Telethon ita

Fondazione Telethon

XVII Convention Scientifica 11-13 Marzo 2013 Riva del Garda - Palazzo dei Congressi

Provincia Autonoma di Trento

Fondazione Telethon

Xvii CONveNTiON SCieNTiFiCa 11-13 marzo 2013 Palazzo dei Congressi Riva del GaRda (TN)

PROVINCIA AUTONOMA DI TRENTO

La copertina di questo Libro degli Abstract è dedicata a Renato Dulbecco e Rita Levi Montalcini: la loro scienza ed il loro impegno personale continuano ad ispirare la comunità scientifica Telethon.

Immagine di copertina: Ispirazioni da Nobel Sinistra: Ricostruzione 3D del virus SV40. Gentile concessione del Prof. Timothy S. Baker, University of California, San Diego, La Jolla, CA, USA. Renato Dulbecco (Catanzaro, 1914 - La Jolla, 2012) fu insignito unitamente a David Baltimore e Howard Temin del Premio Nobel per la Medicina nel 1975 per le scoperte sul meccanismo d’azione dei virus tumorali nelle cellule animali.

Destra: Struttura 3D del Fattore di Crescita Nervoso (NGF). Gentile concessione del Prof. Antonino Cattaneo, Scuola Normale Superiore di Pisa.

Rita Levi-Montalcini (Torino, 1909 – Roma, 2012) fu insignita unitamente a Stanley Cohen del Premio Nobel per la Medicina nel 1986 per le scoperte rispettivamente sul Fattore di Crescita Nervoso (NGF) e sul Fattore di Crescita Epidermico (EGF).

Retro di copertina: Rita Levi-Montalcini e Renato Dulbecco durante una premiazione, 1987. LaPresse.

Renato Dulbecco e Telethon Renato Dulbecco ha presieduto dal 1991 al 1995 la Commissione Medico Scientifica di Telethon, di cui è stato presidente onorario fino alla sua scomparsa. Il suo contributo alle attività della Fondazione è stato anche significativo grazie alla sua partecipazione ai lavori del primo Consiglio di indirizzo scientifico: è infatti dalla elaborazione strategica di questo organo consultivo che è nato il progetto carriere Telethon, poi Istituto Telethon Dulbecco. Nel 1999, anno in cui prese parte al Festival di Sanremo, Dulbecco decise infatti di devolvere il suo cachet proprio allo sviluppo un istituto che consentisse a giovani ricercatori di svolgere in piena indipendenza la propria carriera in Italia. Da allora l’Istituto Telethon Dulbecco (DTI) ha coinvolto 30 laboratori in Italia e ha permesso ad oltre 370 tra “Telethon scientist”, collaboratori, borsisti di svolgere la propria attività, arricchendo con il proprio talento la comunità degli scienziati italiani impegnati nella ricerca sulle malattie genetiche.

Realizzazione e Stampa: Pinelli Printing S.r.l., Via E. Fermi, 8 - 20096 Seggiano di Pioltello (MI)

2

XVII Convention Scientifica

RiNGRaZiaMeNTi

La Fondazione Telethon desidera esprimere la propria gratitudine a coloro che, con la loro generosità, hanno contribuito a rendere possibile la XVII Convention Scientifica Telethon:

Provincia Autonoma di Trento

AGILENT TECHNOLOGIES BIOSIGMA S.r.l.

BIO-RAD LABORATORIES S.r.l.

BMR Genomics S.r.l.

Charles River Laboratories Italia S.p.A. DASIT SCIENCES S.r.l. (M-Medical) EPPENDORF S.r.l.

EUROCLONE S.p.A. GILSON Italia S.r.l.

HAMILTON Italia S.r.l.

ILLUMINA ITALY S.r.l.

MERCK - MILLIPORE S.p.A. Nikon Instruments PERKIN ELMER Italia PRIMM S.r.l.

PRODOTTI GIANNI S.p.A. RESNOVA S.r.l.

SIGMA ALDRICH S.r.l.

BIOSPA - Società Prodotti Antibiotici S.p.A. Tema Ricerca S.r.l.

VWR International PBI S.r.l.

3

PROGRaMMa SCieNTiFiCO Lunedì 11 marzo 2013 10.00 – 14.00

Registration and poster setting up

14.15 – 14.30

Welcome

14.30 – 15.00

Opening address Lucia Monaco (Fondazione Telethon)

15.00 – 15.30

leCTURe

Sala 1000

an introduction to the international Rare diseases Research Consortium (iRdiRC) Irene Norstedt (European Commission, Brussels, Belgium) (Talk 1) 15.30 – 17.00

PleNaRY SeSSiON 1 – Genes and mechanisms of intellectual disabilities: paving the way for potential therapies Chairpersons: Han Brunner, Maria Passafaro intellectual disability: lessons from 500 diagnostic exomes Han Brunner (Nijmegen, The Netherlands)

(Talk 2)

The X-linked intellectual disability protein TSPaN7 regulates excitatory synapse development and aMPaR trafficking Maria Passafaro (Milan, Italy) (Talk 3) FMR1 expression and FMRP function as possible targets of pharmacotherapy in the Fragile X Syndrome Giovanni Neri (Rome, Italy) (Talk 4) Molecular bases and in vitro modeling of Cdkl5 dependent infantile neurological disorders Vania Broccoli (Milan, Italy) (Talk 5) 17.00 – 17.30

Coffee break

17.30 – 19.00

POSTeR SeSSiON 1

19.00 – 20.00

O.Ma.R. Journalism award

Sala 1000

Organized by the Osservatorio Malattie Rare, Fondazione Telethon and Orphanet Italia with the collaboration of the National Rare Diseases Centre (CNMR) http://www.premiomalattierare.it/ 20.00 – 21.00

Welcome cocktail

Martedì 12 marzo 2013 08.30 – 09.00

Registration and poster setting up

09.00 – 10.30

PleNaRY SeSSiON 2 – Therapeutic strategies for Mendelian disorders

Sala 1000

Chairpersons: Luis Galietta, Ennio Ongini (Nicox - Milan, Italy - and Rare Partners) Pharmacological strategies to rescue chloride transport in Cystic Fibrosis Luis Galietta (Genoa, Italy)

(Talk 6)

exploiting artificial nucleases for targeted transgene integration in human Hematopoietic Stem Cells and induced Pluripotent Stem Cells derived from normal donors and SCid-X1 patients Angelo Lombardo (Milan, Italy) (Talk 7) High Content Screening Facility at TiGeM: pharmacological approaches to treat rare genetic diseases Diego Medina (Naples, Italy) (Talk 8) a computational strategy to discover pharmacological chaperones with therapeutic potential for Retinitis Pigmentosa Francesca Fanelli (Modena, Italy) (Talk 9) 10.30 – 11.00

Coffee break

11.00 – 12.30

POSTeR SeSSiON 2

5

12.30 – 13.00

PiCTURe OF TeleTHON SCieNTiSTS taken by Filippo Sbalchiero

13.00 – 14.00

Buffet Lunch

14.00 – 15.00

KeYNOTe leCTURe

gathering point: registration desk Sala 1000

TiGeM goes translational Andrea Ballabio (Naples, Italy)

(Talk 10)

imagining new therapies for patients with Rare diseases: translate the future Arthur Tzianabos (Shire - Lexington, MA, USA) 15.00 – 16.00

Shire HGT and TiGeM (Talk 11)

PleNaRY SeSSiON 3 – advances in clinical trials Chairpersons: Robertson Parkman (Los Angeles, CA, USA), Luigi Naldini (Milan, Italy) The development of Givinostat for the treatment of duchenne Muscular dystrophy: from the animal to the clinic Paolo Bettica (Italfarmaco – Cinisello Balsamo, Italy), Eugenio Mercuri (Rome, Italy) (Talk 12) Phase i/ii clinical trial of Hematopoietic Stem Cell gene therapy for the treatment of Metachromatic leukodystrophy Alessandra Biffi (Milan, Italy) (Talk 13) Clinical trial of Hematopoietic Stem Cell gene therapy for Wiskott-aldrich Syndrome Alessandro Aiuti (Milan, Italy) (Talk 14)

16.00 – 17.00

ROUNd TaBle – Navigating the valley of death An interactive session engaging all Telethon scientists in tackling the hurdles of translating laboratory research to the clinic Moderators: Robertson Parkman (Los Angeles, CA, USA), Helen Heslop (Houston, TX, USA) Speakers: Luigi Naldini (Milan), Alberto Auricchio (Naples), Grazia Valsecchi (University of Milano-Bicocca, Milan, Italy), Alessandro Aiuti (Milan), Paolo Bettica (Italfarmaco – Cinisello Balsamo, Italy)

17.00 – 17.30

Coffee break

17.30 – 19.00

POSTeR SeSSiON 3

19.00 – 20.00

SPeCial eveNT

Sala 300

The Executive Director of the American Society for Cell Biology meets young investigators Stefano Bertuzzi (ASCB - Bethesda, MD, USA) Wine and Cheese

Mercoledì 13 marzo 2013 09.00 – 10.30

PaRallel SeSSiONS a-B a- Cardiomyopathy - failure and success

Sala 1000

Chairpersons: Daniel Garry, Silvia Priori emerging therapies for dMd Cardiomyopathy Daniel Garry (Minneapolis, MN, USA)

(Talk 15)

Channelopathies: moving toward gene therapy Silvia Priori (Pavia, Italy)

(Talk 16)

Melusin gene therapy: an innovative approach to prevent Familial Cardiomyopathies Guido Tarone (Torino, Italy)

(Talk 17)

inherited Cardiomyopathies: from phenotype-based to genetic-based nosology Eloisa Arbustini (Pavia, Italy)

(Talk 18)

6

B- decoding an engineering marvel: insights from genetic Renal diseases Chairpersons: Gregory Germino, Antonella De Matteis

Sala 300

On the edge of glory? Polycystic Kidney disease research as a model for moving from bench to bedside Gregory Germino (Bethesda, MD, USA) (Talk 19) Uromodulin and chronic diseases of the kidney Luca Rampoldi (Milan, Italy)

(Talk 20)

Cell biology and pharmacology of lowe Syndrome Antonella De Matteis (Naples, Italy)

(Talk 21)

ClC-5, an endosomal chloride – proton exchanger mutated in dent’s disease: a biophysical perspective Michael Pusch (Genoa, Italy) (Talk 22) 10.30 – 11.00 11.00 – 13.00

Coffee break PaRallel SeSSiONS C-d C- Trial readiness in Neuromuscular diseases

Sala 1000

Chairpersons: Jeffrey Chamberlain, Rossella Tupler Therapeutic potential of aav-microdystrophin vectors for gene therapy of duchenne Muscular dystrophy Jeffrey Chamberlain (Seattle, WA, USA) (Talk 23) Facioscapulohumeral Muscular dystrophy: a walk on the dark side of the (epi)genome Davide Gabellini (Milan, Italy)

(Talk 24)

From the bench to the clinic: what we have learnt from the italian National Registry for Facioscapulohumeral Muscular dystrophy Rossella Tupler (Modena, Italy) (Talk 25) Trial readiness in Peripheral Neuropathies: the Charcot-Marie-Tooth disease pathway Davide Pareyson (Milan, Italy) (Talk 26) Trial readiness in Peripheral Neuropathies: developing a unifying treatment strategy Carla Taveggia (Milan, Italy) (Talk 27) d- Blood disorders: from genetics to genetic therapies

Sala 300

Chairpersons: Punam Malik, Giuliana Ferrari Mutations in the 5’UTR of aNKRd26 result in a “new” form of inherited Thrombocytopenia that predisposes to leukemia and is characterized by the presence in platelets and megakaryocytes of a “new” cell structure Carlo Balduini (Pavia, Italy) (Talk 28) Hepcidin at the crossroad between Hemochromatosis and genetic iron deficiency Clara Camaschella (Milan, Italy) (Talk 29) RNa-based therapeutic approaches for Blood Coagulation Factor deficiencies caused by splicing mutations Mirko Pinotti (Ferrara, Italy) (Talk 30) Gene therapy for non-lethal disorders: the paradigm of Beta-Thalassemia Giuliana Ferrari (Milan, Italy)

(Talk 31)

Genetic therapy for Hemoglobinopathies: from the bench to the bedside Punam Malik (Cincinnati, OH, USA)

(Talk 32)

13.00 – 13.30

laTe BReaKiNG NeWS

13.30 – 14.00

POSTeR PRiZe aWaRd aNd ClOSiNG ReMaRKS

7

CONVEGNO DELLE ASSOCIAZIONI DI PAZIENTI Lunedì 11 marzo 2013 10.00 – 13.30

Registrazione dei partecipanti e ritiro cuffie per traduzione simultanea

14.15 – 15.30

SESSIONE PLENARIA (Sala 1000) – Ricercatori e rappresentanti delle Associazioni Amiche insieme Apertura dei lavori Lucia Monaco, Direttore Scientifico – Fondazione Telethon LECTURE – An introduction to the International Rare Diseases Research Consortium (IRDiRC) Irene Norstedt - Deputy Head of Unit Personalised Medicine, Health Research Directorate, DG Research and Innovation, European Commission, Bruxelles, Belgio

15.30 – 16.00

Coffee break

16.00 – 18.00

WORKSHOP 1 (Sala 300) - La ricerca farmacologica: prospettive per la cura delle malattie genetiche Moderatori: Fabrizio Seidita, Presidente Associazione Italiana Glicogenosi Francesca Sofia, Fondazione Telethon Intervento introduttivo di Michael Caplan, Yale University School of Medicine, Presidente del Consiglio d’Indirizzo Scientifico di Telethon La lunga strada della ricerca: il caso del rene policistico Alessandra Boletta – Associate Telethon Scientist, DIBIT San Raffaele, Milano Dallo studio dell’emofilia allo sviluppo di piccoli RNA terapeutici per le malattie genetiche Mirko Pinotti, Università di Ferrara Sviluppo informatico di agenti terapeutici: l’esempio della retinite pigmentosa Francesca Fanelli – Associate Telethon Scientist, Università di Modena e Reggio Emilia Prospettive della ricerca farmacologica sulle disabilità intellettive Patrizia D’Adamo – Associate Telethon Scientist, Università Vita-Salute San Raffaele Milano Discussione con la platea

18.00 – 19.00

SESSIONE POSTER 1: Incontro con i Ricercatori

19.00 – 20.00

Premio Nazionale Giornalistico O.Ma.R. dedicato alle malattie e tumori rari (Sala 1000)

20.00 – 21.00

Cocktail di benvenuto

8

Martedì 12 marzo 2013 08.30 – 11.00

WORKSHOP 2 (sala 300) - Costruire la piattaforma clinica per la sperimentazione di nuove terapie per le malattie genetiche Moderatori: Eloisa Arbustini, Università di Pavia - IRCCS Fondazione Policlinico San Matteo Fabio Ciceri, Ospedale San Raffaele Milano Piattaforma di ricerca clinica per la terapia cellulare avanzata Fabio Ciceri, Ospedale San Raffaele, Milano Un registro dei pazienti al servizio dei pazienti: genetica, diagnosi e ricerca per la cura della distrofia facio-scapolo-omerale Rossella Tupler, Università di Modena e Reggio Emilia Prepararsi alla sperimentazione clinica: l’esperienza del network italiano per la malattia di Charcot Marie Tooth Davide Pareyson, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta Dalla genetica alla terapia: il trial clinico nella Sindrome di Marfan Eloisa Arbustini, Università di Pavia - IRCCS Fondazione Policlinico San Matteo Discussione con la platea Filo Diretto con i Pazienti Alessia Daturi, Fondazione Telethon

11.00 – 11.30

Coffee break

11.30 – 12.30

SESSIONE POSTER 2: Incontro con i Ricercatori

12.30 – 13.00

Fotografia dei partecipanti al Congresso

13.00 – 14.00

Pranzo

14.30

Partenza navetta per Verona aeroporto e stazione FS

9

PReSeNTaZiONi ORali

11

PRESENTAZIONI ORALI

OPENING LECTURE

cialist who recognizes their particular rare condition.

Given that a considerable proportion of rare diseases are based in genetics, one may envisage a scenario whereby patients with complex clinical presentation be included in a program for undiagnosed diseases where the next step would be exome sequencing. I propose that such a strategy would provide many accurate diagnoses, thereby reducing doctor’s delay, unnecessary invasive, costly and burdensome procedures, and allowing a prognosis and care pathway to be charted.

Since collectively, rare disease are not rare, exome sequencing will soon move to the front end of the diagnostic process for an increasing number of clinically complex conditions, amongst which are intellectual disability, neurodegenerative diseases, immune deficiencies and several others.

Talk 1 AN INTRODUCTION TO THE INTERNATIONAL RARE DISEASES RESEARCH CONSORTIUM (IRDIRC) Irene Norstedt Deputy Head of Unit Personalised Medicine, Health Research Directorate, DG Research and Innovation, European Commission, Brussels, Belgium Irene.Norstedt@ec.europa.eu - http://ec.europa.eu/research/ health/medical-research/rare-diseases/irdirc_en.html The International Rare Diseases Research Consortium (IRDiRC) was launched in April 2011 and today it brings together some 30 public and private organisations from three continents.

IRDiRC teams up researchers and organisations investing in rare diseases research in order to achieve two main objectives, namely to deliver 200 new therapies for rare diseases and means to diagnose most rare diseases by the year 2020.

Maximising scarce resources and coordinating research efforts are key elements for success in the rare diseases field. Worldwide sharing of information, data and samples to boost research is currently hampered by the absence of an exhaustive rare disease classification, standard terms of reference and common ontologies, as well as harmonised regulatory requirements.

IRDiRC gathers organisations that share common goals and principles and have agreed to work in a coordinated and collaborative manner within a multinational consortium. A number of grand challenges will need to be addressed through collaborative actions to reach IRDiRC objectives and the 2020 goals: - establish and provide access to harmonised data and samples; - perform the molecular and clinical characterisation of rare diseases; - boost translational, preclinical and clinical research.

This collaboration will also require harmonisation of policies related to research use, standardisation, and dissemination and a comprehensive policy agenda will be developed.

Talk 3 THE X-LINKED INTELLECTUAL DISABILITY PROTEIN TSPAN7 REGULATES EXCITATORY SYNAPSE DEVELOPMENT AND AMPAR TRAFFICKING Maria Passafaro CNR Neuroscience Institute, Milan, Italy, and DTI Dulbecco Telethon Institute Defective formation or function of synapses in the CNS during development results in disorders of learning and memory, including autism and intellectual disability. X-linked intellectual disability (XLID) is a heterogeneous condition that is caused by single gene mutations on the X chromosome. Over half of the genes that are found to be mutated in XLID encode synaptic proteins involved in actin cytoskeleton rearrangement, synaptic plasticity, synapse formation or neurotransmission, although the precise roles of most of these genes remain unknown.

One of the genes responsible for XLID is TM4SF2 which encodes TSPAN7-member of tetraspanins family. Tetraspanins are evolutionary conserved membrane proteins that tend to associate laterally with one another and to cluster dynamically with numerous partner proteins in membrane microdomains (Tetraspanin-Enriched Microdomains, TEMs) but their function in brain is not clear. Here we describe that TSPAN7 promotes filopodia and dendritic spine formation in cultured hippocampal neurons, and is required for spine stability and normal synaptic transmission. We also identify PICK1 (protein interacting with C kinase 1) as a TSPAN7 partner. Remarkably, TSPAN7 regulates the association of PICK1 with AMPARs, and controls AMPAR trafficking.

GENES AND MECHANISMS OF INTELLECTUAL DISABILITIES: PAVING THE WAY FOR POTENTIAL THERAPIES Talk 2 INTELLECTUAL DISABILITY: LESSONS FROM 500 DIAGNOSTIC EXOMES

Talk 4

Han G. Brunner Radboud University Medical Center Nijmegen, The Netherlands, h.brunner@gen.umcn.nl

FMR1 EXPRESSION AND FMRP FUNCTION AS POSSIBLE TARGETS OF PHARMACOTHERAPY IN THE FRAGILE X SYNDROME

The recent introduction of powerful new DNA sequencing machines has rapidly changed the study of inherited diseases. Interrogating all 22.000 human genes in one experiment, rather than one at a time, is now a practical possibility which we have explored in a first exploratory study on 500 patients with a number of different problems which often involve a genetic causes such as intellectual disability, movement disorders, blindness, and deafness. Our data suggest that it should now be possible to accurately molecularly diagnose a large fraction of patients with these conditions.

This has already changed the practice of medical genetics.

Previously, the molecular test would have been the final step in the diagnostic journey. Molecular testing would be ordered, after an accurate clinical diagnosis had been obtained, supported by other tests, some of which might be invasive, expensive and cumbersome to the patient. Clearly, all this will now change, since it would be defensible to order an “exome” screen once a genetic condition is suspected, in order to provide the medical geneticist with a molecular differential diagnosis. From this, molecular list, further clinical investigation may then follow in order to confirm or refute suspected diagnoses.

It is clear, that any success of applying exome sequencing should not be limited to medical genetics.

An estimated 1 in 16 individuals has a rare disease or will develop a rare disease in their lifetime. Rare diseases are often not recognized and diagnosed, and long delays, misdiagnosis, and missed diagnosis occur frequently. About half of all patients with a rare disease visit multiple doctors over an extended period before they reach a spe-

Giovanni Neri, Elisabetta Tabolacci, Stella Lanni, Martina Goracci, Giorgia Mancano, Pietro Chiurazzi Istituto di Genetica Medica, Università Cattolica del S. Cuore, Roma, Italy The fragile X syndrome (FXS) is the leading cause of inherited intellectual disability, with a prevalence of approximately 1 in 3000 males. It is caused by an unstable mutation of the FMR1 gene, consisting of expansion beyond 200 repeats of a CGG sequence in the 5’ UTR of the gene. Expansion is followed by methylation of the cytosines, including those of the promoter upstream, suppressing gene transcription. Absence of the protein product FMRP causes an excessive response of dendritic spine synapses to stimulation of metabotropic glutamate receptors, resulting in increased long term depression (LTD), as well as increased number of immature dendritic spines. Genetic homogeneity, apparent lack of structural damages to the nervous system, apparent reversibility of FXS manifestations in mouse model systems, support the view that FXS is amenable to treatment through drug-induced correction of the FMR1 insufficiency. We have explored two possible approaches.

The first approach aims at reactivating the FMR1 mutant gene by removing the epigenetic block that suppresses transcription. By treating FXS lymphoblastoid cells in vitro with the demethylating drug 5-azadeoxycytidine, we induced restoration of FMR1 transcription and translation. The treatment induced not only DNA demethylation, but also methylation of lysine 4 and partial demethylation of

12

PRESENTAZIONI ORALI

lysine 9 of histone H3, as well as acetylation of histones H3 and H4 in the FMR1 promoter region. This euchromatic configuration is also seen in naturally occurring unmethylated full mutations that are found in rare individuals of normal intelligence. A modest reactivation of the mutant FMR1 gene can also be induced by treatment with valproic acid. A preliminary clinical trial of this drug on 10 FXS individuals resulted in significant amelioration of their hyperactivity and attention deficit, as measured by the Conners scale (reviewed by Pirozzi et al. Am J Med Genet (part A) 155:1803–1816, 2011).

The second approach aims at compensating the absence of FMRP within the post-synaptic compartment of dendritic spines. Here, activation of metabotropic glutamate receptors (mGluR5) induces protein synthesis, which is normally downregulated by FMRP. Lack of FMRP results in excessive dendritic protein synthesis and increased LTD. This dysregulation can be corrected by mGluR5 inhibitors, such as AFQ056. This molecule was used in a double-blind, placebo-controlled, crossover study of 30 FXS adult subjects that demonstrated its efficacy in reducing hyperactivity and attention deficit.

Interestingly, not all tested individuals appeared to respond to this treatment, but only those who were found, retrospectively, to be carriers of a completely methylated FMR1 mutation (Jacquemont et al. Sci Transl Med 3: 64ra1, 2011).

Taken together, these results demonstrate that the concept of translational medicine can be successfully applied to the fragile X syndrome with a realistic expectation for the development of an effective pharmacotherapy within the foreseeable future.

ate transport in the epithelial cells of various organs. In the lungs, the basic defect causes chronic bacterial infections and plugging of the airways by highly dense mucus secretions. Our aim is to develop novel pharmacological strategies to correct the basic defect in CF. To this purpose, we are considering two different targets: CFTR, the plasma membrane chloride channel protein that is altered by CF mutations, and the calcium-activated chloride channel (CaCC), which represents an alternative pathway to circumvent the basic defect. Our project has two specific aims: 1) the identification of drug-like small molecules to correct the molecular defect caused by F508del, the most frequent mutation affecting CF patients; 2) the development of strategies to upregulate TMEM16A protein, the major component of the epithelial CaCC. The F508del mutation causes impaired maturation of the CFTR protein. Indeed, F508del-CFTR is detected as a misfolded protein during its biosynthesis and is rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome system. Although a small fraction of the mutant protein reaches the plasma membrane, it is rapidly internalized and degraded. To rescue F508del-CFTR, we have screened chemical libraries with a high-throughput functional assay based on the halide-sensitive yellow fluorescent protein (HS-YFP). This approach has detected several active compounds that are able to improve F508del-CFTR targeting to the plasma membrane. In particular, we have identified small molecules, belonging to the class of aminoarylthiazoles, that cause a dual effect on F508del-CFTR. They improve protein trafficking but also enhance the intrinsic ion channel activity. In parallel, we are using the HS-YFP assay to screen a genome-wide siRNA library. The purpose is to identify genes whose silencing leads to rescue of F508del-CFTR. The screening has identified a series of proteins, involved in ubiquitination and sumoylation. Such proteins may represent novel drug targets in CF. We are also studying the TMEM16A protein since it is a major component of epithelial CaCC. Interestingly, we have found that TMEM16A expression in the airway epithelium is particularly associated with mucus cell metaplasia, a condition of mucus hypersecretion that is typical of CF, asthma, and other chronic respiratory diseases. In particular, TMEM16A is highly expressed in goblet cells whereas CFTR is expressed in ciliated cells. Such results suggest that TMEM16A may be particularly required for mucin secretion. The separate localization of TMEM16A and CFTR requires further investigation to assess whether the former protein is a suitable drug target for CF therapy.

Disclosure: Studies entailing the use of AFQ056 were done in collaboration with and supported by Novartis Pharma, AG.

Talk 5 MOLECULAR BASES AND IN VITRO MODELING OF CDKL5 DEPENDENT INFANTILE NEUROLOGICAL DISORDERS Ricciardi Sara (1), Ungaro Federica (1), Hambrock Melanie (2), Rademacher Nils (2), Dario Brambilla (3), Sessa Alessandro (1), Charlotte Kilstrup-Nielsen (4), Carlo Sala (5), Kalscheuer Vera M. (2), Broccoli Vania (1) (1) Istituto Scientifico San Raffaele, Milan, Italy, broccoli.vania@hsr.it (2) Max Planck Institute for Molecular Genetics, Department of Human Molecular Genetics, Berlin, Germany (3) Department of Human Physiology, University of Milan Medical School, Milan, Italy (4) Laboratory of Genetic and Epigenetic Control of Gene Expression, Department of Structural and Functional Biology, University of Insubria, Busto Arsizio, VA, Italy (5) Consiglio Nazionale delle Ricerche Neuroscience Institute, Milan, Italy

Talk 7 EXPLOITING ARTIFICIAL NUCLEASES FOR TARGETED TRANSGENE INTEGRATION IN HUMAN HEMATOPOIETIC STEM CELLS AND INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS DERIVED FROM NORMAL DONORS AND SCID-X1 PATIENTS Angelo Lombardo (1), Pietro Genovese (1,2), Claudia Firrito (1), Tiziano Di Tomaso (1), Giulia Escobar (1), Giulia Schiroli (1), Andrew R. Gennery (3), Lucia Sergi Sergi (1), Philip D. Gregory (4), Michael C. Holmes (4), Luigi Naldini (1,2)

Mutations of the cyclin-dependent kinase-like 5 (CDKL5) and netrinG1 (NTNG1) genes cause a severe neurodevelopmental disorder with clinical features that are closely related to Rett syndrome, including intellectual disability, early-onset intractable epilepsy and autism. We report here that CDKL5 is localized at excitatory synapses and contributes to correct dendritic spine structure and synapse activity. To exert this role, CDKL5 binds and phosphorylates the cell adhesion molecule NGL-1. This phosphorylation event ensures a stable association between NGL-1 and PSD95. Accordingly, phosphomutant NGL-1 is unable to induce synaptic contacts whereas its phospho-mimetic form binds PSD95 more efficiently and partially rescues the CDKL5-specific spine defects. Interestingly, similarly to rodent neurons, iPSC-derived neurons from patients with CDKL5 mutations exhibit aberrant dendritic spines, thus suggesting a common function of CDKL5 in mice and humans.

(1) San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy, San Raffaele Institute, Milan, Italy (2) Vita-Salute San Raffaele University, Milan, Italy (3) Newcastle Upon Tyne Hospital, Newcastle Upon Tyne, United Kingdom (4) Sangamo BioSciences Inc., Richmond, CA, United States Gene targeting by homologous recombination holds great promise for gene therapy as it may overcome the risks of insertional mutagenesis and uncontrolled transgene expression associated with the use of conventional gene transfer vectors. The development of artificial nucleases, such as Zinc Finger Nucleases (ZFNs), has brought the possibility of targeted integration and gene correction within the reach of gene therapy. A ZFN-induced DNA double strand break at a predetermined site of the genome can trigger homology-directed repair (HDR), a pathway that can be exploited to insert new sequences with high efficiency and specificity into the ZFN target site (Lombardo et al., Nat. Biotech. 2007; Gabriel*, Lombardo* et al.

Nat. Biotech. 2001, *: equal contribution). Here we have exploited the ZFN technology to induce HDR-driven transgene insertion into a predetermined genomic site and used this strategy to insert transgene expression cassettes and correct mutations in Hematopoietic Stem/Progenitor Cells (HSPC) and induced Pluripotent Stem Cells (iPSC) from normal donors and X-linked Severe Combined Immunodeficiency (SCID-X1) patients, respectively. This disease, which is caused by mutations in the Interleukin-2 Receptor Common Gamma Chain (IL2RG) gene, is an ideal candidate to test the effica-

THERAPEUTIC STRATEGIES FOR MENDELIAN DISORDERS Talk 6 PHARMACOLOGICAL STRATEGIES TO RESCUE CHLORIDE TRANSPORT IN CYSTIC FIBROSIS Luis J.V. Galietta Laboratorio di Genetica Molecolare, Istituto Giannina Gaslini, Genova Cystic fibrosis (CF), one of the most frequent genetic diseases in caucasian populations, is caused by reduced chloride and bicarbon-

13

PRESENTAZIONI ORALI

cy and safety of this novel approach, as HSPC-based gene therapy trials performed with randomly integrating vectors showed clinical benefits but also a high rate of leukemia due to insertional mutagenesis and uncontrolled transgene expression. To achieve ZFN-mediated targeted insertion in HSPC, we developed a combined gene delivery protocol based on integrase-defective lentiviral vectors to deliver a donor template DNA for HDR and mRNA nucleofection to drive a short but robust spike of ZFNs expression. By using this protocol we can either target a transgene expression cassette into the putative “safe harbor” AAVS1 locus (Lombardo et al., Nat. Methods 2011) or insert a functional corrective IL2RG cDNA downstream of its own endogenous promoter (Lombardo et al., Nat. Biotech. 2007) with unprecedented efficiency and high specificity in HSPC. Gene edited HSPC generated both erythroid and myeloid colonies in vitro and, upon transplantation into NSG mice, reproducibly gave rise to both myeloid and lymphoid lineages. Importantly, gene-targeted cells were also found in the mice within the primitive human hematopoietic compartment, thus demonstrating editing of the longterm repopulating stem cell. In parallel, we have explored the use of patient-derived iPSC as a potentially unlimited source of gene-corrected HSPC. We have established a strategy that allows correction of the IL2RG gene and safe reprogramming of these cells. Using ZFN technology we inserted a corrective IL2RG cDNA downstream of its own endogenous promoter in fibroblasts from SCID-X1 patients with high efficiency. Since fibroblasts do not express IL2RG, to identify the gene-corrected cells we included downstream of the corrective cDNA a loxP-flanked drug-selection cassette, and efficiently reprogrammed the selected cells to iPSC by using a single-copy, Creexcisable Lentiviral Vector (LV) expressing the reprogramming factors (Camnasio et al., Neurobiol Dis. 2012). Transient Cre delivery resulted in near complete excision of the reprogramming LV and the selector cassette from the iPSC genome, demonstrating the feasibility of generating gene-corrected and reprogramming factor-free iPSC from SCID-X1 patients. Overall, these studies provide proof-ofprinciple for ZFN-mediated gene targeting and correction in wildtype and patient-derived HSPC and iPSC, and provide a path to the development of a more precise and safe gene therapy strategy for SCID-X1 and, conceivably, several other diseases.

the pathogenesis of LSDs using cultured cells and animal models. We aim to, a) the developing of cell-based assays for the phenotyping of rare genetic diseases and, b) the discovery of new therapeutic approaches to treat neglected diseases, such as lysosomal storage disorders (LSDs), and other common neurodegenerative diseases.

Talk 9 A COMPUTATIONAL STRATEGY TO DISCOVER PHARMACOLOGICAL CHAPERONES WITH THERAPEUTIC POTENTIAL FOR RETINITIS PIGMENTOSA Angelo Felline (1,2), Petra Behnen (2), Francesco Raimondi (1,2), Valeria Marigo (2), Francesca Fanelli (1,2) (1) Dulbecco Telethon Institute (DTI) (2) Department of Life Sciences, University of Modena and Reggio Emilia, Modena, Italy A majority of the over 16,000 missense mutations linked to human diseases affect folding or trafficking, rather than protein function [1].

Many disease-linked mutations occur in integral membrane proteins, a class of proteins whose folding we know very little about.

Conformationally based failure of a protein to achieve its functional structural state and normal cellular location as well as activation of Endoplasmic Reticulum (ER) stress are common contributors to the etiology and pathology of heritable human diseases. Defects in protein folding or trafficking are at the basis of the pathogenicity of rhodopsin mutations linked to Autosomal Dominant Retinitis Pigmentosa (ADRP). RP comprises a group of hereditary human diseases that are characterized by progressive retinal degeneration and severe visual impairment in as many as 1.5 million patients worldwide. Thus, ADRP-linked rhodopsin mutants fit in the protein-misfolding disease model suitable for treatments with pharmacological chaperones, i.e. ligands able to rescue proper protein fold [2]. Yet, the structural features of such mutants are obscure, which hampers rational drug design.

Rhodopsin, a member of the G protein Coupled Receptor (GPCR) superfamily of seven-transmembrane proteins, is the visual pigment molecule of rod cells that captures light and activates an electrical signal transmitted to the brain for vision [3]. Photon absorption by rhodopsin causes the cis-trans isomerization of the covalently bound retinal chromophore and the consequent formation of the signaling active state.

A structural model of rhodopsin misfolding was built by thermal unfolding simulations of 46 ADRP mutants combined with the graphbased Protein Structure Network (PSN) analysis implemented in the Wordom software [4], in line with previous mechanical unfolding simulations [5]. ADRP rhodopsin mutations share more or less marked abilities to affect the connectivity of selected amino acid residues, which act as hubs in the native structure network. These highly connected nodes are essentially located in the retinal binding site that participates in the stability core of the protein. In silico analysis was associated with an in vitro study of subcellular localization of different mutants expressed in Cos-7 cells.

The combination of structural and in vitro characterizations allowed us to select a number of representative rhodopsin mutants as targets of virtual screening. The latter considered over two-million compounds taken from the ZINC Database (http://zinc.docking.org/).

A number of hit compounds were selected on the basis of docking score and ability to mimic the binding mode of retinal. In vitro testing of such compounds is underway.

The investigation provided insights into the structural fundamentals of the disease and is expected to discover pharmacological chaperones with therapeutic potential.

References: 1. Sanders CR, Myers JK (2004) Disease-related misassembly of membrane proteins. Annu Rev Biophys Biomol Struct 33: 25-51.

2. Krebs MP, et al. (2010) Molecular mechanisms of rhodopsin retinitis pigmentosa and the efficacy of pharmacological rescue. J Mol Biol 395: 1063-1078.

3. Fanelli F, De Benedetti PG (2011) Update 1 of: Computational Modeling Approaches to Structure-Function Analysis of G ProteinCoupled Receptors. Chem Rev 111: PR438-535.

4. Seeber M, et al. (2011) Wordom: A user-friendly program for the analysis of molecular structures, trajectories, and free energy surfaces. J Comput Chem 32: 1183-1194.

5. Fanelli F, Seeber M (2010) Structural insights into retinitis pigmentosa from unfolding simulations of rhodopsin mutants. FASEB J 24: 3196-3209.

Talk 8 HIGH CONTENT SCREENING FACILITY AT TIGEM: PHARMACOLOGICAL APPROACHES TO TREAT RARE GENETIC DISEASES Diego L. Medina Telethon Institute for Gene Therapy (TIGEM) – Naples, Italy Lysosomes are ubiquitous intracellular organelles that receive and degrade macromolecules from the secretory, endocytic, autophagic and phagocytic membrane-trafficking pathways. The lysosome is involved in numerous diseases including lysosomal storage disorders (LSDs), and neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s (AD), Parkinson’s (PD), and Huntington’s (HD). All these diseases share as a common feature the progressive accumulation of undigested macromolecules within the cell. Such accumulation ultimately results in cellular dysfunction that leads to clinical manifestations with variable association of visceral, skeletal, hematologic and, most importantly, severe neurological involvement. Whereas the unique solution for monogenic rare disorders is the replacement of the functional gene, the increasing discovery of the intracellular pathways involved in the pathogenesis of these diseases envisage new therapeutic alternatives to treat these devastating diseases, including pharmacological approaches.

High content screening (HCS) is a sophisticated method for drug discovery that combines all the molecular tools of modern cell biology with automated high-resolution microscopy and robotic handling.

The technology allows the development of complex cell-based assays to measure multiple cell processes that simultaneously identify a relevant and specific cell phenotype, and to assess how this phenotype responds to chemical or genetic perturbations. The multiparametric analysis of these cell responses allows the simultaneous analysis of the effects of a given perturbant (small molecule or modifying gene) on a variety of molecular and cellular targets, including sub-cellular localization and redistribution of proteins. In contrast to biochemical screening, HCS detects the responses within the context of the intercellular structural and functional networks of normal and diseased cells, respectively.

Here we present the new HCS Facility at TIGEM that takes the advantages of both state-of-the-art HC technology and the knowledge we have gained on the cellular and molecular mechanisms of

14

PRESENTAZIONI ORALI

KEYNOTE LECTURE

THE DEVELOPMENT OF GIVINOSTAT FOR THE TREATMENT OF DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY: FROM THE ANIMAL TO THE CLINIC

Talk 10

Paolo Bettica (1), Eugenio Mercuri (2) TIGEM GOES TRANSLATIONAL

(1) Clinical Research & Development, Italfarmaco S.p.A., Cinisello Balsamo, Italy (2) Neuropsichiatria infantile, Universita Cattolica Sacro Cuore, Roma, Italy

Andrea Ballabio Telethon Institute for Gene Therapy (TIGEM) – Naples, Italy

Inhibition of Histone Deacetylases (HDAC) has beneficial effects in mouse models of muscular dystrophies indicating that HDACs are a pharmacological target for Duchenne Muscular Dystrophy (DMD).

Givinostat is a potent HDAC inhibitor which is being developed for the treatment of DMD. Givinostat was first tested in a validated preclinical model of DMD, the mdx mouse. Results showed a dose- and concentration-dependent beneficial effect of the compound on muscle histological parameters affected by the disease such as inflammation, necrosis, fibrosis and myofiber regeneration. The histological effects translated into an improvement in function (treadmill test). The results obtained in the preclinical experiments formed the basis for the development of the ongoing clinical study in DMD ambulant children. In particular, the clinical study main objective is to confirm that the histological changes observed in the mdx model are obtained also in children treated with Givinostat. Moreover, a pharmacometric analysis of the preclinical results allowed us to identify Givinostat exposures expected to be efficacious and thus define the doses to be used in the clinical study. Finally, the study will also incorporate the assessment of a number of endpoints such as functional scales (6 Minute Walk Test, North Star, Upper Limb Scale), Magnetic Resonance, biomarker. In the end the study will allow us to understand the effect of Givinostat both at tissue and functional level. This study can be used as a paradigm of translational research.

More specifically, the study illustrates how the parallel development of pharmacological and animal studies on one side, and, on the other side clinical related activities, such as patients registries, definition of standards of care and outcome measures have paved the way to facilitate the different steps leading to a clinical trial.

The main goal of the Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM) is to elucidate the molecular mechanisms underlying genetic diseases and to develop preventive and therapeutic strategies. Research at TIGEM is focused on three strategic programs, Cell Biology of Genetic Diseases, Systems Biology and Molecular Therapy. The Institute counts with 13 independent research groups and 7 research facilities tailored to support the Institute’s research needs. Recently, TIGEM’s research interest has reached a turning point with the immediate need to move from scientific discovery to clinical applications. Towards this goal, partnerships between nonprofit organizations, such as Telethon, and pharmaceutical companies are of pivotal importance due to the complexity of expertize required and the high costs of translational studies and clinical trials. As of October 2012 the Telethon Foundation and Shire Pharmaceuticals have announced a 5-year partnership to support translational research at TIGEM. This partnership is based on TIGEM scientific discoveries in the fields of lysosomal function and cellular clearance, of the mechanisms underlying lysosomal storage disorders, neurodegenerative diseases and disorders of intracellular trafficking and on TIGEM development of novel gene therapy and cell-based drug screening approaches. Shire will invest approximately US$ 22 million in 5 years to support TIGEM research projects in these fields. The complementarity of TIGEM and Shire expertize and efforts will pave the way to the development of therapies for people suffering from several devastating diseases still lacking a cure.

Talk 11 Talk 13

IMAGINING NEW THERAPIES FOR PATIENTS WITH RARE DISEASES: SHIRE HGT AND TIGEM TRANSLATE THE FUTURE

PHASE I/II CLINICAL TRIAL OF HEMATOPOIETIC STEM CELL GENE THERAPY FOR THE TREATMENT OF METACHROMATIC LEUKODYSTROPHY

Arthur Tzianabos Shire Human Genetic Therapies, Shire Way, Lexington, MA, USA

Montini Eugenio (1), Lorioli Laura (1,2,3,4), Cesani Martina (1), Fumagalli Francesca (2,5), Plati Tiziana (1), Martino Sabata (5), Baldoli Cristina (7), Calabria Andrea (1), Canale Sabrina (2), Benedicenti Fabrizio (1), Vallanti Giuliana (8), Biasco Luca (1), Leo Simone (9), Kabbara Nabil (10), Zanetti Gianluigi (9), Rizzo William B. (11), Metha Nalini AL. (12), Cicalese Maria PIa (2,3), Casiraghi Miriam (2), Boelens Jaap J (13), Del Carro Ubaldo (5), Dow David J (12), Schmidt Manfred (14), Di Serio Clelia (4), Stupka Elia (15), Von Kalle Christof (14), Bordignon Claudio (4,8), Ciceri Fabio (3,16), Rovelli Attilio (17), Roncarolo Maria Grazia (1,2,3,4), Aiuti Alessandro (1,2,3,18), Sessa Maria (2,5), Naldini Luigi (1,4), Biffi Alessandra (1,2,3)

Shire Human Genetic Therapies (Shire HGT) is a fully integrated biopharmaceutical company dedicated to helping patients with rare diseases lead better lives. The company has a long history of developing novel therapies for rare genetic diseases first as Transkaryotic Therapies and now as Shire HGT. Through its internal Research and Development capabilities, Shire HGT has developed enzyme replacement therapies (ERTs) for Fabry disease, Hunter Syndrome and Gaucher disease. All three ERTs were developed using the company’s propriety gene activation technology in a human cell line. The company has a fourth product for patients suffering from hereditary angioedema (HAE). This product is a peptide that inhibits the bradykinin receptor and reduces the painful swelling associated with attacks in HAE patients. Shire HGT is actively developing novel approaches to bringing therapies forward for rare diseases through its own R & D efforts and in collaboration with other biotech companies, academic institutions, nonprofit institutes, and patient organizations. In October 2012, Shire HGT and the Telethon Foundation announced a 5-year partnership to support translational research at TIGEM. This partnership is based on the recognition of the outstanding scientific advances TIGEM has made in the fields of lysosomal function and cellular clearance, of the mechanisms underlying lysosomal storage disorders, neurodegenerative diseases and disorders of intracellular trafficking and development of novel gene therapy and cell-based drug screening approaches. Through the combination of TIGEM’s scientific expertise in discovering and translating novel therapeutic concepts and Shire HGT’s non-clinical, clinical and manufacturing capabilities, the goal of the alliance is to bring much needed therapies for rare diseases to patients around the world.

(1) San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy (HSR-TIGET), Division of Regenerative Medicine, Stem Cells and Gene Therapy, San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy (2) HSR-TIGET Pediatric Clinical Research Unit, San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy (3) Pediatric Immunohematology, San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy (4) Vita Salute San Raffaele University, Milan, Italy (5) Neurology Unit, Department of Neurology, San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy (6) Neuroradiology Unit, Head and Neck Department, San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy (7) Department of Experimental Medicine and Biochemical Sciences, University of Perugia, Perugia, Italy (8) Molmed S.p.A., Milan, Italy (9) Distributed Computing Group, Center for Advanced Studies, Research and Development in Sardinia (CRS4), Pula, Italy (10) Pediatric Hematology Oncology Division, Rafic Hariri University Hospital, Beirut, Lebanon (11) Department of Pediatrics, University of Nebraska Medical Center, Omaha, NE, USA. (12) Molecular and Cellular Technologies, GlaxoSmithKline, Stevenage, United Kingdom

ADVANCES IN CLINICAL TRIALS Talk 12

15

PRESENTAZIONI ORALI

(13) Pediatric Blood and Marrow Transplantation Program, UMC Utrecht, Netherland (14) Department of Translational Oncology, National Center for Tumor Diseases and German Cancer Research Center, Heidelberg, Germany (15) Center for Translational Genomics and BioInformatics, San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy (16) Hematology and Bone Marrow Transplant Unit, San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy (17) Bone Marrow Transplant Unit, MBBM Foundation, Pediatric Department, Milano-Bicocca University at San Gerardo Hospital, Monza, Italy (18) University of Rome Tor Vergata, Italy

(7) Texas Children’s Hospital, Baylor College of Medicine, USA (8) IRGB-CNR, Milan, Italy (9) Hematology and Bone Marrow San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy Wiskott-Aldrich Syndrome (WAS) is an X-linked immunodeficiency characterized by thrombocytopenia, infections, autoimmunity and lymphomas. In patients lacking a compatible hematopoietic stem/progenitor cell (HSPC) donor, mismatched allogeneic transplantation or gene therapy with gamma-retroviral vectors provided clinical benefit but resulted in transplant complications and genotoxicity of the vector, respectively. We adopted a new protocol of HSPC gene therapy based on a self-inactivating lentiviral vector (LV) expressing the WAS protein under its endogenous promoter combined with reduced intensity conditioning (anti-CD20, busulfan and fludarabin). Three patients were treated with autologous bone marrow (BM) CD34+ cells transduced with highly purified lentiviral vector. The first patient received also mobilized peripheral blood transduced CD34+ cells to reach an adequate cell dose. Transduction of clonogenic progenitors was highly efficient (94.3 ± 5.3%), with a mean VCN/genome in bulk CD34+ cells of 2.1 ± 0.6. We then evaluated the engraftment of transduced cells in bone marrow and peripheral blood (PB) lineages and patients’ immune functions. A robust multilineage engraftment of gene corrected cells was observed in the PB and BM at 1-1.5 years after treatment. Molecular tests showed the presence of gene modified cells in BM clonogenic progenitors (25-50%), BM myeloid lineages (VCN range: 0.290.78), PB granulocyte (VCN: 0.56±0.15) and lymphocytes (VCN range: 1.05-2.29) at the latest follow-up. WASp expression was detected in platelets, monocytes and at higher levels in lymphoid cells, as assessed by flow cytometric analyses. Proliferative responses to anti-CD3, NK cell cytotoxic activity, immune synapsis formation and Treg suppressive function were normalized after gene therapy. All patients are currently clinically well, independent from platelet transfusions, free from eczema and severe infections. Highthroughput sequencing of vector integration sites after transplant demonstrated a highly polyclonal haematopoiesis. Importantly, we were able to directly compare the LV and gamma-retroviral vector insertion profiles in cells from gene therapy treated patients with the same disease background. This analysis highlighted significant differences in the genomic distribution of vector insertions between the two trials and showed that the LV gene therapy protocol did not induce in vivo selection of integrations near cancer genes or aberrant clonal expansions. The current clinical follow (1.4-2.4 years) and the cumulative data derived from other safety monitoring tests are consistent with an improved safety of LV gene therapy. In conclusion, LV-based HSPC gene therapy provides a new treatment option for WAS and, conceivably, other genetic blood disorders.

Metachromatic Leukodystrophy (MLD) is an autosomal recessive lysosomal storage disorder caused by Arylsulfatase A (ARSA) deficiency and leading to severe demyelination, neurodegeneration and premature death of the affected patients. Currently, no treatment can halt the progression of this devastating disease. According to preclinical data demonstrating the safety and efficacy of hematopoietic stem cell gene therapy in the animal model of the disease, and based on the experience we acquired on the natural clinical course of the disease and its instrumental and clinical monitoring, on March 2010 a clinical trial based on transplantation of autologous hematopoietic stem cells transduced with lentiviruses (LVs) encoding ARSA was approved by the Italian Regulatory Authorities. The clinical protocol foresees the enrollment of 6 late infantile (LI) and 2 early juvenile (EJ) patients, in pre- and, in the case of EJ patients, early-symptomatic stage, in order to provide them a reasonable expectation of clinical benefit. The study objectives are the evaluation of the safety of the treatment, related to the myeloablative conditioning regimen employed and to the use of LVs, and of its efficacy by measuring patients’ motor abilities and demyelination occurring in the nervous system through the use of validated instrumental readouts.

Until now seven patients have been enrolled and treated. Six of them had a biochemical, molecular and familiar history compatible with a diagnosis of LI MLD and have been treated in a pre-symptomatic stage of their disease. Only one patient, with a disease onset compatible with the EJ form of the disease, was treated in an early symptomatic stage. Thus far, we can report a favorable outcome of the transplant procedure with a good bone marrow recovery and the short/medium-term safety of both the conditioning regimen and stem cell transduction with LVs in all the treated patients. Moreover, we report stable sustained ARSA gene replacement to nearly exhaustive levels in the reconstituted hematopoiesis of the patients, resulting in supra-normal ARSA activity throughout the hematopoietic lineages and its reconstitution in the cerebrospinal fluid, the latter thus far documented in the first three treated patients. These findings are associated with substantial therapeutic benefit. Indeed, at the follow-up of the first three late infantile treated patients performed after the expected symptoms’ onset (as defined according to disease onset in the affected older siblings) the disease had not appeared/progressed; furthermore they are rather experiencing a continuous motor and cognitive development, at odds with the natural disease course and their sibling anamnesis, and have a normal quality of life. These data are extremely encouraging, even if only the long-term follow-up of all the treated patients will confirm this favorable preliminary indication.

CARDIOMYOPATHY - FAILURE AND SUCCESS Talk 15 EMERGING THERAPIES FOR DMD CARDIOMYOPATHY Daniel J. Garry Lillehei Heart Institute, University of Minnesota, Minneapolis, MN, USA 55455

Talk 14

Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is a common and deadly disease caused by dystrophin gene mutations. Treatment advances have improved survival however, DMD-associated cardiomyopathy has emerged as a major cause of death. Relatively few clinical studies have focused on DMD cardiomyopathy treatment and therefore uniform therapies have not been defined and/or broadly applied to this patient population. High resolution imaging technologies now allow us to interrogate and monitor the natural progression of DMD cardiomyopathy and to evaluate the impact of pharmacological therapies. The goal of our studies is to examine the role of the sympathetic nervous system and the renin-angiotensin-aldosterone system in the progression of DMD associated cardiomyopathy. We will examine the endogenous regenerative capacity of the adult heart focusing on the Abcg2 expressing cardiac SP progenitor cell population and the use of emerging technologies using cell therapy or iPSC derived cardiomyocytes for early diagnosis and treatment strategies.

As a complementary approach, we have defined a role for Etv2 in promoting vascularization of the diseased heart. We have defined a Vegf/Flk2/Creb/Etv2 transcriptional network that promotes the endothelial molecular program. Collectively, these studies highlight new strategies aimed at restoring cardiovascular architecture and function in chronic diseases such as DMD cardiomyopathy.

CLINICAL TRIAL OF HEMATOPOIETIC STEM CELL GENE THERAPY FOR WISKOTT-ALDRICH SYNDROME Scaramuzza Samantha (1), Biasco Luca (1), Ferrua Francesca (2), Cicalese Maria Pia (2), Giannelli Stefania (1), Castiello Maria Carmina (1,3), Evangelio Costanza (2), Assanelli Andrea (2), Casiraghi Miriam (2), Bosticardo Marita (1), Rizzardi Paolo (4), Finocchi Andrea (5), Metin Ayse (6), Banerjee Pinaki P (7), Orange Jordan S (7), Biffi Alessandra (1,2), Villa Anna (1,8), Ciceri Fabio (9), Roncarolo Maria Grazia (1,2,3), Naldini Luigi (1,3), Aiuti Alessandro (1,2,5) (1) San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy (HSR-TIGET), Milan, Italy (2) Pediatric Immuno-hematology and Bone Marrow Transplant, San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy (3) Università Vita-Salute San Raffaele, Milan, Italy (4) MolMed SpA, Milan, Italy (5) University of Rome “Tor Vergata”, Rome, Italy (6) Ankara Dispaki Children’s Hospital, Ankara, Turkey

16

PRESENTAZIONI ORALI

therapy protocol to test if overexpression of the muscle-specific melusin chaperone can buffer genetic mutations causing familial cardiomyopathies.

Two mouse models of cardiomyopathy, closely mimicking the human pathology are used. The first model replicates the Emery Dreifuss point mutation H222P in Lmna gene. Starting from 3 months of age, mutant mice develop dilated cardiomyopathy and muscular dystrophy with clinical features similar to those of human patients with the same mutation. A second model carries the W4R mutation in the MLP gene, a genetic defect with 1% frequency in Caucasian populations. Mutant mice develop hypertrophic cardiomyopathy at 12 months of age and the heart failure phenotype is characterized by almost complete loss of contractile reserve under catecholamine induced stress. Melusin will be expressed in the heart of these mutant mice either before or after the onset of the pathology allowing to evaluate the efficacy of the treatment both in preventing or treating the pathology. Cardio tropic adeno associated virus vector (AAV9) will be used for in vivo targeted gene delivery. Preliminary data of ongoing experiments will be presented.

Talk 16 CHANNELOPATHIES: MOVING TOWARD GENE THERAPY Silvia G. Priori Fondazione Salvatore Maugeri, UniversitĂ di Pavia, Italy and Leon Charney Division of Cardiology, Cardiovascular Genetics, New York University, NY Families affected by inherited life-threatening diseases are asking for a curative approach able to revert molecular, structural, and functional abnormalities of these diseases. This urgency is justified by the incomplete protection afforded by pharmacological therapy and by the frequent complications in the pediatric population of use of the Implantable Cardioverter Defibrillator that may be needed to reduce the risk of death.

Our clinical group is providing care to a large number of families with inherited arrhythmias both in Italy (Pavia) and in USA (New York) and therefore we appreciate the importance to advance therapies for channelopathies and therefore we recently committed to initiate a line of research targeted to the evaluation of gene therapy in one of the most lethal form on inherited arrhythmias called Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia (CPVT).

CPVT is an inherited arrhythmogenic disease associated with cardiac arrest in children or young adults. We identified that the gene for the autosomal recessive form is the cardiac Ryanodine receptor, but the most severe form is the recessive CPVT, characterized by the absence of cardiac calsequestrin 2, a protein that plays a pivotal role for the regulation of cytoplasmic calcium homeostasis in cardiac myocytes. The diagnosis of CPVT is most commonly established in subjects manifesting stress- or emotion-induced ventricular tachycardia and syncopal spells however sudden cardiac death may also be the first clinical sign of the disease. Recently, we engineered and characterized a CASQ2-/- mouse model that closely mimics the clinical phenotype of CPVT patients. We demonstrated that administration at birth of the CASQ2 gene delivery by adeno-associated viral vector was able to restore normal levels of calsequestrin and of the sister proteins Triadin and Junctin. Similarly, viral gene therapy was able to abolish cardiac arrhythmias in all mice. Mice were followed over time and at 52 weeks still maintain 100% protection from adrenergically induced arrhythmias. We therefore decided to explore whether such a remarkable therapeutic response could be reproduced in a Knock in mouse model CASQ2R33Q/R33Q treated with the AAV-CASQ2 construct despite the presence of the mutant protein that could hamper the polymerization of WT calsequestrin.

Follow up data at 6-9-12 months confirmed that also in the knock in mice the viral gene therapy is effective in abolishing structural abnormalities (fragmentation of couplons), depletion of triadin and junctin as well as development of malignant arrhythmias.

These data are extremely encouraging and support our interest in moving toward a clinical efficacy trial of gene therapy in CPVT patients with mutations in the CASQ2 gene.

Talk 18 INHERITED CARDIOMYOPTHIES: FROM PHENOTYPE-BASED TO GENETIC-BASED NOSOLOGY Eloisa Arbustini Centre for Inherited Cardiovascular Diseases, IRCCS Foundation Policlinico San Matteo, Pavia, Italy Cardiomyopathies (CMP) are myocardial disorders in which the heart muscle is structurally and functionally abnormal, in the absence of other diseases sufficient to cause the observed myocardial abnormality. Based on phenotype, the current classification recognizes 4 major groups of cardiomyopathies: - Dilated Cardiomyopathy (DCM, 1:2500) which is the commonest indication to heart transplantation; - Hypertrophic Cardiomyopathy (HCM, 1:500) which is the commonest inherited heart condition in Europe affecting 1 million individuals; - Arrhythmogenic (ARVC, 1:5.000) which is a common cause of Sudden Death in athletes and is currently classified as classical right (ARVC), biventricular and left dominant; - Restrictive Cardiomyopathy (RCM), a very rare condition (1:100.000) characterized by abnormal relaxation and abnormal left ventricular filling, dilation of both atria and absence of significant LV hypertrophy.

More than 70% CMPs show familial. Clinical screenings of large series of consecutive families have shown that most familial CMP are inherited as autosomal dominant traits, with a minority of recessive (2%), X-linked recessive (5%) and matrilineal (3%) forms. The 4 major CMP phenotypes share: genetic heterogeneity, age-dependent penetrance, and potential overlapping of phenotypes, with different members of same families showing either HCM and DCM, or DCM and ARVC, or HCM and RCM. More than 80 disease genes have been identified to date and the increasing number of genotyped families is providing the basis for revisiting the nosology of each major group of CMPs, based on the genetic cause rather on the major phenotype. Typical examples in the setting of DCM are dilated cardio-laminopathies (8% of all DCM) associated with high risk of life threatening arrhythmias, dilated cardio-dystrophinopathies (7% of consecutive DCM males) presenting with minor or clinically silent muscle involvement and predominant heart involvement leading to end-stage heart failure; sarcomeric HCM (about 90% of all HCM) and non sarcomeric HCM (10%) (HCM phenocopies), which include a broad group of multisystem diseases, affecting heart, muscle, brain, and other organs/tissues and including a variety of syndromes that require gene-based, specific diagnosis for treatment and prognostic stratification; desmosome ARVC caused by defect of genes coding desmosome proteins and nondesmosome ARVC caused by defects of genes also causing DCM phenotypes or left ventricular non-compaction (LVNC) such as LMNA or TAZ or LDB3; RCM broadly grouping in troponinopathies and desminopathies, two major groups of RCM with disease-specific traits, risk and systemic involvement.

Current treatments, medical interventional and surgical therapy (heart transplantation, LV remodeling) are based on clinical signs and symptoms and not on the specific disease: accordingly, we treat arrhythmias or heart failure, independently on the cause. Guidelines have been generated on phenotypes and are now largely inadequate to interpret the novel genetically driven clinical needs. The most impressive example is represented by cardio-laminopathies and ICD implantation. In LMNA patients the risk of SD is largely independent

Talk 17 MELUSIN GENE THERAPY: AN INNOVATIVE APPROACH TO PREVENT FAMILIAL CARDIOMYOPATHIES Mara Brancaccio, Cristina Rubinetto, James Cimino, Nicoletta Vitale, Guido Tarone Department of Molecular Biotechnology and Health Sciences, University of Torino, Italy Melusin is a muscle-specific gene required to activate a compensatory cardiac hypertrophy program. Its forced expression in heart of transgenic mice efficiently protects from left ventricle dilation in response to chronic pressure overload (De Acetis et al 2005) and myocardial infarct. Moreover, melusin levels are strongly reduced in the heart of human patients with dilated cardiomyopathy.

Melusin belongs to the family of small HSP molecular chaperons, it binds to the well known heat shock protein HSP90 and it is co-regulated both with HSP70 and HSP90. Molecular chaperones recognize partially denatured proteins and help them to retain correct function.

Since mutations often affect protein folding, it has been proposed that the molecular chaperones can also function in buffering deleterious genetic mutations. Indeed experimental evidences indicate that chaperone overexpression allows the retention of catalytic activity of artificially mutated enzymes. We have, thus, set up a gene

17

PRESENTAZIONI ORALI

on the severity of the LV dysfunction, which is one of the major criteria indicating ICD implantation according to existing guidelines.

A number of clinical warning is demonstrating that CMP patients cannot longer be classified and managed simply on their phenotype: CMPs caused by defects of different genes call for disease-specific diagnostic work-up, treatment strategy and prognostic stratification.

Tools are available: by Sanger sequencing of 40 disease genes in DCM patients/families we have demonstrated that cardiac and extra cardiac clinical traits/ markers, additional to the major CMP phenotype (DCM or HCM or ARVC or RCM), may support a sustainable, clinically-oriented genetic testing in a large number of families. By NGS screening of 50 genes in 77 probands we obtained more than 40.000 non-synonymous, splice, frameshift and in frame variants, the majority not segregating in families, and with 80% confirmation

by Sanger. Biotechnology cannot drive clinics; vice versa, our clinical skill and respect of rules of clinical genetics are the guarantee of the best use of new data for patients and families.

The future scenario for treatment innovation in inherited CMP includes at least four major avenues: 1. Development of novel drugs/molecules for subgroups of diseases sharing identical genetic causes; 2. Exploring, in experimental setting, the potential benefits of novel molecules (such as biological drugs) in subgroups of cardiomyopathies, based on specific interference of these molecules with the pathogenetic mechanisms of disease (typical example: cardio-laminopathies); 3. Old drugs for novel uses, when “new” molecular bases of “old diseases” meet recent discoveries of unexpected properties of old drugs (for example the anti-TGFbeta effects of Angiotensin II receptor 1 inhibitors); 4. Start medical treatments in preclinical phases of the CMP, before non-specific mechanisms of disease progression contribute to make the phenotype clinically overt. Under the EU project INHERITANCE (FP7 Project N. 241924) we are implementing a spontaneous clinical trial in mutation carriers with preclinical DCM (INHERITANCE-PRECARDIA). While waiting for novel molecules we need to make the best use of existing molecules and strategies: this is a urgent clinical need and a genetically-based nosology of CMP may largely contribute to this goal.

more under consideration. The community is abuzz with anticipation, and much activity is now focused on testing potential interventions.

This new-found optimism has prompted some to declare that we now know enough to move aggressively ahead with testing treatments and focus less on investigating the underlying biology.

In this presentation, I will review progress in the field, discuss the recent clinical trials and demonstrate why we must continue to pursue basic mechanistic studies, even as we embrace the optimism and hopefulness of our patients.

Talk 20 UROMODULIN AND CHRONIC DISEASES OF THE KIDNEY Luca Rampoldi DTI c/o Molecular Genetics of Renal Disorders Unit, Division of Genetics and Cell Biology, San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy Uromodulin is a protein exclusively produced in the kidney and secreted in the urine where it represents the most abundant protein under physiological conditions. Its biological function is still elusive, though it has been associated with protection against urinary tract infections and kidney stone formation, ion transport and kidney innate immunity (1).

Mutations in UMOD, the gene encoding uromodulin, lead to rare autosomal dominant diseases collectively referred to as uromodulinassociated kidney disease (UAKD). They are characterised by progressive tubulo-interstitial damage, impaired urinary concentrating ability, hyperuricaemia, renal cysts and progressive renal failure.

Through studies in cell models and in a transgenic mouse model of UAKD, we demonstrated that uromodulin mutations lead to ER retention of mutant protein, a primary event in the disease pathogenesis that precedes all other features (2). Uromodulin ER retention was never accompanied by induction of the unfolded protein response or apoptosis. Rather, some key pro-inflammatory markers were already upregulated well before the presence of any histological or functional renal damage, suggesting that UMOD mutations exert a non cell-autonomous proteotoxic effect that is significantly contributed by the inflammatory/fibrotic response. These data clearly demonstrate a gain-of-toxic function of uromodulin mutations and provide insight into the disease pathophysiology.

The importance of uromodulin in kidney (dys)function has been further enhanced by recent genome-wide association studies that identified uromodulin as a risk factor for chronic kidney disease (CKD) and hypertension (3). Our studies show that common risk variants in the UMOD gene are causally linked to these complex traits through modulation of gene expression.

References 1. L. Rampoldi et al. (2011) Kidney Int 80, 338.

2. I. Bernascone et al. (2010) Hum Mol Genet 19, 2998.

3. A. Kottgen et al. (2009) Nature genetics 41, 712.

DECODING AN ENGINEERING MARVEL: INSIGHTS FROM GENETIC RENAL DISEASES Talk 19 ON THE EDGE OF GLORY? POLYCYSTIC KIDNEY DISEASE RESEARCH AS A MODEL FOR MOVING FROM BENCH TO BEDSIDE Gregory Germino National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK), National Institutes of Health, Bethesda, MD; Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) is one of the most common inherited diseases of man, affecting ~1/1000. Cysts arise at all stages of life, and gradually expand to replace normal renal parenchyma. This process results in end stage kidney failure (ESKF) in approximately half by the 6th decade, accounting for approximately 5% of all cases of ESKF. Hepatic cysts affect >80% and on rare occasions can necessitate liver replacement.

Hypertension affects most, and intracranial aneurysms, which cluster in families, are an uncommon but often fatal extrarenal manifestation.

Therapies at present are limited to managing the complications. We have, however, made great progress in understanding the pathobiology of this disease and the role of the normal PKD gene products in regulating tubular morphology. Mutations in either of two genes, PKD1 and PKD2, cause all forms of the disease. Mutations appear to compromise gene function, and much data implicate a molecular recessive model as responsible for initiating cyst growth. PKD1 and PKD2 encode components of a receptor-channel complex that likely has ciliary and non-ciliary functions. Using syntenic mouse models, we have demonstrated unsuspected, complex development-stage specific consequences of Pkd1 inactivation that are linked to metabolic pathways. These models also have been used to show that PKD genes are essential for proper form and function of multiple other organs. In parallel to the lab-based studies, the ADPKD community has developed better tools for measuring progression of disease.

Armed with knowledge of pathways likely dysregulated in cystic epithelia, drugs that target the same, and non-invasive methods of assessing cystic progression, the community is on the cusp of changing the course of this disease. There have been several recent high profile clinical trials aimed at delaying progression, and many

Talk 21 CELL BIOLOGY AND PHARMACOLOGY OF LOWE SYNDROME Mariella Vicinanza (1), Antonella Di Campli (2), Elena Polishchuk (1), Michele Santoro (1), Maria Giovanna De Leo (1), MariaPaz Marzolo (3), and Maria Antonietta De Matteis (1) (1) Telethon Institute of Genetics and Medicine, Naples, Italy (2) Institute of Protein Biochemistry, CNR, Naples, Italy (3) Pontificia Universidad Católica de Chile, Santiago, Chile Mutations in the PtdIns4,5P2 5-phosphatase OCRL cause Lowe syndrome, which is characterised by congenital cataracts, central hypotonia, and renal proximal tubular dysfunction. Previous studies have shown that OCRL interacts with components of the endosomal machinery; however, its role in endocytosis, and thus the pathogenic mechanisms of Lowe syndrome, have remained elusive. To gain insight into OCRL function, into the role of its PtdIns4,5P2 5-phosphatase activity in membrane trafficking, and into the pathogenetic mechanisms of Lowe syndrome, we have analysed the endocytic compartments in kidney proximal tubular cells obtained from Lowe syndrome patients. Similarly, in kidney cell lines, we have studied the functional and ultrastructural consequences of the knock-down of OCRL-1 on multiple endocytic pathways. Our data indicate that through its PtdIns4,5P2 5-phosphatase activity, OCRL maintains the

18

PRESENTAZIONI ORALI

TRIAL READINESS IN NEUROMUSCULAR DISEASES

identity, structure, and function of early endosomes and the efficiency of trafficking pathways that traverse this compartment. These include the recycling of megalin, the multiligand receptor that drives uptake and absorption of protein in proximal tubular cells, and that undergoes mistrafficking in cells devoid of functional OCRL. The trafficking defects induced by OCRL mutations/depletion are caused by ectopic accumulation of PtdIns4,5P2 in early endosomes, which in turn induces an N-WASP-dependent increase in endosomal F-actin.

Finally, we have exploited the endocytic defects of cells deprived of OCRL to set up assays for high-content screening of small-molecule libraries to identify correctors of the endocytic mistrafficking as potential lead compounds for drug development for the treatment of Lowe syndrome.

Talk 23 THERAPEUTIC POTENTIAL OF AAV-MICRODYSTROPHIN VECTORS FOR GENE THERAPY OF DMD Jeffrey Chamberlain, Jane Seto, Julian Ramos, Guy Odom Department of Neurology, University of Washington, Seattle, WA, USA Duchenne muscular dystrophy (DMD) is among the most common lethal genetic disorder of children and is caused by mutations in the dystrophin gene. We are developing methods to deliver therapeutic genes to muscles throughout the body to either replace the missing dystrophin gene or to help compensate for the lack of dystrophin.

We show that shuttle vectors derived from adeno-associated virus type 6 (AAV6) are able to deliver genes systemically to adult mice when injected directly into the vasculature. AAV6 delivery results in highly efficient gene expression in skeletal and cardiac muscle that persists for the lifespan of the mouse. However, the AAV shuttles have a limited carrying capacity, and as a result we have also been developing truncated versions of the dystrophin gene that can be carried by AAV yet retain sufficient functional capacity to halt dystrophy. A single injection of an AAV6/micro-dystrophin vector into the vasculature of adult, dystrophic mice results in elimination of dystrophic histopathology for the lifespan of the mouse. Studies are also underway to scale the procedures for the dog model of DMD. These studies revealed a cellular immune response directed against the AAV capsid proteins, but one that could be blocked by short-term immune suppression, leading to micro-dystrophin expression for at least two years in injected limb muscles of the cxmd model for DMD. In comparing transduction of canine muscles using AAV6 vs AAV9, we found that AAV6 is comparable or better than AAV9 in skeletal and cardiac muscles. Nor have we found evidence for neutralization or inactivation of AAV6 vectors in a survey of more than 30 dogs.

These results suggest that a combination of intravascular AAV delivery coupled with transient immune suppression could lead to an effective therapy for DMD.

Talk 22 CLC-5, AN ENDOSOMAL CHLORIDE–PROTON EXCHANGER MUTATED IN DENT’S DISEASE: A BIOPHYSICAL PERSPECTIVE Michael Pusch, Silvia De Stefano, Michele Fiore, Antonella Gradogna, Elena Jeworutzki, Ilaria Zanardi, Giovanni Zifarelli Istituto di Biofisica, CNR, Genova, Italy BACKGROUND: Four of the nine human CLC proteins are plasma membrane Cl- channels whereas the other five are coupled 2 Cl- / 1 H+ antiporters localized in endo-/lysosomes (1). Mutations in CLC-5 lead to Dent’s disease, characterized by low molecular weight proteinura (LMWPU), hypercalciuria, kidney stones and eventual renal failure (2). CLC-5 is localized in apical endosomes in the brush border in the proximal tubule (PT). Here, it is important for endocytosis, explaining the LMWPU phenotype (3). The other symptoms are indirectly caused by a defective PT handling of hormones involved in calcium homeostasis (3). Despite these physiological insights, the actual role of CLC-5 in endocytosis is unclear. Previously, it was thought that CLC-5 is a Cl- channel helping endosomal acidification, providing counter ions balancing charge accumulation by the H+ pump. However, it now clear that CLC-5 is a Cl-/H+ antiporter (4).

A specific Glu residue (E211, “gating Glu”) is essential for the antiporter function and mutating it to Ala (E211A) converts CLC-5 into a Cl- channel (4). Knockin-mice carrying this uncoupling mutation develop Dent’s disease symptoms, demonstrating that the antiporter function cannot be replaced by a Cl- channel (5).

OBJECTIVES: Our group is investigating several biophysical aspects of CLC-proteins involved in genetic diseases (CLC-5, CLC-K, CLC-2).

In this talk, we will focus on one aspect of CLC-5 that we have recently studied in detail (6). The Cl- / H+ exchange involves two critical Glu residues: the gating Glu (E211) controls access of Clfrom the extracellular space and its cyclical (de)protonation is critical for Cl-/H+ coupling (7); the proton Glu (E268) is the intracellular entry point for protons (8). The E268A mutant eliminates steadystate transport (9) but exhibits transient currents upon positive voltage steps (10). Such transient currents reflect charge movements within the transporter and their nature may reveal information on the molecular details of transport coupling.

RESULTS: From the dependence of the transient currents of E68A on pH and [Cl-], we conclude that they represent the movement of an intrinsic gating charge followed by the voltage dependent binding of extracellular Cl- ions. In addition, we found that the gating Glu mutation E211D abolishes stationary transport but displays transient currents which are shifted by 150 mV compared to those of E268A, identifying E211 as a major component of the charge movement. We suggest that that the initial events in the transport cycle are a movement of the gating Glu from the “external site” (Sext) to the “central site” (Scen) with accompanying displacement of a Cl- ion from Scen to the inside, followed by binding of an extracellular Cl- ion into Sext. These biophysical insights increase our molecular understanding of CLC antiporters. We hope that such an improved understanding aids in the development of strategies for the treatment of the diseases in which these proteins are involved.

References (1) G. Zifarelli and M. Pusch, Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 158, 23 (2007) (2) S. E. Lloyd et al., Nature 379 (6564), 445 (1996) (3) N. Piwon et al., Nature 408 (6810), 369 (2000) (4) A. Picollo and M. Pusch, Nature 436 (7049), 420 (2005) (5) G. Novarino et al., Science 328 (5984), 1398 (2010) (6) G. Zifarelli et al., Biophys. J. 102 (9), 2060 (2012) (7) A. Accardi and C. Miller, Nature 427 (6977), 803 (2004) (8) A. Accardi et al., J. Gen. Physiol. 126 (6), 563 (2005) (9) A. A. Zdebik et al., J. Biol. Chem. 283 (7), 4219 (2008) (10) A. J. Smith and J. D. Lippiat, Faseb J. 24 (10), 3696 (2010)

Talk 24 FACIOSCAPULOHUMERAL MUSCULAR DYSTROPHY: A WALK ON THE DARK SIDE OF THE (EPI)GENOME Davide Gabellini Dulbecco Telethon Institute and Division of Regenerative Medicine, San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy Only about 1% of the genome encodes for the 20000 human proteins, which are similar in number and largely orthologous to those found in organisms of significant lower complexity. On the contrary, the proportion of non protein-coding DNA has increased with developmental complexity reaching 98.5% in humans. Interestingly, up to two thirds of the human genome is composed of non protein-coding repetitive sequences. Furthermore, a significant portion of the epigenetic modifications is present in these regions and DNA repeats are dynamically transcribed in different cells and developmental stages producing a vast pool of non protein-coding RNA (ncRNA) molecules. Thus, ncRNAs produced by DNA repeats may hold the key to understanding the regulatory complexity inherent in advanced biological networks.

Long ncRNAs (lncRNAs) represent the most numerous and functionally diverse class of RNA produced by mammalian cells. Despite the growing interest on lncRNAs, they still remain poorly explored in terms of biological relevance, cellular function, mechanism of action and involvement in disease. We have recently contributed to this field through the identification of the first activating lncRNA involved in a human genetic disease: facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD).

FSHD is the third most prevalent myopathy and is characterized by progressive wasting of facial, upper arm, and shoulder girdle muscles. The classical form of FSHD (FSHD1, MIM 158900) is not caused by mutation in a protein-coding gene. Instead, the disease is associated with a reduced copy number of the D4Z4 macrosatellite repeat mapping to 4q35. Several FSHD clinical features, such as the variability in severity and rate of progression, the gender bias in

19

PRESENTAZIONI ORALI

penetrance, the asymmetric muscle wasting, and the discordance of the disease in monozygotic twins, strongly suggest the involvement of epigenetic factors. Accordingly, a number of epigenetic alterations have been reported in FSHD patients. While these features of the disease have been established for over a decade, the molecular mechanism through which D4Z4 repeats regulate chromatin structure and gene expression at 4q35 has remained elusive. We recently identified DBE-T, a chromatin-associated lncRNA produced preferentially in FSHD patients. We showed that DBE-T regulates the chromatin structure of the FSHD locus and the expression of FSHD candidate protein-coding genes.

Here, we will discuss our recent results regarding the regulation of DBE-T expression and how this ncRNA activates the epigenetic cascade leading to FSHD.

Talk 26 TRIAL READINESS IN PERIPHERAL NEUROPATHIES: THE CHARCOT-MARIE-TOOTH DISEASE PATHWAY Davide Pareyson on behalf of the Italian CMT Network Clinic of Central and Peripheral Degenerative Neuropathies Unit, IRCCS Foundation, C. Besta Neurological Institute, Milan, Italy Advances in our understanding of genetics and pathophysiology of Charcot-Marie-Tooth neuropathies (CMT) are creating great expectations in the field. Promising therapeutic approaches include rehabilitation therapy, curcumin, progesteron antagonists, neuregulin-1 III pathway regulation, high-throughput drug screening, and histon deacetylase 6 (HDAC6) inhibitors.

Translation of positive results of potential therapies in cellular and animal models to clinical trials in the human disease is long and difficult and requires a coordinated multidisciplinary approach. The preparation of the ascorbic acid (AA) multicentre trial in Italy and UK (funded by Telethon and co-funded by AIFA in Italy) was based on a ENMC workshop and on validation of outcome measures in CMT. All the AA trials worldwide were negative, revealed difficulties in detecting intervention efficacy, owing to slow disease progression, but provided a lot of important information on how to proceed in clinical trial design. A fundamental point is that we need to develop responsive outcome measures. We showed the limits of the CMTNS and the potentiality of foot dorsiflexion myometry (the most sensitive-tochange measure of the Italian-UK trial). Clinical research led to development of an updated version of the CMTNS, of a novel paediatric scale (CMTPedS) based on clinimetric methods, and of tests of outcome measures used in other disorders (activity monitors, 6MWT). Exploration of surrogate paraclinical outcome measures includes studies on computerised gait analysis and quantitative MRI, and biomarkers. We measured mRNA PMP22 levels in skin biopsies from 46 patients recruited in the ascorbic acid trial at study entry and end of study: we found no change over two years and no correlation with disease severity. The skin biopsy approach allows testing other potential biomarkers. National and international registries for neuromuscular disorders are being developed and are important for favouring recruitment in novel trials: a CMT registry, linked to the international registry, is starting in Italy thanks to the Registry Association, Telethon and the ACMT-Rete patients’ association.

Telethon funded many of these studies and made it possible the contribution of Italian centres to the international effort in finding a therapy for CMT.

Talk 25 FROM THE BENCH TO THE CLINIC: WHAT WE HAVE LEARNT FROM THE ITALIAN NATIONAL REGISTRY FOR FACIOSCAPULOHUMERAL MUSCULAR DYSTROPHY Rossella Tupler Department of Biomedical Sciences, University of Modena and Reggio Emilia, Modena, Italy The practice of medical genetics requires a clear and definite evaluation of the significance of mutations and/or variations of DNA sequences for diagnosis, in order to provide prognostic information, and genetic counseling and to support research and clinical trials.

This is particularly important for a progressive disease with unpredictable onset and a high variability of clinical expression, such as Facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD). To address this fundamental question we have generated the Italian National Registry for FSHD (INRF), which collects clinical and molecular data from over one thousand independent families.

FSHD, a common myopathy, is considered an autosomal dominant disease. FSHD mutation has not been found in any protein-coding gene. Instead FSHD has been genetically linked to reduced numbers (≤8) of D4Z4 repeats at 4q35 combined with 4A(159/161/168) PAS haplotype. However, our most recent studies demonstrate that 1.3% of healthy individuals carry this molecular signature and 19% of subjects affected by FSHD do not carry alleles with reduced D4Z4 repeats. Thus the presence of D4Z4 reduction at 4q is not sufficient per se to cause disease. To unravel this unexpected genetic complexity, genotype-phenotype correlation was studied in 176 families in which FSHD and D4Z4 alleles of reduced size are present. The associations between clinical severity and size of D4Z4 allele, degree of kinship, gender, age, and 4q haplotype were evaluated. Overall, 32.2% of relatives did not display any muscle functional impairment.

This phenotype was influenced by the degree of relation with proband, because 47.1% of second- through third-degree relatives was unaffected, while only 27.5% of first-degree family members did not show motor impairment. Male relatives were more severely affected than females. No 4q haplotype was exclusively associated with the presence of disease. Remarkably in 16% of families the disease expression was reported only in one generation, supporting the idea that the disease develops because of the presence of additional genetic defect(s). Indeed by extending clinical and molecular studies of FSHD patients and families we found other factors/pathologic conditions that might influence and modulate the disease expression.

In summary, our study indicates that a profound rethinking of the genetic disease mechanism and modes of inheritance of FSHD are now required and that entirely new models and approaches are needed. Our data point at the possibility that in the heterozygous state a D4Z4 reduction might produce a subclinical sensitized condition that requires other epigenetic mechanisms or a contributing factor to cause overt myopathy. In some rare cases, that could be by becoming homozygous and doubling the dose of a dominant factor at 4q35. In others, it might be by the simultaneous heterozygosity for a different hereditary myopathy, as suggested by many reports in which the FSHD contractions are found in association with a second molecular defect.

We believe that by broadening the scope of investigations, including next-generation deep sequencing in particular in families with asymptomatic and clinically affected members carrying the same FSHD allele, may finally lead to a understanding of the molecular pathogenesis of this complex disease with crucial implication for clinical practice and research in FSHD.

Talk 27 TRIAL READINESS IN PERIPHERAL NEUROPATHIES: DEVELOPING A UNIFYING TREATMENT STRATEGY Carla Taveggia (1), Maria Laura Feltri (2), Stefano C. Previtali (1), Lawrence Wrabetz (2), and Alessandra Bolino (1,3) (1) Division of Neuroscience and INSPE San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy (2) Division of Genetics and Cell Biology San Raffaele Scientific Institute via Olgettina 58, 20132 Milan, Italy (3) Dulbecco Telethon Institute CMT neuropathies, the most frequent human hereditary neuropathies, are associated with mutations in more than 30 genes.

Modes of transmission include: recessive, dominant, or X-linked, with recessive diseases being more severe and of earlier onset. The severe disability and motor impairment derive mainly from progressive axonal damage and loss, with inefficient regeneration. Many CMT neuropathies display altered levels of myelination. Therefore therapeutical strategies aiming at restoring normal myelin levels could produce an effective approach for their collective treatment.

Furthermore, as myelin is neuroprotective, restoring its normal levels could facilitate the maintenance of a functional Schwann cellaxon unit and reduce axonal damage, which is the ultimate cause of morbidity.

In the peripheral nervous system (PNS), the key molecule regulating all the aspects linked to myelination is Neuregulin1 (NRG1) type III. Above a threshold level of expression of NRG1 type III, axons are myelinated and the amount of myelin is proportional to the levels of axonal NRG1 type III. All NRG1 proteins are proteolytically

20

PRESENTAZIONI ORALI

cleaved in their extracellular region. In particular the β-secretase BACE1 activates NRG1 type III enhancing myelination, while we recently showed that the pharmacologically accessible α-secretase TACE inhibits myelination. Our studies suggest the existence of a post-transcriptional mechanism modulating NRG1 activity and establish secretases as potential therapeutic target to modulate myelination in the PNS. To confirm our hypothesis and identify a unifying treatment strategy for CMT hereditary neuropathies disorders, we explored the mechanisms of action of NRG1 type III and TACE in the array of preclinical animal models of CMT neuropathies we have generated and characterized over the years. Further we investigated whether NRG1 type III cooperates with components of the extracellular matrix and of the cytoskeleton to regulate myelination.

Our results indicate that in vitro and in vivo modulation of NRG1 type III levels is effective in modulating myelination in hyper- and hypomyelinating neuropathies. We also have evidences suggesting that the extracellular matrix and the cytoskeleton modulate and integrate signals from NRG1 to regulate myelination. Further, the use of TACE inhibitors or activators can effectively control myelination in vitro in a Schwann cell neuronal coculture system. Preclinical trials are ongoing to validate our results in preclinical animal models of hypo and hyper-myelinating neuropathies.

With these studies we provide treatment prospects for subgroups of rare hereditary neuropathies and proof of principle that unifying strategies can be identified for rare diseases that in aggregate are common.

31.5 Kb involving the last five exons of the gene in the James D. Watson’s genome is not associated with a thrombocytopenic phenotype (3).

Most of patients described so far had moderate thrombocytopenia (mean platelet count 47 x109/L) and mild bleeding tendency. In contrast to the majority of inherited thrombocytopenias, which are characterized by large platelets, mean platelet volume was normal or slightly reduced. Peripheral blood film examination, in vitro platelet aggregation and flow cytometry of platelet GPs did not show consistent defects. Bone marrow examination and serum thrombopoietin levels suggested that thrombocytopenia is derived from dysmegakaryopoiesis, since many small and dystrophic megakaryocytes, often with hypolobulated nuclei, were observed.

Interestingly, the prevalence of acute leukemia among patients with this disorder was more than 30 time higher than in normal population, raising the suspicion that mutations in the ANKRD26 5’UTR expose to the risk of hematological malignancies (4). This suspicion is increased still further by the identification of large amounts of Particulate Cytoplasmic Structures (PaCSs) in platelets and megakaryocytes of patients with ANKRD26-RT (5). These recently identified cell structures, consisting of polyubiquitinated proteins and proteasome, have been observed so far in a number of solid cancers, in preneoplastic gastric lesions and in the neutrophils of Shwachman-Diamond syndrome, a genetic disease with neutropenia and increased leukemia risk.

Based on the findings reported above, further study of ANKRD26-RT promises not only to improve knowledge of inherited thrombocytopenias, but also to clarify the functional significance of PaCSs and the role of ANKRD26 in oncogenesis.

References (1) Johnson HJ et al. Exp Hematol 2009;37:901-8.

(2) Punzo F et al. J Thromb Haemost 2010;8:2085-7.

(3) Pippucci T et al. Am J Hum Genet 2011;88:115-20.

(4) Noris P et al. Blood 2011;117:6673-80.

(5) Necchi V et al. Thromb Haemost 2012; 109(2) [Epub ahead of print]

BLOOD DISORDERS: FROM GENETICS TO GENETIC THERAPIES Talk 28 MUTATIONS IN THE 5’UTR OF ANKRD26 RESULT IN A “NEW” FORM OF INHERITED THROMBOCYTOPENIA THAT PREDISPOSES TO LEUKEMIA AND IS CHARACTERIZED BY THE PRESENCE IN PLATELETS AND MEGAKARYOCYTES OF A “NEW” CELL STRUCTURE

Talk 29

Carlo L. Balduini (1), Silverio Perrotta (2), Anna Savoia (3), Marco Seri (4)

HEPCIDIN AT THE CROSSROAD BETWEEN HEMOCHROMATOSIS AND GENETIC IRON DEFICIENCY

(1) Medicina Interna, Fondazione IRCCS Policlinico San MatteoUniversità degli Studi di Pavia, Pavia, Italy (2) Dipartimento di Pediatria, Seconda Università di Napoli, Napoli, Italy (3) Genetica Medica, Dipartimento di Scienze Mediche e Chirurgiche, Università degli Studi di Bologna-Policlinico S.Orsola-Malpighi, Bologna, Italy (4) Dipartimento di Scienze mediche, chirurgiche e della salute, Università di Trieste-IRCCS Burlo Garofolo, Trieste, Italy

Clara Camaschella, Antonella Nai, Marco Rausa, Alessia Pagani, Laura Silvestri Università Vita-Salute and IRCCS San Raffaele, Milan, Italy Genetic studies of hemochromatosis have contributed to identify the liver peptide hormone hepcidin as the key regulator of systemic iron homeostasis. Binding to and internalizing ferroportin, the sole cellular iron exporter, hepcidin regulates iron release from enterocytes and macrophages to plasma. In vitro studies and mice models have identified the IL6-STAT3 signaling as the pathway that increases hepcidin transcription in inflammation and the BMP6-SMAD signaling as the iron responsive pathway. The latter feedback mechanism that limits excess iron is deficient in hemochromatosis and in iron loading anemias, as exemplified by beta-thalassemia. Mutations of hepcidin, the BMP coreceptor hemojuvelin, HFE and TFR2 cause hemochromatosis of different severity, correlated to the degree of inability to increase hepcidin. Hepcidin transcription is suppressed in all conditions that require iron, such as iron deficiency, hypoxia and erythropoiesis expansion. Hepcidin suppression is mediated by the “erythroid regulator”, whose nature remains elusive. The serine protease matriptase-2 encoded by TMPRSS6 is the only hepcidin inhibitor known in vivo. TMPRSS6 inactivation in humans and mice causes iron refractory iron deficient anemia (IRIDA), since hepcidin excess blocks intestinal absorption of dietary and pharmacological iron. Membrane hemojuvelin is a substrate of TMPRSS6 and hemojuvelin cleavage accounts for the downregulation of the BMP-SMAD pathway in iron deficiency (Silvestri et al, Cell Met 2008;8:502-11), a mechanism disrupted in IRIDA (Silvestri et al, Blood 2009,113:5605-8) TMPRSS6 haploinsufficiency in mice predisposes to iron deficiency (Nai et al, Blood 2010,116:851-2). In humans GWAS have shown that TMPRSS6 genetic variants are associated with erythrocytes traits and iron parameters. We observed that the minor allele of the common TMPRSS6 rs855791, found associated with low MCV and MCH, induces a higher hepcidin transcription in an in vitro assay and associates with high hepcidin levels in a large study of normal individuals (Nai et al, Blood 2011;118:4459-621).

