro, aunque normalmente supera los 50 m de altura y los 1,50 m de diámetro medido a 1,30 m de altura sobre el suelo (denominada "altura normal" o "altura del pecho"). El mayor ejemplar que se cita en España es el eucalipto de Charia (Vivero, Lugo) con 80 m de altura y más de 6 m de circunferencia en la base del tronco. Estas enormes dimensiones se alcanzan en árboles de avanzada edad, aislados o en alineaciones, pero nunca en cultivos forestales, pues en éstos se cortan para su aprovechamiento maderero cuando todavía tienen dimensiones bastantes menores (Balmelli, 1995). El sistema radicular es profundo. Posee fuste de base recta con corteza lisa, con moteaduras grises, marrón y verdosas o azuladas que desprende en tiras largas; corteza interna amarilla clara con una capa delgada de color verde. Sus ramas tienen corteza lisa, delgada, de color verde azulado. Las ramillas son delgadas, cuadrangulares, de color verde-amarillo que se tornan rojas o marrón oscuros. Las hojas juveniles son opuestas, glaucas; las hojas adultas son alternas, pecioladas, lanceoladas y a menudo curvadas, que cuelgan en peciolos amarillentos, están ligeramente acuminadas en el ápice y base decurrente, de bordes lisos, glabras, gruesas, con nervaduras secundarias rectas y numerosas y nervaduras paralelas a los bordes; de color verde oscuro brillante en el haz y el envés. Las flores son individuales y blancas (raras veces hay dos o tres) en la base de las hojas, con un pedicelo delgado y muy corto. Los frutos o capsulas simples, se encuentran en la base de las hojas, son redondeados, tetragonales y arrugados, con un disco blanquecino, ancho, grueso, aplanado o convexo y 3-5 incisiones. Las semillas son numerosas, (230,000ª 330,000 semillas/Kg) irregulares, elípticas, de 2-3 mm de longitud de color negro mate, con muchas semillas pequeñas y estériles. La madera es blanca, con duramen amarillo marrón pálido, con textura mediana, de grano recto a entrecruzado y los anillos de crecimiento conspicuos (Costa Rica, 1986). 6

Fuente: Jardín botánico

Figura 1. Eucaliptus Globulus Labill 2.1.2. Localización geográfica de la especie (Eucaliptus globulus Labill) El eucalipto blanco (Eucaliptus globulus Labill) se considera la especie leñosa más cultivada y difundida actualmente en el mundo, encontrándose como especie introducida en las islas mediterráneas, Azores, Irlanda, América del Sur, California, América tropical y la India, estando asilvestrado en alguno de estos países (Ruiz de la torre, 2006). La distribución natural de (Eucaliptus globulus Labill) esta confinada a Tasmania, Victoria y Nueva Gales del sur de Australia entre las latitudes 31° y 43° S. presentándose cuatro sitios principales de ocurrencia: Los Pirineos australianos; You Yangs-Bacchus Marsh; en el oeste de Tasmania e Isla del Rey. Actualmente la especie se ha plantado en Europa, África, América del sur (Brasil, Perú, Ecuador, Colombia) y en Hawái. En América central se localizan pequeñas plantaciones y arboles aislados en casi todos los países (Costa Rica, 1986). 2.1.3. Descripción taxonómica de la especie (Eucaliptus globulus Labill) Tabla 1. Descripción taxonómica Eucaliptus globulus Labill Reino División Orden Familia Género Epíteto específico Autor del epíteto específico Nombre científico

Plantae Angiosperms Myrtales Myrtaceae Eucalyptus Globulus Labill. Eucalyptus globulus Labill

Fuente: Jardín Botánico

2.1.4. Principales sustancias en extracto etanólico de las hojas de la especie (Eucaliptus globulus Labill) Para la mayoría de las especies del género, las principales investigaciones han sido dirigidas al estudio del aceite esencial de sus hojas. Su contenido oscila entre el 0,5 y el 3,5 %1,8-cineol (eucaliptol) que es el que se encuentra en mayor proporción (70% como mínimo). Acompañado de aproximadamente una centena de otros componentes terpénicos: hidrocarburos y alcoholes monoterpénicos, sesquiterpenos, cetona, ésteres, hidrocarburos. En el aceite esencial no rectificado se encuentran aldehídos alifáticos. Parte destilada: hojas y tallos (Lima, 2005). La sustancia que se encuentra especialmente en esta planta es el eucaliptol, que tiene propiedades expectorantes y antiinflamatorias, también contiene taninos, resina y ácidos grasos. El aceite extraído de esta variedad posee un efecto refrescante. Esta variedad se utiliza en muchas especialidades farmacéuticas por sus virtudes sobre el sistema respiratorio. Facilita la disolución y eliminación de mucosidades de los bronquios (Balsámico, mucofluidificante y expectorante), antiinfecciosos contra las bacterias y los virus. Antireumatismal. Estimulante y tonificante. Es muy utilizado para purificar el aire en casos de epidemia y como repelente de insectos (Alfonsina et. al, 2008).

2.1.5. Biopesticidas a partir de extractos de eucalipto El control de enfermedades causadas por hongos filamentosos tales como los pertenecientes al género Fusarium, que es catalogado como uno de los más importantes géneros de hongos patógenos en cultivos de frutales, ornamentales y hortalizas (Kyanko et. al, 2010), se ha convertido en objeto de estudio por parte de científicos los cuales buscan dar una solución sostenible y amigable con el medio ambiente en pro de eliminar el uso de sustancias agroquímicas las cuales ponen en peligro la sostenibilidad agrícola y ambiental. Numerosos estudios apuntan al uso de aceites y extractos etanolitos de la familia Eucalyptus como una fuente promisoria de sustancias antimicrobianas (Schelz et. al, 2006, Inouye et. al, 2006) y antifungicas (Foley & Lassak, 2004). Las sustancias que contienen dichos extractos de Eucalipto y les confieren propiedades antifúngicas son principalmente metabolitos secundarios como los fenoles y los terpenoides, estos últimos, responsables del olor característico del follaje de este género (Foley & Lassak, 2004). Algunos de los compuestos más importantes encontrados hasta el momento en distintas especies de eucalipto son: el 1,8‐cineol, citronelal, citronelol, acetato de citronelilo, p‐cimeno, limoneno, eucamalol, linalol, α‐pineno, terpineno, α‐terpineol, alloocimeno y aromadendreno (Watanabe et. al, 1993). 8

En estudios realizados por Murillo et. al (2012) se evaluó el potencial insecticida agudo y crónico sobre (Drosophila melanogaster) y antifúngico en (Fusarium oxysporum) de emulsiones aceite-en-agua de mezclas binarias y ternarias de extractos de (Nicotiana tabacum), (Azadiractha indica Neem), y aceite esencial de (Eucalyptus tereticornis), obteniendo como resultado una actividad fungicida en el eucalipto a 3 g/L con un porcentaje inhibitorio igual al 100%, demostrando su alta eficacia como antifúngico. Las especies de Eucalyptus no solamente proveen biomasa y reducen el dióxido de carbono atmosférico directamente (Barton, 2000, Martín, 2002) además puede realizar una cantidad alta de actividades y servicios indirectos a través del uso de su aceite esencial como un agente repelente, insecticida y pesticida (Barton, 2000). En efecto el aceite esencial de Eucalyptus ha sido reconocido durante décadas como un antibacterial, antifúngico y antiséptico natural (Brooker & Kleinig, 2006). En condiciones naturales se conoce que el aceite esencial de Eucalyptus provee propiedades alelopáticas a la planta (Kohli, 1990, Liu et. al, 2008). Demostrando su acción en la tardanza del desarrollo de otras especies vegetales simbióticas en la zona donde se encuentre la planta, adicionalmente provee una defensa natural para el follaje del Eucalyptus contra algunos herbívoros y un sin número de insectos perjudiciales para la misma (Brooker & Kleinig, 2006).

2.1.5.1.

Mecanismo de acción del extracto etanólico de la especie (Eucaliptus globulus Labill) como antifúngico.

Dentro de los metabolitos secundarios con actividad fungicida se encuentran los provenientes de la fracción líquida volátil que contiene las sustancias responsables del aroma de las plantas (Harbone, 1998) o aceites esenciales. Generalmente son mezclas complejas de hasta más de 100 componentes de bajo peso molecular como compuestos alifáticos simples, alcoholes, aldehídos, cetonas, ésteres y ácidos, que hacen parte de los monoterpenos, sesquiterpenos y fenilpropanos (Mesa et. al, 2004). Los aceites esenciales son conocidos por ejercer actividad antimicrobiana (Mesa et. al, 2004, Schelz et. al, 2006, Barreto et. al, 2006). Aunque el mecanismo por el cual actúan no está totalmente entendido, puede involucrarse en éste la destrucción de la membrana microbiana por los constituyentes lipofílicos que poseen (Schelz et. al, 2006, Keeler & Tu, 1991), y estudios recientes reportan otros efectos como cambios en la morfología del hongo que incluyen daños sobre estructuras como conidias, macroconidias e hifas, así como la disminución en la producción de micotoxinas (Park et. al, 2009). Las plantas sintetizan metabolitos secundarios como las fitoanticipinas y las Fitoalexinas, que utilizan para defenderse de la infección por agentes fitopatogenos, entre ellos los hongos (Taylor, 1998). Otras moléculas producidas por las plantas son las fitodefensinas, de naturaleza peptídica y ricas en cisteína, con capacidad de inhibir el crecimiento de los hongos al producir en ellos cambios morfológicos y daño 9

en algunas estructuras celulares (De Lucca & Walsh, 1999). Por esta razón, dichas moléculas pueden ser candidatas para estudios in vitro contra agentes micoticos implicados en infecciones humanas y también sobre hongos fitopatogenos que atacan a las plantas (Agrios, 2005). 2.2.