Since TMPRSS6 is the only hepcidin negative regulator known in mammals we reasoned that deletion of TMPRSS6 would be of bene-

Thrombocytopenia 2 (THC2) is an autosomal dominant form of thrombocytopenia that, until recently, had been described in only 2 families: one in Italy and the other in North America. Linkage studies mapped the genetic locus to a ~ 8 Mb interval on chromosome 10p11-12, and mutations in three different genes were reported for this locus. In 2003, an aminoacid E167D substitution in the protein encoded by the MASTL gene was considered causative of the disorder in the North American family, and a transient knockdown of MASTL in zebrafish resulted in reduction of circulating thrombocytes (1). Nevertheless, no other case of THC2 has been subsequently found to have mutations in the same gene. More recently, an ACBD5 missense change was reported as possibly disease-causing in the original Italian family (2). Finally, in this last family, as well as in 8 additional unrelated pedigrees without alterations in MASTL, several mutations in a specific sequence of the ANKRD26 5’UTR (from c.-134 to c.-113) were described (3). After this report, 12 different noncoding nucleotide changes in the 5’UTR of ANKRD26 were identified in 21 families out of a cohort of 210 thrombocytopenic pedigrees.

Thus, ANKRD26-related thrombocytopenia (ANKRD26-RT) is one of the most frequent forms of inherited thrombocytopenia (4). Current genetic data strongly argue in favor of THC2 as a disorder due to specific alterations of ANKRD26, and the hypothesis that THC2 is a genetically heterogeneous should be supported by testing the affected members of the MASTL-mutated North American family for 5’UTR ANKRD26 mutations.

The mechanism by which ANKRD26 mutations lead to the disease is unknown, although Luciferase reporter assays suggested that they may enhance expression of gene (3). This hypothesis is consistent with the observation that mice with partial inactivation of Ankrd26 are not thrombocytopenic and that a heterozygous deletion of about

21

PRESENTAZIONI ORALI

fit to both hemochromatosis and beta-thalassemia, the latter being characterized by low hepcidin despite iron overload, because of the dominant negative effect of the expanded erythropoiesis. Genetic loss of Tmprss6, increasing hepcidin expression, improves TfR2hemochromatosis in mice and ameliorates the phenotype of Hbbth3/+, a murine model of thalassemia intermedia (Nai et al, Blood 2012,119:5021-9). Along these lines recent preclinical studies have shown the potential of RNAi targeting Tmprss6 for treatment of low-hepcidin conditions.

Talk 31 GENE THERAPY FOR NON-LETHAL DISORDERS: THE PARADIGM OF BETA-THALASSEMIA Giuliana Ferrari San Raffaele-Telethon Institute for Gene Therapy (HSR-TIGET), San Raffaele Scientific Institute and “Vita-Salute” San Raffaele University Medical School, Milan, Italy

Talk 30

Beta-thalassemia (ß-thal) is a severe congenital anemia caused by reduced or absent β globin chain production of the adult hemoglobin tetramer (α2β2, HbA). It represents the most common autosomal recessive syndrome to cause a major health problem worldwide. Its global estimated annual birth incidence is 40.000/year and it occurs at a high frequency in a line stretching from Mediterranean littoral to Middle East and Southern Asia countries. More than 200 mutations leading to the disease have been described, affecting all the steps related to the expression of the b-globin gene.

Profound anemia is the most frequent and early clinical manifestation of the severe form of ß-thal major. Consequently, children affected and not appropriately treated show the stigmata of chronic hemolysis, the profound local and systemic effects of a rapid expansion of erythroid bone marrow mass and the organ damage due to iron overload.

Treatment of ß-thal is essentially supportive. Patients require a lifelong transfusion regimen combined with iron chelation therapy to reduce hemosiderosis that is ultimately fatal if not continuously treated. Before the introduction of regular transfusion and chelation therapy, ß-thal used to be a rapidly fatal disease. Nevertheless, in the last few decades, the life expectancy of thalassemic patients has progressively increased.

The widespread acceptance of chronic hypertransfusion in association with continuous iron chelation as the therapy of choice for severe ß-thal has altered the typical clinical course for patients in areas of the world with sufficient resources to support adequate healthcare, transforming a lethal disease of infancy into a chronic disease of adulthood. For these reasons, we have a dramatic difference in both survival and life expectancy of patients from regions with limited resources compared to those from wealthier countries.

At present, the only curative approach is represented by allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT), which, however, is limited by HLA compatibility and toxicity due to graft versus host disease, graft rejection and immunosuppressive regimens required.

Medical management and HSCT are both therapeutic options that could improve the quality of life and survival of thalassemic patients.

Nevertheless, they are both burden by complications and limitations, outlining the need for testing innovative curative approaches.

For these reasons ß-thal has long been studied as a candidate for treatment by gene therapy, i.e. the autologous transplantation of genetically-modified hematopoietic stem cells. The development of HIV-derived lentiviral vectors (LV) and the optimization of hematopoietic stem cells transduction have provided significant contributions to this field, leading to the application of LVs expressing the human ß-globin gene in preclinical models and to the treatment of the first patient in France.

In this presentation, the major contributions from HSR-TIGET to the field, from development and production of ß-globin vectors to disease correction in preclinical models, as well as relevant issues related to the future clinical translation, like the choice of the source of hematopoietic stem cells and the demonstration of safety, will be discussed.

RNA-BASED THERAPEUTIC APPROACHES FOR BLOOD COAGULATION FACTOR DEFICIENCIES CAUSED BY SPLICING MUTATIONS Mirko Pinotti, Franco Pagani Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Ferrara, Ferrara, Italy Intervention at the pre-mRNA splicing level represents a promising therapeutic approach for genetic diseases as it permits restoration of gene expression while maintaining gene regulation in physiological tissues, and overcomes limitations related to vector-mediated delivery of large genes. Increasing attention has been given to the U1 small nuclear RNA (U1snRNA) that, in the earliest splicing step, mediates recognition of the donor splice site (5’ss) by the ribonucleoprotein U1snRNP. Studies in various cellular models of demonstrated that engineered U1snRNAs can rescue splicing impaired by 5’ss mutations.

We explored the modified U1snRNA in severe coagulation factor VII (FVII) and IX (FIX, hemophilia B) deficiencies, in which splicing mutations are relatively frequent (15%). FVII/FIX deficiencies may lead to life-threatening bleeding and their treatment still presents several drawbacks. The U1snRNA-mediated in these diseases approach can be particularly beneficial since even modest increase of functional protein levels would result in improvement of clinical phenotypes.

As first model we chose the FVII deficiency caused by the c.840+5G>A mutation in the F7 IVS7 5’ss. Studies in cellular models indicated that the modified U1snRNA+5a (U1+5a), which restores complementarity to the mutated 5’ss, efficiently rescued FVII splicing and pro-coagulant function (8-10% of FVIIwt). To assess the U1+5a efficacy in vivo we created a novel mouse model of human FVII (hFVII) deficiency by liver-restricted expression, either transient (by non-viral vectors) or prolonged (by adeno-associated viral [AAV] vectors), of the mutated splicing-competent hFVII minigene (FVII+5A) in mice. In both experimental systems, hFVII expression was detectable in mice only upon co- injection of vectors for the U1+5a. In particular, correct hFVII transcripts were detectable in hepatocytes. Transient U1+5a co-expression resulted in hepatocyte localization of hFVII and secreted levels up to 367 ng/ml (~17% of wt-hFVII). Prolonged and vector dose-dependent hFVII levels in plasma (from undetectable up to 30 ng/ml) was demonstrated via delivery of AAV-FVII+5A and AAV-U1+5a viral vectors.

At variance from FVII deficiency, Hemophilia B provided us with several F9 splicing mutations potentially approachable with U1snRNAs. By minigene splicing assays we established the disease-causing mechanism of 25 mutations at 5’ss, which resulted in exon skipping or cryptic 5’ss activation. U1snRNAs with increased complementarity to mutated 5’ss efficiently corrected several 5’ss defects.

Intriguingly, they also corrected some acceptor splice site (3’ss) mutations. Through splicing-competent cDNA constructs we also demonstrated restoration of secreted FIX levels with coagulant activity (from undetectable to to 100%).

To improve specificity for F9 gene, we designed a panel of U1snRNAs targeting non-conserved intronic sequences downstream of the 5’ss (Exon Specific U1snRNA, ExSpeU1). We found a gradient of rescue efficacy, which decreased with the 5’ss distance. Intriguingly, the best ExSpeU1 (ExSpeU1-FIX+9) remarkably rescued FIX biosynthesis and function (~90%) impaired by different 5’ss or 3’ss mutations.

CONCLUSIONS: For the first time, we demonstrated that a unique ExSpeU1 can restore gene expression impaired by different splicing mutants, and the increase of FVII/FIX levels, if achieved in patients, would be far beyond the therapeutic threshold. Moreover, we provided the first in vivo proof-of-principle of the therapeutic potential of the U1snRNA-mediated correction of splicing mutations, a frequent cause of all human genetic diseases.

Talk 32 GENETIC THERAPY FOR HEMOGLOBINOPATHIES: FROM THE BENCH TO THE BEDSIDE Punam Malik Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, Cincinnati, OH, USA Sickle cell disease (SCD) and β-thalassemias are common monogenic blood disorders with potentially devastating consequences. In SCD, the chronic episodic vascular occlusions cause cumulative damage to organs and tissues and have an enormous impact on patient’s quality of life, on the healthcare system, and on the lifespan of individuals with SCD. In β-thalassemia, patients are dependent on chronic transfusions for a lifetime. The only current curative therapy is an allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HCT)

22

PRESENTAZIONI ORALI

from a matched sibling donor, but is restricted by the availability of matched related donors and has potential complications such as graft versus host disease, graft rejection, and late effects, such as sterility. Gene therapy of autologous hematopoietic stem cells followed by transplant could result in a one-time cure, avoid adverse immunological consequences and not be limited by availability of donors; it may also be feasible with a reduced-intensity chemotherapy conditioning regimen, thereby lowering toxicity. We show correction of SCD and β-thalassemia mouse models. Based upon our preliminary data, we propose that gene transfer of gamma-globin lentivirus vector into CD34+ cells of subjects with SCD and β-thalassemia followed by autologous transplant following chemotherapy will be safe, feasibility and show potential efficacy. The eventual goal of gene transfer is to offer a patient a one-time ex vivo correction of sickle or thalassemia hematopoietic stem cells and their autologous transplant and circumvent the immunological consequences such as graft rejection and graft versus host disease associated with allogeneic transplant. We are proposing a phase I/II pilot gene transfer trial that will study the safety, feasibility and efficacy of a) obtaining sufficient CD34+ cells via a bone marrow harvest in patients with SCD and via apheresis in patients with β-thalassemia; b) ex-vivo gene transfer of the γ-globin lentivirus vector into the sickle or thalassemia CD34+ cells followed by c) chemotherapy conditioning and d) engraftment and efficacy of autologous gene modified CD34+ cells, when transplanted back into subjects with SCD and β-thalassemia. Preclinical data on HSC correction in mouse and human models of SCD and thalassemia and the design of the two gene therapy trials will be presented.

23

poster

.

Indice per Categoria

IstItUtI teLetHoN ABstrACt

ABstrACt

teLetHoN INstItUte oF GeNetICs AND MeDICINe (tIGeM) N.

N.

N.

N.

N.

N.

N.

1

2

3

4

5

6

7

N.

13

rUoLo DeLLA proteINA oFD1 NeLLA DeGrADAZIoNe A CArICo DeL proteAsoMA FRANCO BRUNELLA

terApIe CoN pICCoLe MoLeCoLe per Le MALAttIe LIsosoMIALI PARENTI GIANCARLO

N.

14

DeFINIZIoNe DeLLe BAsI MoLeCoLArI e CeLLULArI DeLLA DIspLAsIA spoNDILoepIFIsIArIA tArDA e

MoDULAZIoNe DeLLA CLeArANCe CeLLULAre NeLLe MALAttIe DA ACCUMULo LIsosoMIALe BALLABIO ANDREA

IDeNtIFICAZIoNe DI tArGet per L'INterVeNto FArMACoLoGICo DE MATTEIS MARIA ANTONIETTA

MoDIFICA DI eNZIMI LIsosoMIALI ALLo sCopo DI MIGLIorArNe LA seCreZIoNe eD IL trAsFerIMeNto AL sIsteMA NerVoso CeNtrALe FRALDI ALESSANDRO

sAN rAFFAeLe teLetHoN INstItUte For GeNe tHerApY (Hsr-tIGet)

terApIA GeNICA per Le MALAttIe CoNGeNIte DeL MetABoLIsMo epAtICo BRUNETTI PIERRI NICOLA

N.

15

LA perDItA DeI MeCCANIsMI DI toLLerANZA CeNtrALe e perIFerICA È respoNsABILe DeLLe MANIFestAZIoNI AUtoIMMUNe

LA BIoLoGIA CoMpUtAZIoNALe per Lo stUDIo DeLLe MALAttIe GeNetICHe: IDeNtIFICAZIoNe DeLLA FUNZIoNe GeNICA e DeL MeCCANIsMo DI AZIoNe DeI FArMACI DI BERNARDO DIEGO

NeLL’ADA-sCID AIUTI ALESSANDRO N.

16

trIAL CLINICo DI terApIA GeNICA CoN CeLLULe eMAtopoIetICHe stAMINALI per IL trAttAMeNto DeLLA sINDroMe DI WIsKott-

pAtoGeNesI DeLLA MALAttIA DI WILsoN: I MeCCANIsMI MoLeCoLArI DeLLA VeICoLAZIoNe DI Atp7B NeL MANteNIMeNto DeLL'oMeostAsI DI rAMe POLISHCHUK ROMAN

ALDrICH AIUTI ALESSANDRO N.

17

MeCCANIsMI CeLLULArI e MoLeCoLArI ALLA BAse DeLL'AUtoIMMUNItÀ NeLLA sINDroMe DI WIsKott ALDrICH

Verso LA sperIMeNtAZIoNe CLINICA DI terApIe GeNICHe AAV-MeDIAte DIrette ALLA retINA e AL FeGAto AURICCHIO ALBERTO

VILLA ANNA N.

18

rICostItUZIoNe tIMICA e perIFerICA NeL MoDeLLo MUrINo DeLLA sINDroMe DI oMeNN

N.

N.

N.

N.

N.

8

9

10

11

12

eFFICACIA e sICUreZZA DI repressorI trAsCrIZIoNALI UtILIZZAtI CoMe AGeNtI terApeUtICI per IL trAttAMeNto DeLLA retINIte pIGMeNtosA AUtosoMICA DoMINANte (ADrp) SURACE ENRICO

Dopo trAttAMeNto CoN ANtI-CD3e VILLA ANNA N.

19

terApIA GeNICA e CeLLULAre per LA sINDroMe IpeX e sIMILI pAtoLoGIe (IpeXLIKe) CoN IMMUNoDIsreGoLAZIoNe FoXp3INDIpeNDeNte

IDeNtIFICAZIoNe DI NetWorK GeNICI reGoLAtI DA MICrorNA NeLLA retINA UMANA BANFI SANDRO

BACCHETTA ROSA N.

20

protoCoLLo CLINICo DI FAse I/II DI terApIA GeNICA CoN CeLLULe stAMINALI

sUperAre I LIMItI DeL trAsFerIMeNto ALLA retINA DI GeNI DI GrANDI DIMeNsIoNI per LA CUrA DI MALAttIe ereDItArIe A CArICo DeI FotoreCettorI AURICCHIO ALBERTO

eMAtopoIetICHe per IL trAttAMeNto DeLLA LeUCoDIstroFIA MetACroMAtICA BIFFI ALESSANDRA N.

sVILUppo DI UN ApproCCIo rAZIoNALe ALLA CorreZIoNe DeL DIFetto DI trAFFICo DI D508-CFtr LUINI ALBERTO

21

terApIA GeNICA CoN CeLLULe stAMINALI eMAtopoIetICHe per Le MALAttIe LIsosoMIALI: LA CoMpreNsIoNe DeI MeCCANIsMI DI tUrNoVer CeLLULAre NeL CerVeLLo AFFetto per ottIMIZZAre L'eFFICACIA terApeUtICA

DeFINIZIoNe DeI MeCCANIsMI MoLeCoLArI ALLA BAse DeLLe DIsFUNZIoNI DeLLA VIA eNDoCItICA INDotte DA MUtAZIoNI DeI GeNI oCrL e CLC5 ALLo sCopo DI IDeNtIFICAre CorrettorI FArMACoLoGICI per LA sINDroMe DI LoWe e per LA MALAttIA DI DeNt DE MATTEIS MARIA ANTONIETTA

BIFFI ALESSANDRA N.

22

ANALIsI DeI sItI DI INteGrAZIoNe NeLLA sperIMeNtAZIoNe CLINICA per LA LeUCoDIstroFIA MetACroMAtICA MONTINI EUGENIO

26

N.

23

terApIA CeLLULAre/GeNICA DeLLe LeUCoDIstroFIe

DULBeCCo teLetHoN INstItUte (DtI)

DIrettA AL sIsteMA NerVoso CeNtrALe

MALAttIe NeUroMUsCoLArI

GRITTI ANGELA N.

24

stUDIo DeLLe DINAMICHe CLoNALI DeLLe CeLLULe stAMINALI eMAtopoIetICHe e

N.

36

rUoLo DeLL'AUtoFAGIA NeLLe MALAttIe MUsCoLArI CECCONI FRANCESCO

N.

37

DeFINIZIoNe DeI MeCCANIsMI MoLeCoLArI DeLLA perDItA DI MAssA MUsCoLAre. IDeNtIFICAZIoNe DI NUoVI tArGet terApeUtICI per BLoCCAre LA DeGeNerAZIoNe MUsCoLAre SANDRI MARCO

N.

38

rUoLo DeLL'epIGeNoMA e DeL GeNoMA NoNCoDIFICANte NeLLA DIstroFIA MUsCoLAre DI DUCHeNNe ORLANDO VALERIO

N.

39

FsHD MUsCULAr DYstropHY reGIoN GeNe 1 (FrG1) LeGA LA IstoNe MetILtrANsFerAsI sUV4-20H1 e INIBIsCe IL DIFFereNZIAMeNto MUsCoLAre GABELLINI DAVIDE

N.

40

ANALIsI DeLLe BAsI MoLeCoLArI DeLLe MIopAtIe CorreLAte A sepN1 ZITO ESTER

N.

41

LA DIsFUNZIoNe DI CICLoFILLINA A e LA CoNseGUeNte DestABILIZZAZIoNe DeI CoMpLessI HNrNp ACCoMUNA Le pAtoLoGIe DA soD1 e tDp-43 NeLLA sCLerosI LAterALe AMIotroFICA BONETTO VALENTINA

N.

42

rUoLo DeI seGNALI INtrACeLLULArI AttIVAtI NeL MUsCoLo DALLA CHINAsI AKt NeLLA pAtoGeNesI DeLLA AtroFIA MUsCoLAre spINALe e BULBAre PENNUTO MARIA

N.

43

rUoLo DeI FosFoLIpIDI e DeL trAFFICo DI MeMBrANA NeLLA pAtoGeNesI DeLLe NeUropAtIe DI CHArCot-MArIe-tootH BOLINO ALESSANDRA

MoDeLLI DI eMAtopoIesI UMANA MeDIANte L'ANALIsI DeLLe INteGrAZIoNI VIrALI AIUTI ALESSANDRO N.

25

rIsULtAtI preLIMINArI DI sICUreZZA eD eFFICACIA DeLLA MoBILIZZAZIoNe DI CeLLULe CD34+ Dopo trAttAMeNto CoN pLerIXAFor IN pAZIeNtI tALAsseMICI ADULtI: VALUtAZIoNe DI UNA NUoVA FoNte DI CeLLULe stAMINALI eMAtopoIetICHe per LA terApIA GeNICA DeLLA BetA-tALAsseMIA FERRARI GIULIANA

N.

26

VALUtAZIoNe preCLINICA DeLLA BIosICUreZZA DI proDottI MeDICINALI BAsAtI sU terApIA GeNICA: stUDIo DI tUMorIGeNICItÀ e tossICItÀ NeLLA terApIA GeNICA per LA BetA-tALAsseMIA FERRARI GIULIANA

N.

27

MIGLIorANDo LA BIosICUreZZA DeL trAsFerIMeNto GeNICo CoN VettorI LeNtIVIrALI MONTINI EUGENIO

N.

28

NUoVe pIAttAForMe per LA terApIA GeNICA IN CeLLULe stAMINALI eMAtopoIetICHe NALDINI LUIGI

N.

29

UtILIZZo DI NUCLeAsI ArtIFICIALI per LA CorreZIoNe GeNICA MIrAtA DI CeLLULe stAMINALI eMAtopoIetICHe e DI CeLLULe stAMINALI pLIrIpoteNtI INDotte DerIVAte DA pAZIeNtI sCID-X1 NALDINI LUIGI

N.

30

LA terApIA GeNICA DIrettA AL FeGAto CoN VettorI LeNtIVIrALI e trANsGeNI IperAttIVI È UN trAttAMeNto sICUro eD eFFICACe per L’eMoFILIA B IN MoDeLLI MUrINI e CANINI

MALAttIe NeUroLoGICHe

NALDINI LUIGI N.

31

INDUZIoNe DI toLLerANZA AG-speCIFICA

N.

44

MeCCANIsMI CeLLULArI DI DIsFUNZIoNe sINAptICA NeLLe MALAttIe DA prIoNI FAMILIArI CHIESA ROBERTO

N.

45

ANALIsI DeLLe ALterAZIoNI NeUroNALI AssoCIAte A MUtAZIoNI NeL GeNe tM4sF2 e reCUpero FUNZIoNALe MeDIANte terApIe GeNetICHe e FArMACoLoGICHe PASSAFARO MARIA PIA

N.

46

ANALIsI DeL rUoLo DI rAB39B NeL rItArDo MeNtALe AssoCIAto AL CroMosoMA X: reCettorI AMpA CoMe possIBILI tArGet terApeUtICI D'ADAMO PATRIZIA

AttrAVerso IL trAsFerIMeNto GeNICo NeL pAreNCHIMA epAtICo: MeCCANIsMo e poteNZIALI AppLICAZIoNI RONCAROLO MARIA GRAZIA N.

32

strAteGIe DI terApIA CeLLULAre per INDUZIoNe DeLLA toLLerANZA IMMUNoLoGICA GREGORI SILVIA

N.

33

terApIA GeNICA CoN CeLLULe stAMINALI eMAtopoIetICHe per LA CUrA DeLLA MUCopoLIsACCArIDosI DI tIpo I BIFFI ALESSANDRA

N.

34

terApIA GeNICA DeLLA MALAttIA GrANULoMAtosA

ALtre MALAttIe GeNetICHe

CroNICA CoN VettorI LeNtIVIrALI reGoLAtI AIUTI ALESSANDRO N.

35

N.

terApIA GeNICA CoN CeLLULe stAMINALI eMAtopoIetICHe per LA CUrA DeLLA LeUCoDIstroFIA A CeLLULe GLoBoIDI BIFFI ALESSANDRA

27

47

IL rIMoDeLLAMeNto DeLLe Creste MItoCoNDrIALI CoNtroLLAto DA opA1: DAI MoDeLLI ALLe BAsI per LA terApIA DeLL’AtroFIA ottICA DoMINANte SCORRANO LUCA

N.

48

stUDI INteGrAtI IN sILICo, IN VItro eD IN VIVo Verso LA proGettAZIoNe DI poteNZIALI AGeNtI terApeUtICI per LA retINIte pIGMeNtosA FANELLI FRANCESCA

N.

52

CoMe LA MANCANZA DeLL’ANtIossIDANte AptoGLoBINA MoDIFICA IL MUsCoLo sCHeLetrICo e LA sUA rIspostA ALLo stress MetABoLICo MAFFEI MARGHERITA

N.

49

BAsI MoLeCoLArI DeLLA poLIeNDoCrINopAtIA AUtoIMMUNe DI tIpo I: stUDI FUNZIoNALI e strUttUrALI sUL DoMINIo pHD FINGer DeLLA proteINA AIre MUSCO GIOVANNA

N.

53

MoDeLLI CeLLULArI eD ANIMALI per L'IDeNtIFICAZIoNe DeI MeCCANIsMI DI pAtoGeNesI IN MALAttIe CIstICHe reNALI AssoCIAte A MUtAZIoNI DI UroMoDULINA RAMPOLDI LUCA

N.

50

CoNtroLLo DeL MetABoLIsMo DA pArte DeL LIsosoMA SETTEMBRE CARMINE

N.

54

N.

51

VALUtAZIoNe DI UN ApproCCIo DI terApIA GeNICA CoN CeLLULe stAMINALI per IL trAttAMeNto DeLLA sINDroMe DI HUrLer SERAFINI MARTA

Verso LA CoMpreNsIoNe DeLLA FUNZIoNe DI poLICIstINA-1 e L'IDeNtIFICAZIoNe DI tArGet terApeUtICI speCIFICI per ADpKD BOLETTA ALESSANDRA

N.

55

UN MeCCANIsMo DI MeMorIA epIGeNetICA AD rNA CORONA DAVIDE

proGettI DI rICerCA teLetHoN ABstrACt

ABstrACt

MALAttIe NeUroMUsCoLArI

N.

63

MoDIFICAZIoNe GeNICA DI CeLLULe stAMINALI DIstroFICHe ALLo sCopo DI

N.

N.

N.

N.

N.

N.

N.

56

57

58

59

60

61

62

trApIANto AUtoLoGo NeLLA DIstroFIA

UN NUoVo BersAGLIo MoLeCoLAre per LA terApIA DeL DANNo MUsCoLAre e DeLLe MIopAtIe MINCHIOTTI GABRIELLA

MUsCULAre DI DUCHeNNe TORRENTE YVAN N.

64

terApIA GeNICA sperIMeNtALe DeLLA

rUoLo DeLLA CICLINA D3 NeLLA reGoLAZIoNe DeLL'AttIVItÀ DeLLe CeLLULe sAteLLItI DUrANte LA rIGeNerAZIoNe MUsCoLAre CARUSO MAURIZIA

DIstroFIA MUsCoLAre DI DUCHeNNe CoN

IL CoNtroLLo INtrA-CeLLULAre DeL seGNALe DeLL'orMoNe tIroIDeo NeLLe CeLLULe stAMINALI DI MUsCoLo e NeLLA DIstroFIA MUsCoLAre DI DUCHeNNe SALVATORE DOMENICO

DALLA MANCANZA DI DIstroFINA

FAttorI trAsCrIZIoNALI sINtetICI CHe AUMeNtANo I LIVeLLI DI UtroFINA, UNA proteINA CHe proteGGe DAI DANNI CAUsAtI MATTEI ELISABETTA N.

65

terApIA GeNICA DeLLA DIstroFIA MUsCoLAre DI DUCHeNNe BAsAtA sULL'Uso DI rNA: rUoLo DeI MICrorNA NeLLA pAtoGeNesI e NeLLA terApIA DeLLA DMD

BAsI MoLeCoLArI DeLL'AZIoNe terApeUtICA DeL NItroFLUrBIproFeNe (HCt1026), UN ANtI-INFIAMMAtorIo CHe rILAsCIA NItrossIDo, NeLLA DIstroFIA MUsCoLAre: ANALIsI DeLLA srUttUrA e FUNZIoNALItÀ DeI MItoCoNDrI NeLLA rIGeNerAZIoNe e sVILUppo MUsCoLAre CLEMENTI EMILIO

BOZZONI IRENE N.

66

MIsUre DI oUtCoMe NeLLA DIstroFIA MUsCoLAre DI DUCHeNNe: VALIDAZIoNe DeL peDIAtrIC QUALItY oF LIFe INVeNtorY tM NeUroMUsCULAr MoDULe NeLLA popoLAZIoNe ItALIANA e CorreLAZIoNI CoN ALtre VALUtAZIoNI FUNZIoNALI

IMMortALIZZAZIoNe reVersIBILe e trAsDUZIoNe DI MesoANGIoBLAstI DMD CoN UN CroMosoMA ArtIFICIALe esprIMeNte LA DIstroFINA per LA terApIA CeLLULAre DeLLA DIstroFIA MUsCoLAre COSSU GIULIO

MESSINA SONIA N.

67

VALUtAZIoNe DeLLA FUNZIoNe DeGLI ArtI sUperIorI IN pAZIeNtI NoN DeAMBULANtI AFFettI DA DIstroFIA MUsCoLAre DI DUCHeNNe PANE MARIKA

ALLo-trApIANto DI MesoANGIoBLAstI DA DoNAtore HLA-IDeNtICo per LA terApIA CeLLULAre DeLLA DIstroFIA MUsCoLAre DI DUCHeNNe COSSU GIULIO

N.

68

LA FAMIGLIA DeI pAZIeNtI AFFettI DA DIstroFIe MUsCoLArI: CArICo, rete soCIALe e sUpporto proFessIoNALe MAGLIANO LORENZA

VALUtAZIoNe pre-CLINICA DI NANopArtICeLLe BIoCoMpAtIBILI CoMe sIsteMA DI trAsporto DI oLIGorIBoNUCLeotIDI ANtIseNso per INDUrre IL rIprIstINo DI DIstroFINA trAMIte “eXoN sKIppING” FERLINI ALESSANDRA

N.

69

VALUtAZIoNe DI tUrNoVer osseo, MetABoLIsMo osseo, DeNsItÀ osseA e FrAttUre NeI BAMBINI AFFettI DA DIstroFIA MUsCoLAre DI DUCHeNNe, e DeI possIBILI eFFettI DI UNA terApIA steroIDeA CroNICA BIANCHI MARIA LUISA

28

N.

70

sVILUppo DeL reGIstro NAZIoNALe DeLL'FsHD TUPLER ROSSELLA GINEVRA

N.

71

ANALIsI DeLLA FUNZIoNe MItoCoNDrIALe NeLLe DIstroFIe MUsCoLArI DA DeFICIt DI CALpAINA-3 FIORILLO CHIARA

N.

72

rUoLo DeLL'ADeNosINA trIFosFAto (e-Atp) e DeI reCettorI pUrINerGICI NeLLA pAtoGeNesI DeLLA DIstroFIA MUsCoLAre DA DeFICIt DI ALFA-sArCoGLICANo (LGMD2D) BRUNO CLAUDIO

N.

73

reCUpero FArMACoLoGICo DI proteINe MAL rIpIeGAte: ApproCCI INNoVAtIVI per LA CUrA DI ALCUNe pAtoLoGIe MUsCoLArI SANDONà DORIANNA

N.

74

LA MIopALLADINA NeLLA CArDIoMopAtIA DILAtAtIVA e NeLLA DIstroFIA MUsCoLAre DeI CINGoLI BANG MARIE-LOUISE

N.

75

LA DIstroFIA MUsCoLAre DeI CINGoLI 2H È CAUsAtA DA UN proCesso AUtoFAGICo DIFettIVo? FIMIA GIAN MARIA

N.

76

IDeNtIFICAZIoNe DeL GeNe CHe DeterMINA LA DIstroFIA MUsCoLAre DeI CINGoLI DI tIpo 1H PETRUZZELLA VITTORIA

N.

77

DIAGNosI GeNetICA DeI pAZIeNtI ItALIANI CoN DIstroFIA MUsCoLAre DeI CINGoLI BAsAtA sU seQUeNZIAMeNto DI NUoVA GeNerAZIoNe (NGs) NIGRO VINCENZO

N.

78

rete CLINICA e DI LABorAtorIo DeLLe DIstroFIe DeI CINGoLI per stABILIre UN reGIstro NAZIoNALe COMI GIACOMO PIETRO

N.

79

sVILUppo DI UN DAtA BAse sULLe DIstroFIe MUsCoLArI CoNGeNIte NeL CoNtesto DI UN NetWorK CoLLABorAtIVo NAZIoNALe per rICostrUIre eLeMeNtI DI storIA NAtUrALe DI QUeste MALAttIe MERCURI EUGENIO

N.

80

rICerCA DI NUoVI FArMACI per Le DIstroGLICANopAtIe trAMIte UNo sCreeNING BAsAto sULL'AttIVAZIoNe DeL proMotore DeL GeNe LArGe GAZZERRO ELISABETTA

N.

81

rUoLo DI JAB1 NeL CoNtroLLo DeLLo sVILUppo e rIGeNerAZIoNe DeL NerVo perIFerICo: IMpLICAZIoNe NeLLA pAtoGeNesI DeLLe NeUropAtIe ereDItArIe AssoCIAte ALLA DIstroFIA MUsCoLAre CoNGeNItA (MDC1A) PREVITALI STEFANO CARLO

N.

82

ApproCCI terApeUtICI GUIDAtI DALLA strUttUrA proteICA per LA DIstroFIA MUsCoLAre oCULoFArINGeA e pAtoLoGIe CorreLAte FIUMARA FERDINANDO

N.

83

CHAperoNe FArMACoLoGICI per LA CUrA DI MALAttIe GeNetICHe: sVILUppo DI NUoVI FArMACI e INDIVIDUAZIoNe DI BersAGLI CUBELLIS MARIA VITTORIA

29

N.

84

eFFICACIA DeLLA terApIA CoN CHAperoNe FArMACoLoGICI IN AssoCIAZIoNe CoN LA terApIA eNZIMAtICA sostItUtIVA IN pAZIeNtI AFFettI DALLA MALAttIA DI poMpe ANDRIA GENEROSO

N.

85

CArAtterIZZAZIoNe DeLLA MUtAZIoNe r7s DeLLA proteINA HspB3 e DI ALtre DUe NUoVe MUtAZIoNI troVAte IN pAZIeNtI AFFettI DA MIopAtIA CoNGeNItA: CoMpreNsIoNe DeI MeCCANIsMI GeNetICI e MoLeCoLArI CARRA SERENA

N.

86

VALUtAZIoNe DeL rUoLo pAtoGeNetICo DI UNA MUtAZIoNe MIsseNso IN UNA MIopAtIA BeNIGNA AUtosoMICA DoMINANte CoN IperCKeMIA DI BLASI CLAUDIA

N.

87

IDeNtIFICAZIoNe DeL GeNe respoNsABILe DI UNA NUoVA ForMA DI MIopAtIA DIstALe VAZZA GIOVANNI

N.

88

CArAtterIZZAZIoNe CLINICA, MorFoLoGICA e MoLeCoLAre DI pAZIeNtI ItALIANI CoN MIopAtIA CoNGeNItA BRUNO CLAUDIO

N.

89

Verso UNA terApIA MItoCoNDrIALe DeLLe DIstroFIe MUsCoLArI DeL CoLLAGeNe VI BERNARDI PAOLO

N.

90

LA DIetA IpoproteICA per CorreGGere IL DIFetto AUtoFAGICo NeI pAZIeNtI CoN MIopAtIe DA DeFICIt DI CoLLAGeNo tIpo VI MERLINI LUCIANO

N.

91

IL rUoLo DeL seGNALe DI CALCIo NUCLeAre INDotto DAL INosItoLo 1,4,5-trIsFosAFAto NeLLo sVILUppo DeLLA MIopAtIA CoNGeNItA 'CeNtrAL Core' SZABADKAI GYORGY

N.

92

Le CALseQUestrINe NeLL'oMeostAsI DeL CALCIo e Loro poteNZIALe rUoLo IN MIopAtIe sCHeLetrICHe UMANe ereDItArIe PROTASI FELICIANO

N.

93

INterAZIoNe GeNetICA trA IL seGNALe INNesCAto DAL FAttore DI CresCItA INsULINo-sIMILe 1 e GLI ANDroGeNI NeLLA pAtoGeNesI DeLLA AtroFIA MUsCoLAre spINALe e BULBAre PENNUTO MARIA

N.

94

sVILUppo DI UN ApproCCIo terApeUtICo per L'AtroFIA MUsCoLAre spINALe CoN DIstress respIrAtorIo DI tIpo 1 (sMArD1) MeDIAto DA CeLLULe stAMINALI NeUroNALI e MotoNeUroNI DIFFereNZIAtI DA CeLLULe stAMINALI pLUrIpoteNtI INDotte COMI GIACOMO PIETRO

N.

95

ApproCCIo NeUroprotettIVo MeDIAto DA CeLLULe stAMINALI NeUroNALI CoMe strAteGIA terApeUtICA per L’AtroFIA MUsCoLAre spINALe CORTI STEFANIA

N.

96

reGoLAZIoNe DeLLo spLICING ALterNAtIVo DeL GeNe sMN2 DA pArte DI sAM68 e Le sUe IMpLICAZIoNI NeLL’AtroFIA MUsCoLAre spINALe SETTE CLAUDIO

N.

97

ANALIsI DI MIrNoMA e trAsCrIttoMA

N. 109

DeFICIeNZA DeLL'IsoForMA 1 DeL CArrIer MItoCoNDrIALe per L'AspArtAto/GLUtAMMAto: MeCCANIsMI pAtoGeNetICI e ANALIsI MUtAZIoNALe PALMIERI FERDINANDO

N. 110

MItMeD: UN CoNsorZIo MULtICeNtrICo per L'IDeNtIFICAZIoNe e LA CArAtterIZZAZIoNe DI GeNI NUCLeArI respoNsABILI DI MALAttIe MItoCoNDrIALI UMANe ZEVIANI MASSIMO

N. 111

strAteGIe terApeUtICHe per CoMBAttere Le MALAttIe MItoCoNDrIALI ZEVIANI MASSIMO

N. 112

sVILUppo e VALIDAZIoNe DI UNA rete NAZIoNALe per LA CreAZIoNe DeL reGIstro ItALIANo DeLLe MALAttIe MItoCoNDrIALI SICILIANO GABRIELE

N. 113

sBILANCIAMeNto DeI DeossINUCLeotIDI, CoNserVAZIoNe DeL DNA MItoCoNDrIALe e MALAttIe MItoCoNDrIALI BIANCHI VERA

N. 114

BAsI GeNetICHe e terApIA DeL DeFICIt DI CoeNZIMA Q SALVIATI LEONARDO

N. 115

CANALopAtIe DA CLoro ereDItArIe DeL MUsCoLo sCHeLetrICo e DeL reNe: DAL GeNotIpo AL FeNotIpo e NUoVI ApproCCI FArMACoterApeUtICI CONTE CAMERINO DIANA

MUsCoLArI CoMe strUMeNto per L’IDeNtIFICAZIoNe DI BIoMArCAtorI NeLL’AtroFIA MUsCoLAre spINALe TIZIANO FRANCESCO DANILO N.

98

NUoVe MIsUre DI oUtCoMe NeLLA MALAttIA DI CHArCot-MArIe-tootH VITA GIUSEPPE

N.

99

sVILUppo DI UN protoCoLLo strUMeNtALe DI ANALIsI DeL MoVIMeNto per L’ANALIsI MULtItAsKING DeLLe FUNZIoNI LoCoMotorIe NeLLA MALAttIA DI CHArCot-MArIe-tootH NeLL’etÀ eVoLUtIVA e NeLL’ADULto: VALUtAZIoNe DeLL’AFFIDABILItÀ e DeLLA CApACItÀ DI MIsUrAre LA rIspostA AL trAttAMeNto trAMIte stUDIo MULtICeNtrICo FERRARIN MAURIZIO

N. 100

stUDIo MULtICeNtrICo per VALUtAre eFFICACIA e sICUreZZA DI UN protoCoLLo rIABILItAtIVo CostItUIto DA eserCIZI AL treADMILL, stretCHING e DI proprIoCeZIoNe IN pAZIeNtI AFFettI DA NeUropAtIA DI CHArCot-MArIe-tootH tIpo 1A SCHENONE ANGELO

N. 101

rUoLo DeI reCettorI pUrINerGICI NeLLA MIeLINIZZAZIoNe: IMpLICAZIoNI terApeUtICHe per IL trAttAMeNto DeLLA NeUropAtIA perIFerICA CHArCot-MArIetootH 1A BRUZZONE SANTINA

N. 102

INDIVIDUAZIoNe DeLLA perIFerINA CoMe

MALAttIe NeUroLoGICHe

NUoVo INterAttore DI rAB7: IMpLICAZIoNI per LA NeUropAtIA CHArCot-MArIe-tootH DI

N. 116

LeUCoDIstroFIA AUtosoMICA DoMINANte DeLL’etÀ ADULtA: stUDIo trAsLAZIoNALe DeI MeCCANIsMI GeNetICI, MoLeCoLArI e CeLLULArI DI MALAttIA MeDIAtI DALLA proteINA LAMINA B1 e CorreLAZIoNe CoN pArAMetrI CLINICI e NeUrorADIoLoGICI GASPARINI LAURA

N. 117

IDeNtIFICAZIoNe DI NUoVI GeNI-MALAttIA NeLLA pArApLeGIA spAstICA ereDItArIA ORLACCHIO ANTONIO

N. 118

MoDeLLI DI FUNZIoNe e DIsFUNZIoNe DI AtLAstINA DAGA ANDREA

N. 119

CArAterIZZAZIoNe MoLeCoLAre DeI proCessI MetABoLICI CoNtroLLAtI DALLA proteINA seN1/setX e DIFettIVI NeLLe sINDroMI NeUroDeGeNerAtIVe AoA2 e AsL4 LIBERI GIORDANO

N. 120

stUDIo DI NUoVe strAteGIe terApeUtICHe per L'AtAssIA DI FrIeDreICH TESTI ROBERTO

N. 121

IL rUoLo DeL CoMpLesso proteAsICo MItoCoNDrIALe m-AAA NeLLA pAtoGeNesI DeLLe DeGeNerAZIoNI spINoCereBeLLArI TARONI FRANCO

N. 122

AtAssIA spINoCereBeLLAre tIpo 28 (sCA28): MoDeLLI CeLLULArI e ANIMALI per IDeNtIFICAre I MeCCANIsMI pAtoGeNetICI eD I poteNZIALI BersAGLI terApeUtICI BRUSCO ALFREDO

tIpo 2B BUCCI CECILIA N. 103

LAMININe e Loro reCettorI NeLLe NeUropAtIe ereDItArIe FELTRI MARIA LAURA

N. 104

MoDULAZIoNe DeLLA NeUreGULINA-1 per IL trAttAMeNto DI NeUropAtIe DeMIeLINIZZANtI TAVEGGIA CARLA

N. 105

ANALIsI strUttUrALe e FUNZIoNALe DI pArtICoLArI MUtAZIoNI DeLLA CoNNessINA 32 IMpLICAte NeLLA pAtoGeNesI DeLLA ForMA X-LINKeD DeLLA MALAttIA DI CHArCot-MArIetootH BORTOLOZZI MARIO

N. 106

sVILUppo DI UNA terApIA A BAse DI NGF per Le NeUropAtIe ereDItArIe seNsorIe eD AUtoNoMe DI tIpo IV e V CATTANEO ANTONINO

N. 107

CoINVoLGIMeNto DI proteINe MItoCoNDrIALI IN AUtoFAGIA: UNA possIBILe IMpLICAZIoNe IN MALAttIe MItoCoNDrIALI PINTON PAOLO

N. 108

rUoLo DeLLA DINAMICA MItoCoNDrIALe e DeLL’AUtoFAGIA NeLLA seGreGAZIoNe DeL DNA MItoCoNDrIALe MUtAto VERGANI LODOVICA

30

N. 123

DINAMICA MItoCoNDrIALe eD oMeostAsI DeL CALCIo soNo FAttorI DeterMINANtI per LA NeUroDeGeNerAZIoNe AssoCIAte A MUtAZIoNI DI AFG3L2. DALL’IpotesI MoLeCoLAre AL trAttAMeNto preCLINICo CASARI GIORGIO

N. 136

INsoNNIA FAtALe FAMILIAre: trAttAMeNto preVeNtIVo CoN DoXICICLINA IN soGGettI A rIsCHIo GeNetICo DI MALAttIA FORLONI GIANLUIGI

N. 137

NUoVe prospettIVe terApeUtICHe per LA MALAttIA DI ALZHeIMer BAsAte sU UNA VArIANte DI ABetA CHe INIBIsCe L'AMILoIDoGeNesI DI FEDE GIUSEPPE

N. 138

stUDIo DeLLe BAsI MoLeCoLArI DeLLA NeUroDeGeNerAZIoNe NeLLA sINDroMe DI CoCKAYNe PROIETTI DE SANTIS LUCA

N. 139

sKIppING esoNICo INDotto DA rNA ANtIseNso per LA terApIA GeNICA DeLLA DeMeNZA FroNto-teMporALe CoN pArKINsoNIsMo LeGAtA AL CroMosoMA 17 (FtDp-17) DENTI MICHELA ALESSANDRA

N. 124

DIFettI ereDItArI NeL seGNALe DeL DANNo AL DNA CHe CAUsANo NeUroDeGeNerAZIoNe: CoMpreNsIoNe DeI MeCCANIsMI DELIA DOMENICO

N. 125

CoNtroLLo DeLLA AttIVItÀ DI AtM DA pArte DI rNA GeNerAtI DA DICer e DrosHA D'ADDA DI FAGAGNA FABRIZIO

N. 126

sIsteMI MoDeLLo per IDeNtIFICAre GeNI e FAttorI NeI proCessI MoLeCoLArI DIFettIVI NeI pAZIeNtI DI AtAXIA teLANGIeCtAsIA FOIANI MARCO

N. 127

rUoLo DeLLe MUtAZIoNI NeI GeNI DeLLe sINApsINe NeLL'epILessIA e NeLL'AUtIsMo BENFENATI FABIO

N. 140

rUoLo DeLLe MUtAZIoNI DeL reCettore GABAA NeLLA epILessIA IDIopAtICA GeNerALIZZAtA: UNo stUDIo sULLo sVILUppo CANCEDDA LAURA

IMpAtto DeLLA MINor proDUZIoNe DI CoLesteroLo DI orIGINe GLIALe NeLLA MALAttIA DI HUNtINGtoN CATTANEO ELENA

N. 141

VArIAZIoNe DeLLA proDUZIoNe DeL tGF-BetA1 NeI MACroFAGI e CeLLULe GLIALI NeLLA MALAttIA DI HUNtINGtoN SQUITIERI FERDINANDO

N. 142

rUoLo DeL Ferro e DeI MItoCoNDrI NeLLA pAtoGeNesI DeLLA NeUroDeGeNerAZIoNe AssoCIAtA A pANtoteNAto CHINAsI (pKAN): sVILUppo DI NUoVI MoDeLLI CeLLULArI NeUroNALI e ANALIsI DI UN MoDeLLo DI MALAttIA MUrINo LEVI SONIA

N. 143

MoDeLLI ANIMALI DI NeUroFerrItINopAtIe per Lo stUDIo DeL rUoLo DeL Ferro NeLLA NeUroDeGeNerAZIoNe AROSIO PAOLO

N. 144

pINK1, UNA proteINA MUtAtA NeLLA MALAttIA DI pArKINsoN A trAsMIssIoNe AUtosoMICA reCessIVA, INterAGIsCe CoN LA proteINA proAUtoFAGICA BeCLIN1 e CoN IL sUo pArtNer ANtIApoptotICo BCL-XL: CArAtterIZZAZIoNe DeL rUoLo NeUroprotettIVo DI QUeste INterAZIoNI AttrAVerso LA reGoLAZIoNe DI MULtIpLe VIe CeLLULArI VALENTE ENZA MARIA

N. 145

DeFINIZIoNe DeLLA MALAttIA DI pArKINsoN trAMIte proFILo DI espressIoNe GeNICA DA sANGUe perIFerICo DI pAZIeNtI AFFettI DALLA ForMe MoNoGeNetICHe LrrK2 e pArKINA GUSTINCICH STEFANO

N. 128

N. 129

IDeNtIFICAZIoNe DI NUoVI GeNI per L'epILessIA teMporALe LAterALe AUtosoMICA DoMINANte IN FAMIGLIe seNZA MUtAZIoNI IN LGI1 NOBILE CARLO

N. 130

rUoLo DeI reCettorI NICotINICI NeLLA pAtoGeNesI DeLL'epILessIA NottUrNA AUtosoMICA DoMINANte DeL LoBo FroNtALe: stUDIo sU UN MoDeLLo MUrINo CoNDIZIoNALe BECCHETTI ANDREA

N. 131

MeCCANIsMI CeLLULArI ALLA BAse DeLLe DIsFUNZIoNI CereBrALI osserVAte IN UN MoDeLLo MUrINo DI sINDroMe DI DrAVet FELLIN TOMMASO

N. 132

rUoLo DeLLe INterAZIoNI trA AstroCItI eD INterNeUroNI NeL CoNtroLLo DeLLe CrIsI epILettICHe IN MoDeLLI DI MALAttIe NeUroLoGICHe MoNoGeNICHe AssoCIAte AD epILessIA CARMIGNOTO GIORGIO

N. 133

stUDI IN MoDeLLI GeNetICI DI topo e pAZIeNtI AFFettI DA eMICrANIA eMIpLeGICA FAMILIAre tIpo 1 per sVeLAre L’INterAZIoNe FrA NeUroNI seNsorIALI e CeLLULe NeUroINFIAMMAtorIe NeI GANGLI trIGeMINALI CoMe BAse per Lo sVILUppo DeL DoLore eMICrANICo NISTRI ANDREA

N. 134

IL rUoLo DeLLA NeUroserpINA NeLLA eNCeFALopAtIA FAMIGLIAre DA CorpI D'INCLUsIoNe DI NeUroserpINA BOLOGNESI MARTINO

N. 146

IDeNtIFICAZIoNe DI GeNI reCessIVI CHe proVoCANo LA MALAttIA DI pArKINsoN trAMIte seQUeNZA CoMpLetA DeLL'esoMA GOLDWURM STEFANO

N. 135

LA proteINA prIoNICA MUtAtA IMpeDIsCe L'INserZIoNe DI CANALI per IL CALCIo VoLtAGGIo-DIpeNDeNtI NeLLA MeMBrANA presINAptICA: ANALIsI DeI MeCCANIsMI DI NeUrotossICItÀ e poteNZIALI strAteGIe terApeUtICHe MATTEOLI MICHELA

N. 147

MeCCANIsMI pAtoGeNetICI DeL MorBo DI pArKINsoN FAMILIAre: ALFA-sINUCLeINA e LA sUA ForMA MUtAtA A30p AGIsCoNo sULLA strUttUrA DeI MICroFILAMeNtI e DeI FILAMeNtI INterMeDI. VIe DI seGNALAZIoNe eD eFFettI sULLe DINAMICHe CItosCHeLetrICHe CHIEREGATTI EVELINA

31

N. 148

N. 149

N. 150

N. 151

FUNZIoNe e DIsFUNZIoNe A LIVeLLo presINAptICo DI LrrK2, UNA proteINA CHINAsI AssoCIAtA ALLA MALAttIA DI pArKINsoN GREGGIO ELISA

N. 161

CeLLULArI e MUrINI per Lo stUDIo DeL rUoLo DI FoXG1 NeLLA NeUroGeNesI RENIERI ALESSANDRA N. 162

ArrAY-CGH AD ALtA rIsoLUZIoNe AD ANALIsI D’espressIoNe GeNICA NeLLo stUDIo DeI DIsorDINI DeLLo spettro AUtIstICo CICCONE ROBERTO

N. 153

N. 154

N. 155

N. 156

N. 157

N. 158

N. 159

N. 160

rett e VALIDAZIoNe DI terApIe IN MoDeLLI preCLINICI: UNo stUDIo GeNoMICo, MorFoFUNZIoNALe e CoMportAMeNtALe NeI MoDeLLI ANIMALI e NeL pAZIeNte PIZZORUSSO TOMMASO

MeCCANIsMI ALLA BAse DI UNA ALterAtA trAsMIssIoNe GABAerGICA NeLL'IppoCAMpo DI topI trANsGeNICI portAtorI DeLLA MUtAZIoNe UMANA r451C NeL GeNe CoDIFICANte LA NLG3: UN MoDeLLo ANIMALe DI AUtIsMo CHERUBINI ENRICO

N. 163

rUoLo DeLLA FosForILAZIoNe DI MeCp2 e DeLLe CHINAsI IMpLICAte NeLLA sINDroMe DI rett e NeLL'eNCeFALopAtIA epILettICA INFANtILe preCoCe-2 LANDSBERGER NICOLETTA

rUoLo DeI CANALI rettIFICAtorI DI INGresso DeL K+ AstroCItArI NeLLA pAtoGeNesI DeI DIstUrBI DeLLo spettro AUtIstICo CoN sUsCettIBILItÀ ALLe CrIsI epILettICHe (FeNotIpo AUtIsMo-epILessIA) SICCA FEDERICO

N. 164

espressIoNe eD eFFettI DI L1CAM e DeLLe sUe MUtAZIoNI MIsseNse IN CeLLULe pC12 e NeUroNI MELDOLESI JACOPO

N. 165 N. 152

sINDroMe DI rett CoNGeNItA: MoDeLLI

ANALoGHI DeLL’ossItoCINA NeLLA sINDroMe DI prADer-WILLI: NUoVI strUMeNtI per Lo stUDIo eD IL trAttAMeNto DeI DIstUrBI CoMportAMeNtALI DI tIpo AUtIstICo CHINI BICE

IL CoMpLesso r-rAs/rIN2/rAB5 CoNtroLLA L’ADesIoNe DeLLe CeLLULe eNDoteLIALI e LA MorFoGeNesI VAsCoLAre AttrAVerso L’eNDoCItosI DeLLe INteGrINe AttIVe e LA trAsDUZIoNe DeL seGNALe rAC-DIpeNDeNte SERINI GUIDO

CArAtterIZZAZIoNe DeLLe ALterAZIoNI NeUroNALI INDotte DALLe MUtAZIoNI DI sHANK3 e sVILUppo DI ApproCCI terApeUtICI FArMACoLoGICI e GeNetICI UtILIZZANDo MoDeLLI ANIMALI e CeLLULe Ips DeI pAZIeNtI SALA CARLO

N. 166

IDeNtIFICAZIoNe DI tArGet terApeUtICI NeLLA MICroCeFALIA prIMArIA AttrAVerso L’ANALIsI DeLLA VIA CIt-K/AspM DI CUNTO FERDINANDO

N. 167

CoINVoLGIMeNto DeI reCettorI MetABotropICI DeL GLUtAMMAto DeL GrUppo I NeLLA FIsIopAtoLoGIA DeLLA sINDroMe DeL CroMosoMA X FrAGILe CATANIA MARIA VINCENZA

IL rUoLo DeLL'rNasiH2 NeLLA pAtoGeNesI DeLLA sINDroMe DI AICArDI-GoUtIÈres PLEVANI PAOLO

N. 168

rUoLo DeLLo stress CeLLULAre, proteostAsI e oMeostAsI DeL CALCIo NeLLA DeGeNerAZIoNe DeLLe CeLLULe DeL pUrKINJe

MeCCANIsMI DI rIAttIVAZIoNe DeL GeNe FMr1 eD ANALIsI DeLLA pAtoGeNesI MoLeCoLAre DeLLA sINDroMe X FrAGILe: Verso UNA terApIA FArMACoLoGICA NERI GIOVANNI

NeLLA sINDroMe DI MArINesCo-sJoGreN SALLESE MICHELE N. 169

LA proteINA UBe3A LIGAsI DeLL’UBIQUItINA AssoCIAtA ALLA sINDroMe DI ANGeLMAN

sVILUppo e FUNZIoNe DeI CIrCUItI NeUroNALI IN UN MoDeLLo DI rItArDo MeNtALe AssoCIAto AL CroMosoMA X CALEO MATTEO

CoNtroLLA Le FUNZIoNI DeL proteosoMA BANKS LAWRENCE N. 170

terApIA preVeNtIVA DeL rItArDo MeNtALe NeLLA sINDroMe DI DoWN CoN UN NUoVo

rUoLo DeLLe Gtpasi DeLLA FAMIGLIA rHo DUrANte Lo sVILUppo NeUroNALe DE CURTIS IVAN

INIBItore DeLLA GAMMA-seCretAsI: MeCCANIsMI App-DIpeNDeNtI NeLLo sVILUppo DeL sIsteMA NerVoso

BAsI MoLeCoLArI e MoDeLLI CeLLULArI DeLLe MALAttIe NeUroLoGICHe INFANtILI CAUsAte DA MUtAZIoNI DeL GeNe CDKL5 BROCCOLI VANIA

BARTESAGHI RENATA N. 171

MeCCANIsMI MoLeCoLArI rIGUArDANtI IL trAsporto, LA reGoLAZIoNe DA pArte DI

CDKL5, UN NUoVo GeNe ALLA BAse DI UNA VArIANte DeLLA sINDroMe DI rett, GIoCA UN rUoLo CHIAVe NeLLA reGoLAZIoNe DeLLA proLIFerAZIoNe, Morte e DIFFereNZIAMeNto DeI preCUrsorI NeUroNALI CIANI ELISABETTA

pICCoLI LIGANDI e L’INterAZIoNe CoN ALtre sUBUNItÀ DeLLe proteINe CLC CoINVoLte IN MALAttIe GeNetICHe UMANe PUSCH MICHAEL N. 172

MALAttIe CorreLAte A DIFettI NeLLA FUNZIoNe DeLLe MIosINe DI CLAsse V: BAsI

ApproCCI FArMACoLoGICI per IL rIprIstINo DeI LIVeLLI DI BDNF IN MoDeLLI CeLLULArI eD ANIMALI DeLLA sINDroMe DI rett TONGIORGI ENRICO

MoLeCoLArI DeL MeCCANIsMo DI rICoNosCIMeNto DeL CArGo RAGNINI-WILSON ANTONELLA

32

ALtre MALAttIe GeNetICHe

N. 185

NUoVe strAteGIe terApeUtICHe per DIFettI ereDItArI DeLLA CoAGULAZIoNe CAUsAtI DA

N. 173

N. 174

N. 175

IDeNtIFICAZIoNe e CArAtterIZZAZIoNe FUNZIoNALe DeI BersAGLI MoLeCoLArI DeL FAttore trAsCrIZIoNALe soX2 NeLLA MALAttIA GeNetICA DeL CerVeLLo: UN ApproCCIo MeDIANte ABLAZIoNe CoNDIZIoNALe DI soX2 NeL topo NICOLIS SILVIA KIRSTEN

MUtAZIoNI DI spLICING PINOTTI MIRKO N. 186

poteNZIALI eFFettI terApeUtICI DeLLe CeLLULe UMANe eNDoteLIALI DeI sINUsoIDI epAtICI, DeL MIDoLLo osseo e DeL sANGUe DA CorDoNe NeLL'eMoFILIA A FOLLENZI ANTONIA

CArAtterIZZAZIoNe MoLeCoLAre e CeLLULAre DI UBIAD1, UN NUoVo proDotto GeNICo CoINVoLto NeLLA DIstroFIA DeL CrIstALLINo DI sCHNYDer SANTORO MASSIMO

N. 187

strAteGIe terApeUtICHe VoLte AD ALLeVIAre IL DANNo ossIDAtIVo INDotto DALL’eMe NeLL’ANeMIA FALCIForMe TOLOSANO EMANUELA

ALFA-B-CrYstALLINo reCUperA L'espressIoNe IN MeMBrANA pLAsMAtICA DI reCettorI MUtANtI FZ4 e Atp7B rIteNUtI NeL retICoLo eNDopLAsMICo BONATTI STEFANO

N. 188

proDUZIoNe DI eMoGLoBINA IN CeLLULe erItroIDI DA pAZIeNtI CoN BetA tALAsseMIA ALterANDo proCessI BIoMoLeCoLArI IN GrADo DI reGoLAre L'espressIoNe DeI GeNI per Le GLoBINe

N. 176

N. 177

N. 178

N. 179

N. 180

N. 181

N. 182

N. 183

N. 184

stUDIo DI sICUreZZA eD eFFICACIA IN soGGettI CoN AMAUrosI CoNGeNItA DI LeBer (ACL) trAMIte Vettore ADeNo-AssoCIAto per trAsFerIre IL GeNe rpe65 UMANo NeLL’epIteLIo pIGMeNtAto DeLLA retINA (epr): trAttAMeNto e FoLLoW-Up DI 3 pAZIeNtI ItALIANI SIMONELLI FRANCESCA

GAMBARI ROBERTO N. 189

L'AttIVAZIoNe CostItUtIVA DeL reCettore ALFAIIB-BetA3 CAUsAtA DA UNA MUtAZIoNe DeLL'INteGrINA BetA3 portA A DIFettI DeLLA FUNZIoNALItÀ pIAstrINICA e DeLLA troMBopoIesI GRESELE PAOLO

IDeNtIFICAZIoNe DeI GeNI MoDIFICAtorI NUCLeArI NeLLA NeUropAtIA ottICA ereDItArIA DI LeBer e Loro VALIDAZIoNe IN LINee CeLLULArI e orGANIsMI MoDeLLo CARELLI VALERIO

N. 190

UN NUoVo GeNe respoNsABILe DI pIAstrINopeNIA ereDItArIA: stUDI CLINICI, pAtoGeNetICI e FArMACoLoGICI BALDUINI CARLO LUIGI

N. 191

ALLA rICerCA DeLLe BAsI MoLeCoLArI DeLL'ALBINIsMo oCULAre DI tIpo 1: UN’eCCeZIoNALe opportUNItÀ per FAr LUCe sULLA trAsDUZIoNe DeL seGNALe NeL sIsteMA DeLLe eNDoMeMBrANe SCHIAFFINO MARIA VITTORIA

NUoVI BersAGLI FArMACoLoGICI NeLL'ANeMIA DI FANCoNI LA VOLPE ADRIANA

N. 192

NUoVe strAteGIe per CUrAre L’eMoCroMAtosI ereDItArIA AttrAVerso LA stIMoLAZIoNe DeLLA proDUZIoNe epAtICA DI

sVILUppo DI INterFACCe BIo-orGANICHe FotoVoLtAICHe e Loro AppLICAZIoNe CoMe protesI retINICHe per LA CUrA DeLLA retINIte pIGMeNtosA LANZANI GUGLIELMO

epCIDINA, L'orMoNe DeL Ferro PIETRANGELO ANTONELLO N. 193

eMoCroMAtosI: DAI GeNI ALLA CLINICA e rItorNo CAMASCHELLA CLARA

UNA NUoVA strAteGIA terApeUtICA MIrAtA AL DANNo ossIDAtIVo DeI FotoreCettorI NeLLe ereDo-DeGeNerAZIoNI retINICHe INDotte DA MUtAZIoNI DeL GeNe ABCr. stUDIo CLINICo e sperIMeNtALe FALSINI BENEDETTO

N. 194

eFFetto DeLLe MUtAZIoNI DeL GeNe CIAs-1 sUI MeCCANIsMI pAtoGeNetICI DeLLe sINDroMI perIoDICHe AUtoINFIAMMAtorIe DA DIFetto DI CrIopIrINA (CAps). rICerCA DI NUoVI GeNI e DI NUoVI ApproCCI

GeNetICA DeLLA perDItA UDItIVA GASPARINI PAOLO

terApeUtICI GATTORNO MARCO

eFFICIeNte INserIMeNto GeNICo NeLL'oreCCHIo INterNo AttrAVerso CANALostoMIA MAMMANO FABIO

N. 195

IL sIsteMA reCettore p2X7/ADeNosINA: UN NUoVo BersAGLIo per LA terApIA DeLLe MALAttIe AUtoINFIAMMAtorIe DI VIRGILIO FRANCESCO

ApproCCI “oMICI” per L’IDeNtIFICAZIoNe DI NUoVI GeNI respoNsABILI DI sorDItÀ NoN sINDroMICA NeUroseNsorIALe ereDItArIA DUGA STEFANO

N. 196

strAteGIe INNoVAtIVe per LA CUrA DeLLe MALAttIe GeNetICHe MeDIANte IL trApIANto DI MIDoLLo osseo FLEISCHHAUER KATHARINA

reGoLAZIoNe GAtA1-MeDIAtA DeLL’espressIoNe GeNICA DI seC23B: IMpLICAZIoNI per LA DIAGNosI DI ANeMIA CoNGeNItA DIserItropoIetICA II IOLASCON ACHILLE

N. 197

reGoLAZIoNe DeI GeNI CoINVoLtI NeLLA pAtoGeNesI DeLL'ANGIoeDeMA ereDItArIo DA CAreNZA DI C1 INIBItore CICARDI MARCO

33

N. 198

N. 199

N. 200

N. 201

N. 202

N. 203

N. 204

N. 205

N. 206

N. 207

N. 208

N. 209

N. 210

pAtoGeNesI DeLLe MALAttIe DA ALterAto trAsporto e ACCUMULo proteICo NeLLA VIA seCretorIA SITIA ROBERTO

N. 211

IDeNtIFICAZIoNe DeL GeNe respoNsABILe DI UNA ForMA AUtosoMICA DoMINANte DI IMMUNoDeFICIeNZA CoMUNe VArIABILe (CVID) FERRARI SIMONA

stAtINe CoMe poteNZIALI strUMeNtI terApeUtICI per IL trAttAMeNto DeL DIABete INsIpIDo NeFroGeNICo SVELTO MARIA

N. 212

sAp reGoLA LA DIACILGLICeroLo CHINAsI ALFA: IMpLICAZIoNI per LA rIspostA IMMUNItArIA IN pAZIeNtI CoN MALAttIA LINFoproLIFerAtIVA LeGAtA AL CroMosoMA X (XLp) e possIBILI ApproCCI FArMACoLoGICI per LA terApIA DeLL'XLp GRAZIANI ANDREA

LeptINA, stAto MetABoLICo e CeLLULe t reGoLAtorIe NAtUrALI: BAsI CeLLULArI e MoLeCoLArI per UN UN INterVeNto IMMUNoterApeUtICo INNoVAtIVo NeL DIABete DI tIpo 1 MATARESE GIUSEPPE

N. 213

eFFettI protettIVI DI CoMpostI FItoCHIMICI NeI CoNFroNtI DeI DANNI INDottI DA CItoCHINe NeLLe CeLLULe BetA pANCreAtICHe eD espLorAZIoNe DeI MeCCANIsMI CoINVoLtI MASIELLO PELLEGRINO

N. 214

VALUtAZIoNe DeL poteNZIALe terApeUtICo DeLLe CeLLULe reGoLAtorIe NKt NeL DIABete AUtoIMMUNe DI tIpo 1 FALCONE MARIKA MARIA CATERINA

N. 215

UtILIZZo DI tIMp3 per BLoCCAre Le CoMpLICANZe MetABoLICHe e VAsCoLArI DeLL’oBesItÀ FEDERICI MASSIMO

N. 216

terApIA GeNICA FeGAto-speCIFICA perMANeNte IN UN MoDeLLo MUrINo DeLLA sINDroMe DI CrIGLer-NAJJAr MURO ANDRES FERNANDO

LA FUNZIoNe DeL GeNe prep1 NeL DIABete tIpo 2 BEGUINOT FRANCESCO

N. 217

IDeNtIFICAZIoNe DI NUoVe strAteGIe per LA CorreZIoNe DeL DIFetto DI BAse NeLLA FIBrosI CIstICA GALIETTA LUIS

NUoVI GeNI e AspettI CLINICo-pAtoLoGICI IN FAMIGLIe AFFette DA CArDIoMIopAtIA ArItMoGeNA DeL VeNtrICoLo Destro BAUCE BARBARA

N. 218

IDeNtIFICAZIoNe DeI preDIttorI GeNetICI, eLettroANAtoMICI e strUttUrALI DI ArItMIe VeNtrICoLArI MALIGNe IN pAZIeNtI CoN sINDroMe DI BrUGADA PIERONI MAURIZIO

N. 219

MeLUsINA CoMe AGeNte DI terApIA GeNICA: UN NUoVo ApproCCIo per CoNtrAstAre Le CArDIoMIopAtIe TARONE GUIDO

N. 220

MUtAZIoNI DeL GeNe CAsQ2 (CALseQUestrINA) eD ArItMIe CArDIACHe: ApproCCIo sperIMeNtALe ALLA pAtoGeNesI e terApIA PRIORI SILVIA GIULIANA

N. 221

NUoVo MetoDo per Lo stUDIo DeLLe ArItMIe CAteCoLAMINerGICHe FAMILIArI BAsAto sULL'Uso DI proteINe FotoAttIVAte MONGILLO MARCO

N. 222

DAL topo ALL'UoMo: Verso L'IDeNtIFICAZIoNe DI UNA terApIA GeNICA per LA VArIANte LQt3 DI sINDroMe DeL Qt LUNGo CROTTI LIA

N. 223

ALLestIMeNto DI MoDeLLI sperIMeNtALI DI ALCAptoNUrIA e VALUtAZIoNe preCLINICA DI AGeNtI terApeUtICI per IL trAttAMeNto DeLL’ArtropAtIA oCroNotICA SANTUCCI ANNALISA

N. 224

VArIABILItÀ FeNotIpICA e ApLoINsUFFICIeNZA GeNICA BALDINI ANTONIO

IL sIsteMA DI trAsporto INtrAFLAGeLLAre NeI LINFoCItI t: DIsseZIoNe FUNZIoNALe NeL trAsporto DeL reCettore DeLL’ANtIGeNe e VALUtAZIoNe QUALe BersAGLIo DeLLA MALAttIA NeLL’IMMUNoDeFICIeNZA CoMUNe VArIABILe BALDARI COSIMA

LA pAtoGeNesI DeLLA sINDroMe WHIM: ANALIsI DeLLe FUNZIoNI DeL CXCr4 NeLLA AttIVAZIoNe e NeL trAFFICo DeI LINFoCItI VIOLA ANTONELLA UNA CoNNessIoNe trA L’ALterAtA rIspostA AI reCettorI DI tIpo toLL NeLLe CeLLULe DeNDrItICHe e Le MALAttIe AUtoIMMUNI NeI pAZIeNtI AFFettI DALLA sINDoMre DI WIsKott-ALDrICH BENVENUTI FEDERICA

L’eMe-ossIGeNAsI 1 (Ho-1) CoMe MoDULAtore DeLLA pAtoLoGIA poLMoNAre AssoCIAtA ALLA FIBrosI CIstICA MAIURI LUIGI IL DIFetto DI FUNZIoNe DeL CFtr ALterA Le rIsposte DI IMMUNItÀ INNAtA MeDIAte DA reCettorI toLL-LIKe: IMpLICAZIoNI pAtoGeNetICHe e terApeUtICHe per LA MALAttIA epAtICA AssoCIAtA A FIBrosI CIstICA STRAZZABOSCO MARIO MIGLIorAre L’ACCUrAteZZA DIAGNostICA DI UN protoCoLLo DI sCreeNING NeoNAtALe per LA FIBrosI CIstICA: sCeLtA DeLLe soGLIe ottIMALI per I LIVeLLI eMAtICI DeLLA trIpsINA IMMUNoreAttIVA (Irt) MILANI SILVANO stUDI strUttUrA-FUNZIoNe sULLA 24DeIDroCoLesteroLo rIDUttAsI, L’eNZIMA DIFettoso NeLLA DesMosteroLosI, UNA GrAVe MALAttIA ereDItArIA A CArICo DeL MetABoLIsMo DeGLI steroLI VANONI MARIA ANTONIETTA sVILUppo DI NUoVe strAteGIe per IL trAttAMeNto DeLL'IperossALUrIA prIMArIA DI tIpo I VOLTATTORNI CARLA

34

N. 225

eFFettI DI LosArtAN Vs NeBIVoLoLo Vs L’AssoCIAZIoNe DI eNtrAMBI sULLA proGressIoNe DeLLA DILAtAZIoNe DeLLA rADICe AortICA NeLLA sINDroMe DI MArFAN CoN MUtAZIoNe DeL GeNe FBN1: report sUL trIAL CLINICo IN Atto ARBUSTINI ELOISA

N. 226

AttIVAZIoNe INtestINALe DeL reCettore NUCLeAre per GLI ACIDI BILIArI FXr NeL trAttAMeNto DeLLA CoLestAsI INtrAepAtICA proGressIVA FAMILIAre MOSCHETTA ANTONIO

N. 227

trANsIZIoNe epIteLIo-MeseNCHIMALe e MeCCANIsMI DI Cross tALK NeLLo sVILUppo DeLLA FIBrosI epAtICA NeI DIFettI CoNGeNItI DI FIBroCIstINA (FIBrosI epAtICA CoNGeNItA) FABRIS LUCA

N. 228

BAsI GeNetICHe DeLLA sINDroMe NeFrosICA steroIDo-resIsteNte e IMpLICAZIoNI per LA terApIA BRESIN ELENA

N. 229

ANoMALIe DeL CoMpLeMeNto NeLLA GLoMerULoNeFrIte MeMBrANoproLIFerAtIVA prIMArIA NORIS MARINA

N. 230

ANALIsI ULtrAstrUttUrALe AD ALtA rIsoLUZIoNe DeI CoMpLessI proteICI respoNsABILI DeL trAsporto INtrAFLAGeLLAre (IFt): sIsteMA MoLeCoLAre esseNZIALe per LA ForMAZIoNe DeLLe CIGLIA e ALLA BAse DeLLA MALAttIA DeL reNe poLICIstICo (pKD, poLYCYstIC KIDNeY DIseAse) LUPETTI PIETRO

N. 231

N. 232

N. 233

DeterMINANtI GeNetICHe DeLL’IpoDIspLAsIA reNALe NoN sINDroMICA e FeNotIpI AssoCIAtI GHIGGERI GIAN MARCO DeLUCIDAre Le BAsI GeNetICHe DeLLA MeNopAUsA preCoCe e ALCUNI DeI MeCCANIsMI MoLeCoLArI DeLLA pAtoLoGIA TONIOLO DANIELA CArAtterIZZAZIoNe FUNZIoNALe DeL rUoLo DeLLA NUCLeotIDAsI 1 AttIVAtA DAL CALCIo (CANt1) NeLLo sCHeLetro: UNo stUDIo IN VIVo CoN UN MoDeLLo ANIMALe DI DIspLAsIA DI DesBUQUoIs ROSSI ANTONIO

N. 234

GeNetICA e FArMACoGeNetICA DeLLA MALAttIA osseA DI pAGet GENNARI LUIGI

N. 235

DIFettI eNZIMAtICI NeLLA CoNDroDIspLAsIA pUNtAtA rIZoMeLICA: BIoCHIMICA e possIBILItÀ terApeUtICHe MATTEVI ANDREA

N. 236

N. 237

DIspLAsIA FIBrosA poLIostotICA MoDeLLI DI MALAttIA e MoDeLLI DI terApIA BIANCO PAOLO soMMINIstrAZIoNe DI rANKL e trApIANto DI CeLLULe MeseNCHIMALI stAMINALI CoMe ApproCCI terApeUtICI per L'osteopetrosI rANKL-DIpeNDeNte SOBACCHI CRISTINA

35

N. 238

NUoVI ApproCCI terApeUtICI per L'osteopetrosI TETI ANNA MARIA

N. 239

strUttUre CoILeD-CoIL DI poLIALANINA reGoLANo AGGreGAZIoNe, FUNZIoNe e DIsFUNZIoNe DI proteINe AssoCIAte A MALAttIe GeNetICHe FIUMARA FERDINANDO

N. 240

sorDItÀ NeUroseNsorIALe IN pAZIeNtI AFFettI DA eeC sINDroMe: rUoLo DI p63 NeI MeCCANIsMI DI ApoptosI/DIFFereNZIAMeNto DeL NeUroepIteLIo CoCLeAre. MELINO GENNARO

N. 241

stUDIo DeI MeCCANIsMI CoINVoLtI NeI DIFettI CUtANeI CArAtterIZZANtI LA sINDroMe DI HAY-WeLLs MISSERO CATERINA

N. 242

trAsFerIre Le CoNosCeNZe sUL rUoLo DeL GeNe MALAttIA p63 DUrANte Lo sVILUppo eMBrIoNALe ALLA possIBILItÀ DI rIprIstINAre Lo sVILUppo NorMALe IN MoDeLLI DI CoLtUre DI tessUto e IN VIVo MERLO GIORGIO ROBERTO

N. 243

BAsI MoLeCoLArI DeLLA sINDroMe DI NooNAN e DI MALAttIe GeNetICHe CorreLAte TARTAGLIA MARCO

N. 244

DIMerIZZAZIoNe DI sHp-2: UN MeCCANIsMo reGoLAtIVo ADDIZIoNALe per LA MoDULAZIoNe DeLL'AttIVItÀ DI sHp2 CESARENI GIANNI

N. 245

DereGoLAZIoNe DeL CALCIo e stressossIDAtIVo: DAI MeCCANIsMI MoLeCoLArI ALLe IMpLICAZIoNI terApeUtICHe NeLLA pAtoLoGIA DI HAILeY-HAILeY TALORA CLAUDIO

N. 246

ANALIsI DeI MeCCANIsMI MoLeCoLArI CHe CoMproMettoNo LA FUNZIoNALItÀ DI NeMo NeLLA pAtoGeNesI Ip URSINI MATILDE VALERIA

N. 247

IDeNtIFICAZIoNe DeI MeCCANIsMI MoLeCoLArI ALLA BAse DeI DIFettI DI seGreGAZIoNe DeI CroMosoMI sessUALI NeI MAMMIFerI: IL rUoLo DeL GeNe spo11 BARCHI MARCO

N. 248

IMprINtING GeNoMICo e DIsorDINI DeLLA CresCItA: DIFettI GeNetICI e MeCCANIsMI MoLeCoLArI RICCIO ANDREA

N. 249

CorreLAZIoNe trA DIFettI NeLLA rIpArAZIoNe DeL DNA e ANoMALIe strUttUrALI DeI CroMosoMI NeLLe CeLLULe DI pAZIeNtI AFFettI DA CoesINopAtIe BRANZEI DANA

N. 250

MoDULAZIoNe DeLLA AttIVItÀ DeL FAttore DI INIZIo 6 (eIF6) e sUo UtILIZZo terApeUtICo NeLLe MALAttIe A CAUsA rIBosoMALe BIFFO STEFANO

N. 251

Verso LA CoMpreNsIoNe DeLLA pAtoGeNesI DeLLA sINDroMe DI WerNer: stUDIo DeLLA CorreLAZIoNe FUNZIoNALe trA LA proteINA Atr e LA proteINA WrN NeLL'INsorGeNZA DeLLA seNesCeNZA CeLLULAre preMAtUtA DeLLA sINDroMe PICHIERRI PIETRO

N. 252

IL LIeVIto sACCHAroMYCes CereVIsIAe CoMe

N. 253

AMBIeNte CeLLULAre per stUDIAre LA repLICAZIoNe, L'INteGrAZIoNe e L'INCApsIDAZIoNe DeL VIrUs ADeNoAssoCIAto GALLI ALVARO

Verso UNA pIÙ eFFICACe terApIA GeNICA CoN VettorI AAV. sCreeNING AD ALtA proCessIVItÀ per L'IDeNtIFICAZIoNe DeI DeterMINANtI MoLeCoLArI CHe reGoLANo LA trAsDUZIoNe DA AAV, LA proDUZIoNe DeI VettorI e LA CorreZIoNe GeNICA GIACCA MAURO

serVIZI teLetHoN ALLA rICerCA ABstrACt

ABstrACt

N. 254

rete DeLLe BIoBANCHe GeNetICHe teLetHoN (tNGB) WWW.BIoBANKNetWorK.orG FILOCAMO MIRELLA

N. 255

serVIZIo teLetHoN DI MICrosCopIA eLettroNICA teeMCoF POLISHCHUK ROMAN

N. 256

Wep: UN WorKFLoW DI ANALIsI AD eLeVAte prestAZIoNI per L’ANALIsI DI DAtI DI seQUeNZe DI “WHoLe-eXoMe” PESOLE GRAZIANO

TELETHON INSTITUTE OF GENETICS AND MEDICINE

TELETHON INSTITUTE OF GENETICS AND MEDICINE

ABSTRACT N. 2 TIGEM - Altre Malattie Genetiche

ABSTRACT N. 1 TIGEM - Malattie Neuromuscolari Responsabile

PARENTI GIANCARLO

Telethon grant N.

TGM11MT4

Totale €

192.300

Num Centri: 1

BALLABIO ANDREA

Responsabile

Durata (anni): 3

Telethon grant N.

TGM11CB6

Totale €

560.000

Num Centri: 1

Durata (anni): 5

Anno d’inizio: 2011

MODULAZIONE DELLA CLEARANCE CELLULARE NELLE MALATTIE DA ACCUMULO LISOSOMIALE

Anno d’inizio: 2011

TERAPIE CON PICCOLE MOLECOLE PER LE MALATTIE LISOSOMIALI

Settembre Carmine (1,2,3), Annunziata Fabio (1), Calcagnì Alessia (1), D’Orsi Luca (1), De Cegli Rossella (1), Florio Francesca (1), Mansueto Gelsomina (1), Montefusco Sandro (1), Peluso Ivana (1), Prezioso Carolina (1), Saide Assunta (1), Medina Sanabria Diego Luis (1), Spampanato Carmine (1), Ballabio Andrea (1,2,3,4)

Parenti Giancarlo (1,2), Cardone Monica (1), Porto Caterina (1,2), Rossi Barbara (1), Donaudy Francesca (1), Tarallo Antonietta (1), Pignata Antonella (1)

(1) Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM), Via P. Castellino 111, 80131 Naples, Italy (2) Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, Houston, TX 77030, USA (3) Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children Hospital, Houston, TX 77030, USA (4) Medical Genetics, Department of Pediatrics, Federico II University, Naples 80131, Italy

(1) Telethon Institute of Genetics and Medicine - Via P. Castellino 111, 80131 Naples; Tel: 081 6132227; E-mail: parenti@tigem.it (2) Department of Pediatrics, Federico II University, Naples

La terapia enzimatica sostitutiva (enzyme replacement therapy, ERT) è attualmente considerata l’approccio standard per il trattamento di diverse malattie da accumulo lisosomiale (lysosomal storage diseases, LSD), ma, nonostante il successo in alcune di queste malattie, questo approccio ha dei limiti e lascia importanti problemi clinici irrisolti. Strategie terapeutiche basate sull’uso di piccole molecole possono avere vantaggi rispetto all’ERT, come una migliore biodisponibilità e la possibilità di somministrazione orale. La terapia con farmaci chaperone (pharmacological chaperone therapy, PCT) è basata sull’uso di ligandi che impediscono il misfolding e la degradazione di proteine mutate. La terapia da riduzione del substrato (substrate reduction therapy, SRT) è volta a ridurre il flusso dei substrati ai lisosomi attraverso l’inibizione di specifici enzimi coinvolti nelle loro vie biosintetiche.

Abbiamo valutato le potenzialità di questi approcci in tre diversi modelli di malattia, la malattia di Pompe (PD) causata dal deficit di alfa-glucosidasi (GAA), la malattia di Fabry (FD) dovuta alla carenza di alfa-galattosidasi A, e la mucopolisaccaridosi IIIA (MPSIIIA) causata dal deficit di N-sulfoglucosamina sulfoidrolasi.

Gran parte del lavoro è stato fatto sulla PCT nella PD. Abbiamo dimostrato che la combinazione di PCT e ERT in questa malattia ha un effetto sinergico. Questi studi hanno aperto la strada ad una sperimentazione clinica sulla combinazione del farmaco chaperone NB-DNJ (miglustat) ed ERT con GAA ricombinante umana (rhGAA) nella PD. Dodici pazienti PD sono stati arruolati in questo studio. I risultati preliminari mostrano che la combinazione di PCT ed ERT comporta un aumento del picco dell’attività GAA (misurata in gocce di sangue essiccate su cartoncino) in tutti i pazienti, rispetto alle attività ottenuti negli stessi pazienti con la sola ERT. Abbiamo inoltre identificato tre nuovi farmaci chaperone allosterici per la GAA. La strategia utilizzata per l’identificazione e la caratterizzazione di questi composti era basata sulla combinazione di studi biochimici e di una analisi computazionale delle loro interazioni con la GAA. L’identificazione di tali molecole è innovativa in quanto esse rappresentano il primo esempio di chaperone farmacologici che non interagiscono con il sito catalitico dell’enzima, e quindi non sono potenziali inibitori dell’enzima.

Abbiamo dimostrato che la sinergia tra ERT e PCT non è solo limitata alla PD, ma si osserva anche nella FD. Questi studi supportano l’idea che i protocolli di combinazione possono essere estesi al trattamento di altre LSD per i quali sono disponibili ERT e farmaci chaperone. Questo potrà verosimilmente tradursi in maggiore efficacia della ERT nelle LSD. Mentre questa sinergia è ben documentata sia in vitro che in vivo, i meccanismi molecolari responsabili di questo effetto sono meno chiari. Studi attualmente in corso mostrano che i farmaci chaperone migliorano la stabilità degli enzimi ricombinanti in funzione del pH e aumentano il targeting lisosomiale degli enzimi.

Stiamo anche esplorando le potenzialità di un approccio diverso, la SRT, per il trattamento di MPSIIIA. Questi studi sono focalizzati sull’impiego di una molecola in grado di ridurre la sintesi di proteoglicani e glicosaminoglicani nei fibroblasti di pazienti con MPSIIIA

I lisosomi giocano un ruolo molto importante nel meccanismo di “clearance” cellulare. Dal momento che il fabbisogno energetico è differente a seconda della tipologia di tessuto, dell’età e delle condizioni ambientali, abbiamo ipotizzato l’esistenza di un sistema responsabile del coordinamento dell’attività lisosomiale. Utilizzando un approccio di systems-biology, abbiamo scoperto una rete genica (CLEAR: Coordinated Lysosomal Enhancement And Regulation) che controlla la biogenesi e la funzione lisosomiale; abbiamo inoltre identificato il gene “master” di questa rete, il fattore di trascrizione TFEB (bHLH-leucin zipper) il quale, mediante il legame ai siti bersaglio CLEAR presenti nei promotori dei geni lisosomiali, ne regola positivamente l’espressione. L’overespressione di TFEB, infatti, induce la biogenesi lisosomiale e promuove la “clearance” cellulare (Sardiello et al. Science 2009). Abbiamo inoltre dimostrato che TFEB è direttamente coinvolto nella regolazione di due importanti processi cellulari regolati dall’attività lisosomiale: l’autofagia (Settembre et al. Science 2011) e l’esocitosi lisosomiale (Medina et al. Dev. Cell 2011).

L’overespressione di TFEB promuove la clearance cellulare in diversi modelli murini di malattie da accumulo lisosomiale (LSD), sia in colture cellulari sia in vivo (Medina et al. Dev Cell 2011). Recenti studi svolti nel nostro laboratorio hanno dimostrato che TFEB co-localizza, sulla membrana lisosomiale, con la proteina chinasi mTOR, che è il principale regolatore della crescita cellulare. Quando la cellula ha a disposizione i nutrienti, TFEB viene fosforilato da mTOR sulla superficie lisosomiale ed è inattivo. Al contrario, l’inibizione farmacologica di mTOR, così come la privazione di nutrienti e il danneggiamento lisosomiale, attivano TFEB promuovendone la traslocazione nel nucleo. Questi dati mettono in luce un nuovo asse di “signaling” lisosoma-nucleo, sensibile al livello dei nutrienti all’interno della cellula, che regola l’attività lisosomiale mediante mTOR e TFEB (Settembre et al. EMBO J, 2012). In conclusione, abbiamo identificato un nuovo meccanismo molecolare, utilizzabile anche dal punto di vista farmacologico, che controlla la clearance e il metabolismo energetico cellulare.

ABSTRACT N. 3 TIGEM - Altre Malattie Genetiche Responsabile

FRALDI ALESSANDRO

Telethon grant N.

TGM11MT5

Totale €

90.000

Num Centri: 2

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2011

MODIFICA DI ENZIMI LISOSOMIALI ALLO SCOPO DI MIGLIORARNE LA SECREZIONE ED IL TRASFERIMENTO AL SISTEMA NERVOSO CENTRALE Sorrentino Nicolina Cristina (1), D’Orsi Luca (1), De Leonibus Elvira (1), Ballabio Andrea (1,2), Fraldi Alessandro (1) (1) Telethon Institute of Genetics and Medicine, Via P. Castellino 111, 80131 Naples, Italy, Tel. +39 081 6132462, Fax +39 081 5609877, E-mail: fraldi@tigem.it (2) Department of Pediatrics, Federico II University, Via S. Pansini 5, 80131 Naples, Italy

37

TELETHON INSTITUTE OF GENETICS AND MEDICINE

La Mucopolisaccaridosi di tipo IIIA (MPS IIIA) è una malattia da accumulo lisosomiale causata dal deficit di un enzima lisosomiale: la sulfamidasi. Questa malattia colpisce maggiormente il cervello, ed attualmente non esiste alcuna terapia in grado di trattare efficacemente la neuropatologia. In questo progetto abbiamo generato una sulfamidasi modificata capace di essere altamente secreta e di attraversare la barriera emato-encefalica (BBB). La sulfamidasi modificata è stata ingegnerizzata con il dominio di legame dell’Apolipoproteina B (ApoB) per i recettori delle lipoproteine a bassa densità (LDLR).