GENERALIDADES Y TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN DE LOS ACEITES O EXTRACTOS ESENCIALES

2.2.1. Métodos de obtención de aceites y extractos esenciales Los aceites esenciales se pueden extraer de las muestras vegetales mediante varios métodos como son: expresión, destilación con vapor de agua, extracción con solventes volátiles, enfleurage y con fluidos supercríticos (Martínez, 2001). Stashenko (2009) afirma que los aceites esenciales se pueden obtener de material vegetal por tres principales métodos, arrastre con vapor, destilación con agua-vapor e hidrodestilacion. 2.2.1.1.

Arrastre con vapor

En la destilación por arrastre con vapor de agua, la muestra vegetal generalmente fresca y cortada en trozos pequeños, es encerrada en una cámara inerte y sometida a una corriente de vapor de agua sobrecalentado, la esencia así arrastrada es posteriormente condensada, recolectada y separada de la fracción acuosa (Chem J. , 1980). Este proceso se lleva a cabo con vapor seco sobrecalentado, generado usualmente por una caldera, que penetra el material vegetal a presión más alta que la atmosférica, la corriente de vapor rompe las células o canales oleíferos en la planta y arrastra la mezcla volátil, que se condensa luego de atravesar un refrigerante. Generalmente los aceites son más livianos que el agua y muy poco solubles en ella; por ende, pueden ser separados por decantación. El método de arrastre con vapor se usa para extraer aceites de rizomas, raíces, semillas y hojas secas o fermentadas de algunas plantas. 2.2.1.2.

Destilación agua-vapor

En este sistema de extracción se emplea un vapor húmedo, proveniente del agua en ebullición, que traspasa el material vegetal suspendido encima y apoyado sobre una malla. La mayoría de plantas herbáceas se destilan por este método (Stashenko, 2009).

2.2.1.3.

Hidrodestilación

Es un proceso cuando el material vegetal se sumerge directamente al agua, que se calienta a hervor. Este método se usa para la destilación del material vegetal delicado, por ejemplo, flores (Stashenko, 2009).

Fuente: (Stashenko, 2009)

Figura 2. Obtención de extractos por arrastre con vapor, agua-vapor e hidrodestilación. 2.2.1.4.

Hidrodestilación asistida por microondas

La hidrodestilación asistida con microondas consiste en la utilización de un extractor cerrado donde se sumerge el disolvente y el material, dentro de un horno microondas conectado a un condensador. El horno microondas crea un campo eléctrico que produce calor y brinda un calentamiento homogéneo a toda la muestra lo que lleva a la ruptura de la pared celular y liberación de los aceites esenciales de la planta. En comparación a la hidrodestilacion esta técnica es más rápida y posee un buen rendimiento de extracción (Golmakani & Rezaei, 2007). Las mezclas obtenidas por los métodos anteriormente mencionados reciben el nombre de “aceites esenciales”; otros productos, asilados por maceración en diferentes solventes o con fluido supercrítico (CO2), se llaman, generalmente, “extractos”, y no “aceites”; entre ellos figuran concretos-obtenidos por extracción con hidrocarburos de la plantas aromáticas o, más frecuentemente, de flores, y absolutos, que se separan de los concretos por acción del alcohol (Ramírez et. al, 2006).

2.2.1.5.

Extracción con solventes volátiles

En el método de extracción con solventes volátiles, la muestra seca y molida se pone en contacto con solventes tales como alcohol, cloroformo, etc. Estos solventes solubilizan la esencia pero también solubilizan y extraen otras sustancias tales como grasas y ceras, obteniéndose al final una esencia impura (Chem J. , 1991). 2.2.1.6.

Expresión

En la expresión el material vegetal es exprimido para liberar el aceite y este es recolectado y filtrado. Este método es utilizado para el caso de las esencia de cítricos (Martínez, 2001). 2.2.1.7.

Enfleurage

En el método de enflorado o enfleurage, el material vegetal (generalmente flores) es puesto en contacto con un aceite vegetal. La esencia es solubilizada en el aceite vegetal que actúa como vehículo extractor. Se obtiene inicialmente una mezcla de aceite esencial y aceite vegetal la cual es separada posteriormente por otros medios físico-químicos (Martínez, 2001). 2.2.1.8.

Extracción con fluidos supercríticos

El método de extracción con fluidos supercríticos, el material vegetal cortado en trozos pequeños, licuado o molido, se empaca en una cámara de acero inoxidable y se hace circular a través de la muestra un líquido supercrítico (por ejemplo bióxido de carbono líquido), las esencias son así solubilizadas y arrastradas y el líquido supercrítico que actúa como solvente extractor y se elimina por descompresión progresiva hasta alcanzar la presión y temperatura ambiente, y finalmente se obtiene una esencia pura (Kerrola & Kallio, 1993) (Yonei & Col, 1995). Existen otras técnicas de extracción comúnmente usadas entre las cuales encontramos, hidrodestilacion asistida con microondas, extracción por método soxhlet (Bimakr et. al, 2011). 2.2.1.9.

Extracción con solvente método soxhlet

La extracción con método soxhlet tiene como función la recirculación de vapores condensados con ayuda de un sifón arrastrando consigo el extracto de la materia prima. Para la extracción por este método se debe tener en cuenta el solvente, entre los más utilizados se encuentra el etanol. El contenido de extracto se cuantifica por diferencias de pesos (Bimakr et. al, 2011). 12

2.2.2. Técnicas de secado de material vegetal El secado o deshidratación es una técnica de conservación de materiales cuyo objetivo principal es la disminución de la actividad del agua de los mismos. Desde la antigüedad se ha reconocido que los alimentos o materiales vegetales con mayor contenido en humedad son los más perecederos, de tal manera que el control del contenido en agua es una herramienta para su conservación (Moraga, 2002). 2.2.2.1.

Secado por convección

Durante la deshidratación tiene lugar un transporte simultáneo de calor y materia. En los secadores convectivos el calor se transfiere al material vegetal mediante una corriente de aire caliente que además de transmitir el calor necesario para la evaporación del agua, es también el agente transportador del vapor de agua que se elimina del material (Fito et. al, 2001). Al calentar al producto por convección, el calor penetra hacia el interior del alimento a través de la superficie principalmente por conducción, mientras que la humedad debe salir a través de ella, por lo que el gradiente de temperatura es contrario al gradiente de humedad. 2.2.2.2.

Secado por conducción

Cuando se calienta un cuerpo sólido y las moléculas que reciben directamente el calor aumentan su vibración y chocan con las que están alrededor, estas hacen lo mismo a su vez con las moléculas vecinas hasta que todas se agitan con la misma velocidad, por esta razón una cuchara metálica que se calienta en una flama y al transcurrir varios segundos el calor llega hasta el otro extremo. El producto que debe secarse se encuentra en recipientes calentado o se desplaza por encima de estos. El calor también se difunde en el sólido a través de la conductividad del propio sólido (Sánchez, 2007). 2.2.2.3.

Secado por radiación

Este mecanismo se produce como resultado del movimiento vibratorio de los átomos y moléculas de los cuerpos, los cuales emiten ondas o radiaciones electromagnéticas que se propagan como la luz a través de los cuerpos. Un ejemplo lo podemos observar por medio del sol, como fuente primaria de energía, que emite su calor en forma de radiación, este a su paso por el espacio no calienta, sino hasta chocar con la superficie terrestre es cuando la Tierra absorbe la energía radiante como calor (Madrid Vicente, 1994). También se reporta en la literatura el secado por sublimación, denominando así́ al secado en estado de congelación al vacío profundo. Según el método de transmisión del calor este procedimiento es análogo al secado por conducción pero debido a sus peculiaridades el secado por sublimación se destaca como un grupo especial (Kviesitis, 1975). 13

2.2.3. Efecto del secado sobre el rendimiento y características fitoquímicas del extracto Estudios previos han demostrado la importancia del secado de la materia prima en la composición y rendimiento del extracto de especies naturales que han llegado a sobrepasar el 80 % con respecto al contenido del extracto sin un proceso de secado (Gomez, 2007). Barbosa et. al (2006) en su estudio sobre extracto de Citral obtenido a partir de Capim-limao demostraron que la concentración del principio activo aumento significativamente cuando las hojas se sometieron al tratamiento de secado con respecto a la concentración obtenida a partir de hojas frescas. Lima (2005) en su estudio realizado sobre el efecto del secado en el rendimiento de la extracción de aceites de dos variedades de Eucalipto afirma que una incorrecta forma de secado y pretratamiento aumenta más la cantidad de productos de degradación sin valor industrial y terapéutico, perdiendo así el principio activo y su calidad. En estudios realizados por Evans (1991) se afirma que “La desecación artificial o secado mecánico contribuye a que las flores y hojas conserven su color y las drogas aromáticas su aroma, pero la temperatura empleada en cada caso ha de ajustarse en función de los componentes y la naturaleza física de los metabolitos contenidos. Como regla general, las hojas, sumidades y flores deben secarse entre 20 y 40 ° C y las cortezas y raíces de 30 a 65 ° C”, con el fin de conservar en mayor medida los principios activos de interés. 2.2.4. Influencia del tipo de solvente en las características y rendimiento del extracto Debe seleccionarse un solvente de tal forma que ofrezca el mejor balance de varias de sus características deseables; alto límite de saturación y selectividad respecto al soluto por extraer, capacidad para producir el material extraído con una calidad no alterada por el disolvente, estabilidad química en las condiciones de proceso, baja viscosidad, baja presión de vapor, baja toxicidad e inflamabilidad, baja densidad, baja tensión superficial, facilidad y economía de recuperación de la corriente del extracto y bajo costo (Dahlstrom, 1999). Cada solvente permite obtener extractos y composiciones específicos. Uno de los solventes más ampliamente utilizados para obtener extractos de plantas es el hexano. Sin embargo, el n-hexano, el elemento principal del hexano comercial, está ubicado como el número uno en la lista de los 189 contaminantes del aire más riesgosos por la Agencia Americana de Protección del Ambiente. El uso de solventes alternativos tales como: isopropanol, etanol, hidrocarburos, e incluso el agua, se ha incrementado debido a asuntos medioambientales, la salud y a preocupaciones de seguridad, sin embargo, los solventes alternativos producen a menudo menos recuperación debido a una 14

afinidad molecular disminuida entre el solvente y el soluto. Los costos de los solventes alternativos pueden ser superiores. En ocasiones se agrega un cosolvente para aumentar la polaridad de la fase liquida. Además, se han reportado extracciones de mezclas de isopropanol y el hexano para aumentar el rendimiento y la cinética de extracción (Lizcano, 2007). 2.3.

CONTROL IN VITRO DE HONGOS FITOPATÓGENOS A PARTIR DE EXTRACTOS VEGETALES

2.3.1. Generalidades de los hongos fitopatógenos Los patógenos más importantes que causan elevadas pérdidas de frutas y hortalizas son normalmente las bacterias y hongos, sin embargo, con mayor frecuencia son especies de hongos las causantes del deterioro patológico de frutas, hojas, tallos y productos subterráneos (raíces, tubérculos, cormos, etc.) (Juárez-Becerra et al , 2010). Algunas fuentes estiman que dichas pérdidas son del orden de 5-25% en países desarrollados y 20-50% en países en desarrollo (FHIA, 2007). Una amplia gama de hongos han sido caracterizados como causantes del deterioro patológico en una variedad de productos, siendo los más comunes especies de Alternaria, Botytis, Diploida, Monilinia, Penicillium, Colletotrichum, Phomopsis, Fusarium, Rhizopus y Mucor (FHIA, 2007). Las enfermedades de las plantas suelen ser una limitante en la producción de cualquier cultivo, por lo que un factor importante a considerar es su control (Investigacion y Desarrollo, 2010). Existen diferentes métodos que pueden ser usados para el control de fitopatogenos, dentro de los que se pueden mencionar la aplicación de fungicidas químicos, tratamientos térmicos, aplicación de aceites esenciales entre otros (Juárez-Becerra et. al, 2010). Se considera que existen más de 8000 especies de hongos que producen enfermedades en las plantas. La mayoría de las plantas pueden ser atacadas por algún tipo de hongo (o por varios) y también se sabe que un mismo hongo fitopatógeno puede infectar a uno o más tipos de plantas, aunque sean de diferentes familias, la mayor parte de hongos fitopatógenos pasan la mayoría de su ciclo de vida en la planta que les sirve de huésped (como parasito) y otra parte en el suelo, en los residuos vegetales que se encuentran ahí (como saprofitos), aunque algunos solo se desarrollan como parásitos. Generalmente los cuerpos reproductores del hongo se forman en la superficie de los tejidos de la planta huésped (o muy cerca de ella), lo cual causa que las esporas se dispersen rápida y fácilmente (García, 2004). Los efectos que producen los hongos en las plantas pueden ser de tipo local, cuando afectan una porción pequeña del tejido, o general, si causan un daño completo a toda la planta, lo cual depende del tipo de planta que parasiten. Sin embargo, en una misma planta pueden producir primero un efecto local y luego uno generalizado. El daño producido por hongos es, principalmente una muerte del 15

tejido (necrosis) que infectan. También pueden producir atrofia de la planta completa o de algunas de sus partes y, en otros casos, pueden causar un crecimiento excesivo (hipertrofia). Además, los hongos que afectan la raíz, o bien el sistema vascular de la planta, tienden a producir color amarillo en la planta y marchitez (García, 2004). Las manchas foliares, el tizón, la putrefacción de la raíz son algunos ejemplos de signos necróticos, mientras que los signos asociados con la hipertrofia de partes de las plantas pueden ser agallas de las raíces, verrugas o tumores. Todos los efectos mencionados pueden causar atrofia o disminución de la vitalidad de las plantas (o de los órganos infectados), lo que puede llevar a la muerte de la planta o a que esta sea improductiva (García, 2004).

2.3.2. Generalidades del hongo Fusarium oxysporum Dianthi 2.3.2.1.

Clasificación taxonómica

Tabla 2. Clasificación taxonómica del hongo Fusarium oxysporum Dianthi REINO

Fungi

PRHYLUM

Ascomycota

CLASE

Sordariomycetes

SUBCLASE

Hypocreomycetidae

ORDEN

Hypocreales

FAMILIA

Nectriaceae

GÉNERO

Fusarium

ESPECIE

Fusarium oxysporum

NOMBRE CIENTIFICO

Fusarium oxysporum Dianthi

Fuente: (Moreno, 2011)

2.3.2.2.

Características morfológicas de Fusarium oxysporum Dianthi

Fusarium oxysporum Dianthi es un hongo cosmopolita que existe en muchas formas patogénicas, parasitando más de 100 especies de plantas, gracias a los diversos mecanismos que tiene el hongo para vencer las defensas de muchas plantas (Bosland, 1988). Se caracteriza por producir colonias de rápido crecimiento, con una tasa diaria cercana a un centímetro en medio papa – dextrosa - agar (PDA) a 25ºC. La morfología de las colonias es muy variable y puede presentando dos tipos: una de tipo micelial caracterizada por la producción de abundante micelio aéreo, algodonoso, con una coloración variable, de blanco a rosado durazno, pero 16

usualmente con un tinte púrpura o violeta más intenso en la superficie del agar (Booth, 1970). El hongo produce tres clases de esporas: Microconidias, esporas generalmente unicelulares, sin septas, hialinas, elipsoidales a cilíndricas, rectas o curvadas; se forman sobre fiálides laterales, cortas, simples o sobre conidióforos poco ramificados. Las microconidias tienen 5- 12 μm de largo por2.5- 3.5 μm de ancho (Nelson, 1981). Macroconidias, esporas de paredes delgadas, fusiformes, largas, moderadamente curvadas en forma de hoz, con varias células y de 3 a 5 septas transversales, con la célula basal elongada y la célula apical atenuada; las macroconidias tiene un tamaño de 27 a 46 μm de largo por 3.0 a 4.5 μm de ancho (Nelson, 1981). Clamidosporas, esporas formadas a partir de la condensación del contenido de las hifas y de las conidias, de paredes gruesas. Se forman simples o en pares, terminales o intercalares: poseen un tamaño de 5 a 15 μm de diámetro (Nelson, 1981). Estas estructuras le permiten al hongo sobrevivir en condiciones ambientales desfavorables y en el suelo como saprófito de vida libre en ausencia de plantas hospederos (Garret, 1977). 2.3.2.3.

Sintomatología

La enfermedad se caracteriza por la aparición unilateral de los síntomas de marchitamiento, acompañada del amarillamiento parcial de las hojas y el doblamiento de los brotes hacia el lado de la planta enferma, a causa de la interferencia en el crecimiento; en estados iniciales en las hojas puede observarse la mitad clorótica y la mitad de un color verde normal. Se observa además un enanismo de los brotes y disminución del crecimiento de la planta. Los síntomas de la enfermedad avanzan afectando la planta hacia arriba hasta causar un marchitamiento generalizado y la muerte (Moreno, 2011).

2.4.

GENERALIDADES DE LAS MICROEMULSIONES

Las microemulsiones se definen como un sistema de agua, aceite y por lo menos un compuesto anfifílico que se presenta como una solución líquida simple, ópticamente isotrópica y termodinámicamente estable. Además de microemulsiones, exámenes estructurales pueden revelar la existencia de emulsiones regulares, fases hexagonales cristalinas anisotrópicas o cúbicas y estructuras lamelares dependiendo de la relación de los componentes. La mayoría de estas diferentes fases y estructuras son fácilmente reconocibles por simple inspección visual de las composiciones debido a su apariencia física (por ejemplo, las emulsiones no son transparentes, y las fases se separan luego de un tiempo); 17

las estructuras lamelares y las fases cúbicas son altamente viscosas, y pueden ser reveladas por inspección con luz polarizada (fases cristalinas), y por lo tanto ser diferenciadas de las microemulsiones verdaderas. En la práctica, la diferencia clave entre emulsiones y microemulsiones es que las primeras son fundamentalmente inestables desde el punto de vista termodinámico y eventualmente sufrirán separación de fases. Además, existen diferencias en sus métodos de preparación, debido a que las emulsiones requieren un gran aporte de energía mientras que las microemulsiones no. El último punto tiene obvias implicaciones cuando se considera el costo relativo de producción comercial de los dos tipos de sistemas (Carlucci et. al, 2004). 2.4.1. Clasificación de las microemulsiones La clasificación de microemulsiones imita a la utilizada para emulsiones convencionales, es decir aquí también se define el signo o/w para aceite en agua y w/o para agua en aceite. Pero para este caso en particular se utilizan los términos microemulsiones discretas o gotas (eninglés, droplet microemulsión). En los sistemas o/w la fracción de volumen de aceite es baja. Contrariamente, las microemulsiones gotas w/o se presentan probablemente cuando la fracción de volumen del agua es baja. Una tercera clasificación se define para sistemas en los cuales las cantidades de agua y de aceite son similares, en los que puede resultar una microemulsión bicontinua. En este último caso, ambos, el aceite y el agua existen como una fase continua en presencia de una interfase continuamente fluctuante que es estabilizada por el surfactante con una curvatura final de cero (Carlucci et. al, 2004).