Tale dominio di legame conferisce alla sulfamidasi modificata la capacità di attraversare la BBB attraverso un processo di trasporto mediato dai recettori LDLR (transcitosi). La sulfamidasi chimerica contiene inoltre un segnale peptidico di secrezione alternativo (sp) derivato da un’altra solfatasi molto secreta, l’iduronato-solfatasi (IDS), il quale permette alla proteina di essere altamente secreta dal fegato.

Allo scopo di trasdurre efficientemente il fegato con la sulfamidasi chimerica abbiamo eseguito un’iniezione sistemica di vettori virali adenoassociati (AAV) con sierotipo 8, il quale presenta un alto tropismo per il fegato. L’iniezione intravenosa di questi vettori codificanti la sulfamidasi chimerica in topi adulti MPS IIIA rende il fegato un organo capace di rilasciare elevate quantità di sulfamidasi modificata nel circolo sistemico. In seguito abbiamo osservato un rilevante incremento dell’attività della sulfamidasi nel cervello di topi MPS IIIA iniettati, dimostrando che la sulfamidasi modificata è in grado di attraversare efficientemente la barriera emato-encefalica. Inoltre, nei topi trattati abbiamo osservato un miglioramento della neuropatologia sia a livello tissutale che comportamentale. Questi risultati sono la prova che l’ingegnerizzazione della sulfamidasi, con domini che incrementano l’efficienza di secrezione e che permettono l’attraversamento della BBB, è potenzialmente utilizzabile per lo sviluppo di una terapia a bassa invasività per il trattamento della neuropatologia in MPS IIIA. Abbiamo inoltre osservato una certa variabilità di trasduzione nel cervello dei topi trattati con la sulfamidasi chimerica. Quest’osservazione indica che l’attraversamento della barriera ematoencefalica potrebbe essere influenzato non solo dall’efficienza di transcitosi mediata da Apo-BD ma anche dall’espressione dei recettori della BBB, responsabili di tale trasporto. Pertanto, noi stiamo analizzando i recettori di BBB dei topi MPS IIIA trattati e se cambiamenti nella loro espressione possano influenzare l’efficienza di attraversamento della BBB da parte della proteina modificata. Tali studi sono utili per incrementare l’efficacia del nostro approccio terapeutico e aprono nuove prospettive per la terapia genica ed enzimatica sostitutiva sia per MPS IIIA che per altre patologie da accumulo lisosomiale dovute a difetti delle idrolasi lisosomiali.

rischio-beneficio, la disponibilità di misure biochimiche dirette per valutare il beneficio clinico e perchè vi è un numero sufficiente di pazienti arruolabili in uno studio clinico. Pertanto, abbiamo generato dati preclinici per la PH1 utilizzando vettori HDAd per la terapia genica diretta al fegato. Abbiamo dimostrato che una singola iniezione endovenosa di un HDAd esprimente il gene umano AGT, sotto il controllo di una cassetta di espressione fegato-specifica, porta a normalizzazione a lungo termine dell’ escrezione urinaria di ossalato. Inoltre, abbiamo dimostrato che un vettore HDAd esprimente un gene che codifica per un enzima coinvolto nella disintossicazione del gliossilato, risulta nella riduzione dei livelli urinari di ossalato e dei calcoli renali nei topi PH1. In sintesi, i nostri studi supportano l’efficacia della terapia genica per il trattamento della PH1 e mostrano che la diversione metabolica ottenuta mediante overespressione genica è una nuova opzione terapeutica per il trattamento di PH1.

ABSTRACT N. 5 TIGEM - Altre Malattie Genetiche Responsabile

TGM11MT3 410.000

Num Centri: 1

Durata (anni): 5

Durata (anni): 5

Anno d’inizio: 2011

Gambardella Gennaro (1), Pagliarini Roberto (1), di Bernardo Diego (1,2) (1) TIGEM, Via P. Castellino 111, 80131, Napoli, Italy - TIGEM, Via P. Castellino 111, 80131, Napoli, Italy; Tel. 081.6132319; Fax 081.6132351; E-mail: dibernardo@tigem.it (2) Dipartimento Informatica e Sistemistica, Università degli Studi “Federico II”, Napoli, Italy

L’obiettivo di questo progetto è quello di sviluppare e applicare approcci basati sulla biologia dei sistemi per ottenere una comprensione della regolazione genica a livello di sistema trascrizionale, post-trascrizionale e post-traduzionale in tessuti specifici, e di mettere in relazione alla regolazione della funzione metabolica. Reti di regolazione genica saranno computazionalmente ricostruite da dati sperimentali eterogenei di grandi dimensioni, tra cui profili di espressione genica e di microRNA, interazioni proteina-proteina e dati epigenetici. L’obiettivo è quello di individuare le interazioni regolative, includendo la regolazione trascrizionale (fattore di trascrizione-> geni bersaglio), la regolazione post-trascrizionale (microRNA-> mRNA bersaglio) e posttraduzionale (chinase/fosfatasi-> proteine-bersaglio). Questi risultati saranno completati dallo sviluppo di un approccio computazionale per identificare piccole molecole candidate, composti che possono specificamente modulare questi meccanismi, con lo scopo di identificare potenziali trattamenti farmacologici di malattie genetiche. I metodi saranno applicati a due casi di studio: (i) identificazione di meccanismi regolatori specificamente attivi nella retina umana, (ii) identificazione di un modello di rete integrata di regolazione genica e metabolica di epatociti umani per studiare errori innati del metabolismo epatico e di esplorare terapie farmacologiche.

BRUNETTI PIERRI NICOLA

Totale €

500.000

LA BIOLOGIA COMPUTAZIONALE PER LO STUDIO DELLE MALATTIE GENETICHE: IDENTIFICAZIONE DELLA FUNZIONE GENICA E DEL MECCANISMO DI AZIONE DEI FARMACI

TIGEM - Altre Malattie Genetiche Telethon grant N.

TGM11SB1

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 4 Responsabile

DI BERNARDO DIEGO

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2011

TERAPIA GENICA PER LE MALATTIE CONGENITE DEL METABOLISMO EPATICO Castello Raffaele (1), Borzone Roberta (1), d’Aria Stefania (1), Piccolo Pasquale (1), Annunziata Patrizia (1), Brunetti-Pierri Nicola (1,2)

ABSTRACT N. 6

(1) Telethon Institute of Genetics and Medicine - TIGEM, Via P. Castellino 111, 80131 Napoli; Tel. 081 6132361; Fax 081 5609877; E-mail: brunetti@tigem.it (2) Department of Pediatrics, Federico II University of Naples, Italy

TIGEM - Altre Malattie Genetiche Responsabile

I vettori adenovirali helper-dipendenti (HDAd) sono molto interessanti per la terapia genica perché conducono ad espressione a lungo termine di geni terapeutici risultando cosí nella correzione di vari modelli animali di malattie genetiche. Tuttavia, la somministrazione per via sistemica di elevate dosi di vettore, necessaria per un efficiente trasferimento genico al fegato, risulta nell’attivazione di una risposta infiammatoria acuta con conseguenze potenzialmente gravi. In precedenza abbiamo sviluppato un metodo per migliorare l’indice terapeutico di questi vettori che si è dimostrato molto efficace in modelli animali di grandi dimensioni (primati non-umani). Questo approccio comporta l’uso di cateteri a palloncino per la somministrazione dei vettori preferenzialmente all’organo di interesse, ossia al fegato. Sulla base dei livelli di espressione ottenuti, utilizzando basse dosi di vettore, è probabile che si possa ottenere un beneficio clinico per vari difetti congeniti del metabolismo epatico. L’iperossaluria primaria di tipo 1 (PH1), dovuta alla deficienza dell’enzima fegato-specifico alanina: gliossilato aminotransferasi (AGT), è un’eccellente malattia candidata per questo approccio di terapia genica, per il favorevole rapporto

POLISHCHUK ROMAN

Telethon grant N.

TGM11CB4

Totale €

214.000

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2011

PATOGENESI DELLA MALATTIA DI WILSON: I MECCANISMI MOLECOLARI DELLA VEICOLAZIONE DI ATP7B NEL MANTENIMENTO DELL’OMEOSTASI DI RAME Chesi Giancarlo (1), Polishchuk Elena (1), Parashuraman Raman (1,2), Hegde Ramanath (1,2), Iacobacci Simona (1), Concilli Mafalda (1), Di Bernardo Diego (1), Luini Alberto (1,2), Polishchuk Roman (1) (1) Telethon Institute of Genetics and Medicine - Via Pietro Castellino, 111, 80131, Naples, Italy, Tel. +39 081 6132336, Fax +39 081 5609877, E-mail: polish@tigem.it (2) Institute of Protein Biochemistry, CNR, Naples, Italy

38

TELETHON INSTITUTE OF GENETICS AND MEDICINE

Negli ultimi anni, è stato chiaramente dimostrato che diverse malattie genetiche si manifestano a causa di mutazioni geniche. Esse non permettono alla proteina risultante di raggiungere il compartimento intracellulare, all’interno del quale svolgerebbe la propria funzione fisiologica. Uno di questi geni, ATP7B, codifica per una proteina fondamentale per la regolazione dei livelli di Rame (Cu) all’interno dell’organismo. Fisiologicamente, negli epatociti, la proteina ATP7B, appena sintetizzata, viene trasportata ai suoi siti funzionali mediante un sistema di organelli membranosi del “pathway secretorio”. In questi compartimenti, essa ha il compito di rimuovere gli eccessi di Cu proveniente dalla dieta, espellendolo attraverso la membrana delle cellule epatiche all’interno dei dotti biliari.

Mutazioni a carico di ATP7B ostacolano il corretto iter di questa proteina e, di conseguenza, si osserva un forte accumulo di Cu all’interno degli epatociti. Tutto ciò porta all’insorgenza della Malattia di Wilson, la quale è letale (se non opportunamente curata) e si manifesta attraverso anomalie epatiche, neuro degenerazione e disturbi psichiatrici, inclusi depressione e psicosi.

Dal momento che la perdita di funzione dei più frequenti mutanti di ATP7B è causata da una consistente mis-localizzazione nella cellula, ci si aspetterebbe che la correzione del loro traffico e della loro veicolazione agli appropriati compartimenti intracellulari, apporti un beneficio alla stragrande maggioranza dei pazienti affetti da Malattia di Wilson. Ad ogni modo, non si conoscono ancora i meccanismi di trasporto di ATP7B e di come questi ultimi sono influenzati dalle mutazioni a carico di questa proteina.

Di conseguenza, lo scopo del nostro progetto è quello di identificare i meccanismi regolatori coinvolti nel “trafficking” e nella localizzazione di ATP7B, e di determinare la loro importanza nell’insorgenza della Malattia di Wilson. Quindi, grazie alle nostre competenze ed a strumenti tecnologicamente avanzati, presenti sia nel nostro laboratorio che al TIGEM, abbiamo scoperto nuove molecole che potranno essere utilizzate per correggere il trasporto di ATP7B, ergo, per sviluppare nuove strategie per curare la Malattia di Wilson.

ficacia del trasferimento genico mediato da AAV in modelli animali di queste malattie.

Per tutte e tre le malattie vengono utilizzati vettori AAV di tipo 2/8 che si è rivelato essere il sierotipo più efficiente nella trasduzione sia di fotorecettori retinici che di epatociti.

Risultati preliminari mostrano l’enorme potenziale di questo vettore in grado di fornire livelli d’espressione terapeutici e duraturi sia nella terapia genica mirata alla retina che al fegato.

L’obiettivo generale di questo programma è quello di completare gli studi preclinici volti a valutare l’efficacia e la sicurezza del trasferimento genico mediato da AAV necessari per poter applicare il più rapidamente possibile questi progetti in ambito clinico.

Tali indagini includono studi di dose risposta dei vettori AAV in roditori e, laddove disponibili, in grandi modelli animali (gatti MPS VI e maiali), l’ottimizzazione di cassette d’espressione, e il confronto tra vettori AAV a singolo o doppio filamento.

Contemporaneamente, in collaborazione con i Dipartimenti di Oftalmologia e Pediatria dell’Universita “Federico II” di Napoli, stiamo caratterizzando a livello clinico e molecolare un elevato numero di pazienti affetti da LCA4, MPS VI e PH1.

ABSTRACT N. 7

Botta Salvatore (1), Mussolino Claudio (1), Marrocco Elena (1), de Prisco Nicola (1), Giunti Massimo (3), Della Corte Michele (2), Rossi Settimio (2), Bacci Maria Laura (3), Simonelli Francesca (2), Surace Enrico Maria (1)

ABSTRACT N. 8 TIGEM - Altre Malattie Genetiche

TGM11MT6

Totale €

300.000

Num Centri: 3

Durata (anni): 5

TGM11MT2

Totale €

290.000 Durata (anni): 5

Anno d’inizio: 2011

EFFICACIA E SICUREZZA DI REPRESSORI TRASCRIZIONALI UTILIZZATI COME AGENTI TERAPEUTICI PER IL TRATTAMENTO DELLA RETINITE PIGMENTOSA AUTOSOMICA DOMINANTE (ADRP)

AURICCHIO ALBERTO

Telethon grant N.

Telethon grant N. Num Centri: 1

TIGEM - Altre Malattie Genetiche Responsabile

SURACE ENRICO

Responsabile

(1) Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM) - Via Pietro Castellino 111, 80131, Napoli, Tel. 0816132334, E-mail: surace@tigem.it (2) Dept of Ophthalmology, Second University of Naples (3) Dept of Veterinary Morphophysiology and Animal Production (DIMORFIPA), University of Bologna

Anno d’inizio: 2011

VERSO LA SPERIMENTAZIONE CLINICA DI TERAPIE GENICHE AAV-MEDIATE DIRETTE ALLA RETINA E AL FEGATO

Di recente abbiamo descritto un metodo per spegnere l’espressione di un gene malattia che causa Retinite Pigmentosa autosomica dominante (adRP), la rodopsina, tramite l’uso di AAV e fattori di trascrizione artificiali basati sulla tecnologia Zinc Finger. La strategia utilizzata è basata sull’utilizzo di proteine artificiali (repressori trascrizionali artificiali) capaci di legare il DNA di sequenze regolatrici del gene della rodopsina e bloccarne l’espressione. Il sistema fino a ora creato è stato disegnato per superare l’eterogeneità genetica della patologia, in quanto è capace di reprimere entrambi i loci del gene indipendentemente dalla mutazione e, successivamente, sostituire il gene mutato con una copia esogena (repression–replacement strategy). Questa strategia assume un’importanza rilevante poiché nel locus della rodopsina sono state trovate più di 150 differenti mutazioni. Il sistema creato, sebbene efficace, è specifico per sequenze di DNA di rodopsina umana, quindi il suo ulteriore sviluppo e sperimentazione in animali modello.sono difficoltosi. Lo scopo del progetto è di disegnare e testare nuovi repressori trascrizionali artificiali basati sia sulla tecnologia TAL (Transcription ActivatorLike) che su quella Zinc Finger capaci di funzionare in più specie animali, con il fine di caratterizzarne le modalità di azione, la tossicità e l’efficacia in modelli animali di patologie retiniche.

Ferla Rita (1,2), Castello Raffaele (1), Marrocco Elena (1), Claudiani Pamela (1,2), Borzone Roberta (1), Gargiulo Annagiusi (1), Fontanella Bianca (1), Haskins Mark (3), Surace Enrico Maria (1), Brunetti-Pierri Nicola (1,2), Auricchio Alberto (1,2) (1) Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM), via Pietro Castellino 111, Naples, Italy, Tel. 0816132229, Fax 0815790919, E-mail: auricchio@tigem.it (2) Dept. of Pediatrics, “Federico II” University, Naples, Italy (3) Department of Pathobiology, School of Veterinary Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, USA

La terapia genica per il trattamento di malattie ereditarie basata sull’uso di vettori virali adeno-associati (AAV) inizia a raccogliere i primi successi a livello clinico.

Importanti risultati sono stati raggiunti in tre studi clinici indipendenti per il trattamento di una forma ereditaria di cecità infantile (Amaurosi congenita di Leber di tipo 2, LCA2), ad uno dei quali abbiamo dato un importante e diretto contributo, e in uno studio clinico per l’emofilia B basato sulla somministrazione intravascolare di AAV2/8.

Sulla base di questi risultati promettenti e della nostra lunga esperienza nello sviluppo e nell’applicazione pre-clinica di vettori AAV, riteniamo di poter rapidamente traslare in clinica la terapia genica basata su AAV per tre ideali malattie “target”.

Abbiamo focalizzato la nostra attenzione su LCA di tipo 4 e su due errori congeniti del metabolismo, la mucopolisaccaridosi di tipo VI (MPS VI) e l’iperossaluria primaria di tipo 1.

Queste tre malattie sono ereditate come caratteri recessivi e sono eccellenti candidati per la terapia genica: la LCA4 è una forma di cecità simile a LCA2; la MPS VI è una malattia da accumulo lisosomiale senza coinvolgimento del sistema nervoso centrale; e la PH1 è invece dovuta ad un difetto in un enzima epato-specifico con conseguente accumulo sistemico di un metabolita tossico.

Per queste malattie non vi è attualmente alcun trattamento o, se disponibile, presenta comunque scarsa efficacia. Nei nostri laboratori stiamo o abbiamo recentemente fornito dati preclinici circa l’ef-

ABSTRACT N. 9 TIGEM - Altre Malattie Genetiche Responsabile

BANFI SANDRO

Telethon grant N.

TGM11SB2

Totale €

500.000

Num Centri: 1

Durata (anni): 5

Anno d’inizio: 2011

IDENTIFICAZIONE DI NETWORK GENICI REGOLATI DA microRNA NELLA RETINA UMANA Conte Ivan (1), Karali Marianthi (1), Carrella Sabrina (1), Pizzo Mariateresa (1), Avellino Raffaella (1), Barbato Sara (1), Meola Nicola

39

TELETHON INSTITUTE OF GENETICS AND MEDICINE

(1), Marrocco Elena (1), Surace Enrico Maria (1), Banfi Sandro (1,2)

(2) Dept. of Pediatrics, “Federico II” University, Naples, Italy

Le malattie ereditarie della retina sono causa di cecità in oltre 250.000 persone in Europa. La maggioranza di queste malattie è dovuta a mutazioni in geni espressi nei fotorecettori della retina.

Abbiamo recentemente dimostrato la sicurezza e l’efficacia di un approccio di terapia genica per il trattamento delle malattie ereditarie nella retina di pazienti affetti da amaurosi congenita di Leber (LCA). Uno dei maggiori limiti nell’estendere questo successo clinico ad altre condizioni di cecità è che molte di queste patologie sono causate da mutazioni in geni con una lunga sequenza codificante (>5 kb). Tali geni, infatti, eccedono la capacità di incapsidamento del vettore per terapia genica che è stato finora dimostrato essere il più efficiente nel veicolare il gene ai fotorecettori: il virus Adeno-Associato (AAV). Viceversa, vettori con una più grande capacità di incapsidamento, quali i vettori Lentivirali (LV) o quelli Adenovirali “helper-dependent” (HD-Ad), hanno uno scarso tropismo per i fotorecettori.

Obiettivo del progetto è quello di identificare approcci che consentano di superare il limite di veicolazione di geni di grandi dimensioni ai fotorecettori.

A tale scopo, proponiamo sia di superare il limite di incapsidamento degli AAV che di identificare/modificare vettori LV e HD-Ad per ottenere vettori in grado di trasdurre in maniera più efficiente i fotorecettori. Per espandere la capacità di impacchettamento degli AAV, abbiamo progettato di costruire 2 vettori “split-AAV”, ognuno contenente una metà di un gene di grandi dimensioni, che sono in grado di ricostituire, nel nucleo di una cellula target infettata da entrambi i virus, l’intera cassetta di espressione, tramite concatemerizzazione intermolecolare. In parallelo, testeremo l’efficienza nel trasdurre i fotorecettori di vari pseudotipi lentivirali e sierotipi adenovirali già esistenti. Infine compareremo l’efficienza dei tre tipi di approcci nel trasdurre la retina murina e porcina. La strategia con la maggiore efficienza sarà poi usata per correggere il fenotipo retinico di modelli murini di malattie retiniche ereditarie frequenti dovute a mutazioni in geni di grandi dimensioni.

Il superamento del limite nella veicolazione di grandi geni permetterà di curare malattie frequenti dovute a mutazioni nei fotorecettori per le quali, ad oggi, non esiste trattamento.

(1) Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM), Via Pietro Castellino 111, 80131 Naples, Italy, Tel. +39-0816132228, Fax +39-0815609877, Email: banfi@tigem.it (2) Department of Biochemistry, Biophysics and General Pathology, Second University, Naples

I microRNA (miRNA) sono un gruppo di piccoli RNA non-codificanti che controllano i livelli di espressione dei loro geni bersaglio mediante degradazione del trascritto e/o inibizione della traduzione.

Essi esercitano dei ruoli fondamentali nel differenziamento di molti organi e tessuti e stanno emergendo sia come protagonisti nella patogenesi di malattie umane che come possibili target terapeutici.

Ci proponiamo di fare luce sul ruolo funzionale dei miRNA nella retina, che costituisce il tessuto bersaglio di molte forme di cecità su base ereditaria, a cominciare dalla retinite pigmentosa (RP). Per il raggiungimento di tale obiettivo, stiamo perseguendo in parallelo i seguenti due approcci: 1) Implementazione di algoritmi, basati su analisi di co-espressione, finalizzati alla ricostruzione di network genici regolati da miRNA. In particolare, abbiamo recentemente sviluppato l’algoritmo denominato Co-expression Meta-analysis of miRNA Targets (CoMeTa) che è in grado di predirre in modo efficace le funzioni biologiche di miRNA e di generare un quadro globale dei network genici controllati da ciascun miRNA umano [1].

2) Caratterizzazione dettagliata di alcuni miRNA implicati nella funzione retinica, tra cui i miRNA della famiglia miR-181 e della famiglia miR-204/211. Per quanto concerne quest’ultima, abbiamo precedentemente dimostrato, mediante approcci di guadagno-di-funzione e perdita-di-funzione nell’organismo modello medaka fish [Oryzias latipes (ol)] che l’alterazione dell’attività del miR-204 ha un impatto significativo su molteplici aspetti del differenziamento e funzionalità oculare. Più precisamente, l’ablazione, tramite utilizzo di oligo morfolino, dell’espressione del miR-204 determina l’insorgenza in medaka di un fenotipo oculare aberrante caratterizzato da microftalmia e alterazione della determinazione dell’asse dorso-ventrale che a sua volta determina coloboma oculare [2].

Ulteriori evidenze ora suggeriscono che il miR-204 ha un impatto significativo sullo sviluppo corretto delle proiezioni assonali retiniche e quindi del nervo ottico durante lo sviluppo dell’occhio. Infine, abbiamo verificato, sia in medaka che nel topo, che il miR-204 e il suo paralogo altamente correlato miR-211 (presente a partire dai mammiferi nella scala evolutiva) svolgono un ulteriore ruolo cruciale nella retina. Sono infatti necessari per il corretto differenziamento e sopravvivenza dei fotorecettori. In particolare, abbiamo dimostrato, sia mediante analisi molecolare (immunofluorescenza) che funzionale (elettroretinogramma), che l’inattivazione di questi miRNA determina una notevole riduzione del numero dei coni, uno dei due tipi principali di fotorecettori. Nel complesso, questi dati indicano che i miR-204 e miR-211 sono importanti regolatori della funzione e sviluppo oculare nei vertebrati e possono essere considerati candidati alla patogenesi di malattie oculari umane.

REFERENZE 1. Gennarino VA, D’Angelo G, Dharmalingam G, Fernandez S, Russolillo G, Sanges R, Mutarelli M, Belcastro V, Ballabio A, Verde P, et al: Identification of microRNA-regulated gene networks by expression analysis of target genes. Genome Res 2012.

2. Conte I, Carrella S, Avellino R, Karali M, Marco-Ferreres R, Bovolenta P, Banfi S: miR-204 is required for lens and retinal development via Meis2 targeting. Proc Natl Acad Sci U S A 2010, 107:15491-15496.

ABSTRACT N. 11 TIGEM - Altre Malattie Genetiche Responsabile

TGM11MT1 450.000

Num Centri: 1

Durata (anni): 5

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2011

Parashuman Raman, Hegde Ramanath, Ciciriello Fabiana, Carissimo Anna Maria, Mutarelli Margherita, Di Bernardo Diego, Luini Alberto Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM), via Pietro Castellino 111, Naples, Italy, Tel. +39.081.6132535, Fax +39.081.6132277, E-mail: luini@tigem.it

La fibrosi cistica è causata, nella gran parte dei casi, dall’assenza dalla membrana esterna delle cellule di una proteina chiamata Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator (CFTR). La CFTR è un canale del cloro, la cui assenza reduce appunto i flussi di cloro in uscita dalle cellule dell’ epitelio bronchiale. Questo difetto alla fine conduce ad un ispessimento del muco che ricopre i bronchi. Il muco troppo denso non viene rimosso efficientemente dalle cellule bronchiali, e finisce col causare l’insediamento locale di batteri e quindi il verificarsi di frequenti infezioni broncopolmonari, che sono poi spesso la causa dei sintomi più gravi. Sul piano molecolare, la maggioranza dei pazienti di fibrosi cistica esprime una forma mutante della proteina CFTR. Questa proteina mutante potrebbe funzionare come canale del cloro ma non è capace di uscire dal compartimento cellulare in cui è sintetizzata (il reticolo endoplasmico) e viene riconosciuta da meccanismi di controllo di qualità che portano alla sua degradazione appunto nel reticolo. Noi studiamo i meccanismi molecolari che eseguono tale controllo e conducono alla degradazione di CFTR. Nel corso dell’ ultimo anno abbiamo definito alcuni di questi meccanismi e identificato al loro interno alcune componenti che possano servire da bersaglio farmacologico. Abbiamo infine usato farmaci o profarmaci capaci di colpire tali bersagli e abbiamo in tal modo indotto l’inibizione di degradazione della CFTR e un recupero parziale, ma superiore a quello prodotto dai trattamenti finora sperimentati, della capacità di CFTR di raggiungere la membrane cellulare esterna.

AURICCHIO ALBERTO

Totale €

229.100

SVILUPPO DI UN APPROCCIO RAZIONALE ALLA CORREZIONE DEL DIFETTO DI TRAFFICO DI D508-CFTR

TIGEM - Altre Malattie Genetiche Telethon grant N.

TGM11CB5

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 10 Responsabile

LUINI ALBERTO

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2011

SUPERARE I LIMITI DEL TRASFERIMENTO ALLA RETINA DI GENI DI GRANDI DIMENSIONI PER LA CURA DI MALATTIE EREDITARIE A CARICO DEI FOTORECETTORI Trapani Ivana (1), Colella Pasqualina (1), Puppo Agostina (1), Bartolomeo Rosa (1), Sommella Andrea (1), Iodice Carolina (1), Cesi Giulia (1), De Simone Sonia (1), Auricchio Alberto (1,2) (1) Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM), via Pietro Castellino 111, Naples, Italy, Tel. 0816132229, Fax 0815790919, E-mail: auricchio@tigem.it

40

TELETHON INSTITUTE OF GENETICS AND MEDICINE

ABSTRACT N. 12

venienti da diversi gruppi di ricerca hanno evidenziato il ruolo delle ciglia nella trasduzione di diverse molecole segnale. La disfunzione di queste strutture ciliate è stata associata a numerose malattie genetiche inclusa la sindrome Oro-facio-digital type I (OFDI).

Ad oggi sono state identificate migliaia di proteine potenzialmente coinvolte nelle funzioni ciliari. Dati sperimentali indicano un ruolo per queste strutture nella regolazione della trasduzione di diverse molecule segnale inclusa quella necessaria per il funzionamento di Sonic Hedgehog (Shh). Tuttavia, molto rimane ancora da essere determinato circa la biologia e la funzione di queste complesse strutture cellulari che stanno acquisendo un’importanza sempre maggiore nella ricerca biomedica. OFD1 codifica per una proteina localizzata al centrosoma/corpo basale che riveste un ruolo molto importante nella formazione delle ciglia. Abbiamo utilizzato un’approccio di “system biology” per ottenere una preliminare caratterizzazione delle proteine che costituiscono il complesso Cilia/Centrosome Complex. Quest’analisi ha evidenziato che OFD1 è fortemente connesso ai componenti del complesso del proteosoma. Inoltre, esperimenti di spettrometria di massa hanno identificato come possibili interattori di OFD1 diversi membri della componente 19S del complesso del proteasome 26S. Abbiamo ipotizzato che OFD1 potesse mediare la degradazione proteica attraverso l’attività del proteasoma.

I nostri esperimenti hanno dimostrato che la difettiva degradazione proteasomale porta ad accumulo di componenti del pathway di Shh in modelli deficitari per Ofd1. Inoltre, modelli deficitari per Ofd1 mostrano anche aumentati livelli di componenti dei pathways di Notch, Wnt and NF-kB. Utilizzando un’approccio biochimico abbiamo dimostrato che: a) la perdita di OFD1 altera la degradazione dei bersagli protesomali ubiquitin-dipendenti ed independenti; b) OFD1 interagisce con subunità proteasomali e c) la perdita di OFD1 porta ad uno svuotamento delle subunità regolatorie dalla porzione centrosomale.

Infine in collaborazione con il gruppo del Prof Katsanis abbiamo dimostrato che anche mutanti per una diversa ciliopatia, la malattia di Bardet-Biedl (BBS), mostrano difetti della degradazione proteasomale. In accordo con questi risultati abbiamo ottenuto un miglioramento dei difetti mediate dai signalling di Notch e Wnt in modelli in vivo deficitari per Ofd1 e BBS tramite perturbazione dell’espressione di subunità del proteasoma. I nostri risultati indicano che la regolazione del corpo basale è un meccanismo di regolazione del segnale paracrine e suggeriscono possibili effetti benefici per i pazienti mediante modulazione del protasoma.

TIGEM - Altre Malattie Genetiche Responsabile

DE MATTEIS MARIA ANTONIETTA

Telethon grant N.

TGM11CB1

Totale €

300.000

Num Centri: 1

Durata (anni): 5

Anno d’inizio: 2011

DEFINIZIONE DEI MECCANISMI MOLECOLARI ALLA BASE DELLE DISFUNZIONI DELLA VIA ENDOCITICA INDOTTE DA MUTAZIONI DEI GENI OCRL E CLC5 ALLO SCOPO DI IDENTIFICARE CORRETTORI FARMACOLOGICI PER LA SINDROME DI LOWE E PER LA MALATTIA DI DENT Vicinanza Mariella (1), De Leo Giovanna (1), Santoro Michele (1), Marzolo MariaPaz (2), Levtchenko Elena (3), Di Campli Antonella (4), De Matteis Maria Antonietta (1) (1) Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM), via P. Castellino 111, Naples, Italy, Tel. 081.6132220, E-mail: dematteis@tigem.it (2) Department of Cellular and Molecular Biology, Facultad de Ciencias Biológicas, Pontificia Universidad Católica de Chile, Santiago, Chile (3) Department of Paediatrics, University Hospitals Leuven, Leuven, Belgium (4) IBP, CNR, Naples

La sindrome di Lowe è una rara malattia genetica che colpisce prevalentemente i maschi e che è caratterizzata da cataratta congenita, ipotonia muscolare, ritardo mentale e sindrome renale di Fanconi. Nella sindrome di Fanconi proteine, nutrienti e sali, inclusi il fosfato e i bicarbonati, vengono persi con le urine anziché essere riassorbiti dalle cellule del tubulo prossimale renale. Le conseguenze a livello sistemico sono acidosi e segni di deficit di vitamina D fino al rachitismo. L’aspettativa di vita si aggira in media intorno ai trent’anni e la principale causa di morte è rappresentata da insufficienza renale terminale. La malattia di Dent (anche nota come nefrocalcinosi e nefrolitiasi legata alla X) ha in comune con la sindrome di Lowe la sindrome di Fanconi mentre non presenta né segni cerebrali né oculari. Una buona frazione dei pazienti va incontro a insufficienza dopo i trent’anni. Non esiste trattamento specifico né per la sindrome di Lowe, né per la malattia di Dent. Mutazioni del gene OCRL possono causare sia la sindrome di Lowe che la malattia di Dent (Dent2) mentre mutazioni nel gene CLCN5 causano la malattia di Dent (Dent1). Il prodotto del gene OCRL è un enzima che agisce su importanti componenti della membrane cellulari, i fosfoinositidi mentre il prodotto di CLCN5 è un canale del cloro.

I meccanismi attraverso i quali mutazioni di OCRL e ClCN5 portano al malfunzionamento delle cellule del tubulo prossimale renale non sono noti e la loro comprensione rappresenta l’obiettivo principale del nostro progetto. L’obiettivo finale è di impiegare la comprensione di tali meccanismi per individuare correttori farmacologici del difetto cellulare indotto dalla deplezione dei prodotti dei due geni, i composti attivi saranno testati sul modello murino di tubulopatia indotto dalla deplezione del gene OCRL. È questo un passo importante per lo sviluppo di trattementi farmacologici per la sindrome di Lowe e la malattia di Dent.

ABSTRACT N. 14 TIGEM - Altre Malattie Genetiche Responsabile

TGM11CB3 284.100

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Durata (anni): 5

Anno d’inizio: 2011

Venditti Rossella (1), Zappa Francesca (1), Santoro Michele (1), Zelante Leopoldo (2), Malhotra Vivek (3), Vertel Barbara (4), De Matteis Maria Antonietta (1) (1) Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM), via Pietro Castellino 111, Naples, Italy, Tel. 081.6132220, E-mail: dematteis@tigem.it (2) Medical Genetics Unit, IRCCS Casa Sollievo della Sofferenza, San Giovanni Rotondo, Foggia, Italy (3) Department of Cell and Developmental Biology, Centre de Regulacio Genomica, Barcelona, Spain and Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA), Barcelona, Spain (4) Department of Cell Biology and Anatomy, Rosalind Franklin University of Medicine and Science, North Chicago, Illinois, USA

FRANCO BRUNELLA

Totale €

300.000

DEFINIZIONE DELLE BASI MOLECOLARI E CELLULARI DELLA DISPLASIA SPONDILOEPIFISIARIA TARDA E IDENTIFICAZIONE DI TARGET PER L’INTERVENTO FARMACOLOGICO

TIGEM - Altre Malattie Genetiche Telethon grant N.

TGM11CB2

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 13 Responsabile

DE MATTEIS MARIA ANTONIETTA

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2011

RUOLO DELLA PROTEINA OFD1 NELLA DEGRADAZIONE A CARICO DEL PROTEASOMA

La displasia spondiloepifisaria tarda (SEDT) è una malattia genetica legata al cromosoma X che si manifesta con bassa statura, collo e tronco corti, torace a botte e segni precoci di artrite. I sintomi compaiono dopo i dieci anni, durante la fase di massima crescita. La malattia è causata da mutazioni del gene SEDL che si trova sul cromosoma X. Attualmente non esiste alcuna terapia specifica per questa malattia.

La SEDT è legata ad una difettosa deposizione della matrice cartilaginea ad opera dei condrociti (le cellule che sono deputate alla secrezione di questa matrice) e ad un conseguente alterato sviluppo osseo. Ad oggi la funzione di SEDL non è nota e non si conosce il meccanismo con cui mutazioni di SEDL causano la malattia: questo rappresenta il principale obiettivo del nostro progetto. Abbiamo ottenuto importanti risultati che indicano che SEDL controlla la secre-

Morleo Manuela (1), Liu Yangfan P (2), Massa Filomena (1), Amato Roberto (1), Oh Edwin (2), Tsai I-Chun (2), Lee Byung-Hoon (3), Finley Daniel (3), Di Bernardo Diego (1), Katsanis Nicholas (2), Franco Brunella (1,4) (1) Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM), via Pietro Castellino 111, Naples, Italy, Tel. 0816132207; E-mail: franco@tigem.it (2) Center for Human Disease Modeling, Durham, USA (3) Department of Cell Biology, Harvard Medical School, Boston (4) Department of Pediatrics Federico II University, Naples

Le ciglia sono organelli che protrudono dalla superfice di quasi tutte le cellule in mammiferi. Hanno una struttura microtubulare e svolgono funzioni sensoriali e di motilità all’interno della cellula. Dati pro-

41

SAN RAFFAELE TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY

zione di uno dei maggiori costituenti della matrice cartilaginea, ossia il procollageno di tipo II. In questo progetto proponiamo di studiare il ruolo cellulare di SEDL anche grazie ad uno studio comparato delle disfunzioni causate dalla deplezione di SEDL in cellule di mammifero e dell’omologo di SEDL nel lievito. Un importante obiettivo del progetto è quello di identificare possibili bersagli farmacologici o composti attivi nel “correggere” i difetti di secrezione del procollageno di tipo II indotti dalla deplezione di SEDL. Tale identificazione si baserà su uno screening di collezioni di molecole farmacologicamente attive utilizzando il saggio della secrezione del procollageno. I composti attivi verranno saggiati su un modello animale, la cui messa a punto rappresenta un altro obiettivo del progetto

di preB1 nei pazienti non trattati, che viene corretto dopo terapia con PEG-ADA o HSC-GT. Abbiamo osservato un accumulo di cellule transizionali in periferia nei pazienti PEG-ADA, il quale viene progressivamente normalizzato dopo HSC-GT. Il vantaggio selettivo per le cellule trasdotte è stato osservato nella transizione dallo stadio da immature a cellule naïve in periferia. Per valutare se l’assenza di ADA alteri la tolleranza mediata dalle cellule B, abbiamo testato la reattività di anticorpi ricombinanti isolati da singole cellule B isolate da pazienti ADA-SCID prima e dopo HSC-GT. Nei campioni pre-terapia genica le cellule B contenevano cloni ANA-positivi e più autoreattivi. Questo è il primo indice di difetto nei punti di controllo della tolleranza centrale e periferica. Sorprendentemente, dopo HSCGT i pazienti ADA-SCID presentavano uno sviluppo della tolleranza quasi-normale. I pazienti trattati con PEG-ADA mostrano incapacità delle cellule B di proliferare dopo stimulazione BCR / TLR mediata, la quale viene normalizzata dopo terapia genica.

Nel complesso, i nostri dati indicano che l’adenosina deaminasi svolge un ruolo essenziale nel controllo dell’eliminazione delle cellule B autoreattive, attraverso la regolazione delle funzioni del BCR e TLR. Inoltre, i nostri risultati confermano l’efficacia della terapia genica nel ripristino della tolleranza e della funzionalità delle cellule B.

SAN RAFFAELE TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY ABSTRACT N. 15 HSR-TIGET - Altre Malattie Genetiche Responsabile

AIUTI ALESSANDRO

Telethon grant N.

TGT11A01

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 16

576.800 Durata (anni): 5

HSR-TIGET - Altre Malattie Genetiche

Anno d’inizio: 2011

Responsabile

LA PERDITA DEI MECCANISMI DI TOLLERANZA CENTRALE E PERIFERICA È RESPONSABILE DELLE MANIFESTAZIONI AUTOIMMUNE NELL’ADA-SCID

AIUTI ALESSANDRO

Telethon grant N.

TGTGSK03

Totale €

1.755.700

Num Centri: 1

Durata (anni): -

Anno d’inizio: 2011

TRIAL CLINICO DI TERAPIA GENICA CON CELLULE EMATOPOIETICHE STAMINALI PER IL TRATTAMENTO DELLA SINDROME DI WISKOTT-ALDRICH

Sauer Aisha V (1), Brigida Immacolata (1), Carriglio Nicola (1,2), Jofra Hernandez Raisa (1), Giannelli Stefania (1), Ferrua Francesca (3), Di Lorenzo Biagio (1), Sanvito Francesca (4), Poliani Pietro L (5), Traggiai Elisabetta (6), Carlucci Filippo (7), Van der Burg Mirjam (8), Meffre Eric (9), Aiuti Alessandro (1,2)

Scaramuzza Samantha (1), Biasco Luca (1), Ferrua Francesca (2), Cicalese Maria Pia (2), Giannelli Stefania (1), Castiello Maria Carmina (1,3), Evangelio Costanza (2), Assanelli Andrea (2), Casiraghi Miriam (2), Bosticardo Marita (1), Rizzardi Paolo (4), Finocchi Andrea (5), Metin Ayse (6), Banerjee Pinaki P (7), Orange Jordan S (7), Biffi Alessandra (1,2), Villa Anna (1,8), Ciceri Fabio (9), Roncarolo Maria Grazia (1,2,3), Naldini Luigi (1,3), Aiuti Alessandro (1,2,5)

(1) Telethon Institute for Gene Therapy (HSR-TIGET), Via Olgettina 58, Milan, Italy; Tel. 02.26434435, E-mail: a.aiuti@hsr.it (2) University of Rome “Tor Vergata”, Rome, Italy (3) Pediatric Immunohematology and Bone Marrow Transplantation Unit, San Raffaele Scientific Institute, Milano, Italy (4) Pathology Unit, Department of Oncology, San Raffaele H Scientific Institute, Milan, Italy (5) Department of Pathology, University of Brescia, Brescia, Italy (6) Second Division of Pediatrics, IRCCS, Institute G. Gaslini, Genova, Italy (7) Department of Internal Medicine, Endocrine-Metabolic Sciences and Biochemistry, University of Siena, Italy (8) Department of Immunology, Erasmus MC, University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands (9) Department of Immunobiology, Yale University School of Medicine, New Haven, USA

(1) San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy (HSR-TIGET), Via Olgettina 58, 20132 Milan, Italy, Tel. +39.02.26434671, Fax +39.02.26434668, Email: alessandro.aiuti@hsr.it (2) Pediatric Immuno-hematology and Bone Marrow Transplant, Scientific Institute HS Raffaele, Milan, Italy (3) Università Vita-Salute San Raffaele, Milan, Italy (4) MolMed SpA, Milan, Italy (5) University of Rome “Tor Vergata”, Rome, Italy (6) Ankara Dispaki Children’s Hospital, Ankara, Turkey (7) Texas Children’s Hospital, Baylor College of Medicine, USA (8) IRGB-CNR, Milan, Italy (9) Hematology and Bone Marrow Scientific Institute HS Raffaele, Milan, Italy

Il deficit di Adenosina Deaminasi (ADA-SCID) è caratterizzato da una compromissione nello sviluppo e nella funzione linfocitaria, e dà danno sistemico d’organo dovuto all’accumulo di metaboliti tossici. I pazienti con esordio tardivo della malattia o curati con terapia enzimatica sostitutiva (PEG-ADA) possono manifestare disregolazioni immunitarie, e di recente queste sono state osservate dopo terapia genica. Il nostro obiettivo è acquisire nuove informazioni sulle manifestazioni autoimmuni per l’ADA-SCID e determinare la capacità dei diversi trattamenti nel correggerne il difetto.

L’adenosina agisce come mediatore antinfiammatorio del sistema immunitario ed è importante nella regolazione della soppressione mediata dalle cellule T-regolatorie (Treg). Il nostro studio ha dimostrato che l’adenosina accumulatasi in assenza di ADA e il suo turnover eccessivo in presenza di PEG-ADA, interferiscono con la funzionalità delle Treg. Le Treg isolate dai pazienti trattati con PEG-ADA sono presenti in numero ridotto e hanno un’attività soppressiva molto bassa se paragonate ai pazienti trattati con terapia genica, in cui sono corrette. I topi trattati con PEG-ADA sviluppano autoanticorpi multipli e ipotiroidismo, a differenza dei topi trattati con trapianto di midollo osseo o con terapia genica. Le Tregs isolate dai topi sottoposti a terapia con PEG-ADA perdono l’attività soppressiva, evidenziando come questo trattamento interferisca con la funzionalità delle Treg. L’osservazione di una perdita di funzione nelle Tregs difettive per ADA fornisce nuovi elementi per comprendere la predisposizione all’autoimmunità e i meccanismi che contribuiscono ad un difetto di tolleranza periferica nell’ADA-SCID. Abbiamo quindi studiato se lo sviluppo e la funzione dei linfociti B con deficit di ADA avvengano correttamente. Una caratterizzazione approfondita dello sviluppo dei linfociti B nel midollo osseo nei pazienti ADA-SCID ha dimostrato la presenza di un blocco nello stadio

La Sindrome di Wiskott-Aldrich (WAS) è una immunodeficienza legata al cromosoma X caratterizzata da trombocitopenia, infezioni ricorrenti, autoimmunità e un rischio maggiore per lo sviluppo di linfomi. Nei pazienti che non hanno un donatore HLA-identico per un trapianto di cellule ematopoietiche staminali/progenitori (HSPC), il trapianto allogenico da donatori non correlati e la terapia genica (TG) basata sull’uso di vettori gamma-retrovirali si sono dimostrati trattamenti efficaci. Questi benefici però sono limitatati da possibili complicazioni legate al trapianto o da una possibile genotossicità del vettore nel caso della TG. Abbiamo adottato un nuovo approccio di TG nelle HSPC, basato sull’uso di vettori lentivirali auto-inattivanti (LV) che esprimono la proteina WAS sotto il controllo del promotore endogeno, in combinazione con un regime di condizionamento a bassa intensità (anti-CD20, busulfano e fludarabina). Tre pazienti sono stati trattati con cellule CD34+ autologhe isolate dal midollo osseo (BM) e trasdotte con un vettore altamente purificato. Il primo paziente ha anche ricevuto HSPC trasdotte purificate da sangue periferico dopo mobilizzazione per raggiungere una dose di CD34+ adeguata. La trasduzione dei progenitori clonogenici è risultata molto efficiente (94.3 ± 5.3%), con un numero medio di copie di vettore integrate (VCN) per genoma nelle CD34+ in coltura di 2.1 ± 0.6.

Abbiamo quindi analizzato l’attecchimento delle cellule trasdotte nel BM e nel sangue periferico (PB) e le funzioni immunologiche nei pazienti trattati. Ad 1-1.5 anni dal trattamento è stato possibile misurare un buon attecchimento delle cellule trasdotte nel PB e nel BM. I test molecolari mostrano la presenza delle cellule geneticamente

42

SAN RAFFAELE TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY

modificate nei progenitori clonogenici (25-50%) e nelle linee mieloidi purificate dal BM (intervallo di VCN: 0.29-0.78), oltre che nei granulociti (VCN: 0.56±0.15) e nei linfociti isolati dal PB (VCN: 1.05-2.29). L’espressione della proteina WAS è presente nelle piastrine, nei monociti e, a livelli più elevati, nei linfociti, come evidenziato dall’analisi citofluorimetrica delle popolazioni del PB. La proliferazione dopo stimolazione con anti-CD3, l’attività citotossica delle NK, la formazione della sinapsi immunologica e la capacità soppressiva delle Treg normalizzano dopo TG. Tutti i pazienti sono in buone condizioni cliniche, indipendenti da trasfusione di piastrine, e non mostrano eczema ed infezioni severe. Il sequenziamento high-throughput per i siti di integrazione del vettore dopo TG mostrano una ematopoiesi altamente policlonale. Inoltre, abbiamo potuto paragonare direttamente il profilo di inserzione dei vettori lentivirale e retrovirale nelle cellule di pazienti trattati con terapia genica per lo stessa malattia. Tale analisi ha evidenziato differenze significative nella distribuzione genomica delle inserzioni dei vettori tra i 2 trial clinici, dimostrando che la TG con vettore LV non induce selezione in vivo di integrazioni vicino a geni tumorali o espansioni clonali aberranti. I dati clinici (1.4-2.4 anni dalla terapia genica) e i dati derivanti dall’analisi di altri parametri di sicurezza sono coerenti con un protocollo di terapia genica sicuro. In conclusione, la terapia genica con LV per le HSPC rappresenta una nuova alternativa per il trattamento della Sindrome di Wiskott-Aldrich e plausibilmente per altre malattie genetiche ematologiche.

IFN-alfa e un’aumentata espressione di tre geni relativi all’IFN-alfa e cinque geni indotti dal gruppo di IFN di tipo I rispetto ai soggetti sani di pari età. In linea con osservazioni precedenti nei pazienti LES, abbiamo trovato una ridotta frequenza di cellule pDC nei PBMC di 15 pazienti WAS pediatrici rispetto ai soggetti sani. Successivamente abbiamo valutato la capacità delle pDC di produrre IFN-alfa in risposta ad un agonista del TLR9 trovando che la produzione relativa di IFN-alfa era significativamente maggiore nei pazienti WAS rispetto ai soggetti sani. Nel complesso, tali dati sostengono fortemente la conclusione che l’asse pDC/IFN-alfa potrebbe essere alterata nei pazienti WAS e che elevati livelli di IFN di tipo I possono contribuire alla patogenesi delle manifestazioni autoimmuni.

ABSTRACT N. 17

Marrella Veronica (1), Poliani Luigi (2), Fontana Elena (2), Grassi Fabio (3), Villa Anna (1,4)

ABSTRACT N. 18 HSR-TIGET - Altre Malattie Genetiche Responsabile

VILLA ANNA

Telethon grant N.

TGT11A02

Totale € Num Centri: 1

512.600 Durata (anni): 5

Anno d’inizio: 2011

RICOSTITUZIONE TIMICA E PERIFERICA NEL MODELLO MURINO DELLA SINDROME DI OMENN DOPO TRATTAMENTO CON ANTI-CD3E

(1) San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy (HSR-TIGET), - Via Olgettina 58, Milan, Italy, Tel. 0226435273, E-mail: anna.villa@hsr.it (2) Pathology Department, University of Brescia (3) IRB, Bellinzona, Switzerland (4) IRGB, Milan Unit, CNR

533.700 Durata (anni): 5

TGT11A03

Totale € Num Centri: 1

HSR-TIGET - Altre Malattie Genetiche Responsabile

VILLA ANNA

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2011

MECCANISMI CELLULARI E MOLECOLARI ALLA BASE DELL’AUTOIMMUNITÀ NELLA SINDROME DI WISKOTT ALDRICH

La sindrome di Omenn è una immunodeficenza primaria atipica, caratterizzata da manifestazioni di tipo autoimmune. La creazione di un modello murino portatore di una mutazione già descritta nei pazienti, rappresenta uno strumento importante per capire a fondo le basi molecolari e cellulari della patologia e per testare apporci terapeutici alternativi per i pazienti, la cui unica cura è il trapianto da donatore genotipicamente identico. La ridotta attività ricombinasica riduce l’espressione del complesso recettoriale dei precursori delle cellule T nei timociti immaturi impedendo il normale sviluppo della componente epiteliale timica. La midollare timica gioca un ruolo fondamentale nello stabilire e nel mantenere la tolleranza centrale eliminando le cellule autoreattive e permettendo lo sviluppo delle cellule T regolatorie.

I topi Rag2R229Q hanno una profonda disorganizzazione nell’architettura del timo e una ridotta espressione di Aire che ha un ruolo importante nella selezione timica. Queste alterazioni, descritte anche nei pazienti, suggeriscono che i difetti del timo insieme con la ridotta attività di Rag siano responsabili della fuga di cloni autoreattivi che causano un danno d’organo periferico. Abbiamo analizzato in dettaglio il difetto epiteliale timico nei topi Rag2R229Q mediante analisi FACS e real-time PCR mostrando che il coompartimento midollare è gravemente compromesso, con un difetto evidente nella maturazione che può giustificare la ridotta espressione a livello di mRNA di Aire e degli antigeni tessuto-specifici.

Poiché il trattamento con l’anticorpo monoclonale anti-CD3epsilon è noto per promuovere l’espansione del timo e indurre maturazione della midollare in topi Rag2-/-, abbiamo studiato la sua efficacia nel modello murino Rag2R229Q per indagare l’importanza del “dialogo” tra timociti e cellule epiteliali nel prevenire l’autoimmunità. Abbiamo trattato Rag2R229Q tre giorni dopo la nascita con due dosi di antiCD3epsilon e abbiamo analizzato l’effetto della somministrazione sul timo e in periferia dopo due mesi. Abbiamo osservato un miglioramento significativo nella componente epiteliale timica con chiara maturazione della midollare anche se l’espressione AIRE non è stata indotta dal trattamento. Le cellule T periferiche hanno rivelato una riduzione dell’espressione di marcatori di attivazione, una ridotta capacità di produrre citochine pro-infiammatorie e una ridotta capacità di infiltrazione. Infatti gli organi bersaglio sono privi di infiltrati linfocitari e ciò porta a un miglioramento generale del quadro patologico. Questi risultati indicano che un miglioramento della componente epiteliale timica può prevenire il comportamento patologico delle cellule con difetto Rag, fornendo un’importante prova per eventuali applicazioni cliniche del trattamento con anti-CD3epsilon in forme di immunodeficienza severa combinata (SCID) caratterizzate da scarsa funzione timica e da autoimmunità.

Castiello Maria Carmina (1,2), Catucci Marco (1), Pala Francesca (1), Prete Francesca (3), Benvenuti Federica (3), van der Burg Mirjam (4), Meffre Eric (5), Bosticardo Marita (1), Villa Anna (1,6) (1) San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy (HSR-TIGET), - Via Olgettina 58, Milan, Italy, Tel. 0226435273, E-mail: anna.villa@hsr.it (2) Vita-Salute San Raffaele University, Milan, Italy (3) International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology, Padriciano 99, 34149, Trieste, Italy (4) Department of Immunology, Erasmus MC, University Medical Center Rotterdam, Rotterdam, The Netherlands (5) Department of Immunobiology, Yale University School of Medicine, New Haven, CT, USA (6) IRGB, Milan Unit, CNR

La sindrome di Wiskott-Aldrich (WAS) è un’immunodeficienza primaria legata al cromosoma X ed è causata da mutazioni che interessano il gene codificante la proteina WAS (WASp), un regolatore della riorganizzazione del citoscheletro coinvolto anche nella trasduzione dei segnali nelle cellule ematopoietiche. WAS è caratterizzata da micro-trombocitopenia, eczema, infezioni e un’elevata incidenza di autoimmunità e tumori. I meccanismi alla base della comparsa delle manifestazioni autoimmuni non sono stati ancora chiaramente descritti. Pertanto, dato il ruolo svolto dalle cellule B nella patogenesi delle malattie autoimmuni, abbiamo studiato lo sviluppo di tali cellule in una coorte di 22 pazienti pediatrici affetti da WAS. In tutti i pazienti analizzati, la sottopopolazione di cellule B transizionali è espansa, come osservato in altre condizioni di immunodeficienza o in altre malattie autoimmuni. Il maggiore utilizzo del gene J-kappa 5 da parte delle cellule B transizionali dei pazienti WAS suggerisce che il processo di editing del recettore non è adeguatamente regolato durante lo sviluppo di cellule B. Abbiamo anche trovato un’aumentata frequenza delle cellule B CD21low. È stata notata una bassa espressione del recettore per il complemento di tipo 1, che potrebbe contribuire ad uno stato infiammatorio cronico favorendo un difetto di tolleranza periferica. Infine, i pazienti WAS presentano un difetto nella maturazione delle cellule B di memoria, una riduzione della proliferazione in vivo e delle mutazioni somatiche. I nostri dati indicano che la deficienza di WASp incide sulle fasi cruciali della differenziazione delle cellule B a livello centrale e periferico così da pregiudicare la risposta immunitaria umorale e favorire la presenza di popolazioni di cellule B autoreattive nei pazienti WAS. Abbiamo in seguito analizzato la cellule dendritiche plasmacitoidi (pDC) che in diverse malattie autoimmuni contribuiscono al difetto di tolleranza.

Le pDC isolate mostrano una maggiore induzione di produzione di

43

SAN RAFFAELE TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY

ABSTRACT N. 19

ABSTRACT N. 20

HSR-TIGET - Altre Malattie Genetiche

HSR-TIGET - Altre Malattie Genetiche

Responsabile

BACCHETTA ROSA

Responsabile

Telethon grant N.

TGT11A04

Telethon grant N.

TGTGSK02

Totale €

946.000

Totale €

1.557.300

Num Centri: 1

Durata (anni): 5

Anno d’inizio: 2011

Num Centri: 1

BIFFI ALESSANDRA

Durata (anni): -

Anno d’inizio: 2011

TERAPIA GENICA E CELLULARE PER LA SINDROME IPEX E SIMILI PATOLOGIE (IPEX-LIKE) CON IMMUNODISREGOLAZIONE FOXP3-INDIPENDENTE

PROTOCOLLO CLINICO DI FASE I/II DI TERAPIA GENICA CON CELLULE STAMINALI EMATOPOIETICHE PER IL TRATTAMENTO DELLA LEUCODISTROFIA METACROMATICA

Passerini Laura (1), Santoni de Sio Francesca (1), Barzaghi Federica (1), Rossi Mel Eva (1,2), Sartirana Claudia (1), Gizzi Maria Concetta (1,7), Levings Megan K. (3), Lampasona Vito (4), Bosi Emanuele (5,6,7), Naldini Luigi (1,7), Roncarolo Maria G. (1,7), Bacchetta Rosa (1)

Montini Eugenio (1), Lorioli Laura (1,2,3,4), Cesani Martina (1), Fumagalli Francesca (2,5), Plati Tiziana (1), Martino Sabata (5), Baldoli Cristina (7), Calabria Andrea (1), Canale Sabrina (2), Benedicenti Fabrizio (1), Vallanti Giuliana (8), Biasco Luca (1), Leo Simone (9), Kabbara Nabil (10), Zanetti Gianluigi (9), Rizzo William B. (11), Metha Nalini AL. (12), Cicalese Maria PIa (2,3), Casiraghi Miriam (2), Boelens Jaap J (13), Del Carro Ubaldo (5), Dow David J (12), Schmidt Manfred (14), Di Serio Clelia (4), Stupka Elia (15), Von Kalle Christof (14), Bordignon Claudio (4,8), Ciceri Fabio (3,16), Rovelli Attilio (17), Roncarolo Maria Grazia (1,2,3,4), Aiuti Alessandro (1,2,3,18), Sessa Maria (2,5), Naldini Luigi (1,4), Biffi Alessandra (1,2,3)

(1) San Raffaele Telthon Institute for Gene Therapy, San Raffaele Scientific Institute, Via Olgettina 58, 20132, Milan, Italy, Tel. 02.26434669; Fax 02.26434668; E-mail: rosa.bacchetta@hsr.it (2) University of Rome Torvergata, Rome, Italy (3) University of British Columbia, Vancouver, Canada (4) Center for Translational Genomics and Bioinformatics, San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy (5) Autoimmunity Section, Laboraf, Ospedale San Raffaele, Milan, Italy (6) Diabetes Research Institute, San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy (7) Vita-Salute San Raffaele University, Milan, Italy

(1) San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy (HSR-TIGET), Division of Regenerative Medicine, Stem Cells and Gene Therapy, San Raffaele Scientific Institute, Via Olgettina 58, 20132 Milan, Italy; Tel. 0226434678; Fax 0226434668; E-mail: a.biffi@hsr.it (2) HSR-TIGET Pediatric Clinical Research Unit, San Raffaele Scientific Institute, Milan (3) Pediatric Immunohematology, San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy (4) Vita Salute San Raffaele University, Milan, Italy (5) Neurology Unit, Department of Neurology, San Raffaele Scientific Institute, Milan (6) Neuroradiology Unit, Head and Neck Department, San Raffaele Scientific Institute, Milan (7) Department of Experimental Medicine and Biochemical Sciences, University of Perugia, Perugia, Italy (8) Molmed S.p.A., Milan, Italy (9) Distributed Computing Group, Center for Advanced Studies, Research and Development in Sardinia (CRS4), Pula, Italy (10) Pediatric Hematology Oncology Division, Rafic Hariri University Hospital, Beirut, Lebanon (11) Department of Pediatrics, University of Nebraska Medical Center, Omaha, NE, USA. (12) Molecular and Cellular Technologies, GlaxoSmithKline, Stevenage, United Kingdom (13) Pediatric Blood and Marrow Transplantation Program, UMC Utrecht, Netherland (14) Department of Translational Oncology, National Center for Tumor Diseases and German Cancer Research Center, Heidelberg, Germany (15) Center for Translational Genomics and BioInformatics, San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy (16) Hematology and Bone Marrow Transplant Unit, San Raffaele Scientific Institute (17) Bone Marrow Transplant Unit, MBBM Foundation, Pediatric Department, Milano-Bicocca University at San Gerardo Hospital, Monza, Italy (18) University of Rome Tor Vergata

La sindrome da Immuno-disregolazione, Poliendocrinopatia, Enteropatia, legata alla X (IPEX) è una grave malattia autoimmune dovuta a mutazioni nel gene Forkhead box P3 (FOXP3), un fattore di trascrizione importante per le cellule T regolatorie CD4+CD25+ (Tregs) (Barzaghi, Front Immunol 2012), essenziali per il controllo delle risposte immuni agli autoantigeni. Le mutazioni di FOXP3 causano la disfunzione e l’instabilità delle cellule Tregs e l’aumento delle cellule Th17 (Passerini, JACI 2011). L’unico trattamento curativo è il trapianto di cellule staminali ematopoietiche (HSCT), che non è disponibile per tutti i pazienti. Inoltre, poiché non vi è alcuna chiara correlazione genotipo-fenotipo (Gambineri, JACI 2008), non vi sono indicatori prognostici per la gravità della malattia.

Abbiamo lavorato (i) per sviluppare strategie terapeutiche alternative per IPEX, (ii) per indagare l’eziologia della sindrome IPEX-like, in cui i sintomi IPEX occorrono senza mutazione di FOXP3, e (iii) per identificare biomarcatori della risposta alla terapia e per la diagnosi differenziale di sindromi IPEX e IPEX-like. (i) Abbiamo dimostrato in precedenza che la trasduzione di linfociti T CD4+ umani con lentivirus (LV) codificanti per FOXP3 dà origine a cellule Tregs (Allan, Mol Ther 2008). Per mezzo di LV, abbiamo espresso FOXP3 nelle cellule T isolate da pazienti IPEX. La risultante popolazione CD4FOXP3 esprime marcatori di Treg, è anergica, sopprime la produzione di citochine, e possiede attività soppressiva sia in vitro che in vivo, in un modello di graft-versus-host disease xenogenica. Questi risultati indicano che le cellule T effettrici dei pazienti possono essere convertite in Tregs funzionali. Pertanto, il trasferimento del gene FOXP3 è fattibile. (ii) Analizzando lo stato di metilazione della regione demetilata specifica delle Tregs (TSDR), abbiamo dimostrato che nei pazienti IPEXlike il numero delle Tregs periferiche è ridotto (Barzaghi, J Autoimmunity 2012). Ciò dimostra che un difetto quantitativo di Tregs, e non funzionale, potrebbe sostenere l’autoimmunità. (iii) Le proteine da 75kDa USH1C (harmonin) (Kobayashi, Clin Exp Immunol 1998) e quella da 95 kDa villin (Kobayashi, Clin Immunol 2011) sono state individuate come obiettivi di autoanticorpi in IPEX. Abbiamo dimostrato che gli anticorpi anti-harmonin ed, in misura minore, anti-villin (HAA e VAA), misurati mediante LIPS, sono presenti nel siero di tutti i pazienti IPEX, ma assenti negli IPEX-like, fornendo così un marcatore sensibile e specifico di IPEX. Inoltre, HAA e VAA possiedono un valore prognostico rilevante: gli HAA raggiungono il picco durante la fase acuta, al momento d’insorgenza e ricaduta dell’enteropatia, e diminuiscono in remissione e dopo trapianto.

In conclusione, i risultati dei nostri studi aprono la strada ad una diagnosi più precisa e ad approcci terapeutici più razionali per le sindromi IPEX ed IPEX-like, e migliorano la nostra conoscenza della biologia della regolazione immunitaria.

La Leucodistrofia Metacromatica (LDM) è una rara malattia da accumulo lisosomiale, a trasmissione autosomica recessiva, causata dal deficit dell’enzima Arilsolfatasi A (ARSA), e caratterizzata da demielinizzazione e degenerazione dell’intero sistema nervoso, ad esito invariabilmente infausto. Ad oggi, nessun trattamento è in grado di modificare la storia naturale di malattia. Sulla base di dati pre-clinici che hanno dimostrato la sicurezza e l’efficacia della terapia genica con cellule staminali ematopoietiche nel modello animale della LDM, ed in base all’esperienza da noi acquisita rispetto alla storia naturale di malattia, un protocollo clinico basato sul trapianto di cellule staminali ematopoietiche autologhe trasdotte con vettori lentivirali codificanti il cDNA del gene ARSA è stato approvato dalle Autorità Competenti Italiane nel Marzo 2010. Il protocollo clinico prevede l’arruolamento di 6 pazienti LDM affetti dalla forma tardo infantile e 2 affetti dalla forma giovanile precoce, in fase pre- o, limitatamente alle forme giovanili precoci, pauci-sintomatica, con l’obiettivo di fornire loro una ragionevole aspettativa di beneficio clinico. Obiettivi dello studio sono la valutazione della sicurezza del trattamento, correlata sia al regime di condizionamento utilizzato che all’uso di LV, e della sua efficacia tramite la determinazione delle abilità motorie dei pazienti trattati e del loro grado di demielinizzazione a livello del sistema nervoso attraverso le indagini strumentali precedentemente validate. Fino ad ora sette pazienti sono stati arruolati e trattati. Sei

44

SAN RAFFAELE TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY

di loro, con storia biochimica, molecolare e familiare compatibile con la diagnosi di LDM tardo infantile, sono stati trattati in fase presintomatica di malattia. Un solo paziente, affetto dalla forma giovanile precoce, è stato trattato in fase sintomatica precoce. Ad oggi riportiamo in tutti i pazienti trattati un buon esito della procedura in termini trapiantologici con ricostituzione dell’attività midollare, e la sicurezza a breve/medio termine del protocollo di condizionamento e del trasferimento genico. Inoltre, è stata documentata una elevata efficienza di trasferimento genico nelle cellule staminali e nella loro progenie differenziata; ciò ha determinato una ricostituzione dell’attività ARSA a livelli sovra-fisiologici sia nel sistema ematopoietico che nel liquor cefalorachidiano, quest’ultima documentata nei primi tre pazienti. Questi risultati sono associati ad un’evidenza di beneficio clinico. In particolare, il follow-up dei primi tre pazienti trattati effettuato dopo l’esordio stimato dei sintomi (definito in relazione all’esordio nei rispettivi fratelli affetti), non ha evidenziato la comparsa/progressione dei sintomi di malattia; tutti e tre i pazienti presentano continue acquisizioni cognitive e motorie, in contrasto con l’evoluzione attesa in base alla storia naturale e familiare di malattia, con una normale qualità di vita. Questi dati sono estremamente incoraggianti, sebbene solo il follow-up a lungo termine di tutti i pazienti trattati potrà confermare queste favorevoli indicazioni preliminari.

blativi caratterizzati da un differente profilo di tossicità e di distribuzione. Studiando animali sani o affetti da LDM, a tempi diversi dall’HCT, abbiamo dimostrato che una frazione delle cellule staminali ematopoietiche trapiantate migra a breve termine all’interno del SNC, indipendentemente dalla somministrazione di un regime preparativo al trapianto. Tuttavia, solo l’utilizzo di un regime di condizionamento capace di eliminare i precursori mieloidi residenti nel SNC permette di ottenere una ricostituzione microgliale da parte delle cellule del donatore, mediata dalla proliferazione locale della frazione migrata precocemente nel SNC, piuttosto che dall’ingresso di cellule mature circolanti.

Questi risultati aprono numerose altre domande che saranno indagate in futuro. In particolare, la caratterizzazione dei progenitori mieloidi che vengono selettivamente eliminati dal regime di condizionamento avrebbe una grande rilevanza biologica, mentre l’identificazione all’interno delle cellule staminali ematopoietiche trapiantate di quelle capaci di migrare precocemente nel SNC e proliferare localmente avrebbe notevoli ricadute per l’ottimizzazione di più efficaci protocolli di trapianto per la malattie lisosomiali con coinvolgimento neurologico.

ABSTRACT N. 22 HSR-TIGET - Altre Malattie Genetiche

ABSTRACT N. 21

Responsabile

HSR-TIGET - Altre Malattie Genetiche Responsabile

BIFFI ALESSANDRA

Telethon grant N.

TGT11B01

Totale € Num Centri: 1

TGTGSKP1

Totale €

345.500

Num Centri: 1

596.600 Durata (anni): 5

MONTINI EUGENIO

Telethon grant N.

Durata (anni): -

Anno d’inizio: 2011

ANALISI DEI SITI DI INTEGRAZIONE NELLA SPERIMENTAZIONE CLINICA PER LA LEUCODISTROFIA METACROMATICA

Anno d’inizio: 2011

TERAPIA GENICA CON CELLULE STAMINALI EMATOPOIETICHE PER LE MALATTIE LISOSOMIALI: LA COMPRENSIONE DEI MECCANISMI DI TURNOVER CELLULARE NEL CERVELLO AFFETTO PER OTTIMIZZARE L’EFFICACIA TERAPEUTICA

Biffi Alessandra (1), Calabria Andrea (1), Biasco Luca (1), Cesani Martina (1), Benedicenti Fabrizio (1), Plati Tiziana (1), Leo Simone (2), Zanetti Gianluigi (2), Aiuti Alessandro (1), von Kalle Christof (3), Schmidt Manfred (3), Sessa Maria (4), Naldini Luigi (1), Montini Eugenio (1)

Capotondo Alessia (1), Milazzo Rita (1,2), Politi Letterio Salvatore (3,4), Cecere Francesca (1), Quattrini Angelo (5), Palini Alessio (6), Plati Tiziana (1), Montini Eugenio (1), Naldini Luigi (1,2), Biffi Alessandra (1)

(1) San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy, via Olgettina 58, Milan, Italy, Tel. +39.02.26433869, E-mail: montini.eugenio@hsr.it (2) Center for Advanced Studies, Research, and Development in Sardinia, Pula, Italy (3) National Center for Tumor Diseases, Heidelberg, Germany (4) Pediatric Immunohematology and Bone Marrow Transplant Unit, Pediatric and Maternal Department, San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy

(1) HSR-TIGET, San Raffaele Scientific Institute, Via Olgettina 58, Milano, Italy; Tel. 02.26434678; Fax 02.26434668; E-mail: a.biffi@hsr.it (2) Vita-Salute San Raffele University, San Raffaele Scientific Institute, Milano, Italy (3) Imaging Core, San Raffaele Scientific Institute, Milano, Italy (4) Neuroradiology Unit, Head and Neck Department, San Raffaele Scientific Institute, Milano, Italy (5) Division of Neuroscience, San Raffaele Scientific Institute, Milano, Italy (6) Flow Cytometry Resource Analytical Cytology Technical Applications Laboratory, San Raffaele Scientific Institute, Milano, Italy (7) Center of Biostatistics, Università Vita-Salute San Raffaele, San Raffaele Scientific Institute, Milano, Italy

Nella recente sperimentazione clinica per la leucodistrofia metacromatica (MLD) inziata a Milano è stato utilizzato un vettore lentivirale (LV) auto-inattivante per trasdurre cellule staminali ematopoietiche (CSE) di pazienti MLD. In 5 pazienti trattati abbiamo ottenuto la ricostituzione ematopoietica di diversi lineaggi ematopoietici con livelli di marcatura da vettore fino all’ 80%. Per valutare la sicurezza e l’efficacia del trasferimento genico, nonché le dinamiche di ricostituzione ematopoietica nei primi 3 pazienti MLD, abbiamo studiato il profilo di integrazione di LV tramite LAM PCR e sequenziamento in diverse linee cellulari e a diversi intervalli temporali dopo il trapianto (1, 3, 6, 9 e 12 mesi).

Complessivamente abbiamo ottenuto > 32.000 siti di integrazione.

Il profilo di integrazione di LV in questa sperimentazione clinica è molto simile a quello descritto nella sperimentazione clinica per la adrenoleucodistrofia. I Common Insertion Sites (CIS) sono raggruppati in specifiche regioni cromosomiche molto ampie (mega-basi) e i geni colpiti sono arricchiti in funzioni di rimodellamento della cromatina e geni HLA, suggerendo che i CIS in questa sperimentazione clinica possono essere l’effetto di una caratteristica intrinseca dell’integrazione virale piuttosto che l’effetto della selezione genetica di cellule con integrazioni genotossiche.

Il numero di sequenze ottenute, che rappresentano ogni sito di integrazione, è stato usato come surrogato per determinare l’abbondanza di cloni cellulari specifici. Dalla nostra analisi si evince che vari cloni contribuiscono in modo variabile alla ricostituzione ematopoietica e non hanno evidenze di dominanza clonale. È importante sottolineare che il monitoraggio delle integrazioni di LV attraverso i diversi lineaggi ematopoietici durante il tempo ha permesso di confermare che la marcatura con LV è avvenuta a livello delle CSE, di caratterizzare il livello di contribuzione delle CSE nei diversi lineaggi ematopoietici e di caratterizzare la dinamica della ricostituzione ematopoietica tra linee mieloidi e linfoidi dopo il trapianto.

Nel complesso, i nostri dati mostrano che nei pazienti MLD trattati sono stati raggiunti dei livelli di marcatura con LV senza precedenti e senza chiari eventi di genotossicità.

I risultati favorevoli ottenuti con trapianto di cellule staminali ematopoietiche (HCT) da donatore sano nella Sindrome di Hurler hanno inizialmente fatto supporre che tale procedura potesse essere efficace nella maggior parte delle malattie da accumulo lisosomiale.

Tuttavia, l’efficacia terapeutica dell’HCT si è dimostrata dipendente dal tipo di malattia, dal coinvolgimento del Sistema Nervoso Centrale (SNC) e dallo stadio della malattia al momento del trattamento. In particolare il HCT risulta inefficace nei pazienti con manifesti sintomi neurologici o in quelli affetti da forme ad esordio precoce o aggressivo. Il nostro gruppo ha già dimostrato l’importanza di aumentare i livelli di enzima espressi nel cervello dai macrofagi e dalla microglia derivati dal trapianto attraverso la terapia genica - trasferendo il gene difettivo nelle cellule staminali ematopoietiche trapiantate. Sulla base dei nostri studi pre-clinici condotti nel modello murino della Leucodistrofia Metacromatica (LDM) nel nostro Istituto è iniziata una sperimentazione clinica di terapia genica con cellule staminali ematopoietiche per la cura della LDM. Tuttavia, è anche fondamentale cercare di favorire e rendere più rapida l’infiltrazione mieloide nel SNC e la ricostituzione microgliale con le cellule del donatore in modo da anticipare i tempi di efficacia dell’HCT. Nonostante numerosi studi su questo argomento siano disponibili in letteratura, i meccanismi che sottendono questo fenomeno sono ancora dibattuti e ben lontani dall’essere compresi. Pertanto, nel nostro studio abbiamo indagato le modalità di ricostituzione microgliale in seguito a HCT nel modello murino della LDM, monitorando la cinetica di infiltrazione mieloide nel SNC in condizioni basali o in seguito alla somministrazione di diversi regimi di condizionamento mieloa-

45

SAN RAFFAELE TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY

ABSTRACT N. 23

mae (5), Chiara Bonini (3), Christof Von Kalle (5), Manfred Schmidt (5), Eugenio Montini (1), Luigi Naldini (1,2), Alessandro Aiuti (1,6)

HSR-TIGET - Altre Malattie Genetiche Responsabile

GRITTI ANGELA

Telethon grant N.

TGT11B02

Totale € Num Centri: 1

(1) San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy (HSR-TIGET), Via Olgettina 58, 20132, Milano, Italy, Tel. +39.02.26434671, Fax +39.02.26434668, Email: alessandro.aiuti@hsr.it (2) Università Vita-Salute San Raffaele, Milano, Italy (3) San Raffaele Scientific Institute, HSR, Italy (4) CUSSB, Università Vita-Salute, Milan Italy (5) National Center for Tumor Diseases (NCT-DKFZ), Heidelberg, Germany (6) University of Rome “Tor Vergata”, Rome, Italy

1.094.900 Durata (anni): 5

Anno d’inizio: 2011

TERAPIA CELLULARE/GENICA DELLE LEUCODISTROFIE DIRETTA AL SISTEMA NERVOSO CENTRALE

Lo studio delle dinamiche delle cellule staminali emopoietiche (HSC) si basa su dati provenienti da esperimenti in vitro o modelli animali, ma mancano evidenze dirette derivate da analisi a livello clonale delle HSC nell’uomo. In seguito al trasferimento genico mediato da vettori retrovirali, le cellule trasdotte sono univocamente marcate da siti di integrazione (IS). Il profilo delle IS dei pazienti trattati presso l’HSR-TIGET con terapia genica (TG) per la sindrome di Wiskott-Aldrich (WAS) e ADA (adenosina deaminasi)-SCID ci permette di studiare le HSC nelle fasi precoci e tardive dopo il trapianto, rispettivamente. Mediante sequenziamento ad alta densità abbiamo raccolto 23,156 IS in 3 pazienti WAS fino a 1 anno e 3,054 IS in 4 pazienti ADA-SCID da 4 a 6 anni dopo TG. Nelle prime fasi dopo il trapianto abbiamo rilevato in pazienti WAS un aumento della diversità dei repertori di IS nei vari tipi cellulari tra 6 e 12 mesi dopo la TG in assenza di espansioni clonali. Dallo studio della attività delle HSC a lungo termine nei pazienti ADA-SCID abbiamo scoperto che le cellule nel midollo e i granulociti nel sangue periferico si raggruppano in modo diverso dai linfociti nel PB a causa dell’effetto del vantaggio selettivo nelle cellule T e B dopo correzione genica. Approcci basati su reti bayesiane ci hanno permesso di ricostruire un modello di struttura ematopoietica sottolineando la coerenza biologica delle somiglianze di IS del sito tra i vari tipi cellulari.

Abbiamo identificato IS “core” condivisi tra cellule CD34+ e le cellule sia linfoidi che mieloidi, i quali costituiscono marcatori di cellule staminali con capacità ripopolante a lungo termine. Con PCR specifiche siamo stati in grado di monitorare le dinamiche e l’attività di produzione di due di questi cloni di HSC durante un periodo di 5 anni, dimostrando che HSC esposte a citochine, e quindi non dormienti, possono conservare il loro potenziale anni dopo l’infusione. Un altro studio su pazienti trattati con infusioni di linfociti trasdotti consente il monitoraggio di singoli cloni di cellule T e lo studio della sopravvivenza e delle relazioni gerarchiche di sottopopolazioni naive e di memoria direttamente in vivo nell’uomo. Abbiamo scoperto che le cellule T trasdotte con un fenotipo apparente naive condividono la più alta percentuale di IS con le altre sottopopolazioni T e sopravvivono in vivo 10 anni dopo l’infusione. La maggioranza delle cellule fenotipicamente naive esprimono CD95+ come le recentemente definite cellule T staminali di memoria (TSCM) le quali sopravvivono a lungo termine mantenendo la plasticità in vivo delle naive. I nostri dati preliminari indicano che le TSCM potrebbero essere generate in vitro in seguito al protocollo di trasduzione dei linfociti T maturi. In conclusione le analisi dei IS stanno fornendo nuove informazioni sulle dinamiche ematopoietiche con un potenziale impatto per la TG e più in generale per gli approcci terapeutici delle malattie ematopoietiche.

Ricca Alessandra (1,2), Lattanzi Annalisa (1,2), Cavazzin Chiara (1), Meneghini Vasco (1), Frati Giacomo (1), Corno Daniela (1), Martino Sabata (2), Ungari Daniela (1), Biffi Alessandra (1), Naldini Luigi (1), Gritti Angela (1) (1) San Raffaele Scientific Institute, San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy (TIGET), Via Olgettina 58, Milan, Italy; Tel +39 0226434623; Fax +39 0226434668; E-mail: gritti.angela@hsr.it (2) Dept. of Exp. Medicine and Biochemical Sciences, Univ. of Perugia, Italy

Le malattie da accumulo lisosomiale sono causate dalla mancanza di enzimi lisosomiali necessari per importanti reazioni metaboliche.

La mancanza di arilsufatasi A (ARSA) e di beta-galattocerebrosidasi (GALC) nelle Leucodistrofie Metacromatica e a cellule Globoidi rispettivamente (MLD, GLD), provocano una grave carenza di mielina e colpiscono il sistema nervoso centrale e periferico (SNC, SNP).

Ogni tentativo volto a sviluppare nuove strategie terapeutiche deve considerare che: i) una singola terapia potrebbe non essere sufficiente a contrastare i diversi processi patofisiologici che concorrono a creare i sintomi; ii) il trattamento del SNC rimane problematico; iii) la patogenesi di queste malattie non è del tutto chiara. Approcci di terapia genica (GT) possono fornire una fonte permanente di enzima nei tessuti nervosi, sia somministrando direttamente dei vettori virali che veicolano il gene carente sia trapiantando cellule che producono livelli fisiologici o sovra- fisiologici di enzima funzionale (cellule staminali ematopoietiche, HSC; cellule staminali neurali, NSC). Abbiamo recentemente dimostrato la fattibilità e l’efficacia della GT intracerebrale e del trapianto di NSC in modelli murini di GLD e MLD (Lattanzi et al., HMG 2010; Neri et al., Stem Cells 2011). In questo progetto vogliamo verificare l’ipotesi che un approccio combinato di GT intracerebrale e trapianto di NSC e HSC geneticamente corrette a produrre alti livelli di enzima mancante (Gentner et al., Sci Transl Med 2010), disegnati per coprire i diversi organi bersaglio della patologia, e in particolare il sistema nervoso, in una finestra temporale appropriata, possano costituire una soluzione per il trattamento delle leucodistrofie. Abbiamo ottimizzato diversi protocolli combinati nei modelli murini di malattia e ne stiamo valutando l’efficacia. In parallelo, dato che la progressione di questi approcci verso studi clinici è la valutazione degli stessi in modelli di grandi animali, stiamo valutando la fattibilità e la tollerabilità della GT intracerebrale in primati non-umani, per ottenere dati importanti riguardanti la biodistribuzione del vettore e dei transgeni e la sicurezza di questo approccio. Una migliore conoscenza dei meccanismi alla base di queste malattie è essenziale per lo sviluppo di terapie efficaci. Abbiamo recentemente dimostrato il ruolo dell’enzima GALC nel mantenimento di una nicchia neurogenica funzionale durante lo sviluppo del SNC (Santambrogio et al., HMG 2012). Al fine di ricapitolare in vitro la patologia nervosa di GLD e MLD, abbiamo stabilito cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) da cellule somatiche di pazienti tramite tecniche di riprogrammazione somatica, differenziandole poi in cellule neurali. Stiamo attualmente valutando le caratteristiche funzionali, molecolari e biochimiche di queste cellule paziente-specifiche, al fine di studiare i meccanismi patogenetici e valutare strategie di correzione genica.

ABSTRACT N. 25 HSR-TIGET - Altre Malattie Genetiche Responsabile

AIUTI ALESSANDRO

Telethon grant N.

TGT11C01

Totale €

739.000

Num Centri: 1

Durata (anni): 5

736.200 Durata (anni): 5

Anno d’inizio: 2011

RISULTATI PRELIMINARI DI SICUREZZA ED EFFICACIA DELLA MOBILIZZAZIONE DI CELLULE CD34+ DOPO TRATTAMENTO CON PLERIXAFOR IN PAZIENTI TALASSEMICI ADULTI: VALUTAZIONE DI UNA NUOVA FONTE DI CELLULE STAMINALI EMATOPOIETICHE PER LA TERAPIA GENICA DELLA BETATALASSEMIA

HSR-TIGET - Altre Malattie Genetiche Responsabile

TGT11C02

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 24

FERRARI GIULIANA

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2011

STUDIO DELLE DINAMICHE CLONALI DELLE CELLULE STAMINALI EMATOPOIETICHE E MODELLI DI EMATOPOIESI UMANA MEDIANTE L’ANALISI DELLE INTEGRAZIONI VIRALI

Lidonnici Maria Rosa (1,5), Aprile Annamaria (1), Frittoli Marta (1,5), Mandelli Giacomo (1), Gentner Bernhard (1,2,5), Bellio Laura (3), Cassinerio Elena (4), Zanaboni Laura (4), Rossini Silvano (3), Cappellini Maria Domenica (4), Ciceri Fabio (2), Marktel Sarah (2), Ferrari Giuliana (1,5)

Luca Biasco (1), Cristina Baricordi (1), Serena Scala (1,2), Francesca Dionisio (1), Andrea Calabria (1), Samantha Scaramuzza (1), Nicoletta Cieri (3), Danilo Pellin (4), Clelia Di Serio (2,4), Cynthia Bartholo-

(1) San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy (HSR-TIGET), Via Olgettina 58, 20132 Milan, Italy, Tel. 0226434705, Fax 0226434668, E-mail: ferrari.giuliana@hsr.it

46

SAN RAFFAELE TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY

(2) Hematology and Bone Marrow Transplantation Unit, San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy (3) Immunohematology and Transfusion Medicine Unit, San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy (4) Università di Milano, Ca Granda Foundation IRCCS, Milan, Italy (5) Università Vita-Salute San Raffaele, Milan, Italy

(4) Glaxo Smith Kline, R&D, Ware, UK

Diversi studi clinici pionieristici hanno dimostrato il potenziale terapeutico delle cellule ematopoietiche geneticamente modificate nel correggere malattie genetiche. Rigorosi studi preclini in modelli animali appropriati sono di essenziale importanza nel dimostrare il rischio/beneficio delle terapie, per condurre la sperimentazione clinica in conformità alle indicazioni regolatorie nell’ottica di ottenere l’autorizzazione al commercio. Inoltre la valutazione della sicurezza biologica di prodotti medicinali per terapia genica utilizzando le Buone Pratiche di Laboratorio (Good Laboratory Practices, GLP) fornisce risultati di estrema importanza scientifica ed un eccellente livello di qualità nel quadro delle norme regolatorie. Per questi motivi abbiamo iniziato ad allestire una struttura GLP all’interno dei laboratori accademici HSR-Tiget, e uno studio preclinico di terapia genica per la beta-talassemia.

Lo studio dovrà dimostrare l’assenza di potenziale tossicità e tumorigenicità indotta dal trapianto di cellule ematopoietiche staminali/progenitrici di topo trasdotte con il vettore lentivirale esprimente il gene per la beta-globina umana (GLOBE) in un omologo modello murrino di malattia.

Lo studio è stato disegnato tenendo in cosiderazione la scelta del modello animale, la numerosità dei gruppi sperimentali, la selezione della dose e modalità di somministrazione, la durata, e la pianificazione dei controlli durante lo studio.

La dose selezionata corrisponde ad un multiplo della dose somministrata all’uomo ed il protocollo di trasduzione è stato ottimizzato per raggiungere un numero di copie di vettore per cellula (VCN) uguale o superiore a quello previsto nelle cellule umane.

Le cellule trasdotte (Test Item) sono ottenute mediante trasduzione di HSPCs purificate (Lin-) da topi donatori mutanti talassemici (th3/+) e sono state trapiantate in topi riceventi th3/+ pretrattati con Busulfano (Test System, n=30). In parallelo, le cellule non trasdotte (Control Item) sono state trapiantate in topi riceventi. Un gruppo di controllo costituito da topi th3/+ non trattati sarà monitorato per tutto lo studio. La durata dello studio è 12 mesi. Il Test e Control Item sono stati prodotti in 3 esperimenti indipendenti, e ciascun prodotto caratterizzato per vitalità cellulare, capacità clonogenica e VCN/cellula.

A 16±2 settimane dopo il trapianto è stata valutata nel sangue la quantità di VCN/cellula, l’espressione del transgene mediante misura della concentrazione di Hb e la presenza di Hb chimerica.

La vitalità cellulare del Test Item è 71.9±6.8%, il numero di CFU 3.2±0.16 x104 CFU/106 cellule, VCN è 8.5±1.8 VCN/cellula, l’efficienza di trasduzione è 100%. La vitalità cellulare del Control Item è 71±6.8%, il numero di CFU 2.5± 0.17 x104CFU/106 cellule.

A 16 settimane il VCN nel sangue è 9.6±2.3 (maschi), 8.3±3.1 (femmine), i parametri ematologici dimostrano una correzione dell’alterazione genetica. Non sono stati rilevati valori anomali e tutti gli animali dello studio sono vivi e in buone condizioni.

La terapia genica delle malattie ereditarie del sangue richiede il trapianto e l’attecchimento di un alto numero di cellule staminali ematopoietiche (CSE) autologhe geneticamente ingegnerizzate. Per ottenere la correzione della malattia, è necessario raggiungere un bilanciamento favorevole tra il regime di condizionamento del midollo osseo (MO) del ricevente e la dose di CSE trasdotte trapiantate.

Nell’applicazione clinica della terapia genica per i pazienti adulti beta-talassemici, il problema dell’ottenimento delle CSE è cruciale poiché la dose minima richiesta mette alla prova il MO allo stato basale. Cellule CD34+ mobilizzate di sangue periferico rappresentano una valida alternativa, ma le caratteristiche intrinsiche dei pazienti talassemici (splenomegalia e trombofilia) richiedono attenzione nella scelta della fonte di CSE, specialmente se si usa il G-CSF come agente mobilizzante.

Un protocollo clinico che esplora l’uso del Plerixafor (AMD3100) come singolo agente è stato sottomesso e approvato (acronimo AMDTHAL, EudraCT 2011-000973-30). Plerixafor antagonizza in modo selettivo e reversibile il legame di SDF-1 al suo recettore CXCR4 con la conseguente uscita delle CSE nel sangue periferico.

Gli scopi dello studio clinico di fase I-II AMD-THAL sono l’esplorazione dell’abilità di Plerixafor nell’indurre una mobilizzazione sicura e efficace delle CSE nei pazienti talassemici, la caratterizzazione delle CSE mobilizzate dal MO e dal sangue periferico dei soggetti trattati e il raggiungimento di un livello di efficienza di trasferimento genico delle cellule CD34+ mobilizzate paragonabile a quello ottenuto con il MO basale.

4 soggetti talassemici trasfusione-dipendenti sono stati arruolati e mobilizzati. Plerixafor è stato somministrato sottocute come singolo agente e in un’unica dose di 0,24 mg/kg ed è stata effettuata una leucaferesi. Solo un paziente ha ricevuto una seconda dose di 0,4 mg/kg 24 ore dopo la prima e ha subito una seconda leucaferesi.

3/4 pazienti hanno raggiunto la dose minima di cellule richiesta (2x106cell/kg), ma nessuno la dose ottimale (5x106cell/kg). Nessuna reazione avversa importante è stata osservata. In aggiunta, sono stati eseguiti aspirati midollari allo stato basale e dopo la somministrazione di Plerixafor, per analizzare le possibili modifiche nella concentrazione di cellule CD34+ nel MO a seguito della somministrazione. Il risultato è un arricchimento in cellule CD34+.

Le cellule CD34+ purificate dalla leucaferesi sono state analizzate per le loro proprietà biologiche e funzionali, la composizione in sotto-popolazioni e il profilo di espressione. I potenziali ricostitutivo e differenziativo linfomieloide di queste cellule sono stati testati attraverso il trapianto nei topi NSG. Abbiamo inoltre confrontato le cellule CD34+ mobilizzate di sangue periferico con quelle da MO prima e dopo il trattamento con Plerixafor, provenienti dallo stesso paziente.

Le cellule sono state trasdotte con un vettore lentivirale esprimente il gene della beta-globina umana (GLOBE LV) per verificare l’efficienza di trasferimento genico. I risultati indicano che le cellule mobilizzate con Plerixafor hanno un fenotipo primitivo con un potenziale ricostitutivo alto e sono efficientemente trasdotte, e sono quindi una fonte adatta per la terapia genica.

ABSTRACT N. 27 HSR-TIGET - Altre Malattie Genetiche Responsabile

TGT11D01

Totale €

731.800

Num Centri: 1

ABSTRACT N. 26

Anno d’inizio: 2011

FERRARI GIULIANA

Telethon grant N.

TGTGSK04

Totale €

327.300

Num Centri: 1

Durata (anni): 5

MIGLIORANDO LA BIOSICUREZZA DEL TRASFERIMENTO GENICO CON VETTORI LENTIVIRALI

HSR-TIGET - Altre Malattie Genetiche Responsabile

MONTINI EUGENIO

Telethon grant N.

Durata (anni): -

Cesana Daniela (1), Ranzani Marco (1), Volpin Monica (1), Bartholomä Cynthia (2), Benedicenti Fabrizio (1), Merella Stefania (1), Sergi Sergi Lucia (1), Sanvito Francesca (3), Brombin Chiara (4), Nonis Alessandro (4), Di Serio Clelia (4), Doglioni Claudio (3), Von Kalle Christof (2), Schmidt Manfred (2), Naldini Luigi (1), Montini Eugenio (1)

Anno d’inizio: 2011

VALUTAZIONE PRECLINICA DELLA BIOSICUREZZA DI PRODOTTI MEDICINALI BASATI SU TERAPIA GENICA: STUDIO DI TUMORIGENICITÀ E TOSSICITÀ PER TERAPIA GENICA DELLA BETA-TALASSEMIA

(1) San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy, via Olgettina 58, Milan, Italy, Tel. +39.02.26433869, Fax +39.02.26434621, E-mail: montini.eugenio@hsr.it (2) National Center for Tumor Diseases, Heidelberg, Germany (3) San Raffaele Department of Pathology, Milan, Italy (4) Centro Universitario di Statistica per le Scienze Biomediche, Milan, Italy

Salvatori Francesca (1), Tiboni Francesca (1), Mandelli Giacomo (1), Aprile Annamaria (1), Lidonnici Maria Rosa (1,3), Sanvito Francesca (2), Cristofori Patrizia (4), Palini Alessio (2), Oriani Enzo (2), Naldini Luigi (1,3), Ferrari Giuliana (1,3)

Abbiamo sviluppato una nuova piattaforma in vivo per detectare la genotossicità associata ad integrazioni di vettori virali. Questa piattaforma si basa sulla iniezione sistemica di vettori virali in topi neonati proni allo sviluppo tumorale, sia di genotipo Cdkn2a-/- sia eterozigote.

Il trattamento con un vettore lentivirale (LV), con le sequenze ter-

(1) San Raffaele-Telethon Institute for Gene Therapy (HSR-TIGET) - Via Olgettina 58, 20132, Milano, Italy, Tel 02 26434705, Fax 02 26434668 E-mail: giuliana.ferrari@hsr.it (2) San Raffaele Scientific Institute, Milan (3) Vita-Salute San Raffaele University, Milan, Italy

47

SAN RAFFAELE TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY

minali ripetute lunghe (LTR) auto-inattivanti (SIN) ed un forte enhancer-promotore virale (SF) posto in posizione interna per guidare l’espressione della proteina verde fluorescente (GFP), induce un’importante accelerazione nell’incidenza di tumori ematopoietici rispetto ai controlli di entrambi i modelli murini.

Diversamente, il trattamento con un vettore senza una cornice aperta di lettura (ORF) posta a valle dell’enhancer-promotore SF interno, accelera ulteriormente la tumorigenesi nonostante la presenza delle SIN LTR. Analizzando più di 7500 integrazioni dai tumori indotti da LV, abbiamo identificato 72 siti comuni di integrazione (CIS) indice del fatto che l’accelerazione della tumorigenesi è causata da eventi di mutagenesi inserzionale.

Abbiamo scoperto che i vettori senza ORF sono in grado di causare oncogenesi principalmente attraverso l’attivazione di Braf, che è indotta da un meccanismo di inserzione da promotore. Diversamente, i vettori conteneti una ORF, non essendo in grado di attivare Braf, causano invece attivazione e/o inattivazione di altri oncogeni e/o oncosoppressori attraverso meccanismi di attivazione enhancer-mediata o troncando il gene bersaglio. L’attivazione di Braf risulta essere predominante nell’induzione di oncogenesi nel nostro modello murino, mentre l’attivazione di altri oncogeni influenza più lievemente l’accelerazione tumorale.

In due corti indipendenti di pazienti con leucemia mieloide acuta, i livelli di espressione degli ortologhi umani di due geni CIS, identificati nel nostro studio, correlano attraverso analisi multivariata con la sopravvivenza di questi pazienti (n=229). Soprendentemente l’espressione dei due geni CIS influenza significativamente la loro sopravvivenza.

Questi risultati dimostrano che il nostro approccio può essere funzionale sia per studiare la genotossicità di vettori integranti, sia per identificare nuovi geni clinicamente rilevanti associati a tumori.

permette un’induzione dell’espressione del trasgene di 300 volte durante il differenziamento mieloide. Questo costrutto è in corso di validazione per lo sviluppo di un protocollo di terapia genica per la cura della granulomatosi cronica e della leucodistrofia a cellule globoidi.

ABSTRACT N. 28

In questo progetto abbiamo utilizzato le Zinc Finger Nucleasi (ZFN) per inserire un transgene tramite ricombinazione omologa in un sito genomico predeterminato e sfruttato questa strategia per correggere mutazioni in cellule staminali emopoietiche (CSE) e cellule staminali pluripotenti indotte (CSPI) di pazienti con immunodeficienza combinata grave legata al cromosoma X (SCID-X1). Questa malattia, causata da mutazioni nel gene IL2RG, è un candidato ideale per testare questo approccio innovativo; trial eseguiti su CSE con vettori ad integrazione random hanno mostrato benefici clinici, ma anche un’alta frequenza di leucemia dovuta a mutagenesi inserzionale ed espressione non controllata del transgene. Per ottenere integrazione sito-specifica mediata dalle ZFN in CSE, abbiamo sviluppato un protocollo di trasferimento genico combinato basato su vettori lentivirali (VL) integrasi-difettivi e nucleofezione di mRNA che permette di fornire sia il DNA donatore per la ricombinazione omologa sia di esprimere transientemente le ZFN. Utilizzando questo protocollo abbiamo inserito una cassetta di espressione del transgene nel locus AAVS1 o inserito un cDNA funzionale e correttivo per IL2RG a valle del suo promotore endogeno con efficienza e alta specificità nelle CSE. Le CSE con integrazione siti-specifica hanno generato in vitro colonie eritroidi e mieloidi e, dopo trapianto in topi NSG, hanno generato in modo riproducibile sia cellule della linea eritroide sia di quella mieloide. È importante sottolineare che le cellule con gene targeting sono state trovate nei topi anche nel compartimento staminale ematopoietico, indicando integrazione mirata in cellule umane capaci di ripopolamento a lungo termine. In parallelo abbiamo esplorato l’uso di CSPI derivate da pazienti, fonte potenzialmente illimitata di CSE geneticamente corrette. Mediante l’uso delle ZFN abbiamo inserito con alta efficienza il CDNA correttivo per IL2RG in fibroblasti di pazienti SCID-X1. Per selezionare i fibroblasti con correzione genica, che non esprimono IL2RG, abbiamo incluso a valle del cDNA correttivo una cassetta di selezione fiancheggiata da siti loxP e abbiamo riprogrammato efficientemente le cellule selezionate a CSPI utilizzando un VL codificante i fattori di riprogrammazione e rimovibile mediante la ricombinasi Cre. Veicolando transientemente Cre abbiamo rimosso quasi completamente dal genoma il sia il VL di riprogrammazione sia la cassetta di selezione, dimostrando la fattibilità di generare in modo sicuro CSPI geneticamente corrette e prive di fattori di riprogrammazione da pazienti SCID-X1; attualmente stiamo differenziando queste cellule in CSE. In conclusione, questi studi forniscono dunque prova di principio di integrazione sito-specifica e correzione genica mediante ZFN in CSE e CSPI derivanti da pazienti. Ciò apre la strada per sviluppare una più precisa e sicura strategia di terapia genica per la SCID-X1 e, plausibilmente, molte altre malattie.

ABSTRACT N. 29 HSR-TIGET - Altre Malattie Genetiche Responsabile

TGTGSKP2

Totale €

191.700

Num Centri: 1

Durata (anni): -

918.400 Durata (anni): 5

Anno d’inizio: 2011

UTILIZZO DI NUCLEASI ARTIFICIALI PER LA CORREZIONE GENICA MIRATA DI CELLULE STAMINALI EMATOPOIETICHE E DI CELLULE STAMINALI PLIRIPOTENTI INDOTTE DERIVATE DA PAZIENTI SCID-X1 Lombardo Angelo (1), Genovese Pietro (1,2), Firrito Claudia (1), Di Tomaso Tiziano (1), Escobar Giulia (1), Schiroli Giulia (1,2), Gennery Andrew R. (3), Sergi Lucia (1), Gregory Philip D. (4), Holmes Michael C. (4), Naldini Luigi (1,2) (1) San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy, San Raffaele Hospital, Via Olgettina 58, Milan, Italy, Tel. 0226434681, Fax 0226434668, E-mail: naldini.luigi@hsr.it (2) Vita-Salute San Raffaele University, Milan, Italy (3) Newcastle Upon Tyne Hospital, Newcastle Upon Tyne, United Kingdom (4) Sangamo BioSciences Inc., Richmond, CA, United States

NALDINI LUIGI

Telethon grant N.

TGT11D02

Totale € Num Centri: 1

HSR-TIGET - Altre Malattie Genetiche Responsabile

NALDINI LUIGI

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2011

NUOVE PIATTAFORME PER LA TERAPIA GENICA IN CELLULE STAMINALI EMATOPOIETICHE Gentner Bernhard (1,2), Zonari Erika (1), Giustacchini Alice (1,2), Boccalatte Francesco (1,2), Plati Tiziana (1), Biffi Alessandra (1,2), Aiuti Alessandro (1,2), Naldini Luigi (1,2) (1) San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy, Via Olgettina 58, 20132 Milano, Tel 02.26434681, Fax 02.26434621/4668, E-mail: naldini.luigi@hsr.it (2) Vita Salute San Raffaele University

La terapia genica in cellule staminali ematopoietiche (CSE) ha fatto progressi importanti negli ultimi anni ed è diventata una valida alternativa nel trattamento di varie malattie genetiche, con meno rischi e una potenziale maggior efficacia rispetto ad un trattamento standard, i.e. trapianto allogenico di CSE. Abbiamo sfruttato l’attività di microRNA per regolare negativamente l’espressione di un transgene in distinte sottopopolazioni ematopoietiche, raggiungendo un profilo d’espressione ristretto secondo lo stato di differenziamento della cellula ematopoietica. In particolare, abbiamo fatto uso di 2 miRNA specificamente espressi nelle CSE (miR-126 e miR130a) per costruire dei vettori “CSE-OFF” che non dimostrano espressione nelle CSE e nei progenitori primitivi, accendendosi solo dopo differenziamento lungo le filiere mieloide e linfoide. Questi vettori permettono di trasdurre le CSE senza alterare il loro proteoma, interferendo il meno possibile con la loro biologia mentre dimostrano piena efficacia di espressione sostenuta nel tempo nelle cellule differenziate. Abbiamo ottimizzato la combinazione delle sequenze miRNA responsive per ottenere un’ indice di regolazione di 10-20 volte, minimizzando allo stesso momento il rischio di interferire con la funzione fisiologica del miRNA. Inoltre, abbiamo anche definito il ruolo fisiologico del miR-126 nell’emopoiesi (Lechman et al, Cell Stem Cell 2012), e abbiamo stabilito che l’antagonismo di questo miRNA risulta nell’espansione delle CSE senza esaurirle e senza trasformarle: un fenotipo benigno e potenzialmente sfruttabile nell’ambito della terapia cellulare.

Infine, abbiamo caratterizzato un promotore mielo-specifico (Barde et al, Gene Ther 2011) in cellule midollari da donatori sani. Questo promotore dimostra una inducibilità di 30 volte tra CSE e cellule mieloidi differenziate, con livelli assoluti sorpassando quelli del promotore ubiquitario, PGK, nella linea mieloide. In più, la combinazione del promotore mielospecifico con la strategia basata sui miRNA

48

SAN RAFFAELE TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY

ABSTRACT N. 30

Annoni Andrea (1), Goudy Kevin (1), Cantore Alessio (1), Akbarpour Mahzad (1), Naldini Luigi (1,2), Roncarolo Maria Grazia (1,2)

HSR-TIGET - Altre Malattie Genetiche Responsabile

NALDINI LUIGI

Telethon grant N.

TGT11D03

Totale € Num Centri: 1

(1) San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy (HSR-TIGET), Via Olgettina 58, 20132 Milano, Italy, Tel. +39.02.26434875 Fax +39.02.26434668;Email: roncarolo.mariagrazia@hsr.it (2) Vita-Salute San Raffaele University, Milano, Italy

1.100.300 Durata (anni): 5

Anno d’inizio: 2011

Abbiamo sviluppato una piattaforma lentivirale per il trasferimento genico (LV) nel fegato, che combina due livelli di regolazione dell’espressione del transgene: trascrizionale e post-trascrizionale, mediati rispettivamente da un promotore attivo negli epatociti (ET) e da sequenze bersaglio per il micoRNA-142 (142T). LV.ET.142T anche nella sua forma integrasi-difettiva, può indurre uno stato di tolleranza immunologica attiva verso l’antigene (Ag) codificato che è mediata dalla generazione di cellule T regolatorie inducibili Foxp3+ (iTreg) Ag-specifiche (Annoni et al. Blood 2009).

Sulla base dei risultati ottenuti stiamo studiando il meccanismo d’induzione delle cellule iTreg nel fegato. Avvalendoci del topo transgenico OTII-Foxp3gfp possiamo identificare le cellule iTreg transgene-specifiche che si differenziano a seguito del trattamento con LV.ET.OVA.142T o LV.PGK (controllo immunogenico). I risultati hanno mostrato che il TGF-beta è sovraregolato nel siero di topi trattati con LV.ET.142T, in accordo con il differenziamento di iTreg osservato. Neutralizzando in vivo il TGF-beta, l’induzione di iTreg Ag-specifiche ritorna ai livelli rilevati nei topi di controllo trattati con LV.PGK. Abbiamo, inoltre, studiato quale sottoinsieme di cellule del fegato abbia un ruolo nell’induzione di iTreg, fornendo TGF-ß e/o presentando l’Ag. Studi di espressione genica dopo il trattamento con LV.ET.142T indicano che gli epatociti aumentano di 10 volte la trascrizione del gene del TGF-ß. Inoltre, la stimolazione in vitro di cellule T transgene-specifiche non ha rivelato un ruolo preferenziale di alcuna sottopopolazione epatica non-parenchimale presentante l’Ag. Al fine di ampliare il potenziale terapeutico della piattaforma LV.ET.142T, stiamo usando due modelli pre-clinici per testarne le potenzialità tollerogeniche.

In pazienti emofilici in seguito alla consueta terapia di somministrazione del fattore mancante si pùò generare una risposta immune mediata da anticorpi neutralizzanti (nAbs) che ne vanifica gli effetti.

Il trattamento LV.ET.FIX.142T di topi affetti da emofilia B (F.IX-/-) che sviluppano nAbs F-IX specifici dopo immunizzazione, ha progressivamente risolto la risposta neutralizzante anti-FIX e ha fornito livelli terapeutici di F.IX. Inoltre, topi NOD (modello murino di diabete di tipo I) sono stati trattati a 10 settimane di età con LV.ET.142T, codificante per il frammento B(9-23) dell’insulina. Il monitoraggio glicemico dei topi trattati ha rivelato che LV.ET.InsB.142T ha bloccato la risposta autoimmune contro le cellule Beta pancreatiche.

I risultati indicano che la piattaforma LV.ET.142T può essere sfruttata per l’induzione di tolleranza Ag-specifica per la definizione di nuovi approcci terapeutici per disturbi mediati dal sistema immunitario.

LA TERAPIA GENICA DIRETTA AL FEGATO CON VETTORI LENTIVIRALI E TRANSGENI IPERATTIVI È UN TRATTAMENTO SICURO ED EFFICACE PER L’EMOFILIA B IN MODELLI MURINI E CANINI Cantore Alessio (1,2), Ranzani Marco (1,2), Della Valle Patrizia (3), Bartolaccini Sara (1), Sergi Sergi Lucia (1), VandenDriessche Thierry (4), Chuah Marinee (4), Bellinger Dwight (5), D’Angelo Armando (3), Nichols Timothy (5), Montini Eugenio (1), Naldini Luigi (1,2) (1) San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy, San Raffaele Hospital, Via Olgettina 58, Milan, Italy, Tel. 0226434681, Fax 0226434668, E-mail: naldini.luigi@hsr.it (2) “Vita Salute San Raffaele” University, Milan, Italy (3) Coagulation Service, San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy (4) The Free University of Brussels, Brussels, Belgium (5) University of North Carolina, Chapel Hill, USA

I vettori lentivirali (VL) sono utili veicoli per la terapia genica diretta al fegato, grazie alla loro considerevole capacità di trasporto e capacità di integrarsi nel genoma della cellula ospite. Inoltre, la maggior parte degli esseri umani non hanno immunità pre-esistente né umorale né cellulare contro le componenti del vettore. Abbiamo sviluppato VL regolati dal microRNA 142, che restringono l’espressione del transgene rigorosamente agli epatociti e inducono tolleranza immunitaria nei confronti delle proteine transgeniche. Abbiamo dimostrato che questi VL possono correggere pienamente e stabilmente il fenotipo della malattia in topi affetti da emofilia B. Stiamo ora valutando questa strategia in un modello canino della malattia. I nostri risultati mostrano espressione del Fattore IX (FIX) canino fino all’1% dei livelli normali e benefici clinici (prevenzione quasi completa dei sanguinamenti spontanei) in due cani emofilici fino a oltre 3 anni dalla terapia. Questi dati indicano che la terapia genica è efficace, tuttavia al fine di aumentare ulteriormente l’attività del FIX, abbiamo generato VL che esprimono FIX ottimizzati e iperattivi, sfruttando una singola sostituzione amminoacidica, precedentemente associata a iperattività catalitica nell’uomo. Questi VL permettono di ottenere una maggiore attività del FIX nel plasma dei topi trattati, senza effetti collaterali, permettendo la correzione del fenotipo della malattia a basse dosi di VL, migliorando così la fattibilità, l’efficacia e la sicurezza della nostra terapia. Il trattamento di un cane emofilico con questo FIX iperattivo è in corso.

Pur non avendo osservato alcun effetto negativo nei topi trattati con terapia genica, al fine di valutare rigorosamente il rischio di oncogenesi associato all’integrazione del VL, abbiamo sviluppato modelli murini sensibili alla genotossicità, sia geneticamente proni a sviluppare tumori oppure sfruttando la carcinogenesi chimica. Come controllo positivo di mutagenesi inserzionale, abbiamo utilizzato VL progettati appositamente per indurre carcinoma epatocellulare (CEC). La terapia genica con i VL contenenti il FIX non ha indotto CEC in nessuno di questi modelli sensibili a sviluppare CEC. Abbiamo poi mappato 9.215 siti di inserzione del VL nei topi trattati.

Considerando che le integrazioni del VL genotossico si riscontrano maggiormente in oncogeni precedentemente associati a CEC, indice di una selezione positiva di questi eventi inserzionali che causano CEC, il VL terapeutico non ha mostrato alcuna aumentata incidenza di integrazione in questi geni. Inoltre, non abbiamo constatato alcuna prova di selezione positiva di integrazioni del VL terapeutico.

Questi dati indicano che la terapia genica diretta al fegato con VL ha un basso rischio di oncogenesi inserzionale e incoraggia l’ulteriore sviluppo e trasferimento in clinica.

ABSTRACT N. 32 HSR-TIGET - Altre Malattie Genetiche Responsabile

TGT11E01 954.300

Num Centri: 1

Durata (anni): 5

Durata (anni): 5

Anno d’inizio: 2011

Andolfi Grazia (1), Locarafo Grazia (1), Russo Fabio (1), Camisa Barbara (2), Attilio Bondanza (2), Maria Grazia Roncarolo (1,2), Silvia Gregori (1) (1) San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy (HSR-TIGET), Division of Regenerative Medicine, Stem Cells and Gene Therapy, San Raffaele Scientific Institute, Via Olgettina 58, 20132 Milan, Italy. Tel 02.26434669, Fax 02.26434668, E-mail: gregori.silvia@hsr.it (2) Experimental Hematology Unit, PIBIC, Division of Regenerative Medicine, Stem Cells and Gene Therapy, San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy (3) Università Vita-Salute San Raffaele, Milan, Italy

RONCAROLO MARIA GRAZIA

Totale €

710.600

STRATEGIE DI TERAPIA CELLULARE PER INDUZIONE DELLA TOLLERANZA IMMUNOLOGICA: CELLULE T INGEGNERIZZATE CON IL-10

HSR-TIGET - Altre Malattie Genetiche Telethon grant N.

TGT11E02

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 31 Responsabile

GREGORI SILVIA

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2011

L’induzione della tolleranza specifica verso i transgeni è fondamentale per lo sviluppo di protocolli clinici di trasferimento genico, altrimenti ostacolati dalla eliminazione immuno-mediata delle cellule ingegnerizzate. Le cellule T regolatorie sono essenziali per indurre e mantenere la tolleranza, rappresentano quindi un buon candidato

INDUZIONE DI TOLLERANZA AG-SPECIFICA ATTRAVERSO IL TRASFERIMENTO GENICO NEL PARENCHIMA EPATICO: MECCANISMO E POTENZIALI APPLICAZIONI

49

SAN RAFFAELE TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY

per inibire risposte mediate dalle cellule T, comprese quelle associate con il trasferimento genico. Nell’uomo due principali sottoclassi di cellule regolatorie CD4+ sono state descritte: le cellule FOXP3+ e le cellule Tr1 che producono IL-10. Le cellule Tr1 modulano le risposte immunitarie mediante la secrezione di IL-10 e l’eliminazione delle cellule mieloidi attraverso il rilascio di granzima B. Le cellule Tr1 possono essere generate in vitro utilizzando le cellule dendritiche tollerogeniche DC-10 (1). Sebbene le DC-10 siano efficaci nel promuovere il differenziamento delle cellule Tr1, la popolazione risultante comprende una frazione significativa di cellule non-Tr1, che rappresenta un grave limite per l’applicazione clinica delle cellule Tr1. Per superare questo limite, abbiamo sviluppato un vettore lentivirale bidirezionale (LV) che codifica per IL-10 umana e un “marker gene” (ΔNGFR). L’espressione di IL-10 indotta con LV conferisce ai linfociti T CD4+ umani la capacità di produrre alti livelli di IL-10 e concomitanti bassi livelli di IL-4. Le cellule ingegnerizzate con IL-10 (CD4IL-10) sono anergiche in vitro e sopprimono le risposte delle cellule T mediante la secrezione di IL-10 e del fattore di crescita trasformante (TGF)-β e indipendentemente dal contatto cellula-cellula. Utilizzando un modello pre-clinico di topi NSG umanizzati per lo studio delle reazioni di xeno graft-versus-host disease (xeno-GvHD) abbiamo dimostrato che una singola iniezione di cellule CD4IL-10 è sufficiente per inibire la xeno-GvHD mediata da cellule T CD4+ o cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) allogeniche in vivo (2). Questi risultati mostrano che l’espressione costitutiva di IL-10 in cellule T CD4+ umane induce una popolazione cellulare stabile fenotipicamente e funzionalmente sovrapponibile alle cellule Tr1. La piattaforma LV-IL-10 è stata applicata per generare cellule CD4IL-10 allo-specifiche. Le cellule risultanti, dopo stimolazione allo-specifica, secernono IL-10, sono anergiche e sopprimono risposte delle cellule T allo-specifiche in vitro.

In conclusione, abbiamo sviluppato un metodo per generare cellule allo-specifiche mediante trasferimento genico di IL-10. Questi risultati rappresentano il primo passo per lo sviluppo di cellule antigenespecifiche ingegnerizzate per produrre IL-10 e contribuirà ad aumentare il successo dell’immunoterapia con cellule Tr1 finalizzata all’induzione di tolleranza antigene-specifica.

Referenze 1. Gregori S, Goudy KS, Roncarolo MG. The cellular and molecular mechanisms of immuno-suppression by human type 1 regulatory T cells. Front Immunol. 2012;3:30. Epub 2012 Feb 29.

2. Andolfi G, Fousteri G, Rossetti M, Magnani CF, Jofra T, Locafaro G, Bondanza A, Gregori S, Roncarolo MG. Enforced IL-10 expression confers type 1 regulatory T cell (Tr1) phenotype and function to human CD4(+) T cells. Mol Ther. 2012 Sep;20(9):1778-90. doi: 10.1038/mt.2012.71. Epub 2012 Jun 12.

La mucopolisaccaridosi di tipo I è una malattia ereditaria da accumulo lisosomiale causata dal deficit dell’enzima a-L-iduronidase (IDUA), caratterizzata dall’accumulo intra-lisosomiale di mucopolisaccaridi in diversi tessuti. Tale accumulo provoca un danno multisistemico, con visceromegalia, insufficienza d’organo, anomalie scheletriche, dismorfismo e ritardo mentale. Si possono distinguere tre varianti di malattia, differenti per la gravità dei sintomi: la sindrome di Schieie, lieve; la sindrome di Hurler, severa (MPS I-H, caratterizzata dal coinvolgimento del sistema nervoso centrale) e la forma intermedia Hurler-Scheie. I trattamenti disponibili, la terapia enzimatica sostitutiva - applicata solo alle forme Schieie/HurlerScheie, e il trapianto di cellule ematopoietiche (HSCT) - applicato per il trattamento della MPS I-H, sono poco efficaci nel correggere le manifestazione patologiche a livello dello scheletro e del sistema nervoso. Con lo scopo di migliorare l’efficacia terapeutica del HSCT, abbiamo sviluppato un approccio di terapia genica (GT) basato sull’utilizzo di un vettore lentivirale (LV) per la trasduzione delle cellule staminali ematopoietiche (HSC) per indurre una produzione suprafisiologica dell’ enzima da parte delle HSC e della loro progenie matura che infiltra i tessuti. Testata nel modello murino di MPS I, la HSCGT si è dimostrata più efficace rispetto al HSCT da donatore sano sia nel prevenire l’insorgenza della malattia che nel correggere i difetti neurologici e scheletrici. Basandosi su questi risultati, è iniziato un percorso di transizione verso la sperimentazione clinica. A questo scopo, sono iniziati anche studi di sicurezza, volti a valutare il potenziale tossico e tumorigenico, e le proprietà di biodistribuzione delle HSC trasdotte con un LV codificante per IDUA prodotto secondo standard clinico. Tali studi sono condotti seguendo le norme di “Good Laboratory Practice” allo scopo di garantire la qualità e la validità dei dati. Per studiare il potenziale tossico e tumorigenico delle HSC trasdotte con IDUA.LV, HSC murine (isolate con una selezione negativa per i marcatori di linea (Lin-)) sono state trapiantate in topi MPS I. Questo perchè: i) l’uso di HSC da pazienti MPS I avrebbe richiesto l’espianto di una elevata quantità di midollo osseo, procedura non etica e non percorribile in pazienti pediatrici; ii) le cellule Lin- possono essere considerate equivalenti alle cellule umane CD34+ utilizzate nei trial clinici; iii) lo studio di tossicologia prevede l’utilizzo del modello più sensibile per valutare qualunque possibile rischio di tumorigenicità in un contesto preclinico e i modelli murini chimerici umanizzati non consentono, per limitazioni intrinseche nel modello, di eseguire valutazioni a lungo termine, possibili invece in un contesto trapiantologico topo/topo. Contemporaneamente, per lo studio di biodistribuzione sono in corso esperimenti di trasduzione di HSC umane da donatori sani con un IDUA.LV clinical-grade, per confermare la fattibiltà e la sicurezza del protocollo attualmente impiegato nel trial clinico MLD per la trasduzione delle HSC da pazienti MPS I. Sono inoltre in corso studi di comparazione tra il condizionamento con Busulfano, e l’irradiamento total body nel modello immunodeficiente murino selezionato per lo studio di biodistribuzione.

ABSTRACT N. 33 HSR-TIGET - Altre Malattie Genetiche Responsabile

BIFFI ALESSANDRA

Telethon grant N.

TGTGSK05

Totale €

993.000

Num Centri: 1

Durata (anni): -

ABSTRACT N. 34 HSR-TIGET - Altre Malattie Genetiche

Anno d’inizio: 2011

Responsabile

TERAPIA GENICA CON CELLULE STAMINALI EMATOPOIETICHE PER LA CURA DELLA MUCOPOLISACCARIDOSI DI TIPO I

TGTGSK06

Totale €

166.000

Num Centri: 1

Visigalli Ilaria (1), Delai Stefania (1), Ferro Francesca (1), Cecere Francesca (1), Politi Letterio Salvatore (2), Quattrini Angelo (3), Sanvito Francesca (4), Rovelli Attilio (5), Parini Rossella (5), Boelens Jaap J (6), Di Natale Paola (7), Naldini Luigi (1,8), Biffi Alessandra (1,9,10)

AIUTI ALESSANDRO

Telethon grant N.

Durata (anni): -

Anno d’inizio: 2011

TERAPIA GENICA DELLA MALATTIA GRANULOMATOSA CRONICA CON VETTORI LENTIVIRALI REGOLATI Chiriaco Maria (2), Farinelli Giada (2), Capo Valentina (2), Scaramuzza Samantha (1), Sergi Sergi Lucia (1), Grez Manuel (3), Trono Didier (4), Finocchi Andrea (1), Rossi Paolo (2), Naldini Luigi (1,5), Gentner Bernhard (1), Aiuti Alessandro (1,2)

(1) San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy (HSR-TIGET), Division of Regenerative Medicine, Stem Cells and Gene Therapy, San Raffaele Scientific Institute, Via Olgettina 58, 20132, Milan, Italy, Tel. 0226434678; Fax 0226434668; E-mail: a.biffi@hsr.it (2) Neuroradiology Group, Imaging Core, San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy (3) Experimental Neuropathology Unit, Neuroscience Dept., San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy (4) Mouse HistoPathology Unit, San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy (5) Pediatric Blood and Marrow Transplantation Program, UMC Utrecht, Netherland (6) MBBM Foundation, Pediatric Department, Milano-Bicocca University at San Gerardo Hospital, Monza, Italy (7) Department of Biochemistry and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, Naples, Italy (8) Vita Salute San Raffaele University, Milano, Italy (9) HSR-TIGET Pediatric Clinical Research Unit, San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy (10) Pediatric Immunohematology, San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy

(1) San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy (HSR-TIGET), Via Olgettina 58, 20132 Milan, Italy, Tel. +39.02.26434671, Fax +39.02.26434668, Email: alessandro.aiuti@hsr.it (2) Department of Pediatrics, Children’s Hospital Bambino Gesù and University of Rome Tor Vergata, Rome, Italy (3) Georg-Speyer Research Institute, Frankfurt, Germany (4) École Polytechnique Fédérale de Lausanne, Lausanne, Switzerland (5) Vita-Salute” S.Raffaele University, Milan, Italy

La malattia granulomatosa cronica (CGD) è causata da un difetto di funzione di NADPH ossidasi nei fagociti dei pazienti che portano ad un aumento della suscettibilità alle infezioni fungine e batteriche. La terapia genica con cellule staminali ematopoietiche (HSC) può rappresentare una valida alternativa per i pazienti con deficit di gp91phox (X-CGD). Negli studi clinici con vettori gamma-retrovirali

50

DULBECCO TELETHON INSTITUTE

è stato raggiunto un ripristino dell’attività della NADPH ossidasi, ma a lungo termine il beneficio clinico è stato ostacolato da livelli bassi di attecchimento delle cellule di geni modificati, silenziamento del transgene, e dalla presenza di dominanza clonale e mielodisplasia.

Poiché gp91phox non è presente nelle HSC umane e la sua espressione non era regolata in questi primi studi, è stato anche ipotizzato un ruolo negativo della espressione ectopica del transgene sulla sopravvivenza e la crescita delle HSC. Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un nuovo approccio di trasferimento genico in HSC per la terapia della X-CGD mediante vettori lentivirali SIN (LV) codificanti gp91phox. Per ridurre il rischio di espressione ectopica della gp91phox nelle HSC, abbiamo introdotto quattro o due sequenze bersaglio miR-126 (miR-126T) in una cassetta di espressione gp91phox (LVV-PGKgp91_126T), con conseguente downregolazione post-trascrizionale dell’espressione di gp91phox da parte del miR126 che si trova ad alti livelli in HSC ma non nella progenie mieloide (Gentner et al, Gentner B. et al., Sci Transl Med2010). Abbiamo anche generato un LV che incorpora un promotore specifico mieloide (LV.MSP.gp91) per permettere la regolazione trascrizionale del transgene. I vettori regolati sono stati confrontati con LV in cui il transgene gp91phox è costitutivamente espresso controllato da promotori cellulari (LVV-PGKgp91) o virali (LVV-SFFVgp91). Linee cellulari umane, cellule Lin- murine e cellule CD34+ sono state trasdotte e testate per l’espressione e la funzione specifica di gp91phox (FACS, DHR, riduzione del citocromo c). Tutti i vettori hanno ripristinato l’espressione di gp91phox e l’ attività NADPH ossidasi umane in linee X-CGD mieloidi. La trasduzione di cellule murine X-CGD e umane CD34+ ha ripristinato l’espressione del transgene e dell’attività NADPH dopo il differenziamento in vitro. Nelle culture a breve termine, è stata rilevata la presenza di gp91phox ectopica in cellule CD34+ indifferenziate trasdotte con il vettore LVV.PGK.gp91 (espressione costitutiva). Al contrario, entrambe i vettori regolati hanno dimostrato la loro efficacia nel ridurre l’espressione di gp91phox HSC da pazienti e donatori sani, mantenendola in cellule mieloidi differenziate. I risultati preliminari in topi X-CGD hanno mostrato che l’espressione del transgene e l’attività sono ripristinati in vivo. Sono in corso studi per completare la valutazione di efficacia e sicurezza preclinica dei vettori per la terapia genica della XCGD prima di procedere alle applicazioni cliniche.

nelle HSC (microRNA 126). Abbiamo dimostrato l’efficacia di questo vettore in vitro ed anche in vivo nel modello murino di malattia, nel quale la terapia genica ha esercitato un notevole beneficio terapeutico, con miglioramento della sopravvivenza e del fenotipo degli animali trattati. L’efficacia della terapia genica con HSC è dose-dipendente e sostanzialmente maggiore dell’efficacia del trapianto di HSC da donatore sano. Per consentire una traslazione clinica a questi promettenti risultati stiamo lavorando all’identificazione del miglior costrutto LV per lo sviluppo clinico. Abbiamo ottimizzato la sequenza cDNA umana di GALC per ottenere una migliore attività enzimatica rispetto ai livelli della controparte sana in un LV contenente da 1 a 4 elementi regolatori miRNA-mediati. Questi LV sono stati testati su HSC umane da sangue di cordone o midollo osseo di donatori sani. Sono state osservate un’espressione sopra-fisiologica sostenuta di GALC nella progenie delle HSC trasdotte dopo due settimane di coltura in vitro e una consistente repressione miRNA126-mediata dell’attività un giorno dopo la trasduzione. In questo contesto non è stata osservata alcuna tossicità da espressione sopra-fisiologica di GALC in seguito a trasduzione, anche in assenza di regolazione, sia in vitro che in vivo in seguito a trapianto delle cellule trasdotte in topi immunodeficienti. Questi risultati suggeriscono che le cellule umane potrebbero essere meno sensibili alla tossicità dovuta all’espressione sopra-fisiologica di GALC in confronto a HSC murine; non sono però ancora state testate con i medesimi LV HSC di pazienti GLD. Allo scopo di scegliere il costrutto lentivirale più sicuro per l’uso clinico stiamo quindi cercando di identificare dei markers coinvolti nelle vie apoptotiche/infiammatorie che potrebbero essere indotti dall’espressione sopra-fisiologica di GALC, mediante l’analisi del trascrittoma di cellule umane e murine trasdotte con vettore GALC regolato o meno. Allo stesso scopo verranno quantificati, sugli stessi campioni, il ceramide e diversi sfingolipidi che sono prodotti delle reazioni enzimatiche di GALC e noti essere stimoli anti o proapoptotici.

DULBECCO TELETHON INSTITUTE ABSTRACT N. 36

ABSTRACT N. 35

DTI - Malattie Neuromuscolari Responsabile

HSR-TIGET - Altre Malattie Genetiche Responsabile

BIFFI ALESSANDRA

Telethon grant N.

TGTGSK07

Totale €

239.400

Num Centri: 1

Durata (anni): -

GGP10225

Totale €

532.500

Num Centri: 3 Anno d’inizio: 2011

CECCONI FRANCESCO

Telethon grant N.

Durata (anni): 2

Anno d’inizio: 2010

RUOLO DELL’AUTOFAGIA NELLE MALATTIE MUSCOLARI

TERAPIA GENICA CON CELLULE STAMINALI EMATOPOIETICHE PER LA CURA DELLA LEUCODISTROFIA A CELLULE GLOBOIDI

Grumati Paolo (3), Di Bartolomeo Sabrina (1), Sferra Antonella (4), Nazio Francesca (2), Cianfanelli Valentina (1), Bertini Enrico (4), Bonaldo Paolo (3), Cecconi Francesco (1,2)

Ungari Silvia (1,2), Morena Francesco (3), Visigalli Ilaria (1), Gentner Bernhard (1), Delai Stefania (1), Martino Sabata (3), Naldini Luigi (1,2), Biffi Alessandra (1,4,5)

(1) Dulbecco Telethon Institute, Department of Biology, University of Rome Tor Vergata, and (2) IRCCS Fondazione S. Lucia, Via del Fosso di Fiorano, 00142, Rome; Tel. +39.06.72594230; +39.06.501703092; Fax +390672594222, E-mail: francesco.cecconi@uniroma2.it (3) Department of Biomedical Sciences, University of Padova, Padova, Italy (4) Department of Neuroscience, Neuromuscular Unit, “Bambino Gesù” Childrens Hospital, Rome, Italy

(1) San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy (HSR-TIGET), Division of Regenerative Medicine, Stem Cells and Gene Therapy, San Raffaele Scientific Institute, Via Olgettina 58, 20132, Milan, Italy, Tel. 02.26434678; Fax 02.26434668; E-mail: a.biffi@hsr.it (2) Vita-Salute San Raffele University, San Raffaele Scientific Institute, Milano, Italy (3) Department of Experimental Medicine and Biochemical Sciences, University of Perugia, Perugia, Italy (4) HSR-TIGET Pediatric Clinical Research Unit, San Raffaele Scientific Institute, Milano, Italy (5) Pediatric Immunohematology, San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy

L’autofagia è un processo di degradazione del citoplasma, di proteine a lunga emivita e di organuli interi. La maggior parte degli ortologhi dei geni Atg come Beclin1, Atg5, Atg7, Vps34 and Atg12 sono stati identificati nei mammiferi e la loro inattivazione nel topo ha rilevato interessanti fenotipi embrionali. Ambra1 forma un complesso stabile con Beclin1 e Vps34 e tale complesso viene traslocato dal citoscheletro al reticolo endoplasmatico durante le prime fasi di induzione del processo autofagico, dove media la nucleazione dell’autofagosoma.

Una corretta regolazione del flusso autofagico è fondamentale per l’omeostasi del muscolo scheletrico in condizioni fisiologiche e alterazioni del flusso autofagico sono la causa di disordini muscolari. Molto recentemente abbiamo effettuato una analisi istologica su muscoli di topo deficienti per Ambra1. Abbiamo osservato un chiaro fenotipo muscolare in embrioni Ambra1gt/gt al 13.5 d.p.f. I muscoli in via di sviluppo di tali embrioni mostrano una marcata disorganizzazione dell’architettura del muscolo. I miotubi e le miofibrille non seguono il pattern chiaro e ordinato che è tipico del muscolo scheletrico. Il muscolo nascente presenta una iper-celllularità che contribuisce alla struttura morfologica asimmetrica e all’anomalo incremento delle dimensioni del muscolo. Al fine di elucidare meglio le funzioni di Ambra1 nell’omeostasi del muscolo stiamo generando topi knockout

La Leucodistrofia a cellule globoidi (GLD) o malattia di Krabbe è una rara e severa malattia da accumulo lisosomiale demielinizzante dovuta al deficit dell’enzima Galattocerebrosidasi (GALC). La nostra ricerca è diretta a migliorare il limitato beneficio terapeutico apportato dal trapianto di cellule staminali ematopoietiche (HSC) in pazienti affetti da GLD attraverso il trasferimento genico dell’enzima deficitario mediato da vettori lentvirali (LV) in HSC autologhe. Diversamente da quanto osservato in altre malattie da accumulo lisosomiale, nel caso della terapia genica per la GLD con HSC, è necessaria una regolazione fine dell’espressione dell’enzima GALC all’interno delle HSC a causa della tossicità dell’espressione sopra-fisiologica dell’enzima stesso in tale popolazione, ma non in cellule maggiormente differenziate. Per ottenere tale regolazione abbiamo utilizzato un LV codificante GALC e regolato da un microRNA espresso solo

51

DULBECCO TELETHON INSTITUTE

ABSTRACT N. 38

condizionali che ci permetteranno di eliminare l’espressione della proteina selettivamente nel muscolo scheletrico. Il team sta utilizzando un altro modello murino per le patologie genetiche e di disregolazione dell’autofagia: il topo deficiente per il collagene VI (un modello di miopatia di Bethlem e di distrofia muscolare congenita di Ulrich). Abbiamo dimostrato che il topo deficiente per il collagene VI (Col6a1–/–) mostra un fenotipo miopatico con accumulo di organelli malfunzionanti e apoptosi spontanea dovuta a difetti autofagici. I topi Col6a1–/– mostrano un difetto del flusso autofagico a livello del muscolo scheletrico. La riattivazione forzata dell’autofagia attraverso la dieta o approcci farmacologici determina nei topi Col6a1–/– un miglioramento del fenotipo distrofico. Inoltre le biopsie muscolari ottenute da pazienti affetti da miopatia di Behtlem e distrofia muscolare congenita di Ulrich mostrano ridotti livelli di Beclin 1 e Bnip3. Tali evidenze sperimentali suggeriscono che difetti nell’attivazione del macchinario autofagico hanno un ruolo patogenico nelle distrofie muscolari congenite. Inoltre abbiamo dimostrato che un corretto flusso autofagico è fondamentale in risposta ad esercizi fisici. L’allenamento fisico, infatti, aggravava il fenotipo distrofico dei topi Col6a1–/–, suggerendo quindi che in una situazione di alterata autofagia, l’esercizio fisico possa avere più effetti dannosi che benefici.

Inoltre, stiamo sfruttando l’Unità Neuromuscolare dell’ospedale di ricerca Bambino Gesù di Roma, per analizzare biopsie muscolari e colture di fibroblasti, collezionati negli ultimi anni, di pazienti affetti da miopatie e che mostrano autofagia livello muscolare. Tra questi, sono stati analizzati 2 pazienti affetti da Sindrome di Vici, una malattia multisistemica ereditaria causata da una mutazione nel gene KIAA1632 (omologo umano di epg5), che codifica per un regolatore chiave della formazione dell’autofagolisosoma. Abbiamo osservato che tali pazienti affetti da sindrome di Vici mostrano una marcata atrofia delle fibre del muscolo scheletrico e variabilità del diametro delle fibre con up-regolazione delle proteine p62, Nbr1, LC3II, suggerendo il coinvolgimento di epg-5 nella degradazione dei componenti miofibrillari e dimostrando che la sindrome di Vici è associata a un difetto dell’ autofagia.

DTI - Malattie Neuromuscolari Responsabile

TCR09003 610.000

Num Centri: 1

Durata (anni): 5

Durata (anni): 2

Anno d’inizio: 2011

Bodega Beatrice (1), Della Valle Francesco (1), Saccone Valentina (2), Consalvi Silvia (2), Martone Julie (3), Cazzella Valentina (3), Hayashizaki Yoshihide (4), Carninci Piero (4), Forrest Al (4), Bozzoni Irene (3), Puri Pier Lorenzo (2), Orlando Valerio (1) (1) Dulbecco Telethon Institute (DTI), IRCSS Fondazione Santa Lucia, Epigenetics and Genome reprogramming, Via del Fosso di Fiorano 64, 00143 Rome, Italy, Tel 06 501703262, E-mail: vorlando@dti.telethon.it (2) Dulbecco Telethon Institute (DTI), IRCCS Fondazione Santa Lucia, Phamacology and Epigenetics, Rome, Italy (3) Department of Biology and Biotechnology “Charles Darwin”, Sapienza University of Rome, Italy (4) RIKEN Yokohama Institute, Omics Science Center, Yokohama, Kanagawa, Japan

La regolazione epigenetica e l’impatto degli elementi ripetuti (45% del genoma) nella funzione del genoma umano e nelle malattie resta sconosciuto. Studi recenti indicano l’esistenza di un’attività dinamica degli elementi LINE1 (L1) nelle cellule cerebrali in sviluppo e che difetti nella loro mobilizzazione e regolazione epigenetica sono associate con malattie neurodegenerative. In generale, la domanda se e come la mobilizzazione di elementi ripetuti contribuisca al corretto differenziamento di altri tessuti e di malattie associate resta inesplorata.

La DMD è una malattia genetica ben definita da mutazioni nel gene della Distrofina. Recenti studi hanno mostrato che la distruzione del complesso proteico del sarcolemma DAPC, alla base della degenerazione della fibra muscolare, comporta un effetto globale sull’intero trascrittoma delle cellule sia nella componente codificante che non codificante. Tale effetto è mediato dalla deregolazione del pathway epigenetico nNOS-HDAC2.

Qui mostriamo che durante la miogenesi la trascrizione e la variazione del numero di copie (CNV) degli elementi L1 è regolata dinamicamente, mentre in cellule da pazienti DMD l’attività aberrante di HDAC2 determina il blocco di tale processo. Allo stesso modo, il blocco farmacologico di HDAC2 determina un blocco del differenziamento, suggerendo che la dinamica degli elementi L1 è un parametro fondamentale per il corretto sviluppo della fibra muscolare.

Viceversa, il ripristino della normale attività di HDAC2 in cellule DMD, ottenuto sia mediante inibitori specifici (TSA) sia via terapia genica (exon-skipping) del difetto genetico del gene della distrofina, riporta alla normalità il programma di mobilizzazione degli elementi L1, sia in modelli murini (mdx) che in cellule di pazienti DMD. Tali risultati indicano la regolazione epigenetica degli elementi ripetuti L1 come un componente essenziale del corretto differenziamento della fibra muscolare scheletrica e un nuovo target diretto degli attuali protocolli in fase di sperimentazione clinica per la DMD.

SANDRI MARCO

Totale €

200.000

RUOLO DELL’EPIGENOMA E DEL GENOMA NON-CODIFICANTE NELLA DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE

DTI - Malattie Neuromuscolari Telethon grant N.

TCR11001

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 37 Responsabile

ORLANDO VALERIO

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2010

DEFINIZIONE DEI MECCANISMI MOLECOLARI DELLA PERDITA DI MASSA MUSCOLARE. IDENTIFICAZIONE DI NUOVI TARGET TERAPEUTICI PER BLOCCARE LA DEGENERAZIONE MUSCOLARE Sandri Marco (1,2), Nascimbeni Anna Chiara (3), Fanin Marina (3), Angelini Corrado (3) (1) Dulbecco Telethon Institute at Venetian Institute of Molecular Medicine, via Orus 2, 35129 Padova, Tel. 049.7923258, Fax 049.7923250, E-mail: marco.sandri@unipd.it (2) Department of Biomedical Science, University of Padova (3) Department of Neurosciences, University of Padova, Biomedical Campus “Pietro d’Abano”, Padova, Italy

La regolata rimozione di proteine e organelli attraverso il sistema autofagico-lisosomiale è fondamentale per l’omeostasi muscolare.

L’eccessiva attivazione dell’ autofagia contribuisce all’ atrofia muscolare e allo sviluppo della cachessia. Al contrario, l’inibizione dell’autofagia provoca l’accumulo di anomale proteine in forma di aggregati e di organelli malfunzonanti, che portano alla degenerazione delle miofibre. Difetti nella funzione lisosomiale sono causa di gravi malattie muscolari come la malattia di Pompe (GSDII). Tali patologie sono caratterizzate da un massivo accumulo di autofagosomi.

Tuttavia, se l’autofagia sia dannosa o meno per la funzione muscolare dei pazienti GSDII non è chiaro. Per chiarire il ruolo dell’autofagia abbiamo studiato il sistema autofagico-lisosomiale nelle biopsie muscolari di pazienti GSDII di diversa età e correlato con il grado di atrofia muscolare. Abbiamo inoltre monitorato l’autofagia in pazienti che hanno ricevuto il trattamento con a-glucosidasi ricombinante. I nostri dati mostrano che i pazienti infantili e quelli ad esordio tardivo hanno diversi livelli di flusso autofagico, accumulo di aggregati proteici positivi a p62 e di espressione di geni correlati con atrofia. I nostri dati confermano un’interessante correlazione tra blocco dell’ autofagia e progressione dell’atrofia e della malattia. Inoltre, la riattivazione dell’ autofagia in vitro contribuisce alla maturazione della maltasi acida. In conclusione, i nostri dati suggeriscono che l’autofagia non è deleteria ma anzi protegge miofibre dalla progressione della malattia e dall’atrofia.

ABSTRACT N. 39 DTI - Malattie Neuromuscolari Responsabile

GABELLINI DAVIDE

Telethon grant N.

TCR11003

Totale €

210.000

Num Centri: 1

Durata (anni): 2

Anno d’inizio: 2012

FSHD MUSCULAR DYSTROPHY REGION GENE 1 (FRG1) LEGA LA ISTONE METILTRANSFERASI SUV4-20H1 E INIBISCE IL DIFFERENZIAMENTO MUSCOLARE Neguembor Maria Victoria (1,2), Xynos Alexandros (1), Onorati Maria Cristina (3), Caccia Roberta (1), Bortolanza Sergia (1), Godio Cristina (1), Corona Davide F. (3), Schotta Gunnar (4), Gabellini Davide (1) (1) Dulbecco Telethon Institute and Division of Regenerative Medicine, San Raffaele Scientific Institute, via Olgettina 58, 20132 Milano Tel. 02-26435934 Fax 02-26435544, E-mail: gabellini.davide@hsr.it (2) Università Vita-Salute San Raffaele, Milan, Italy (3) Dulbecco Telethon Institute, Sezione Biologia Cellulare, Dipartimento

52

DULBECCO TELETHON INSTITUTE

STEMBIO, Università degli Studi di Palermo, Italy (4) Munich Center for Integrated Protein Science and Adolf Butenandt Institute, Ludwig Maximilians University, Munich, Germany

(1) Dulbecco Telethon Institute, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri, Dipartimento di Biochimica e Farmacologia Molecolare, Laboratorio di Proteomica Traslazionale, Via La Masa 19, 20156 Milano, Italy, Tel. +39.02.39014548, Fax +39.02.39014744, E-mail: valentina.bonetto@marionegri.it (2) Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri, Dipartimento di Neuroscienze

La distrofia muscolare Facio-scapolo-omerale (FSHD) è una miopatia autosomica dominante con una forte componente epigenetica.

La FSHD è associato alla delezione della sequenza ripetuta D4Z4 con conseguente sovra-espressione dei geni vicini. Tra questi, ci siamo concentrati sul FSHD region gene 1 (FRG1) poichè la sua sovra-espressione in topo, X. laevis e C. elegans porta a difetti simili alla FSHD. Abbiamo scoperto che FRG1 si lega e interferisce con l’attività della istone metiltransferasi Suv4-20h1 sia nei mammiferi che in Drosophila. Malgrado difetti di differenziamento muscolare siano stati ampiamente riportati nella FSHD, il meccanismo molecolare non è noto. Abbiamo trovato che la sovra-espressione di FRG1 o il silenziamento di Suv4-20h1 inibiscono il differenziamento muscolare. Inoltre, topi KO Suv4-20h sviluppano distrofia muscolare.

Infine, abbiamo identificato il target di FRG1/Suv4-20h1 Eid3 come un nuovo inibitore miogenico che contribuisce ai difetti muscolari identificati ed è impropriamente up-regolato selettivamente nei pazienti FSHD. Il nostro studio suggerisce un nuovo ruolo di FRG1 come regolatore epigenetico del differenziamento muscolare, indica che Suv4-20h1 ha una funzione gene-specifica nella miogenesi e rivela potenziali bersagli terapeutici per la FSHD.

La sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è una malattia neurodegenerativa incurabile che colpisce preferenzialmente i motoneuroni. Ciclofillina A (CypA) è stata identificata come marcatore di malattia, già ad uno stadio presintomatico, nel modello murino di SLA familiare che esprime la SOD1 mutata, e nei pazienti sporadici (1,2).

CypA è stata inoltre trovata negli aggregati proteici isolati da midollo spinale del modelli murino che esprime SOD1 mutata e nei pazienti con SLA sporadica (3). CypA è una proteina ubiquitaria con molteplici funzioni che potrebbero avere un certo rilievo nel sistema nervoso centrale dove non si conosce esattamente la sua funzione ed è espressa in maniera abbondante. Uno studio di interattomica per CypA ha messo in luce aspetti della funzione di questa proteina fino ad ora ignoti. In particolare è stato visto che interagisce con proteine che regolano il metabolismo dell’RNA, tra cui le hnRNP e TDP-43, una proteina che è stata associata alla SLA. TDP-43 e CypA interagiscono nel nucleo in maniera dipendente dall’RNA. CypA ha un ruolo fondamentale nella stabilizzazione dell’interazione tra TDP43 e hnRNP A2/B1, e nella regolazione dell’espressione di HDAC6 mediata da TDP-43, proprietà che sono alterate nei mutanti di TDP43 associati alla SLA, probabilmente per una perdita dell’interazione con CypA. CypA interagisce anche con SOD1 mutata, suggerendo che questa interazione potrebbe avere un ruolo anche nella SLA familiare associata a mutazioni di SOD1. Modelli animali che esprimono la SOD1 mutata e che mancano di CypA hanno livelli elevati di SOD1 aggregata e TDP-43 iperfosforilata nel midollo spinale già all’insorgenza della malattia. Questo studio dimostra che CypA ha un ruolo protettivo nella SLA come chaperone e nel mantenimento della stabilità dei complessi multiproteici (TDP-43/hnRNP). Indipendentemente dalla causa della malattia, SOD1 mutata o alterazioni di TDP-43, si assiste ad un’alterazione dell’interazione con CypA e la sua inclusione negli aggregati proteici, che ne impedisce l’attività protettiva. Il risultato finale è la formazione di inclusioni proteiche patologiche che possono portare ad un metabolismo dell’RNA deficitario. CypA essendo interattore sia di SOD1 mutata che di TDP-43 potrebbe rappresentare “l’anello mancante” che unisce questi due meccanismi patogenetici e potrebbe rappresentare un obbiettivo terapeutico interessante.

1. Massignan et al. (2007) Proteomic analysis of spinal cord of presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis G93A SOD1 mouse. Biochem Biophys Res Commun 353, 719-725.

2. Nardo et al. (2011) Amyotrophic lateral sclerosis multiprotein biomarkers in peripheral blood mononuclear cells. PLoS One 6, e25545.

3. Basso et al. (2009) Characterization of detergent-insoluble proteins in ALS indicates a causal link between nitrative stress and aggregation in pathogenesis. PLoS One 4, e8130.

ABSTRACT N. 40 DTI - Malattie Neuromuscolari Responsabile

ZITO ESTER

Telethon grant N.

TCP12001

Totale €

517.000

Num Centri: 1

Durata (anni): 5

Anno d’inizio: 2013

ANALISI DELLE BASI MOLECOLARI DELLE MIOPATIE CORRELATE A SEPN1 Zito Ester Dulbecco Telethon Institute, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri, Via G. la Masa 19, 20156 Milano, Italy, Tel. +39.02.39014402, Fax +39.02.3546277, E-mail: ester.zito@marionegri.it

Le proteine sono coinvolte in molti processi fisiologici ed agiscono anche come catalizzatori biologici (enzimi) di numerose reazioni chimiche che avvengono nell’organismo. Per poter assolvere alla loro funzione biologica, le proteine acquisiscono una specifica conformazione tridimensionale attraverso un processo di riarrangiamento proteico. L’acquisizione del corretto stato 3D delle proteine richiede a sua volta l’ausilio di altre proteine ed enzimi, che garantiscono la fedeltà del processo.

Molte malattie sono causate da proteine che falliscono ad assumere la corretta conformazione 3D e pertanto incapaci di assolvere alla funzione biologica. Noi ipotizziamo che SEPN1, la proteina che se mutata causa la distrofia muscolare da spina rigida e altre miopatie, sia uno degli enzimi coinvolti nel processo di riarrangiamento proteico. Questo progetto mira a studiare il meccanismo attraverso cui SEPN1 promuove il riarrangiamento di proteine importanti per la fisiologia muscolare. L’obiettivo finale è di riuscire a manipolare farmacologicamente il meccanismo d’azione di SEPN1 in modo da curare la miopatia, di cui SEPN1 è responsabile.

A questo proposito, alcune nostre recenti scoperte serviranno come basi scientifiche per valutare l’impiego di candidati terapeutici nella miopatia.

ABSTRACT N. 42 DTI - Malattie Neuromuscolari Responsabile

517.000 Durata (anni): 5

Anno d’inizio: 2013

RUOLO DEI SEGNALI INTRACELLULARI ATTIVATI NEL MUSCOLO DALLA CHINASI AKT NELLA PATOGENESI DELLA ATROFIA MUSCOLARE SPINALE E BULBARE Rocchi Anna (1), Pellegrini Matteo (1), Urciolo Anna (2), Blaaw Bert (3), Bonaldo Paolo (2), Sandri Marco (4), Pennuto Maria (1)

DTI - Malattie Neuromuscolari BONETTO VALENTINA

Telethon grant N.

TCR08002

Totale €

800.000

Num Centri: 1

TCP12013

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 41 Responsabile

PENNUTO MARIA

Telethon grant N.

Durata (anni): 5

(1) Department of Neuroscience and Brain Technologies, Istituto Italiano di Tecnologia, via Morego 30, Genoa 16163, Italy, Tel. +39.010.71781793, Fax +39.010.71781230 (2) Departments of Histology Microbiology & Medical Biotechnologies, University of Padua, Italy (3) Dipartimento di Anatomia e Fisiologia Umana, University of Padua, Italy (4) VIMM, University of Padua, Italy

Anno d’inizio: 2009

LA DISFUNZIONE DI CICLOFILLINA A E LA CONSEGUENTE DESTABILIZZAZIONE DEI COMPLESSI HNRNP ACCOMUNA LE PATOLOGIE DA SOD1 E TDP-43 NELLA SCLEROSI LATERALE AMIOTROFICA

Il fattore di crescita insulino-simile (IGF-1) e la proteina chinasi Akt svolgono un ruolo essenziale nel regolare il mantenimento della omeostasi del muscolo scheletro. Cio` avviene sia mediante l’attivazione di segnali che stimolano la crescita delle fibre muscolari, fenomeno noto come ipertrofia muscolare, sia mediante l’inibizione di

Lauranzano Eliana (1), Stucchi Riccardo (1), Pasetto Laura (1), Pozzi Silvia (1), Massignan Tania (1), Bendotti Caterina (2), Bonetto Valentina (1)

53

DULBECCO TELETHON INSTITUTE

segnali che stimolano la degradazione di proteine e organelli cellulari, fenomeno noto come atrofia muscolare. I segnali che inducono ipertrofia agiscono mediante fattori quali Gsk3beta e mTOR, mentre i segnali che inducono atrofia agiscono tramite fattori quali FOXO3a.

L’atrofia muscolare spinale e bulbare (SBMA), anche conosciuta come malattia di Kennedy, è una malattia genetica dovuta ad una mutazione nel gene che esprime il recettore degli androgeni. Quando il recettore lega il testosterone, esso diventa tossico per i motoneuroni e il muscolo scheletrico. Il nostro obiettivo è ottenere informazioni concernenti il meccanismo attraverso cui il recettore causa lo sviluppo di atrofia muscolare. In questo progetto, testeremo l’ipotesi che il recettore mutato causa atrofia muscolare agendo direttamente nel muscolo scheletrico. Inoltre, proponiamo di testare l’ipotesi secondo cui l’attivazione dei segnali ad opera della proteina Akt nel muscolo abbia effetti protettivi in modelli cellulari e animali della malattia. La nostra ipotesi e` supportata dai dati precedentemente ottenuti, i quali mostrano come la attivazione di Akt da parte del fattore di crescita insulino-simile (IGF-1) nel muscolo scheletrico di topi SBMA sia protettiva (Palazzolo et al., 2009). Questi dati supportano la nostra ipotesi, secondo cui il segnale originato da IGF1/Akt nel muscolo scheletrico dei topi SBMA abbia un ruolo fondamentale nella patologia.

Noi mostriamo che nel muscolo scheletrico dei topi SBMA i livelli di espressione e di attivazione della chinasi Akt sono aumentati. Inoltre, noi abbiamo ottenuto evidenza secondo cui le vie si segnalazione attivate da Akt e che inducono ipertrofia sono attivate. Tale attivazione e` precoce e precede la attivazione di autofagia, processo che porta alla degradazione delle proteine. Noi proponiamo un modello in cui i topi sviluppano ipertrofia adattattiva per compensare la presenza del recettore mutato. Tale fenomeno non e` pero` sufficiente a compensare la atrofia indotta dalla proteina mutata.

In questo progetto valuteremo se MTMR2 sia coinvolta nella regolazione dell’endocitosi nella cellula di Schwann e se la sua attività fosfatasica sia fondamentale per il corretto sviluppo della mielina e la sua formazione.

Infine, cercheremo di valutare se l’utilizzo di uno specifico inibitore di una fosfolipide chinasi che interagisce geneticamente e funzionalmente con la fosfatasi MTMR2 sia in grado di migliorare la neuropatia del topo Mtmr2 knock-out.

ABSTRACT N. 44 DTI - Malattie Neurologiche Responsabile

GGP12017 253.000

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Durata (anni): 5

Anno d’inizio: 2009

Senatore Assunta (1), Colleoni Simona (2), Verderio Claudia (3), Restelli Elena (1), Morini Raffaella (3), Condliffe Steven B. (3), Bertani Ilaria (1), Mantovani Susanna (1), Canovi Mara (2), Micotti Edoardo (2), Forloni Gianluigi (2), Dolphin Annette C. (4), Matteoli Michela (3), Gobbi Marco (2), Chiesa Roberto (1) (1) Dulbecco Telethon Institute c/o Mario Negri Institute for Pharmacological Research, via G. La Masa 19 20156 Milan, Italy, Tel. +39.0239014428, E-mail: roberto.chiesa@marionegri.it (2) Mario Negri Institute for Pharmacological Research, Milan, Italy (3) University of Milan, Italy (4) University College London, Uk

Il meccanismo con cui la proteina prionica (PrP) mutata causa la disfunzione neurologica nelle malattie da prioni genetiche non è noto.

I topi transgenici Tg(PG14) producono nel cervello una forma confomazionalmente alterata della PrP che si accumula nel reticolo endoplasmatico (ER) neuronale. Con l’invecchiamento questi animali sviluppano atassia e una marcata degenerazione dei neuroni granulari del cervelletto. In questo studio riportiamo che nei topi Tg(PG14) i deficit motori insorgono prima della degenerazione neuronale e sono associati a un difetto della trasmissione glutammatergica cerebellare dovuto ad un’alterata funzionalità dei canali per il calcio voltaggio-dipendenti (VGCCs). Abbiamo scoperto che la PrP interagisce con la subunità alpha2delta-1 dei VGCCs, che promuove la corretta localizzazione dei canali sulla membrana presinaptica. A causa della ritenzione della PrP mutata nell’ER, la subunità alpha2delta-1 si accumula all’interno della cellula, impedendo il corretto posizionamento dei VGCCs sulla membrana presinaptica. La PrP mutata quindi causa un deficit della trasmissione glutammatergica cerebellare poiché altera la funzione dei canali per calcio nei neuroni granulari.

Questi risultati indicano un nuovo meccanismo di neurotossicità e nuovi potenziali target terapeutici.

BOLINO ALESSANDRA

Totale €

800.000

MECCANISMI CELLULARI DI DISFUNZIONE SINAPTICA NELLE MALATTIE DA PRIONI FAMILIARI

DTI - Malattie Neuromuscolari Telethon grant N.

TCR08005

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 43 Responsabile

CHIESA ROBERTO

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2012

RUOLO DEI FOSFOLIPIDI E DEL TRAFFICO DI MEMBRANA NELLA PATOGENESI DELLE NEUROPATIE DI CHARCOT-MARIE-TOOTH Françoise Piguet (1), Ilaria Vaccari (1), Stefania Scarlino (1), Angela Cattaneo (2), Bernard Payrastre (3), Michael Simons (4), Angela Bachi (2), Alessandra Bolino (1) (1) Dulbecco Telethon Institute, ISNPE-Division of Neuroscience, San Raffaele Scientific Institute, Via Olgettina 58 20132, Milan, Italy, Tel. 02.26434743, Fax 02.26435093, E-mail: bolino.alessandra@hsr.it (2) Division of Genetics and Cell Biology, San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy (3) INSERM U1048, Toulouse, France (4) Max Planck Institute for Experimental Medicine, Goettingen, Germany

ABSTRACT N. 45

La neuropatia di Charcot-Marie-Tooth (CMT) di tipo 4B1 è una grave forma di neuropatia demielinizzante con esordio nell’infanzia caratterizzata da ispessimenti focali di mielina denominati “myelin outfoldings”. Il nostro gruppo ha dimostrato che la neuropatia di CMT4B1 è causata da mutazioni da perdita di funzione nel gene MTMR2 (Myotubularin related protein 2), che codifica per una proteina fosfatasi di fosfolipidi, implicati nella regolazione di diverse funzioni cellulari tra cui il traffico di membrana intracellulare, un processo fondamentale nella biogenesi della mielina. Per studiare il meccanismo molecolare alla base di CMT4B1 abbiamo generato diversi modelli in vivo e in vitro di CMT4B1. In particolare, abbiamo generato topi knock-out generali e condizionali nelle cellule di Scwhann e nel motoneurone, che ci hanno permesso di concludere che la mancanza di MTMR2 nelle cellule di Schwann genera gli ispessimenti focali di mielina. Per quanto concerne il modello in vitro, abbiamo allestito colture mielinizzanti cellula di Schwann/neurone sensitivo da espianti di gangli di neuroni dorsali sensitivi (DRG) dal topo Mtmr2 knock out e abbiamo riprodotto in vitro il fenotipo ipermielinizzante. Sfruttando questi modelli, abbiamo recentemente proposto che la fosfatasi MTMR2 regola l’omeostasi di membrana durante la mielinizzazione e che quindi, quando essa è assente, la cellula di Schwann si accresce mielinizzando in modo eccessivo, formando degli ispessimenti focali, segni tipici della morfologia dei nervi di uomo e topo affetti da CMT4B1.

Tuttavia, restano ancora da definire il ruolo di MTMR2 nel controllo del traffico e omeostasi di membrana e la sua attività biochimica.

DTI - Malattie Neurologiche Responsabile

PASSAFARO MARIA PIA

Telethon grant N.

GGP12097

Totale €

255.400

Num Centri: 2

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2012

ANALISI DELLE ALTERAZIONI NEURONALI ASSOCIATE A MUTAZIONI NEL GENE TM4SF2 E RECUPERO FUNZIONALE MEDIANTE TERAPIE GENETICHE E FARMACOLOGICHE Folci Alessandra (1), Murru Luca (1), Vezzoli Elena (2), D’Adamo Patrizia (3,4), Francolini Maura (2,5), Passafaro Maria (1,3) (1) CNR Neuroscience Institute, Via Vanvitelli 32, 20129, Milan, Italy, Tel.+039.02.50317102, Fax +039.02.7090574, E-mail: m.passafaro@in.cnr.it (2) Dipartimento di Biotecnologie Mediche e Medicina Traslazionale, Università degli Studi di Milan, Italy (3) DTI Dulbecco Telethon Institute (4) Vita-Salute San Raffaele University, Milan, Italy (5) Fondazione Filarete, Milan, Italy

TM4SF2 è un gene coinvolto nei deficit cognitivi (intellectual disability, ID) che codifica per la proteina tetraspanina7 (TSPAN7). Le tetraspanine sono proteine di membrana conservate nel corso dell’e-

54

DULBECCO TELETHON INSTITUTE

voluzione in grado di associarsi dinamicamente con diverse proteine all’interno di microdomini (tetraspanin eriched microdomains, TEMs) e regolare la morfologia cellulare, la motilità e trasduzione del segnale. Il gene TM4SF2 è espresso soprattutto nel cervello.

Studi recenti del nostro laboratorio hanno dimostrato il coinvolgimento di TSPAN7 nella formazione delle sinapsi e nel traffico del recettore di tipo AMPA (AMPAR) in neuroni ippocampali in coltura. In particolare, il silenziamento di TSPAN7 riduce dimensione e stabilità delle spine dendritiche, contrastandone il rimodellamento indotto da LTP chimico e riduce l’espressione di proteine sinaptiche. TSPAN7 interagisce inoltre con PICK1 (protein interacting with C kinase 1), noto regolatore del traffico di AMPAR . Il silenziamento shRNA-mediato di TSPAN7 promuove l’internalizzazione della subunità GluA2/3 di AMPAR in modo PICK1-dipendente, e riduce le correnti AMPAR postsinaptiche. A partire da questi dati, il nostro obiettivo adesso è lo studio della funzione di TSPAN7 in vivo in topi KO. Abbiamo analizzato l’anatomia del sistema nervoso centrale in topi KO giovani ed adulti, concentrandoci sull’organizzazione cellulare di corteccia ed ippocampo, le due aree non mostrano differenze importanti per quanto riguarda la loro struttura istologica e quindi siamo passati all’analisi ultrastrutturale dei neuroni in queste regioni per verificare se l’assenza della proteina determini differenze nella struttura delle sinapsi. Inoltre , in dati preliminari abbiamo osservato un’alterazione della frequenza delle correnti eccitatorie postsinaptiche in hippocampo di animali KO per TM4SF2 rispetto ai controlli. Se l’animale riproducesse il fenotipo ID dei pazienti, rappresenterebbe un prezioso modello per lo screening di composti farmacologici.

quantità di GluA1 aumenta.

Studi su fettine di ippocampo di topo organotipiche hanno confermato questa osservazione e hanno rivelato che l’assenza di RAB39B non causa cambiamenti nelle correnti AMPA basali e LTD, ma aumenta l’indice di rettificazione perché diminuisce la frazione di GluA2, a sostegno dell’ipotesi che RAB39B è necessario a mantenere GluA2 a livello della membrana post-sinaptica.

Poiché il confronto dei risultati ottenuti in vitro con l’analisi cellulare, biochimica e comportamentale fatta su un modello animale è fondamentale per comprendere la funzione RAB39B nella plasticità sinaptica e memoria, abbiamo generato un topo mancante del gene Rab39b. La caratterizzazione di questo modello animale potrà fornire un chiaro vantaggio alla scoperta di nuove strategie terapeutiche mirate per ristabilire la funzione dei recettori AMPA.

ABSTRACT N. 47 DTI - Altre Malattie Genetiche Responsabile

371.500 Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2012

IL RIMODELLAMENTO DELLE CRESTE MITOCONDRIALI CONTROLLATO DA OPA1: DAI MODELLI ALLE BASI PER LA TERAPIA DELL’ATROFIA OTTICA DOMINANTE Scorrano Luca Dulbecco-Telethon Institute, Venetian Institute of Molecular Medicine, Via Orus 2, 35129 Padova, Italy, Tel. +39.049.7923221, Fax +39.049.7923256, E-mail: lscorrano@dti.telethon.it

DTI - Malattie Neurologiche D’ADAMO PATRIZIA

Telethon grant N.

TCR11002

Totale €

470.000

Num Centri: 1

GGP12162

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 46 Responsabile

SCORRANO LUCA

Telethon grant N.

Durata (anni): 3

L’atrofia ottica dominante è una malattia genetica caratterizzata dalla progressiva perdita della vista, a partire dall’età prescolare, cusata dalla morte delle cellule gangliari della retina, i neuroni che trasmettono le immagini dal nostro occhio alla parte del cervello deputata ad interpretarle. Questa morte avviene probabilmente a causa di un eccesso nel normale processo di “suicidio” cellulare che noi chiamiamo apoptosi e che serve al naturale ricambio di tutte le cellule del nostro corpo. Per mettere a punto dei farmaci che consentano di bloccare questo processo, dobbiamo comprenderne i meccanismi.

I mitocondri, gli organelli che nella cellula funzionano da centrale energetica, giocano un ruolo fondamentale anche in questi processi di apoptosi. Il loro coinvolgimento nella morte cellulare programmata è accompagnato da cambiamenti nella loro forma. Alcune proteine controllano la forma dei mitocondri e mutazioni a loro carico sono associate a patologie genetiche che comprendono anche forme di cecità. In particolare una di queste proteine, chiamata OPA1, è mutata nell’atrofia ottica dominante. In questo studio ci riproponiamo di studiare come questa proteina sia regolata, di chiarire il suo ruolo nella vita e nella morte delle cellule gangliari della retina, di eslorare se possa essere un bersaglio per farmaci che interferiscano con la morte di queste cellule e quindi che possano prevenire il lento degenerare verso la cecità.

Anno d’inizio: 2012

ANALISI DEL RUOLO DI RAB39B NEL RITARDO MENTALE ASSOCIATO AL CROMOSOMA X: RECETTORI AMPA COME POSSIBILI TARGET TERAPEUTICI Giannandrea Maila (1), Mignogna Maria Lidia (1,2), Magro Daniela (2), Bassani Silvia (3), Mapelli Lisa (3), Passafaro Maria (3), Esteban Jose Antonio (4), D’Adamo Patrizia (1,2) (1) DTI at San Raffaele Scientific Institute, via Olgettina 58 Milan, Italy Tel. 02.26434604, Fax 02.23464844, E-mail: p.dadamo@hsr.it (2) Università Vita-Salute San Raffaele, Milan, Italy (3) CNR, Neuroscience Institute, Milan, Italy (4) Universidad Autonoma de Madrid, Madrid, Spain

La Disabilità Intellettiva (ID) è un disturbo comune dello sviluppo cerebrale caratterizzato da un QI inferiore a 70. ID colpisce circa il 2% della popolazione e la malattia può essere in comorbidità con disturbi dello spettro autistico, con un impatto socio-economico elevato.

Le RAB GTPasi sono una classe di proteine che svolgono un ruolo chiave nel meccanismo di rilascio e di maturazione sinaptica e controllano il traffico intracellulare, agendo come interruttori molecolari tra uno stato attivo (GTP-bound) e uno inattivo (GDP-bound).

Abbiamo identificato mutazioni nel gene RAB39B. I nostri studi mostrano che RAB39B è un gene neuronale e la sua down-regolazione provoca una drastica riduzione del numero di sinapsi, un fenotipo che potrebbe correlare con le caratteristiche ID. Abbiamo stabilito che RAB39B lega GM130 e Trip11, due proteine strutturali del Golgi, Dynactin1, una proteina che modula dineina importante nel trasporto di vescicole ai dendriti.

Il principale legame di RAB39B è con PICK1 (proteina che interagisce con C-kinase1), che gioca un ruolo importante nel trasporto dei recettori AMPA (GluA2/3) ai dendriti. Studi di elettrofisiologia dimostrano che la down-regolazione di RAB39B influenza sia la funzione pre che post-sinaptica dei neuroni. Ci siamo concentrati sulla funzione post-sinaptica in cui RAB39B svolge un ruolo dinamico nel trasporto delle subunità GluA2/3 AMPA. Infatti, RAB39B lega il dominio PDZ di PICK1 per mediare l’uscita di GluA2/3 dal reticolo endoplasmatico e raggiungere l’apparato di Golgi. In seguito, grazie al trasporto dineina-mediato GluA2/3 è trasferito alla post-sinapsi neuronale. Per dimostrare questo abbiamo determinato in primo luogo possibili alterazioni di PICK1 e GluA2 nella loro localizzazione cellulare con esperimenti di immunofluorescenza su neuroni down-regolati per Rab39b, scoprendo che PICK1 mislocalizza e che la quantità di GluA2 esposta alla membrana neuronale è diminuita, mentre la

ABSTRACT N. 48 DTI - Altre Malattie Genetiche Responsabile

FANELLI FRANCESCA

Telethon grant N.

GGP11210

Totale €

361.900

Num Centri: 2

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2011

STUDI INTEGRATI IN SILICO, IN VITRO ED IN VIVO VERSO LA PROGETTAZIONE DI POTENZIALI AGENTI TERAPEUTICI PER LA RETINITE PIGMENTOSA Felline Angelo (1,2), Behnen Petra (3), Marigo Valeria (3), Fanelli Francesca (1,2) (1) Department of Life Sciences, University of Modena and Reggio Emilia, Via Campi 183, 41125, Modena, Italy, Tel. +39.059.2055114, Fax +39.059.373543; E-mail: fanelli@unimo.it (2) Dulbecco Telethon Institute (DTI) (3) Department of Life Sciences, Via Campi 287, Modena

La Retinite Pigmentosa (RP) costituisce un gruppo di malattie umane ereditarie caratterizzate da degenerazione retinica e progressiva

55

DULBECCO TELETHON INSTITUTE

perdita della vista in circa 1.5 milioni di pazienti nel mondo. Nonostante l’elevata eterogeneità genetica della sindrome, ~140 mutazioni puntiformi sono state trovate nel gene della rodopsina, codificante il pigmento visivo che genera un segnale elettrico in risposta alla luce. La rodopsina, appartiene alla superfamiglia dei recettori accoppiati a proteina G costituiti da sette eliche transmembraniche [1]. L’assorbimento di un fotone da parte della rodopsina causa la foto-isomerizzazione cis-trans del cromoforo retinale seguita dall’attivazione della proteina.

La maggior parte delle mutazioni della rodopsina causa la forma Autosomica Dominante (ADRP) della malattia. Un’analisi recente di dati di letteratura indica che 89% dei mutanti della rodopsina caratterizzati biochimicamente sono non correttamente conformati e, come tali, sono potenzialmente trattabili con agenti farmacologici capaci di ripristinarne la struttura nativa (i.e. chaperone farmacologici) [2]. Tuttavia, le proprietà strutturali di tali mutanti sono sconosciute, cosa che limita la progettazione razionale di farmaci.

Questo progetto transdisciplinare integra simulazioni molecolari dei mutanti ADRP della rodopsina, screening virtuale di librerie di composti, ed esperimenti in vitro e in vivo al fine di scoprire chaperone farmacologici.

La prima fase è consistita nello screening in silico e in vitro di 46 mutanti ADRP caratterizzati da variabili difetti nel folding. Gli esperimenti in silico su rodopsina nativa e mutata sono consistiti in simulazioni di denaturazione termica combinate con analisi delle reti strutturali proteiche basate sulla teoria dei grafi, in analogia con precedenti simulazioni di denaturazione meccanica [3]. Le mutazioni ADRP della rodopsina condividono variegate capacità di indebolire nodi iperconnessi della rete strutturale, hubs, localizzati essenzialmente nel sito di legame del retinale, che forma il nucleo di stabilità della proteina. La combinazione di determinati indici computazionali ha consentito la classificazione strutturale dei mutanti.

In parallelo, gli stessi mutanti sono stati clonati in vettori si espressione ed espressi in vitro in cellule COS-7. La loro localizzazione subcellulare è stata, quindi, analizzata mediante due anticorpi monoclonali specifici per le code N-terminale o C-terminale della rodopsina. Al fine di definire livelli di espressione e differenze nelle modificazioni post-translazionali dei mutanti rispetto al wild type, la proteina è stata analizzata mediante Western blotting.

Questi due livelli di analisi hanno consentito una caratterizzazione dei differenti mutanti basata su esperimenti in vitro. I risultati dell’analisi in vitro sono stati integrati con quelli dell’analisi strutturale al fine di generare la prima classificazione di mutanti ADRP basata su un approccio multiscala, cioè su scale atomica e cellulare. Queste informazioni saranno il punto di partenza per la scelta di mutazioni da testare per rivelare proprietà di chaperone farmacologici in piccoli composti individuati mediante screening virtuale e in vitro.

REFERENZE [1] Fanelli F, De Benedetti PG (2011) Chem Rev 111: PR438-535.

[2] Krebs MP, Holden DC, Joshi P, Clark CL, 3rd, Lee AH, et al.

(2010) J Mol Biol 395: 1063-1078.

[3] Fanelli F, Seeber M (2010) FASEB J 24: 3196-3209.

tolleranza immunologica. Al fine di comprendere il ruolo dei PHD fingers di AIRE in situazioni normali e patologiche abbiamo utilizzato un approccio strutturale e proteomico per studiare l’effetto di alcune mutazioni patologiche all’interno dei PHD fingers. I due PHD fingers sono strutturalmente indipendenti e non interagiscono fra di loro. La mutazione C446G nel secondo PHD finger distrugge il fold, causa una mislocalizzazione di AIRE e riduce l’attivazione dei geni target di AIRE. Mutazioni all’interno di AIRE-PHD1 compromettono la formazione di un complesso macromolecolare a livello cromatinico. In conclusione i nostri risultati rivelano il duplice ruolo dei PHD fingers di AIRE come i) domini necessari per l’attivazione dei geni target di AIRE e come ii) piattaforma d’interazione macromolecolare.

ABSTRACT N. 50 DTI - Altre Malattie Genetiche Responsabile

TCR07003 800.000

Num Centri: 1

Durata (anni): 5

Durata (anni): 5

Anno d’inizio: 2013

Settembre Carmine (1,2,3,10), Rossella De Cegli (1), Gelsomina Mansueto (1), Pradip Saha (4), Francesco Vetrini (2,3), Orane Visvikis (5), Tuong Huynh (2,3), Annamaria Carissimo (1), Donna Palmer (2), Tiemo Jürgen Klisch (2,3), Amanda Wollenberg (5), Diego Di Bernardo (1,6), Lawrence Chan Chan (4,7,8), Javier Irazoqui (5), Andrea Ballabio (1,2,3,9) (1) Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM), Via Pietro Castellino 111, 80131, Naples, Italy (2) Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, USA (3) Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children Hospital, Houston, Texas, USA (4) Diabetes and Endocrinology Research Center, Division of Diabetes, Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, USA (5) Program in Developmental Immunology, Department of Pediatrics, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, USA (6) Department of Systems and Computer Science, “Federico II” University of Naples, Naples, Italy (7) Departments of Molecular & Cellular Biology and Biochemistry, Baylor College of Medicine (8) St. Lukès Episcopal Hospital, Houston, Texas, USA (9) Medical Genetics, Department of Pediatrics, Federico II University, Via Pansini 5, 80131 Naples, Italy (10) Dulbecco Telethon Institute (DTI)

Il pathway lisosomiale-autofagico è attivato in seguito a deprivazione di nutrienti e svolge un ruolo importante sia nella degradazione cellulare che nel catabolismo lipidico. Tuttavia, la regolazione trascrizionale di questo processo in risposta a stimoli metabolici è attualmente non caratterizzato. Noi dimostriamo che il fattore di trascrizione EB (TFEB), il principale regolatore della biogenesi lisosomiale e autofagico, è indotto dalla carenza di nutrienti attraverso un circuito di autoregolazione ed esercita un controllo trascrizionale globale sul catabolismo dei lipidi attraverso la regolazione di PGC1a e PPARa. Così, durante il digiuno un meccanismo trascrizionale collega la via autofagica al metabolismo energetico cellulare. La conservazione di questo meccanismo in Caenorhabditis elegans suggerisce un ruolo fondamentale per TFEB nell’evoluzione della risposta adattativa alla privazione di cibo. l’overespressione di TFEB nel fegato previene l’aumento di peso e la sindrome metabolica in modelli murini di obseità suggerendo una nuova strategia terapeutica per i disturbi del metabolismo lipidico.

MUSCO GIOVANNA

Totale €

517.000

CONTROLLO DEL METABOLISMO DA PARTE DEL LISOSOMA

DTI - Altre Malattie Genetiche Telethon grant N.

TCP12008

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 49 Responsabile

SETTEMBRE CARMINE

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2008

BASI MOLECOLARI DELLA POLIENDOCRINOPATIA AUTOIMMUNE DI TIPO I: STUDI FUNZIONALI E STRUTTURALI SUL DOMINIO PHD FINGER DELLA PROTEINA AIRE Gaetani M (1), Matafora V (2), Spiliotopoulos D (1), Mollica L (1), Quilici G (1), Chignola F (1), Mannella V (1), Zucchelli C (1), Peterson P (3), Bachi A (2), Musco G (1) (1) Dulbecco Telethon Institute c/o S. Raffaele Scientific Institute, Biomolecular NMR Laboratory, Via Olgettina 58 20132, Milan, Italy, Tel. +39.02.26434824, Fax +39.02.26434824, E-mail: gmusco@dti.telethon.it (2) Biomolecular Mass Spectrometry Unit, San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy (3) Department of Molecular Pathology, University of Tartu, Estonia

ABSTRACT N. 51 DTI - Altre Malattie Genetiche Responsabile

Mutazioni nel gene aire causano la Sindrome Autoimmune poliendocrina, tipo 1. La proteina AIRE contiene due domini plant homeodomains (PHDs) che sono spesso target di mutazioni puntiformi patologiche. I PHD fingers di AIRE sono importanti per l’attività trascrizionale e presumibilmente giocano un ruolo cruciale nella formazione di un complesso multimerico a livello cromatinico che controlla la

SERAFINI MARTA

Telethon grant N.

TCP07004

Totale €

517.000

Num Centri: 1

Durata (anni): 5

Anno d’inizio: 2008

VALUTAZIONE DI UN APPROCCIO DI TERAPIA GENICA CON CELLULE STAMINALI PER IL TRATTAMENTO DELLA SINDROME DI HURLER

56

DULBECCO TELETHON INSTITUTE

PIEVANI ALICE (1,2), GATTO FRANCESCA (1,2), SACCHETTI BENEDETTO (4), REDAELLI DANIELA (1,2), BIONDI ANDREA (2,3), RIMINUCCI MARA (4), BIANCO PAOLO (4), SERAFINI MARTA (1,2)

(2) (3) (4) (5) (6)

(1) Dulbecco Telethon Institute at Tettamanti Research Center, Pediatric Department, University of Milano-Bicocca, San Gerardo Hospital, via Pergolesi, 33 20900 Monza, Italy, Tel. +39.039.2332232, Fax: +39.039.2332167, E-E-mail: serafini.marta@gmail.com (2) Centro Ricerca Tettamanti, Department of Pediatrics, University of MilanoBicocca, San Gerardo Hospital, Monza, Italy (3) Department of Pediatrics, University of Milano-Bicocca, San Gerardo Hospital, Monza, Italy (4) Department of Molecular Medicine, La Sapienza University, Rome, Italy

Lo stress ossidativo (SO) è considerato un fattore determinante per l’atrofia muscolare. Nonostante la sua azione nota sui sistemi proteino degradativi dell’ubiquitino proteasoma e dell’autofagia, i meccanismi alla base di questa relazione causa/effetto non sono stati ancora completamente chiariti.

L’aptoglobina (Hp), una proteina di fase acuta, ha importanti funzioni anti-ossidanti, essendo il principale carrier dell’emoglobina libera.

Scopo di questo studio è analizzare il fenotipo del muscolo scheletrico di topi knock-out per il gene Hp in condizioni normali e in seguito a stress metabolico determinato da esercizio fisico e da dieta ad alto contenuto di grassi (HFD).