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1.

MATERIALES

Los materiales utilizados en la investigación: cajas Petri, dedal celulósico/vidrio, equipo soxhlet, condensador, beaker (50-100-250 ml), regla, asa (recta-curva), tubos de ensayo, pipeta, micropipeta, cuchillo, tabla de picar, probeta, pera, mangueras, pinzas, papel filtro, gradilla, recipientes ámbar, mechero, mortero y pistilo, tubos falcon, gotero. Los reactivos utilizados en la investigación se usaron conforme se presentaron, sin algún tratamiento adicional: etanol etílico anhidro (100%) de CISPROQUIM lote 20940331E, magnesio en polvo (100%) de CARLO EBRA, ácido clorhídrico (36,538%) de JT BAKER lote B31C00, alcohol amílico (98%) de JT BAKER lote 0000035325, ácido sulfúrico (95-98%) de CHEMI lote 040601-2081, cloruro férrico en polvo (100%) de CARLO EBRA, acetato de plomo en polvo (100%) de MERK, zinc en polvo (100%) de CARLO EBRA, éter de petróleo (95%) de RODA QUIMICOS, hidróxido de sodio (100%) de PANREAC lote 305535E5, acetona (80%) de PANREAC lote 0000459239, propil englicol (95%) de PANREAC, agar PDA (100%) de SCHARLAU lote 103699. Los equipos usados en la investigación: horno de secado BINDER-ED23UL, horno de convección LABTECH-LDO 080F, balanza analítica PRECISA-XT 120A, plancha de calentamiento SCI FINETECH, espectrofotómetro JP SELECTRA, vortex GEMMY-VM 300P, centrifuga INDULAB, incubadora QUINCY LAB 12-140, freezer HAIER-BIOMEDICAL, cámara de flujo laminar LABTECH, baño termostatado LAUDA-011, pH metro HANNA PH21, autoclave ALLAMERILAN, bomba sumergible HJ-1141.

3.2.

MÉTODOS

3.2.1. Localización del estudio El proyecto de investigación fue realizado en la Fundación Universitaria Agraria de Colombia – UNIAGRARIA; la cual esta está ubicada en la Calle 170 No 54A -10 en la ciudad de Bogotá (Colombia). Se encuentra a 2650 msnm, con una humedad relativa del 94% y temperatura anual promedio de 14°C. En el laboratorio de fitoquímica de la UNIAGRARIA se efectuó el procedimiento de adecuación, pre tratamiento de las materias primas y obtención de los extractos etanólicos. En la figura 3 se puede apreciar un mapa en el que se localiza la institución. 19

Fuente: Google Maps.

Figura 3. Localización del estudio, Fundación Universitaria Agraria de Colombia. 3.2.2. Descripción del material vegetal. Las hojas de Eucalipto especie (Eucaliptus globulus Labill) fueron obtenidas del municipio de Guasca en el departamento de Cundinamarca, Colombia. Estas fueron transportadas a temperatura ambiente y se almacenaron en el laboratorio de Fitoquímica de la UNIAGRARIA, a temperatura de 4°C. El aceite de Jatropha se obtuvo por extracción mecánica de semillas provenientes del departamento del Meta, Colombia. 3.2.3. Pretratamiento del material vegetal Previo al almacenamiento se realizó un lavado con agua corriente mezclada con hipoclorito 5% para así garantizar la inocuidad de las muestras. 3.2.3.1.

Reducción de tamaño y secado de la materia prima

El material vegetal se cortó en pequeños cuadros de 1 cm x 1 cm. El secado del material vegetal se realizó en un horno de convección forzada LABCHED. Se tomó una muestra inicial de 30 g de hojas y se depositó en cinco cajas de Petri, tres de ellas se destinaron para la extracción y dos para la deshidratación a 105°, a continuación se llevaron al horno para calentamiento por convección forzada.

DEPOSITARLAS HOJAS EN CAJAS PRETRI 30 gr de HOJAS

SECAR

LLEVAR A 35 O 45°C X 4 O 6 horas PESAR MATERIAL CADA HORA

SECAR HASTA PUNTO DE EQUILIBRIO

A 105 °C PESAR MATERIAL DESHIDRATADO

Fuente: Adaptado de (Martínez & Palacio, 2015)

Figura 4. Esquema metodológico para establecer las curvas de secado en las hojas de Eucalipto.

3.2.4. Obtención del extracto etanólico de las hojas de Eucalipto.

Posterior a la realización del pre tratamiento de las hojas, se procedió a realizar la extracción por el método soxhlet. Este se puede observar en la figura 5. .

DEPOSITAR EL MATERIAL EN UN DEDAL

EXTRAER POR METODO SOXHLET

Pesar el balón.

50 gr de hojas deshidratadas con humedad ligada.

Incorporar balón de 250 ml al extractor soxhlet. Adicionar 180 ml de etanol al 99.8%

Llevar a temperatura de ebullición del solvente Realizar 7 ciclos de extracción.

Destilar

MEDIR EL RENDIMIENTO EN EXTRACTO POR DIFERENCIA DE PESO Fuente: Adaptado de (Martínez & Palacio, 2015)

Figura 5. Esquema metodológico de la obtención del extracto presente en las hojas de Eucalipto 3.2.5. Análisis fitoquímico preliminar El análisis fisicoquímico preliminar fue realizado a cada uno de los extractos procedentes del material fitogenético y a una muestra patrón a la cual no se le realizo ningún pretratamiento o secado previo

3.2.5.1.

Análisis de flavonoides

3.2.5.1.1. Prueba de Shinoda Los flavonoides con anillo de gamma-benzopirona reaccionan en presencia de ácido clorhídrico y magnesio. Los colores rosado, anaranjado o fresa indican prueba positiva. 22

Prueba de Shinoda

1 ml de extracto etanólico 0,2 mg magnesio en polvo

Gotas de ácido clorhídrico

Prueba positiva si la coloración es rosa, naranja, fresa. Fuente: Adaptado de (Rodríguez, 1997)

Figura 6. Esquema metodológico para el análisis de flavonoides-Prueba de Shinoda. 3.2.5.1.2. Prueba de Rosenhein El resultado es positivo si se evidencia un cambio de color entre los tonos rosas a rojo carmesí o tonos cálidos.

Prueba de Rosenhein 1 ml de extracto etanólico 0,5 ml de ácido clorhídrico

Calentar a 90° por 10 minutos Enfriar

0,5 ml alcohol amílico Decantar Prueba positiva si la coloración es carmesí a rosa claro.

Fuente: Adaptado de (Rodríguez, 1997)

Figura 7. Esquema metodológico para el análisis de flavonoides-Prueba de Rosenhein. 23

3.2.5.1.3. Prueba de ácido sulfúrico En ácido sulfúrico concentrado las flavonas y flavonoles generan color amarillo. Las chalconas y auronas dan color rojo guinda a rojo azulado. Prueba de Ácido sulfúrico

1 ml de extracto etanólico

1 ml ácido sulfúrico Prueba positiva para chalconas y auronas si coloración rojo o rojo azulado

Prueba positiva para flavonas y flavonoles si coloración amarilla Fuente: Adaptado de (Rodríguez, 1997)

Figura 8. Esquema metodológico para el análisis de flavonoides-Prueba de ácido sulfúrico. 3.2.5.1.4. Prueba de leucoantocianidinas Las leucoantocianidinas en presencia de HCl y calentamiento forman antocianinas de color rojo intenso, los colores amarillo y café pertenecen a las catequinas. Prueba de Leucoantocianidinas

1 ml de extracto etanólico 1 ml de ácido clorhídrico

Calentar a 90° por 20 minutos

Prueba positiva para antocianinas si la coloración es rojo intenso, el amarillo y café son catequinas Fuente: Adaptado de (Rodríguez, 1997)

Figura 9. Esquema metodológico para el análisis de flavonoides-Prueba de Leucoantocianidinas. 24

3.2.5.2.

Análisis de fenoles-taninos

3.2.5.2.1. Prueba de cloruro férrico Los taninos reaccionan con solución acuosa de cloruro férrico presentando coloración azul en presencia de taninos de ácido gálico o verde en taninos derivados de ácido protocatequico. Prueba de Cloruro Férrico

0,2 ml de extracto etanólico

1 gota de cloruro férrico al 1% Prueba positiva para taninos de ácido protocatequico si la coloración es verde

Prueba positiva para taninos de ácido gálico si la coloración es azul Fuente: Adaptado de (Rodríguez, 1997)

Figura 10. Esquema metodológico para el análisis de Fenoles-Taninos-Prueba de Cloruro férrico. 3.2.5.2.2. Prueba de acetato de plomo Los taninos reaccionan con acetato de plomo produciendo turbidez o precipitado blanco. Prueba de Acetato de plomo

1 ml de extracto etanólico

1 ml de acetato de plomo al 10%

Prueba positiva si produce turbidez precipitado blanco Fuente: Adaptado de (Rodríguez, 1997)

Figura 11. Esquema metodológico para el análisis de Fenoles-Taninos-Prueba de acetato de plomo. 25

3.2.5.3.