Topi Hp-/- di 5 mesi allevati in condizioni standard mostrano una riduzione del 10% della superficie della sezione trasversale delle fibre muscolari del tibiale anteriore; non si rilevano segni di miopatia o di alterata distribuzione delle fibre glicolitiche e beta-ossidative. L’inalterata carbonilazione delle proteine si accompagna ad un’aumentata espressione di Nrf2, l’organizzatore della risposta anti-SO. L’espressione delle ubiquitino-ligasi Atrogin1 e MuRF1, e dei geni legati all’autofagia BNIP3 e Catepsina L risultano elevati. L’attivazione di Akt è inferiore, e l’espressione dell’inibitore di sintesi proteica 4EBP aumentata.

Quando sottoposti a corsa su rotarod i topi Hp-/-, ma non i WT, mostrano un calo di forza post esercizio. L’esercizio induce SO in entrambe i genotipi, ma gli effetti sono più pronunciati nel topo Hp-/-.

L’induzione del regolatore di mitocondriogenesi PGC1alpha, tipica dell’esercizio fisico, non avviene nei topi Hp -/-. Cat L e Bnip3 sono diminuiti in entrambi i genotipi, l’espressione di LC3 si mantiene ad alti livelli negli Hp-/- e aumenta nel WT, dove si osserva anche un incremento di p62.

L’effetto dell’esposizione ad HFD per 12 settimane è più pronunciato negli Hp -/- che hanno una riduzione del diametro della fibra del 20% contro il 10% dei WT. I topi obesi Hp-/-, diversamente dai WT, mostrano una forza ridotta anche in condizioni di riposo e un’aumentata carbonilazione delle proteine. HFD induce i sistemi ubiquitino proteasoma e autofagia in entrambi i genotipi, ma i topi Hp -/mostrano un aumento più evidente della lipidazione di LC3 e, diversamente dal WT, nessun incremento di p62.

In conclusione la mancanza di Hp ha effetti negativi sulla dimensione della fibra muscolare scheletrica nonostante l’attivazione della risposta anti SO. In condizioni di stress metabolico, la risposta muscolare del modello Hp -/- si diversifica dal WT: non si ha infatti una riposta anti-ossidativa addizionale, la biogenesi mitocondriale non viene modulata, la funzionalità del muscolo peggiora e si ha una perdita di massa muscolare in condizioni di obesità doppia rispetto al controllo.

Il topo Hp -/- rappresenta un nuovo modello per studiare i meccanismi attraverso i quali lo SO conduce ad atrofia muscolare, e per mettere a punto strategie di prevenzione e cura.

La mucopolisaccaridosi di tipo I (sindrome di Hurler o MPSIH) è una malattia genetica rara caratterizzata da un accumulo intracellulare di glicosaminoglicani (GAG) dovuto al deficit dell’attività dell’enzima alfa-L-iduronidasi, in conseguenza a mutazioni nel gene IDUA. La sindrome di Hurler presenta un ampio spettro di sintomi, tra cui anomalie scheletriche i cui meccanismi patogenetici non sono ancora chiari. E’ stato ipotizzato che parte di tali difetti sia dovuta ad un’insufficienza nel meccanismo di ossificazione endocondrale, il processo di formazione dell’osso a partire da cartilagine. Dal momento che sia osso che cartilagine appartengono al lineage mesenchimale, abbiamo caratterizzato le cellule stromali mesenchimali isolate dal midollo osseo (BM-MSC) dei pazienti MPSI. Al fine di studiare un possibile coinvolgimento delle BM-MSC nelle anomalie scheletriche della MPSI, abbiamo utilizzato un protocollo che permettesse di mimare in vivo l’ossificazione endocondrale. Questo sistema prevede una prima fase in vitro di formazione della cartilagine a partire dalle MSC, seguita poi da una fase in vivo di progressiva ossificazione. BM-MSC con la mutazione nel gene IDUA sono state isolate da pazienti MPSI e hanno mostrato una ridotta attività dell’enzima IDUA e un accumulo intracellulare di GAG. La velocità di espansione, il fenotipo, l’attività telomerasica e la capacità di differenziare in vitro in adipociti, osteoblasti, condrociti e cellule del muscolo liscio valutate in 3 diverse linee di BM-MSC isolate da pazienti MPSI sono risultate simili a quelle mostrate da BM-MSC ottenute da donatori sani di età comparabile.

Le BM-MSC MPSI hanno mostrato anche una capacità di differenziamento osteogenico in vivo simile a quella delle BM-MSC normali. La capacità di supportare l’osteoclastogenesi, invece, è risultata più elevata nelle BM-MSC MPSI, contestualmente con l’up-regolazione del pathway molecolare RANKL/RANK/OPG. I risultati ottenuti dall’impianto in vivo dei pellet cartilaginei ottenuti da 6 diversi pazienti hanno mostrato un’evidente riduzione nel processo di sostituzione dei templati cartilaginei da parte del tessuto osseo, suggerendo un deficit nell’ossificazione endocondrale. Stiamo ora cercando di studiare se il deficit dell’attività dell’enzima IDUA possa influenzare tale processo utilizzando linee di BM-MSC MPSI geneticamente modificate con un vettore IDUA-GFP. In questo modo sarà possibile valutare se l’inserimento del gene IDUA normale nelle BM-MSC MPSI possa contribuire alla reversione del meccanismo compromesso. Abbiamo dimostrato quindi che BM-MSC da pazienti MPSIH possono generare in vitro cartilagine, osso e muscolo liscio normali. Tuttavia, sia le BMMSC che gli osteoblasti derivati dai pazienti producono livelli aumentati di RANKL e mostrano un incremento nella capacità di stimolare la formazione di osteoclasti. Abbiamo, inoltre, osservato una differenza drammatica nella capacità delle BM-MSC MPSI di ricapitolare il processo di ossificazione endocondrale in vivo. I nostri risultati supportano l’ipotesi che uno dei meccanismi alla base delle anomalie scheletriche nella sindrome di Hurler riguardi quindi l’alterazione del processo di ossificazione endocondrale.

ABSTRACT N. 53 DTI - Altre Malattie Genetiche Responsabile

DTI - Altre Malattie Genetiche TCR07007

Totale €

800.000

Num Centri: 1

TCR08006

Totale €

800.000

Durata (anni): 5

Durata (anni): 5

Anno d’inizio: 2009

MODELLI CELLULARI ED ANIMALI PER L’IDENTIFICAZIONE DEI MECCANISMI DI PATOGENESI IN MALATTIE CISTICHE RENALI ASSOCIATE A MUTAZIONI DI UROMODULINA

MAFFEI MARGHERITA

Telethon grant N.

RAMPOLDI LUCA

Telethon grant N. Num Centri: 1

ABSTRACT N. 52 Responsabile

Dulbecco Telethon Institute (DTI) Department of Clinical and Experimental Medicine, University of Pisa Venetian Institute of Molecular Medicine, Padova University-Hospital, Department of Neuroscience, Pisa CNR, Istituto Scienze Alimentazione, Pisa

Schaeffer Céline (1), Trudu Matteo (1), Brunati Martina (1), Creatore Anna (1), Bernascone Ilenia (1), Amoroso Antonio (2), Ghiggeri GianMarco (3), Scolari Francesco (4), Rastaldi Maria Pia (5), Devuyst Olivier (6), Rampoldi Luca (1)

Anno d’inizio: 2008

COME LA MANCANZA DELL’ANTIOSSIDANTE APTOGLOBINA MODIFICA IL MUSCOLO SCHELETRICO E LA SUA RISPOSTA ALLO STRESS METABOLICO

(1) DTI, Molecular Genetics of Renal Disorders, Division of Genetics and Cell Biology, San Raffaele Scientific Institute, Via Olgettina 58, 20132 Milan, Italy, Tel. +39.02.26434947, Fax +39.02.26434767; E-mail: rampoldi.luca@hsr.it (2) Department of Genetics, Biology and Biochemistry, University of Turin, Turin (3) Division of Nephrology, G. Gaslini Children Hospital, Genoa (4) Division of Nephrology, Hospital of Montichiari, Brescia (5) Fondazione IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico, Milan (6) Institute of Physiology, University of Zurich, Zurich, Switzerland

Scabia Gaia (2,3), Bertaggia Enrico (2,4), Dalise Stefania (5), Santini Ferruccio (3), Chisari Carmelo (5), Sandri Marco (2,4), Maffei Margherita (1,2,3,6) (1) Ospedale di Cisanello, Edificio 8, U.O. Endocrinologia, via Paradisa, 2, 56124, Pisa, Tel +39.050.995169, Fax +39.050.578778 E-mail: maffeim@immr.med.unipi.it

57

DULBECCO TELETHON INSTITUTE

Il nostro laboratorio ha precedentemente riportato che PC-1 media tubulogenesi, riarrangiamenti nel cistoscheletro di actina e migrazione cellulare in un modo dipendente da PI3kinase (Boca et al, 2007).

Abbiamo studiato lo sviluppo renale in un modello murino inattivato per il gene Pkd1. recentemente è stato descritto un processo biologico chiamato convergent extension secondo il quale un tubulo renale stabilisce il proprio diametro durante lo sviluppo embrionale.

Difetti nello stabilire un corretto diametro potrebbero stare alla base della formazione delle cisti. Abbiamo trovato che reni embrionali derivati da topi Pkd1-/- presentano un difetto di convergent extension e che i tubuli hanno un diametro maggiore rispetto ai controlli.

Inoltre, abbiamo osservato che l’espressione della PC-1 e quella di Par3 sono regolati durante lo sviluppo renale in un modo molto simile.

Usando un sistema cellulare che ci permette di osservare la polarità cellulare durante la migrazione cellulare abbiamo notato che la policistina è importante per questo processo. Inoltre, abbiamo visto che PC-1 è in grado di regolare la proteina della polarità Par3 e in particolare la sua associazione con la chinasi aPKC. Abbiamo quindi testato se PC-1 fosse in grado di associarsi direttamente al complesso. A questo scopo abbiamo utilizzato un nuovo modello murino sviluppato nel nostro laboratorio, che permette la visualizzazione della PC-1 endogena grazie all’inserimento di tags multipli a valle del gene Pkd1 endogeno. Abbiamo osservato che PC-1 co-immunoprecipita con aPKC e Par3, ma non con Par6, sia in fibroblasti, che nei reni in vivo. Infine, l’inattivazione del gene Par3 specificamente nel rene è in grado di indurre un difetto di sviluppo renale simile a quello osservato nei reni mutanti per il gene Pkd1.

Proponiamo un modello in cui PC-1 è in grado di regolare il complesso Par3/aPKC in diversi contesti, incluso un processo di convergent extension durante lo sviluppo renale che determina la diminuzione di diametro dei tubuli renali e ne previene la dilatazione e la formazione di cisti.

La malattia cistica della midollare renale (MCKD) e la nefropatia iperuricemica familiare giovanile (FJHN) sono malattie autosomiche dominanti caratterizzate da alterazione della capacità di concentrazione delle urine, fibrosi tubulo-interstiziale, ipeuricemia e gotta, cisti renali ed insufficienza renale cronica. Non esistono ad oggi terapie specifiche, se non la dialisi ed il trapianto di rene. MCKD/FJHN sono causate da mutazioni del gene UMOD che codifica per uromodulina e sono collettivamente chiamate malattie renali associate ad uromodulina (UAKD). L’uromodulina è una proteina prodotta nel rene dalle cellule tubulari epiteliali e secreta nelle urine. Il suo ruolo non è ancora chiaro, sebbene si pensi sia importante per la protezione dalle infezioni delle vie urinarie e dai calcoli, per l’assorbimento tubulare di sale e per l’immunità innata renale (Rampoldi et al, 2011).

Il nostro progetto di ricerca ha lo scopo di identificare i meccanismi molecolari di patogenesi di UAKD. Ad oggi sono state descritte più di 60 mutazioni di UMOD, la maggioranza delle quali sono cambi missenso che probabilmente alterano la conformazione della proteina. Abbiamo precendetemente dimostrato che le mutazioni di uromodulina portano ad un difetto del trasporto intracellulare e ritenzione nel reticolo endoplasmatico (ER) della proteina mutata (Bernascone et al, 2006). Questi dati sono in accordo con quanto osservato nelle biopsie renali di pazienti, ovvero la presenza di aggregati intracellulari di uromodulina nell’ER delle cellule epiteliali renali. Abbiamo inoltre dimostrato che parte della proteina mutata può sfuggire ai meccanismi di controllo cellulari e raggiungere la membrane plasmatica, dove tende a formare grossi aggregati intrappolando la proteina wild type (Schaeffer et al, 2012).

Per comprendere le conseguenze fisiologiche delle mutazioni di UMOD, abbiamo generato un topo transgenico esprimente uromodulina mutata (Bernascone et al, 2010).

Questo modello svilluppa una malattia molto simile a quella umana, caratterizzata da progressivo danno tubulo-interstiziale ed insufficienza renale cronica. La ritenzione di uromodulina mutata nel ER precede tutti gli altri sintomi e rappresenta un evento chiave nella patogenesi della malattia. L’analisi del profilo trascrizionale di reni di animali pre-sintomatici evidenzia l’attivazione precoce di segnali pro-fibrotici ed infiammatori. Alcuni di questi segnali sono presenti in animali di una settimana di età, ben prima dello sviluppo di un danno renale visibile all’analisi istologica.

Tali risultati dimostrano chiaramente un effetto “guadagno di funzione” delle mutazioni di uromodulina ed un ruolo chiave del processo fibrotico/infiammatorio nell’insorgenza della malattia. I nostri studi rappresentano un ulteriore passo verso l’identificazione di una possibile terapia per UAKD che potrebbe avere una più ampia ricaduta per altre forme di nefrite tubulo-interstiziale o altre malattie da accumulo.

ABSTRACT N. 55 DTI - Altre Malattie Genetiche Responsabile

800.000 Durata (anni): 5

Anno d’inizio: 2010

UN MECCANISMO DI MEMORIA EPIGENETICA AD RNA Onorati Maria Cristina, Arancio Walter, Corona Davide F.V. Dulbecco Telethon Institute c/o Università degli Studi di Palermo, Dipartimento STEMBIO, Sezione di Biologia Cellulare, Viale delle Scienze, Palermo, Tel. +39.091.23897345, E-mail: dcorona@dti.telethon.it

Una questione centrale nel campo dell’epigenetica e della rigenerazione tissutale è quella di capire come le cellule terminalmente differenziate possono ereditare le complesse modificazioni della cromatina da parte della loro cellula madre. Anche se diversi meccanismi sono stati ipotizzati per spiegare la determinazione ed il mantenimento dell’identità cellulare, non è ancora chiaro in che modo durante la mitosi le modifiche epigenetiche a carico della cromatina vengano trasmesse dopo la replicazione del DNA. Al fine di svelare la natura molecolare della memoria epigenetica delle cellule somatiche, abbiamo usato classici saggi di variegazione per effetto di posizione per verificare se alleli del gene white, che non sono in grado di produrre un trascritto codificante, possano modificare la variegazione del colore degli occhi causati da una inversione del gene white nell’eterocromatina (wm4h). I nostri dati mostrano che diversi alleli di white sopprimono la variegazione di wm4h, determinando un aumento della pigmentazione dell’occhio.

Inaspettatamente, la presenza di alleli bianchi non funzionali provoca un aumento della trascrizione genica di wm4h nonché un’apertura nella struttura della cromatina nel locus wm4h. Sorprendentemente, questo effetto è ereditabile per diverse generazioni ed è mediato da diversi ncRNAs codificati dal locus white, un fenomeno altamente reminiscente della paramutazione mediata da RNA. I nostri dati indicano che la presenza di un gene non funzionale, che non produce un trascritto codificante, ma potenzialmente solo ncRNA, può influenzare in trans l’espressione di una copia funzionale del gene stesso silenziato nell’eterocromatina. I nostri dati suggeriscono che le cellule possono “misurare” la presenza di RNA non codificanti, ereditati dalle loro cellule madri, e possono essere utilizzati per ripristinare epigeneticamente il loro programma trascrizionale dopo la replicazione del DNA.

DTI - Altre Malattie Genetiche BOLETTA ALESSANDRA

Telethon grant N.

GGP12183

Totale €

388.800

Num Centri: 1

TCR09002

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 54 Responsabile

CORONA DAVIDE

Telethon grant N.

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2012

VERSO LA COMPRENSIONE DELLA FUNZIONE DI POLICISTINA-1 E L’IDENTIFICAZIONE DI TARGET TERAPEUTICI SPECIFICI PER ADPKD Castelli Maddalena (1), Boca Manila (1), Chiaravalli Marco (1), Ramalingam Harini (2), Distefano Gianfranco (1), Carroll Thomas (2), Boletta Alessandra (1) (1) Dulbecco Telethon Institute (DTI) at Dibit San Raffaele, via Olgettina, 58, 20132 Milano, Italy, Tel. 02.2643.4805 (2) University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas, USA

Il rene policistico autosomico dominante (ADPKD) è una delle malattie genetiche più comuni con un’incidenza di 1 su 1000. La caratteristica principale di questa malattia è il formarsi cisti in entrambi i reni.

Mutazioni in due geni sono state associate con ADPKD: PKD1 e PKD2. Il primo è responsabile per l’85% dei casi mentre il secondo per il restante 15%.

Il principale interesse del nostro gruppo è di capire la funzione del prodotto genico di PKD1, la Policistina-1 (PC-1). Questa è un recettore di membrana di 520 KDa coinvolto nell’induzione e mantenimento di uno stato differenziato in cellule epiteliali renali.

58

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

In studi precedenti abbiamo dimostrato che la ciclina D3 è indotta durante il differenziamento di mioblasti in vitro tramite meccanismi controllati da MyoD e pRb, due fondamentali regolatori della miogenesi (1,2). In questo studio, abbiamo dimostrato che l’inibizione dell’espressione della ciclina D3 riduce la capacità proliferativa dei mioblasti e induce prematuramente il loro differenziamento terminale. La ciclina D3 gioca quindi un ruolo essenziale nel mantenimento di un corretto equilibrio tra proliferazione e differenziamento dei mioblasti.

Topi geneticamente deprivati di ciclina D3 non presentano evidenti difetti nel muscolo ma hanno ridotta dimensione corporea e ridotta massa muscolare. Abbiamo determinato che i muscoli privi di ciclina D3 contengono miofibre pù piccole del normale e un minor numero di cellule satelliti. Quindi, la ciclina D3 sembra essere coinvolta nella crescita delle fibre muscolari controllando la funzione delle cellule satelliti. Inoltre, l’analisi di mioblasti primari e di cellule satelliti associate a singole fibre in coltura ha dimostrato che mioblasti privi di ciclina D3 hanno un ridotto potenziale proliferativo, una alta propensità a differenziare e una ridotta capacità di autoriprodursi. L’analisi del processo rigenerativo indotto da danno al muscolo ha inoltre dimostrato che nelle fasi precoci della rigenerazione i muscoli privi di ciclina D3 contengono un numero inferiore di precursori proliferanti e, in concomitanza, un numero maggiore di miofbre di nuova sintesi. Alla fine della rigenerazione, i muscoli privi di ciclina D3 mostrano miofibre rigenerate di dimensione ridotta e un numero inferiore di cellule satelliti che sono ritornatate allo stato qiuescente. I nostri risultati dimostrano che la funzione della ciclina D3 è necessaria durante la rigenerazione muscolare per l’espansione proliferativa delle cellule progenitrici miogeniche e per la autoriproduzione di cellule satelliti disponibili per successivi cicli di rigenerazione.

1. Cenciarelli et al., (1999). Critical role played by cyclin D3 in the MyoD-mediated arrest of cell cycle during myoblast differentiation.

Mol. Cell. Biol. 19, 5203-5217.

2. De Santa et al., (2007). pRb-Dependent Cyclin D3 Protein Stabilization Is Required for Myogenic Differentiation. Mol. Cell. Biol. 27, 7248-7265.

ABSTRACT N. 56 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

MINCHIOTTI GABRIELLA

Telethon grant N.

GGP08120

Totale €

261.800

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2008

UN NUOVO BERSAGLIO MOLECOLARE PER LA TERAPIA DEL DANNO MUSCOLARE E DELLE MIOPATIE Guardiola Ombretta (1), Iaconis Salvatore (1), Andolfi Gennaro (1), Tajbakhsh Shahragim (2), Minchiotti Gabriella (1) (1) Institute of Genetics and Biophysics “A. Buzzati-Traverso”, CNR, Via Pietro Castellino 111, Naples, Italy, Tel. 081.6132357, E-mail: gabriella.minchiotti@igb.cnr.it (2) Institut Pasteur, Stem Cells & Development, CNRS URA 2578, Paris, France

Il tessuto muscolare reagisce ad un danno causato da un trauma o dalla malattia attivando processi molto complessi e coordinati che coinvolgono le interazioni di diverse popolazioni cellulari che promuovono l’infiammazione, la rigenerazione muscolare, e l’angiogenesi, la cui conoscenza è ancora limitata. È quindi indispensabile conoscere i meccanismi che sono alla base delle interazioni cellulari e molecolari che regolano la rigenerazione muscolare al fine di promuovere terapie efficaci per le malattie muscolari come le distrofinopatie. Il nostro gruppo di ricerca ha identificato la proteina Cripto quale nuova molecola chiave in questo processo, ed un promettente target terapeutico. Cripto è un gene chiave nell’embriogenesi e nel differenziamento delle cellule staminali embrionali, tuttavia il suo ruolo nella vita adulta è ancora da chiarire. Abbiamo recentemente dimostrato che Cripto è riespresso nel muscolo scheletrico durante la rigenerazione. Cripto è espresso sia nelle cellule satelliti che in quelle infiammatorie, entrambe le popolazioni svolgono un ruolo chiave nel processo di rigenerazione. Quindi, al fine di distinguere il contributo cellulare di Cripto nella rigenerazione muscolare, abbiamo generato un nuovo modello murino, un mutante condizionale di Cripto nelle cellule staminali muscolari (cellue satelliti), e abbiamo dimostrato che l’inattivazione di Cripto in cellule satelliti adulte compromette la rigenerazione muscolare. Questi risultati forniscono la prova diretta che Cripto ha un ruolo chiave nelle cellule staminali muscolari, ed è necessario per una efficace rigenerazione. Inoltre, abbiamo dimostrato che una forma solubile della proteina Cripto (sCripto) è capace di recuperare i difetti di rigenerazione osservati nel mutante condizionale di Cripto, fornendo così la prova diretta che sCripto ricapitola pienamente la funzione della protein Cripto endogena. Tutti insieme i nostri dati forniscono la prova diretta di un ruolo chiave di Cripto nelle cellule satelliti, e nel complesso processo di rigenerazione del muscolo scheletrico, e svelano il potenziale della proteina Cripto nel trattamento delle distrofinopatie.

ABSTRACT N. 58 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

213.900 Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2011

IL CONTROLLO INTRA-CELLULARE DEL SEGNALE DELL’ORMONE TIROIDEO NELLE CELLULE STAMINALI DI MUSCOLO E NELLA DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE Dentice Monica, Ambrosio Raffaele, Sibilio Annarita, Luongo Cristina, Salvatore Domenico Department of Molecular and Clinical Endocrinology and Oncology, University of Naples “Federico II” - Tel. +39 081 7463780, Fax +39 081 7463668; E-mail: domsalva@unina.it

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari

La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è la più comune forma di distrofia muscolare, causata da una severa e progressiva perdita del muscolo.

L’ormone tiroideo attivo (T3) deriva sia direttamente dalla secrezione tiroidea che indirettamente dalla deiodinazione del pro-ormone tiroxina (T4). La maggiore quantità intracellulare di T3 deriva dalla desiodasi di tipo 2 (D2), la sola desiodasi attivante l’ormone tiroideo (OT) espressa nel muscolo; mentre la desiodasi di tipo 3 (D3) svolge una funzione opposta, catalizzando l’inattivazione di T4 e T3.

I nostri studi precedenti hanno chiaramente mostrato che l’enzima D2 è un componente essenziale del programma miogenico per lo sviluppo e rigenerazione del muscolo. Muscoli privi di D2 (Dio2 null) hanno una ridotta quota intracellulare di T3 e mostrano difetti miogenici e rigenerativi significativi, nonostante le normali concentrazioni sieriche dell’OT. L’obiettivo generale di questo studio è di analizzare il ruolo del signaling dell’OT e del suo controllo locale, mediato dalle desiodasi, nella biologia delle cellule staminali del muscolo (cellule satelliti) e nel processo di rigenerazione. Attraverso linee murine geneticamente modificate e colture primarie di cellule staminali muscolari, ci proponiamo di modificare la fisiologia della cellula staminale muscolare manipolando le concentrazioni cellulari di OT. I nostri dati preliminari suggeriscono che il controllo dell’OT, mediato dalle desiodasi, influisce significativamente sulla fisiologia della cellula satellite. Inoltre, dato che questi cambiamenti sono reversibili, ci si apre la possibilità di sfruttare le desiodasi come nuovi tar-

CARUSO MAURIZIA

Telethon grant N.

GGP08126

Totale €

199.000

Num Centri: 1

GGP11185

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 57 Responsabile

SALVATORE DOMENICO

Telethon grant N.

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2008

RUOLO DELLA CICLINA D3 NELLA REGOLAZIONE DELL’ATTIVITÀ DELLE CELLULE SATELLITI DURANTE LA RIGENERAZIONE MUSCOLARE De Luca Giulia, Ferretti Roberta, Bruschi Marco, Caruso Maurizia CNR, Istituto di Biologia Cellulare e Neurobiologia, Via del Fosso di Fiorano 64, 00143 Roma, Tel. 06.501703186, Fax 06.501703311, E-mail: maurizia.caruso@cnr.it

Il potenziale rigenerativo del musclo adulto è dovuto a cellule staminali specializzate, dette satelliti, che risiedono in stretto contatto con le fibre muscolari mature.La conoscenza dei meccanismi che regolano la funzionalità di queste cellule è essenziale per la progettazione di nuove strategie di rigenerazione nelle distrofie muscolari.

Le cellule satelliti sono normalmente quiescenti, ma in risposta a danno al muscolo o a malattia degenerativa, proliferano rapidamente prima di differenziare per formare nuove miofibre. Tuttavia, una sottopopolazione di queste cellule non differenzia ma ritorna allo stato quiescente per ripopolare la nicchia di cellule staminali.

59

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

get terapeutici per manipolare la fisiologia delle cellule staminali del muscolo. Qui noi riportiamo che in risposta a stimoli proliferativi, così come nel caso di danno acuto al muscolo scheletrico, la D3 l’enzima inattivante l’OT – è specificamente indotta nelle cellule satelliti, dove riduce il signaling intracellulare dell’OT. L’ablazione genetica di D3, specificamente nelle cellule satelliti, compromette la rigenerazione del muscolo scheletrico.

In conclusione, i nostri dati indicano che l’enzima D3 è utilizzato dinamicamente in vivo per attenuare il signaling dell’OT e orchestrare contemporaneamente i programmi di attivazione e repressione di distinti geni richiesti per la progressione e la sopravvivenza delle cellule satelliti nel muscolo.

20132 Milan Fax +3902 2643 4621 E-mail: cossu.giulio@hsr.it (2) Department of Physiology and Interuniversity Institute of Myology, University of Pavia, 27100, Pavia (3) Department of Biomedical Science, Institute of Regenerative Medicine and Biofunction, Tottori University, Yonago, Japan (4) Universite ´ Pierre et Marie Curie/Paris 6/Inserm UMR_S 974, CNRS UMR 7215, Institut de Myologie, Groupe Hospitalier Pitié-Salpétrière, Paris (5) San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy, 20132 Milan, Italy.

(6) Department of Life Sciences, University of Milan, 20133, Milan, Italy (7) Departmentof Biology, University of Tor Vergata, Rome (8) Stem Cell Laboratory, Department of Neurological Science, University of Milan

La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una malattia genetica, causata dall’assenza della proteina distrofina, che causa un progressivo deterioramento del tessuto muscolare scheletrico. Questo progetto si propone di sviluppare un nuovo approccio di terapia cellulare autologo per la DMD, basato sul trapianto di mesoangioblasti (MABs, progenitori associati ai vasi) umani distrofici, il cui difetto genetico sia stato precedentemente corretto con un cromosoma artificiale umano (HAC) contenente l’intero locus della distrofina (DYS-HAC).

Gli HACs presentano diversi vantaggi rispetto ai vettori normalmente impiegati nella terapia genica, tra cui il mantenimento in forma episomale e la capacità di contenere intere regioni geniche comprensive di elementi regolatori. Recentemente abbiamo dimostrato l’efficacia di trasferimento del DYS-HAC in MABs murini distrofici (mdx(DYSHAC)MABs). Gli mdx(DYS-HAC)MABs si sono mostrati in grado di colonizzare efficacemente il muscolo scheletrico di topi distrofici, producendo un considerevole numero di fibre esprimenti la distrofina le quali hanno permesso un significativo e stabile miglioramento morfologico e funzionale del fenotipo distrofico (Tedesco et al. Sci. trasl. Med. 2011). L’estensione di questo protocollo a mesoangioblasti umani (hMABs) non è direttamente possibile poichè in coltura i hMABs entrerebbero in senescenza dopo la selezione necessaria per isolare le cellule in cui il DYS-HAC è stato tarsferito. È necessario pertanto un processo di immortalizzazione reversibile che è stato ottenuto mediante trasduzione con vettori lentivirali “floxati” esprimenti hTERT(iresHSV1-TK) e Bmi-1(iresHSV1-TK), per impedire rispettivamentemte l’accorciamento dei telomeri e l’azione anti-proliferativa di p16. Popolazioni policlonali e clonali sono state selezionate per l’espressione di hTERT e Bmi-1 e quindi caratterizzate per la capacità proliferativa, la non tumorigenicità e il potenziale miogenico in vitro. In seguito la stessa strategia è stata adottata per immortalizzare i hMABs distrofici (DMD hMABs) prima del trasferimento di un nuovo DYS-HAC privato di transgeni immunogenici (DYS-HAC2). Dal trasferimento del DYS-HAC2 sono stati ottenuti cloni in cui la presenza dell’HAC è stata confermata sia per PCR sia per FISH. Al momento stiamo testando la reversibilità dell’immortalizzazione, tramite l’utilizzo di un lentivirus non integrante esprimente la Cre ricombinasi, e la potenzialità di tali cloni di colonizzare il muscolo scheletrico distrofico formando fibre esprimenti la distrofina.

ABSTRACT N. 59 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

CLEMENTI EMILIO

Telethon grant N.

GGP07006

Totale €

268.400

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2007

BASI MOLECOLARI DELL’AZIONE TERAPEUTICA DEL NITROFLURBIPROFENE (HCT1026), UN ANTI-INFIAMMATORIO CHE RILASCIA NITROSSIDO, NELLA DISTROFIA MUSCOLARE: ANALISI DELLA SRUTTURA E FUNZIONALITÀ DEI MITOCONDRI NELLA RIGENERAZIONE E SVILUPPO MUSCOLARE De Palma Clara (1), Touvier Thierry (2), Brunelli Silvia (3), Clementi Emilio (1) (1) Università degli Studi di Milano - Dip Scienze Biomediche e Cliniche L. Sacco, via GB Grassi 74, 20157 Milano, E-mail: emilio.clementi@unimi.it; Tel. 366.6227327, 02.50319646 (2) IRCCS E. Medea, Bosisio Parini, LC (3) Dip Medicina Sperimentale, Università di Milano Bicocca, Milano

I protocolli terapeutici in uso per il trattamento della distrofia muscolare sono basati sulla somministrazione di corticosteroidi; si tratta, tuttavia, di terapie non risolutive e accompagnate dall’insorgenza di severi effetti collaterali. Gli approcci di terapia genica e cellulare oggi in studio sono molto costosi e utilizzabili per la cura solo di specifici sottogruppi di pazienti. Il trattamento farmacologico, pur non risolvendo il difetto genetico, può ancora oggi offrire numerosi vantaggi, in quanto si tratta di un approccio economicamente sostenibile ed applicabile a tutti i pazienti, e che può ritardare la progressione della patologia. Nel corso di questo progetto, ora concluso, abbiamo dimostrato in studi preclinici l’efficacia di farmaci donatori di nitrossido (NO) quando associati a farmaci antiinfiammatori non steroidei nel rallentare il decorso della malattia. Abbiamo inoltre studiato il meccanismo alla base dell’azione di NO dimostrando un ruolo importante dei processi di fissione e fusione mitocondriale, identificando nel controllo della funzione della proteina di fissione mitocondriale DRP-1 un’ importante chiave di regolazione della miogenesi riparativa da parte di NO. Abbiamo generato un topo esprimente DRP-1 nel muscolo scheletrico. In questo modello sperimentale abbiamo identificato diversi parametri alterati di funzionalità e struttura muscolare classicamente osservabili nelle forme umane di miopatia

ABSTRACT N. 61 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

Durata (anni): 2

Anno d’inizio: 2011

COSSU GIULIO

Telethon grant N.

GGP08030

Totale €

329.900

Num Centri: 1

716.000

ALLO-TRAPIANTO DI MESOANGIOBLASTI DA DONATORE HLA-IDENTICO PER LA TERAPIA CELLULARE DELLA DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

GSP11002

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 60

COSSU GIULIO

Telethon grant N.

Durata (anni): 3

Cossu Giulio (1), Napolitano Sara (2), Cicalese Maria Pia (2), Previtali Stefano (3), Venturini Massimo (4), Politi Letterio Salvatore (5), Fiori Rossana (6), Tedesco Francesco Saverio (1), Noviello Maddalena (1), Tettamanti Andrea (7), Nicastro Francesca (7), Godi Claudia (7), Marktel Sarah (2), Natali-Sora Maria Grazia (3), Scarlato Marina (3), Ciotti Francesca (2), Giuliani Serena (2), Tonlorenzi Rossana (3), Bonini Chiara (1), Torrente Yvan (8), Ciceri Fabio (2)

Anno d’inizio: 2008

IMMORTALIZZAZIONE REVERSIBILE E TRASDUZIONE DI MESOANGIOBLASTI DMD CON UN CROMOSOMA ARTIFICIALE ESPRIMENTE LA DISTROFINA PER LA TERAPIA CELLULARE DELLA DISTROFIA MUSCOLARE

(1) Division of Regenerative Medicine San Raffaele Hospital Via Olgettina 58 20132 Milan, Fax +39.02.26434621, E-mail: cossu.giulio@hsr.it (2) Hematology and BMT Unit, Department of Oncology, San Raffaele Hospital, Milano, Italy (3) Institute of Experimental Neurology, San Raffaele Scientific Hospital, Milan, Italy (4) Department of Radiology, San Raffaele Hospital, Milan, (5) Department of Neuroradiology, San Raffaele Hospital, Milan (6) Department of Anesthesiology, San Raffaele Hospital, Milan (7) Physiotherapy and Rehabilitation, San Raffaele Hospital, Milan

Benedetti Sara (1), Tedesco Francesco Saverio (1), Hoshiya Hidetoshi (1), D’Antona Giuseppe (2), Gerli Mattia (1), Ragazzi Martina (1), Yasushiro Kazuki (3), Tonlorenzi Rossana (1), Chaouch Soraya (4), Lombardo Angelo (5), Antonini Stefania (6), Gargioli Cesare (7), Naldini Luigi (5,1), Torrente Yvan (8), Bottinelli Roberto (2), Messina Graziella (6), Oshimura Mitsuo (3), Cossu Giulio (1,6) (1) Division of Regenerative Medicine San Raffaele Hospital. Via Olgettina 58

60

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

nell’intestino per almeno 48 ore. L’analisi delle criosezioni dei topi trattati con iniezioni multiple (i.p.) di ZM4-IR ha mostrato la fluorescenza fino a 60 giorni dopo l’ultimo inoculo. Per la via orale è risultato positivo solamente l’ileo con un segnale visibile fino a 7 giorni dopo l’ultima somministrazione; tutti i tessuti analizzati 30 giorni dopo l’ultimo trattamento orale sono apparsi negativi. L’analisi delle feci e delle urine dopo somministrazione i.p. ha indicato che le nanoparticelle vengono eliminate sia attraverso le feci sia tramite le urine, mentre per la via orale sono eliminate principalmente con le feci. In seguito abbiamo trattato per 12 settimane, per via orale, i topi mdx con i complessi ZM2-AON incapsulati o no con l’alginato.

Abbiamo osservato un moderato ripristino della sintesi di distrofina nella muscolatura liscia intestinale e una lieve positività nel diaframma solo in presenza di alginato. Infine abbiamo sintetizzato e testato un nuovo tipo di nanoparticelle, le ZM5, che a differenza delle ZM2 sono più piccole e non sono costituite dal NIPAM. L’analisi in vivo dopo singola o multipla somministrazione di ZM5-IR ha dimostrato la loro presenza nel lume intestinale per 48 ore. Le ZM5IR erano presenti nelle criosezioni di fegato, intestino e diaframma; la maggior delle ZM5-IR è stata eliminata attraverso le feci nelle prime 36 ore, come per le ZM4-IR. Questi risultati preliminari suggeriscono che le ZM5 sono nanoparticelle capaci di superare la barriera intestinale distribuendosi in diversi distretti dell’organismo.

Questi dati incoraggiano ad approfondire lo studio della via orale come via di somministrazione delle molecole antisenso.

(8) Department of Neurology and Laboratory of Neuroscience, University of Milan, Ospedale Maggiore Policlinico, Milan

Uno studio mono-centrico, sequenziale, non randomizzato, “openlabel” di fase I-II di terapia cellulare basato sul trapianto intra-arterioso di mesoangioblasti allogenici da un familiare HLA-identico é in corso in cinque pazienti affetti da Distrofia Muscolare di Duchenne, in regime di immuno-soppressione con Tacronimus.

Il protocollo prevede quattro infusioni consecutive (ad intervallo bimensile) a dosi crescenti di cellule.

L’obiettivo primario dello studio é la sicurezza per cui gli eventi avversi sono monitorati. Al tempo stesso viene studiato un possible effetto dell’infusione nel modificare la forza muscolare.

I mesoangioblasti sono progenitori associati ai vasi sanguigni che possono essere espansi in vitro e hanno mostrato efficiacia nel migliorare la struttura e la funzione del muscolo distrofico in modelli murini e canini.

Le cellule umane sono state caratterizzate ed espanse come prodotto medicinale in condizioni GMP presso MolMed, Milano.

Studi di tossicologia, condotti da Accelera, Nerviano, hanno mostrato l’assenza di effetti tossici acuti o cronici. Infine, abbiamo preliminarmente condotto uno studio osservazionale (DMD01) della durata di un anno in una coorte di 28 pazienti Duchenne, misurando la loro forza muscolare a distanza di tre mesi (Lerario et al. BMC Neurology 2012): 5 di questi pazienti sono risultati elegibili per il trapianto a causa di un fratello HLA-identico.

I risultati dei primi tre pazienti hanno mostrato una stabilizzazione della motilità e della forza contrattile che invece stavano deteriorando rapidamente in due dei tre pazienti. Il terzo paziente aveva già perso la deambulazione 6 mesi prima di iniziare il trial. Inoltre abbiamo trovato DNA del donatore (fino al 0.7%) in due pazienti e distrofina del donatore in un paziente per analisi per Western Blot analysis. Questo paziente non ha linfociti T reattivi contro le cellule del donatore. Due ulteriori pazienti iniziano il tapianto nel Novembre 2012 e i risultati saranno disponibili verso la fine del 2013.

ABSTRACT N. 63 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

FERLINI ALESSANDRA GGP09093

Totale € Num Centri: 4

Durata (anni): 2

Anno d’inizio: 2009

Meregalli Mirella (1), Farini Andrea (1), Belicchi Marzia (1), Parolini Daniele (1), Sitzia Clementina (1), Razini Paola (1), Cassinelli Letizia (1), Da Silva Bzario Joao Carlos (2), Garcia Luis (3), Torrente Yvan (1)

515.700 Durata (anni): 2

98.100

MODIFICAZIONE GENICA DI CELLULE STAMINALI DISTROFICHE ALLO SCOPO DI TRAPIANTO AUTOLOGO NELLA DISTROFIA MUSCULARE DI DUCHENNE

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Telethon grant N.

GGP09292

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 62 Responsabile

TORRENTE YVAN

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2009

(1) Laboratorio Cellule Staminali, Dipartimento di Fisiopatologia Medico-Chirurgica e dei Trapianti, Università degli Studi di Milano, Fondazione IRCCS Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico di Milano, Centro Dino Ferrari, via F. Sforza, 35 20122 Milano, Tel. 0039-02-55033874, Fax 0039-02-50320430; Email: yvan.torrente@unimi.it (2) AADM/UNAERP Ribeirao Preto-SP-Brazil (3) UMR S 787, INSERM/UPMC, Institut de Myologie, Facultè de Medecine Pierre et Marie Curie, Paris Cedex 13, France

VALUTAZIONE PRE-CLINICA DI NANOPARTICELLE BIOCOMPATIBILI COME SISTEMA DI TRASPORTO DI OLIGORIBONUCLEOTIDI ANTISENSO PER INDURRE IL RIPRISTINO DI DISTROFINA TRAMITE “EXON SKIPPING” Falzarano Maria Sofia (1), Bassi Elena (1), Fabris Marina (1), Perrone Daniela (2), Sabatelli Patrizia (3), Maraldi Nadir (3), Donà Silvia (4), Bonaldo Paolo (4), Braghetta Paola (4), Rimessi Paola (1), Sparnacci Katia (5), Laus Michele (5), Ferlini Alessandra (1)

Nella Distrofia Muscolare di Duchenne, sono molto colpiti sia i muscoli scheletrici che cardiaci. La terapia cellulare è un approccio promettente; le cellule staminali, infatti, possono essere isolate da un donatore sano o, quando possibile dallo stesso paziente. Nel primo caso le cellule saranno trapiantate in un regime di soppressione immunitaria, mentre nel secondo caso, le cellule dovranno essere geneticamente corrette prima del trapianto nello stesso paziente da cui sono state derivate. Il nostro laboratorio ha messo a punto la tecnica di “exon skipping” per trovare nuovi strumenti finalizzati al trattamento della DMD. Abbiamo, per questo, trattato cani GRMD poiché rappresentano il modello animale clinicamente più simile alla distrofia muscolare umana. Abbiamo isolato cellule CD133+ da biopsie muscolari di cani GRMD di un anno di età caratterizzati da un fenotipo clinico intermedio e grave. La scelta di utilizzare cani anziani è giustificata dalla necessità di mettere a punto una terapia che non sia efficace solo in soggetti giovani ma anche in pazienti adolescenti o adulti. I cani sono stati trattati con le proprie cellule CD133+ trasdotte con un vettore lenti virale U7exon6-8 in grado di saltare gli esoni 6-8. Tutti i cani hanno ricevuto 2 iniezioni arteriose sistemiche. Dopo l’iniezione, abbiamo effettuato diverse misure funzionali: claim Stairs (Time), nuoto, 6 minute walking test (6MWT). I cani iniettati con cellule CD133+ non ingegnerizzate e i cani non trattati sono sopravvissuti un anno circa dall’inizio dello studio, mentre i cani iniettati con le cellule ingegnerizzate sono sopravissuti per due anni dopo la prima iniezione. L’insieme di questi dati ci conferma che l’iniezione con le cellule trasdotte aumenta la sopravvivenza dei cani. L’espressione della distrofina nelle biopsie era variabile, compresa fra 2 = 7% ed era visibile dopo un anno dalla prima iniezione. L’analisi di Western Blot delle biopsie muscolari ha confermato la presenza di diverse quantità di distrofina, fino a circa il 6% in peso del muscolo. I risultati preclinici ottenuti nei cani, ci ha por-

(1) Department of Medical Sciences, Section of Medical Genetics, University of Ferrara, Italy, Via Fossato di Mortara, 74, 44100 Ferrara, Tel 0532.974439, Fax 0532.974406, E-mail: fla@unife.it (2) Department of Biology and Evolution, University of Ferrara, Ferrara, Italy (3) IGM-CNR, Unit of Bologna c/o IOR, Bologna, Italy (4) Department of Biomedical Sciences, University of Padua, Padua, Italy (5) Department of Environmental and Life Sciences INSTM, University of Eastern Piedmont, Alessandria, Italy

Nei precedenti lavori abbiamo dimostrato che il trattamento intraperitoneale (i.p.) con l’antisenso M23D (2’-O-metil-fosforotioato) coniugato con le nanoparticelle ZM2 era in grado di indurre il ripristino della sintesi della proteina distrofina nei muscoli di topi mdx (Ferlini et al 2010 Gene Ther,. Bassi et al. 2012 J Biom Biotech). In questo lavoro abbiamo studiato: i) la biodistribuzione delle ZM2 in tessuti e liquidi biologici (urine, feci) dopo somministrazione i.p. o orale; ii) la via orale come via di somministrazione alternativa per il complesso ZM2-AON; iii) un nuovo tipo di nanoparticelle, le ZM5, più piccole, per migliorare la biodistribuzione attarverso la via orale.

Per questo studio abbiamo utilizzato l’Odyssey ® Infrared Imaging System (Li-Cor) e per consentire il legame con la sonda IRDye abbiamo modificato la superficie delle nanoparticelle ottenendo le nanoparticelle ZM4-IR e ZM5-IR. Le immagini sono state acquisite sia in vivo (animali anestetizzati) sia ex vivo (criosezioni). Dopo un singolo inoculo i.p. la fluorescenza delle ZM4-IR era visibile in tutto l’organismo, soprattutto nei tessuti linfatici, suggerendo che la distribuzione avviene soprattutto attraverso i vasi linfatici. La singola somministrazione orale delle ZM4-IR ha dimostrato la loro presenza

61

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

tati a giudicare promettente un approccio terapeutico che vede la combinazione di terapia genica e cellulare nel trattamento della DMD. Ci sono, però, diverse mutazioni che causano la DMD, questo approccio focalizzato sulla singola mutazione offre l’opportunità di un trattamento di terapia genica e cellulare personalizzata non solo nella DMD ma anche nella terapia di diverse malattie genetiche.

Cazzella Valentina, Morlando Mariangela, Legnini Ivano, Martone Julie, Majello Sara, Briganti Francesca, Bozzoni Irene Dept. of Biology and Biotechnology, Sapienza University of Rome, Tel. 0649912202, E-mail: irene.bozzoni@uniroma1.it

Una delle più rilevanti sorprese degli ultimi anni, derivate dall’analisi del trascrittoma su larga scala, è stata la scoperta che il genoma è diffusamente trascritto in varie complesse famiglie di RNA. Ora è ampiamente accettato che la porzione non codificante del genoma, e non la sola controparte codificante, può spiegare la maggiore complessità degli eucarioti superiori. Oltre ad un ampio numero di siti d’inizio di trascrizione e terminazione alternativi e varianti di splicing, è stata scoperta una complessa collezione di nuovi trascritti antisenso, intronici e intergenici.

Piccoli RNA non codificanti sono stati ampiamente studiati ed è stato dimostrato il loro ruolo chiave nella regolazione dell’espressione genica in molti eucarioti, inclusi animali e piante. Anche se inizialmente sono stati descritti come interruttori molecolari negativi in grado di agire con i fattori di trascrizione per controllare l’espressione genica, questi sono ora considerati dei fini modulatori della regolazione post-trascrizionale, spesso coinvolti in circuiti regolativi sia positivi che negativi.

Sebbene molti studi hanno contribuito a svelare la funzione di piccoli RNA non codificanti, molto poco è noto riguardo ai lunghi RNA non codificanti presenti nel trascrittoma. Saranno presentati esempi di circuiti regolatori controllati sia da piccoli che lunghi RNA non codificanti e verranno discusse le prospettive future sul loro ruolo nel controllare l’espressione genica nel tessuto muscolare normale e Duchenne.

ABSTRACT N. 64 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

MATTEI ELISABETTA

Telethon grant N.

GGP10094

Totale €

124.000

Num Centri: 1

Durata (anni): 2

Anno d’inizio: 2010

TERAPIA GENICA SPERIMENTALE DELLA DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE CON FATTORI TRASCRIZIONALI SINTETICI CHE AUMENTANO I LIVELLI DI UTROFINA, UNA PROTEINA CHE PROTEGGE DAI DANNI CAUSATI DALLA MANCANZA DI DISTROFINA Passananti Claudio (2), Strimpakos Georgios (1), Onori Annalisa (2), Pisani Cinzia (2), Di Certo Maria Grazia (1), Severini Cinzia (1), Luvisetto Siro (1), Monaco Lucia (3), Corbi Nicoletta (2), Mattei Elisabetta (1) (1) Istituto Biologia Cellulare e Neurobiologia, CNR, Via del Fosso di Fiorano 64, 00143, Roma, Tel. +39.06.50170323, Fax +39.06.501703313, E-mail: elisabetta.mattei@inmm.cnr.it (2) Istituto di Biologia e Patologia Molecolari, CNR, Roma (3) Dipartimento di Fisiologia e Farmacologia, Università La Sapienza, Roma

ABSTRACT N. 66 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari

La cura della Distrofia Muscolare di Duchenne (DMD) dipende dallo sviluppo di terapie innovative capaci di migliorare la qualità e prolungare l’aspettativa di vita dei pazienti DMD. L’aumento di espressione di geni correlati alla distrofina, come l’utrofina, rappresenta una promettente strategia terapeutica. Per incrementare l’espressione di utrofina abbiamo ideato e realizzato fattori trascrizionali sintetici di tipo zinc finger (ZF ATFs) che legano specificamente il promotore “A” del gene dell’utrofina umana e murina e ne attivano la trascrizione. Utilizzando un modello murino di distrofia muscolare (mdx) abbiamo realizzato un topo distrofico transgenico che esprime il mini-gene di un fattore trascrizionale sintetico chiamato “Jazz”. Nei topi mdx-Jazz la proteina Jazz è in grado di aumentare l’ espressione di utrofina nei muscoli inducendo un notevole recupero della forza muscolare.

Con l’attuale progetto dimostriamo la fattibilità e l’efficacia del trattamento sistemico di topi mdx con il nostro mini-gene Jazz veicolato da vettori virali Adeno-associati ricombinanti (rAAVs). Per ottenere un’espressione specifica di Jazz nel tessuto muscolare e cardiaco, abbiamo usato il promotore muscolo-specifico dell’ alpha-Actina umana in combinazione con il sierotipo AAV8 che ha un’ alta affinità per il tessuto muscolare. Inoltre, per seguire l’andamento dell’infezione virale, abbiamo realizzato una seconda molecola sostituendo Jazz con la green fluorescent protein (GFP). Topi mdx neonati sono stati iniettati per via intraperitoneale con AAV8-Jazz o con AAV8GFP. Entrambi i virus mostrano simili livelli di diffusione sistemica e di efficienza di trasduzione, caratterizzata da una precoce ed elevata espressione nel muscolo scheletrico e cardiaco. L’analisi dei tipici criteri diagnostici per la DMD dimostra che AAV8-Jazz migliora i sintomi della patologia muscolare al confronto con topi non trattati o iniettati con AAV8-GFP. Inoltre, sottoponendo i topi mdx trattati con AAV8-Jazz a prove di resistenza muscolare come il treadmill o a tests elettrofisiologici su muscoli isolati, abbiamo rilevato un significativo recupero funzionale. Questi risultati confermano la fattibilità e l’efficacia di strategie terapeutiche basate su ZF ATFs e accelerano il possibile trasferimento clinico di “Jazz” nella terapia genica della Distrofia Muscolare di Duchenne.

Responsabile

GGP11149 305.700

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Durata (anni): 2

Anno d’inizio: 2010

Mercuri Eugenio (11), Vita Giuseppe (2), Bertini Enrico (3), Berardinelli Angela (4), Minetti Carlo (5), Politano Luisa (6), Mongini Tiziana (7), Pegoraro Elena (8), Morandi Lucia (9), D’Angelo Maria Grazia (10), Messina Sonia (1,10) (1) Dipartimento di Neuroscienze, Università di Messina, Via C. Valeria 1, 98125, Messina, Tel. 090.2212793, Fax 090.2212789, E-mail: smessina@unime.it (2) Unità Malattie Neuromuscolari, Ospedale Bambin Gesù, Roma (3) Unità di Neuropsichiatria Infantile, Istituto IRCCS “C.Mondino”, Pavia (4) Istituto IRCCS “Gaslini”, Genova (5) Dipartimento di Medicina Sperimentale, Seconda Università, Napoli (6) Centro per le Malattie Neuromuscolari “Peirolo”, Dipartimento di Neuroscienze, Università di Torino (7) Dipartimento Di Neuroscienze, Università di Padova, Padova (8) Istituto Neurologico IRCCS “C. Besta”, Milano (9) IRCCS Medea Bosisio Parini (10) Dipartimento di Pediatria, Università Cattolica del Sacro Cuore, Policlinico Gemelli, Roma

Obiettivo dello studio: l’obiettivo principale dello studio era di tradurre e validare il questionario Pediatric Quality of Life Inventory TM 3.0 Neuromuscular Module (PedsQL NM) insieme ad altre misure di outcome quali PedsQL TM 4.0 Generic Core Scales (PedsQL GCS), 6-minute walk test (6MWT), North Star Ambulatory Assessment (NSAA) e prove temporizzate, in un’ampia coorte di pazienti italiani con diagnosi di distrofia muscolare di Duchenne (DMD). Un ulteriore obiettivo era di raccogliere i dati longitudinali delle diverse prove di valutazione dopo 6 e 12 mesi, e di verificare le possibili correlazioni tra esse.

Background: la maggiore difficoltà nella progettazione di studi clinici multicentrici è l’assenza di strumenti validati per valutare la qualità della vita (QoL) nei bambini con malattie neuromuscolari (NMD) e la mancanza di un accordo internazionale sulle misure di outcome da utilizzare. Recentemente il PedsQL NM è stato proposto come strumento affidabile per valutare la QoL nei bambini con NMD. Il questionario, disponibile nelle versioni per i genitori e per il paziente, è stato validato nell’atrofia muscolare spinale (SMA) e nella di-

BOZZONI IRENE

Totale €

189.000

MISURE DI OUTCOME NELLA DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE: VALIDAZIONE DEL PEDIATRIC QUALITY OF LIFE INVENTORY TM NEUROMUSCULAR MODULE NELLA POPOLAZIONE ITALIANA E CORRELAZIONI CON ALTRE VALUTAZIONI FUNZIONALI

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Telethon grant N.

GUP09010

Totale € Num Centri: 10

ABSTRACT N. 65 Responsabile

MESSINA SONIA

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2011

TERAPIA GENICA DELLA DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE BASATA SULL’USO DI RNA: RUOLO DEI microRNA NELLA PATOGENESI E NELLA TERAPIA DELLA DMD

62

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

strofia muscolare di Duchenne (DMD). Tuttavia, ad oggi, nessuno studio sistematico è stato progettato per correlare i risultati della QoL con le misure di outcome “gold standard” per la DMD. Il progetto è in corso. Abbiamo eseguito la traduzione del PedsQL NM in versione Italiana e tenuto delle sessioni di training sul protocollo somministrato (PedsQLNM GCS e valutazioni con 6MWT, NSAA e prove temporizzate). Sono stati arruolati 157 pazienti (range d’età 2,4-17,8 anni), 107/157 pazienti sono deambulanti e quindi abbiamo potuto effettuare le correlazioni con le misure di outcome selezionate. I pazienti sono stati valutati a baseline ed a distanza di 6 e 12 mesi. E’ in corso l’analisi dei dati.

Risultati attesi:convalidare per la prima volta uno strumento di valutazione della QoL specifico per i pazienti DMD in correlazione con le misure di outcome disponibili per sperimentazioni cliniche e raccogliere informazioni longitudinali sui cambiamenti osservati nel periodo di un anno.

Questo ci fornirà informazioni importanti sulla progressione della malattia e ci permetterà di identificare misure che siano il più adatte possibili da utilizzare in eventuali trial clinici futuri.

ABSTRACT N. 68 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

GUP11002 300.000

Num Centri: 12

Durata (anni): 3

Durata (anni): 2

Anno d’inizio: 2011

Politano Luisa (2), Stutifero Marianna (2), Zaccaro Antonella (2), Balottin Umberto (3), Berardinelli Angela Lucia (3), Camia Michela (3), Motta Maria Chiara (3), Vita Giuseppe (4), Messina Sonia (4), Sframeli Maria (4), Vita Gianluca (4), Pane Marika (5), Lombardo Maria Elena (5), Scalise Roberta (5), D’Amico Adele (6), Catteruccia Michela (6), Colia Giulia (6), Angelini Corrado (7), Gaiani Alessandra (7), Semplicini Claudio (7), Battini Roberta (8), Astrea Guja (8), Ricci Giulia (8), D’Angelo Maria Grazia (9), Brighina Erika (9), Civati Federica (9), Patalano Melania (1), Sagliocchi Alessandra (1), Magliano Lorenza (1)

PANE MARIKA

Totale €

145.000

LA FAMIGLIA DEI PAZIENTI AFFETTI DA DISTROFIE MUSCOLARI: CARICO, RETE SOCIALE E SUPPORTO PROFESSIONALE

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Telethon grant N.

GUP10002

Totale € Num Centri: 9

ABSTRACT N. 67 Responsabile

MAGLIANO LORENZA

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2012

VALUTAZIONE DELLA FUNZIONE DEGLI ARTI SUPERIORI IN PAZIENTI NON DEAMBULANTI AFFETTI DA DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE

(1) Dipartimento di Psicologia, Seconda Università di Napoli, Viale Ellittico, 31, 81100 Caserta, Tel. 0823.275358; Fax 0823.274759; E-mail:lorenza.magliano@unina2.it (2) Cardiomiologia e Genetica Medica, Dipartimento di Medicina Sperimentale, Seconda Università di Napoli (3) Unità di Neuropsichiatria infantile, IRCSS “C. Mondino”, Pavia (4) Dipartimento di Neuroscienze, Scienze Psichiatriche e Anestesiologiche, Università di Messina (5) Dipartimento di Neuropsichiatria Infantile, Università Cattolica, Roma (6) Unità per i Disordini Neuromuscolari e Neurodegenerativi, Dipartimento di Neuroscienze, Ospedale Bambin Gesù, Roma (7) Dipartimento di Neuroscienze, Università di Padova (8) Dipartimento di Neurologia, Università di Pisa (9) Unità Neuromuscolare-Dipartimento di Neuroriabilitazione, IRCCS E. Medea, Bosisio Parini, Lecco

Pane Marika (1), Mazzone Elena (1), Berardinelli Angela Lucia (2), Messina Sonia (3), D’Amico Adele (4), Baranello Giovanni (5), Gardani Alice (2), Capone Luca (2), Vita Gianluca (3), Cavallaro Filippo (3), Catteruccia Michela (4), Colia Giulia (4), Iotti Elena (5), D’Ambrosio Paola (6), Taglia Antonella (6), Rolle Enrica (7), Lanzillotta Valentina (8), Pini Antonella (9), Terzi Silvia (9), Talarico Maria Laura (9), Frosini Silvia (10), D’Angelo Maria Grazia (11), Molteni Francesca (11), Fiorillo Chiara (10), Battini Roberta (10), Bello Luca (12), Cao Michelangelo (12), Mongini Tiziana (7), Pedemonte Marina (8), Pegoraro Elena (12), Morandi Lucia (5), Politano Luisa (6), Mercuri Eugenio (1) (1) Department of Paediatric Neurology, Catholic University, Policlinico Gemelli, Largo A. Gemelli, 8, 00168, Rome, Italy 347/9347864 E-mail: marika.pane@rm.unicatt.it (2) Child Neurology and Psychiatry Unit, IRCCS “C. Mondino” Foundation, University of Pavia, Italy (3) Department of Neurosciences, Psychiatry and Anaesthesiology, University of Messina, Messina, Italy (4) Department of Laboratory Medicine, Unit of Molecular Medicine, Bambino Gesù Hospital, Rome, Italy (5) Myopathology and Neuroimmunolgy, Pediatric Neurology and Neuroradiology Units, Neurological Institute C. Besta, Milan, Italy (6) Department of Experimental Medicine, Second University of Naples, Italy (7) Neuromuscular Center, SG. Battista Hospital, University of Turin, Italy (8) Neuromuscular Disease Unit, G. Gaslini Institute, Genoa, Italy (9) Child Neurology and Psychiatry Unit, Maggiore Hospital, Bologna, Italy (10) Department of Developmental Neuroscience, Stella Maris Institute, University of Pisa, Italy (11) IRCCS Eugenio Medea, Bosisio Parini, Italy (12) Department of Neurosciences, University of Padua, Padua, Italy

Le Distrofie Muscolari (DM) sono malattie degenerative a carattere progressivo con ridotta aspettativa di vita ed importante limitazione funzionale che si ripercuote significativamente sulla qualità della vita dei pazienti e dei loro familiari. Le famiglie, nelle fasi più avanzate della malattia, possono trovarsi a sostenere un consistente carico pratico e psicologico, non sempre alleviato dalla rete sociale e dall’aiuto professionale, e quasi del tutto inesplorato.

Lo studio GUP10002 ha lo scopo di descrivere le difficoltà e le risorse, sociali e professionali, disponibili per le famiglie dei pazienti con DM in Italia. In particolare, nello studio saranno intervistati i familiari-chiave (età 18-80 anni) di pazienti con DM di Duchenne, Becker o Cingoli, di età compresa tra 4 e 25 anni, in carico da almeno 6 mesi ad uno degli 8 Centri partecipanti alla ricerca e distribuiti sull’intero territorio nazionale. Inoltre, lo studio si propone di esaminare il carico sul familiare minorenne sano di età compresa tra 9 e 17 anni più prossimo per età al paziente. I dati sono raccolti mediante strumenti di rilevazione standardizzati.

Lo studio, iniziato a giugno 2011, comprende 3 fasi: 1) Preliminare (sei mesi). In questa fase sono stati raggiunti i seguenti obbiettivi: a) Finalizzazione del protocollo; adattamento degli strumenti di rilevazione del carico, della rete sociale e del sostegno professionale; messa a punto di una scheda per la rilevazione degli interventi ricevuti dai pazienti e dalle famiglie; elaborazione di un’intervista semistrutturata per la rilevazione del livello di autonomia del paziente secondo il Bartel Index (BI); sviluppo di una guida per i ricercatori; b) Sviluppo di un data-base e di linee-guida per l’inserimento dei dati; c) Formazione all’uso degli strumenti e all’inserimento dei dati dei 19 ricercatori coinvolti nello studio, attraverso due training courses tenutisi a Napoli nel Settembre e nell’Ottobre 2011, durante i quali è stata formalmente misurata l’inter-rater reliability. d) Screening dei casi eleggibili in ciascun centro, divisi per diagnosi.

Sono risultati in carico agli 8 Centri un totale di 1056 pazienti con DM, variabile da 43 a 344 per Centro, così rappresentato: Duchenne (32-92%); Becker (8-58%); Cingoli (0-32%). A seconda della tipologia dei Centri – pediatrici, per adulti o misti - la percentuale dei pazienti minorenni è variata dal 100 al 32%.

2) Principale, di raccolta dei dati (mesi 12): In questa fase, ancora in corso, sono stati valutati 408 familiari: 288 di pazienti con DM di Du-

Pochi sono gli studi presenti in letteratura sulle abilità degli arti superiori in ragazzi affetti da Distrofia muscolare di Duchenne e più in generale in pazienti con malattie neuromuscolari. Inoltre, mentre sono stati fatti importanti passi avanti per i bambini deambulanti con DMD, non ci sono ancora studi prospettici per quest’altro gruppo di pazienti, con crescente dispiacere delle famiglie. Lo scopo di questo progetto è quello di identificare in una popolazione italiana misure d’outcome per pazienti non deambulanti affetti da DMD. Tutti i ragazzi saranno testati utilizzando delle scale che misurano abilità degli arti superiori importanti per la vita di tutti i giorni. I test saranno somministrati ad un tempo 0 e poi a 6 e 12 mesi. Potremo così monitorare i possibili cambiamenti e l’entità di tali cambiamenti in pazienti con diversi livelli di abilità e diverse età.

Sarà uno studio multicentrico (Roma Gemelli, Messina, Rome Bambin Gesù, Pavia, Genoa, Napoli, Torino, Bologna, Padova, Milano, Bosisio Parini, Pisa). Ciascun centro parteciperà con 15-20 ragazzi ognuno.

UN primo meeting è stato già organizzato per effettuare il training dei terapisti.

Un secondo meeting per stabilire l’inter obesrver reliability usando video con il punteggio e discutendone insieme.

63

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

ABSTRACT N. 70

chenne, 93 di pazienti con DM di Becker e 27 di pazienti con DM dei Cingoli. Sono stati inoltre intervistati 17 familiari minorenni (dati al 30 settembre 2012). La raccolta dei dati terminerà a Dicembre 2012.

3) Finale, di analisi dei dati e diffusione dei risultati (mesi 6). I dati saranno elaborati nel I semestre 2013 ed i risultati utilizzati per lo sviluppo di programmi di sostegno familiare mirati nelle DM.

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

TUPLER ROSSELLA GINEVRA

Telethon grant N.

GUP11009

Totale €

200.000

Num Centri: 15

Durata (anni): 1

Anno d’inizio: 2012

ABSTRACT N. 69 SVILUPPO DEL REGISTRO NAZIONALE DELLA DISTROFIA MUSCOLARE FACIO-SCAPOLO-OMERALE (FSHD)

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

BIANCHI MARIA LUISA

Telethon grant N.

GUP11011

Totale €

380.900

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Ricci Giulia (2), Scionti Isabella (1), Sera Francesco (3), Govi Monica (1), Mele Fabiano (1), D’Amico Roberto (4), Filosto Massimiliano (5), Vercelli Liliana (6), Ruggiero Lucia (7), Berardinelli Angela (8), Angelini Corrado (9), Antonini Giovanni (10), Bucci Elisabetta (10), Cao Michelangelo (9), Di Muzio Antonio (11), Iannaccone Elisabetta (12), Maggi Lorenzo (13), Moggio Maurizio (14), Morandi Lucia (13), Mongini Tiziana (6), Pastorello Ebe (15), Ricci Enzo (12), Rodolico Carmelo (16), Santoro Lucio (7), Siciliano Gabriele (2), Tomelleri Giuliano (17), Galluzzi Giuliana (18), Tupler Rossella (19)

Anno d’inizio: 2012

VALUTAZIONE DI TURNOVER OSSEO, METABOLISMO OSSEO, DENSITÀ OSSEA E FRATTURE NEI BAMBINI AFFETTI DA DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE, E DEI POSSIBILI EFFETTI DI UNA TERAPIA STEROIDEA CRONICA Maria Luisa Bianchi

(1) Dipartimento di Scienze della Vita, Università di Modena e Reggio Emilia, via G. Campi 287, 41125 Modena, Italy, Tel. 0592055414, Fax 0592055426, Email: rossella.tupler@unimore.it (2) Department of Neuroscience, Neurological Clinic, University of Pisa, Pisa, Italy (3) ICH - Paediatric Epidemiology Unit, Department of Population Health Sciences, Faculty of Population Health Sciences, London UK (4) University of Modena and Reggio Emilia, Unit of statistics, Department of Oncology and Hematology, Italy (5) Clinical Neurology, University Hospital ‘‘Spedali Civili’’, Brescia, Italy (6) Department of Neuroscience, Center for Neuromuscular Diseases, University of Turin, Turin, Italy (7) Department of Neurological Sciences, University Federico II, Naples, Italy (8) Unit of Child Neurology and Psychiatry, IRCCS “C.Mondino” Foundation, Pavia, Italy (9) Department of Neurosciences, University of Padua, Padua, Italy (10) Department of Neurology, S. Andrea Hospital, University of Rome “Sapienza”, Rome, Italy (11) Center for Neuromuscular Disease, University “G. d’Annunzio”, Chieti, Italy (12) Department of Neurosciences, Università Cattolica Policlinico A. Gemelli, Rome 00168, Italy (13) IRCCS Foundation, C. Besta Neurological Institute, Milano, Italy (14) Department of Neurology, IRCCS Fondazione Ospedale Maggiore Policlinico, University of Milan, Milan, Italy (15) Department of Neurological and Psychiatric Sciences, University of Padua, Padua, Italy (16) Department of Neurosciences, Psychiatry and Anaesthesiology, University of Messina, Messina, Italy (17) Department of Neurological Sciences and Vision, University of Verona, Verona, Italy (18) Molecular Genetics Laboratory of UILDM, Lazio Section, IRCCS Santa Lucia Foundation, Rome, Italy

Centro Malattie Metaboliche Ossee, Istituto Auxologico Italiano IRCCS, via Ariosto 13, 20155 Milano, Tel. 02.619112505, Fax 02.619112519, E-mail: ml.bianchi@auxologico.it

Il progetto (BON-DMD) si innesta su un altro progetto multicentrico internazionale (FOR-DMD), indipendentemente finanziato, che dovrebbe partire in dicembre 2012-gennaio 2013.

L’oggetto di studio è una delle più frequenti malattie genetiche legate al sesso, la Distrofia Muscolare di Duchenne (DMD). Il FORDMD ha per obiettivo principale la valutazione di tre diversi schemi terapeutici a base di corticosteroidi (CS), la sola terapia che, pur non risolutiva, ha dimostrato effetti positivi nella DMD, sia sul mantenimento della funzione muscolare, sia sulla durata della vita.

Purtroppo i CS usati cronicamente ad alte dosi hanno una serie di effetti collaterali anche gravi, tra cui lo sviluppo precoce di osteoporosi secondaria (riduzione della massa minerale ossea e alterazione dell’architettura microstrutturale dell’osso, con aumentata fragilità ossea e maggior rischio di fratture).

Lo studio sarà condotto in 40 Centri in 5 diversi paesi (Italia, Germania, UK, Canada, USA). Tutti i pazienti dovranno completare un follow-up di 36 mesi (il periodo di arruolamento sarà di 24 mesi). Il metabolismo osseo, la densità ossea e le fratture saranno valutati al tempo basale e poi ogni anno. Saranno arruolati 300 bambini (4-7 anni) affetti da DMD, tutti ambulanti, prepuberi, non in terapia con CS. I bambini saranno randomizzati in uno dei tre diversi regimi terapeutici (prednisone giornaliero o intermittente e deflazacort).

Nell’ambito del BON-DMD, i 300 pazienti arruolati saranno sottoposti a un approfondito studio del metabolismo e del turnover osseo, tramite la valutazione di specifici “markers” biochimici, oltre che a un’accurata valutazione dell’evoluzione della massa ossea.

Inoltre, saranno raccolte tutte le informazioni relative alle fratture incidenti.

L’ampia popolazione studiata dovrebbe permettere sia di dare una risposta alla domanda ancora irrisolta se la DMD in sé, anche prima dell’uso di CS e indipendentemente da esso, determini una perdita di massa ossea e un indebolimento dell’osso, sia di identificare i soggetti più a rischio di severa osteoporosi e di fratture.

Per la prima volta, diversi parametri (inclusi i markers di turnover osseo e le citochine) saranno utilizzati per identificare i pazienti a maggiore rischio di aumentata perdita di BMD e di fratture durante la terapia con CS. Inoltre, il paratormone (PTH) e la 25-OH vitamina D saranno determinati in quanto principali regolatori del metabolismo calcico e per la loro interazione fisiologica (regolazione a feedback della secrezione di PTH da parte della vitamina D). Nel DMD, è stato osservato un aumentato riassorbimento osseo a causa della carenza di vitamina D e all’iperparatiroidismo secondario.

Lo studio BON-DMD applicherà un rigido controllo di qualità che permetterà di rendere utilizzabili tutte le misurazioni DXA effettuate durante i 60 mesi di studio in diverse aree geografiche nei vari Centri partecipanti, con diversi strumenti.

Lo studio è la condizione ideale per arrivare a conclusioni evidencebased sugli effetti ossei della DMD prima dell’uso di steroidi, e costituisce una solida base per valutare l’impatto del trattamento con CS in un numeroso gruppo di pazienti affetti da DMD (100 per ciascuna terapia con CS) e di identificare il trattamento steroideo con minori effetti avversi sull’osso.

Si pensa che i risultati ottenuti dal progetto BON-DMD possano condurre allo sviluppo di una strategia ottimale per massimizzare la densità ossea, controllare il turnover osseo e ridurre il rischio di fratture nella DMD.

La distrofia muscolare facio-scapolo-omerale (FSHD) è considerata una miopatia autosomica dominante associate alla delezione di copie integrali di sequenze di 3.3 kb (D4Z4) ripetute in tandem in combinazione con altri polimorfismi adiacenti che insieme costituiscono l’aplotipo 4A(159/161/168)PAS nella regione cromosomica 4q35. La penetranza della malattia è considerata completa entro i vent’anni. Tuttavia noi abbiamo recentemente scoperto un’alta percentuale di soggetti asintomatici portatori di alleli D4Z4 di dimensioni ridotte (DRA, D4Z4 reduced allele) nella regione 4q (J Med Genet 49:171-8, 2012) e abbiamo riportato il 3% di soggetti dalla popolazione generale sono portatori di DRA e l’1,3% è associato all’aplotipo 4A161 (Am J Hum Genet 90:628-35, 2012).

Attraverso il Registro Italiano per la FSHD (Italian National Registry for FSHD, INRF), sono stati reclutati 530 soggetti portatori di DRA (367 parenti and 167 probandi) da 176 famiglie FSHD non correlate. Tutti i soggetti sono stati valutati clinicamente e studiati dal punto di vista molecolare. Lo studio è stato condotto valutando la dimensione dei DRA, il sesso, l’età, il grado di parentela e l’aplotipo 4q per stabilire se queste variabili hanno un ruolo sulla severità dell’espressione clinica della malattia. La scala FSHD è stata utilizzata per definire il grado di debolezza muscolare utilizzando un punteggio (FSHD score).

Il nostro studio mostra che complessivamente il 32·2% dei parenti non mostra debolezza muscolare. Il 47·1% dei parenti di secondoterzo grado e il 27,5% dei parenti di primo grado risulta senza deficit muscolari. La stima del rischio di sviluppare la FSHD mostra che per i portatori di DRA con 1-3 unità il rischio è del 64,3% a 20 anni, dell’80·1% a 40, e del 96·2 % a 60 anni, mentre per i parenti por-

64

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

tatori di DRA con 4-8 unità il rischio di sviluppare la malattia è di circa il 20% a 20 anni, del 43% a 40, del 65% a 60.

Inoltre comparando l’FSHD score ricevuto da femmine o maschi con DRA delle stesse dimensioni, abbiamo osservato che i parenti maschi sono colpiti in modo più severo, infatti ricevono un FSHD score significativamente più alto di quello ricevuto dalle femmine portatrici (mean FSHD score: 5.4 in maschi vs 4.0 nelle femmine, p 0.003). Inoltre il nostro studio mostra che nessun aplotipo 4qé associato in modo esclusivo con la presenza della malattia.

In conclusione il nostro lavoro stabilisce che la presenza di DRA con 4-8 unità ripetute ha un limitato valore prognostico. In questa classe di alleli il sesso e il grado di parentela influenzano l’espressione clinica della malattia In particolare, le femmine e i parenti di secondo-terzo grado hanno un rischio ridotto di sviluppare la FSHD. Nessun aplotipo è predittivo dell’espressione clinica della malattia.

La ridotta penetranza della malattia nei parenti di secondo-terzo grado verso quelli di primo grado prova che la patogenesi della malattia coinvolge più fattori genetici e che la presenza di un DRA dev’essere accuratamente valutata per poter stabilire il suo valore prognostico nelle famiglie studiate, soprattutto per le importanti conseguenze per il consiglio genetico e la diagnosi prenatale.

LGMD2A con mutazioni accertate del gene della calpaina-3. Sono state eseguite 2 nuove biopsie muscolari e messi in coltura i mioblasti. Sul tessuto muscolare sono stati dosati i livelli di calpaina-3 tramite western-blot, le attività ossidative tramite colorazione COX ed SDH e sono stati analizzate le attività dei complessi della catena respiratoria. In un caso sono state evidenziate alterazioni della attività della COX e una riduzione della attività della catena respiratoria. Sono state ottenute altre 3 linee cellulari di pazienti affetti da LGMD2A dalle Biobanche Telethon su cui si procederà con gli studi.

REFERENZE Saenz, A. (2005) LGMD2A: genotype–phenotype correlations based on a large mutational survey on the calpain-3 gene.

Brain,128,732–742.

Kramerova, I. (2007) Molecular and cellular basis of calpainopathy (limb girdle muscular dystrophy type 2A). Biochim. Biophys. Acta, 1772,128–144.

Kramerova, I. (2009) abnormalities, energy deficit and oxidative stress are features of calpain-3 deficiency in skeletal muscle. Hum Mol Genet. (17):3194-205 Millay, D.P. (2008) Genetic and pharmacologic inhibition of mitochondrial-dependent necrosis attenuates muscular dystrophy. Nat. Med.14, 442–447.

ABSTRACT N. 71

ABSTRACT N. 72

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

FIORILLO CHIARA

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari

Telethon grant N.

GEP12019

Responsabile

Totale €

35.300

Telethon grant N.

GEP12053

Totale €

50.000

Num Centri: 1

Durata (anni): 1

Anno d’inizio: 2012

Num Centri: 1

ANALISI DELLA FUNZIONE MITOCONDRIALE NELLE DISTROFIE MUSCOLARI DA DEFICIT DI CALPAINA-3

BRUNO CLAUDIO

Durata (anni): 1

Anno d’inizio: 2012

RUOLO DELL’ADENOSINA TRIFOSFATO (E-ATP) E DEI RECETTORI PURINERGICI NELLA PATOGENESI DELLA DISTROFIA MUSCOLARE DA DEFICIT DI ALFA-SARCOGLICANO (LGMD2D)

Baldacci Jacopo (1), Cassandrini Denise (1), Nesti Claudia (1), Meschini Chiara (1), Mora Marina (2), Ruggiero Lucia (3), Santoro Lucio (3), Politano Lucia (4), Siciliano Gabriele (5), Santorelli Filippo (1), Fiorillo Chiara (1)

Baldassari Simona (1), Gazzerro Elisabetta (1), Traggiai Elisabetta (2), Grassi Fabio (3), Bruno Claudio (1)

(1) Fondazione Stella Maris IRCCS - Viale del Tirreno 331, 56018, Calambone, Pisa, Tel. 050886311, Fax 050886247, E-mail: c.fiorillo@inpe.unipi.it (2) Istituto Neurologico C.Besta, Milano (3) Clinica Neurologica, Università di Napoli Federico II, Napoli (4) Genetica Medica, Seconda Università di Napoli, Napoli (5) Clinica Neurologica, Università di Pisa, Pisa

(1) U.O. Neurologia Pediatrica e Malattie Muscolari, IRCCS Istituto G. Gaslini, Largo G. Gaslini 5, 16147 Genova, Italy, Tel. +39.010.5636756; Fax +39.010.3538265, E-mail: claudiobruno@ospedale-gaslini.ge.it (2) U.O. Pediatria II-IRCCS Istituto Giannina Gaslini-Genova, Italy (3) Dipartimento di Biologia e Genetica per le Scienze Mediche, Univ. degli Studi di Milano-Milano, Italy

Introduzione e Razionale - La distrofia muscolare di cingoli tipo 2A (LGMD2A) è una forma di distrofia muscolare ad esordio nel giovane adulto con lenta progressione. E’ considerata la forma più comune di LGMDs ed è causata da mutazioni del gene CAPN3 che codifica per una proteina enzimatica con azione proteolitica della famiglia delle calpaine, la calpaina-3. L’esatto meccanismo patogenetico responsabile del danno muscolare in seguito ad alterazione della calpaina-3 non è noto. Da modelli animali e studi cellulari sono stati proposti diverse spiegazioni quali le alterazioni del rimodellamento della membrana del muscolo, della formazione del sarcomero e modificazione di alcuni fattori di trascrizione con attivazione dei pathways apoptotici. In un recente studio condotto su topi knockout per la calpaina-3 (C3KO) sono state riscontrate delle alterazioni del metabolismo energetico come alterazioni della distribuzione dei mitocondri, della sintesi di ATP e della produzione di radicali liberi dell’ossigeno.

Obiettivi del progetto Ci proponiamo di studiare le funzioni mitocondriali in tessuti muscolari e mioblasti di pazienti affetti da LGMD2A. A nostra conoscenza non sono mai stati eseguiti studi sperimentali sulle alterazioni della calpaina-3 in popolazioni cellulari di pazienti. Lo studio delle funzioni mitocondriali in pazienti affetti da LGMD2A porterà ad una maggiore comprensione dei meccanismi patogenetici di questa forma di distrofia muscolare. Inoltre sarà possibile ipotizzare una strategia terapeutica che agisca sulla modulazione del metabolismo ossidativo.

Metodologia - Saranno selezionati pazienti con dimostrate mutazioni del gene CAPN3 e biopsia muscolare disponibile. Le attività mitocondriali saranno studiate con le metodiche biochimiche standard e con test funzionali in vitro per la misurazione del potenziale di membrana, la produzione di ATP e di ROS. I risultati ottenuti dai vari saggi funzionali saranno confrontati con i risultati ottenuti da pazienti controllo. Le misurazioni di ATP e ROS saranno ripetute anche dopo esposizione a sostanze stressanti (galattosio) o a sostanze in grado di stimolare le attività mitocondriale (analoghi della ciclosporina A).

Risultati preliminari - Sono stati reclutati 7 pazienti affetti da

Il progetto è finalizzato ad analizzare il ruolo dell’ATP extracellulare (eATP) e della sua via di attivazione dei recettori purinergici nell’ambito del processo distrofico causato dal deficit di alfa-sarcoglicano (alfa-SG). Inoltre, lo studio valuterà il potenziale terapeutico della modulazione di tale via di segnale tramite un antagonista del recettore purinergico P2.

Sebbene la Distrofia Muscolare dei Cingoli legata al deficit di alfaSG (LGMD2D) non sia classificata come una miopatia infiammatoria, la risposta immunologica è una componente importante di tale difetto genetico. eATP è una molecola coinvolta nello sviluppo della risposta immunitaria sia adattativa che innata. Infatti, eATP viene rilasciato dal citosol di cellule in degenerazione e, in una fase iniziale della risposta immunitaria, contribuisce all’attivazione delle cellule presentanti l’antigene e dei linfociti T, facilitando in seguito l’amplificazione della risposta immunitaria.

In condizioni d’infiammazione cronica, i livelli di eATP incrementano e l’inibizione di questa via di segnale migliora il fenotipo di modelli animali con diverse malattie infiammatorie.

D’altra parte, eATP gioca un ruolo essenziale anche nella regolazione dell’omeostasi del calcio intracellulare in cellule muscolari.

Il ruolo patogenetico di eATP potrebbe dunque essere persino più rilevante nella LGMD2D, in quanto, alfa-SG presenta un sito di legame per ATP nella sua porzione extracellulare ed è caratterizzato da un’attività ecto-ATPasica che permette di controllare la concentrazione di eATP sulla superficie di cellule che esprimono recettori P2, attenuando così l’ampiezza e la durata dell’effetto di tale molecola.

L’assenza di a-SG e perciò la perdita di attività ecto-ATPasica sul sarcolemma muscolare potrebbe causare un persistente incremento della concentrazione di eATP, amplificandone gli effetti, e inducendo un sovraccarico di calcio intracellulare con conseguente morte delle miofibre.

Nel nostro progetto ci proponiamo di caratterizzare la via di attivazione eATP/ recettori purinergici in colture primarie di mioblasti isolati da campioni di muscolo scheletrico di pazienti e modelli murini affetti da deficit di alfa-SG. In tali sistemi cellulari valuteremo la

65

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

ABSTRACT N. 74

sintesi di eATP, il suo rilascio e la sua proteolisi. Inoltre studieremo l’espressione e la funzione dei recettori purinergici P2.

In secondo luogo, testeremo l’efficacia del farmaco oATP, un antagonista del recettore P2, in un modello animale di deficit di alfa-SG. I parametri clinici, istopatologici, immunologici e l’omeostasi del calcio verrà valutata in topi knock-out per alfa-SG trattati con oATP per via sistemica.

Il nostro studio contribuirà a chiarire alcuni aspetti patogenetici della degenerazione muscolare in LGMD2D e faciliterà l’identificazione di una nuova strategia terapeutica finalizzata a migliorare l’infiammazione muscolare e l’omeostasi calcica in questa malattia.

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

SANDONÀ DORIANNA GEP12058

Totale € Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2012

Ludwig Yamamoto Daniel (2,3), Marmonti Enrica (1), Caremani Marco (4), Chen Ju (5), Nigro Vincenzo (6,7), Linari Marco (4), Bang Marie-Louise (1) (1) Institute of Genetic and Biomedical Research, National Research Council (IRGB-CNR), Milan Unit at Humanitas Clinical and Research Center, Via Manzoni 113, 20089 Rozzano, Milan. Tel. 02.82245210, Fax 02.82245290, E-mail: marie-louise.bang@cnr.it (2) Institute of Biomedical Technologies, National Research Council (ITB-CNR) (3) MultiMedica Hospital, Scientific and Tecnology Pole, Milan (4) Department of Biological Evolution, University of Florence, Florence (5) Department of Medicine, University of California San Diego, USA (6) Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM), Naples (7) Department of General Pathology, Second University of Naples

49.400 Durata (anni): 1

430.600

LA MIOPALLADINA NELLA CARDIOMOPATIA DILATATIVA E NELLA DISTROFIA MUSCOLARE DEI CINGOLI

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Telethon grant N.

GGP12282

Totale € Num Centri: 3

ABSTRACT N. 73 Responsabile

BANG MARIE-LOUISE

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2012

RECUPERO FARMACOLOGICO DI PROTEINE MAL RIPIEGATE: APPROCCI INNOVATIVI PER LA CURA DI ALCUNE PATOLOGIE MUSCOLARI Bianchini Elisa (1), Gomiero Chiara (1), Dorotea Tiziano (2), Valle Giorgia (1), Mascarello Francesco (2), Betto Romeo (1,3), Volpe Pompeo (1), Sacchetto Roberta (2), Sandonà Dorianna (1)

La miopalladina (MYPN) è una proteina sarcomerica del muscolo striato che appartiene alla famiglia delle proteine associate all’actina contenenti domini immunoglobilinici, insieme a palladina e miotilina. Nella linea Z del muscolo scheletrico, MYPN si lega alle proteine alfa-actinina, nebulina e PDZ-LIM (Bang et al. J Cell Biol 153, 413-27, 2001; von Nandelstadh et al. Mol Cell Biol 29, 822-34, 2009). Inoltre è presente nel nucleo e nella banda I, dove si lega al cofattore trascrizionale inducibile dallo stiramento Repeat Cardiac Protein Ankyrin (CARP) che, a sua volta, si lega alla titina nella banda I, suggerendo un ruolo della MYPN nel mechanosensing (Miller et al. J Mol Biol 333, 951-64, 2003). Mutazioni del gene della MYPN sono state recentemente descritte in soggetti affetti da cardiomiopatie dilatative, ipertrofiche e restrittive (Duboscq-Bidot et al. Cardiovasc Res 77, 118-25, 2008; Purevjav et al. Hum Mol Genet 21, 2039-53, 2012; Meyer et al. Eur J Hum Genet. Epub 2012). Inoltre abbiamo recentemente identificato mutazioni per la MYPN in pazienti affetti da distrofia muscolare dei cingoli (LGMD) con associata cardiomiopatia dilatativa. Lo scopo del progetto è quello di utilizzare virus adeno-associato (AAV) per esprimere in vivo la MYPN wildtype (WT) o mutata in topi knockout per la MYPN (MKO), allo scopo di verificare se le mutazioni identificate sono la causa della malattia e se l’inserimento di WT MYPN può ripristinare il fenotipo dei topi MKO. I nostri risultati mostrano che i topi MKO hanno dimensioni ridotte rispetto ai WT e un’area della sezione trasversa delle fibre muscolari ridotta di circa il 40%. In accordo, la velocità di differenziamento e le dimensioni dei miotubi provenienti da colture primarie di muscolo scheletrico di topi MKO sono inferiori rispetto ai WT e i muscoli di MKO sviluppano una minore forza isometrica e potenza in proporzione alla minore grandezza delle fibre. Le prestazioni in vivo (up- e down-hill treadmill running) non hanno mostrato differenze ma con la corsa downhill (contrazioni eccentriche) ripetuta per quattro giorni la performance dei topi MKO diminuisce progressivamente con associazione di rigenerazione muscolare dovuta a danno del tessuto. In accordo con una più alta suscettibilità al danno muscolare, un progressivo allargamento della linea Z è stato osservato nel muscolo scheletrico dei topi MKO a partire da circa 8 mesi di età. Infine, abbiamo identificato che la MYPN interagisce direttamente con i filamenti di actina e ha un ruolo nell’attivazione della via del serum response factor (SRF), un fattore che è regolato da cambiamenti nella dinamica dell’actina ed è fondamentale per la crescita e la maturazione muscolare (Li et al. PNAS 102, 10821087, 2005). Il ruolo della MYPN nell’organizzazione dell’actina citoscheletrica e nel pathway di SRF potrebbe essere responsabile della ridotta dimensione delle fibre muscolari, della velocità di differenziazione e della performance muscolare nei topi MKO.

(1) Department of Biomedical Sciences University of Padua, Via G. Colombo 3, 35121 Padua, Tel. +39 049 8276028, Fax +39 049 8276040, E-mail: dorianna.sandona@unipd.it (2) Department of Comparative Biomedicine and Food Science, University of Padua (3) Institute of Neuroscience, Padua, National Research Council of Italy

L’evento patogenetico chiave di un gruppo eterogeneo di malattie genetiche, collettivamente chiamate malattie da proteine mal ripiegate (UPDs), è la presenza di mutazioni geniche che causano il mal ripiegamento della proteina codificata. Questo può portare all’acquisizione di una funzione tossica dovuta all’aggregazione della proteina mutata o ad una perdita di funzione, a causa della prematura eliminazione della proteina difettosa da parte del sistema di controllo qualità cellulare (QCS).

Le sarcoglicanopatie, in particolare le distrofie muscolari dei cingoli di tipo 2D e 2E (LGMD2D/2E), la malattia di Brody (BD) e la sua controparte bovina pseudomiotonia (PMT) e la forma recessiva della tachicardia polimorfa ventricolare catecolaminergica (CPVT) sono tre malattie genetiche del muscolo striato che presentano peculiarità di UDPs. Nonostante presentino fenotipi clinici molto diversi, queste malattie hanno una caratteristica comune, un livello pressoché normale dei trascritti mutati mentre la quantità delle proteine codificate (alfa o beta-sarcoglicano, SERCA1a e calsequestrina2, rispettivamente) è bassissima. Tali mutanti sono substrati della degradazione proteica associata al reticolo endoplasmatico (ERAD) come già dimostrato nella LGMD2D (Gastaldello et al Am. J. Path.2008) e come qui dimostrato per quanto riguarda PMT. Sfortunatamente, al momento, non si conoscono terapie efficaci per il trattamento di queste malattie. Lo scopo di questo progetto è provare la fattibilità di una nuova terapia farmacologica per tali patologie, volta a “curare” le proteine mutate prevenendo la loro degradazione (“strategia di recupero della proteina”) o promuovendo il loro ripiegamento e trafficking (“strategia di riparazione della proteina”).

Abbiamo identificato numerosi componenti di ERAD coinvolti nella degradazione del mutante V247M di alfa-sarcoglicano che possono rappresentare dei potenziali target farmacologici nella cosiddetta “strategia di recupero”. Il loro abbattimento mediante l’uso di RNA interferenti, infatti, permette il recupero del mutante. Del resto, l’inibizione del proteasoma ha effetti positivi anche sul recupero del mutante di SERCA1a sia in esperimenti in vivo in un modello cellulare, sia in esperimenti ex vivo su un espianto muscolare di un bovino affetto da PMT. Per quanto riguarda la “strategia di riparazione”, stiamo testando diverse piccole molecole che, assistendo il folding, promuovono la maturazione e il trafficking delle proteine mutate. I primi esperimenti effettuati sono molto promettenti poiché i trattamenti farmacologici preservano i mutanti di SERCA 1a e alfa-sarcoglicano dalla degradazione e favoriscono la loro corretta localizzazione cellulare.

Questo progetto rappresenta il primo passo per lo studio di nuove terapie farmacologiche atte a curare patologie muscolari rare, per le quali attualmente né le terapie classiche né quelle più innovative, come la terapia genica, sono efficaci o attuabili.

ABSTRACT N. 75 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

GEP12072

Totale €

50.000

Num Centri: 1

66

FIMIA GIAN MARIA

Telethon grant N.

Durata (anni): 1

Anno d’inizio: 2012

PROGETTI DI RICERCA TElEThOn

LA DISTROFIA MUSCOLARE DEI CINGOLI 2H È CAUSATA DA UN PROCESSO AUTOFAGICO DIFETTIVO?

della sequenza, l’attribuzione delle varianti e l’annotazione sono in corso. le reads sono ora sottoposte a exome analysis pipeline presso l’IGA Technology Service, che eseguirà una mappatura e allineamento rispetto alla sequenza di riferimento del genoma umano (nCBI build 37/UCSC hg19).

Per filtrare e selezionare le mutazioni causative della patologia rispetto al gran numero di cambi nucleotidici ottenuti, tutte le varianti saranno valutate rispetto al loro effetto nell’alterare una funzione, rispetto alla segregazione nei membri della famiglia, e saranno escluse le mutazioni ritrovate anche in soggetti-controllo. Combinando la potenza delle nuove tecnologie di sequenziamento con le tecniche genetiche più tradizionali dovrebbe emergere un numero limitato di cambi nucleotidici rilevanti nella diagnosi genetica di lGMDh1. Questo risultato rappresenterà un avanzamento nel tentativo di caratterizzare tutti i geni importanti nel processo di degenerazione muscolare delle varie forme di lGMD.

Romagnoli Alessandra (1), Di Rienzo Martina (1), Fusco Carmela (2), Micale lucia (2), Merla Giuseppe (2), Fimia Gian Maria (1) (1) national Institute for Infectious Diseases ‘l. Spallanzani’ IRCCS, Via Portuense 292, 00149 Rome, Italy. Tel. +39.06.55170908, Fax +39.06.5582825, E-mail: gianmaria.fimia@inmi.it (2) Medical Genetics Unit, IRCCS “Casa Sollievo della Sofferenza”, San Giovanni Rotondo, Italy

l’autofagia svolge un ruolo cruciale nell’omeostasi tissutale, garantendo il turnover fisiologico dei componenti cellulari e rimuovendo selettivamente organelli e proteine danneggiate. Di recente è stata individuata una importante relazione funzionale tra il processo autofagico e le distrofia muscolari causate dalla deficienza di collagene di tipo IV. Dati sperimentali ottenuti nel nostro laboratorio suggeriscono che ci possa essere una correlazione tra un difetto di autofagia e un’altra distrofia muscolare, la distrofia muscolare dei cingoli di tipo 2h (lGMD2h). Infatti abbiamo trovato che la proteina TRIM32, la cui mutazione è noto causare la lGMD2h, interagisce con Ambra1, un regolatore positivo dell’autofagia. Basandoci su questa evidenza sperimentale, l’obiettivo di questo progetto è di chiarire se la sindrome lGMD2h sia caratterizzata da un deficit autofagico. A questo scopo, sono in corso esperimenti mirati a comprendere se la proteina TRIM32 è in grado di regolare il processo autofagico modulando l’attività di Ambra1. Inoltre, stiamo valutando l’effetto dell’espressione dei mutanti di TRIM32 individuati nella lGMD2h sul turnover delle proteine muscolari mediato dall’autofagia. nel loro insieme, tali approcci sperimentali permetteranno di raccogliere importanti informazioni sul potenziale utilizzo di composti capaci di stimolare il processo autofagico al fine di prevenire o rallentare la progressione della sindrome lGMD2h.

ABSTRACT N. 77 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie neuromuscolari Responsabile

GEP12025 41.840

Num Centri: 1

Durata (anni): 1

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2012

nigro Vincenzo (1,2), Savarese Marco (1,2), Mutarelli Margherita (2), Torella Annalaura (1), Di Fruscio Giuseppina (1), Politano luisa (3), Fanin Marina (4), Pegoraro Elena (4), Angelini Corrado (4), Bruno Claudio (5), Minetti Carlo (5), Santoro lucio (6), Comi Giacomo (7), Toscano Antonio (8), Siciliano Gabriele (9), Bertini Enrico (10), D’Amico Adele (10), Mongini Tiziana (11), Ricci Enzo (12), Belardinelli Angela (13), Santorelli Filippo Maria (14), Fiorillo Chiara (14), Sacconi Sabrina (15), Del Vecchio Blanco Francesca (1), De Concilio Ombretta (1), Piluso Giulio (1), Dionisi Manuela (2), Giugliano Teresa (1), Iacomino Michele (1), Garofalo Arca (1), Erpice Rosalba (1), Cuomo Anna (1), Pisano Cristina (1), Cutillo luisa (2), Guarracino Mario (16)

PETRUZZELLA VITTORIA

Totale €

240.800

DIAGNOSI GENETICA DEI PAZIENTI ITALIANI CON DISTROFIA MUSCOLARE DEI CINGOLI BASATA SU SEQUENZIAMENTO DI NUOVA GENERAZIONE (NGS)

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie neuromuscolari Telethon grant N.

GUP11006

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 76 Responsabile

NIGRO VINCENZO

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2012

(1) Dipartimento di Biochimica, Biofisica e Patologia Generale, Seconda Università degli Studi di napoli - laboratorio di Genetica Medica, via luigi De Crecchio 7, 80138 napoli, Italy, Tel. 0815665704, E-mail: vincenzo.nigro@unina2.it (2) Telethon Institute of Genetics and Medicine, via Pietro Castellino 111, napoli, Italy (3) Cardiomiologia e Genetica Medica, Seconda Università degli Studi di napoli, napoli, Italy (4) Dipartimento di neuroscienze, Università degli Studi di Padova, Padova and IRCSS S. Camillo, Venezia, Italy (5) Università di Genova e Unità malattie muscolari, Opedale G. Gaslini, Genova, Italy (6) Dipartimento di Scienze neurologiche, Università di napoli “Federico II”, napoli, Italy (7) Dipartimento di Scienze neurologiche, Università degli Studi di Milano, Italy (8) Dipartimento di neuroscienze, Università di Messina, Messina, Italy (9) Dipartimento di neuroscienze, Università di Pisa, Pisa, Italy (10) Ospedale Ped. Bambino Gesù, Roma, Italy (11) AOU S. Giovanni Battista, SS Malattie neuromuscolari, Torino, Italy (12) Dip di neurologia, Policlinico Gemelli, Università Cattolica, Roma, Italy (13) IRCCS Mondino, Pavia, Italy (14) IRCCS Stella Maris, Pisa, Italy (15) nice hospital and UMR CnRS6543, nice University, nice, France (16) national Research Council of Italy (ICAR-CnR), napoli, Italy

IDENTIFICAZIONE DEL GENE CHE DETERMINA LA DISTROFIA MUSCOLARE DEI CINGOLI DI TIPO 1H Bianco Angelica (1), Bisceglia luigi (2), Amati Angela (3), Zoccolella Stefano (3), Petruzzella Vittoria (1) (1) Dipartimento di Scienze Mediche di Base, neuroscienze ed Organi di Senso, Università degli Studi “Aldo Moro”, Piazza G. Cesare, 70124, Bari, Tel 080.5448529, Fax 080.5448538, E-mail: vittoria.petruzzella@uniba.it (2) Ospedale Casa Sollievo della Sofferenza IRCCS, UOC Genetica Medica, San Giovanni Rotondo, Italia (3) Azienda Ospedaliera-Universitaria Policlinico Consorziale, Raggruppamento di Scienze neurologiche, Bari

nel presente progetto ci proponiamo di identificare le basi genetiche di una forma di distrofia dei cingoli trasmessa con modalità autosomica-dominante, lGMD1h (Bisceglia et al., 2010 A new locus on 3p23-p25 for an autosomal-dominant limb-girdle muscular dystrophy, lGMD1h. Eur J hum Genet. 6:636-641). Precedenti studi di linkage avevano permesso di mappare il locus della lGMDh1 sul cromosoma 3p23-25 in una famiglia composta da quattro generazioni che presenta una storia di ipostenia progressiva a carico dei muscoli prossimali degli arti superiori ed inferiori con decorso benigno ed insorgenza nella quinta decade di vita. Avendo escluso diversi geni candidati nella regione 3p23-25 mediante metodiche convenzionali di sequenziamento l’obiettivo che ora ci proponiamo, è di identificare il gene-malattia attraverso sequenziamento dell’intero esoma mediante hT-nGS (GA-IIe platform, Illumina).

Campioni di DnA estratto dal sangue di cinque membri della famiglia (generazione due: 1 soggetto sano e 2 affetti; generazione tre: 1 soggetto sano e 1 affetto) sono stati frammentati con Biorupter e le libraries preparate con il sistema SPRIWorks FX- library su robot Beckman FX utilizzando adattatori TruSeq Illumina. l’arricchimento dell’esoma è stato eseguito mediante TruSeq Exome Enrichment Kit (Illumina) che è in grado di selezionare circa 62Mbp del genoma umano. Il sequenziamento è stato condotto mediante la piattaforma hiSeq2000 (Illumina) generando reads di 100 paia di basi. Il valore ottenuto per ciascun soggetto analizzato è stato: l1=61,9 mr; l2=60,5 mr; l3=52,8mr; l4=59,4 mr; l5=65,1mr. l’allineamento

Il sequenziamento di nuova generazione (nGS) ha un enorme impatto sulla nostra conoscenza dei diversi aspetti della biologia. Può essere anche molto potente per studiare i pazienti con malattie genetiche eterogenee, come le distrofie muscolari dei cingoli (lGMD). Il nostro progetto si propone di individuare le mutazioni in tutti i geni noti mediante approccio mirato nGS e array CGh, e mira anche alla scoperta di nuovi geni con approccio “exome sequencing” ed RnASeq. nel corso di questo primo anno del progetto, abbiamo reclutato 150 campioni di DnA da pazienti italiani viventi affetti da lGMD. I pazienti da studiare sono stati selezionati in base ai seguenti criteri: a) diagnosi clinica di lGMD con debolezza prossimale e trasmissione autosomica (sia recessiva e dominante), b) nessuna diagnosi molecolare dopo tests convenzionali per geni lGMD, c) gravità della malattia, d) disponibilità di una biopsia muscolare per l’estrazione di mRnA. Tutti i campioni di DnA sono stati arricchiti per 486.480 bp che comprendono 2.447 esoni di 98 geni, utilizzando la tecnologia halo-

67

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

plex con l’uso di codici a barre (Motor Haloplex). Abbiamo quindi effettuato pooling utilizzando la piattaforma Illumina HiSeq1000, in grado di analizzare 128 campioni raggruppati in 16 pools combinatori a 2x75bp. Abbiamo sequenziato con “coverage” di 3000 x i 16 pools ed identificato circa 70 mutazioni uniche, confermate dal sequenziamento Sanger. I casi negativi sono stati poi studiati con il MotorChip 3.0 con matrice Agilent CGH per identificare eventuali delezioni o duplicazioni. I nostri risultati confermano che vi è una elevata eterogeneità genetica delle distrofie muscolari dei cingoli e che i tests basati sull’NGS sono pronti per un uso diagnostico.

Abbiamo poi usato la NGS per scoprire nuovi geni malattia con approccio “exome sequencing” nelle famiglie. L’analisi consiste di almeno 55Mb di sequenze che coprono tutti i trascritti umani conosciuti. A titolo di esempio, abbiamo studiato famiglia con 64 membri affetti in 7 generazioni definita come LGMD1F. Abbiamo sequenziato l’ exoma di quattro membri della famiglia separati da un massimo di undici meiosi e abbiamo individuato una singola nuova mutazione condivisa: una delezione che causa frame-shift. Questo provoca un cambiamento nonstop nel gene Transportin 3 (TNPO3) che codifica un membro della importina ß super-famiglia.

In conclusione, utilizzando diversi approcci NGS ci aspettiamo di fornire la diagnosi molecolare in un massimo di 80% dei casi.

esordio è 27 anni, anche se la LGMD2D presenta un esordio più precoce (11.5±7 anni).Tutte le forme si caratterizzano per un marcato aumento dei valori di CPK, ad eccezione della LGMD1B che si distingue per valori solo modicamente aumentati (295±127 UI/L).

Le forme LGMD2E e 2I presentano frequentemente cardiomiopatia (rispettivamente nel 30 e 40% dei casi) mentre nella LGMD2A e 2B l’interessamento cardiaco è più raro e per lo più caratterizzato da disturbi del ritmo (6 e 21%). La LGMD2E e 2I mostrano inoltre un maggiore interessamento respiratorio (70 e 50% dei casi), mentre nelle altre forme un lieve quadro restrittivo è presente in circa il 20% dei casi. Complessivamente circa il 30% dei pazienti perde la deambulazione.

Uno studio osservazionale è attualmente in corso al fine di meglio descrivere la storia naturale e i parametri migliori per la sua definizione. Nel complesso questo studio fornirà una caratterizzazione più dettagliata di questo gruppo di malattie, incrementerà la capacità diagnostica, definirà lo spettro di variabilità fenotipica ed esplorerà potenziali fattori modificatori; questi risultati potranno essere una base di partenza per la definizione di potenziali approcci terapeutici.

Referenze1. Magri F,et al. Frequency and characterisation of anoctamin 5 mutations in a cohort of Italian limb-girdle muscular dystrophy patients. Neuromuscul Disord. 2012;22(11):934-43.

2. Vattemi G, et al. Selective pseudohypertrophy of vastus medialis muscles associated with calpain 3 deficiency.Neurologist.2012;18(5):306-9.

3. Bello L, et al. Cardiomyopathy in patients with POMT1-related congenital and limb-girdle muscular dystrophy. Eur J Hum Genet.

2012 May 2.

4. Gavassini BF, et al. Clinical and molecular characterization of limb-girdle muscular dystrophy due to LAMA2 mutations. Muscle Nerve. 2011;44(5):703-9.

ABSTRACT N. 78 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

COMI GIACOMO PIETRO

Telethon grant N.

GUP10006

Totale €

163.600

Num Centri: 8

Durata (anni): 2

Anno d’inizio: 2011

ABSTRACT N. 79

RETE CLINICA E DI LABORATORIO DELLE DISTROFIE DEI CINGOLI PER STABILIRE UN REGISTRO NAZIONALE

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari

Magri Francesca (1), Nigro Vincenzo (2,3), Angelini Corrado (4), Mongini Tiziana (5), Mora Marina (6), Moroni Isabella (6), Toscano Antonio (7), Tomelleri Giuliano (8), Siciliano Gabriele (9), Comi Giacomo (1)

Responsabile

GUP11001

Totale €

203.300

Num Centri: 13

(1) Dipartimento di Scienze Neurologiche, Università degli Studi di Milano, Fondazione IRCCS Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico, Milano - Dipartimento di Scienze Neurologiche, Università degli Studi di Milano, Fondazione IRCCS Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico, via F. Sforza 35, 20122 Milano, Tel. +39.02.55033817, Fax +39.02.55033800; E-mail: giacomo.comi@unimi.it (2) Dipartimento di Patologia Generale, Seconda Università degli Studi di Napoli, Napoli (3) Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM), Napoli (4) Dipartimento di Neuroscienze: SNPSRR, Università di Padova, Padova (5) Dipartimento di Neuroscienze, AOU S. Giovanni Battista di Torino, Torino (6) Divisione di Malattie Neuromuscolari e Neuroimmunologia, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico C. Besta, Milano (7) Dipartimento di Neuroscienze, Università di Messina.

(8) Dipartimento di Scienze Neurologiche, Verona (9) Dipartimento di Neuroscienze, Università di Pisa, Pisa

MERCURI EUGENIO

Telethon grant N.

Durata (anni): 2

Anno d’inizio: 2012

SVILUPPO DI UN DATA BASE SULLE DISTROFIE MUSCOLARI CONGENITE NEL CONTESTO DI UN NETWORK COLLABORATIVO NAZIONALE PER RICOSTRUIRE ELEMENTI DI STORIA NATURALE DI QUESTE MALATTIE Mercuri Eugenio (1), D’Amico Adele (2), Messina Sonia (3), Politano Luisa (4), Santorelli Filippo M. (5), Bruno Claudio (6), Boffi Patrizia (7), Berardinelli angela lucia (8), Pegoraro Elena (9), Moroni Isabella (10), Pini Antonella (11), Comi Giacomo Pietro (12), Corbo Massimo (13), Bianco Flaviana (1), Pane Marika (1) (1) Child Neurology and PsichiatryUnit Institute of Psychiatry Catholic University Policlinico Gemelli Roma, Tel. 06 30155586, E-mail: eumercuri@gmail.com (2) Neuromuscular and Neurodegenerative Unit, Department of Neuroscience, Bambino Gesù Children’s Hospital, Rome (3) Dipartimento di Neuroscienze, Scienze Psichiatriche e Anestesiologiche, Messina (4) Department of Experimental Medicine, Second University of Naples (5) Dipartimento di Medicina Molecolare, Neurogenetica e Malattie Neuromuscolari IRCCS Fondazione Stella Maris, Calambrone, Pisa (6) Dept. of Pediatric Sciences, Istituto Giannina Gaslini, University of Genova (7) Dipartimento di Scienze Pediatriche e dell’Adolescenza Sezione di Neuropsichiatria Infantile, Torino (8) Fondazione “Istituto Neurologico Nazionale C. Mondino”Struttura Complessa di Neuropsichiatria Infantile Pavia (9) Department of Neurosciences, University of Padova (10) Division of Child Neurology, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico C. Besta, Milano (11) Unità Operativa di Neuropsichiatria Infantile, Dipartimento di neuroscienze, Azienda USL di Bologna. Bologna (12) Department of Neurological Sciences University of Milano Milano (13) NEMO (NEuroMuscular Omnicentre) Fondazione Serena Onlus, Ospedale Niguarda Cà Granda, Milano

Le distrofie muscolari dei cingoli (Limb girdle muscular dystrophies, LGMD) sono un gruppo eterogeneo di malattie muscolari geneticamente determinate, caratterizzate da progressiva ipostenia ed atrofia muscolare a carico prevalentemente della muscolatura cingolare e prossimale ai quattro arti. Al momento attuale sono state descritte 18 forme autosomiche recessive (AR) e 8 forme autosomico dominanti (AD), ma nonostante la recente scoperta di nuovi geni, il 30-40% delle LGMD è ancora privo di una diagnosi molecolare. I recenti progressi in ambito genetico hanno tuttavia sottolineato l’importanza della definizione di correlazioni clinico-genetiche sia ai fini di consulenza genetica sia per approfondire la patogenesi.

Questo studio collaborativo tra 8 differenti centri italiani si pone come obiettivo di raccogliere un ampio gruppo di pazienti Italiani affetti da LGMD, al fine di definire l’epidemiologia di queste forme e creare i presupposti per la costituzione di un registro nazionale.

Inoltre uno studio osservazionale della durata di due anni servirà a tracciarne la storia naturale e a definire i parametri clinico-strumentali migliori per seguirne l’evoluzione nel tempo e valutare l’efficacia di eventuali terapie.

Abbiamo raccolto dati clinici e molecolari di 281 pazienti, 42 affetti da forme AD e 192 da forme AR. Tra le forme recessive le più frequenti sono la LGMD2A (17%) e LGMD2B (16%), seguite da LGMD2I (11%), LGMD2D (9%), LGMD2E (4%), LGMD2C (3%), LGMD2L (2 %) e LGMD2F (0.5%). In un soggetto che presentava alterazioni della sostanza bianca alla RMN encefalo sono state dimostrate mutazioni nel gene LAMA2. In 49 pazienti non è stato ancora possibile definire il gene causativo.

Le diverse forme differiscono per storia naturale. L’età media di

Negli ultimi 15 anni l’identificazione di numerosi nuovi geni responsabili delle diverse forme di distrofia muscolare congenita (CMD) ha non solo espanso notevolmente lo spettro delle forme note di CMD ma ha anche prodotto importanti progressi nella comprensione dei meccanismi sottesi da questo gruppo di malattie.

La nostra capacità di curare queste malattie è ancora estremamente limitata. In più, considerando che le CMD sono una malattie rara, l’esiguo numero di pazienti rappresenta il maggior impedimento per

68

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

i progressi sia della clinica e che della ricerca. Questo limite può essere effettivamente superato armonizzando un network nazionale con piu ampi network internazionali ottenenedo un registro dei pazienti unico che serva anche a condividere valutazioni e misure di outcome al fine di acquisire dati di storia naturale. Il principale obiettivo è quindi quello di confluire in un registro on-line internazionale di pazienti CMD per conoscere meglio i vari fenotipi e incrementare le informazioni sulla storia naturale di queste malattie.Tale l’obiettivo dovrebbe essere raggiunto: 1) Stabilendo il network italiano di tutti i centri clinici esperti di CMD e creando un registro di casi CMD sulla base di quello internazionale disponibile on-line e ideato dall’associazione CURE CMD (CMDIR) 2) Raccogliendo informazioni epidemiologiche sulle varie forme di CMD 3) Usando il registro come piattaforma per promuovere standard di cura e, in sinergia con TREAT-NMD a CURE CMD, identificare le misure di outcome più appropriate per ogni forma di CMD e utilizzarle al fine di raccogliere dati di storia naturale.

Questi passi sono fondamentali non solo per capire meglio la storia naturale delle CMD e migliorare la gestione di queste malattie a livello clinico, ma anche per pianificare correttamente i passaggi necessari in preparazione a possibili strategie terapeutiche future.

Nella prima parte di questo studio preliminare, vari incontri sono serviti a identificare i pazienti tra i diversi centri partecipanti e a identificare le migliori strategie di arruolamento.Considerando le difficoltà di ingresso nel registro on-line e considerando che numerose famiglie italiane hanno poca esperienza con i computer, sono stati discussi metodi alternativi per la registrazione. E’ stato suggerito che una copia stampata del sondaggio potrebbe essere spedito prima per consultazione alle famiglie, in modo che le stesse possano iniziare a riempire la versione cartacea discutendo allo stesso tempo i campi che hanno trovato difficili Una traduzione dell’intero registro è stata completata e sarà disponibile in formato elettronico nei prossimi mesi.

costituisce un approccio alternativo a terapie geniche finalizzate a incrementare un gene d’interesse. L’uso di piccole molecole per ottenere un incremento di LARGE offre degli ovvi vantaggi in termini di biodisponibilità e reazioni immunitarie.

L’obiettivo del nostro “exploratory” grant è lo sviluppo di un solido, riproducibile e controllato sistema di saggio su cellule per l’attivazione del promotore di LARGE. Questo è un passaggio critico per il possibile successo di uno screening di composti o di farmaci già esistenti che sarà condotto in esperimenti successivi.

Per sviluppare il progetto, analizzeremo diverse regioni del promotore di LARGE tramite un approccio bioinformatico. Trasfetteremo quindi in cellule C2C12 diversi costrutti contenenti la luciferasi posta a valle di delezioni sequenziali delle regioni 5’ del gene (aim #1). Contemporaneamente, testeremo diversi controlli positivi, ossia molecole in grado d’incrementare i trascritti di LARGE (aim#2).

Quindi, creeremo e valideremo delle linee cellulari di C2C12 stabilmente trasfettate con costrutti esprimenti la regione d’interesse del promotore di LARGE e la luciferasi (aim #3).

ABSTRACT N. 81 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

GEP12046 50.000

Num Centri: 1

Durata (anni): 1

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2012

Porrello Emanuela (1), Rivellini Cristina (1), Dina Giorgia (1), Velardo Daniele (1), Domi Teuta (1), Del Carro Ubaldo (1), Ungaro Daniela (1), Panattoni Martina (2), Feltri Maria Laura (3), Wrabetz Lawrence (3), Pardi Ruggero (2), Quattrini Angelo (1), Previtali Stefano Carlo (1)

GAZZERRO ELISABETTA

Totale €

290.900

RUOLO DI JAB1 NEL CONTROLLO DELLO SVILUPPO E RIGENERAZIONE DEL NERVO PERIFERICO: IMPLICAZIONE NELLA PATOGENESI DELLE NEUROPATIE EREDITARIE ASSOCIATE ALLA DISTROFIA MUSCOLARE CONGENITA (MDC1A)

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Telethon grant N.

GGP12024

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 80 Responsabile

PREVITALI STEFANO CARLO

Telethon grant N.

(1) Division of Neuroscience and Institute of Experimental Neurology (INSPE), San Raffaele Scientific Institute, Via Olgettina 60, 20132 Milano, Tel 02.26433036, E-mail: previtali.stefano@hsr.it (2) Division of Immunology, San Raffaele Scientific Institute, Milano, Italy (3) Division of Genetics and Cell Biology, San Raffaele Scientific Institute, Mlano, Italy

Anno d’inizio: 2012

RICERCA DI NUOVI FARMACI PER LE DISTROGLICANOPATIE TRAMITE UNO SCREENING BASATO SULL’ATTIVAZIONE DEL PROMOTORE DEL GENE LARGE Assereto Stefania (1), Galietta Luis (2), Zara Federico (1), Bruno Claudio (1), Minetti Carlo (1), Gazzerro Elisabetta (1)

La distrofia muscolare congenita di tipo 1A (MDC1A), è una malattia multiorgano caratterizzata da una distrofia muscolare e una neuropatia dismielinizzante. Questa malattia è causata da mutazione del gene LAMA2, che codifica per la laminina2, il principale componente della membrana basale delle cellule muscolari e delle cellule di Schwann. La mancanza di laminina2 lascia i suoi recettori privi di legame e comporta la progressiva degenerazione del tessuto neuromuscolare. Nel precedente grant Telethon (GGP08037), abbiamo studiato la possibilità di migliorare la malattia MDC1A mediante trapianto di cellule staminali mesoangioblasti, che erano stati ingegnerizzati al fine di produrre una proteina chiamata mini-agrina (mMAG). Questa mMAG era in grado di legare nuovamente i recettori orfani di laminina2 alla membrana basale e quindi ripristinare la loro attività. Questo approccio ha portato ad un miglioramento della distrofia muscolare nei modelli animali di MDC1A, ma non della neuropatia con successivo peggioramento delle capacità motorie.

In questa nuovo grant, vogliamo meglio caratterizzare il meccanismo molecolare alla base dei processi degenerativi della neuropatia associata a MDC1A. Questi stessi processi sono coinvolti anche in altre neuropatie del gruppo delle CMT, che sono causate da un difetto dei segnali originati della laminina2. Caratteristica delle neuropatie associate a CMD1A è la presenza di un difetto nei processi di defascicolazione degli assoni durante lo sviluppo (detto di sorting) e nel successivo accoppiamento cellula di Schwann-assone, e mielinizzazione. Meccanismi alla base di questo difetto sono correlati con la proliferazione, sopravvivenza e differenziazione delle cellule di Schwann. Jab1 è una molecola intracellulare coinvolta nel regolare il ciclo cellulare, l’espressione genica e la proteolisi, e la sua funzione è controllata da segnali originati dalla matrice extracellulare.

Jab1 è espressa dalle cellule di Schwann nel nervo periferico, e la sua espressione è regolata durante lo sviluppo e i processi rigenerativi del nervo. La creazione di topi transgenici con selettiva inattivazione di Jab1 nelle cellule di Schwann ha determinato l’insorgenza di una neuropatia dismielinizzante, con le stesse caratteristiche istologiche osservate nelle neuropatie associate a MDC1A. Abbiamo anche osservato che l’espressione di Jab1 è notevolmente ridotta nei modelli animali di MDC1A. Questo ci ha fatto supporre che Jab1

(1) Center of Myology, Pediatric Neurology Unit, Department of Neuroscience and Rehabilitation, G. Gaslini Institute, Largo G. Gaslini 5, 16147 Genova, Italy, Tel. +39.010.5636606; Fax +39.010.3538265; E-mail: eligazzerro@gmail.com (2) Laboratory of Molecular Genetics, Istituto Giannina Gaslini, Genova

Il progetto è finalizzato a sviluppare e validare un sistema di screening su vasta scala per l’attivazione del promotore della glicosiltransferasi LARGE. Il termine “distroglicanopatie” indica un gruppo eterogeneo di distrofie muscolari congenite che frequentemente includono alterazioni del sistema nervoso centrale e che presentano un’ampia gamma di gravità clinica. Le distroglicanopatie sono causate dall’ipoglicosilazione dell’alfa-distroglicano (a-DG). Questa proteina di membrana, una volta glicosilata nel suo dominio mucinico, lega dei ligandi extracellulari (laminina, agrina, perlecano) giocando così un ruolo chiave nel mantenimento delle membrane cellulari nel tessuto muscolare e nervoso. Difetti in 8 glicosiltransferasi o proteine accessorie possono causare un fenotipo distroglicanopatico (LARGE, POMT1, POMT2, POMGnT1, FKTN, DMP2, DMP3). La gravità della distrofia muscolare e la ratio relativa di a-DG glicosilato verso la molecola non-glicosilata correlano strettamente. I pazienti con presentazione clinica più severa tendono ad avere la più cospicua riduzione di glicosilazione, mentre persino una limitata quantità di proteina glicosilata sembra essere sufficiente a preservare la funzione muscolare.

Differenti Autori hanno dimostrato che l’overespressione di LARGE può compensare il difetto di glicosilazione causato da mutazioni di altre glicosiltranferasi e può incrementare così l’affinità di a-DG per la laminina con un decremento della patologia muscolare. Perciò, l’identificazione di composti in grado di stimolare l’espressione di LARGE rappresenta una interessante strategia farmacologica per le distroglicanopatie.

Lo screening di gruppi di composti chimici e farmaci su vasta scala

69

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

possa essere coinvolta nei meccanismi patogenetici delle neuropatie associate a MDC1A, e più in generale ai segnali originati dalla laminina2.

In questo grant vogliamo caratterizzare meglio questa neuropatia e i meccanismi molecolari che portano al difetto di sorting e di mielinizzazione e che sfociano nei deficit motori. Inoltre valuteremo se questa molecola interviene anche nei processi rigenerativi del nervo periferico e proporremo un approccio terapeutico per migliorare la neuropatia in corso di MDC1A.

CHAPERONE FARMACOLOGICI PER LA CURA DI MALATTIE GENETICHE: SVILUPPO DI NUOVI FARMACI E INDIVIDUAZIONE DI BERSAGLI Andreotti Giuseppina (3), Cammisa Marco (1,2), Correra Antonella (1,2), Citro Valentina (1,2), Cimmaruta Chiara (3), De Crescenzo Agostina (4), Cubellis Maria Vittoria (1,2) (1) Department of Structural and Functional Biology, University “Federico II”, via Cinthia, Naples, Tel 3383484213, Fax 081679233, E-mail: cubellis@unina.it (2) Istituto di Chimica Biomolecolare, CNR, Pozzuoli, Napoli (3) Istituto di Biostrutture e Bioimmagini-CNR, Napoli (4) Dipartimento di Scienze Ambientali, Seconda Università di Napoli, Caserta

ABSTRACT N. 82 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

FIUMARA FERDINANDO

Telethon grant N.

GEP12087

Totale € Num Centri: 1

La riduzione della stabilità di una proteina è il più comune fenotipo biochimico delle malattie monogeniche. Questa constatazione apre la strada a un nuovo approccio terapeutico basato sugli chaperone farmacologici. Gli chaperone farmacologici sono piccole molecole che stabilizzano le proteine mutate, aumentano la loro concentrazione intracellulare e conseguentemente la loro attività biologica. La malattia di Fabry, un disordine da accumulo lisosomiale, rappresenta un utile sistema modello per approntare protocolli sperimentali per lo sviluppo della terapia con chaperone farmacologici. Infatti per questa patologia esistono una grande quantità di dati. Sono noti più di 400 genotipi e il nostro gruppo ha dimostrato che le mutazioni potenzialmente rispondenti agli chaperone, circa il 40% del totale, possono essere predette (Andreotti G, Guarracino MR, Cammisa M, Correra A, Cubellis MV: Prediction of the responsiveness to pharmacological chaperones: lysosomal human alpha-galactosidase, a case of study. Orphanet journal of rare diseases 2010, 5:36). Sebbene il metodo predittivo sia accurato, prima di poter proporre a pazienti affetti da una data mutazione, la terapia farmacologica in alternativa alla sostituzione enzimatica, è necessario validare la predizione in vitro (Andreotti G, Citro V, De Crescenzo A, Orlando P, Cammisa M, Correra A, Cubellis MV: Therapy of Fabry disease with pharmacological chaperones: from in silico predictions to in vitro tests. Orphanet journal of rare diseases 2011, 6(1):66). Per questo scopo si potrebbe adattare uno dei metodi classici utilizzati per valutare la stabilità termodinamica delle proteine all’analisi dei mutanti presenti in piccole quantità in estratti cellulari. Noi proponiamo di utilizzare la fusione in urea associata al western blot.

Vorremmo estendere l’approccio terapeutico con gli chaperone ad altre patologie per le quali non c’è ancora cura .

La deficienza di fosfomannomutasi2 rappresenta il tipo più frequente di disordine congenito della glicosilazione. La perdita completa dell’attività della fosfomannomutasi probabilmente non è compatibile con la vita e le persone affette possiedono almeno un allele con attività residua. Abbiamo caratterizzato la fosfommannomutasi2 normale e il suo più comune mutante ipomorfo, p.F119L, che è associato a un fenotipo grave della malattia. Abbiamo dimostrato che la specie attiva è l’enzima dimerico e che la mutazione destabilizza la struttura quaternaria, e, allo stesso tempo, danneggia l’attività e la stabilità dell’enzima. Abbiamo dimostrato che il legame di ligandi stabilizza sia la fosfomannomutasi2 mutata che wild type e favorisce l’associazione delle subunità in vitro. L’effetto più forte si manifesta con il glucosio-1,6-bisfosfato o con glucosio monofosfato in presenza di vanadato. Questa scoperta suggerisce un nuovo approccio terapeutico per il trattamento della deficienza di fosfomannomutasi2.

44.100 Durata (anni): 1

Anno d’inizio: 2012

APPROCCI TERAPEUTICI GUIDATI DALLA STRUTTURA PROTEICA PER LA DISTROFIA MUSCOLARE OCULOFARINGEA E PATOLOGIE CORRELATE Cibelli Marica, Pelassa Ilaria, Fiumara Ferdinando Department of Neuroscience, Università degli Studi di Torino, Corso Raffaello 30, 10125 Torino, Tel. 011.6708486, E-mail: ferdinando.fiumara@unito.it

La distrofia muscolare oculofaringea (OPMD) è una patologia indotta dalla espansione di triplette di DNA codificanti per alanina nel gene PABPN1. Questa espansione porta alla sintesi di proteine PABPN1 contenenti tratti allungati di poli-alanina (polyA).

La OPMD appartiene ad un più vasto gruppo di patologie genetiche causate anch’esse da espansione di tratti codificanti polyA in diversi geni. L’allungamento dei tratti di polyA causa aggregazione e disfunzione proteica, portando a danno e morte cellulare. La OPMD si manifesta con una forma di distrofia muscolare ad insorgenza tardiva che colpisce primariamente i muscoli oculari e faringei con ptosi palpebrale, disfagia, disfonia, e che può estendersi anche ad altri muscoli causando debolezza muscolare e deficit motori più generalizzati.

I meccanismi strutturali e molecolari che inducono l’aggregazione e la tossicità di PABPN1 nella OPMD sono compresi solo in parte, e si ritiene che siano basati sulla perdita della struttura nativa (misfolding) della proteina indotta dalla espansione del tratto di polialanina, fatto che condurrebbe alla formazione di strutture aggreganti di tipo beta-sheet, in analogia con quanto avviene nelle malattie da proteine amiloidi. Tuttavia, recenti studi nel nostro laboratorio hanno evidenziato il ruolo cruciale di strutture alfa-elicali di tipo coiled coil (CC) nella aggregazione e tossicità di proteine con espasione dei tratti di polyA. Queste osservazioni ci hanno spinto alla ricerca di strategie di interferenza con i CC che possano risultare in nuovi approcci terapeutici che siano specifici per la OPMD e le malattie da espansione di polyA. A questo scopo abbiamo sviluppato una serie di peptidi sintetici idrosolubili contenenti tratti di polyA di lunghezza variabile e ne abbiamo caratterizzato in vitro la struttura, la stabilità e lo stato oligomerico attraverso una combinazione di tecniche di dicroismo circolare e cross-linking chimico. Questi peptidi possono anche essere overespressi in modelli cellulari per studiarne il comportamento aggregativo in vivo. Stiamo ora impiegando questi peptidi come base per screening rivolti alla ricerca di piccole molecole e peptidi capaci di interferire specificamente con l’aggregazione proteica da polyA, sia in vitro sia in vivo. Molti di questi composti e peptidi vengono prodotti attraverso design razionale basato sulle loro caratteristiche strutturali predicibili, inclusa la loro compatibilità per l’interazione con specifiche strutture di PABPN1 e altre proteine legate ad espansione di polyA. Questo approccio fornisce una piattaforma fondamentale per l’identificazione di composti e peptidi con potenziale terapeutico in grado di interferire con gli specifici meccanismi strutturali della OPMD e delle altre malattie da espansione di polyA.

ABSTRACT N. 84 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

GGP12108 191.700

Num Centri: 2

Durata (anni): 3

Durata (anni): 1

Anno d’inizio: 2011

Parenti Giancarlo (1,2), la Marca Giancarlo (3), Fecarotta Simona (1), Donati Maria Alice (4), Morandi Lucia Ovidia (5), Ravaglia Sabrina (6), Moglia Arrigo (6), Ascione Serena (1), Ombrone Daniela (3), Sacchini Michele (4), Pasanisi Barbara (5), De Filippi Paola (7), Rosa Margherita (1), Agovino Teresa (1,4), Porto Caterina (1,2), Rossi Barbara (2), Carbone Maria Teresa (8), Costantino Demetrio (9), Concolino Daniela (10), Andria Generoso (1)

CUBELLIS MARIA VITTORIA

Totale €

260.000

EFFICACIA DELLA TERAPIA CON CHAPERONE FARMACOLOGICI IN ASSOCIAZIONE CON LA TERAPIA ENZIMATICA SOSTITUTIVA IN PAZIENTI AFFETTI DALLA MALATTIA DI POMPE

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Telethon grant N.

GUP09017

Totale € Num Centri: 4

ABSTRACT N. 83 Responsabile

ANDRIA GENEROSO

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2012

(1) Dipartimento di Pediatria, Università di Napoli “Federico II”, Via S. Pansini

70

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

5, 80131, Napoli, Tel. +39.081.7462673, Fax +39.081.7463116; E-mail: andria@unina.it (2) Telethon Institute of Genetics and Medicine, Napoli (3) Dipartimento di Farmacologia Clinica, Ospedale Pediatrico Meyer, Firenze (4) UO Malattie Metaboliche e Muscolari Ereditarie, Ospedale Pediatrico Meyer, Firenze (5) UO Patologia Muscolare-Neuroimmunologia, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Besta, Milano (6) Dipartimento di Sanità Pubblica e Neuroscienze, Università di Pavia (7) Dipartimento di Medicina Molecolare, Università di Pavia (8) Ospedale SS Annunziata, AORN Santobono-Pausilipon, Napoli (9) AO Bianchi Melacrino Morelli, Reggio Calabria (10) Pediatria, Università “Magna Graecia” di Catanzaro

gen, Dipartimento di Genetica, 9700 RB Groningen, Paesi Bassi (3) Dipartimento di Neuroscienze, Università degli Studi di Padova, Padova, Italia (4) Radboud Università degli Studi di Nijmegen, Nijmegen, Paesi Bassi (5) Dipartimento di Scienze della Vita, Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia, Modena, Italia

HSPB3 è un membro sino ad ora solo marginalmente studiato della famiglia delle piccole proteine da shock termico (HSPB1-HSPB10) che forma un complesso stabile con HSPB2 con ratio pari ad 1:3.

L’espressione del complesso HSPB2/HSPB3 è indotta durante il differenziamento delle cellule muscolari e gioca un ruolo nel mantinimento della struttura e funzione di tali cellule. Recentemente la mutazione R7S nella proteina HSPB3 è stata associata con lo sviluppo della neuropatia motoria di tipo 2C (dHMN 2C). Noi riportiamo l’identificazione di due nuove mutazioni in HSPB3 trovate in pazienti affetti da miopatia congenita: 1) la prima mutazione risiede nel residuo R116, localizzato nel dominio alpha-cristallina e la cui mutazione in altri membri della famiglia delle HSPB è stata precedentemente associata a malattie neuro/muscolari (R116 di HSPB3 è ad esempio equivalente al residuo R120 in HSPB5, la cui mutazione causa miopatia miofibrillare ed al residuo K141 in HSPB8, la cui mutazione causa neuropatia periferica); 2) la seconda mutazione da noi identificata causa un cambiamento nel codice di lettura di HSPB3 e l’inserimento di un codone di stop prematuro. Entrambe queste mutazioni non sono state trovate in più di 400 campioni di DNA provenienti da pazienti controllo. Studi di espressione ci hanno permesso di confermare che la mutazione che causa l’inserimento di un codone di stop prematuro porta alla produzione di un peptide che molto probabilmente viene immediatamente degradato e che pertanto non può essere visualizzato. Invece, bensì entrambe le mutazioni R7S ed R116 sono espresse, abbiamo osservato che la mutazione R116 influenza negativamente la stabilità e l’espressione di HSPB3. Abbiamo successivamente caratterizzato la capacità dei vari mutanti di HSPB3 di interagire con HSPB2 e formare il complesso HSPB2/HSPB3. I nostri studi dimostrano che mentre il mutante R7S forma un complesso stabile con HSPB2, il mutante R116 non è più capace di interagire con HSPB2. I nostri studi futuri vertono ad analizzare come questi mutanti possono influenzare la stabilità, la localizzazione subcellulare e la funzione di HSPB3 ed indirettamente di HSPB2, permettendo di comprenderne meglio le funzioni in neuroni motori e cellule muscolari. Inoltre i nostri studi permetteranno di stabilire come i mutanti di HSPB3 da noi identificati influenzano dal punto di vista meccanicistico la funzione e vitalità di neuroni motori e cellule muscolari, ponendo le basi per una migliore comprensione dello sviluppo della malattia.

Introduzione. La malattia di Pompe (PD) o Glicogenosi tipo II (OMIM 232300) è una miopatia metabolica, con ampia variabilità fenotipica, causata dalla carenza dell’idrolasi lisosomiale alfa-glucosidasi (maltasi acida, GAA). La terapia enzimatica sostitutiva (ERT) con GAA umano ricombinante (rhGAA) è l’unico trattamento approvato per i pazienti con PD, ma la sua efficacia è variabile, in particolare sulla miopatia scheletrica. I nostri studi recenti condotti in vitro e in un modello animale della PD (Porto et al Mol Ther 2009; 17:964-71) hanno dimostrato che uno chaperone farmacologico, miglustat (NB-DNJ) aumenta l’attività della rhGAA. Obiettivo. Valutare se il trattamento combinato con ERT e NB-DNJ è più efficace della ERT nel correggere il difetto enzimatico in pazienti con PD. Pazienti. Sono stati arruolati 13 pazienti PD (range di età: 5-52 anni) con forme cliniche diverse: 1 infantile classica (CI), 2 infantile non classica (NCI) e 10 ad esordio tardivo (LO).

End-point primari. Aumento dell’attività ematica della GAA in tempi diversi dopo ERT da sola o in combinazione con NB-DNJ (80 mg/m2 circa la sera prima dell’infusione e 80-100 mg/m2 X3 il giorno dell’infusione); diminuzione dei livelli plasmatici di creatina chinasi (CK) prima e dopo l’inizio della terapia combinata.

Metodi. L’attività della GAA è stata dosata mediante spettrometria di massa in tandem su macchie di sangue secche prelevate 24 ore dopo la ERT (T1) e poi ogni 48 ore per 14 giorni fino alla successiva ERT. I campioni sono stati raccolti in 3 cicli di ERT senza NB-DNJ e 3 cicli con NB-DNJ. L’analisi statistica è stata effettuata coi test di Mann-Whitney e/o t di Student, se applicabile.

Risultati. I dati preliminari finora ottenuti dimostrano che in ciascun paziente l’ attività della GAA aumenta al T1 durante il trattamento combinato in confronto all’ attività con la sola ERT. Nei 13 pazienti l’aumento dell’attività varia tra 1,6 e 63,1 volte ed è statisticamente significativo (P< 0,05) in 11 pazienti (1CI, 1NCI e 9LO). L’attività media della GAA a T1 in tutta la popolazione dei pazienti è 6,9 volte maggiore durante la terapia combinata rispetto alla sola ERT (P<0,00001). I livelli plasmatici di CK sono risultati paragonabili tra i cicli con sola ERT e i cicli con il trattamento combinato.

Conclusioni. I risultati di questo studio, anche se ancora preliminari, indicano che l’approccio terapeutico combinato può aumentare in vivo l’attività della rhGAA; quindi un protocollo terapeutico basato su questo approccio si può tradurre in una correzione più efficace del difetto enzimatico nei pazienti con PD. I nostri dati sembrano particolarmente incoraggianti per i pazienti LO, in cui l’ERT mostra un’efficacia variabile e limitata sulla miopatia scheletrica. La stessa combinazione di ERT e specifici chaperone farmacologici potrebbe essere applicata ad altre malattie da accumulo lisosomiale, come la m. di Fabry (Porto et al, J Inherit Metab Dis 2012;.35:513-20).

ABSTRACT N. 86 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

CARRA SERENA GEP12008

Totale € Num Centri: 1

Durata (anni): 1

Anno d’inizio: 2012

D’Adamo Maria Cristina (2), Saredi Simona (1), Vasso Michele (3), Morandi Lucia (1), Gelfi Cecilia (3), Pessia Mauro (2), Mora Marina (1), Di Blasi Claudia (1) (1) Division of Neuromuscular Diseases and Neuroimmunology, Foundation, Neurological Institute C. Besta, Via Temolo 4, 20126 Milano, Tel. 02.23942625, Fax 02.23942619, E-mail: cdiblasi@istituto-besta.it (2) Section of Human Physiology, University of Perugia School of Medicine, Perugia (3) Department of Biomedical Sciences for Health, University of Milan, Segrate, Milan

50.000 Durata (anni): 1

50.000

VALUTAZIONE DEL RUOLO PATOGENETICO DI UNA MUTAZIONE MISSENSO IN UNA MIOPATIA BENIGNA AUTOSOMICA DOMINANTE CON IPERCKEMIA

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Telethon grant N.

GEP12074

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 85 Responsabile

DI BLASI CLAUDIA

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2012

CARATTERIZZAZIONE DELLA MUTAZIONE R7S DELLA PROTEINA HSPB3 E DI ALTRE DUE NUOVE MUTAZIONI TROVATE IN PAZIENTI AFFETTI DA MIOPATIA CONGENITA: COMPRENSIONE DEI MECCANISMI GENETICI E MOLECOLARI

Elevati livelli plasmatici di creatina chinasi (CK) sono indice di patologie neuromuscolari e spesso ne precedono l’espressione clinica.

Tuttavia, molti pazienti, pur presentando un innalzamento persistente dei valori di CK sono asintomatici o presentano una patologia con decorso benigno.

Alcuni casi con livelli di CK stabilmente e cronicamente elevati si associano a suscettibilità all’ipertermia maligna, una sindrome farmaco-genetica dei muscoli scheletrici che può causare morte a seguito di esposizione ad alcuni gas anestetici e a miorilassanti depolarizzanti. L’ipertermia maligna si trasmette con modalità autosomica dominante. Le alterazioni patofisiologiche di questa affezione consistono in un difetto nella regolazione del calcio mioplasmico.

Heldens Lonneke (1), Verbeek Dineke (2), Angelini Corrado (3), Boelens Wilbert (4), Tupler Rossella (5), Carra Serena (1) (1) Dipartimento di Scienze Biomediche, Metaboliche e Neuroscienze, Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia, via Giuseppe Campi, 287, 41125 Modena, Italia, Tel. +39.059.2055421 Fax +39.059.2055363 E-mail: serena.carra@unimore.it (2) Centro Medico Ospedaliero di Groningen, Università degli Studi di Gronin-

71

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

Recentemente, in 7 pazienti, provenienti da 3 famiglie italiane, con iperCKemia associata a miopatia benigna, lo studio della biopsia muscolare ha evidenziato lievi alterazioni patologiche e inclusi sarcoplasmatici positivi alla calsequestrina. La calsequestrina è parte di un complesso multiproteico responsabile dell’accumulo e del rilascio di calcio nelle fibre muscolari necessario per la contrazione. In questi pazienti, l’analisi del gene CASQ1, che codifica per la calsequestrina 1, ha evidenziato la presenza di una mutazione missenso in un aminoacido altamente conservato.

Nel muscolo striato sono espresse due isoforme di calsequestrina (1 e 2), codificate da due geni diversi e che presentano una diversa capacità di legare il calcio. Il muscolo scheletrico le esprime entrambe, mentre il muscolo cardiaco soltanto l’isoforma 2.

Mutazioni nel gene CASQ2 sono responsabili di aritmie ventricolari e causa di morte improvvisa. Ad oggi non sono state identificate mutazioni in CASQ1 nell’uomo; tuttavia, nel topo l’inattivazione genetica di CASQ1 aumenta la suscettibilità degli animali a sindromi ipermetaboliche in risposta a stress da calore o anestetici, simili a quelle dell’ipertemia maligna.

Mutazioni nel gene CASQ1 potrebbero interferire con il corretto meccanismo di accumulo e rilascio del calcio e determinare gravi alterazioni cellulari e delle proprietà contrattili.

Questo progetto si propone di verificare se la mutazione CASQ1 identificata nei nostri pazienti sia responsabile dell’iperCKemia e se possa causare l’ipertemia maligna.

Esperimenti preliminari di trasfezione cellulare utilizzando costrutti normali e mutati hanno evidenziato che la proteina mutata forma aggregati citoplasmatici anomali.

Ovociti di Xenopus laevis, un modello sperimentale utilizzato per lo studio del calcio, sono stati microiniettati con mRNA normale e mutato del gene CASQ1 per effettuare studi elettrofisiologici e di live imaging.

Studi di proteomica su estratti cellulari di pazienti e controlli, per la caratterizzazione della proteina mutata sono in corso, come pure l’analisi molecolare del gene CASQ1 in altri casi di iperCKemia familiare e in casi con suscettibilità all’ipertermia maligna.

queziamento di nuova generazione (Next-Generation Sequencing) e di integrare i risultati dell’analisi di linkage al sequenziamento dell’esoma. Tale analisi è attualmente in corso per tre soggetti della famiglia.

Una volta ottenute le sequenze dell’esoma, verrà utilizzata una procedura che consente di individuare e prioritizzare le varianti nucleotidiche con alta affidabilità, focalizzando lo studio nelle tre regioni di interesse. Le mutazioni con possibile effetto patogenetico saranno quindi ulteriormente validate verificandone la corretta segregazione nella famiglia ed escludendone la presenza in un campione di controlli appartenenti alla stessa popolazione. Infine, un campione di soggetti affetti da DM ad eziologia sconosciuta è già disponibile per uno screening di mutazioni nel nuovo gene candidato.

ABSTRACT N. 88 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

GEP12083 43.000

Num Centri: 1

Durata (anni): 1

Durata (anni): 9

Anno d’inizio: 2009

Cassandrini Denise (1), Berardinelli Angela (2), Bertini Enrico (3), Comi Giacomo P. (4), Mercuri Eugenio (5), Mongini Tiziana (6), Nigro Vincenzo (7), Pegoraro Elena (8), Toscano Antonio (9), Mora Marina (10), Morandi Lucia (10), Battini Roberta (1), D’Amico Adele (3), Fattori Fabiana (3), Magri Francesca (4), Pane Marika (5), Codemo Valentina (8), Messina Sonia (9), Santorelli Filippo M. (1), Bruno Claudio (11) (1) U.O. Medicina Molecolare, IRCCS Fondazione Stella Maris, Calambrone, Pisa, Italy (2) Dipartimento di Neuropsichiatria Infantile, IRCCS Fondazione Mondino, Pavia, Italy (3) U.O. Medicina Molecolare, IRCCS Ospedale Bambino Gesù, Roma, Italy (4) Dipartimento di Scienze Neurologiche, Fondazione Cà Granda, Univ. degli Studi di Milano, Milano, Italy (5) Dipartimento di Neuropsichiatria Infantile, Policlinico A. Gemelli, Univ. Cattolica Sacro Cuore, Roma, Italy (6) Dipartimento di Neuroscienze, Univ. degli Studi di Torino, Torino, Italy (7) Centro Interdipartimentale di Ricerca, Seconda Univ. degli Studi di Napoli, Napoli, Italy (8) Dipartimento di Neuroscienze, Univ. degli Studi di Padova, Padova, Italy (9) Dipartimento di Neuroscienze, Univ. degli Studi di Messina, Messina, Italy (10) U.O. Malattie Neuromuscolari, IRCCS Istituto C. Besta, Milano, Italy (11) U.O. Neurologia Pediatrica e Malattie Muscolari, IRCCS Istituto Giannina Gaslini, Largo G. Gaslini 5, 16147 Genova, Italy, Tel. +39.010.5636756, Fax +39.010.3538265, E-mail: claudiobruno@ospedale-gaslini.ge.it

VAZZA GIOVANNI

Totale €

169.000

CARATTERIZZAZIONE CLINICA, MORFOLOGICA E MOLECOLARE DI PAZIENTI ITALIANI CON MIOPATIA CONGENITA

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Telethon grant N.

GUP08005

Totale € Num Centri: 9

ABSTRACT N. 87 Responsabile

BRUNO CLAUDIO

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2012

IDENTIFICAZIONE DEL GENE RESPONSABILE DI UNA NUOVA FORMA DI MIOPATIA DISTALE Boaretto Francesca (1), Salvoro Cecilia (1), Pegoraro Elena (2), Mostacciuolo Maria Luisa (1), Giovanni Vazza (1) (1) Dipartimento di Biologia, Università di Padova - Via G. Colombo 3, 35131, Padova; Tel. 049.8276226, Fax 049.8276209, E-mail: giovanni.vazza@unipd.it (2) Dipartimento di Neuroscienze, Università di Padova

Le miopatie congenite rappresentano un gruppo di malattie neuromuscolari che colpiscono primitivamente il muscolo scheletrico, e che vengono classicamente distinte sulla base di specifiche caratteristiche morfologiche alla biopsia muscolare. I recenti progressi nel campo della genetica molecolare hanno portato all’identificazione di nuove correlazioni tra la genetica e la morfologia, aumentando il numero di entità nosografiche e fornendo nuovi spunti di patogenesi. Tuttavia, molte miopatie congenite presentano un’ampia eterogeneità clinica e spesso non è possibile definire una precisa correlazione genotipo-fenotipo con importanti implicazioni per la prognosi clinica. Inoltre in molti pazienti non si riesce a giungere ad una definizione genetica ed è verosimile che altri geni non noti siano responsabili di queste forme.

Questo progetto multicentrico è basato sulla collaborazione di 9 centri di eccellenza italiani specializzati nelle malattie neuromuscolari allo scopo di raccogliere il maggior numero di pazienti con miopatia congenita e classificare le loro caratteristiche cliniche, morfologiche e genetiche.

Nel primo anno sono stati selezionati un totale di 275 pazienti e revisionate le caratteristiche cliniche e morfologiche. I pazienti sono stati classificati sulla base degli aspetti istopatologici, secondo quanto proposto da North (Neuromuscul Disord 2008; 18:433-442) nei seguenti 4 sottogruppi: Miopatia Nemalinica (MN) (52 pazienti, 19%), Miopatia con cores (MC) (133 pazienti, 48%), Miopatia con nuclei centrali (MCN) (33 pazienti, 12%), and Miopatia con di sproporzione di fibre (CFTD) (57 pazienti, 20%).

Negli anni successivi sono stati analizzati tramite sequenziamento di Sanger in maniera estensiva tutti i geni allora noti responsabili di queste forme : ACTA1, TPM2, TPM3, NEB1, RYR1, SEPN1, MTM1, DNM2, MYH2, MYH7. La scelta dell’analisi genetica più appropriata è stata basata sulla frequenza relativa del gene nei determinati sotto-

Le miopatie distali (DM) sono un gruppo di malattie genetiche, caratterizzate da atrofia e debolezza muscolare che colpiscono progressivamente i muscoli volontari degli arti superiori ed inferiori.

Sulla base di studi clinici e molecolari, le miopatie distali sono oggi distinte in più di 20 varianti e per 14 di esse si conosce già il gene responsabile.

Il presente progetto si inserisce in tale contesto e ha come obiettivo finale l’identificazione di un nuovo gene associato ad una forma di miopatia distale ad esordio precoce che colpisce principalmente i muscoli delle mani. Tale forma è stata clinicamente caratterizzata in una famiglia italiana in cui segrega secondo una modalità autosomica dominante.

In uno studio preliminare sono stati presi in considerazione i geni e i loci noti associati a forme di DM clinicamente simili a quella riportata nella famiglia oggetto di studio. Attraverso sequenziamento diretto sono state pertanto escluse mutazioni nei geni KLHL9 (MIM 611201) e Cav3 (MIM 601253), mentre i loci e/o geni responsabili delle forme di Welander (MIM 604454), MYH7 (MIM160500), Myotilin (MIM609200), Matrin 3 (MIM606070) e Filamin C (MIM614065) sono stati esclusi mediante analisi di linkage.

Utilizzando la genotipizzazione di SNP ad alta densità si è quindi proceduto all’analisi di linkage su tutto il genoma identificando tre regioni associate alla malattia nei cromosomi 1, 3 e 17. Nessuna di queste regioni si sovrappone a geni e/o loci responsabili di miopatie distali o altre patologie muscolari supportando di fatto l’esistenza di un nuovo gene-malattia per la DM. Nel loro complesso le tre regioni cromosomiche si estendono per oltre 9 megabasi e contengono più di 150 geni noti.

Al fine di raggiungere l’obiettivo finale, si è deciso di impiegare il se-

72

PROGETTI DI RICERCA TElEThOn

gruppi di miopatie congenite. I pazienti sono stati anche sottoposti a risonanza magnetica muscolare degli arti inferiori.

Dei 52 pazienti con nM, 12 avevano mutazioni in ACTA1, mentre non son ostate identificate mutazioni nei geni TPM2 e TPM3. Mutazioni del gene nEB1 sono state ritrovate in 7 degli 8 pazienti analizzati. lo studio di questo gene è ancora in corso. nel gruppo di 133 pazienti con MC, 58 avevano mutazioni in RYR1, e 5 in SEPn1 (Cagliani et al, J neurol Sci 2011). Per quanto riguarda le mutazioni in RYR1, le forme recessive erano frequenti quanto le dominanti. le mutazioni recessive si trovano distribuite per tutto il gene e solo 2/3 nelle regioni hot-spot, mentre l’84% delle varianti dominanti sono tipiche mutazioni missenso delle regioni hot-spot. nei 33 pazienti con MCn, sono stati identificate 9 mutazioni della MTM1 e 10 mutazioni della DnM1 (Catteruccia et al, neuromuscul Disord, in press). Infine nei 57 pazienti con CFTD sono state identificate solo quattro casi mutati (1 in ACTA1, 2 in TPM3, and 1 in TPM3). la di sproporzione di fibre è una caratteristica comune a molte miopatie e questo può spiegare la bassa percentuale di casi mutati in questo sottogruppo.

In conclusione, abbiamo estensivamente studiato una ampia casistica di pazienti italiani con miopatia congenita ed abbiamo confermato che mutazioni del gene RYR1 sono le cause più comuni di queste patologie in Italia (Bruno et al. Acta Myologica 2012). la detection rate globale di questo studio è risultata essere del 41%, circa. E’ possibile che nuovi geni possano essere responsabili di queste forme ed a tale scopo studi di sequenziamento di nuova generazione sono in corso nei casi non diagnosticati.

Abbiamo inoltre potuto verificare un’alta variabilità delle presentazioni cliniche, delle modalità di trasmissione e delle caratteristiche istopatologiche. la RMn muscolare è risultata essere uno strumento utile nell’indicare la corretta analisi genetica.

Infine sono in corso specifiche elaborazioni dei dati per stabilire se le informazioni estrapolate dai risultati individuali possano essere utilizzate per facilitare l’approccio diagnostico e la selezione dei principali geni da analizzare.

malattia, che è peggiorata anche dall’eccesso di stress ossidativo e di accumulo mitocondriale di Ca2+. Valuteremo l’efficacia di derivati non immunosoppressori della ciclosporina A che sono attivi sia nel modello murino che nelle cellule dei pazienti, nonchè di nuovi trattamenti basati sui bersagli descritti sopra (PTP, MAO, omeostasi del Ca2+, autofagia). I risultati attesi sono la definizione e la validazione di una terapia combinatoria efficace nel trattamento delle distrofie muscolari del ColVI.

ABSTRACT N. 90 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie neuromuscolari Responsabile

77.300 Durata (anni): 2

Anno d’inizio: 2012

LA DIETA IPOPROTEICA PER CORREGGERE IL DIFETTO AUTOFAGICO NEI PAZIENTI CON MIOPATIE DA DEFICIT DI COLLAGENO TIPO VI Battistini nino Carlo (2), Bernardi Paolo (3), Bonaldo Paolo (4), Cocchi Daniela (5), Ripamonti Claudio (6), Sabatelli Patrizia (8), Ferlini Alessandra (7), Merlini luciano (1) (1) laboratorio di Biologia Cellulare Muscoloscheletrica, Istituto Ortopedico Rizzoli, via di Barbiano 1/10, 40136 Bologna, Tel. 051.6366779, Fax 051.583593, E-mail: luciano.merlini@ior.it (2) Cattedra di Scienze Tecniche Dietetiche Applicate, Università di Modena (3) Dipartimento di Scienze Biomediche Sperimentali, Università di Padova (4) Dipartimento di Istologia, Microbiologia e Biotecnologie Mediche, Università di Padova (5) Dipartimento di Scienze Statistiche Paolo Fortunati, Università di Bologna (6) Medicina, Istituto Ortopedico Rizzoli, Bologna (7) Dipartimento di Medicina Sperimentale e Diagnostica, Genetica Medica, Università di Ferrara (8) CnR, Istituto di Genetica Molecolare-IOR, Bologna

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie neuromuscolari BERNARDI PAOLO

Telethon grant N.

GGP11082

Totale €

730.000

Num Centri: 5

GUP11007

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 89 Responsabile

MERLINI LUCIANO

Telethon grant N.

Durata (anni): 1

lo studio comprende una fase di 3 mesi di osservazione sul decorso naturale, seguito da un trial clinico della durata di 12 mesi, in aperto, non-comparativo, a braccio singolo, di fase II, per valutare l’efficacia, la sicurezza e la tollerabilità di una dieta a basso contenuto proteico (lPD) in 8 pazienti adulti affetti da miopatia di Bethlem (BM) e da distrofia muscolare congenita di Ullrich (UCMD). lo studio è stato registrato: http://clinicaltrials.gov Identifier (nCT01438788) Risultati della fase di osservazione Abbiamo studiato la relazione tra la composizione corporea, la forza muscolare, la capacità di esercizio e la funzione polmonare in pazienti adulti affetti da miopatia di Bethlem (BM) e da distrofia muscolare congenita di Ullrich (UCMD) da mutazioni del collagene di tipo VI (COl6). la massa magra (MM) e la percentuale di massa grassa (% MG) sono state valutate mediante densitometria Dexa, la forza muscolare isometrica con un dinamometro, la capacità di esercizio in base alla distanza percorsa in 6 minuti (6MWD) e la funzione polmonare con uno spirometro. nonostante un indice di massa corporea inferiore a 30 (media + / - SD: 22,9 + / - 3,7%) i pazienti hanno mostrato un marcato aumento di massa grassa (media + / SD: 45,3 + / - 12,6%). la forza muscolare è risultata diffusamente ridotta in particolare la flessione del gomito (media + / - SD: 63 + / - 12 n) e l’estensione del ginocchio (media + / - SD: 98 + / - 22 n).

C’era una buona correlazione tra la forza muscolare e la massa magra (r = 0,84), FVC% (r = 0.78), e la 6MWD (r = 0,74). non c’era però alcuna correlazione tra indice di massa corporea (IBM) e forza muscolare (r = -0,03), 6MWD (r = -0,10), o FVC% (-0,002). Una buona correlazione era evidente tra 6MWD e FVC% (r = 0,73).

Conclusioni: i) i pazienti COl6 hanno una massa elevata di grasso nonostante il loro IBM sia normale. ii) la quantità di massa magra correla positivamente con la forza muscolare residua, la capacità di esercizio e la funzione polmonare.

Abbiamo confrontato la capacità di 2 metodiche non invasive, analisi di impedenza bioelettrica (BIA) e misura dello spessore della plica cutanea (ST), di valutare la composizione corporea in 7 pazienti adulti affetti da BM. Abbiamo valutato la massa magra (MM) e la percentuale di massa grassa (% MG) con BIA, ST e il metodo di riferimento cioè la Dexa. Quando confrontate con la Dexa (media + / - SD: 34.2 + / - 8.6), le misurazioni ST (46,8 + / - 8,3 kg) e BIA (43,5 + / - 8,6 kg) sovrastimano in modo significativo (p <0.0001) la MM e di conseguenza sottostimano la percentuale di massa grassa (ST: 27,0 + / - 6,3%; BIA: 31,8 + / - 11,5%; Dexa: 44,1 + / 13,2%). In conclusione con la Dexa, il metodo standard di riferi-

Anno d’inizio: 2011

VERSO UNA TERAPIA MITOCONDRIALE DELLE DISTROFIE MUSCOLARI DEL COLLAGENE VI Bonaldo Paolo (1), Rizzuto Rosario (1), Maraldi nadir M (2,3), Gelfi Cecilia (4), Argenton Francesco (5), Di lisa Fabio (1), Merlini luciano (3), Reggiani Carlo (1), Sabatelli Patrizia (3), Bernardi Paolo (1) (1) Dipartimento di Scienze Biomediche, Università di Padova, Viale Giuseppe Colombo 3, 35131 Padova, Tel. 049.8276365, Fax 049.8276361, E-mail: bernardi@bio.unipd.it (2) Dipartimento di Scienze Anatomiche, Università di Bologna (3) laboratorio di Biologia Cellulare Muscoloscheletrica, Istituto Ortopedico Rizzoli, Bologna (4) Dipartimento di Bioimmagini e Fisiologia Molecolare, Consiglio nazionale delle Ricerche, Milano (5) Dipartimento di Biologia, Università di Padova

Obiettivo di questo programma è ottenere una comprensione dettagliata dei meccanismi alla base della patogenesi delle distrofie muscolari del collagene (Col) VI, con particolare riguardo al ruolo della disfunzione mitocondriale. Il nostro scopo è tradurre i progressi fatti nei modelli animali in trattamenti efficaci per l’uomo. Scopi specifici sono (i) stabilire il ruolo relativo dell’attivazione delle monoamino ossidasi (MAO), della deregolazione del Ca2+ e della clearance difettiva degli organuli nel causare e/o amplificare la disfunzione mitocondriale attraverso il poro di transizione della permeabilità (PTP) e le conseguenze sul metabolismo energetico; (ii) identificare i meccanismi adattativi che portano all’attenuazione spontanea della disfunzione mitocondriale durante la coltura in vitro di cellule derivate dal muscolo dei pazienti; (iii) definire le basi molecolari della compromessa rigenerazione/differenziazione e il relativo contributo alla patogenesi delle malattie del ColVI; (iv) sviluppare una terapia combinatoria mirata a questi bersagli multipli in modelli preclinici di malattie del ColVI. la logica di questo programma poggia sulle nostre scoperte che (i) la disfunzione mitocondriale mediata da apertura inappropriata del PTP svolge un ruolo chiave nelle miopatie del ColVI e i topi Col6a1-/- vengono curati dalla ciclosporina A, che ha dato anche risultati incoraggianti in uno studio clinico pilota; e che (ii) la compromessa rimozione dei mitocondri difettosi amplifica la

73

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

ABSTRACT N. 92

mento, tutti i pazienti risultavano obesi, mentre l’indice di massa corporea risultava inferiore a 30 in tutti i pazienti e le misure ST definivano obesi solo 2 e quelle BIA solo 3 pazienti.

Conclusione: Le stime della composizione corporea di ST e BIA non sono in grado di individuare l’accumulo di grasso nei pazienti con BM. I leucociti dei pazienti sono stati isolati da campioni di sangue raccolti al giorno -85, -45 e 1. I valori di Beclin1, BNIP3 e LC3-II erano in un range di normalità con una variabilità minima inter e intra-individuale (rispetto ai 5 soggetti sani, 21-52 anni), solo in un paziente BM abbiamo trovato una lieve riduzione di LC3 II lipidato.

L’analisi dei marcatori di autofagia nelle biopsie muscolari dei pazienti ottenuti al giorno 1, è in corso. Le colture di mioblasti, fibroblasti cutanei e di melanociti sono state allestite per gli studi biochimici, morfologici e funzionali.

Aggiornamento dello studio pilota LPD Novembre 2011 - febbraio 2012: reclutamento degli 8 pazienti che sono entrati nella fase di osservazione.

Febbraio - aprile 2012: terminata la fase di osservazione gli 8 pazienti sono stati arruolati nel trial con LPD.

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

GEP12066 49.500

Num Centri: 1

Durata (anni): 1

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2008

Michelucci Antonio (1), Paolini Cecilia (1), Pietrangelo Laura (1), Dirksen Robert T. (2), Reggiani Carlo (3), Protasi Feliciano (1) (1) CeSI - Centro Scienze dell’Invecchiamento & DNI - Dipartimento di Neuroscienze ed Imaging; Università G. d’Annunzio, via Colle dall’Ara, 66100, Chieti, Italy, Tel. 0871.541423; Fax 0871.541422, E-mail: fprotasi@unich.it (2) Department of Pharmacology and Physiology, University of Rochester Medical Center, NY, USA (3) Dipartimento di Anatomia e Fisiologia, Università di Padova

Introduzione. Ad oggi, l’Ipertermia Maligna (IM) è considerata solo come una sindrome clinica nella quale individui geneticamente predisposti rispondono ad alcuni anestetici con attacchi potenzialmente letali caratterizzati da aumento della temperatura corporea e da miolisi delle fibre scheletriche. Tuttavia, episodi simili - conosciuti come colpi di calore (CC) - sono anche stati descritti in individui esposti ad elevate temperature e/o a esercizio strenuo. Sono ancora molti gli aspetti che devono essere ancora però chiariti: a) non tutti i casi di IM sono legati a mutazioni nel RYR1, il canale di rilascio del Ca2+ del muscolo, un fatto che presuppone il coinvolgimento di altri geni; b) la relazione fra i casi di IM e alcuni CC non è ancora ampiamente riconosciuta; c) i meccanismi molecolari che portano a miolisi delle fibre scheletriche non sono chiari.

Risultati. Grazie al supporto di Telethon, nei passati anni abbiamo dimostrato in modelli animali che: a) sia episodi di IM che CC possono risultare non solo da mutazioni nel RYR1, ma anche da mutazioni in proteine che lo regolano, come la calsequestrina-1 (CASQ1); b) i meccanismi molecolari alla base degli episodi scatenati da anestetici e da calore sono identici e coinvolgono: i) perdita di Ca2+ attraverso RYR1 causata da eccessivo stress ossidativo, ii) svuotamento delle riserve di Ca2+ intracellulare, ed infine iii) ingresso massivo di Ca2+ dall’ambiente extracellulare. Per verificare la nostra ipotesi, abbiamo trattato topi CASQ1-knockout (suscettibili sia a IM che a CC) con N-acetilcisteina (NAC, un potente antiossidante) riducendo in maniera molto significativa il tasso di mortalità in seguito ad esposizione ad alotano (2%, 1h a 32°C) e calore (1h a 41°C): 78.6 vs 25.0% e 85.7 vs 30.0% rispettivamente in controlli e trattati. Tale protezione è verosimilmente dovuta alla diminuzione di: a) stress ossidativo, come mostrato dalla ridotta produzione di ione super-ossido a livello mitocondriale (P<0.05); b) temperatura interna durante i protocolli di stress (42.1 vs 40.8 °C); c) numero di fibre che vanno in contro a miolisi (37.6 vs 11.6 %). Inoltre, il trattamento con NAC ha anche ridotto la suscettibilità delle fibre a contratture indotte da caffeina, un protocollo di diagnosi per l’IM. Questi risultati indicano che gli agenti antiossidanti dovrebbero essere presi in considerazione per la prevenzione/trattamento di tali sindromi nell’uomo.

Prospettive. Considerata l’elevata incidenza e la natura potenzialmente letale di queste crisi, esiste una forte necessità di sviluppare nuovi trattamenti. Grazie a Telethon, stiamo facendo notevoli passi avanti nell’identificazione dei meccanismi molecolari alla base della miolisi delle fibre scheletriche. Il principale obbiettivo è ora quello di sviluppare/testare nuovi farmaci capaci di controllare/bloccare tali meccanismi per prevenire le crisi indotte sia da anestetici, che da temperatura o esercizio strenuo.

SZABADKAI GYORGY

Totale €

484.900

LE CALSEQUESTRINE NELL’OMEOSTASI DEL CALCIO E LORO POTENZIALE RUOLO IN MIOPATIE SCHELETRICHE UMANE EREDITARIE

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Telethon grant N.

GGP08153

Totale € Num Centri: 3

ABSTRACT N. 91 Responsabile

PROTASI FELICIANO

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2012

IL RUOLO DEL SEGNALE DI CALCIO NUCLEARE INDOTTO DAL INOSITOLO 1,4,5-TRISFOSAFATO NELLO SVILUPPO DELLA MIOPATIA CONGENITA ‘CENTRAL CORE’ Szabadkai Gyorgy, Suman Matteo Dipartimento di Scienze Biomediche, Complesso Interdipartimentale Vallisneri, Universita degli Studi di Padova, Viale Colombo, 3 - Via Marzolo, 3 35131 Padova, Italy, Tel. +39.049.8276047; E-mail: gyorgy.szabadkai@unipd.it

La maggior parte delle patologie muscolari sono causate da alterazioni nell’omeostasi intracellulare del calcio. Questo fenomeno è particolarmente evidente nelle miopatie con alterazione centrale della fibra (core myopathies), come la Central Core Disease (CCD) e la Multi Minicore Disease (MmD), entrambe dovute a mutazioni nei recettori rianodinici dei canali rilascianti calcio. Tuttavia, numerose evidenze sperimentali indicano che stimoli di tipo depolarizzante inducono nelle fibre muscolari due vie del segnale del calcio tra loro diverse ed indipendenti: una via del segnale “rapida”, associata all’accoppiamento eccitazione-contrazione (EC), ed una via del segnale “lenta”, la quale insorge principalmente nel nucleo e comporta una regolazione di tipo genomico. Mentre il ruolo delle mutazioni RyR1, che determinano un malfunzionamento dell’accoppiamento EC, è stato accuratamente approfondito, poco si conosce sulle funzioni che ricoprono in queste malattie le vie di segnale nucleari calcio-dipendenti.

In un lavoro recente abbiamo analizzato e descritto in tubuli-T di cardiomiociti un complesso di vie di segnalazione intracellulare (responsabile del controllo locale della trascrizione genica mediata dal calcio) composto da recettori della membrana plasmatica accoppiati alla produzione di 1,4,5 inositolo-tri-fosfato (IP3), a loro volta associati a recettori nucleari per l’IP3 (IP3R). In aggiunta, i nostri dati preliminari indicano che la distribuzione cellulare e l’espressione degli IP3R viene alterata in modelli animali e cellulari che presentano la CCD. Basandoci su queste premesse, vogliamo ipotizzare che (i) come nel muscolo cardiaco, a livello del nucleo il controllo locale dei segnali calcio mediato dagli IP3R controlla l’espressione genica anche nel muscolo scheletrico, ma soprattutto che (ii) il prodotto fenotipico della CCD può risultare da un malfunzionamento della vie del segnale calcio mediate dagli IP3R con conseguenti alterazioni nell’espressione genica.

In questo lavoro esporremo i primi dati raccolti allo scopo di caratterizzare morfologicamente e fisiologicamente il sistema che genera la via del segnale nucleare IP3/Ca2+ all’interfaccia tra i tubuli T e la membrana nucleare. Abbiamo utilizzato a tale proposito tre approcci differenti: imaging cellulare, genetica e biologia molecolare. Il nostro obbiettivo finale è determinare il ruolo ricoperto dal signalling mediato dell’IP3 nella regolazione trascrizionale in muscoli normali ed affetti da CCD, con lo scopo di poter svelare nuove modalità di trattamento alla malattia.

ABSTRACT N. 93 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

PENNUTO MARIA

Telethon grant N.

GGP10037

Totale €

190.300

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2010

INTERAZIONE GENETICA TRA IL SEGNALE INNESCATO DAL FATTORE DI CRESCITA INSULINO-SIMILE 1 E GLI ANDROGENI NELLA PATOGENESI DELLA ATROFIA MUSCOLARE SPINALE E BULBARE

74

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

Scaramuzzino Chiara (1), Milioto Carmelo (1), Casci Ian (2), Fackelmeyer Frank (3), Pandey Udai (2)

peutica per la SMARD1. Abbiamo generato linee cellulari iPSC da fibroblasti ottenuti da soggetti sani utilizzando un metodo non virale basato su vettori episomiali non integranti. Le iPSC sono state differenziate in cellule staminali neuronali e motoneuroni che sono stati caratterizati dal punto di vista morfologico, funzionale e mediante analisi di espressione genica e proteica. Abbiamo quindi trapiantato i motoneuroni derivati dalle iPSC nel midollo spinale di modelli murini SMARD1. Abbiamo determinato la sopravvivenza e il fenotipo delle cellule donatrici. Mediante analisi istologica con microscopia conofocale, abbiamo identificato i motoneuroni di origine umana integrati nelle corna anteriori degli animali trapiantati. Queste cellule presentavano un fenotipo motoneuronale appropriato con espressione di marcatori specifici tra cui Hb9 e ChAT. Abbiamo inoltre dimostrato che il trapianto cellulare migliora significativamente il fenotipo degli animali SMARD1 sia dal punto di vista neuromuscolare che di sopravvivenza. Il nostro obbiettivo è di approfondire lo studio dei meccanismi molecolari responsabili dell’osservato miglioramento. Questo studio ha dimostrato la possibilità di utilizzare motoneuroni derivati da iPSC umane come strumento terapeutico contribuendo allo sviluppo di una terapia cellulo-mediata efficace per la terapia della SMARD1 e di altre malattie del motoneurone.

(1) Department of Neuroscience and Brain Technologies, Istituto Italiano di Tecnologia, Via Morego 30, 16163 Genoa, Italy, Tel. +39.010.71781793, Fax +39.010.71781230 (2) Department of Genetics, Louisiana State University Health Sciences Center, New Orleans, LA, USA (3) Biomedical Research Institute (BRI-FORTH), Ioannina, Greece

La atrofia muscolare spinale e bulbare (SBMA), nota anche come malattia di Kennedy, é una malattia neuromuscolare ereditata geneticamente. La malattia é causata da una mutazione nel gene che esprime il recettore degli androgeni. La malattia SBMA é caratterizzata dalla perdita di motoneuroni dal midollo spinale e midollo allungato e da debolezza, fascicolazioni e atrofia muscolare. Il recettore lega il testosterone, e ciò innesca la malattia poiché il testosterone induce dei cambiamenti nel recettore che lo rendono tossico. Il nostro obiettivo a lungo termine é capire qual é il meccanismo attraverso cui il testosterone converte il recettore in una molecola nociva.

Noi abbiamo mostrato precedentemente che la fosforilazione (aggiunta di gruppi -PO3) del recettore mutato ad opera della proteina cinasi AKT blocca il legame al testosterone. Cio` risulta in una ridotta localizzazione nucleare, nel ridotto accumulo della proteina e in una ridotta aggregazione. Inoltre, abbiamo mostrato che il fattore di crescita insulino-simile 1 (IGF-1) attenua la progressione della malattia in topo con un meccanismo che coinvolge la modifica del recettore da parte di AKT. E` importante sottolineare che abbiamo espresso il fattore di crescita solo nel muscolo, dimostrando che é possible agire sul muscolo per migliorare la progressione della malattia in topo. Ora vogliamo investigare come tale modifica del recettore viene regolata all’interno della cellula. La nostra ipotesi e` che tale modifica sia influenzata da diversi fattori. Abbiamo dati preliminari che mostrano che il recettore é influenzato da modifiche quali metilazione (aggiunta del gruppo -CH3), e che queste modifiche sono correlate alla fosforilazione del recettore ad opera di AKT. Noi abbiamo ottenuto dati in supporto all’idea secondo cui una particolare classe di enzimi, noti come trasferitori di gruppi -CH3, possa giocare un ruolo fondamentale nello sviluppo e nel decorso della malattia. Noi mostriamo che il recettore mutato interagisce selettivamente con alcuni membri di questa classe di enzimi, e che tale interazione modifica la funzione del recettore. Inoltre, i nostri dati supportano l’idea secondo cui tali enzimi modifichino la funzione del recettore attraverso la modifica del sito riconosciuto dalla cinasi AKT. Cio` ci porta a sostenere che tale interazione tra enzima e recettore mutato abbia ripercussione sulla fosforilazione e quindi sulla tossicita` della proteina mutata stessa.

ABSTRACT N. 95 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

GGP10062 399.200

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2009

Simone Chiara (1), Nizzardo Monica (1), Ronchi Dario (1), Salani Sabrina (1), Riboldi Giulietta (1), Magri Francesca (1,2), Faravelli Irene (1), Zanetta Chiara (1), Menozzi Giorgia (2), Bonaglia Chiara (2), Bresolin Nereo (1,2), Comi Giacomo (1), Corti Stefania (1) (1) Dino Ferrari Centre, Neuroscience Section, Department of Pathophysiology and Transplantation (DEPT), University of Milan, Neurology Unit, IRCCS Foundation Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico, 20122 Milan, Italy, Tel. 39.02.5503807, Fax +39.02.55033800; E-mail: stefania.corti@unimi.it (2) IRCCS E. Medea La Nostra Famiglia, Bosisio Parini, LC

L’Atrofia Muscolare Spinale (SMA) è una malattia del motoneurone causata da mutazioni nel gene SMN1. La SMA è una delle malattie neurologiche genetiche più frequenti e la prima causa genetica di morte in età infantile. Attualmente non esiste una terapia efficace per questa patologia.

In questo progetto abbiamo studiato il protenziale terapeutico di cellule staminali neuronali e motoneuroni derivate da cellule pluripotenti indotte umane (iPSC) come strumento terapeutico per la SMA. Inoltre, per utilizzare le cellule del paziente affetto da SMA in applicazioni terapeutiche è necessario che siano corrette ex-vivo.

Abbiamo quindi sviluppato un nuovo approccio di correzione genica basata sul genome editing. Abbiamo generato cellule iPSC da fibroblasti di pazienti SMA, soggetti eterozigoti e wild-type, utilizzando un metodo non virale. Le cellule sono state trasfettate mediante nucleofezione con vettori oriP/EBNA1 codificanti per sei fattori di riprogrammazione. Abbiamo utilizzato oligonucleotidi per indurre a livello genomico una transizione da T a C in posizione +6 dell’esone 7, in modo da convertire il gene SMN2 in un gene funzionalmente più simile a SMN1, nelle linee cellulari SMA-iPSCs. Le cellule iPSC SMA corrette non contenevano sequenze esogene ed erano indistinguibili dalle linee normali. Le iPSC dopo caratterizzazione sono state differenziate in senso neuronale e motoneuronale. I fenotipi delle cellule ottenute sono stati caratterizzati mediante analisi morfologica, di espressione genica e proteica. I motoneuroni derivati da iPSC (SMA, WT e cellule SMA corrette), dopo procedura di selezione, sono stati trapiantati nei midolli spinali degli animali SMA. I motoneuroni derivati da iPSC-SMA presentavano sia in vitro che in vivo aspetti caratteristici della malattia, tra cui riduzione della sopravvivenza, dimensioni dei corpi cellulari e lunghezza assonale diminuita, mentre le cellule geneticamente corrette presentavano un fenotipo simile al wild-type. Abbiamo inoltre dimostrato che anche i profili di espressione genica e di splicing, determinati mediante analisi microarray, dopo la correzione genica sono risultati più simili al normale. Il trapianto dei motoneuroni wild-type e SMA corretti ha migliorato il fenotipo degli animali trattati sia nella sopravvivenza (con un incremento >50%) e delle capacità neuromuscolare in modo significativamente superiore rispetto al trapianto delle cellule SMA e agli ani-

COMI GIACOMO PIETRO

Totale €

257.900

APPROCCIO NEUROPROTETTIVO MEDIATO DA CELLULE STAMINALI NEURONALI COME STRATEGIA TERAPEUTICA PER L’ATROFIA MUSCOLARE SPINALE

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Telethon grant N.

GGP09107

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 94 Responsabile

CORTI STEFANIA

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2010

SVILUPPO DI UN APPROCCIO TERAPEUTICO PER L’ATROFIA MUSCOLARE SPINALE CON DISTRESS RESPIRATORIO DI TIPO 1 (SMARD1) MEDIATO DA CELLULE STAMINALI NEURONALI E MOTONEURONI DIFFERENZIATI DA CELLULE STAMINALI PLURIPOTENTI INDOTTE Nizzardo Monica, Simone Chiara, Rizzo Federica, Ruggieri Margherita, Salani Sabrina, Brajkovic Simona, Bresolin Nereo, Corti Stefania, Comi Giacomo Dino Ferrari Centre, Neuroscience Section, Department of Pathophysiology and Transplantation (DEPT), University of Milan, Neurology Unit, IRCCS Foundation Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico, 20122 Milan, Italy, Tel. +39.02.55033817, Fax +39.02.55033800; E-mail:giacomo.comi@unimi.it

L’Atrofia Muscolare Spinale con Distress Respiratorio di tipo 1 (SMARD1) è una malattia del motoneurone ad esito fatale dell’età infantile. E’ causata da mutazioni nel gene IGHMBP. Attualmente non esistono terapie efficaci per questa patologia. Il nostro gruppo di ricerca ha precedentemente descritto come il trapianto di motoneuroni derivati da cellule staminali pluripotenti murine sia in grado di migliorare il fenotipo della malattia in un modello animale di SMARD1.

In questo progetto abbiamo analizzato il potenziale terapeutico del trapianto di cellule staminali neuronali e motoneuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane, quale strategia tera-

75

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

mali non trattati. Questi risultati dimostrano la possibilità di ottenere linee cellulari iPSC e motoneuroni paziente specifiche, geneticamente corrette, senza sequenze esogene, e il loro potenziale terapeutico per lo sviluppo di una cura per la SMA.

STRUMENTO PER L’IDENTIFICAZIONE DI BIOMARCATORI NELL’ATROFIA MUSCOLARE SPINALE Di Marcotullio Lucia (2), Bertini Enrico (3), Morandi Lucia (4), Baranello Giovanni (5), Mercuri Eugenio (6), Messina Sonia (7), Mora Marina (4), Di Pietro Lorena (1), Infante Paola (2), Moroni Isabella (5), D’Amico Davide (2), Gulino Alberto (2), D’Amico Adele (3), Abiusi Emanuela (1), Fiori Stefania (1), Neri Giovanni (1), Tiziano Francesco Danilo (1)

ABSTRACT N. 96 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

SETTE CLAUDIO

Telethon grant N.