Análisis de Quinonas

Las quinonas tienden a dar colores amarillos, rojos o purpuras en presencia de ácidos. Las antraquinonas producen color amarillo. Prueba de reconocimiento de Quinonas

0,2 ml de extracto etanólico 0,2 gr de zinc en polvo

Gotas de ácido clorhídrico

Prueba positiva para quinonas si la coloración es amarilla, roja o purpura. Las antraquinonas dan coloración amarilla. Fuente: Adaptado de (Rodríguez, 1997)

Figura 12. Esquema metodológico para el análisis de Quinonas.

3.2.5.4.

Análisis de carotenoides-isoprenoides

Se hace uso de una solución etérea del extracto sobre ácido sulfúrico al 85%, dando como resultado coloración azul entre dos fases. Prueba de reconocimiento de carotenoides

1 ml de extracto etanólico 1 ml de éter de petróleo

Agitar en vortex

Prueba positiva si la coloración es azul entre dos fases.

Fuente: Adaptado de (Rodríguez, 1997)

Figura 13. Esquema metodológico para el análisis de Carotenoides. 26

3.2.5.5.

Análisis de saponinas

3.2.5.5.1. Reacción de espuma con NaOH Las saponinas y cardiotónicos reducen la tensión superficial y producen espuma de dos centímetros. Prueba de espuma con NaOH

1 ml de extracto etanólico

1 ml de NaOH pH 13

Prueba positiva si produce espuma de dos centímetros Fuente: Adaptado de (Rodríguez, 1997)

Figura 14. Esquema metodológico para el análisis de Saponinas- Prueba de espuma con NaOH.

3.2.5.5.2. Reacción de espuma con HCl Las saponinas y cardiotónicos reducen la tensión superficial y producen espuma de dos centímetros. Prueba de espuma con HCl

1 ml de extracto etanólico 1 ml de HCl pH 1

Prueba positiva si produce espuma de dos centímetros Fuente: Adaptado de (Rodríguez, 1997)

Figura 15. Esquema metodológico para el análisis de Saponinas- Prueba de espuma con HCl.

3.2.5.6.

Análisis de alcaloides- reacción de Wagner

Una solución de yodo-yoduro de potasio (12.7 gr de yodo aforado en un litro de yoduro de potasio) forma precipitado café con alcaloides. Reacción de Wagner

1 ml de extracto etanólico 1 ml de solución yodo-yoduro de potasio

Prueba positiva si produce precipitado café Fuente: Adaptado de (Rodríguez, 1997)

Figura 16. Esquema metodológico para el análisis de Alcaloides- Reacción de Wagner. 3.2.5.7.

Determinación de contenido de clorofila-método de la acetona al 80%.

En la determinación de clorofila a y b, así como carotenoides se utilizaron las expresiones dadas por (Lichtenthaler, 1987): Para la determinación del contenido de clorofilas a y b de las hojas de (Eucaliptus globulus Labill), se usó material fresco reducido en su tamaño a 0,5 cm, se homogenizaron en acetona al 80% y se centrifugaron, posteriormente se tomó el sobrenadante y se midió la absorbancia y tramitación a espectros de luz del rango 470-750 nm, ya que la absorción máxima de las clorofilas se encuentran en la región roja y azul del espectro visible, por eso se midieron absorbancias en 663 y 646 nm. Igualmente el contenido de carotenoides se determinó con la medida de absorbancia a 470 nm. La concentración de clorofilas se calcula mediante las siguientes formulas. 

Clorofila a (µg / ml) = 12,25 x A663 – 2,79 x A646



Clorofila b (µg / ml) = 21,50 x A646 – 5,10 x A663



Clorofila a+b= 7,15 x A663 + 18,71 x A646



C (carotenoides) (µg / ml)= (1000 x A470 – 1,82 Chla – 85,02 Chlb) ÷ 198 28

Determinación de clorofilas a y b 0,1 mg de hojas frescas 10 ml de acetona al 80%

Oscuridad durante 2 minutos

Centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos

0,2 ml sobrenadante

2 ml de acetona al 80%

Medir la absorbancia en 663, 646 y 470 nm. Empleando como blanco Acetona al 80 %

Fuente: Adaptado de (Lichtenthaler, 1987)

Figura 17. Esquema metodológico para la determinación de clorofilas a y b. 3.2.5.8.

Preparación de la microemulsión del extracto de (Eucaliptus globulus Labill).

La preparación de la micro emulsión seguirá la dinámica descrita por (Pant et. al, 2014), en el cual realiza una emulsión con una fase discontinua o extracto de eucalipto y una fase acuosa o continua de aceite de Jatropha.

Preparación de microemulsión

80% aceite de Jatropha

10% agua destilada

Adicionar surfactante 5%

Temperatura a 45°C

Adicionar propil englicol 5%

Adicionar extracto 1 -2 %

Agitación por 15 min a 750 rpm Fuente: Adaptado de (Pant et. al, 2014)

Figura 18. Esquema metodológico para la preparación de la microemulsión. 3.2.6. Análisis antifúngico Para el análisis de la actividad anti fúngica se utilizaron cepas del hongo Fusarium oxysporum Dianthi proporcionadas por los investigadores de un trabajo anterior de control antifungico y se tomó como referencia la metodología de dicha investigación realizada en la Fundación Universitaria Agraria de Colombia UNIAGRARIA (David & López, 2014). Se evaluó el efecto del tipo de aplicación del extracto en su forma pura y en microemulsión con aceite de Jatropha.

3.2.6.1.

Técnica de difusión en agar Difusión en agar

Servir agar + extracto/microemulsión uniformemente Dejar solidificar Perforar pozos 0,4 - 0,7 cm

Sembrar 0,4 cm de hongo

Incubar 1-2 semanas a 28°C

Medir el halo de inhibición

Fuente: Adaptado de (Duque, 2008)

Figura 19. Esquema metodológico para el análisis antifungico- técnica de difusión en agar.

3.2.6.2.

Análisis antifúngico extracto puro Análisis antifúngico con extracto puro

20 ml agar PDA por caja Petri

Adicionar extracto etanólico al agar PDA

0,5%

1,5%

0,4 cm de hongo Fusarium oxysporum Dianthi se siembra en el centro de la caja Petri Fuente: Adaptado de (David & López, 2014)

Figura 20. Esquema metodológico para el análisis antifungico con extracto puro.

3.2.6.3.

Análisis antifúngico de la microemulsión Análisis antifúngico de la microemulsión

20 ml agar PDA por caja Petri

Adicionar microemulsión al agar PDA

0,4 cm de hongo Fusarium oxysporum Dianthi se siembra en el centro de la caja Petri

Fuente: Adaptado de (David & López, 2014)

Figura 21. Esquema metodológico para el análisis antifungico con la microemulsión. 32

Los porcentajes de inhibiciĂłn se calcularon segĂşn la fĂłrmula propuesta por (Lizcano, 2007). % đ?&#x2018;&#x2018;đ?&#x2018;&#x2019; đ?&#x2018;?đ?&#x2018;&#x;đ?&#x2018;&#x2019;đ?&#x2018;?đ?&#x2018;&#x2013;đ?&#x2018;&#x161;đ?&#x2018;&#x2013;đ?&#x2018;&#x2019;đ?&#x2018;&#x203A;đ?&#x2018;Ąđ?&#x2018;&#x153; =

đ?&#x2018;&#x2018;đ?&#x2018;&#x2013;đ?&#x2018;&#x17D;đ?&#x2018;&#x161;đ?&#x2018;&#x2019;đ?&#x2018;Ąđ?&#x2018;&#x;đ?&#x2018;&#x153; đ?&#x2018;&#x2018;đ?&#x2018;&#x2019; đ?&#x2018;?đ?&#x2018;&#x;đ?&#x2018;&#x2019;đ?&#x2018;?đ?&#x2018;&#x2013;đ?&#x2018;&#x161;đ?&#x2018;&#x2013;đ?&#x2018;&#x2019;đ?&#x2018;&#x203A;đ?&#x2018;Ąđ?&#x2018;&#x153; đ?&#x2018;&#x2018;đ?&#x2018;&#x2019;đ?&#x2018;&#x2122; â&#x201E;&#x17D;đ?&#x2018;&#x153;đ?&#x2018;&#x203A;đ?&#x2018;&#x201D;đ?&#x2018;&#x153; â&#x2C6;&#x2019; đ?&#x2018;&#x2018;đ?&#x2018;&#x2013;đ?&#x2018;&#x17D;đ?&#x2018;&#x161;đ?&#x2018;&#x2019;đ?&#x2018;Ąđ?&#x2018;&#x;đ?&#x2018;&#x153; đ?&#x2018;&#x2013;đ?&#x2018;&#x203A;đ?&#x2018;&#x153;đ?&#x2018;?đ?&#x2018;˘đ?&#x2018;&#x2122;đ?&#x2018;&#x17D;đ?&#x2018;&#x2018;đ?&#x2018;&#x153; â&#x2C6;&#x2014; 100 đ?&#x2018;&#x2018;đ?&#x2018;&#x2013;đ?&#x2018;&#x17D;đ?&#x2018;&#x161;đ?&#x2018;&#x2019;đ?&#x2018;Ąđ?&#x2018;&#x;đ?&#x2018;&#x153; đ?&#x2018;&#x2018;đ?&#x2018;&#x2019; đ?&#x2018;?đ?&#x2018;&#x;đ?&#x2018;&#x2019;đ?&#x2018;?đ?&#x2018;&#x2013;đ?&#x2018;&#x161;đ?&#x2018;&#x2019;đ?&#x2018;&#x2013;đ?&#x2018;&#x203A;đ?&#x2018;Ąđ?&#x2018;&#x153; đ?&#x2018;?đ?&#x2018;&#x17D;đ?&#x2018;Ąđ?&#x2018;&#x;đ?&#x2018;&#x153;đ?&#x2018;&#x203A;

% đ?&#x2018;&#x2018;đ?&#x2018;&#x2019; đ?&#x2018;&#x2013;đ?&#x2018;&#x203A;â&#x201E;&#x17D;đ?&#x2018;&#x2013;đ?&#x2018;?đ?&#x2018;&#x2013;đ?&#x2018;?đ?&#x2018;&#x2013;đ?&#x2018;&#x153;đ?&#x2018;&#x203A; = 100 â&#x2C6;&#x2019; % đ?&#x2018;&#x2018;đ?&#x2018;&#x2019; đ?&#x2018;?đ?&#x2018;&#x;đ?&#x2018;&#x2019;đ?&#x2018;?đ?&#x2018;&#x2013;đ?&#x2018;&#x161;đ?&#x2018;&#x2013;đ?&#x2018;&#x2019;đ?&#x2018;&#x203A;đ?&#x2018;Ąđ?&#x2018;&#x153; Para este estudio el diĂĄmetro inoculado corresponde al descrito en las figuras 20 y 21, correspondiente a 0,4 cm del hongo. El diĂĄmetro patrĂłn serĂĄ el crecimiento del hongo sin ningĂşn tipo de tratamiento o adiciĂłn de extracto o microemulsiĂłn.

3.2.7. AnĂĄlisis por cromatografĂa de gases El anĂĄlisis cromatogrĂĄfico se llevĂł a cabo en un cromatĂłgrafo de gases AT6890, acoplado a un detector de masas, operado en el modo de barrido completo de radiofrecuencia. La columna empleada en el anĂĄlisis fue DB-5MS [5%-fenil-poli (metilsiloxano) ,60 m x 0,25 mm x 0,25 Âľm]. La inyecciĂłn se realizĂł en modo Split (30:1), Viny = 2 ÂľL (crommmass).

3.2.8. DiseĂąo Experimental: La base del diseĂąo experimental fue el estudio del efecto de la temperatura y el tiempo de secado, sobre el rendimiento del extracto de las hojas de Eucalipto (Eucaliptus globulus Labill) 3.2.8.1.

DiseĂąo experimental del proceso de secado de las hojas de Eucalipto (Eucaliptus globulus Labill).

HipĂłtesis del diseĂąo experimental. La temperatura y tiempo de secado afectan significativamente el rendimiento del extracto de Eucalipto (Eucaliptus globulus Labill). En el diseĂąo experimental se tuvo en cuanta las siguientes variables: ď&#x201A;ˇ ď&#x201A;ˇ

Variables Independientes: Temperatura de secado, tiempo de secado. Variable Dependiente: Rendimiento del extracto

Para estas variables se utilizĂł un Modelo factorial de 22 de la siguiente forma: Factor H: Tiempo de secado. H1= 4 Horas H2= 6 Horas 33

Factor C: Temperatura de secado. C1= 35 °C C2= 45 °C A continuación se describe el diseño de experimentos planteado: Tabla 3. Modelo experimental de la etapa de laboratorio para la extracción de solución del extracto de las hojas de Eucalipto (Eucaliptus globulus Labill). TEMPERATURA (C) TIEMPO (H) 35C 35C4H 35C6H

4H 6H

45C 45C4H 45C6H

Fuente: Autor

En total son 12 ensayos, lo que conlleva a un total de 12 mediciones de la variables respuesta Y (rendimiento del extracto obtenido). Análisis estadístico El modelo estadístico utilizado para el diseño general de 2 factores es: Yijl =+ i +j+()i j +  ijl Para ij l i = 1,2,....,a j = 1,2,., b l = 1,2,,, n

Dónde: Yij es la respuesta observada (Rendimiento de la extracción) cuando el factor C esta al i em, y el factor H esta al j em,  es el efecto conjunto del total de las medias, i es el efecto i em nivel del factor fila C, j es el efecto del j em nivel factor columna H, () ij es el efecto de la interacción entre i y j y ijl es el componente aleatorio del error. Las hipótesis a probar se refieren a los efectos de los factores en las variables de respuesta Yij. Ho: C= Ci; Ha: C Ci;

Ho: H = Hj; Ho: CH = CH ij Ha: H  Hj; Ha: CH  CH ij

Para la evaluación de los resultados experimentales se efectuó un análisis de varianza (ANOVA). Para lo anterior se empleó el programa Statgraphics 5.1 PLUS. 34

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 4.1.

RESULTADOS DEL SECADO

4.1.1. Curvas de secado La Figura 22 presenta las curvas de secado para las hojas de la planta (Eucaliptus globulus Labill) para temperaturas de 35°C y 45°C. Se presenta el cambio de peso a través del tiempo, del material vegetal.

Fuente: autor

Figura 22. Curvas de secado de las hojas de (Eucaliptus globulus Labill) a diferentes tiempos y temperaturas. Como se puede observar, luego de 3 horas de secado se consigue llegar al equilibrio para la mayoría de los tratamientos excepto el de 45C4H. Los resultados aquí encontrados son similares a los descritos por (Gómez, 2007), para un quimiotipo de (Lippia alba). Según este autor, se puede conseguir el equilibrio de secado para partes aéreas de la planta en condiciones de secado de entre 3 a 4 horas y temperaturas de entre 35°C a 50°C. Teniendo en cuenta que la humedad libre del material fitogenético para los diferentes tratamientos se encuentran en un rango de 4-6 (gr H2O/gr ss) y que el material correspondiente al tratamiento 45C6H presentaba mayor humedad libre (6 gr H2O/gr ss), se deduce que este pretratamiento presenta la mayor pérdida de humedad en el menor tiempo, ya que el material fitogenético alcanza el punto de 35

equilibrio o peso seco en un lapso de 2.5 horas, esto tiene explicación en que a mayor temperatura más fácilmente se produce la evaporación, contrastando con las muestras de los otros tres pretratamientos (35C4H, 35C6H, 45C4H), los cuales alcanzan el punto de equilibrio entre las 3,5-4h, esta es una diferencia importante si se escala el proceso a nivel industrial debido a los costos energéticos que genera el proceso de secado.

4.1.2. Rendimiento en la extracción La extracción se llevó a cabo por el método soxhlet (ver Anexo C) posterior al secado del material fitogenetico. En la figura 23 se puede observar el resultado del rendimiento de extracción de las hojas de la planta (Eucaliptus globulus Labill).

Fuente: autor

Figura 23. Rendimiento en la extracción en función de los diferentes pretratamientos. Como se puede observar de la figura anterior solo el tratamiento 45C6H permitió obtener un ligero mayor rendimiento (49,2%) con respecto al material sin secar (41%) que es congruente con los resultados reportados por (Salazar & Betancourth, 2009), quien en su estudio evaluó el rendimiento del extracto de hojas de eucalipto (Eucaliptus globulus L’Her. (Mirtacea) y ruda Ruta graveolens L. (Rutacea) previo secado a temperatura ambiente y en horno de secado obteniendo resultados 36

mayores de extracción y concentración de metabolitos secundarios de interés con la aplicación del secado. Los resultados obtenidos en la extracción demuestran que el pretratamiento que mejor rendimiento proporciona es el de 45C6H, seguido de la muestra sin tratamiento o sin secado, esto puede parecer contradictorio con el objeto de estudio, su explicación se basa en la polaridad que presentan el agua y etanol, ambos son solventes y por tanto en el momento de la extracción parte de dicha humedad (H2O) fue arrastrada junto con el extracto y el etanol, igualmente en el proceso de destilación al tener el etanol un punto de ebullición más bajo que el agua, este fue retirado totalmente de la mezcla pero parte del agua se conjugo con el extracto.

4.1.3. Análisis de varianza A nivel estadístico, los promedios de los tratamientos se contrastaron mediante el análisis de varianza. Puesto que el valor P del análisis fue de 0.74, no existe una diferencia estadísticamente significativa en las medias de las cuatro variables con un nivel del 95% de confianza (Ver anexo E). La tabla 4 presenta una síntesis del resumen estadístico. Tabla 4. Resumen estadístico

PROMEDIO DESVIACION ESTANDAR ANOVA

35C4H

35C6H

45C4H

45C6H

36,9

39,5

40,9

49,2

4,9

21,1

15,3

9,8

Fuente: autor

La figura 24 muestra la comparación de las medias de los datos experimentales de rendimiento en la extracción por cada uno de los diferentes pretratamientos efectuados, encontrándose que el tratamiento 45C6H fue el que reportó un mayor rendimiento (49,2%) respecto de los demás tratamientos.

Fuente: autor

Figura 24. Comparación de medias estadísticas con respecto a los diferentes pretratamientos. Medias y 95.0% de Fisher LSD. La figura 25 presenta la dispersión según muestra, la cual compara los intervalos entre datos de cada muestra, la figura 25 sugiere que los rendimientos en la muestra 45C6H son altos y homogéneos con CV de 19% contrastando con los reportados en el tratamiento 35C6H y 45C4H con el bajos rendimientos y datos heterogéneos con CV 53% y 37% respectivamente.