GGP09154

Totale €

198.100

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

(1) Istituto di Genetica Medica, Università Cattolica, Roma - Largo Francesco Vito, 1 00168 Roma, Tel. 0630154606 Fax 0630157223; E-mail: fdtiziano@rm.unicatt.it (2) Dipartimento di Medicina Molecolare, Università Sapienza, Roma (3) Unità malattie neuromuscolari e neurodegenerative, Ospedale Bambin Gesù, Roma (4) Unità malattie neuromuscolari, Istituto C. Besta, Milano (5) Unità Neurologia dello Sviluppo, Istituto C. Besta, Milano (6) Unità di Neuropsichiatria Infantile, Università Cattolica, Roma (7) Dipartimento Neuroscienze, Università di Messina, Messina

Anno d’inizio: 2009

REGOLAZIONE DELLO SPLICING ALTERNATIVO DEL GENE SMN2 DA PARTE DI SAM68 E LE SUE IMPLICAZIONI NELL’ATROFIA MUSCOLARE SPINALE Pagliarini Vittoria (2), Bustamante Maria Blaire (1), Compagnucci Claudia (1,2), Sette Claudio (1,2)

L’atrofia muscolare spinale (SMA) è una condizione neuromuscolare autosomica recessive, causata da mutazioni del gene SMN1 (Lefebvre S. et al., 1995) e caratterizzata da atrofia muscolare dovuta a degenerazione degli alfa-motoneuroni del midollo spinale. Tuttavia, diverse linee di evidenza sperimentali supportano il ruolo patogenetico del muscolo scheletrico nella SMA (Guettier-Sigrist et al., 2001; Cifuentes-Diaz et al., 2001; Walker et al., 2008; Martinez-Hernandez et al, 2009; Mutsaers et al., 2011).

Al momento non vi sono cure per la SMA. Diversi approcci terapeutici passeranno a breve alla sperimentazione umana: mentre sono state sviluppate e validate misure di outcome clinico adeguate alla valutazione dei pazienti arruolati nei trial clinici, non vi sono ad oggi biomarcatori affidabili per la condizione.

L’obiettivo principale del presente progetto è di identificare e validare biomarcatori ad RNA per la SMA, indipendenti dai livelli di SMN. A questo scopo, confronteremo miRNoma e trascrittoma di biopsie/colture muscolari di pazienti e controlli per identificare RNA espressi in maniera differenziale. I trascritti identificati saranno quantificati in campioni di siero (miRNA) e sangue (mRNA) di 60 pazienti affetti da SMA I-III, ed un numero simile di controlli agematched. I livelli di RNA saranno correlate con la performance motoria dei pazienti, valutata mediante misure di outcome validate, selezionate sulla base dell’età e della gravità dei pazienti. Ad oggi, abbiamo effettuato l’analisi del miRNoma di 10 colture di mioblasti (5 pazienti e 5 controlli) e stiamo attualmente validando i risultati mediante PCR realtime. Abbiamo identificato circa 30 miRNA regolati in maniera differenziale tre le colture di pazienti e controlli.

Questo progetto ha forti implicazioni traslazionali potenziali, poiché potrebbe portare alla rapida identificazione e validazione di biomarcatori prognostici e farmacodinamici per la SMA, utilizzabili sia per studi clinici che pre-clinici.

(1) Dipartimento di Biomedicina e Prevenzione, Università di Roma Tor Vergata - Via Montpellier, 1, 00133 Roma Tel. 06-72596260 Fax 06-72596268 (2) Laboratorio di Neuroembriologia, IRCSS Fondazione Santa Lucia, Roma

L’Atrofia Muscolare Spinale (SMA) è la causa genetica primaria di mortalità infantile. Tale patologia è determinata da mutazioni che portano alla perdita di funzione del gene SMN1, causando la perdita della proteina Survival Motor Neuron (SMN) e la degenerazione degli alfa-motoneuroni nel midollo spinale. SMN2, un gene quasi identico a SMN1 presente nell’uomo, codifica una proteina SMN tronca ed instabile, a causa dell’esclusione dell’esone 7 durante il processamento del pre-mRNA. Tuttavia, la presenza di almeno una copia del gene SMN2 nei pazienti SMA offre l’opportunità di promuovere l’integrazione dell’esone 7 e l’espressione della proteina funzionale SMN e di migliorare i sintomi della malattia. Abbiamo precedentemente identificato la proteina di legame all’RNA Sam68, quale regolatore dell’esclusione dell’esone 7 del gene SMN2, ed abbiamo dimostrato che l’inibizione della sua attività porta all’inclusione dell’esone 7 e all’espressione della proteina SMN in fibroblasti SMA. Al momento stiamo testando il ruolo di Sam68 in questo evento di splicing anche in un contesto neuronale, di maggiore rilevanza per la patologia. In particolare, abbiamo eseguito questi studi in cellule neurali staminali (Neural Stem Cells, NSCs). Innanzitutto, l’isolamento di NSCs da topi deficienti per Sam68 ha mostrato che la deplezione di questo gene non interferisce con la capacità delle NSCs di generare neuroni, suggerendo che l’assenza di Sam68 non altera la neurogenesi. Inoltre la deplezione di Sam68 aumenta il differenziamento e la maturazione neuronale. Sono state poi generate NSCs anche da embrioni murini SMA I e di controllo ed è stato analizzato lo splicing del gene SMN2 dopo l’infezione con una proteina mutante che agisce da dominante-negativo di Sam68. Abbiamo osservato che la proteina mutante causa un’aumentata espressione dell’mRNA totale di SMN2, suggerendo che interferendo con la funzione di Sam68 è possibile recuperare lo splicing del gene SMN2 anche in un contesto neuronale. Come ulteriore approccio per correggere lo splicing di SMN2, abbiamo utilizzato inibitori HDAC, che possono portare ad un recupero parziale dell’espressione di SMN2 nei modelli murini SMA I. Dato che la modificazione epigenetica della cromatina è in grado di influenzare la regolazione dello splicing, abbiamo testato diversi inibitori di HDAC per la loro capacità di modulare lo splicing di SMN2. L’inibitore LBH589 è il più potente nell’indurre l’inclusione dell’esone 7 sia nei fibroblasti SMA umani che nelle NSCs SMA murine. Tuttavia, l’aumento di espressione di Sam68 reprime completamente l’effetto di LBH589 sullo splicing del gene SMN2, mentre l’espressione della proteina mutante di Sam68 potenzia tale effetto. Questo risultato suggerisce una correlazione tra l’acetilazione istonica e la funzione di Sam68. Inibire Sam68 in cellule SMA significherebbe potenziare gli approcci terapeutici per recuperare l’inclusione dell’esone 7 del gene SMN2 e l’espressione della proteina SMN.

ABSTRACT N. 98 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

GGP12116 313.400

Num Centri: 2

Durata (anni): 2

Durata (anni): 2

Anno d’inizio: 2011

Vita Giuseppe (1), Fabrizi Gian Maria (2), Gemignani Franco (3), Padua Luca (4), Pareyson Davide (5), Quattrone Aldo (6), Santoro Lucio (7), Schenone Angelo (8), Mazzeo Anna (1), Russo Massimo (1), Stancanelli Claudia (1), Gentile Luca (1), Cavallaro Tiziana (2), Vitetta Francesca (3), Contini Mara (3), Pazzaglia Costanza (4), Russo Giuseppina (4), Iacovelli Chiara (4), Piscosquito Giuseppe (5), Calabrese Daniela (5), Valentino Paola (6), Manganelli Fiore (7), Pisciotta Chiara (7), Monti Bragadin Margherita (8), Aiello Alessia (8), Bolla Simone (8) (1) Dipartimento di Neuroscienze, Università di Messina, Tel. 090.2212793; Fax 090.2212789; E-mail: vitag@unime.it (2) Dipartimento di Scienze Neurologiche, Neuropsicologiche, Morfologiche e Motorie, Università di Verona (3) Dipartimento di Neuroscienze, Università di Parma (4) Fondazione Don Carlo Gnocchi ONLUS, Milano (5) Fondazione I.R.C.C.S., Istituto Neurologico “Carlo Besta”, Milano (6) Dipartimento di Scienze Mediche, Università “Magna Graecia”, Catanzaro

TIZIANO FRANCESCO DANILO

Totale €

170.300

NUOVE MISURE DI OUTCOME NELLA MALATTIA DI CHARCOTMARIE-TOOTH

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Telethon grant N.

GUP10008

Totale € Num Centri: 8

ABSTRACT N. 97 Responsabile

VITA GIUSEPPE

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2012

ANALISI DI MIRNOMA E TRASCRITTOMA MUSCOLARI COME

76

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

(7) Dipartimento di Scienze Neurologiche, Università “Federico II”, Napoli (8) Dipartimento di Neuroscienze, Oftalmologia e Genetica, Università di Genova

(3) Dipartimento di Neuroscienze Pediatriche, IRCCS Istituto Neurologico Besta, Milano (4) Centro S. Maria della Pace, Fondazione Don Gnocchi Onlus, Roma (5) Polo Riabilitativo del Levante Ligure, Fondazione Don Gnocchi Onlus, Roma (6) Dipartimento di Neuroscienze, Oftalmologia e Genetica, Università di Genova, Genova (7) Laboratorio Malattie Neurologiche, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri, Milano

L’obiettivo dello studio è quello di validare il 6-minute walk test (6MWT) e lo StepWatchTM Activity Monitor (SAM), due strumenti che riflettono l’attività motoria della vita quotidiana, con altre misure di outcome già validate in una coorte ampia e rappresentativa di pazienti con malattia di Charcot-Marie-Tooth (CMT).

La CMT è la più frequente malattia neuromuscolare ereditaria. Finora sono stati effettuati pochi trial clinici e studi di storia naturale nella CMT tipo 1A. Recentemente sono state identificate e validate alcune misure di outcome. Due strumenti che molto probabilmente riflettono in modo più obiettivo ed accurato le prestazioni motorie dei pazienti nella vita quotidiana, ma non ancora validate nei pazienti CMT, sono il 6MWT ed il SAM. Entrambi sono stati impiegati per valutare la capacità funzionale in molte malattie neurologiche ed in alcune malattie neuromuscolari.

Lo studio viene svolto in 12 mesi su 200 pazienti CMT (CMT1A, CMT1B, CMT-X-linked). Il progetto è articolato nelle seguenti fasi: 1) addestramento dei medici di ciascuno dei centri partecipanti e valutazione della inter- ed intra-rater reliability del 6MWT e del SAM; 2) valutazioni cliniche con il 6MWT, il SAM, il CMTNS, il test dei 10 metri, la misurazione con il miometro della forza dei muscoli distali degli arti superiori ed inferiori, la scala di qualità di vita SF36 all’inizio dello studio e dopo 6 e 12 mesi; 3) analisi provvisoria a 6 mesi; 4) analisi finale dei dati. Tenendo conto della progressione lenta di malattia, se l’analisi finale dei dati non mostrerà risultati significativi, verrà proposta una continuazione dello studio fino a 24 mesi anche in assenza di un ulteriore contributo finanziario.

Aggiornamento sullo studio: l’addestramento dei medici di ciascuno dei centri partecipanti è stato completato nel gennaio 2012. Nell’ Aprile 2012 sono stati arruolati i primi pazienti, i quali effettueranno le valutazioni previste al 6° mese nei prossimi giorni. La compliance e la collaborazione dei pazienti allo studio sono state abbastanza buone. Le due nuove misure di outcome sono state ben accettate dai pazienti. L’appilcazione del SAM richiede 2-3 minuti ed un tempo simile è necessario per estrarre i dati alla fine dei 5 giorni di registrazione. Il 6MWT richiede un piccolo sforzo da parte del paziente, e circa una decina di minuti per essere eseguito. L’insieme delle valutazioni cliniche ed elettrofisiologiche richiede circa 1 ora.

Ad oggi sono stati arruolati 80 pazienti affetti da CMT: 55 con la CMT1A, 12 CMT1B e 13 CMTX. Lo studio permetterà di validare due nuove misure di outcome disponibili per futuri trial clinici e di selezionare gli strumenti più adeguati per individuare i cambiamenti significativi in una malattia con un decorso lentamente progressivo.

La prof.ssa M. Reilly (Londra) partecipa al progetto, come collaboratore esterno, consentendo una correlazione dei dati ottenuti con il SAM con quelli conseguiti con uno strumento simile, il SenseWear Pro 3 Armband. ACMT-RETE, associazione nazionale di volontariato Onlus per la malattia di Charcot Marie Tooth, fornirà tutto l’appoggio utile nel favorire il reclutamento e la partecipazione allo studio e nel diffondere le informazioni relative allo studio.

Introduzione: La malattia di Charcot-Marie-Tooth (CMT) è una neuropatia periferica ereditaria il cui processo degenerativo non è stato ancora ben caratterizzato. La CMT esordisce di solito prima dei 20 anni. Scopo del progetto è studiare, tramite l’Analisi strumentale del Movimento (AM), un gruppo di pazienti CMT, analizzare la correlazione tra i risultati ottenuti dall’AM e i dati clinici, demografici e genetici, e infine valutare l’affidabilità e la sensitività dei dati AM come misure di outcome nella CMT. Metodi: Sono stati reclutati 100 soggetti CMT nelle 3 unità operative coinvolte nel progetto, (Milano, Roma e Sarzana), e sono stati suddivisi in due gruppi in base all’età: giovani (età: 6-17 anni) e adulti (età: 18-70 anni). Da un punto di vista genetico il campione è così caratterizzato: 55 adulti con CMT1A, 15 adulti con CMTX1 e 30 giovani con CMT1A. Ad oggi sono stati reclutati anche 40 controlli sani, 21 adulti e 19 giovani. Ciascun paziente è stato valutato clinicamente e con una valutazione biomeccanica esaminando i seguenti parametri della locomozione: cammino a velocità naturale ed aumentata, cammino su punte e talloni, discesa e salita da un gradino e stabilizzazione posturale dopo il sit-to-stand. Inoltre in un sottogruppo di 20 soggetti CMT è stata valutata la test-retest reliability a 4-6 settimane dell’AM. Risultati: L’affidabilità di questo protocollo è stata misurata tramite il metodo di test-retest, che ha mostrato una buona ripetibilità nella maggior parte dei parametri CMT-specifici con errori assoluti minori di 5° sugli angoli, soglia clinicamente accettabile.

Sono stati identificati i parametri biomeccanici in grado di quantificare i deficit primari legati alla CMT: caduta del piede (foot-drop) e deficit plantaflessorio di spinta (push-off).

Tramite cluster analysis su tali parametri CMT-specifici sono stati identificati, in entrambi i gruppi, tre sottogruppi di pazienti con pattern locomotori distinti nel cammino naturale: 1) pazienti normallike (NL), non significativamente diversi dai controlli; 2) pazienti foot-drop (FD), con un’evidente deficit di dorsiflessione in fase di swing; 3) pazienti con foot-drop e deficit di push-off (FD&POD), con una riduzione nella potenza alla caviglia in fase di spinta oltre alla caduta del piede. Tasks più impegnativi, come il cammino su punte e talloni, hanno evidenziato i deficit della CMT anche nei pazienti NL sia adulti che giovani (p<0.05, rispetto ai controlli).

Il genotipo dei pazienti adulti CMT è risultato non determinante per la caratterizzazione funzionale del pattern locomotorio.

Discussione: L’AM può essere utilizzata come misura di outcome funzionale nella CMT. L’analisi dei segni primari porta a ipotizzare una sintomatologia associata alla progressione della malattia, con transizioni dallo stadio più lieve NL al più grave FD&POD, passando per l’intermedio FD. Tale ipotesi sarà verificata nelle prossime valutazioni di follow-up. Inoltre la classificazione funzionale identificata può essere importante per una corretta impostazione terapeutica.

ABSTRACT N. 99

ABSTRACT N. 100

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

FERRARIN MAURIZIO

Telethon grant N.

GUP10010

Totale €

283.775

Num Centri: 4

Durata (anni): 3

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

Anno d’inizio: 2011

GUP09013

Totale €

124.500

Num Centri: 4

SVILUPPO DI UN PROTOCOLLO STRUMENTALE DI ANALISI DEL MOVIMENTO PER L’ANALISI MULTITASKING DELLE FUNZIONI LOCOMOTORIE NELLA MALATTIA DI CHARCOT-MARIE-TOOTH NELL’ETÀ EVOLUTIVA E NELL’ADULTO: VALUTAZIONE DELL’AFFIDABILITÀ E DELLA CAPACITÀ DI MISURARE LA RISPOSTA AL TRATTAMENTO TRAMITE STUDIO MULTICENTRICO

SCHENONE ANGELO

Telethon grant N.

Durata (anni): 2

Anno d’inizio: 2010

STUDIO MULTICENTRICO PER VALUTARE EFFICACIA E SICUREZZA DI UN PROTOCOLLO RIABILITATIVO COSTITUITO DA ESERCIZI AL TREADMILL, STRETCHING E DI PROPRIOCEZIONE IN PAZIENTI AFFETTI DA NEUROPATIA DI CHARCOT-MARIE-TOOTH TIPO 1A Schenone Angelo (1), Monti Bragadin Margherita (1), Pareyson Davide (2), Padua Luca (3,4), Fabrizi Gianmaria (5)

Lencioni Tiziana (1), Beghi Ettore (7), Di Sipio Enrica (4), Forni Marco (5), Minciotti Ileana (4), Moroni Isabella (3), Padua Luca (4), Pagliano Emanuela (3), Pareyson Davide (2), Pazzaglia Costanza (4), Piscosquito Giuseppe (2), Rabuffetti Marco (1), Russo Giuseppina (4), Schenone Angelo (6), Ferrarin Maurizio (1)

(1) Department of Neuroscience, Ophthalmology, Rehabilitation, Genetics and Mother and Child Sciences University of Genoa, Largo Daneo 3, Genova, Italy, Tel. 010.3537040, Fax 010.3538639, E-mail: aschenone@neurologia.unige.it (2) Clinic of Central and Peripheral Degenerative Neuropathies, Dept of Clinical Neurosciences, IRCCS Foundation, C. Besta Neurological Institute, Milan (3) Department of Neuroscience, Institute of Neurology, Catholic University, Rome, Italy (4) Centro S. Maria della Pace, Don Carlo Gnocchi Onlus Foundation, Italy

(1) Polo Tecnologico, IRCCS Fondazione Don Gnocchi Onlus, Via Capecelatro 66, 20148 Milano, Tel. +39-02-40308305, Fax +39-02-4048919, E-mail: mferrarin@dongnocchi.it (2) Clinica delle neuropatie degenerative centrali e periferiche, IRCCS Istituto Neurologico Besta, Milano

77

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

Inoltre, abbiamo dimostrato che in CMT1A SC il [cAMP]i basale è significativamente più basso che in cellule wild type, in linea con il ruolo, ormai ben stabilito, del cAMP nella regolazione del differenziamento delle SC e della mielinizzazione. E’ interessante sottolineare che il P18 ha inoltre diminuito la quantità dei neurofilamenti non fosforilati, usati come un marker della sofferenza assonale.

Questi risultati suggeriscono che gli antagonisti del P2X7 potrebbero rappresentare una strategia terapeutica che miri a correggere i disordini molecolari che causano la demielinizzazione in CMT1A. Per rafforzare questa ipotesi, abbiamo anche dimostrato che il P2X7 è presente in SC normali umane e negli assoni, ed è overespresso nel tessuto nervoso ottenuto da ratti e da pazienti affetti da CMT1A.

(5) Department of Neurological and Visual Sciences, University of Verona, Italy

La CMT rappresenta la malattia neuromuscolare ereditaria più frequente del sistema nervoso. Al momento non sono disponibili terapie farmacologiche per le neuropatie ereditarie e l’approccio riabilitativo appare l’unico trattamento possibile. Tuttavia, sicurezza ed efficacia della riabilitazione nelle diverse forme di CMT non sono chiare. In particolare, non ci sono esperienze sull’uso di esercizi aerobici in questi pazienti e mancano informazioni su frequenza e durata di un eventuale programma riabilitativo. Il primo obiettivo di questo progetto è chiarire se l’attività aerobica, basata su un programma strettamente controllato di esercizio al treadmill, è ben tollerata ed efficace in pazienti affetti da CMT1A, sottotipo più frequente di CMT1 che ha un fenotipo relativamente stereotipato. Gli obiettivi secondari sono: 1) capire se la risposta respiratoria e cardiopolmonare all’esercizio è compromessa in pazienti affetti da CMT1A; 2) valutare il mantenimento dell’eventuale miglioramento dopo un periodo di sei mesi di follow – up; 3) valutare l’impatto della riabilitazione sulla qualità di vita di questi pazienti. Si tratta di uno studio multicentrico, prospettico, randomizzato, controllato, in singolo cieco. La misura primaria dei risultati è il “10m timed walking test” (T10mW) e le secondarie sono il 6 minute walking test (6MWT), 12-item walking scale; la forza distale determinata con un miometro; SF36 per valutare la qualità di vita; “Range of Motion” (ROM) di caviglia misurato con un goniometro; “Berg Scale” e “Mobility scale”, la massima pressione espiratoria, la capacità vitale forzata e la massima capacità inspiratoria; il picco di consumo di ossigeno durante l’esercizio fisico incrementale sul treadmill e le valutazioni metaboliche. Saranno valutate, inoltre, l’attività fisica quotidiana e la fatica. Abbiamo fino ad ora arruolato 57 pazienti. Essendo l’arruolamento ancora in corso e trattandosi di uno studio in singolo cieco, presenteremo i dati della I valutazione (T0) del gruppo di soggetti fino ad ora arruolati.

ABSTRACT N. 102 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

GGP12002 115.500

Num Centri: 1

Durata (anni): 2

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2009

Cogli Laura, Bramato Roberta, Donno Claudia, Margiotta Azzurra, Paiano Aurora, Bucci Cecilia Dip. Scienze e Tecnologie Biologiche ed Ambientali (DiSTeBA), Università del Salento, Via provinciale Monteroni 165, 73100 Lecce, Tel. 0832.298900, Fax 0832.298626; E-mail: cecilia.bucci@unisalento.it

La Charcot-Marie-Tooth di tipo 2B (CMT2B) è una neuropatia ulceromutilante, che compare nella seconda o terza decade di vita e colpisce la porzione distale degli arti inferiori, determinando atrofia muscolare, parestesia ed estese ulcerazioni che portano spesso ad amputazioni. Quattro mutazioni missenso, che colpiscono amminoacidi altamente conservati nella proteina Rab7, causano la CMT2B. Rab7 è una piccola GTPasi ubiquitaria che controlla il trasporto ai compartimenti endocitici degradativi. In precedenza, abbiamo dimostrato che le proteine Rab7 mutanti che causano la CMT2B rilasciano i nucleotidi (in particolar modo il GDP) più facilmente rispetto alla proteina wt e, di conseguenza, hanno anche una più bassa attività GTPasica. All’interno della cellula, questi mutanti sono prevalentemente legati al GTP, legano maggiormente alcuni effettori e possono recuperare la funzione di Rab7 quando espressi in cellule silenziate per Rab7.

Ancora non è chiaro, però, in che modo mutazioni in una proteina ubiquitaria come Rab7 siano in grado di determinare una patologia specifica del sistema nervoso periferico. Si può ipotizzare che Rab7 regoli un processo peculiare dei neuroni periferici, o che le mutazioni alterino l’interazione di Rab7 con effettori presenti solo in queste cellule. Nell’ambito di questo progetto abbiamo dimostrato innanzitutto che l’espressione di questi mutanti inibisce la crescita dei neuriti e il differenziamento neuronale. Inoltre, utilizzando il sistema del doppio ibrido, in una libreria di cDNA di cellule DRG (Dorsal Root Ganglion) abbiamo identificato la periferina come interattore di Rab7. Abbiamo confermato l’interazione mediante co-immunoprecipitazione e pull-down; inoltre, utilizzando proteine ricombinanti espresse in batteri, abbiamo dimostrato che le due proteine interagiscono direttamente. La periferina è una proteina prevalentemente espressa nei neuroni del sistema nervoso periferico che fa parte dei filamenti intermedi neuronali di tipo III e sembra essere coinvolta nella rigenerazione assonale. La modulazione dei livelli di Rab7 sembra regolare l’assemblaggio della periferina: infatti, il silenziamento di Rab7 causa un aumento della periferina solubile mentre la sovraespressione di Rab7 aumenta la periferina filamentosa. Inoltre, le proteine Rab7 mutanti che causano la CMT2B interagiscono maggiormente con la periferina e ne aumentano l’abbondanza nella frazione solubile. Dal momento che la periferina sembra svolgere un ruolo importante nella rigenerazione assonale dopo una lesione, un’alterazione dell’interazione tra Rab7 e la periferina potrebbe avere effetti negativi sulla rigenerazione assonale. Inoltre, considerato che la periferina si assembla insieme ai neurofilamenti (mutati in altre forme di CMT) si può ipotizzare che alterazioni nell’organizzazione della periferina, causate dai mutanti di Rab7, alterino il corretto assemblaggio dei neurofilamenti che sono importanti per le funzioni dei neuroni sensori e motori.

BRUZZONE SANTINA

Totale €

165.000

INDIVIDUAZIONE DELLA PERIFERINA COME NUOVO INTERATTORE DI RAB7: IMPLICAZIONI PER LA NEUROPATIA CHARCOT-MARIE-TOOTH DI TIPO 2B

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Telethon grant N.

GGP09045

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 101 Responsabile

BUCCI CECILIA

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2012

RUOLO DEI RECETTORI PURINERGICI NELLA MIELINIZZAZIONE: IMPLICAZIONI TERAPEUTICHE PER IL TRATTAMENTO DELLA NEUROPATIA PERIFERICA CHARCOT-MARIETOOTH 1A Nobbio Lucilla (1), Visigalli Davide (1), Mannino Elena (2), Fiorese Fulvia (1), Kassack Matthias (3), Sturla Laura (2), Pareyson Davide (4), Sereda Michael W (5), Prada Valeria (1), Mancardi Gianluigi (1), Zocchi Elena (2), Schenone Angelo (1), Bruzzone Santina (2) (1) Dept of Experimental Medicine, Section of Biochemistry and CEBR, Viale Benedetto XV, 7 16132, Genova, Italy, Tel. +39.010.3538161; Fax +39.010.353415; E-mail: santina.bruzzone@unige.it (2) Institute of Pharmaceutical and Medicinal Chemistry, Heinrich-Heine-University of Düsseldorf, Germany (3) Clinic of Central and Peripheral Degenerative Neuropathies Unit, C. Besta Neurological Institute, Milano, Italy (4) Max-Planck-Institute of Experimental Medicine, Göttingen, Germany

La malattia di Charcot-Marie-Tooth 1A (CMT1A) è una neuropatia ereditaria demielinizzante i cui patomeccanismi sono ancora poco definiti. Di conseguenza, non sono ancora disponibili trattamenti eziologici per la CMT1A. Noi abbiamo dimostrato che l’overespressione del recettore purinergico P2X7 determina un innalzamento della concentrazione intracellulare di Ca2+ in cellule di Schwann (SC) isolate da un modello di ratto di CMT1A (CMT1A SC). La correzione degli elevati livelli di Ca2+ attraverso la down-regolazione del P2X7 ha ripristinato il fenotipo normale nelle CMT1A SC coltivate.

In questo studio, colture organotipiche dei gangli delle radici dorsali (DRG) ottenuti sia da ratti wild type che CMT1A, sono state trattate con A438079, un antagonista commerciale di P2X7, che ha migliorato in modo significativo la mielinizzazione nelle colture CMT1A, come determinato tramite la valutazione dei livelli di espressione della proteina mielinica MPZ e tramite l’analisi morfometrica della densità dei segmenti mielinici. Il P18, un isomero dell’Ap2A (diadenosina difosfato), che si comporta sia come antagonista del P2X7 che come agonista del P2Y11 [Bruzzone S et al, J Biol Chem 285: 21165-74, 2010], era in grado di aumentare il contenuto intracellulare di cAMP ([cAMP]i) in CMT1A SC, tramite l’attivazione del P2Y11, come pure di migliorare la mielinizzazione in colture DRG.

78

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

ABSTRACT N. 103

Raffaele Scientific Institute, via Olgettina 58, 20132 Milan, Italy, Tel. +39.02.26434439, Fax +39.02.26436164, E-mail: taveggia.carla@hsr.it (2) Division of Genetics and Cell Biology San Raffaele Scientific Institute, Milano, Italy (3) Dulbecco Telethon Institute

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

FELTRI MARIA LAURA

Telethon grant N.

GGP08021

Totale €

376.200

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Le neuropatie di Charcot Marie Tooth (CMT) rappresentano le neuropatie ereditarie più frequenti. Sono stati identificati più di 30 geni che provocano queste neuropatie, e si è scoperto che diverse mutazioni agiscono con meccanismi differenti. La grave disabilità di tali neuropatie è principalmente dovuta ad un progressivo danno assonale. Al momento non esiste un trattamento farmacologico adeguato per il trattamento di queste patologie. Molte CMT presentano alterazioni nei livelli di mielinizzazione. Per tale motivo lo sviluppo di trattamenti terapeutici che ripristinino il normale livello di mielinizzazione può essere un valido approccio per sviluppare una terapia comune che sia di beneficio a tutte queste malattie. In aggiunta il ripristino dei normali livelli di mielinizzazione può potenzialmente ridurre il danno assonale, in quanto la mielina è neuro protettiva.

Il Coordinatore di questo studio ed altri gruppi di ricerca, hanno recentemente scoperto che un fattore di crescita denominato Neuregulina 1 di tipo III è in grado di aumentare proprio la produzione della mielina nei nervi. La funzione di questo fattore di crescita è regolata da altre molecole dette secretasi la cui attività può essere modulata a sua volta da farmaci già in uso in sperimentazioni cliniche per altre patologie umane.

In questo progetto ci proponiamo di modulare l’attività della Neuregulina 1 e quindi la mielinizzazione nel sistema nervoso periferico di modelli animali di CMT che abbiamo sviluppato nel corso degli anni nei nostri laboratori. In particolare ci occuperemo di forme ipomielinizzanti (Partner 3) e ipermielinizzanti (Partner 4) di CMT. Inoltre con i Partner 1 e 2 studieremo come i segnali provenienti da Neuregulina 1 si integrino con altri già conosciuti ed importanti per la formazione di una corretta guaina mielinica.

I nostri risultati preliminari suggeriscono che cambiando i livelli di Neuregulina 1 nei modelli animali di CMT possa effettivamente riportare la mielinizzazione a valori normali. Al momento stiamo realizzando studi preclinici per valutare se l’uso di farmaci che aumentano o diminuiscono il fattore pro-mielinizzante possa modulare la quantità di mielina nei modelli animali di CMT. Tali studi verranno eseguiti anche nelle cellule staminali derivate dalle biopsie umane, per valutarne l’efficacia e diminuirne eventuali effetti tossici. In conclusione, ci aspettiamo che i risultati di questi studi ci indichino se questi farmaci, già in uso nell’uomo, possano essere di beneficio per diverse neuropatie ereditarie.

Anno d’inizio: 2008

LAMININE E LORO RECETTORI NELLE NEUROPATIE EREDITARIE Colombelli Cristina (1), Pavoni Ernesto (1), Zambroni Desiree (1), Palmisano Marilena (2), Occhi Simona (1), Nicole Sophie (3), Soininen Raija (4), Eshed Yael (5), Peles Elior (5), Wrabetz Lawrence (1,2), Feltri Maria Laura (1,2) (1) Division of Genetics and Cell Biology, Via Olgettina 58, San Raffaele Scientific Institute, 20132 Milano, Italy, Tel. 02.26434782, Fax 02.26434767, Email:feltri.laura@hsr.it (2) 5 Hunter James Kelly Research Institute, School of Medicine and Biomedical Sciences, State University of New York at Buffalo, NY, USA (3) Inserm, U546, Univ Paris 06, Paris, France (4) Oulu Center for Cell-Matrix Research, Biocenter Oulu, Department of Medical Biochemistry and Molecular Biology, University of Oulu, Finland (5) Department of Molecular Cell Biology, The Weizmann Institute of Science, Rehovot 76100, Israel

Il complesso del distroglicano collega la matrice extracellulare con il citoscheletro in molti tipi cellulari. Mutazioni in vari componenti del complesso sono responsabili di numerose distrofie muscolari. Analogamente, abbiamo dimostrato nel corso dei 3 anni di finanziamento che il complesso del distroglicano ha un ruolo centrale nella patogenesi di varie neuropatie ereditarie (Charcot-Marie-Tooth 4F, neuropatie che accompagnano le distrofie muscolari congenite MDC1A, MDC1C e MDC1D).

Qui dimostriamo che la proteolisi del distroglicano da parte delle furine è importante per la clusterizzazione dei canali del sodio al nodo di Ranvier. La conduzione saltatoria dell’impulso nervoso richiede alte concentrazioni di canali del sodio nella membrana assonale al nodo di Ranvier. Abbiamo dimostrato in precedenza che la lamina basale che circonda i nodi di Ranvier contiene specifiche distrofine e laminine, che sono necessarie per la formazione dei microvilli e la clusterizzazioni dei canali del sodio ai nodi di Ranvier, sia in modelli murini che in pazienti affetti da MDC1A. Qui ne indaghiamo il meccanismo. Sia il distroglicano che la distrofina DP116 si localizzano al nodo precocemente, durante la sua formazione. La delezione del distroglicano nelle cellula di Schwann in vivo previene la completa clusterizzazione dei canali del sodio. Sia l’alfa che il beta-distroglicano sono localizzati sia nella parte dei microvilli che guarda la membrana basale, sia in quella a contatto con l’assone (nodal gap).

Qui la parte N-terminale dell’alpha-distroglicano viene rilasciata dalle cellule di Schwann in seguito a taglio da furina, e co-localizza con altre molecole implicate nella clusterizzazione dei canali del sodio quali NrCam e gliomedin. Dimostriamo inoltre che il distroglicano è necessario per localizzare nella nodal gap di vari proteoglicani , quali il perlecan e il versican. Oltre a questi, rileviamo anche altri proteoglicani in questa sede, quali l’agrina, che insieme ai già noti sindecano 3 e 4 indicano un’alta ridondanza di elementi della matrice in questa sede. Questo è confermato dal fatto che la riduzione di uno solo di questi proteoglicani (perlecan) non è sufficiente a ridurre la clusterizzazione dei canali del sodio al nodo. Questi dati indicano che il distroglicano favorisce la formazione dei nodi di Ranvier attraverso vari meccanismi, tra cui la stabilizzazione dei componenti della nodal gap.

ABSTRACT N. 105 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

GPP10007 1.442.850

Num Centri: 5

Durata (anni): 3

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2013

Crispino Giulia (1), Mammano Fabio (1,2), Bortolozzi Mario (1,2) (1) Istituto Veneto di Medicina Molecolare (Vimm), Via G.Orus 2, 35129, Padova, Italy, Tel. 049.7923247, Fax 049.7923250, E-mail: mario.bortolozzi@gmail.com (2) Dipartimento di Fisica e Astronomia “G.Galilei”, Università di Padova

La malattia di CHARCOT-MARIE-TOOTH (CMT) è il più comune disordine genetico del sistema nervoso periferico. Questa grave malattia, per la quale non è ancora presente alcuna cura, colpisce circa 1 persona su 3000, delle quali il 10-12% porta la forma X-linked, detta CMT1X. Oltre 400 mutazioni associate alla CMT1X sono state scoperte sul cromosoma X, ed in particolare nel gene che codifica per la connessina32 (Cx32). Quest’ultima è una proteina di membrana che forma canali giunzionali riflessivi fra gli strati di mielina delle cellule di Schwann, fornendo un percorso radiale preferenziale estremamente rapido agli ioni e ai secondi messaggeri implicati nel mantenimento di una corretta mielinizzazione. A tutt’oggi, nonostante i numerosi studi sull’espressione e la funzione della Cx32 sana e mutata, non vi è ancora un quadro interpretativo chiaro e coerente che chiarisca i meccanismi della patologia. Tuttavia crediamo che possa esistere una spiegazione comune della CMT1X riconducibile fondamentalmente ad un ridotto trasporto di alcune specifiche molecole cito-

TAVEGGIA CARLA

Totale €

341.400

ANALISI STRUTTURALE E FUNZIONALE DI PARTICOLARI MUTAZIONI DELLA CONNESSINA 32 IMPLICATE NELLA PATOGENESI DELLA FORMA X-LINKED DELLA MALATTIA DI CHARCOT-MARIE-TOOTH

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Telethon grant N.

GGP12269

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 104 Responsabile

BORTOLOZZI MARIO

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2010

MODULAZIONE DELLA NEUREGULINA-1 PER IL TRATTAMENTO DI NEUROPATIE DEMIELINIZZANTI Feltri Maria Laura (2), Pavoni Ernesto (2), Previtali Stefano C. (1), Wrabetz Lawrence (2), D’Antonio Maurizio (2), Bolino Alessandra (1,3), Taveggia Carla (1) (1) Division of Neuroscience San Raffaele Scientific Institute and INSPE San

79

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

plasmatiche cruciali per il corretto mantenimento dello strato mielinico delle cellule di Schwann. Nel 1997 Oh et al. proposero che fosse il cAMP la molecola più adatta a ricoprire questo ruolo chiave, come evidenziato anche in studi successivi (Wang et al. 2004).

Abbiamo per ciò effettuato esperimenti in cellule HeLa basati su una combinazione di doppio patch-clamp e imaging FRET di un biosensore del cAMP (H30) per determinare se un mutante funzionale (R220stop) della Cx32 umana potesse presentare una ridotta permeabilità al cAMP. La conduttanza elettrica di singolo canale misurata nel mutante R220stop è risultata confrontabile con quella del wild type (WT), indicando che la permeabilità allo ione K+ non risulta alterata dalla mutazione. Al contrario, abbiamo misurato una permeabilità al cAMP significativamente ridotta nel canale mutante rispetto al WT. Esperimenti similari sono poi stati condotti con molecole esogene fluorescenti come il lucifer yellow (LY) e la calceina, trovando che il mutante è meno permeabile a tali molecole rispetto al WT, coerentemente con quanto osservato da noi per la prima volta per il cAMP e in accordo con misure precedenti in letteratura con LY e calceina (Bicego et al. 2006).

Riteniamo che questi risultati possano fornire una notevole base per il prosieguo del nostro progetto Telethon, in particolare nello studio delle mutazioni della Cx32 in un nuovo preparato costituito da cellule di Schwann in coltura derivate da pazienti con CMT1X. REFERENZE Oh, S., et al., Changes in permeability caused by connexin 32 mutations underlie X-linked Charcot-Marie-Tooth disease. Neuron, 1997.

Wang, H.L., et al., Functional analysis of connexin-32 mutants associated with X-linked dominant Charcot-Marie-Tooth disease. Neurobiol Dis, 2004.

Bicego, M., et al., Selective defects in channel permeability associated with Cx32 mutations causing X-linked Charcot-Marie-Tooth disease. Neurobiol Dis, 2006.

evidenziato dalla fosforilazione di Plc gamma e di Mapk dopo trattamento con NGF. Nel mutante D668Y la fosforilazione di TrkA indotta da NGF si conferma essere comparabile a quella del recettore wt.

Il secondo approccio consiste nello studiare il signalling di NGF in modelli animali di HSAN IV e V. Per questo abbiamo prodotto un vettore di targeting per una linea di topi knock-in cui la sequenza murina di TrkA è rimpiazzata dalla codificante per l’ortologo umano recante la mutazione D668Y. Sono stati selezionati cloni ricombinanti di cellule ES che verranno iniettati in blastocisti ospiti.

Inoltre, stiamo generando i vettori di targeting per due linee di topi knock-in in cui la sequenza codificante di NGF è rimpiazzata da quella dell’ortologo umano nella sua forma wild-type o recante la mutazione R100W. Ringraziamenti: grazie a Lorenza Ronfani e Luisa Pintonello della Core Facility for Conditional Mutagenesis, Dibit-San Raffaele, Milano, che si sono occupate della ricombinazione omologa nel locus TrkA e stanno iniettando i cloni ES positivi in blastocisti ospiti.

ABSTRACT N. 107 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

263.000 Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2009

COINVOLGIMENTO DI PROTEINE MITOCONDRIALI IN AUTOFAGIA: UNA POSSIBILE IMPLICAZIONE IN MALATTIE MITOCONDRIALI Giorgi Carlotta (1), Baldassari Federica (1), Bononi Angela (1), Bonora Massimo (1), De Marchi Elena (1), Ioannidi Elli (1), Marchi Saverio (1), Missiroli Sonia (1), Morciano Giampaolo (1), Patergnani Simone (1), Poletti Federica (1), Rimessi Alessandro (1), Zanna Claudia (2), Rugolo Michela (3), Carelli Valerio (2), De Pinto Vito (4), Rosario Rizzuto (5), Pinton Paolo (1)

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari CATTANEO ANTONINO

Telethon grant N.

GGP11179

Totale €

189.200

Num Centri: 1

GGP09128

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 106 Responsabile

PINTON PAOLO

Telethon grant N.

Durata (anni): 3

(1) Department of Morphology, Surgery and Experimental Medicine, University of Ferrara, Via L. Borsari 46, 44121, Ferrara Tel. 0532.455802 E-mail: pnp@unife.it (2) Department of Neurological Sciences, University of Bologna (3) Department of Pharmacy and Biotechnology, University of Bologna (4) Department of Chemical Sciences, University of Catania (5) Department of Biomedical Sciences, University of Padua

Anno d’inizio: 2013

SVILUPPO DI UNA TERAPIA A BASE DI NGF PER LE NEUROPATIE EREDITARIE SENSORIE ED AUTONOME DI TIPO IV E V

I mitocondri sono organelli cellulari deputati alla produzione di energia che possiedono un proprio genoma, il DNA mitocondriale (mtDNA). Mutazioni dei geni che costituiscono il mtDNA possono causare numerose malattie mitocondriali. Grande interesse della comunità scientifica è rivolto ai mitocondri, coinvolti non solo nell’apoptosi, ma anche in un altro processo di morte cellulare, l’autofagia, un processo catabolico che comprende la degradazione dei componenti cellulari longevi.

L’eliminazione selettiva dei mitocondri danneggiati (mitofagia) potrebbe svolgere un importante ruolo nell’accumulo di mutazioni del mtDNA. Nel presente progetto abbiamo investigato il coinvolgimento dei mitocondri nell’alterazione del processo autofagico e un’eventuale correlazione con lo sviluppo di malattie mitocondriali. Il progetto ha inoltre studiato la relazione tra autofagia e segnale calcio, un secondo messaggero coinvolto nello sviluppo di malattie mitocondriali.

Pancrazi Laura (1), Capsoni Simona (1), Costa Mario (2), Cattaneo Antonino (1) (1) Laboratory of Neurobiology, Scuola Normale Superiore, Piazza dei Cavalieri 7, 56126 Pisa, Italy Tel. 050.309320, Fax 050.563513, E-mail: antonino.cattaneo@sns.it (2) Institute of Neuroscience, National Research Council (CNR), Pisa

Le neuropatie ereditarie sensorie ed autonome (HSAN) IV e V sono rare patologie caratterizzate da una completa mancanza di sensazione dolorifica e correlate a difetti nel signalling del Fattore di Crescita Nervosa (Nerve Growth Factor, NGF). HSAN IV è caratterizzata dall’assenza di sudorazione e dalla totale assenza di reazione a stimoli dolorosi, che può condurre ad auto mutilazioni, bruciature, fratture multiple e neuropatie delle articolazioni. HSAN IV è causata da un ampio spettro di mutazioni nel gene TrkA, codificante per il recettore tirosina chinasi di NGF. I pazienti affetti da HSAN V hanno una congenita e selettiva insensibilità al dolore ed alla sensazione di calore, che li rende soggetti a fratture indolori, necrosi delle ossa, osteocondriti e distruzione neuropatica delle articolazioni. La sudorazione è normale. La mutazione genetica responsabile è la mutazione R100W nel gene NGF. Si noti che, mentre i pazienti affetti da HSAN IV mostrano un severo ritardo mentale, quelli affetti da HSAN V sono cognitivamente normali.

Il fine del nostro progetto è lo studio dei meccanismi alla base delle alterazioni differenziali del signalling di NGF in queste due malattie.

Per ottenere ciò stiamo adottando due strategie.

La prima consiste nel confrontare la via di trasduzione del segnale a valle di TrkA wild-type e di TrkA D668Y in colture cellulari. D668Y è la mutazione HSAN IV più comune e, a differenza di altri mutanti, la fosforilazione di TrkA indotta da NGF è qui riferita essere comparabile a quella del recettore wt. Tuttavia non era noto se il signalling a valle di tale fosforilazione fosse alterato. Per indagare ciò abbiamo generato due vettori di espressione contenenti il cDNA del gene umano di TrkA rispettivamente nella forma wild-type e nella forma D668Y. I nostri risultati preliminari in cellule SHSY5Y suggeriscono che il signalling a valle del recettore mutato non è alterato, come

ABSTRACT N. 108 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

VERGANI LODOVICA

Telethon grant N.

GGP10145

Totale €

161.000

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2010

RUOLO DELLA DINAMICA MITOCONDRIALE E DELL’AUTOFAGIA NELLA SEGREGAZIONE DEL DNA MITOCONDRIALE MUTATO Sara Bettio, Adriana Malena, Lodovica Vergani Department of Neurosciences SNPSRR, University of Padova, c/o Centro Biomedico Pietro D’Abano, Via Orus 2, 35100 Padova, Italy, Tel. +39.049.8216162; Fax +39.049.8216163, E-mail: lodovica.vergani@unipd.it

80

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

INTRODUZIONE La maggior parte delle mutazioni patogenetiche umane del mtDNA sono eteroplasmiche, per la coesistenza all’interno di una cellula o di un tessuto di molecole di mtDNA mutato e normale. Quando in una cellula la proporzione di mtDNA mutato supera una soglia critica, l’attività della fosforilazione ossidativa risulta danneggiata, determinando un ampio spettro di patologie che generalmente colpiscono i tessuti con alto consumo di ossigeno. Tra queste la mutazione A3243G del mtDNA è prevalentemente legata alla sindrome denominata Encefalomiopatia Mitocondriale Lattico Acidosi Stroke (MELAS). Da notare che le molecole di mtDNA mutato hanno un vantaggio replicativo tessuto specifico, di cui si ignora il meccanismo, che elude il fisiologico controllo di qualità.

AIM Lo studio si prefigge di chiarire il contributo del meccanismo di controllo di qualità mitocondriale nella segregazione del mtDNA. A tal fine due punti sono stati sviluppati: 1) Caratterizzazione del potenziale autofagico : A tale scopo è stata studiata l’efficienza di “auto pulizia” cellulare (mitofagia) valutando, sia a livello proteico che d’espressione, le proteine coinvolte nel processo autofagico quali: BNIP3, BECLIN, LC3-II e p62.

2) Influenza della dinamica mitocondriale sulla segregazione mediante silenziamento di MFN1, proteina responsabile della fusione mitocondriale.

MATERIALI E METODI 1) Caratterizzazione del potenziale autofagico: In cibridi eteroplasmici di muscolo e polmone con diversa proporzione di mutazione MELAS A3243G: 0%-70%-80%-99% , e nelle relative linee parentali, è stata analizzata l’espressione delle proteine autofagiche: BNIP3, BECLIN, p62, LC3 mediante RT-PCR. Le stesse sono state quantizzate mediante Western blot (WB), in cellule trattate con o senza clorochina, per valutareil flusso autofagico.

2) Influenza della dinamica mitocondriale sulla segregazione: In cibridi eteroplasmici muscolari con 80% di mutazione MELAS A3243G, la proteina di fusione mitocondriale MFN1 è stata silenziata con la tecnica dell’ RNA interference. Nei cloni ottenuti dopo selezione in puromicina, è stata valutata la downregolazione di MFN1 con WB e RT-PCR. In quelli dove la down regolazione è risultata significativamente ridotta rispetto ai controlli (trasfettati con il vettore vuoto) sono state eseguite delle valutazioni morfometriche dei mitocondri e la quantizzazione della percentuale di mutazione del mtDNA mediante Hot-PCR. RISULTATI 1) Caratterizzazione del potenziale autofagico: Le cellule di polmone presentano un potenziale autofagico maggiore rispetto alle cellule di origine muscolare, suggerendo una effettivo ruolo della autofagia nella segregazione del mtDNA. 2) Influenza della dinamica mitocondriale sulla segregazione: 9 cloni down regolati per MFN1 e 9 cloni di controllo sono stati selezionati. L’analisi morfometrica ha denotato un significativo incremento della fissione mitocondriale in tutti i cloni downregolati per MTF1. Questo aumento di fissione non era accompagnato ad una variazione della percentuale di mutazione, che è risultata simile a quella dei controlli.

citosol, e fornisce inoltre aspartato nel citosol per la sintesi di urea nel fegato. Nell’uomo esistono due isoforme di AGC: AGC1, codificato dal gene SLC25A12, che è espresso nel cervello, cuore e muscolo scheletrico, e AGC2, codificato dal gene SLC25A13, che è espresso nel fegato e in altri tessuti, mentre la sua espressione nel SNC non è ancora chiara. Abbiamo descritto il primo caso di deficienza di AGC1 in una bambina affetta da grave ipotonia, ritardo dello sviluppo psicomotorio e spasticità sin dai primi mesi di vita (2). La RM sul cervello ha rivelato una ridotta mielinizzazione negli emisferi cerebrali, ma non nel cervelletto e nel tronco encefalico, e nessuna lesione a livello corticale e nei gangli basali. Indagini di 1HMRS dei lobi frontale e occipitale e dei gangli basali hanno mostrato una drastica riduzione dei livelli di N-acetilaspartato (NAA). Le analisi biochimiche su biopsie di muscolo hanno dimostrato una normale attività della catena respiratoria mitocondriale, mentre la sintesi di ATP mitocondriale era notevolmente ridotta in presenza di substrati come il glutammato e glutammato e malato. Il sequenziamento del gene SLC25A12 della paziente ha evidenziato una transizione c.1769A>G omozigote nell’esone 17 che causa la mutazione missense Q590R. La forma mutata di AGC1 è stata espressa in E. coli, purificata e ricostituita in liposomi dove si è dimostrata del tutto incapace di trasportare aspartato e glutammato diversamente dalla proteina WT ricombinante (2). Il fenotipo clinico della paziente è simile a quello precedentemente descritto in topi KO per il gene Slc25a12 caratterizzato da ridotta coordinazione motoria e deficit di mielina nel SNC accompagnato da ridotti livelli di aspartato e NAA (3). NAA è prodotto nei neuroni e subisce un trasferimento transassonale negli oligodendrociti dove fornisce gruppi acetile per la sintesi dei lipidi mielinici. Ciò suggerisce che nei neuroni AGC1 regola l’efflusso di aspartato dai mitocondri verso il citosol, un processo essenziale per la formazione di NAA e la successiva sintesi di mielina.

(1) Palmieri L, Pardo B, Lasorsa FM, del Arco A, Kobayashi K, Iijima M, Runswick MJ, Walker JE, Saheki T, Satrústegui J, Palmieri F. EMBO J. 2001;20, 5060-9.

(2) Wibom R, Lasorsa FM, Töhönen V, Barbaro M, Sterky FH, Kucinski T, Naess K, Jonsson M, Pierri CL, Palmieri F, Wedell A. N Engl J Med. 2009;361, 489-95.

(3) Jalil MA, Begum L, Contreras L, et al. J Biol Chem. 2005, 280, 31333-9.

ABSTRACT N. 109

MITMED: UN CONSORZIO MULTICENTRICO PER L’IDENTIFICAZIONE E LA CARATTERIZZAZIONE DI GENI NUCLEARI RESPONSABILI DI MALATTIE MITOCONDRIALI UMANE

ABSTRACT N. 110 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

Responsabile

388.600 Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2011

PALMIERI FERDINANDO

Telethon grant N.

GGP11139

Totale €

395.900

Num Centri: 4

GGP11011

Totale € Num Centri: 3

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari

ZEVIANI MASSIMO

Telethon grant N.

Durata (anni): 3

Ghezzi Daniele (1), Melchionda Laura (1), Diodato Daria (1), Invernizzi Federica (1), Lamantea Eleonora (1), Ferrero Ileana (3), Dallabona Cristina (3), Baruffini Enrico (3), Costa Rodolfo (4), Da Re Caterina (4), Zeviani Massimo (1,2)

Anno d’inizio: 2011

DEFICIENZA DELL’ISOFORMA 1 DEL CARRIER MITOCONDRIALE PER L’ASPARTATO/GLUTAMMATO: MECCANISMI PATOGENETICI E ANALISI MUTAZIONALE

(1) Unit of Molecular Neurogenetics, Foundation Istituto Neurologico “C. Besta”, via Temolo 4, 20126, Milano, Italy, Tel. +39.02.23942630, Fax +39.02.23942619, E-mail: zeviani@istituto-besta.it (2) Mitochondrial Biology Unit, Medical Research Council, Cambridge, UK (3) Department of Genetics, Biology of Microrganisms, Anthropology and Evolution, University of Parma, Italy (4) Department of Biology, University of Padova, Italy

Palmieri Ferdinando (1), Lasorsa Francesco Massimo (2), Monti Barbara (3), Pinton Paolo (4), Zeviani Massimo (5) (1) Dipartimento di Bioscienze, Biotecnologie e Scienze Farmacologiche, Università degli Studi di Bari “Aldo Moro”, Via Orabona 4, 70125 Bari, Tel 0805443323, Fax 0805442770, E-mail: ferdinando.palmieri@uniba.it (2) Istituto di Biomembrane e Bioenergetica IBBE CNR, Bari (3) Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie, Università di Bologna (4) Dipartimento di Morfologia, Chirurgia e Medicina Sperimentale, Università di Ferrara (5) Fondazione IRCCS Istituto Neurologico “C. Besta”, Milano

Le malattie mitocondriali colpiscono >1:5000 bambini e adulti, e coinvolgono prevalentemente il sistema nervoso e il muscolo scheletrico, causando rilevante morbidità e mortalità. La complessità genetica e biochimica della bioenergetica mitocondriale spiega l’estrema eterogeneità delle malattie mitocondriali, una formidabile sfida per l’approccio diagnostico e terapeutico. Oltre alle mutazioni del DNA mitocondriale, (mtDNA) un numero crescente di geni nucleari codificanti proteine mitocondriali sono stati identificati come responsabili di encefalomiopatie mitocondriali. Tuttavia, non è ancora chiaro come le cellule degenerano in conseguenza del difetto biochimico mitocondriale. Sebbene il deficit bioenergetico sembra un fattore critico nei difetti isolati o combinati della catena respiratoria mitocondriale (CRM), altri meccanismi sono probabilmente coinvolti, e diventano talora predominanti in sindromi specifiche: alterazioni dello stato redox, produzione di specie reattive dell’ossigeno, alterata omeostasi del Ca2+, disregolazione del potenziale di membra-

Il carrier mitocondriale per l’aspartato/glutammato (AGC) catalizza l’ingresso Ca2+-stimolato di glutammato nei mitocondri in scambio con aspartato mitocondriale. AGC possiede un dominio C-terminale con le caratteristiche di sequenza della famiglia dei carrier miocondriali e un dominio N-terminale che sporge nello spazio intermembrana e contiene quattro siti di legame per il Ca2+ (1). AGC, come componente dello shuttle malato-aspartato, permette l’ossidazione nei mitocondri degli equivalenti riducenti dell’NADH provenienti dal

81

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

ne mitocondriale, e attivazione dell’apoptosi. La complessità dell’omeostasi mitochondriale fa sì che in principio ogni membro del proteoma mitocondriale sia candidato per un disordine mitocondriale.

Questo spiega perchè solo il 40% delle malattie mitocondriali dell’adulto, e ancor meno del bambino, abbia attualmente una definizione genetico-molecolare. Tuttavia, nuove tecnologie di sequenza ed elaborazione computazionale offrono la possibilità di analizzare rapidamente ed economicamente l’esoma, cioè la porzione codificante del genoma, in individui singoli o piccole famiglie. Proteine mitocondriali mutate possono poi essere selezionate da programmi predittivi ad hoc, banche dati dedicate, ed esperimenti ex vivo. Noi abbiamo identificato numerosi nuovi geni malattia, ciascuno responsabile di specifici difetti della CRM e/o del metabolismo del mtDNA. L’analisi strutturale ci ha permesso di caratterizzare le conseguenze molecolari dell’eliminazione o modificazione di queste proteine, e il loro stato fisico in condizioni normali e patologiche. Per approfondire ulteriormente lo studio patogenetico, abbiamo creato modelli recombinanti specifici in lievito, moscerino e topo. Presenteremo le più recenti scoperte sull’identificazione e caratterizzazione di nuovi geni malattia, e l’elucidazione dei meccanismi patogenetici, ottenuti grazie al grant GGP11011.

del mtDNA. Risultati preliminari suggeriscono che la sovraespressione di OPA1 protegge i tessuti da diversi insulti, ad es. atrofia da denervazione, mentre la mancanza di OPA1 causa atrofia ottica in un topo condizionale KO, che può essere utilizzato a scopi di trattamento sperimentale, ad es mediante terapia sostitutiva AAV-mediata. In PL3, stiamo testando l’efficacia di composti approvati o sperimentali diretti verso le stesse vie investigate in PL1 e PL2 su pazienti con atrofia ottica ereditaria di Leber, atrofia ottica dominante, ed encefalopatia etilmalonica. Le terapie validate saranno poi estese a pazienti affetti da altre malattie mitocondriali.

ABSTRACT N. 112 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

217.100 Durata (anni): 2

Anno d’inizio: 2010

SVILUPPO E VALIDAZIONE DI UNA RETE NAZIONALE PER LA CREAZIONE DEL REGISTRO ITALIANO DELLE MALATTIE MITOCONDRIALI

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari

Siciliano Gabriele (1), Mancuso Michelangelo (1), Angelini Corrado (2), Bertini Enrico (3), Carelli Valerio (4), Comi Giacomo (5), Minetti Carlo (6), Moggio Maurizio (7), Mongini Tiziana (8), Servidei Serenella (9), Tonin Paola (10), Toscano Antonio (11), Uziel Graziella (12), Zeviani Massimo (13), Mitochondrial Network (14)

ZEVIANI MASSIMO

Telethon grant N.

GPP10005

Totale €

1.235.000

Num Centri: 3

GUP09004

Totale € Num Centri: 11

ABSTRACT N. 111 Responsabile

SICILIANO GABRIELE

Telethon grant N.

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2010

(1) Department of Neuroscience, University of Pisa, S. Chiara Hospital, via Roma 67, 56126 Pisa, Tel. 050.993046, Fax 050.554808; E-mail: g.siciliano@med.unipi.it (2) Neurological Clinic, University of Padova and IRCCS S. Camillo, Venice (3) Bambino Gesù Hospital, Rome (4) Neurological Clinic, University of Bologna (5) Neurology Unit, Fondazione, IRCCS Cà Grande Ospedale Maggiore Policlinico, Milano, Dino Ferrari Centre, University of Milan (6) Neuropediatric and Muscle Disorders Unit, University of Genoa and G. Gaslini Institute, Genoa (7) Neuromuscular Unit, Fondazione, IRCCS Cà Grande Ospedale Maggiore Policlinico, Milano, Dino Ferrari Centre, University of Milan (8) Neurological Clinic, University of Turin (9) Neurological Clinic, University of Rome (10) Department of Neurological, Neuropsychologic, Morphologic and Motor Sciences, University of Verona (11) Department of Neuroscience, University of Messina (12) Child Neurology Unit, The Foundation “Carlo Besta” Institute of Neurology, IRCCS, Milan (13) Unit of Molecular Neurogenetics, The Foundation “Carlo Besta” Institute of Neurology, IRCCS, Milan (14) National Wide Italian Collaborative Network of Mitochondrial Diseases

STRATEGIE TERAPEUTICHE PER COMBATTERE LE MALATTIE MITOCONDRIALI Zeviani Massimo (1,5), Rizzuto Rosario (2), Bernardi Paolo (2), Scorrano Luca (3,4), Carelli Valerio (6), Viscomi Carlo (1), Di Meo Ivano (1), Cerutti Raffaele (1) (1) Unit of Molecular Neurogenetics, Foundation Istituto Neurologico C. Besta, via Temolo 4, 20126, Milano, Italy, Tel. +39.02.23942630; Fax +39.02.23942619; E-mail: zeviani@istituto-besta.it (2) Department of Biomedical Sciences University of Padua, Italy (3) University of Geneva, Switzerland (4) Dulbecco Telethon Institute, Padua, Italy (5) MRC-MBU, Cambridge, UK (6) University of Bologna, Italy

MitCare ha lo scopo di trovare terapie efficaci per le malattie mitocondriali causate da difetti della fosforilazione ossidativa (OXPHOS), mediante strategie basate su: (i) by-pass del difetto biochimico; (ii) correzione di specifici difetti biochimici; (iii) correzione delle conseguenze patogenetiche in modelli cellulari e animali, con l’obiettivo ultimo di (iv) trasferire i risultati positivi sui pazienti. Difetti OXPHOS non solo causano un deficit energetico, ma anche una serie di altri effetti come la produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e altri composti tossici, attivazione dell’apoptosi, e alterazione di numerose vie omeostatiche e di segnale. Perciò, strategie terapeutiche razionali possono mirare a correggere diversi aspetti della disfunzione mitocondriale a livello cellulare e tissutale. MitCare è organizzato in tre programmi di lavoro (PL). In PL1 stiamo utilizzando una serie di linee cellulari ottenute da pazienti con difetti biochimici specifici, per caratterizzarli dal punto di vista della biogenesi mitocondriale, segnale calcio, autofagia e produzione di ROS. Le cellule sono state esposte a sostanze che modificano diverse vie omeostatiche mitocondriali, ad es. antiossidanti e agenti redox (idebenone), antiapoptotici (ciclosporina) e regolatori dell’autofagia (rapamicina) e saranno usate per uno screening ad alta produttività sfruttando la libreria di farmaci NIH. PL2 sta utilizzando diversi modelli murini di specifche malattie umane per testare gli effetti di attivatori della mitobiogenesi nel migliorare fenotipi muscolari o neurologici associati a difetti della OXPHOS. In particolare, abbiamo dimostrato che attivatori di PGC-1a, il principale induttore di geni OXPHOS, possono correggere il deficit motorio dei nostri modelli ricombinanti. In PL2 abbiamo anche provato con successo la terapia genica AAV-mediata e il trapianto di midollo emopoietico in modelli murini di encefalopatia etilmalonica e MNGIE, entrambe caratterizzate dall’accumulo di sostanze tossiche causate da anormalità del metabolismo mitocondriale. Infine, in PL2 abbiamo caratterizzato gli effetti della sovraespressione o dell’ablazione del gene OPA1, responsabile di atrofia ottica dominante sindromica e non sindromica.

OPA1 è un fattore a funzione multipla che regola la forma dei mitocondri, assicura il confinamento intramitocondriale del fattore apoptotico citocromo c e regola, probabilmente, la stabilità e integrità

Negli ultimi anni, molti studi epidemiologici hanno confermato che le malattie mitocondriali sono tra le malattie genetiche più comuni ed un importante costo dal punto di vista sociale. Tuttavia, in contrasto con lo straordinario progresso nella comprensione delle loro basi biochimiche e molecolari, la nostra capacità di trattare queste condizioni rimane estremamente limitata. Il principale impedimento al progresso nella ricerca e nella terapia sono le piccole popolazioni di pazienti. Lo sviluppo di un registro informatico (via web) di pazienti con malattia mitocondriale è necessario per comprendere meglio i fenotipi e la storia naturale di queste patologie.

Il progetto GUP09004 ha avuto avvio nel febbraio 2010. Undici centri con esperienza nella medicina mitocondriale sono stati coinvolti.

Ad oggi, sono stati raccolti più di 1160 pazienti, con esordio sia pediatrico sia adulto. Il network ha raggiunto i seguenti obiettivi: 1. creazione di una rete Italiana di centri clinici con specifica esperienza; 2. creazione di un database informatico armonizzato con altre reti e database europei; 3. caratterizzazione di un amplio gruppo di pazienti.

Il nostro database consente molti studi, partendo sia dal fenotipo sia dal genotipo. Seguono due esempi: - Approccio basato sul fenotipo: intolleranza all’esercizio nelle malattie mitocondriali. La fatica e l’intolleranza all’esercizio sono sintomi comuni delle malattie mitocondriali, difficili da valutare clinicamente. Abbiamo osservato che più del 20% dei nostri pazienti riferisce intolleranza all’esercizio. Questo sintomo si associa a mutazioni specifiche (es. 3243A>G). I livelli di CK sono elevati nel 34% circa dei pazienti con intolleranza all’esercizio, non confermando l’idea che le CK sono normali nella grande maggioranza di questi pazienti.

Inoltre, tutti gli altri sintomi “miopatici” inclusi nel nostro database (mialgie, ipotrofia muscolare, ptosi palpebrale/oftalmoparesi, car-

82

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

diomiopatia) sono associati ad intolleranza all’esercizio. Le fibre “ragged red” e, maggiormente, le fibre COX-negative sono più frequenti nei pazienti con questo sintomo, mentre i livelli di lattato non sono in grado di predire la presenza o meno di intolleranza all’esercizio.

- Approccio basato sul genotipo: la mutazione 8344A>G nel nostro database. L’epilessia mioclonica con fibre “ragged red” (MERRF) è una rara sindrome mitocondriale, più comunemente associata alla mutazione 8344A>G del DNA mitocondriale. La maggior parte degli studi precedenti è basata su singoli casi o famiglie, o serie di pochi pazienti. Nel nostro database sono stati identificati 42 pazienti portatori della mutazione 8344A>G. La grande maggioranza di questi non presenta il fenotipo MERRF completo. Il mioclono è presente solo in un paziente su cinque, mentre le caratteristiche cliniche più comuni sono i segni e sintomi “miopatici”, l’epilessia generalizzata, l’ipoacusia, la ptosi palpebrale e la lipomatosi multipla. Alcuni soggetti asintomatici erano presenti. Il mioclono è più frequentemente associato con l’atassia che con le convulsioni generalizzate nei soggetti adulti con mutazione 8344A>G. Questi dati mostrano una maggior eterogeneità di quanto comunemente ritenuto. Inoltre, la MERRF potrebbe essere meglio definita come un’atassia mioclonica piuttosto che un’epilessia micolonica.

Studi multicentrici come questo sono assolutamente necessari per caratterizzare meglio il quadro clinico e la storia naturale di queste malattie, al fine di identificare possibili contromisure (farmacologiche, fisiche o di altro tipo) per queste malattie croniche, tuttora incorabili.

M. Mancuso, Angelini C., Bertini E., Carelli V., Comi G., Minetti C., Moggio M., Mongini T., Servidei S., Tonin P., Toscano A., Uziel G., Zeviani M., Siciliano G. The Nation-wide Italian Collaborative Network of Mitochondrial Diseases. Fatigue and exercise intolerance in mitochondrial diseases. Literature revision and experience of the Italian Network of mitochondrial diseases. Neuromusc. Disorders, 2012 Dec;22 Suppl 3:S226-9.

In miotubi C2C12 differenziati l’apparato per la sintesi dei dNTP è fortemente modificato. Il silenziamento di TK2 o dGK, ma non quello di p53R2, riduce del 50% il mtDNA e inaspettatamente abbassa tutti e 4 i dNTP, indipendentemente dalla specificità dei singoli enzimi. (4) Trasporto mt dei deossinucleotidi. Abbiamo studiato l’attività in situ del trasportatore PNC1 in cellule umane tramite manipolazioni genetiche ed esperimenti con precursori marcati. (5) Un modello di immunodeficienza in cellule T. Abbiamo simulato in vitro la deficienza per la fosforilasi dei nucleosidi purinici, enzima catabolico che mutando causa una grave immunodeficienza con sospetto interessamento mitocondriale. (6) Un topo knock-out per la 5’-deossinucleotidasi mt (mdN). Fibroblasti ko embrionali presentano scarsi effetti del difetto enzimatico su mtDNA e sui dNTP, probabilmente a causa di una compensazione da parte del corrispondente enzima citosolico.

ABSTRACT N. 114 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

GGP09019 287.500

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2009

Doimo Mara (1), Desbats Maria Andrea (1), Trevisson Eva (1), Casarin Alberto (1), Pertegato Vanessa (1), Cerqua Cristina (1), Cogliati Sara (2), Rodriguez Hernandez Maria Angeles (3), Santos Ocana Carlos (3), Clarcke Cathy (4), Enriquez Jose Antonio (5), Scorrano Luca (2), Navas Placido (3), Salviati Leonardo (1) (1) Clinical Genetics Unit, Department of woman and child health, University of Padova, Via Giustiniani 3, 35128, Padova, Tel +39.049.8211402, Fax +39.049.8211425, E-mail leonardo.salviati@unipd.it (2) Venitian Institute of Molecular Medicine, Padova (3) Department of Chemistry and Biochemistry, University of California, Los Angeles, CA, USA (4) Universidad Pablo de Olavide, Sevilla, Spain (5) Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III, Madrid, Spain

BIANCHI VERA

Totale €

243.700

BASI GENETICHE E TERAPIA DEL DEFICIT DI COENZIMA Q

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Telethon grant N.

GGP09207

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 113 Responsabile

SALVIATI LEONARDO

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2009

Scopo del nostro progetto è stato lo studio della patogenesi del deficit di coenzima Q (CoQ) e l’analisi di possibili strategie terapeutiche per questa malattia. Innanzitutto abbiamo contribuito all’identificazione di mutazioni del gene COQ6 in pazienti affetti da sindrome nefrosica steroido-resistente (SRNS).

COQ6 codifica una monoossigenasi che catalizza l’ossidazione del carbonio C5 dell’anello del CoQ. Il gene umano è espresso ubiquitariamente e produce due isoforme (a e b), che codificano proteine mitocondriali. L’isoforma a complementa un ceppo di S.cerevisiae deleto per il gene ortologo, mentre l’isoforma b è cataliticamente inattiva ma mantiene (almeno in parte) la sua stabilità strutturale. I lieviti deleti per COQ6 crescono in terreni contenenti glicerolo, ma esprimendo l’isoforma a di COQ6 si recuperano la crescita e in parte anche la produzione di CoQ. Ciò è stato utilizzato per validare la patogenicità di tutte le mutazioni identificate nei nostri pazienti, che tuttavia sembrano essere ipomorfiche (compresa una mutazione frameshift al C-terminale), confermando il fatto che un blocco totale nella biosintesi del CoQ è incompatibile con la vita. E’ interessante notare che i pazienti sembrano rispondere bene alla supplementazione orale di CoQ. Abbiamo inoltre scoperto che l’aploinsufficienza di COQ4 può causare deficit di CoQ, che risponde alla somministrazione di CoQ. Questo è l’unico gene COQ finora identificato a mostrare aploinsufficienza. I livelli d’espressione dell’allele residuo di COQ4 correlano con la gravità del deficit di CoQ. Il prodotto del gene COQ4 ha un ruolo fondamentale nella biosintesi di CoQ in lievito, in quanto esso organizza un complesso costituito dalla maggior parte dei prodotti dei geni COQ. Abbiamo dimostrato che questo complesso è presente anche in cellule di mammifero e che interagisce con i supercomplessi della catena respiratoria (RC).

Questa interazione è fisica e funzionale ed è necessaria per un’efficiente biosintesi di CoQ. Infatti le condizioni che aboliscono la formazione dei supercomplessi della RC inibiscono anche la biosintesi di CoQ. Ciò fornisce una spiegazione al fatto che spesso i difetti della RC si associano a deficit di CoQ, e giustifica il trattamento di questi pazienti con CoQ10. In seguito abbiamo ultimato la caratterizzazione di altri tre geni COQ umani, COQ5, COQ10b e ADCK2, necessari per la biosintesi di CoQ, o per la sua regolazione.

Abbiamo identificato due pazienti (finora è stato riportato in letteratura un singolo caso) affetti da sindrome cardio-facio-cutanea dovuta a mutazioni in BRAF, che presentavano deficit secondario di CoQ,

SBILANCIAMENTO DEI DEOSSINUCLEOTIDI, CONSERVAZIONE DEL DNA MITOCONDRIALE E MALATTIE MITOCONDRIALI Ferraro Paola, Frangini Miriam, Franzolin Elisa, Miazzi Cristina, Rampazzo Chiara, Reichard Peter, Bianchi Vera Department of Biology, University of Padova, Via Ugo Bassi 58B, 35131 Padova, Tel. +39.049.8276282, Fax +39.049.8276280, E-mail: vbianchi@bio.unipd.it

Le MDS, sindromi da deplezione del DNA mitocondriale (mt), sono malattie genetiche che colpiscono tessuti differenziati ad alta richiesta energetica. Mutazioni in geni nucleari che regolano la sintesi dei precursori (dNTP) del mtDNA causano MDS. Noi studiamo le conseguenze dell’innattivazione di tali geni per capire come mutazioni presenti in tutte le cellule dell’organismo abbiano una manifestazione fenotipica fortemente tessuto-specifica.

I dNTP vengono prodotti nel citoplasma e nei mitocondri da una rete di reazioni enzimatiche che varia a seconda della proliferazione cellulare. Quando il DNA nucleare viene replicato, i suoi precursori vengono prodotti in abbondanza dall’isoforma R1/R2 della ribonucleotide reduttasi (RNR) e dalla timidina chinasi citosolica. Quando le cellule diventano quiescenti questi 2 enzimi vengono degradati, la sintesi dei dNTP cala fortemente e dipende dall’isoforma R1/p53R2 della RNR, e dalle chinasi mt TK2 e dGK. Mutazioni nei geni per p53R2, TK2 o dGK causano MDS colpendo tessuti differenziati specifici.

Abbiamo studiato la sintesi dei dNTP in cellule quiescenti in vitro affrontando il problema della tessuto-specificità di tali mutazioni e facendo uso di fibroblasti derivati da pazienti con MDS, di linfoblasti e di cellule muscolari di topo. Sei i temi specifici affrontati: (1) sintesi di recupero dei dNTP in fibroblasti umani. L’assenza di alterazioni del mtDNA in 2 linee di fibroblasti con mutazioni in TK2 dipende dalle scarse esigenze energetiche dei fibroblasti quiescenti. Il recupero della deossiguanosina e dell’arabinosil-guanina dipende da enzimi citosolici e mt che le convertono nei corrispondenti trifosfati.

(2) p53R2 in fibroblasti umani. In fibroblasti quiescenti con mutazioni in p53R2 la sintesi de novo dei dNTP è fortemente ridotta, limitando la disponibilità di precursori per la riparazione del DNA e la replicazione del mtDNA. (3) Sintesi dei dNTP nelle cellule muscolari.

83

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

ABSTRACT N. 116

e che hanno beneficiato della somministrazione di CoQ. Infine, abbiamo testato se il bezafibrato potesse aumentare la biosintesi di CoQ in cellule di pazienti affetti da deficit primario, ma non abbiamo riscontrato alcun effetto. Il bezafibrato è stato comunque efficace in cellule di pazienti con difetti in SCO2 o altri geni mitocondriali.

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile

GASPARINI LAURA

Telethon grant N.

GGP10184

Totale €

423.700

Num Centri: 3

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2010

ABSTRACT N. 115 LEUCODISTROFIA AUTOSOMICA DOMINANTE DELL’ETÀ ADULTA: STUDIO TRASLAZIONALE DEI MECCANISMI GENETICI, MOLECOLARI E CELLULARI DI MALATTIA MEDIATI DALLA PROTEINA LAMINA B1 E CORRELAZIONE CON PARAMETRI CLINICI E NEURORADIOLOGICI

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neuromuscolari Responsabile

CONTE CAMERINO DIANA

Telethon grant N.

GGP10101

Totale €

128.000

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2010

Cortelli Pietro (2), Brusco Alfredo (3), Brussino Alessandro (3), Giorgio Elisa (3), Di Gregorio Eleonora (3), Capellari Sabina (2), Parchi Piero (2), Liguori Rocco (2), Lodi Raffaele (2), Vaula Giovanna (4), Contestabile Andrea (1), Denise Ferrera (1), Canale Claudio (1), Giacomini Caterina (1), Gasparini Laura (1)

CANALOPATIE DA CLORO EREDITARIE DEL MUSCOLO SCHELETRICO E DEL RENE: DAL GENOTIPO AL FENOTIPO E NUOVI APPROCCI FARMACOTERAPEUTICI Desaphy Jean-François, Liantonio Antonella, Pierno Sabata, De Bellis Michela, Imbrici Paola, Altamura Concetta, Dinardo Maria Maddalena, Camerino Giulia Maria, Scaramuzzi Antonia, Carbonara Roberta, Conte Camerino Diana

(1) Istituto Italiano di Tecnologia, Dept of Neuroscience and Brain Technologies, Via Morego 30, 16163 Genova Tel. +39 010 71781519; Fax +39 010 71781230; E-mail: laura.gasparini@iit.it (2) IRCCS Istituto delle Scienze Neurologiche di Bologna, UOC Clinica Neurologica, Ospedale Bellaria, University of Bologna, Dept. Of Biomedical and Neuromotor Sciences, Bologna (3) University of Torino, Dept of Medical Sciences, Torino, Italy (4) AO Città della Salute e della Scienza, Dept of Neurology, Torino, Italy

Dipartimento di Farmacia, Sezione di Farmacologia, Università di Bari, Via Orabona 4, 70125, Bari, Italy, Tel. +39.080.5442801, Fax +39.080.5442801, Email: diana.conte@uniba.it

Il progetto mira all’identificazione di farmaci per il trattamento di pazienti affetti da Miotonia Congenita (MC), inerente il muscolo scheletrico (parte#1), e dalla Sindrome di Bartter (BS) e dall’ipertensione sale-sensibile (SSH) riguardante i reni (parte#2). Queste malattie sono dovute a mutazioni/polimorfismi nei geni che codificano per canali al cloro della famiglia CLC (CLCN1, CLCNKB/BSND, CLCNKA). La farmacoterapia di queste patologie è sintomatica per la mancanza di modulatori specifici dell’attività dei canali CLC. Riguardo la parte#1, 8 mutazioni del gene CLCN1 responsabili di MC sono stati espressi in cellule HEK293 e le correnti al cloro registrate con il patch-clamp. Il meccanismo patogenetico è stato chiarito per molti ma non tutti i mutanti. Per meglio comprendere la relazione genotipo/fenotipo, stiamo valutando le possibili interazioni tra mutanti presenti contemporaneamente in pazienti eterozigoti con esperimenti di co-transfezione.

L’acetazolamide (ACTZ), inibitore dell’anidrasi carbonica, è usata empiricamente da pazienti affetti da MC. L’effetto dell’ ACTZ sul canale hClC-1 è stato valutato in cellule HEK293. In condizioni di [Cl-] simmetriche, il farmaco sposta la voltaggio-dipendenza del canale di circa -20 mV. Tuttavia, l’effetto si riduce in condizioni di bassi livelli di [Cl-]i, suggerendo un scarso effetto sulle correnti al cloro in condizioni patofisiologiche.

La mexiletina, bloccante dei canali al sodio (NaCh), è oggi il farmaco più usato nel trattamento della MC, sebbene vi sia la necessità di altri farmaci antimiotonici [Desaphy et al, Eur J Clin Pharmacol, 2012]. Parte della nostra ricerca è finalizzata alla caratterizzazione in vitro di bloccanti di NaCh, già in uso clinico o di nuova sintesi [Catalano et al, J Med Chem 2012; De Luca et al, Neuromuscul Disord 2012; Desaphy et al, Front Pharmacol 2012; De Bellis et al, Biophys J, in press; Desaphy et al, Mol Pharmacol revised]. Abbiamo creato un nuovo modello farmacologico animale di MC, che ci ha permesso di individuare vari composti con un efficacia antimiotonica fino a 70 volte superiore a quella della mexiletina [Desaphy et al, Neuropharmacol 2013].

Riguardo la parte#2, abbiamo studiato la farmacologia dei canali CLC-K/barttina espressi in cellule HEK293 con il patch-clamp. Uno studio di drug design ci ha permesso di identificare un derivato benzofuranico (SRA-36) capace di bloccare le correnti ClC-Ka con affinità 4 microM. Contrariamente a quanto misurato negli oociti di rana, l’acido niflumico (1-1000 microM) blocca ClC-Ka nelle cellule HEK293 a tutti i dosaggi. L’effetto di tali molecole su alcuni mutanti dei CLC-K è in corso di valutazione. Parallelamente, attraverso studi in vivo, abbiamo dimostrato che la somministrazione in acuto dei benzofurani a ratti normotesi provoca effetti diuretici e antiipertensivi [Liantonio et al, J Hypertens 2012]. Risultati preliminari indicano un effetto antiipertensivo mediato dai benzofurani anche in ratti spontaneamente ipertesi.

La leucodistrofia autosomica dominante (ADLD) è una malattia genetica rara associata con una sovraespressione della proteina nucleare Lamina B1 (LB1). Abbiamo identificato due famiglie ADLD portatori di una duplicazione del gene LB1 (Fam-1 e Fam-2, individuate rispettivamente da Partner 1 e 2) e una terza famiglia (ADLDTO) che presenta una delezione a monte del gene LB1 (senza duplicazione e mutazioni) che aumenta l’espressione di LB1.

L’analisi di 3 pazienti Fam-1 ha mostrato una sintomatologia clinica e vegetativa ampia. La disfunzione vegetativa è caratterizzata da insufficienza cardiovascolare e noradrenergica cutanea, con funzione cardio-vagale e innervazione colinergica della ghiandola sudoripara preservate. L’analisi longitudinale con risonanza magnetica è in corso. L’analisi di estratti proteici cerebrali di un paziente Fam-2 ha dimostrato la sovraexspressione di LB1 nella corteccia frontale, parietale ed occipitale, e nella sostanza grigia del cervelletto.

Dal punto di vista genetico, abbiamo definito i confini della duplicazione di Fam-1 e Fam-2 attraverso a-CGH. La duplicazione di Fam-1 si estende per 324,3 kb e un’inserzione di 12 bp è presente a livello del punto di rottura. La duplicazione di Fam-2 si estende per 154,5 kb e i punti di rottura presentano una regione di micro-omologia di 2 basi. Ipotizziamo che il meccanismo causante la duplicazione potrebbe essere il non-homologous end-joining (NHEJ). Tuttavia, in Fam-2, potrebbe essere coinvolto anche il fork-stalling templateswitching (FoSTeS).

In ADLD-TO, nessuna delle regioni evolutivamente conservate a monte della delezione da noi valutate con saggio dual-luciferasi ha mostrato attività regolatrice. Tuttavia, La circular chromosome conformation capture ha identificato quattro regioni non conservate in grado di legare il promotore di LB1, tre delle quali specifiche per il soggetto deleto. Un saggio dual-luciferasi ha mostrato che 2 di tali regioni, 1 nella delezione (presente nel paziente e nel controllo) e 1 a monte (presente solo nel paziente) si comportano come enhancer.

Abbiamo sviluppato colture di fibroblasti cutanei primari da 3 pazienti, 1 soggetto portatore e 6 non portatori di duplicazione, 1 paziente ADLD-TO e 9 volontari sani. Mediante microscopia confocale e a forza atomica, abbiamo dimostrato che la sovraespressione di LB1 è associata ad anomalie morfologiche e aumento della rigidità nucleare in fibroblasti di pazienti ADLD. Il profilo di espressione genica è stato analizzato attraverso microarray su mRNA estratto da fibroblasti e sangue intero di soggetti portatori e non portatori della duplicazione. L’analisi è ora in corso.

Infine, abbiamo generato un topo transgenico condizionale EGFPloxP-hLMNB1 che sovraesprime LB1 umana in seguito a ricombinazione da Cre. La caratterizzazione dei primi 8 fondatori ha rilevato bassi livelli di espressione di EGFP solo in cuore, fegato e polmoni.

Altri fondatori sono in corso di generazione e analisi.

84

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

ABSTRACT N. 117

ABSTRACT N. 118

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche

Responsabile

ORLACCHIO ANTONIO

Responsabile

Telethon grant N.

GGP10121

Telethon grant N.

GGP11189

Totale €

345.000

Totale €

306.000

Num Centri: 4

Durata (anni): 2

Anno d’inizio: 2010

Num Centri: 1

IDENTIFICAZIONE DI NUOVI GENI-MALATTIA NELLA PARAPLEGIA SPASTICA EREDITARIA

DAGA ANDREA

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2011

MODELLI DI FUNZIONE E DISFUNZIONE DI ATLASTINA Daga Andrea, Andreazza Camilla, Rossetto Maria Giovanna, Misticoni Giulia

Di Lullo Martina (1), Lombardi Federica (1), Carosi Laura (1,2), Mearini Marzia (1), Babalini Carla (1), D’Aloia Maria Michela (1), Montieri Pasqua (1), Gaudiello Fabrizio (1), Miele Marialuisa (1), Tessa Alessandra (3), Nesti Claudia (3), Pippucci Tommaso (5), Magini Pamela (5), Pereira Baptista Julia (5), Ciccone Roberto (6), Zuffardi Orsetta (6), Seri Marco (5), Santorelli Filippo Maria (3), Orlacchio Antonio (1,2)

Istituto Scientifico E. Medea, Conegliano Research Center, 31015 Conegliano, (Treviso), Italy

Le Paraplegia Spastiche ereditarie (HSPs) includono diverse malattie caratterizzate da debolezza e spasticità degli arti inferiori. Geneticamente le HSPs si dividono in autosomiche dominanti, autosomiche recessive e legate al cromosoma X. Clinicamente sono suddivise in pure e complicate, queste ultime caratterizzate dalla presenza di altri disturbi neurologici. Nonostante si manifestino come malattie dei muscoli degli arti inferiori, le HSPs sono causate da un difetto neuronale ovvero la degenerazione assonale retrograda dei neuroni che innervano i muscoli. SPG3A rappresenta la seconda causa più comune di HSP ed è dovuta a mutazione del gene atlastina-1. I nostri studi sul gene omologo in Drosophila hanno consentito di dimostrare che la proteina atlastina esercita una funzione fondamentale nel mantenimento della struttura del reticolo endoplasmatico, controllando la fusione omotipica delle sue membrane.

Nel corso del primo anno abbiamo ottenuto i seguenti risultati 1. Abbiamo fatto importanti progressi nella comprensione del meccanismo di funzionamento di atlastina. Un 3-helix bundle (3HB) che si trova nel dominio di mezzo della proteina è necessario per la sua oligomerizzazione. Inoltre, il legame del GTP induce una modifica conformazionale che riorienta il dominio GTPasico rispetto al 3HB che favorisce l’oligomerizzazione ma l’idrolisi del GTP è necessaria per la fusione completa. Questo indica che legame e idrolisi del GTP esercitano ruoli distinti nella funzione di atlastina. Infine abbiamo dimostrato che la distanza tra le membrane determinata dall’oligomerizzazione di atlastina è determinante per la fusione ed il suo aumento inibisce questo processo.

2. Abbiamo generato linee transgeniche per le mutazioni patologiche indicate nel progetto e prodotto le proteine corrispondenti in batteri. Abbiamo così potuto stabilire che queste mutazioni patologiche si comportano sia in vivo sia in vitro come parziali loss of function ma non mostrano effetti dominanti negativi o neomorfici.

Questi risultati suggeriscono che la malattia è causata da aploinsufficienza.

3. Abbiamo analizzato l’attività di atlastina-1 in vitro dopo averla ricostituita in liposomi. Esperimenti di fusione eseguiti in parallelo con atlastina di Drosophila mostrano che atlastina-1 in vitro non possiede attività di fusione. Simili analisi per le altre atlastine umane sono in corso.

4. Sebbene non sia ancora stato iniziato lo screen genetico per l’identificazione di interattori dell’atlastina, abbiamo identificato reticulon e REEP come interattori genetici antagonistici di atlastina.

Questo risultato è molto importante perché mutazioni in geni appartenenti ad entrambe queste famiglie sono stati identificate nell’uomo come responsabili di HSP. I nostri studi indicano che reticulon è molto probabilmente il mediatore della fissione delle membrane del reticolo endoplasmatico e quindi contrasta in vivo l’attività fusogena di atlastina.

(1) Laboratorio di Neurogenetica, CERC-IRCCS Santa Lucia, Via del Fosso di Fiorano 64, 00143 Roma, Tel. 06.501703308; Fax 06.501703312; E-mail: a.orlacchio@hsantalucia.it (2) Dipartimento di Medicina dei Sistemi, Università di Roma “Tor Vergata”, Roma (3) Laboratorio di Medicina Molecolare e Neurogenetica delle Malattie Neurodegenerative, Dipartimento di Medicina Molecolare, IRCCS Stella Maris, Calambrone (Pisa) (4) Istituto di Neuropsichiatria Infantile, Università di Pisa, Pisa (5) Dipartimento di Scienze Mediche e Chirurgiche, Università di Bologna, Bologna (6) Dipartimento di Medicina molecolare, Università di Pavia, Pavia

Le paraparesi spastiche ereditarie (HSP) costituiscono un gruppo geneticamente eterogeneo di malattie neurodegenerative caratterizzate da un progressivo disturbo del passo dovuto alla spasticità e alla debolezza degli arti inferiori. Sebbene la prevalenza stimata delle HSP in Europa sia di circa 1/100000, questi disordini causano importanti problemi di salute che portano ad un progressivo deterioramento funzionale e ad un vero e proprio handicap. Questa patologia può essere ereditata in modo autosomico dominante (AD), autosomico recessivo (AR) o più raramente legato al cromosoma X (X-linked). Ad oggi sono stati identificati approssimativamente 50 geni HSP, definiti come geni dell’andatura spastica (“Spastic Gait Genes” o SPGs) ma solo la metà è stato clonato. Pertanto si prevede un’ulteriore eterogeneità.