Fuente: autor

Figura 25. Dispersión según diferentes pretratamientos.

4.2.

RESULTADOS DEL ANÁLISIS FITOQUÍMICO PRELIMINAR

Se realizaron 11 pruebas fitoquímicas preliminares a cada una de las muestras. La tabla 4 muestra la relación entre pruebas fitoquímicas positivas y negativas por cada uno de los pretratamientos efectuados al material fitogenético.

Tabla 5. Compendio de pruebas fitoquímicas efectuadas a los diferentes extractos.

TIPO DE METABOLITO

PRUEBA

ANALISIS FITOQUIMICO PRELIMINAR TIPO DE PRETRAMIENTO 35C4H 35C6H 45C4H

SHINODA ROSENHEIN FLAVONOIDES

ACIDO SULFURICO LEUCOANTOCIANIDINAS CLORURO FERRICO

FENOLES-TANINOS ACETATO DE PLOMO QUINONAS CAROTENOIDESISOPRENOIDES

SAPONINAS

ACIDO Y DONADOR DE ELECTRONES REACCION DE RECONOCIMIENTO DE CAROTENOIDES REACCION DE ESPUMA CON NaOH REACCION DE ESPUMA CON HCl

45C6H

sin secado

+ + + +

+ +

ALCALOIDES

REACCION DE WAGNER

TOTAL PRUEBAS

POSITIVAS NEGATIVAS

7 4

Fuente: autor

Según los datos expuestos en la tabla 4 se confirmó la presencia de metabolitos secundarios de interés industrial en los extractos de (Eucaliptus globulus Labill) tales como los flavonoides, fenoles y terpenos (isoprenoides), los cuales presentan una alta actividad insecticida y antifungica tal como lo reporta (Adames et. al, 1983) en su estudio un contenido del principio activo citronelal, el cual pertenece al grupo de metabolitos secundarios de tipo terpenoide e isoprenoide; de este modo se puede afirmar que las cuatro muestras de extractos analizados de (Eucaliptus globulus Labill) tienen presencia de dichos metabolitos, por tanto el proceso de secado no afecta las características fitoquímicas del mismo. Estos extractos presentan una fuente promisoria de sustancias con potenciales usos en diferentes industrias como salud y belleza, productos de aseo, productos insecticidas y antifungicos, alimentaria etc. 39

Prueba de Shinoda: Como se puede observar en la figura 26 para los tratamientos 45C4H, 35C4H y la muestra sin secado la prueba de Shinoda genero una coloración amarilla-naranja revelando la presencia de flavonoides con anillo de gamma-benzopirona los cuales reaccionan en presencia de ácido clorhídrico y magnesio. Para el caso de las muestras 45C4H y 35C6H se presentó una coloración verde la cual indica la presencia de metabolitos de tipo flavonoide tales como flavonoles, flavononas y flavononoles.

Fuente: autor

Figura 26. Análisis fitoquímico prueba de Shinoda Prueba de Rosenhein: Como se puede observar en la siguiente figura del análisis fitoquímico, la prueba de Rosenhein revelo la presencia de metabolitos tipo flavonoide con esqueleto flavilo, los cuales generan una tonalidad carmesí y colores cálidos.

Fuente: autor

Figura 27. Análisis fitoquímico prueba de Rosenhein 40

Prueba de leucoantocianidinas: Las pruebas de leucoantocianidinas relevan la presencia de catequinas las cuales reaccionan generando un color amarillo-café como se puede observar en la figura 28.

Fuente: autor

Figura 28. Análisis fitoquímico prueba de leucoantocianidinas Prueba de ácido sulfúrico: El análisis fitoquímico preliminar permitió evidenciar la presencia de metabolitos tipo flavonoide como chalconas y auronas las cuales generan una coloración rojo azuloso como lo indica la prueba de ácido sulfúrico para todas las muestras, incluyendo el sin secado, como lo revela la siguiente figura.

Fuente: autor

Figura 29. Análisis fitoquímico prueba de ácido sulfúrico

Prueba de cloruro férrico: Se observa también en los cuatro extractos obtenidos de material con y sin secado la presencia de compuestos polifenólicos taninos lo anterior se evidencia con la prueba positiva tanto para cloruro férrico como de acetato de plomo. La prueba de cloruro férrico revela la presencia de taninos derivados del ácido protocatetico generando una coloración verde intensa (figura 30).

Fuente: autor

Figura 30. Análisis fitoquímico prueba de cloruro férrico Reconocimiento de isoprenoides: La prueba de reconocimiento de isoprenoides revelo la presencia de metabolitos de tipo carotenoide en las cuatro muestras analizadas, estos metabolitos generaron una coloración azul entre capas como se puede observar en la siguiente figura.

Fuente: autor

Figura 31. Análisis fitoquímico reconocimiento de isoprenoides

En el caso del análisis de quinonas, no revela la presencia del metabolito en ninguna muestras (Tabla 4), lo cual difiere de lo reportado por Cázar et. al (2015) en su estudio acerca de la eficacia de extracto etanólico de eucalipto (Eucaliptus globulus) en el control de Alternaria sp. en cultivos de col y patata, en el cual las pruebas fitoquímicas cualitativas del extracto etanólico de E. globulus revelaron la presencia de quinonas, lactonas y cumarinas, como compuestos mayoritarios. Martínez Guerrero & Quinteros Pérez (2003) reportaron en su estudio acerca de la actividad antimicótica in-vitro de una tintura elaborada con oleorresina de eucalipto (Eucaliptus citriodora) la presencia de flavonoides y taninos realizando numerosas pruebas de carácter cualitativo, confirmando los datos obtenidos en el presente estudio de las pruebas efectuadas a los extractos de (Eucaliptus globulus Labill), además Martínez Guerrero & Quinteros Pérez (2003) reportaron la ausencia de saponinas con la prueba de espuma y la ausencia de alcaloides con la prueba de Wagner y otras, concordando con los datos obtenidos de los extractos de (Eucaliptus globulus Labill) los cuales no presentan dichos metabolitos. 4.2.1. Cuantificación de clorofilas a, b y carotenoides. En la tabla 5 se muestra la información relacionada con el contenido de clorofila a y b, así como el contenido de carotenoides del extracto de clorofila obtenido de las hojas de (Eucaliptus globulus Labill) en el anexo F se pueden observar los datos obtenidos de absorbancia y los cálculos respectivos para la determinación del contenido de clorofila. El contenido de clorofilas puede variar según algunos parámetros que se deben tener en cuenta como la edad de la planta, la época en la cual se hayan tomado las muestras, el ciclo de floración de la planta etc., ya que cada uno de estos aspectos demandan la producción de clorofila o así mismo la pueden abstener. Por ende el resultado del análisis de carotenoides también varía en función de las concentraciones de clorofila (Reyes et. al, 2000). Tabla 6. Cuantificación de Clorofilas a, b y carotenoides presentes en las hojas de (Eucaliptus globulus Labill). CUANTIFICACION DE CLOROFILAS A, B Y CAROTENOIDES SUSTANCIA CONTENIDO µg / ml Clorofila a 1,26197 Clorofila b 0,6339 Clorofila a+ b 1,89587 Carotenoides 65,8090366 Fuente: autor

El contenido de clorofilas a (1,3 µg/ml) y b (0,63 µg/ml) y clorofilas totales (1,9 µg/ml) son relativamente altas en comparación con los resultados reportados en estudios realizados por González et. al, (2013) acerca del contenido de celulosa y polifenoles del aceite de eucalipto haciendo uso de la misma metodología descrita en la figura 17, encontrando contenidos de clorofila a (0,78 µg/ml), clorofila b (0,09 µg/ml), y clorofilas totales (0,82 µg/ml), además el contenido de clorofila a es mayor que el contenido de clorofila b confirmando los datos presentados en la tabla 5. Teniendo en cuenta que la especie de eucalipto utilizado en ambos estudios es el mismo (Eucaliptus globulus Labill) se puede afirmar que el contenido de pigmentos de las hojas puede variar significativamente como se puede verificar en el contenido de clorofilas totales de la tabla 5 (1,89587 µg/ml) el cual duplica el resultado obtenido por Gonzales et al (0,82 µg/ml), estas variaciones responden a lo explicado anteriormente en estudios reportados por (Reyes et. al, 2000) En estudios realizados por (Barry & Newnha, 2012) acerca de la cuantificación de clorofilas y carotenoides en hojas de (Eucaliptus globulus Labill) por el método de transferencia de radiación, afirmaron encontrar contenidos bajos de carotenoides a razón de 21.2 µg/ml comparados con los datos obtenidos de carotenoides en la tabla 5 los cuales triplican dichos valores (65,8090 µg/ml). Además (Barry & Newnha, 2012) reporta contenidos mucho más altos de clorofilas totales (77,4 µg/ml), el cual supera suficientemente los resultados obtenidos en el presente estudio (1,8958 µg/ml).

4.3.

RESULTADOS DE LA CROMATOGRAFÍA DE GASES

Debido a que en el análisis fitoquimico preliminar del material sin secar se observó igual presencia de metabolitos secundarios que en los materiales sometidos a condiciones de secado se efectuaron análisis de cromatografía de estos extractos así como del pretratamiento que mayor rendimiento de extracto reporto (45C6H), los cuales se pueden observar en la tabla 7.

Tabla 7: Identificación presuntiva y cantidad relativa (%) de los componentes presentes en la muestra de Extracto de Eucalipto con pretratamiento (45C6H) y sin pretratamiento

COMPUESTO α-Pineno 1,8-Cineol Acetato de α-terpinilo α-Gurjumeno Aromadendreno Biciclogermacreno NI. Compuesto M+312 NI. Compuesto M+326 Vitamina E NI. NI: compuesto no identificado

% DE CONTENIDO POR TRATAMIENTO 45C6H SIN SECADO 0,7 6,7 100 2 1,7 2,9 1,5 10 9 12 53,5

Fuente: Laboratorio CROM-MASS, Universidad Industrial de Santander

Como se puede observar el extracto de las hojas de Eucalipto sin pretratamiento fue el que presento mayor concentración del compuesto 1,8Cineol, sustancia de gran interés por sus propiedades antifungicas. Watanabe et. al, (1993) afirma que los compuestos más importantes encontrados hasta el momento en distintas especies de eucalipto son: el 1,8‐cineol, citronelal, citronelol, acetato de citronelilo, p‐cimeno, limoneno, eucamalol, linalol, α‐pineno, terpineno, α‐terpineol, alloocimeno y aromadendreno, lo que concuerda con los datos reportados en la tabla 7.

4.4.

RESULTADOS DEL ANÁLISIS ANTIFÚNGICO IN VITRO

Con relación a los análisis fitoquímicos preliminares y de cromatografía de gases el análisis antifungico se llevó a cabo con el extracto de Eucalipto sin pretratamiento del material vegetal. De la figura 32 se puede afirmar que los extractos de (Eucaliptus globulus Labill) presentan un efecto inhibitorio sobre el crecimiento micelial de la especie Fusarium oxysporum Dianthi sin embargo no muestran una diferencia significativa entre tratamientos, esto puede deberse a la baja concentración utilizada.

Fuente: autor

Figura 32. Porcentaje de inoculación por tratamiento en 7 días. Estudios previos sobre la actividad fungicida de extractos etanólicos vegetales afirman que las concentraciones utilizadas en estudios de este tipo deben ser altas teniendo en cuenta que se trabaja con extractos crudos que contienen diferentes tipos de metabolitos e impurezas sin ninguna característica antifúngica (Lizcano, 2007). Por otra parte el porcentaje de inhibición presentado por los tratamientos en los cuales se adiciono la microemulsión (extracto/Jatropha) en concentraciones 1-2 % son evidentemente bajos 12% y 18% respectivamente, a lo cual se puede dar una explicación en la dinámica de dispersión que la microemulsión proporciona al sistema, ya que la liberación del principio activo es gradual, por ende el tiempo de liberación y acción se posterga. 46

Sin embargo estudios realizados por Murillo-Arango et. al (2013) sobre la actividad antifúngica e insecticida de extractos de eucalipto en microemulsión acuosa reporta tazas de mortalidad para hongos patógenos e insectos de 40-60 % con una concentración de 8 g/L, en dicho estudio se hizo uso de bajas concentraciones tan cual se realizó con la microemulsión de extracto/Jatropha, para la cual el mayor porcentaje de inhibición (18,6%) se produjo a una concentración de 2%, concluyendo que este tipo de aplicación es viable para cualquier sistema de control antifúngico pero su bajo desempeño se debe a la mínima concentración a la cual fue aplicado. Murillo reporta además la presencia de terpenos tales como citronelal (44,8 %) y citronelol (9,78 %), que se encuentran comúnmente en la composición de eucaliptos y a los cuales se les confiere las características antifúngicas e insecticidas, esto confirma la actividad antifúngica de los extractos obtenidos de (Eucaliptus globulus Labill) y de los cuales se observó la presencia de terpenoides e isoprenoides en la prueba fitoquímica preliminar en la cual todos los extractos dieron positivo al tratamiento. En estudios realizados por Oh et. al, (2008), se afirma que a partir de extractos de (Eucalyptus dalrympleana Maidense) se han podido aislar compuestos de tipo fenólico así como ácido gálico, los cuales son capaces de inhibir hasta en un 85% el crecimiento aéreo del micelio de hongos fitopatógenos en concentración de hasta 5000mg/l.

5. CONCLUSIONES

El proceso de secado de las hojas de (Eucaliptus globulus Labill) a una temperatura de 45°C demanda de 2,5 a 3,5 horas para que el material solido alcance el punto de equilibrio, siendo este el menor tiempo de todas las muestras sometidas a los diferentes pretratamientos. Después de 4 horas de secado para los tratamientos de 35°C y 45°C la remoción de humedad se estabilizó en un rango de 0,01% a 1,3%, por lo que este tiempo se puede tomar como el límite máximo para el secado de este tipo de material fitogenético.

Respecto al tiempo y temperatura de secado de las hojas de (Eucaliptus globulus Labill) , el rendimiento del extracto presenta una notable diferencia entre muestras en un rango de 37% -49%, teniendo en cuenta que el rendimiento aumenta a medida que la temperatura y tiempo de secado son mayores, sin embargo cabe destacar que la muestra sin pretratamiento presenta un rendimiento alto (46%) seguido del reportado para el pretratamiento de 45C6H (49%), de este modo se puede concluir que la mejor opción es no efectuar un pretratamiento de secado del material puesto que si se desea escalar el proceso a un nivel industrial los costos de servicios por operación del procesos se incrementarían al implementar procesos de secado.

Con respecto al análisis fitoquímico preliminar y cromatografía de gases se pudo observar que los metabolitos secundarios presente en el extracto etanólico de (Eucaliptus globulus Labill) no se ve afectada respecto al pretratamiento de secado en ninguna de las muestras incluyendo la muestra sin secado, sin embargo en el extracto si secado se acentúa la presencia del compuesto 1,8-Cineol de gran importancia en el control biológico de plagas.

El extracto obtenido de las hojas de (Eucaliptus globulus Labill) tiene un efecto antifungico eficaz (65%) frente a la especie (Fusarium oxysporum Dianthi), si es aplicado en su estado puro, al ser aplicado en microemulsión su efecto inhibidor disminuye notablemente a un rango de 12%-18%.

6. RECOMENDACIONES

Para estudios posteriores se debe tener en cuenta el estado del material fitogenético en cuanto a frescura, tiempo de recolección y edad de la planta de la cual se haga la recolección.

En el proceso de extracción en la fase de condensación del extracto/solvente debe tenerse especial cuidado extrayendo la mayor cantidad de solvente, ya que estos contenidos pueden afectar los resultados de rendimiento.

En control antifúngico especialmente si se trabaja en microemulsión se aconseja evaluar el efecto del tamaño de la partícula y la concentración del extracto en la microemulsión sobre el efecto antifúngico.

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ANEXOS Anexo A. (Eucaliptus globulus Labill)

Figura 33. Hoja de Eucaliptus globulus Labill

Figura 34. Ă rbol adulto de Eucaliptus globulus Labill

Figura 35. Ă rbol joven de Eucaliptus globulus Labill

Anexo B. Hojas de (Eucaliptus globulus Labill) secas

Anexo C. Montaje soxhlet por triplicado para extracción, condensación extracto/etanol.

Anexo D. Resumen estadístico 35C4H 35C6H 45C4H 45C6H Total

Recuento 3 3 3 3 12

Promedio 36.92 39.53 40.93 49.1667 41.6367

Desviación Estándar 4.90703 21.1397 15.3123 9.75598 12.9786

Coeficiente de Variación 13.291% 53.4776% 37.4109% 19.8427% 31.171%

Mínimo 31.59 22.22 23.25 41.0 22.22

Máximo 41.25 63.09 49.94 59.97 63.09

Rango 9.66 40.87 26.69 18.97 40.87

Anexo E. Tabla ANOVA Fuente

Suma de Cuadrados

Cuadrado Medio

Razón-F

Valor-P

Entre grupos

251.656

83.8853

0.42

0.7443

Intra grupos

1601.22

200.152

Total (Corr.)

1852.88

La razón-F, que en este caso es igual a 0.419107, es el cociente entre el estimado entre-grupos y el estimado dentro-de-grupos. Puesto que el valor-P de la razón-F es mayor o igual que 0.05, no existe una diferencia estadísticamente significativa entre las medias de las 4 variables con un nivel del 95.0% de confianza.

Anexo F. Cuantificación de clorofila a, b y carotenoides ABSORBANCIA Y TRAMITANCIA LONGITUD DE ONDA (nm) 663

ABSORBANCIA 0,116

TRAMITANCIA (%) 76,5

646 470

0,057 0,122

87,6 75,5

SUSTANCIA

CUANTIFICACION DE CLOROFILAS A, B Y CAROTENOIDES FORMULA

Clorofila a Clorofila a (µg / ml) = 12,25 x A663 – 2,79 x A646 Clorofila b Clorofila b (µg / ml) = 21,50 x A646 – 5,10 x A663 Clorofila a+ b Clorofila a+b= 7,15 x A663 + 18,71 x A646 Carotenoides C (carotenoides) (µg / ml)= (1000 x A470 – 1,82 Chla – 85,02 Chlb) ÷ 198 Anexo G. Siembra del hongo Fusarium oxysporum Dianthi

CONTENIDO µg / ml 1,262 0,634 1,896 65,809

Anexo H. Análisis antifúngico

Hongo sin extracto

Eucalipto 0.5 %

Eucalipto 1 %

Eucalipto 1.5

1% Emulsión (extracto de eucalipto + aceite Jatropha)

2% Emulsión (extracto de eucalipto + aceite Jatropha)

Anexo I. Diámetro de crecimiento del hongo Fusarium oxysporum Dianthi

Anexo J. Porcentaje de crecimiento del hongo Fusarium oxysporum Dianthi