Il nostro laboratorio di ricerca si occuperà di caratterizzare le famiglie con HSP non ancora diagnosticate sia al livello clinico che molecolare, di mappare nuovi loci genetici e di identificare nuovi geni causativi di HSP utilizzando nuove tecniche di biologia molecolare, tra cui l’ibridazione genomica comparativa su microarray (Array-Comparative Genomic Hybridization o Array-CGH) e l’analisi di risequenziamento dell’intero esoma; in ultima analisi ci occuperemo di correlare le caratteristiche cliniche dei pazienti con i dati genetici ottenuti.

L’impiego di uno specifico array-CGH, il MotorChip, disegnato per i disordini muscolari, ci ha permesso di identificare nuove delezioni/duplicazioni geniche in un gruppo di pazienti con AD-HSP. Inoltre, abbiamo trovato nuove mutazioni in geni noti, associati a forme dominanti o recessive della malattia (AD-HSP o AR-HSP). Abbiamo clonato il gene SPG12/RTN2. Le mutazioni identificate sono state associate ad una forma pura e ad esordio precoce di HSP. Abbiamo inoltre dimostrato che la proteina codificata da RTN2 interagisce con una serie di altre proteine HSP, responsabili della corretta forma del reticolo endoplasmatico (RE), rafforzando così l’ipotesi che un’anormale morfogenesi di questo organello rappresenti un meccanismo patogenico della malattia.

In sintesi, i nostri dati hanno aumentato la lista delle varianti geniche associate alle diverse forme di HSP, ampliato lo spettro dei geni causativi noti ed incrementato le nostre conoscenze relative alla patogenesi di questa patologia.

Referenze: 1. Guidubaldi A et al: Novel mutations in SPG11 cause hereditary spastic paraplegia associated with early-onset levodopa-responsive Parkinsonism. Movement Disorders 2011, 26:553-6 2. Orlacchio A et al: Late-onset hereditary spastic paraplegia with thin corpus callosum caused by a new SPG3A mutation. Journal of Neurology 2011, 258: 1361-63 3. Montenegro G et al: Mutations in the ER-shaping protein reticulon 2 cause the axon-degenerative disorder hereditary spastic paraplegia type 12. The Journal of Clinical Investigation 2012, 122:538-44

ABSTRACT N. 119 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile

LIBERI GIORDANO

Telethon grant N.

GGP08057

Totale €

235.800

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2008

CARATERIZZAZIONE MOLECOLARE DEI PROCESSI METABOLICI CONTROLLATI DALLA PROTEINA SEN1/SETX E DIFETTIVI NELLE SINDROMI NEURODEGENERATIVE AOA2 E ASL4 Alzu Amaya (1), Bermejo Rodrigo (1), Begnis Martina (1), Lucca Chiara (1), Piccini Daniele (1), Carotenuto Walter (1), Saponaro Marco (1), Brambati Alessandra (1,2), Cocito Andrea (1), Foiani Marco (1,3), Liberi Giordano (1,2)

85

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

biquitinazione della frataxina. Abbiamo effettuato uno screening funzionale utilizzando una library commerciale di siRNA diretti contro circa 600 differenti E3 ligasi. Il sistema si basa sull’uso di un costrutto di fusione frataxina-prolabel, che, quando trasfettato in cellule, genera un segnale luminoso proporzionale alla quantità di frataxina presente. Da questo screening abbiamo selezionato alcuni candidati che saranno ora testati in diversi sistemi cellulari.

1. Rufini A, Fortuni S, Arcuri G, Condò I, Serio D, Incani O, Malisan F, Ventura N, Testi R. Preventing the ubiquitin-proteasome-dependent degradation of frataxin, the protein defective in Friedreich’s ataxia. Hum Mol Genet. 2011 Apr 1; 20(7):1253-61.

(1) The FIRC Institute of Molecular Oncology (IFOM) Foundation, Via Adamello, 16, 20139, Milano. At IGM-CNR: Tel. 0382.546364, E-mail: giordano.liberi@igm.cnr.it (2) Istituto di Genetica Molecolare del Consiglio Nazionale delle Ricerche (IGMCNR), Pavia (3) DSBB-Università degli Studi di Milano, Milano

Mutazioni nel gene Senataxina, che codifica per una DNA/RNA elicasi evolutivamente conservata, causano due gravi malattie neurodegenerative, l’atassia associata ad aprassia oculomotoria di tipo 2 (AOA2) e la forma 4 di sclerosi laterale amiotrofica giovanile (ALS4).

Utilizzando approcci genetici, genomici e di analisi degli intermedi di replicazione, abbiamo scoperto un ruolo chiave della proteina Senataxina di lievito nel coordinare la replicazione con la trascrizione del DNA (Alzu et al., 2012. Cell). Abbiamo osservato che la proteina Senataxina si muove con la forca di replicazione. Cellule mutate per la Senataxina accumulano intermedi di replicazione aberranti e di ibridi DNA-RNA quando la forca si scontra frontalmente con geni trascritti dalla RNA polimerasi II (RNAPII). Questi difetti replicativi correlano con l’accumulo di segnali di danno al DNA e instabilità genomica in mutanti senataxina. Complessivamente i nostri dati suggeriscono che la proteina Senataxina è reclutata alle forche di replicazione e previene il loro danneggiamento rimuovendo gli ibridi DNA-RNA che si accumulano durante le collisioni tra replicazione e trascrizione RNAPII-dipendente. Abbiamo inoltre osservato che mutanti nella Sentaxina sono resistenti a sostanze che interferiscono con la formazione dei microtubuli, suggerendo che mutazioni nella Senataxina influenzano molteplici aspetti del metabolismo cellulare.

Nell’ insieme i nostri dati forniscono un nuovo quadro per la comprensione dei meccanismi patologici, a livello molecolare, causati da mutazioni nella Senataxina.

ABSTRACT N. 121 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile

465.700 Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2009

IL RUOLO DEL COMPLESSO PROTEASICO MITOCONDRIALE m-AAA NELLA PATOGENESI DELLE DEGENERAZIONI SPINOCEREBELLARI Di Bella Daniela (1), Magri Stefania (1), Fracasso Valentina (1), Plumari Massimo (1), Granata Magda (2), Muzi Falconi Marco (2), Taroni Franco (1) (1) S.O. Genetica delle Malattie Neurodegenerative e Metaboliche, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta, via Celoria 11, 20133 Milano, Tel. +39.02.23944580, Fax +39.02.700548648, E-mail: taroni.f@istituto-besta.it (2) Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie, Università degli Studi di Milano

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche TESTI ROBERTO

Telethon grant N.

GGP11102

Totale €

373.000

Num Centri: 1

GGP09301

Totale € Num Centri: 2

ABSTRACT N. 120 Responsabile

TARONI FRANCO

Telethon grant N.

Durata (anni): 3

Le atassie spinocerebellari dominanti (SCA) sono un gruppo eterogeneo di malattie neurologiche caratterizzate da disfunzione del cervelletto. Abbiamo recentemente scoperto che mutazioni in eterozigosi nel gene AFG3L2 (ATPase family gene 3-like2) causano la forma SCA28. Insieme a paraplegina, AFG3L2 è un componente del complesso mitocondriale m-AAA, una metalloproteasi altamente conservata coinvolta nel controllo di qualità delle proteine mitocondriali e nella loro maturazione. Il presente progetto si propone di analizzare le basi molecolari e i meccanismi patogenetici che determinano i processi neurodegenerativi alla base dell’atassia spinocerebellare dominante SCA28 e di una forma di paraparesi spastica ereditaria autosomica recessiva denominata SPG7 e causata da mutazioni nel gene che codifica il partner di AFG3L2 paraplegina.

Abbiamo osservato che AFG3L2 è espresso in modo elevato e selettivo nelle cellule cerebellari di Purkinje. L’analisi mutazionale ha dimostrato che le mutazioni in AFG3L2 causano ca. il 3% delle SCA di origine non definita. L’analisi funzionale in un modello cellulare di lievito (yta10del/yta12del) privo del complesso m-AAA ha dimostrato che le mutazioni (>20) localizzate nei domini funzionali proteasico e ATPasico causano un difetto respiratorio e una riduzione della capacità di processare i substrati. In un gruppo di mutanti, la coespressione di paraplegina non complementa il difetto respiratorio mentre la coespressione di AFG3L2 selvatico causa una riduzione della crescita cellulare, suggerendo che queste mutazioni agiscano mediante un meccanismo dominante negativo. Per la maggior parte delle mutazioni, tuttavia, la coespressione di paraplegina comporta una reversione del difetto respiratorio, suggerendo che in questi casi il meccanismo molecolare sia l’aploinsufficienza o un effetto dominante negativo debole. Abbiamo pertanto analizzato la possibile cosegregazione di mutazioni in AFG3L2 e paraplegina in pazienti con sindromi spinocerebellari identificando 3 pazienti con mutazioni eterozigoti funzionalmente rilevanti in entrambi i geni. I nostri dati indicano che la cosegregazione di mutazioni in entrambi i componenti del complesso m-AAA può determinare un quadro clinico complesso, espandendo così lo spettro dei fenotipi associati a mutazioni di AFG3L2.

Per meglio comprendere il ruolo del complesso m-AAA nella patogenesi di SCA28, abbiamo effettuato uno screening genetico in ceppi di lievito yta10del/yta12del che sovraesprimono AFG3L2 umano selvatico o mutato. Le cellule yta10del/yta12del/afg3l2E691K sono state trasformate con una libreria genomica multicopia di lievito e selezionate sulla base della soppressione del fenotipo respiratorio.

Con questa strategia è possibile identificare proteine che regolino l’attività e l’espressione di m-AAA, svolgano una funzione correlata o siano implicate in vie alternative. Quaranta cloni sono stati isolati da 12.000 trasformanti. Sedici di essi sono stati ulteriormente validati per la capacità di sopprimere il fenotipo. Benchè siano necessarie ulteriori indagini per poter stabilire il meccanismo alla base della

Anno d’inizio: 2011

STUDIO DI NUOVE STRATEGIE TERAPEUTICHE PER L’ATASSIA DI FRIEDREICH Rufini Alessandra, Fortuni Silvia, Arcuri Gaetano, Serio Dario, Cavallo Francesca, Benini Monica, Malisan Florence, Condò Ivano, Testi Roberto Laboratory of Signal Transduction, Department of Biomedicine and Prevention, University of Rome “Tor Vergata”, Via Montpellier 1, 00133 Rome, Italy, Tel. 06.72596503; Fax 06.72596505, E-mail: roberto.testi@uniroma2.it

L’Atassia di Friedreich è una malattia genetica neurodegenerativa causata da ridotti livelli di espressione della proteina mitocondriale frataxina. La gravità della malattia è correlata strettamente alla quantità di frataxina residua. Gli attuali approcci terapeutici sono quindi mirati ad aumentare i livelli di frataxina. Questo può in principio essere raggiunto aumentando la velocità di trascrizione del gene della frataxina o interferendo con la sua degradazione. Abbiamo in precedenza dimostrato che la frataxina è degradata attraverso il sistema ubiquitina/proteasoma e abbiamo identificato la lisina 147 come l’unica lisina presente sulla frataxina responsabile della sua ubiquitinazione e degradazione. Inoltre, abbiamo descritto la potenzialità terapeutica dell’uso di molecole che interferiscono con il pathway di ubiquitinazione della frataxina, per prevenirne la degradazione e innalzarne i livelli in cellule di pazienti [1]. Queste molecule sono state selezionate in silico per la loro capacità di interagire con la tasca molecolare contenente la lisina 147 sulla frataxina e sono risultate in grado di prevenire l’ubiquitinazione della frataxina e di aumentarne i livelli funzionali in cellule di pazienti. Lo scopo dei nostri attuali studi è l’identificazione di composti nuovi e più efficaci che prevengano l’ubiquitinazione della frataxina. In un processo iterativo, le molecole sono selezionate, da database di milioni di composti chimici commercialmente disponibili, per la loro capacità di docking sulla frataxina nella regione comprendente la lisina 147. La loro efficacia è poi validata analizzando la loro capacità di prevenire l’ubiquitinazione e innalzare i livelli di frataxina in cellue. I dati raccolti da questo processo di selezione hanno permesso l’identificazione dei determinanti molecolari che conferiscono attività ai composti selezionati. Questi dati sono sfruttati per il disegno di nuove molecole. L’efficacia di questi nuovi composti è valutata quindi in linee cellulari e poi in modelli murini della malattia.

Un’altra attraente strategia terapeutica per aumentare i livelli di frataxina è l’inibizione dell’enzima specifico che ubiquitina la frataxina.

Stiamo quindi cercando di identificare l’E3 ligasi responsabile dell’u-

86

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

soppressione, tutte le proteine identificate appaiono svolgere funzioni rilevanti per il metabolismo e l’omeostasi dei mitocondri.

Di Bella D, et al. Mutations in the mitochondrial protease gene AFG3L2 cause dominant hereditary ataxia SCA28. Nat Genet 2010; 42:313-321.

dente all’umana Met666Arg, identificata nello screening di una casistica italo-francese come quella con manifestazioni fenotipiche più precoci), ci permetterà di chiarire meglio il meccanismo patogenetico di SCA28. Oltre alla caratterizzazione fenotipica con test motori, funzionali e biochimici, il modello murino sarà utilizzato per ottenere modelli cellulari come i MEF (Fibroblasti Embrionali Murini) e le cellule del Purkinje.

ABSTRACT N. 122

ABSTRACT N. 123

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile

BRUSCO ALFREDO

Telethon grant N.

GGP12217

Totale € Num Centri: 2

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile

322.800 Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2012

GGP12235

Totale €

423.900

Num Centri: 1

ATASSIA SPINOCEREBELLARE TIPO 28 (SCA28): MODELLI CELLULARI E ANIMALI PER IDENTIFICARE I MECCANISMI PATOGENETICI ED I POTENZIALI BERSAGLI TERAPEUTICI

CASARI GIORGIO

Telethon grant N.

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2012

DINAMICA MITOCONDRIALE ED OMEOSTASI DEL CALCIO SONO FATTORI DETERMINANTI PER LA NEURODEGENERAZIONE ASSOCIATE A MUTAZIONI DI AFG3L2. DALL’IPOTESI MOLECOLARE AL TRATTAMENTO PRECLINICO

Mancini Cecilia (1), Hoxha Eriola (2), Roncaglia Paola (3), Brussino Alessandro (1), Cagnoli Claudia (1), Lo Buono Nicola (1), Funaro Ada (1), Altruda Fiorella (4), Turco Emilia (4), Porcelli Anna Maria (5), Gustincich Stefano (6), Gasparre Giuseppe (7), Tempia Filippo (2), Brusco Alfredo (1)

Maltecca Francesca, Cassina Laura, Consolato Francesco, Baseggio Elisa, Casari Giorgio Università Vita-Salute San Raffaele e Ospedale San Raffaele, Via Olgettina 58, 20132 Milano. Tel +39.02.26433502, Fax +39.02.26436352, E-mail: casari.giorgio@hsr.it

(1) University of Turin, Dept. of Medical Sciences, via Santena 19, 10126 Torino, Tel. +39.011.6334480, E-mail: alfredo.brusco@unito.it (2) Dept. of Neuroscience, National Institute of Neuroscience-Italy (INN) University of Turin (3) European Bioinformatics Institute, Cambridge,United Kingdom (4) Dept. of Molecular Biotechnology and Life Sciences, University of Turin (5) Dipartimento di Biologia Ev. Sp., Università di Bologna (6) Neurobiology Sector, SISSA/ISAS, Trieste, Italy (7) Dipartimento di Scienze ginecologiche, ostetriche e pediatriche, Università di Bologna

L’atassia spinocerebellare di tipo 28 (SCA28) è una forma di atassia spinocerebellare progressiva recentemente identificata e caratterizzata da incoordinazione motoria, nistagmo, oftalmoparesi e sintomi piramidali. Numerose mutazioni responsabili della malattia sono state identificate nel gene AFG3L2. AFG3L2 è una proteina mitocondriale che forma complessi omo-oligomerici ed etero-oligomerici con paraplegina, i complessi m-AAA, sulla membrana mitocondriale interna. Questi complessi sono responsabili del controllo qualità delle proteine e partecipano alla regolazione proteolitica di OPA1, evento necessario per la fusione mitocondriale.

Abbiamo caratterizzato un modello murino deficitario di AFG3L2 che ricapitola le caratteristiche dei pazienti SCA28. Infatti, mostra una progressiva atassia dovuta a degenerazione e perdita delle cellule del Purkinje (PCs), tratto tipico delle SCAs. Nel modello SCA28 le PCs subiscono una degenerazione a cellule scure (dark-cell degeneration). Questa particolare forma degenerativa origina da un’aumentata concentrazione intracellulare di Ca2+ associata a disfunzione del sistema glutammatergico. Nella SCA28 la degenerazione dark-cell origina da disfunzione mitocondriale che si esprime con un’inefficiente capacità di internalizzazione di Ca2+ come evento primario e precoce nella patogenesi della SCA28.

Dati ottenuti recentemente supportano la nostra ipotesi patogenetica. Infatti, abbiamo dimostrato che i mitocondri in cui AFG3L2 non è funzionale hanno una diminuita capacità di internalizzare Ca2+.

Questo difetto non è una conseguenza della globale alterazione nella omeostasi del Ca2+ cellulare, né della diminuita capacità di internalizzazione del Ca2+ nei mitocondri, dato che il calcio citosolico e il potenziale di membrana mitocondriale rimangono inalterati.

Inoltre, esperimenti in cellule permeabilizzate rivelano un’inalterata velocità di assorbimento mitocondriale di Ca2+ nelle cellule Afg3l2/-, il che indica la presenza di un corretto meccanismo di assorbimento del calcio. Tuttavia, i dati sperimentali mostrano che la gestione difettiva del Ca2+ nelle cellule Afg3l2-/- è causata da frammentazione del reticolo mitocondriale, secondaria a disfunzione respiratoria ed alla conseguente proteolisi di OPA1. La frammentazione mitocondriale riduce le massa mitocondriale in contatto con il reticolo endoplasmico, ostacolando il corretto buffering del Ca2+ nel reticolo mitocondriale. La sovraespressione di OPA1 ristabilisce il corretto e ampio reticolo mitocondriale in cellule Afg3l2-/- e recupera il difetto di buffering mitocondriale di Ca2+, pur non ripristinando la respirazione mitocondriale. Questi dati recenti, che mettono in relazione la morfologia mitocondriale con l’omeostasi del calcio, offrono una nuova chiave di lettura dei meccanismi molecolari responsabili della degenerazione causata da mutazioni di AFG3L2.

L’Atassia SpinoCerebellare 28 (SCA28) è una patologia autosomica dominante caratterizzata da atassia cerebellare progressiva e difetti oculomotori. Il gene mutato AFG3L2 (18p11.21) codifica per la proteina omonima facente parte del complesso esamerico mitocondriale m-AAA proteasi (ATPases Associated with a variety of cellular Activities).

Mediante analisi di espressione GenomeWide sono stati confrontati gli RNA estratti da linee linfoblastoidi (LCL) di quattro pazienti SCA28 (p.G671R, p.T654I, p.M666T e p.M666V) e sei controlli sani.

I dati ottenuti hanno evidenziato 76 geni differenzialmente espressi nei pazienti rispetto ai controlli che sono stati raggruppati in cluster omogenei con l’aiuto dei software Gene Ontology e NCBI. Sono risultati alterati i pathways coinvolti nella 1) regolazione della crescita cellulare; 2) apoptosi; 3) risposta agli stress ossidativi.

L’implicazione dei pathways è stata confermata con esperimenti funzionali sulle linee cellulari linfoblastoidi di sette pazienti e altrettanti controlli sani.

1) La velocità di proliferazione cellulare delle linee LCL dei pazienti SCA28 è minore rispetto ai controlli sani (p<0,001) e l’analisi del ciclo cellulare ha evidenziato un incremento del 15% rispetto ai controlli della percentuale di cellule ferme in fase G0/G1 nelle linee dei pazienti (p<0,001).

2) Le linee SCA28 dimostrano un aumentata mortalità cellulare: solo il 40% delle cellule SCA28 risulta vitale mentre nei controlli la vitalità è del 60% (p<0,05).

3) I livelli di perossidazione lipidica delle linee SCA28 sono aumentati rispetto alle linee di controlli sani, in condizioni basali (p<0.05), al contrario l’analisi al FACS della DCFH-DA non ha evidenziato alcuna differenza.

Per escludere difetti nell’attività della catena respiratoria, la sintesi dell’ATP è stata misurata negli LCL trattati con specifici agenti inibitori dei complessi, senza evidenziare alcuna differenza significativa.

Anche il contenuto di ATP totale (mitocondriale + citoplasmatico) è comparabile tra pazienti SCA28 e controlli sani.

In ultimo, è stata valutata l’integrità del DNA mitocondriale escludendo delezioni o riarrangiamenti con long-range PCR e anomalie del numero di copie del mtDNA con un saggio di Real-Time PCR. In conclusione, l’analisi di espressione Genome Wide seppur effettuata su LCL dei pazienti SCA28, un tessuto non direttamente colpito dalla patologia, ha permesso l’identificazione di tre pathways correlabili con la malattia. La diminuzione della crescita e proliferazione cellulare, l’aumento della mortalità e l’incremento dei livelli di stress ossidativo dimostrati nelle linee dei pazienti potrebbero spiegare in parte la patogenesi della SCA28 e permettere l’identificazione di futuri approcci terapeutici per le SCA. Il modello murino knockin, sviluppato grazie ad un precedente Grant Telethon, esprimente la mutazione p.Met665Arg (corrispon-

ABSTRACT N. 124 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile

GGP10066

Totale €

218.300

Num Centri: 1

87

DELIA DOMENICO

Telethon grant N.

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2010

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

DIFETTI EREDITARI NEL SEGNALE DEL DANNO AL DNA CHE CAUSANO NEURODEGENERAZIONE: COMPRENSIONE DEI MECCANISMI

e DDR non hanno dimostrato di interagire direttamente.

Recentemente abbiamo dimostrato in uomo, topo e zebrafish che DICER e DROSHA, ma non fattori pù a valle dell’RNAi, sono necessari per attivare il DDR in seguito a danno al DNA esogeno e stress genotossico indotto da oncogeni, come evinto dallo studio della formazione di foci del DDR e in saggi di checkpoint. I foci del DDR sono sensibili al trattamento con RNasi A e RNA prodotti da DICER e Drosha sono capaci di ripristinare foci del DDR in cellule trattate con RNase-A. Attraverso sequenziamento profondo di RNA e lo studio dell’attivazione del DDR ad un sito unico di taglio nel genoma, abbiamo dimostrato che la formazione di foci di DDR richiede RNA sito-specifici (che abbiamo battezzato come DDRNAs), che agiscono in una maniera MRE11-RAD50-NBS1-dipendente per alimentare il DDR. DDRNAs, sia sintetizzati chimicamente o prodotti in vitro mediante taglio da DICER, sono sufficienti per ripristinare il DDR in cellule trattate con RNasi A, anche in assenza di altri RNA cellulari.

Proponiamo un ruolo diretto di una nuova classe di ncRNAs nel controllo dell’attivazione del DDR a siti di danno al DNA.

Carlessi Luigi, Fusar Poli Elena, Delia Domenico Fondazione IRCCS Istituto Nazionale Tumori, Department of Experimental Oncology, Via Amadeo 42, 20133 Milano, Italy, Tel +39.02.23902641, E-mail: domenico.delia@istitutotumori.mi.it

I disordini neurologici ereditari causati da mutazioni nei geni coinvolti nella risposta e nella riparazione del danno al DNA comprendono circa venti patologie, la più diffusa delle quali è l’Atassia-telangiectasia (A-T). A-T è una rara sindrome neurodegenerativa ad esordio precoce causata da deficit della protein-chinasi ATM, la quale svolge un ruolo fondamentale nell’attivazione e nella propagazione della risposta cellulare al danno al doppio filamento di DNA. ATM può anche essere attivata attraverso la formazione di ponti disolfuro da sostanze ossidanti, ed in questo contesto agisce come sensore di specie reattive dell’ossigeno e promuove l’attività antiossidante proteggendo la cellula dall’accumulo delle stesse. La neuropatogenesi di A-T potrebbe quindi riflettere difetti nella risposta al danno al DNA e/o allo stress ossidativo.

Fondamentali per lo studio dei meccanismi alla base della neuropatologia risultano essere i modelli in vivo ed in vitro, ma i topi knockout per ATM non ricapitolano la patologia a livello del sistema nervoso centrale. In questo lavoro abbiamo utilizzato un metodo basato sulla riprogrammazione cellulare per generare un nuovo modello umano di A-T in vitro per poter studiare le conseguenze della mancanza di ATM nelle cellule neuronali.

Abbiamo ottenuto cellule pluripotenti indotte (iPSC) da fibroblasti di pazienti A-T con mutazioni troncanti nel gene ATM e da fibroblasti normali di controllo grazie all’introduzione dei fattori di pluripotenza Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc, e da queste abbiamo ottenuto cellule progenitrici neurali (NPC) Nestina-positive attraverso la formazione di corpi embrioidi e la successiva generazione di rosette neurali. In seguito al differenziamento, le NPC hanno dato origine ad un’alta percentuale di neuroni elettrofisiologicamente attivi ed esprimenti betaTubIII, MAP2 e GABA. I nostri risultati mostrano che la densità massima di corrente di sodio è simile nelle cellule di controllo e nelle A-T. Inoltre, la capacità di riparazione per escissione di base, che è importante per la rimoziane dei danni al singolo filamento di DNA causati da stress ossidativo, appare essere normale nelle cellule AT. La ridotta espressione di p53, gammaH2AX, pSMC1 e pKap1 in neuroni A-T irradiati indica tuttavia una chiara attenuazione della risposta al danno al DNA in queste cellule. Inoltre, i neuroni mutanti mostrano difetti nell’espressione dei marker pre- e postsinaptici Sinaptofisina e PSD95, così come della proteina associata alla crescita neuronale SCG10 e delle proteine interagenti con i canali del potassio KChIP. Questo modello in vitro rappresenta un importante nuovo strumento per l’esplorazione dei meccanismi che causano la degenerazione dei neuroni umani privi di ATM e potrebbe inoltre essere utilizzato nel futuro per l’individuazione di target terapeutici.

ABSTRACT N. 126 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile

GGP12059 210.600

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2012

Kumar Amit (1), Lucca Chiara (1), Pawan Singh (1), Ghadeer Shubassi (1), Michele Mazzanti (2), Marco Foiani (1,2) (1) IFOM, Via Adamello 16, 20139 Milano, Tel. +39.02.574303238, E-mail: marco.foiani@ifom.eu (2) Università degli Studi di Milano

L’instabilità cromosomica è una caratteristica delle cellule cancerose e dell’invecchiamento cellulare. Le protein chinasi ATM e ATR controllano l’integrità del genoma, coordinando la progressione nel ciclo cellulare con i processi di replicazione, riparazione e ricombinazione del DNA. Mutazioni che impediscono il corretto funzionamento di ATM o ATR sono associate con le malattie Atassia Telangiectasia (A-T) e Sindrome di Seckel, rispettivamente. Le manifestazioni cliniche di A-T e della sindrome di Seckel e la presenza di substrati di ATM e di ATR al di fuori del nucleo suggeriscono che queste chinasi mantengano l’omeostasi cellulare sia in condizioni fisiologiche che in condizioni di stress. Recentemente abbiamo suggerito un ruolo per Mec1, l’ortologo di ATR in lievito, nel mantenimento della stabilità genomica tramite il controllo dell’associazione di regioni della cromatina con il poro nucleare, mediato da eventi di fosforilazione delle proteine nucleoporine. I nostri dati recenti mostrano che, in determinate condizioni, ATR è localizzata alla membrana nucleare, e possiamo ipotizzare che tale localizzazione sia la connessione tra i cambiamenti del nucleo e quelli del citoscheletro che avvengono in condizioni di stress cellulare. Abbiamo ipotizzato che la tensione topologica causata dalle attività dei cromosomi potesse indurre stress meccanico a livello della membrana nucleare attraverso quelle regioni della cromatina che sono fisicamente connesse con la membrana stessa. Pertanto abbiamo esteso il nostro studio ai vertebrati ed abbiamo analizzato se la chinasi ATR fosse in grado di rilevare la tensione presente alla membrana plasmatica o a quella nucleare, in condizioni di stress indotto in vari modi, incluso lo stress meccanico generato sulla singola cellula. I nostri dati suggeriscono un legame tra la trasduzione del segnale meccanico che avviene attraverso la il citoscheletro connesso con la membrana plasmatica cellulare e le attività nucleari mediate da ATR. L’invecchiamento precoce è un altro aspetto che caratterizza i pazienti A-T. Pertanto abbiamo cominciato ad analizzare la risposta di checkpoint nelle cellule vecchie, usando il lievito come sistema modello. Abbiamo osservato che, a differenza delle cellule giovani, quelle vecchie hanno una ridotta capacità di attivare il checkpoint e di riparare i danni al DNA indotti da esposizione a raggi UV. Utilizzando Rapamicina e Metformina, due farmaci che hanno come bersaglio TORC1 e sono in grado di modulare la longevità, abbiamo parzialmente migliorato tanto la risposta di checkpoint quanto la riparazione del danno. Oltre a causare danni al DNA, il trattamento con raggi UV provoca anche danno alle proteine; proteine danneggiate si accumulano anche nelle cellule durante l’ invecchiamento.

Uno degli effetti dell’inibizione di TORC1 è la regolazione della sintesi proteica, che può influenzare la capacità delle cellule di risponde-

D’ADDA DI FAGAGNA FABRIZIO

Totale €

331.500

SISTEMI MODELLO PER IDENTIFICARE GENI E FATTORI NEI PROCESSI MOLECOLARI DIFETTIVI NEI PAZIENTI DI ATAXIA TELANGIECTASIA

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Telethon grant N.

GGP12171

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 125 Responsabile

FOIANI MARCO

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2012

CONTROLLO DELLA ATTIVITÀ DI ATM DA PARTE DI RNA GENERATI DA DICER E DROSHA d’Adda di Fagagna Fabrizio (1,2) (1) Telomeres and cellular senescence, Tel. 02.574303227, Fax 02.574303231, E-mail: fabrizio.dadda@ifom.eu (2) Telomeres Lab, CNR Institute of Molecular Genetics Via Abbiategrasso 207, 27100 Pavia, Tel. +39 0382 5461

La risposta al danno al DNA (DDR) è una via di segnalazione che arresta la proliferazione delle cellule che subiscono eventi genotossici per preservare la stabilità del genoma. ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) è una protein chinasi apicale del DDR. DICER e DROSHA sono ribonucleasi cruciali nel RNA interference (RNAi). Componenti dell’RNAi si pensa si siano evoluti per preservare la stabilità del genoma dagli attacchi di virus e elementi genetici mobili. Prodotti RNA generati dal DICER e DROSHA sono coinvolti nella modulazione della cromatina, silenziamento genico e cancro. Finora, RNAi

88

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

ABSTRACT N. 128

re ai danni al DNA. In accordo con l’ipotesi che la modulazione dell’attività di TORC1 migliora la risposta al danno al DNA tramite cambiamenti nella traduzione, abbiamo osservato che mutazioni che affliggono la sintesi proteica hanno effetto sull’attivazione del checkpoint e la riparazione del danno al DNA.

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile

132.000

GGP09134

Totale €

414.500 Durata (anni): 3

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2010

RUOLO DELLE MUTAZIONI DEL RECETTORE GABAA NELLA EPILESSIA IDIOPATICA GENERALIZZATA: UNO STUDIO SULLO SVILUPPO

BENFENATI FABIO

Telethon grant N. Num Centri: 3

GGP10135

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 127

CANCEDDA LAURA

Telethon grant N.

Szczurkowska Joanna (1), Cwetsch Andrzej (1), Fernandez Ignacio (1), Perlini Laura (1), Succol Francesca (1), Cossette Patrick (2), Benfenati Fabio (1), Barberis Andrea (1), Cancedda Laura (1)

Anno d’inizio: 2009

RUOLO DELLE MUTAZIONI NEI GENI DELLE SINAPSINE NELL’EPILESSIA E NELL’AUTISMO

(1) Department of Neuroscience and Brain Technologies, Istituto Italiano di Tecnologia (IIT), Via Morego 30, 16163 Genova, Italy, Tel. +39.010.71781521/751, Fax +39.010.71781230, E-mail: laura.cancedda@iit.it (2) Neurologue, clinique d’épilepsie CHUM-Hôpital Notre-Dame, Montreal, Canada

Lignani Gabriele (1), Fornasiero Eugenio (2), Greco Barbara (1), Fassio Anna (1), Baldelli Pietro (1), Leocani Letizia (2), Valtorta Flavia (2), Benfenati Fabio (1) (1) Department of Experimental Medicine, University of Genova, Viale Benedetto XV n. 3, 16132 Genova, Italy, Tel. 010.3538183, Fax 010.3538194, E-mail: fabio.benfenati@iit.it (2) Division of Neuroscience, San Raffaele Scientific Institute and Vita-Salute University, Milano, Italy

L’ epilessia familiare generalizzata idiopatica (EGI) è una rara forma di epilessia associata a mutazioni monogeniche del recettore GABAA (GABAAR). Mentre l’analisi funzionale delle mutazioni in vitro ha fornito evidenze di una prevedibile diminuzione dell’ inibizione cellulare che favorirebbe un fenotipo epilettico in vivo, altri scenari realistici sono possibili. Infatti, la trasmissione GABAergica svolge un ruolo fondamentale durante lo sviluppo del sistema nervoso e i pazienti affetti da EGI familiare esprimono GABAAR mutati e quindi non funzionali per tutta la vita, ossia anche durante lo sviluppo del cervello. Abbiamo ipotizzato che parte dei fenotipi di EGI familiare possano dipendere dall’aberrante sviluppo neuronale, causato a sua volta da un’alterata trasmissione GABAergica.

Abbiamo studiato i meccanismi di base dello sviluppo che possono tradurre mutazioni del GABAAR in fenotipi epilettici. In particolare, abbiamo studiato se la trasmissione sinaptica attraverso i GABAAR difettivi durante lo sviluppo neuronale in vitro possa influenzare l’espressione temporale di distinte subunità (alfa e delta) del GABAAR stesso. Inoltre, abbiamo sviluppato un modello corticale in vivo di una rara EGI familiare correlata ad una mutazione della subunità gamma (la subunità più abbondante del GABAAR) mediante accoppiamento delle tecniche di RNA inferferente, che abbiamo generato contro la subunità gamma, e di elettroporazione in utero della corteccia somatosensoriale. Infine, stiamo sviluppando anche un modello cerebellare in vivo di EGI familiare correlata ad una mutazione della subunità delta (altamente espressa nel cervelletto) del GABAAR mediante l’uso di un nuovo dispositivo di elettroporazione (ideato dal nostro laboratorio) che permette un’efficiente manipolazione genetica dei neuroni che popolano il cervelletto. In questi modelli animali, abbiamo valutato la migrazione neurale e la maturazione morfo/funzionale di neuroni con GABAAR mutato. Successivamente, studieremo una possibile correlazione tra i difetti di sviluppo e la propensione a crisi epilettiche. Questo studio farà luce sul possibile effetto negativo delle mutazioni sul GABAAR sullo sviluppo neuronale e sui possibili fenotipi epilettici. I nostri esperimenti amplieranno le conoscienze sullo sviluppo della EGI familiare e potranno eventualmente fornire una finestra per l’intervento terapeutico prima che si manifesti il fenotipo epilettico.

Lo scopo del progetto è di chiarire i meccanismi molecolari attraverso dello sviluppo di un fenotipo epilettico e/o autistico nei topi knockout (KO) per le sinapsine (Syn) e valutare l’impatto funzionale delle mutazioni dei geni umani delle Syn associate ad epilessia e/o autismo.

1. Ruolo funzionale dei geni delle sinapsine In studi di patch-clamp condotti nella regione CA1 di fettine ippocampali di topi KO per SynI/II/III (TKO), abbiamo osservato un forte sbilanciamento nella trasmissione glutamatergica e GABAergica con aumento degli eEPSCs e diminuzione degli eIPSCs e un simile sbilanciamento dell’espressione della plasticità sinaptica a brave termine. Si è inoltre osservata una diminuita corrente tonica di GABA, responsabile dello stato depolarizzato dei neuroni piramidali e della diminuzione del freno inibitorio GABAB sul rilascio di glutammato. Nei terminali eccitatori e inibitori dei topi TKO, le vescicole sinaptiche (SV) sono disperse nell’assone a causa di un’aumentata frazione di SV mobili. Questo fenomeno non è influenzato dalla stimolazione, ma è completamente eliminato dal blocco cronico dell’attività, indicando che le Syns sono fondamentali per mantenere dinamicamente l’organizzazione strutturale delle sinapsi durante periodi d’intensa attività e che un loro difetto è in grado di alterare marcatamente la trasmissione inibitoria.

Registrazioni EEG dei topi TKO hanno mostrato scariche epilettiche sia spontanee sia evocate seguite da una fase post-ictale con attività ritmica a 4 Hz associata ad immobilità dell’animale. Sono state anche rilevate variazioni nell’attività corticale basale con un rallentamento del picco ad alta frequenza nello spettro di potenza dell’EEG. Da un punto di vista comportamentale, la delezione dei tre geni delle Syns determina un’alterazione dei comportamenti sociali, consistente con lo sviluppo di tratti simil-autistici, prima della comparsa del fenotipo epilettico. Inoltre, i topi SynII KO hanno mostrato un fenotipo più severo, con deficit nella memoria sociale e nell’esplorazione di ambienti nuovi e un aumento di comportamenti perseverativi. I risultati dimostrano che i geni Syn sono coinvolti nella generazione di tratti comportamentali autistici e identificano i topi Syn KO come modello sperimentale per autismo ed epilessia.

2. Impatto funzionale delle mutazioni di SYN1 associate a epilessia e/o autismo.

Mutazioni del gene SYN1 sono state identificate in associazione a epilessia e autismo nell’uomo. La trasmissione sinaptica è stata studiata in neuroni primari ippocampali SynI KO trasdotti per esprimere la mutazione Q555X. Una diminuzione del pool di pronto rilascio nelle sinapsi inibitorie e una diminuzione della probabilità di rilascio nelle sinapsi eccitatorie ha provocato una forte riduzione del rilascio evocato in ambedue le sinapsi. Questo effetto era accompagnato da un aumento del rilascio asincrono più intenso nelle sinapsi eccitatorie. La Q555X-hSynI ha inoltre indotto maggiore facilitazione e potenziamento post-tetanico nelle sinapsi eccitatorie e più profonda depressione nelle sinapsi inibitorie. Queste variazioni sono associate a un forte aumento del firing e bursting nell’attività di rete. I dati indicano che uno sbilanciamento tra sinapsi eccitatorie e inibitorie nella plasticità e nella dinamica del rilascio indotto dalla forma mutante della SynI può scatenare uno stato di ipereccitabilità delle reti nervose compatibile con la patogenesi di epilessia e/o autismo.

ABSTRACT N. 129 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile

NOBILE CARLO

Telethon grant N.

GGP12078

Totale €

194.600

Num Centri: 1

Durata (anni): 2

Anno d’inizio: 2012

IDENTIFICAZIONE DI NUOVI GENI PER L’EPILESSIA TEMPORALE LATERALE AUTOSOMICA DOMINANTE IN FAMIGLIE SENZA MUTAZIONI IN LGI1 Fanciulli Manuela (2), Dazzo Emanuela (1), Furlan Sandra (1), Michelucci Roberto (3), Nobile Carlo (1) (1) Istituto di Neuroscienze del CNR, Sede di Padova, viale G. Colombo 3, 35121 Padova, Tel. 049.8276072; Fax 049.8276040; E-mail: nobile@bio.unipd.it (2) Porto Conte Ricerche, Alghero (3) Dipartimento Scienze Neurologiche, Ospedale Bellaria, Bologna

89

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

L’ epilessia temporale laterale autosomica dominante (ADLTE) è una sindrome genetica clinicamente omogenea caratterizzata da crisi focali con aura uditiva o afasica. Le mutazioni che causano l’ ADLTE sono state identificate nel gene LGI1 in meno del 50% delle famiglie. Altri geni responsabili dell’ ADLTE devono ancora essere identificati per chiarire i meccanismi patogenetici dell’ ADLTE e per consulenza genetica. Per identificare nuovi geni per l’ ADLTE, abbiamo condotto una analisi di copy number variations e linkage con SNParray di 16 famiglie LGI1-negative e mappato 3 loci con valori HLOD suggestivi (>2.0) sui cromosomi 2p, 7q e 19p. Altri loci con HLOD positivi sono sui cromosomi 4q e 11q. In generale, questi risultati suggeriscono che 3-5 altri geni hanno mutazioni causative della sindrome. Per identificare questi geni, il sequenziamento esomico appare essere la metodica più appropriata. Un problema principale emerso con l’uso di questa tecnologia è l’ alto numero (circa 100 in media) di varianti rare potenzialmente patogene che vengono identificate nei geni di ciascun individuo. Nel nostro studio, i dati di linkage generati con SNP-array ci aiuteranno a superare questi problemi in quanto la ricerca di mutazioni patogene potrà essere ristretta alle regioni con valori di LOD score positivi in ciascuna famiglia. Ci proponiamo di risequenziare l’intero esoma di 2 affetti di ciascuna famiglia usando il kit Agilent SureSelect per la cattura degli esoni e il sequenziatore Illumina HiSeq2000. Le varianti comuni (nonsinonimo, splice-site e indel) presenti nelle banche dati pubbliche verranno filtrate e le varianti nonsinonimo rare verranno analizzate col programma SIFT per identificare quelle con probabile effetto deleterio sulle proteine. Soltanto le varianti geniche trovate in entrambi i membri affetti di ciascuna famiglia e in particolare quelle che si troveranno nei picchi di linkage comuni a più famiglie saranno ulteriormente studiate. In esperimenti pilota condotti su 2 famiglie con ADLTE, abbiamo trovato pochissime varianti potenzialmente patogeniche all’interno dei picchi di linkage comuni a più famiglie, ciascuna in un gene diverso. Questi geni sono perciò ottimi candidati per l’ ADLTE e verranno ulteriormente studiati. In generale, se un gene è trovato mutato in famiglie diverse, esso molto probabilmente è implicato nell’ ADLTE, specialmente se vengono trovate mutazioni che troncano la proteina. Se la funzione di un nuovo gene per l’ ADLTE è già conosciuta, essa fornirà informazioni sui meccanismi patogenetici dell’ ADLTE. Viceversa, studi preliminari biochimici e funzionali verranno condotti, il cui disegno varierà a seconda che la proteina venga secreta, sia un recettore di membrana o svolga una funzione intracellulare. Inoltre, le proteine mutate verranno saggiate per determinare gli effetti delle mutazioni su di esse.

INTRODUZIONE. Il meccanismo patogenetico dell’ADNFLE è oscuro.

L’espressione eterologa di nAChR mutanti suggerisce un guadagno della funzione recettoriale, ma resta da spiegare come un’epilessia umana focale possa insorgere da recettori iperfunzionali ampiamente espressi in vaste aree cerebrali. Recenti modelli di roditori ‘knock-in’ indicano che le mutazioni associate all’ ADNFLE alterino il bilancio dei neurotrasmettitori nella neocorteccia. Il primo modello condizionale di ADNFLE suggerisce che questi effetti sorgano durante lo sviluppo delle connessioni sinaptiche.

DESCRIZIONE DEL PROGETTO. Modulando l’espressione di beta2V287L, determineremo gli stadi sensibili per l’epilettogenesi. Il fenotipo epilettico sarà valutato in vivo mediante elettrocorticografia (ECoG). In parallelo, determineremo le principali alterazioni elettrofisiologiche e neuroanatomiche indotte dall’espressione di beta2V287L, su fettine neocorticali di animali adulti. La regolazione del rilascio di neurotrasmettitori e l’eccitabilità saranno soprattutto studiate nel V strato della corteccia prefrontale. Studieremo inoltre come l’espressione di beta2-V287L alteri la transizione tra la funzione eccitatoria e quella inibitoria della trasmissione GABAergica durante lo sviluppo del sistema talamocorticale (TC). È questo un meccanismo probabile per produrre alterazioni irreversibili dei circuiti nervosi. Successivamente, proveremo a prevenire lo stabilirsi dell’ipereccitabilità, applicando trattamenti farmacologici durante le fasi più sensibili dello sviluppo delle connessioni sinaptiche.

ABSTRACT N. 131 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile

GGP12147 179.700

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2010

Scalmani Paolo (2), Farisello Pasqualina (1,3), De Stasi Angela Michela (1), Marcon Iacopo (4), Losi Gabriele (4), Cammarota Mario (4), Ratto Gian Michele (5), Arosio Daniele (6), Franceschetti Silvana (2), De Curtis Marco (2), Carmignoto Giorgio (4), Bacci Alberto (3,7), Mantegazza Massimo (8), Fellin Tommaso (1) (1) Istituto Italiano di Tecnologia, Genova, Italia. - Dept. of Neuroscience and Brain Technologies, Istituto Italiano di Tecnologia, via Morego 30, 16163 Genova, Italia. Tel. 010.71781549; Fax 010.71781230; E-mail: tommaso.fellin@iit.it (2) Fondazione IRCCS Istituto Neurologico C.Besta, Milano, Italia (3) Fondazione EBRI “Rita Levi-Montalcini”, Roma, Italia (4) CNR-Istituto di Neuroscienze ed Università di Padova, Padova, Italia (5) CNR- Istituto di Neuroscienze, Pisa, Italia (6) Istituto di Biofisica, CNR, Trento, Italia (7) ICM - Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, Paris, France (8) IPMC, CNRS UMR7275 and University of Nice-Sophia Antipolis, Valbonne, France

BECCHETTI ANDREA

Totale €

479.700

MECCANISMI CELLULARI ALLA BASE DELLE DISFUNZIONI CEREBRALI OSSERVATE IN UN MODELLO MURINO DI SINDROME DI DRAVET

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Telethon grant N.

GGP10138

Totale € Num Centri: 5

ABSTRACT N. 130 Responsabile

FELLIN TOMMASO

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2012

RUOLO DEI RECETTORI NICOTINICI NELLA PATOGENESI DELL’EPILESSIA NOTTURNA AUTOSOMICA DOMINANTE DEL LOBO FRONTALE: STUDIO SU UN MODELLO MURINO CONDIZIONALE

Mutazioni nei canali del sodio voltaggio-dipendenti NaV1.1 sono associate alla sindrome di Dravet (SD). Tali mutazioni inducono una disfunzione nelle proteine NaV1.1 ed una conseguente perdita di funzione. Studi recenti hanno suggerito che gli interneuroni potrebbero essere la principale popolazione cellulare coinvolta nella genesi della SD. Tuttavia, quali sottotipi interneuronali siano coinvolti e quali siano le conseguenze funzionali della disfunzione interneuronale sulle reti sinaptiche è attualmente sconosciuto. Per rispondere a queste domande abbiamo utilizzato topi transgenici NaV1.1 ‘knock out’ (NaV1.1-KO), un modello murino di SD. Combinando l’uso di fettine di ippocampo e corteccia con registrazioni di patchclamp, abbiamo caratterizzato le proprietà elettrofisiologiche di differenti tipi di interneuroni. Le cellule registrate sono state caratterizzate in base alle loro proprietà elettrofisiologiche ed alla ricostruzione morfologica a posteriori. In alcuni esperimenti, gli interneuroni sono stati identificati utilizzando topi transgenici che esprimono appropriate proteine fluorescenti in specifici sottotipi interneuronali.

I nostri risultati mostrano che la maggior parte degli interneuroni ippocampali possiede una ridotta frequenza di scarica di potenziali d’azione (PA) in topi NaV1.1-KO rispetto ad animali di controllo. La pendenza della fase di depolarizzazione e l’ampiezza del PA sono significativamente ridotti in animali NaV1.1-KO. In fettine di tessuto corticale, gli interneuroni che esprimono parvalbumina e somatostatina generano significativamente meno PA in topi NaV1.1-KO rispetto alle stesse cellule in animali di controllo. Questi esperimenti suggeriscono che la funzione di differenti tipi di interneuroni è alterata in questo modello sperimentale, in contrasto con quanto è sta-

Meneghini Simone (2), Del Monte Noemi (2), Aracri Patrizia (2), Curia Giulia (5), Arcangeli Annarosa (3), Amadeo Alida (4), Becchetti Andrea (1) (1) Dipartimento di Biotecnologie e Bioscienze, Università di Milano-Bicocca, 20126, Milano, Italy, Tel. 02.64483301; Fax 02.64483565; E-mail: andrea.becchetti@unimib.it (2) Dipartimento di Biotecnologie e Bioscienze, Università di Milano-Bicocca (3) Dipartimento di Patologia e Oncologia Sperimentali e L.I.Ge.M.A. Università di Firenze (4) Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie, Università di Milano.

(5) Dipartimento di Scienze Biomediche, Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia

OBIETTIVI GENERALI. Ci proponiamo di comprendere le principali caratteristiche patogenetiche dell’epilessia frontale notturna autosomica dominante (ADNFLE) e costituire modelli farmacologici pre-clinici che possano indicare come prevenire il processo epilettogeno.

OBIETTIVI SPECIFICI. L’ADNFLE è spesso causata da mutazioni nei geni relativi a subunità di recettori neuronali eteromerici per l’acetilcolina di tipo nicotinico (nAChRs). Stiamo in particolare studiando lo sviluppo del sistema colinergico neocorticale ed i suoi più rilevanti aspetti funzionali, anatomici e farmacologici in topi transgenici (Tg) che esprimono in modo condizionale la subunità beta2-V287L (sistema TET-off), da noi precedentemente caratterizzata in vitro.

90

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

to proposto in studi precedenti (i.e.: disfunzione selettiva di interneuroni esprimenti parvalbumina). Registrazioni di correnti spontanee postsinaptiche mostrano che la ridotta eccitabilità interneuronale osservata negli esperimenti descritti in precedenza è associata ad una diminuita trasmissione sinaptica GABAergica. Anche la corrente tonica GABAergica è ridotta in animali NaV1.1-KO. Utilizzando sensori proteici analizzeremo se le modifiche a carico della rete interneuronale siano associate ad alterazioni nella concentrazione intracellulare dello ione cloruro. L’attività dei circuiti corticali è inoltre alterata in topi Nav1.1-KO: la propagazione degli eventi epilettiformi è significativamente più veloce e le attività oscillatorie dei neuroni in vivo mostrano dinamiche alterate. Infine, esperimenti combinati di video-EEG durante crisi convulsive indotte da ipertermia mostrano significativa attività pre-ictale in topi Nav1.1-KO. Questi risultati dimostrano che una modifica nella funzione di differenti tipi di interneuroni potrebbe contribuire alle alterazioni cerebrali osservate in un modello animale di SD.

STUDI IN MODELLI GENETICI DI TOPO E PAZIENTI AFFETTI DA EMICRANIA EMIPLEGICA FAMILIARE TIPO 1 PER SVELARE L’INTERAZIONE FRA NEURONI SENSORIALI E CELLULE NEUROINFIAMMATORIE NEI GANGLI TRIGEMINALI COME BASE PER LO SVILUPPO DEL DOLORE EMICRANICO Ceruti Stefania (1), Fabbretti Elsa (4), Vilotti Sandra (4), Magni Giulia (1,2), Merli Davide (1), Verderio Claudia (3), Abbracchio Mariapia (1), Nistri Andrea (4) (1) Laboratory of Molecular and Cellular Pharmacology of Purinergic Transmission, Dept. Pharmacological and Biomolecular Sciences, Università degli Studi di Milano, Milan (2) Dept. Drug Discovery and Development, Italian Institute of Technology (IIT), Genoa (3) CNR, Institute of Neuroscience, Milan (4) International School for Advanced Studies (SISSA), Via Bonomea 265, 34136 Trieste, Italy, Tel. 040.3787718 Fax 040.3787249, E-mail: nistri@sissa.it

ABSTRACT N. 132

Lo scopo principale del nostro progetto è la comprensione dei meccanismi di trasduzione del dolore da parte dei gangli trigeminali nell’emicrania, di svelare la ragione dell’ipersensibilità neuronale e come bloccarla. Ci proponiamo di identificare i processi (incluso i messaggeri chimici focalizzandoci sui sistemi purinergici) attraverso i quali i neuroni trigeminali interagiscono con le cellule gliali satelliti (SGCs) e le modalità di reclutamento di cellule neuroimmuni che possono creare una latente sensibilizzazione neuronale per cui si facilita l’attacco emicranico. A tale fine, noi utilizziamo trigeminali gangli di un modello genetico murino di emicrania, cioè il Cav2.1 R192Q mutant knock-in (KI) mouse che esprime la mutazione umana tipica dell’emicrania familiare emiplegica di tipo 1 (FHM1).

I nostri dati sui recettori metabotropici purinergici mostrano che il peptide algogeno bradichinina (BK), somministrata a culture primarie di ganglio trigeminale, induce release neuronale del mediatore del dolore calcitonin gene-related peptide (CGRP), il quale a sua volta potenzia i recettori P2Y1 ADP-sensibili e quelli P2Y2 UTP-sensibili delle SGCs (Ceruti et al., J Neurosci 31:3638-49, 2011). L’aumentata attività dei recettori P2 è causata da aumentata espressione proteica, specialmente per il sottotipo P2Y1, ed a modulazione del traffico recettoriale verso i lipid rafts di membrana. Sono in corso studi in vivo sul ruolo di tali recettori nei processi del dolore. E’ comunque interessante che il farmaco anti-emicranico sumatriptan blocchi sia il release di CGRP che il potenziamento dei recettori gliali P2Y. Inoltre, la BK incrementa la produzione della prostaglandina PGE2, effetto inibito dal bloccante della COX-1 acido acetilsalicilico ( che deprime anche il release di CGRP). Questi risultati suggeriscono un ruolo dei recettori attivati da nucleotide adeninici e uracilici nel meccanismo di azione dei principali farmaci anti-emicrania.

A differenza delle colture wildtype (WT) di gangli trigeminali, le colture R192Q KI mostrano attivazione basale di macrofagi con incrementato release di TNFalfa e potenziate correnti neuronali mediate da recettori P2X3. L’agente infiammatorio LPS stimola la formazione di TNFalfa mRNA e facilita le correnti P2X3 dei neuroni WT con più rapida ripresa dalla desensitizzazione (Franceschini et al. Purinergic Signal. 2012 in press). Inoltre, co-colture di gangli WT or KI con macrophages esogeni significativamente stimola la fagocitosi di tali cellule (Franceschini et al. BMC Neurosci 2012 in press). Questi dati suggeriscono un profilo neuroinfiammatorio basale dei gangli KI tale da facilitare il release di mediatori endogeni (incluso ATP) per attivare i recettori P2X3 ed amplificare i segnali nocicettivi da parte dei neuroni sensoriali. La complessa interazione che si verifica nei gangli KI già in condizioni basali rafforza la teoria del ruolo dei recettori purinergici nel dolore emicranico.

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile

CARMIGNOTO GIORGIO

Telethon grant N.

GGP12265

Totale €

446.800

Num Centri: 3

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2012

RUOLO DELLE INTERAZIONI TRA ASTROCITI ED INTERNEURONI NEL CONTROLLO DELLE CRISI EPILETTICHE IN MODELLI DI MALATTIE NEUROLOGICHE MONOGENICHE ASSOCIATE AD EPILESSIA Carmignoto Giorgio (1), de Curtis Marco (2), Ratto Gian Michele (3) (1) Istituto di Neuroscienze del Consiglio Nazionale delle Ricerche - Viale Giuseppe Colombo 3, 35121, Padova, Tel. 049.8276075, Fax 049.8276040, Email: giorgio.carmignoto@bio.unipd.it (2) Fondazione I.R.C.C.S. Istituto Neurologico “Carlo Besta”, Milano (3) Istituto di Nanoscienze, CNR NEST, Pisa

I meccanismi alla base della genesi e della regolazione delle scariche epilettiche sono poco definiti. I nostri studi precedenti, sostenuti da Telethon, hanno rivelato che le cellule astrogliali sono in grado di promuovere la sincronia neuronale e contribuire alle scariche epilettiformi. Queste nuove scoperte ridefiniscono i principi di base che regolano l’ictogenesi nell’epilessia cambiando la nostra comprensione della generazione delle crisi nelle epilessie acquisite e genetiche.

Obiettivo generale del presente progetto in fase di attivazione è quello di chiarire ulteriormente il ruolo degli astrociti nella generazione delle crisi epilettiche. Riteniamo che l’inibizione GABAergica che controlla la generazione la propagazione delle scariche ictali possa essere modulata distintamente dagli astrociti. L’ipotesi che una disregolazione del signaling astrociti-interneuroni GABAergici contribuisca alla generazione delle crisi sarà studiata in due modelli animali di malattie neurologiche monogeniche. Nel modello di epilessia mioclonica severa dell’infanzia dovuto ad una mutazione lossof-function di un canale del sodio voltaggio-dipendente (topi KO Nav1.1), studieremo l’interazione reciproca tra astrociti e interneuroni GABAergici. In un modello di emicrania emiplegica familiare associato a crisi epilettiche, causata da un’alterazione negli astrociti della sodio-potassio ATPasi-alfa2 (topi ATP1A2/R887), studieremo se le crisi derivano da un ridotto assorbimento astrocitario di glutammato e di potassio. Ca2+ imaging del soma e dei processi degli astrociti, misurazioni del glutammato e del K+ e registrazioni elettrofisiologiche saranno utilizzati in fettine, in cervelli isolati in vitro e in vivo. Topi transgenici incrociati con topi GCamp3 saranno utilizzati per caratterizzare il signaling reciproco tra astrociti e neuroni/interneuroni durante la generazione e la propagazione delle crisi. I nuovi dati potranno chiarire in modo significativo la nostra comprensione dei meccanismi alla base della genesi e la regolazione delle scariche epilettiche. Gli astrociti dunque possono potenzialmente divenire l’obiettivo primario di nuovi approcci terapeutici nell’epilessia.

ABSTRACT N. 134 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile

419.100 Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2011

IL RUOLO DELLA NEUROSERPINA NELLA ENCEFALOPATIA FAMIGLIARE DA CORPI D’INCLUSIONE DI NEUROSERPINA Sessa Fabio (1), RIcagno Stefano (1), Bolognesi Martino (1), Manno Mauro (2), Martorana Vincenzo (2), Noto Rosina (2), Cupane Antonio (3), Levantino Matteo (3), Santangelo Maria Grazia (3), Miranda Elena (4), Lupo Giuseppe (4), Moriconi Claudia (4), Carucci Nicoletta (4), Timpano Valentina (4), Guadagno Noemi (4), Parisi Daniele (2,1)

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche NISTRI ANDREA

Telethon grant N.

GGP10082

Totale €

221.900

Num Centri: 2

GGP11057

Totale € Num Centri: 3

ABSTRACT N. 133 Responsabile

BOLOGNESI MARTINO

Telethon grant N.

Durata (anni): 2

Anno d’inizio: 2010

91

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

Negli ultimi anni è emerso chiaramente come, nelle malattie prioniche ereditarie (malattie incurabili del SNC causate da mutazioni nel gene che codifica la proteina prionica -PrP), la neurodegenerazione sia preceduta da disfunzioni sinaptiche, causate da un effetto negativo della PrP “misfolded”. Ci proponiamo di chiarire i meccanismi attraverso i quali la PrP difettiva altera la normale attività sinaptica, con l’obiettivo di elaborare strategie efficaci per il trattamento precoce della patologia.

Contesto e motivazioni: Il presente progetto si basa sulla nostra recente dimostrazione che la PrP mutata viene trattenuta nel reticolo endoplasmatico dove interagisce con la subunità Alpha2Delta-1 dei canali del calcio voltaggio dipendenti (VGCC), compromettendo pertanto l’inserzione del canale sulla superficie cellulare (Senatore et al., Neuron, 2012). Ci proponiamo di definire i meccanismi tramite cui il difetto nel traffico del canale è all’origine della neurodegenerazione e se questo processo può essere funzionalmente recuperato.

Disegno sperimentale. Utilizzeremo una serie di tecniche e diversi modelli transgenici di malattia da prioni per verificare l’ipotesi che il “misfolding” di PrP porti a difetti sinaptici e, infine, a morte neuronale. Più in particolare, si verificherà se la mancata inserzione di VGCC nella membrana plasmatica attivi meccanismi compensatori che provocano a loro volta un aumentato rilascio basale di glutammato. Investigheremo quindi se la PrP mutata alteri anche la corretta localizzazione e la funzione dei recettori NMDA, favorendo fenomeni di eccitossicità. Caratterizzeremo infine l’interazione tra PrP e subunità Alpha2Delta-1, con la prospettiva di individuare strategie che, inibendo l’associazione tra le due proteine, forniscano potenziali strategie innovative per l’intervento terapeutico.

Risultati attesi. Ci aspettiamo di definire se le anomalie nel traffico di proteine alla sinapsi possa essere all’origine di fenomeni eccitotossici. Questa informazione è essenziale per identificare nuovi bersagli molecolari e per elaborare strategie terapeutiche, che possano eventualmente utilizzare strumenti farmacologici già disponibili in clinica.

(1) Dipartimento di Bioscienze, Università di Milano, Via Celoria 26, Milano. Tel. +39.02.50314893, Fax +39.02.50314895, E-mail: martino.bolognesi@unimi.it (2) CNR Istituto di Biofisica, Palermo, Italia (3) Dipartimento Fisica, Università di Palermo, Italia (4) Dipartimento Biologia e Biotecnologie Charles Darwin, Università di Roma La Sapienza, Roma, Italia

La neuroserpina umana (NS) appartiene alla famiglia delle serpine (serine protease inhibitor). NS è una proteina glicosilata espressa principalmente nei neuroni ed inibisce specificamente il tissue plasminogen activator (tPA). Sei mutanti di NS inducono un accumulo di NS polimerica responsabile della FENIB, una malattia neurodegenerativa, caratterizzata da demenza ad esordio precoce, epilessia e morte neuronale.

UNIMI unità: Per studiare l’inibizione del tPA, un complesso stabile NS:tPA è stato ricostituito in soluzione usando mutanti inattivi del tPA. Da un’analisi cromatografica è emerso che le mutazioni non hanno influenzato la stabilità del complesso; due diversi complessi stabili sono stati isolati. In parallelo abbiamo anche isolato la forma latente di NS. La cristallizzazione di tutti questi campioni è attualmente in corso.

Inoltre, studiamo il meccanismo di polimerizzazione utilizzando due diversi approcci. A) Per individuare i residui coinvolti nella polimerizzazione, oligomeri di NS sono in fase di analisi mediante crosslinking e spettrometria di massa. B) Per chiarire l’architettura globale dei polimeri la cristallografia e la crio-microscopia elettronica saranno combinate. A questo scopo, anticorpi specifici in grado di riconoscere NS monomerica e polimerica sono utilizzati. La cristallizzazione di complessi NS:anticorpo è in corso.

IBF Unità: Studiamo il meccanismo di polimerizzazione NS in vitro.

Da studi di scattering e cromatografia, abbiamo individuato diversi processi coinvolti (attivazione, dimerizzazione, allungamento, frammentazione, inattivazione) e il loro ruolo nella formazione di polimeri (Noto et al 2012 PLoS ONE).

Abbiamo affrontato gli aspetti molecolari delle conformazioni funzionali e disfunzionali di NS. (I) un fingerprint spettroscopico dei diversi conformeri di NS sono stati individuati spettroscopicamente; i risultati preliminari di EPR e site-directed spin labelling indicano differenze nella loro dinamica e struttura, (ii) la struttura dei polimeri NS dipende dalle condizioni chimico-fisiche (Santangelo et al 2012 Proteine.), (iii) simulazioni di dinamica molecolare dimostrano l’esistenza di domini meccanicamente coerenti le cui perturbazioni locali influenzano le dinamiche globali di NS. UNIRO unità: Ci siamo concentrati sulla biologia cellulare delle varianti polimerogeniche di NS da due punti di vista: a) il ruolo che la N-glicosilazione svolge sulla stabilità di NS all’interno del reticolo endoplasmatico. I nostri risultati dimostrano che l’N-glicosilazione è importante per evitare la polimerizzazione e che può promuovere la degradazione di NS mutata. b) Abbiamo sviluppato un nuovo modello cellulare per lo studio della tossicità di NS polimerica, mediante trasfezione di NS wild type e delle varianti patologiche in cellule staminali neurali di corteccia murina. Tale modello possiede le principali caratteristiche della demenza FENIB: la formazione e l’accumulo di NS polimerica all’interno del reticolo endoplasmatico.

ABSTRACT N. 136 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile

MATTEOLI MICHELA GGP12115

Totale € Num Centri: 2

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2011

Forloni Gianluigi (1), Tagliavini Fabrizio (2), Artuso Vladimiro (3), Redealli Veronica (2), Lucca Ugo (1), Tettamanti Mauro (1), Albanese Yasmin (1), Roiter Ignazio (3) (1) Dipartimento di Neuroscienze, Istituto di Ricerche Farmacologiche “Mario Negri”, Via La Masa 19, 20156 Milano, Italy Tel.02.39014462; Fax 0239001916 (2) Fondazione IRCCS - Istituto Neurologico “Carlo Besta”, Milano, Italy (3) Dipartmento di Medicina Interna, Unità Operativa di Medicina, Oderzo ASL 9 Treviso ASL 9 Treviso, Italy

L’insonnia fatale familiare (FFI) è una malattia genetica neurodegenerativa caratterizzata da disturbo del sonno, iperattivazione del sistema autonomico e anomalie motorie. FFI appartiene al gruppo delle encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE) dette anche malattie da prioni. Le TSE sono malattie neurodegenerative trasmissibili caratterizzate da un fenotipo molto eterogeneo, i casi genetici sono associati a mutazioni sul gene che codifica per la proteina prion. FFI è una malattia autosomica dominante associata alla mutazione da acido aspartico ad asparagina sul codone 178 del gene prion in combinazione con la presenza di metionina sul codone polimorfico 129 (D178/M129). La malattia è devastante e normalmente porta a morte in meno di due anni, non ci sono ad oggi trattamenti efficaci. In questo progetto ci proponiamo di effettuare un trattamento preclinico con doxiciclina (DOXY) in soggetti a rischio genetico di sviluppare FFI. La potenziale efficacia della DOXY nelle TSE deriva da numerosi studi sperimentali e da due studi clinici osservazionali che in Italia e in Germania hanno dimostrato effetti positivi con questo farmaco nelle TSE e un’ottima tollerabilità. Sono stati genotipizzati 85 soggetti appartenenti ad una famiglia con membri affetti da FFI, alcuni di questi sono risultati portatori della mutazione D178/M129. Poiché la penetranza della malattia è elevata e la possibilità di cura alla comparsa dei sintomi è piuttosto remota, un trattamento preventivo con DOXY è stato proposto ai soggetti portatori della mutazione nati tra il 1958 e il 1969. Sulla base dell’ana-

374.800 Durata (anni): 3

237.200

INSONNIA FATALE FAMILIARE: TRATTAMENTO PREVENTIVO CON DOXICICLINA IN SOGGETTI A RISCHIO GENETICO DI MALATTIA

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Telethon grant N.

GGP10208

Totale € Num Centri: 3

ABSTRACT N. 135 Responsabile

FORLONI GIANLUIGI

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2013

LA PROTEINA PRIONICA MUTATA IMPEDISCE L’INSERZIONE DI CANALI PER IL CALCIO VOLTAGGIO-DIPENDENTI NELLA MEMBRANA PRESINAPTICA: ANALISI DEI MECCANISMI DI NEUROTOSSICITÀ E POTENZIALI STRATEGIE TERAPEUTICHE Matteoli Michela (1,2), Senatore Assunta (3), Morini Raffaella (1,2), Ghirardini Elsa (1,2), Verderio Claudia (4), Restelli Elena (3), Pozzoli Manuela (3), Bertani Ilaria (3), Chiesa Roberto (3) (1) Dip Biotecnologie Mediche e Medicina Traslazionale, via Vanvitelli 32, Università di Milano, Tel. 02.50317097, Fax 02.7490574, E-mail: michela.matteoli@unimi.it (2) IRCCS Humanitas, Rozzano (3) Dulbecco Telethon Institute and Mario Negri Institute for Pharmacological Research, Milano (4) CNR Istituto di Neuroscienze, Milano

Obiettivi generali e specifici

92

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

lisi storica della mortalità nei soggetti FFI appartenenti a questa famiglia (38 casi) è stato possibile stabilire che l’età più a rischio di sviluppare la patologia è fra i 50 e i 55 anni. Così, in uno studio a doppio cieco, soggetti portatori della mutazione che riceveranno DOXY (100 mg/die) saranno messi a confronto con i non portatori anch’essi appartenenti alla famiglia che riceveranno il placebo. Per mantenere nascosto il proprio genotipo ai soggetti che partecipano allo studio, anche i soggetti non portatori riceveranno per un breve periodo il trattamento con doxiciclina invece del placebo. Prima di iniziare il trattamento e ogni due anni tutti i soggetti saranno sottoposti ad un’analisi clinica approfondita per stabilire il loro stato di salute in relazione alla FFI. Sebbene le dimensioni del campione siano limitate, l’analisi statistica ci consentirà nell’arco di dieci anni di valutare l’efficacia del trattamento. Questo è il primo studio preventivo nella FFI che è reso possibile dalla possibilità unica di trattare, in condizioni controllate, un numero sufficientemente ampio di soggetti a rischio di sviluppare la malattia appartenenti alla stessa famiglia. Il protocollo dello studio è stato approvato definitivamente dai comitati etici nel dicembre 2011 e nel giugno 2012 il primo soggetto reclutato ha concluso le visite cliniche e neurologiche e ha iniziato il trattamento. Nel novembre 2012, 10 soggetti hanno concluso la valutazione clinica e neurologica iniziale.

da Abeta1-42 in cellule di neuroblastoma umano (SYSH-5Y) in coltura.

Allo scopo di valutare l’efficacia in vivo di Abeta1-6A2V-TAT(D), abbiamo utilizzato uno strain di C. elegans (CL4176) che esprime l’Abeta1-42 umana nelle cellule muscolari. In questi nematodi transgenici, l’accumulo di Abeta1-42 sotto forma di oligomeri nelle cellule muscolari si associa a paralisi che è significativamente migliorata dal trattamento con Abeta1-6A2V-TAT(D).

Questi risultati indicano chiaramente che il peptide Abeta1-6A2VTAT(D) è in grado di inibire la polimerizzazione e la neurotossicità di Abeta. Queste proprietà anti-amiloidogeniche verranno successivamente testate in un modello murino di AD.

ABSTRACT N. 138 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile

94.000 Durata (anni): 2

Anno d’inizio: 2011

STUDIO DELLE BASI MOLECOLARI DELLA NEURODEGENERAZIONE NELLA SINDROME DI COCKAYNE

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche

Ciaffardini Flavia (1), Canu Giovanni (1), Balajee Adayabalam S. (2), Proietti-De-Santis Luca (1)

DI FEDE GIUSEPPE

Telethon grant N.

GGP10120

Totale €

502.400

Num Centri: 2

GGP11176

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 137 Responsabile

PROIETTI DE SANTIS LUCA

Telethon grant N.

Durata (anni): 3

(1) Unità di Genetica Molecolare dell’Invecchiamento, Dipartimento di Ecologia e Biologia, Università della Tuscia, Largo Università, 01100 Viterbo, Tel. ++39.0761.357211, E-mail: proietti@unitus.it (2) Center for Radiological Research, Department of Radiation Oncology, Columbia University Medical Center, New York, New York 10032, USA

Anno d’inizio: 2010

NUOVE PROSPETTIVE TERAPEUTICHE PER LA MALATTIA DI ALZHEIMER BASATE SU UNA VARIANTE DI ABETA CHE INIBISCE L’AMILOIDOGENESI

La sindrome di Cockayne è una malattia neurodegenerativa a decorso progressivo che porta alla morte prematura nel periodo infantile. La maggior parte dei pazienti presenta mutazioni nel gene CSB. Sebbene siano state identificate le basi genetiche della malattia, le cause molecolari non sono ancora del tutto chiare. Questo studio è stato condotto al fine di verificare se la proteina CSB abbia o meno un ruolo nella sopravvivenza, nella capacità differenziativa e di autorinnovamento delle cellule staminali neuronali in condizioni normali e in stato di ipossia. Il nostro approccio innovativo prevede l’uso di un sistema basato su cellule progenitrici neurali umane capaci di autorinnovarsi e differenziarsi. Per prima cosa, abbiamo dimostrato che la ridotta espressione della proteina CSB, ottenuta mediante silenziamento genico, comporta una drammatica riduzione della sopravvivenza e della capacità di autorinnovamento delle cellule staminali neuronali, aspetto questo che sembra particolarmente pronunciato in condizioni di ipossia. Inoltre, il silenziamento genico di CSB riduce drammaticamente il potenziale differenziativo delle cellule staminali neuronali. In tal senso, la crescita neuritica che è uno dei principali aspetti dei neuroni in fase di differenziamento, risulta fortemente compromessa nelle cellule silenziate per CSB. E’ interessante notare come la proteina CSB, che è indotta durante il differenziamento, sembra svolgere un duplice ruolo durante il differenziamento neuronale: nel nucleo essa modula quei programmi trascrizionali che controllano la sopravvivenza e il differenziamento delle cellule staminali neuronali, nel citoplasma essa potrebbe partecipare nei processi che organizzano la crescita neuritica e il trasporto assonale retrogrado. Nel complesso, anche se ancora in corso, questo studio suggerisce che CSB è un fattore critico nella protezione dell’integrità funzionale delle cellule staminali neuronali nei processi di autorinnovamento e differenziamento

Diomede Luisa (2), Catania Marcella (1), Romeo Margherita (2), Morbin Michela (1), Palamara Luisa (1), Fugnanesi Valeria (1), Colombo Laura (2), Rossi Alessandro (2), La Rocca Paolo (2), Stoilova Tatiana (2), Salmona Mario (2), Tagliavini Fabrizio (1), Giuseppe Di Fede (1) (1) U.O. Neurology V, Neuropathology, Fondazione IRCCS “Carlo Besta” Neurological Institute, Via Celoria 11, 20133 Milan, Italy, Tel. +39.02.23944648, +39.02.23944711, E-mail: gdifede@istituto-besta.it (2) Department of Molecular Biochemistry and Pharmacology, Istituto di Ricerche Farmacologiche “Mario Negri”, Milan, Italy

Abbiamo identificato una nuova mutazione nel gene del Precursore dell’Amiloide (APP) consistente in una sostituzione Alanina-Valina al codone 673 [corrispondente alla posizione 2 nella sequenza della proteina amiloide (Abeta)]. La mutazione in stato di omozigosi conferisce un ruolo dominante all’Abeta1-40 nel pathway di aggregazione e nella composizione di specie oligomeriche e amiloide. Studi condotti su campioni biologici derivanti da un carrier omozigote di A673V e su modelli cellulari indicano che tale difetto genetico favorisce il pathway amiloidogenico del processing di APP con conseguente incremento della produzione di peptidi amiloidogenici. Inoltre, la mutazione aumenta il contenuto in beta-sheet nella struttura di Abeta, stimola fortemente la produzione di oligomeri in vitro e in vivo, e incrementa la neurotossicità indotta dalla proteina amiloide.

In seguito all’osservazione che i carriers eterozigoti della mutazione A2V non sviluppano la malattia di Alzheimer (AD), sono stati inoltre condotti studi con peptidi sintetici che hanno dimostrato la straordinaria abilità di AbetaA2V di interagire con Abeta wt full-lenght ed inibirne la nucleazione e la polimerizzazione. Ciò offre una base per lo sviluppo di una terapia “disease-modifying” per l’AD sporadico, basata sull’uso di peptidi Abeta contenenti la mutazione A2V. A questo fine, abbiamo sintetizzato un peptide di sei residui, con sequenza omologa all’Abeta umana, contenente la sostituzione A2V (Abeta1-6A2V), il quale conserva in vitro le proprietà anti-amiloidogeniche dell’Abeta mutata full-lenght. L’isomero D di tale peptide [Abeta1-6A2V(D), che risulta più resistente alla degradazione da parte delle proteasi endogene, risulta anche più efficace dell’analogo isomero L. Al fine di migliorare la capacità di traslocare attraverso la barriera ematoencefalica e le membrane cellulari, una sequenza aminoacidica ricca in residui basici (TAT) è stata coniugata col peptide, ed è stata analizzata la capacità di Abeta1-6A2V-TAT(D) di inibire l’aggregazione e la neurotossicità dei peptidi Abeta full-lenght.

Tali indagini hanno permesso di dimostrare che Abeta1-6A2V(D) inibisce la formazione di fibrille e di strutture amiloidi da parte di Abeta full-lenght.

Inoltre, Abeta1-6A2V-TAT(D) è in grado di inibire la tossicità indotta

ABSTRACT N. 139 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile

DENTI MICHELA ALESSANDRA

Telethon grant N.

GGP08244

Totale €

183.400

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2008

SKIPPING ESONICO INDOTTO DA RNA ANTISENSO PER LA TERAPIA GENICA DELLA DEMENZA FRONTO-TEMPORALE CON PARKINSONISMO LEGATA AL CROMOSOMA 17 (FTDP17) Covello Giuseppina (1), Siva Kavitha (1), Lara Mari (2), Marchesi Elena (2), Perrone Daniela (2), Denti Michela Alessandra (1)

93

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

astrociti WT ma depleto di lipoproteine, non è in grado di promuovere queste proprietà nei neuroni HD. Esperimenti di acquisto e di perdita di funzione di geni chiave coinvolti nella sintesi e nell’efflusso di colesterolo in astrociti WT e HD saranno condotti per testare la rilevanza di questo cross-talk tra astrociti e neuroni in condizioni fisiologiche e patologiche.

(1) Centre for Integrative Biology, University of Trento, via delle Regole, 101, 38123 Mattarello (TN), Italy, Tel.+39.0461.282740, Fax +39.0461.283091, Email: denti@science.unitn.it (2) Dipartimento di Biologia ed Evoluzione, Università degli Studi di Ferrara

L’accumulo di filamenti di proteina Tau aberrante in specifiche aree del cervello è la principale causa di malattie degenerative, generalmente denominate “Tauopatie”, tra le quali la Demenza Frontotemporale con Parkinsonismo legata al cromosoma 17 (FTDP-17). La FTDP-17 è una malattia genetica rara che presenta quadri clinici e neuropatologici eterogenei ed è causata, nel 50% dei casi, da mutazioni che provocano l’inclusione erronea dell’esone 10 (E10) nell’RNA messaggero (mRNA) di Tau. Tale inclusione è responsabile dell’accumulo della proteina Tau nei neuroni degli individui affetti da FTDP-17.

Questo progetto intende esplorare la possibilità di un approccio di terapia genica per la correzione dell’mRNA di Tau da parte di molecole di RNA antisenso (as-RNA). Utilizzando tali molecole è possibile mascherare le sequenze necessarie perché un esone venga incluso nell’mRNA maturo. Mediante l’utilizzo di linee cellulari abbiamo saggiato la capacità delle diverse molecole di as-RNA di indurre l’esclusione dell’E10 nell’mRNA maturo di Tau. Saggi condotti sull’mRNA e sulle proteine hanno mostrato che specifiche molecole di as-RNA sono capaci di escludere l’E10 nell’mRNA maturo di Tau. La loro efficienza di azione è correlata alla concentrazione e alla sequenza bersaglio.

In base a questi risultati sono stati costruiti dei vettori virali in grado di far produrre alle cellule le molecole di as-RNA più efficaci. Per ottenere effetti persistenti, infatti, tali as-RNA sono prodotti come parti integranti di molecole U snRNA, trascritte da promotori specifici. Mediante l’utilizzo di specifiche linee cellulari, abbiamo saggiato che i vettori fossero capaci di indurre l’esclusione dell’esone 10 nell’mRNA di Tau anche per la sequenza umana, utilizzando dei minigeni che mimano la condizione del trascritto endogeno. Per gli studi futuri atti a testare l’efficacia terapeutica dei vettori virali nelle aree specifiche del cervello, sarà utilizzato un modello animale di FTDP17.

I risultati che si otterranno vogliono essere un contributo alla ricerca scientifica verso una cura per le malattie neurodegenerative.

ABSTRACT N. 141 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile

GGP12122 192.000

Num Centri: 1

Durata (anni): 2

Durata (anni): 1

Anno d’inizio: 2012

Di Pardo Alba (1), Alberti Silvia (1), Maglione Vittorio (1), Amico Enrico (1), Elifani Francesca (1), Concetti Fabio (1), Busceti Carla Letizia (2), Battaglia Giuseppe (2), Squitieri Ferdinando (1) (1) Centre for Neurogenetics and Rare Diseases, IRCCS Neuromed, Pozzilli, Italy, Tel. +39.0865.915248, E-mail: squitieri@neuromed.it (2) Neuropharmacology Unit, IRCCS Neuromed, Pozzilli, Italy

La malattia di Huntington (MH) è la più comune malattia ereditaria neurodegenerativa, causata da un’ espansione di un tratto CAG nel gene codificante la proteina huntingtina (htt). Le anomalie neuropatologiche caratteristiche della MH sono spesso associate ad alterazioni di processi biologici essenziali per la sopravvivenza neuronale.

Una difettosa produzione dei fattori neurotrofici sembra rappresentare una delle possibili cause alla base dello sviluppo della malattia.

Recentemente, abbiamo riportato una riduzione dei livelli del fattore di crescita TGF-beta1 sia nel sistema nervoso centrale (cervelli umani post-mortem) che in periferia (siero) di pazienti in fase presintomatica e nei primi stati di malattia. Le nostre osservazioni suggeriscono che un’ alterata biodisponibilità della citochina nella fase precoce della malattia può contribuire allo sviluppo della MH (Battaglia et al., J Cell Mol Med, 2011).

Lo scopo di questo studio è quello di identificare la popolazione cellulare principalmente coinvolta nella produzione di TGF-beta1 periferico nei pazienti con MH ed indagare se le variazioni dei livelli di TGF-beta1 lungo il decorso della malattia possano riflettere i difetti del sistema nervoso centrale. L’esistenza di tale parallelismo potrebbe fornire la possibilità di identificare un potenziale marcatore di progressione di malattia.

CATTANEO ELENA

Totale €

48.000

VARIAZIONE DELLA PRODUZIONE DEL TGF-BETA 1 NEI MACROFAGI E CELLULE GLIALI NELLA MALATTIA DI HUNTINGTON

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Telethon grant N.

GGP12218

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 140 Responsabile

SQUITIERI FERDINANDO

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2012

IMPATTO DELLA MINOR PRODUZIONE DI COLESTEROLO DI ORIGINE GLIALE NELLA MALATTIA DI HUNTINGTON

ABSTRACT N. 142

Marullo Manuela* (1), Valenza Marta* (1), Di Paolo Eleonora (1), Cesana Elisabetta (2), Biella Gerardo (2), Cattaneo Elena (1)

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile

(1) Centre for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano, via Balzaretti 9, 20133 Milano, Italy, Tel.02.50325840, Fax 02.50325843, E-mail: elena.cattaneo@unimi.it (2) Department of Biology and Biotechnology “Lazzaro Spallanzani”, University of Pavia, Pavia, Italy * co-first-authors

LEVI SONIA

Telethon grant N.

GGP11088

Totale €

502.400

Num Centri: 3

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2011

RUOLO DEL FERRO E DEI MITOCONDRI NELLA PATOGENESI DELLA NEURODEGENERAZIONE ASSOCIATA A PANTOTENATO CHINASI (PKAN): SVILUPPO DI NUOVI MODELLI CELLULARI NEURONALI E ANALISI DI UN MODELLO DI MALATTIA MURINO

Risultati precedenti hanno dimostrato una ridotta biosintesi di colesterolo nel cervello di diversi modelli animali di malattia di Huntington (Huntington’s disease, HD), una malattia neurodegenerativa causata dall’espansione di triplette CAG nel gene codificante per l’huntingtina (htt). Questa disfunzione è anche presente negli astrociti (Valenza et al., J. Neurosci. 2010). Il colesterolo cerebrale, sintetizzato localmente, partecipa in diverse attività neuronali, come la crescita neuritica e la trasmissione sinaptica. Nell’adulto, le attività neuronali colesterolo-dipendenti dipendono dalla produzione e dal trasporto di colesterolo mediante le lipoproteine ApoE da parte degli astrociti.

Dati preliminari indicano che astrociti primari dal modello murino transgenico HD R6/2 e astrociti derivati da linee cellulari di staminali neurali murine che portano un numero crescente di ripetizioni CAG nel gene endogeno dell’htt (cellule NS Hdh50Q/7 and Hdh140Q/7; Conforti et al., Neurobiol. Dis. 2012) mostrano una minor produzione cellulare e una minor secrezione di ApoE rispetto agli astrociti controllo. Inoltre, il medium condizionato da astrociti wild-type (WT), o la somministrazione di colesterolo, promuove la crescita neuritica e parametri sinaptici nei neuroni HD. Invece, il medium condizionato da astrociti HD, o medium condizionato da

Campanella Alessandro (1), Brunetti Dario (2), Privitera Daniela (1), Santambrogio Paolo (3), Cozzi Anna (3), Guaraldo Michela (3), Garavaglia Barbara (2), Dusi Sabrina (2), Ruzzenenti Paola (4), De Luca Angela (4), Finazzi Dario (4), Tiranti Valeria (2), Levi Sonia (1) (1) Università Vita-Salute San Raffaele, San Raffaele Scientific Institute, Division of Neuroscience, Via Olgettina 58, 20132 Milano, Tel. 02.26434755, Fax 02.26434844, E-mail: levi.sonia@hsr.it (2) Unit of Molecular Neurogenetics, IRCCS Foundation Neurological Institute “C.Besta”, Milano (3) San Raffaele Scientific Institute, Division of Neuroscience, Milano, Italy (4) Dipartimento Materno Infantile e Tecnologie Biomediche, Università di Brescia, Brescia, Italy

La neurodegenerazione associata alla pantotenato kinasi (PKAN), malattia genetica del movimento, è caratterizzata da accumulo di ferro e degenerazione dei gangli della base. Il gene responsabile, pantotenato kinasi2 (Pank2), codifica per un enzima della biosintesi

94

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

del Coenzima A nel mitocondrio. Scopo del progetto è di chiarire la relazione tra l’attività difettosa di Pank2, il deposito di ferro cerebrale e la disfunzione mitocondriale e di testare gli approcci terapeutici alla malattia. I fibroblasti primari di 3 pazienti PKAN, rispetto a quelli di 3 controlli, hanno mostrato un difetto nel controllo dell’espressione coordinata di TfR1 e di ferritine in risposta al trattamento con ferro per lungo tempo. Ciò ha causato l’aumento di ferro libero intracellulare con conseguente formazione di ROS, suggerendo un ruolo del ferro nel promuovere danno da stress ossidativo in cellule PKAN (1). Neuroni dopaminergici (iDAN) sono stati ottenuti con riprogrammazione diretta di fibroblasti di pazienti mediante infezione con Mash1, Nurr1- e Lmx1a-lentivirus; l’efficienza, pari al 5%, è stata determinata dall’espressione dei marker neuronali TuJ1, TH e N-CAM. L’analisi, in condizioni basali, dei fluorofori DCF e TMRM a livello di singola cellula ha evidenziato nelle iDAN dei pazienti un aumento di ROS e un debole decremento del potenziale di membrana. Abbiamo inoltre dimostrato la localizzazione mitocondriale della Pank2 di topo nello spazio intermembrana, probabilmente ancorata alla membrana interna, mediante analisi in western blot delle frazioni sub-cellulari isolate da cervello e da fibroblasti di topi Pank2+/+ e Pank2-/- (2). Sono stati inoltre analizzati i parametri dell’omeostasi del ferro, il danno ossidativo e la funzionalità mitocondriale in cellule carenti di Pank2 e in tessuti di topi Pank2-/. In HeLa e SH-SY5Y l’alterazione del metabolismo del ferro indotta dal silenziamento della Pank2 è stata recuperata dal trattamento con pantetina ed è associata all’aumento dell’espressione delle altre isoforme di Pank. Il contenuto di ferritine, valutato in testicoli di 4 topi Pank2-/- e 4 controlli (2 Pank2+/+ e 2 Pank2+/-), ha evidenziato una FtL di ~1,6 volte più alta nei Pank2-/-. Al contrario, l’espressione delle proteine antiossidanti FtMt e SOD1 è diminuita (rispettivamente di ~7 e ~2,5 volte) nei Pank2-/- rispetto ai Pank2+/+. L’ossigrafia su microscala di mitocondri isolati da cervello di topo ha dimostrato un profilo respiratorio difettivo nei Pank2-/rispetto ai Pank2+/+. Inoltre, è stata determinata un’alterazione del potenziale di membrana mitocondriale, confermato dalla microscopia elettronica su cervelli, nervi periferici e neuroni di Pank2-/-, mostrando la presenza di mitocondri gonfi, con creste aberranti e una completa modificazione della matrice. Questi risultati dimostrano che la carenza di Pank2 causa alterazione del metabolismo del ferro, danno ossidativo e disfunzione mitocondriale nei modelli cellulari ed animali di PKAN. (1) Campanella A, Privitera D, Guaraldo M, Rovelli E, Barzaghi C, Garavaglia B, Santambrogio P, Cozzi A, Levi S. Skin fibroblasts from pantothenate kinase-associated neurodegeneration patients show altered cellular oxidative status and have defective iron-handling properties. Hum Mol Genet. 2012 Sep 15;21(18):4049-59.

(2) Brunetti D, Dusi S, Morbin M, Uggetti A, Moda F, D’Amato I, Giordano C,d’Amati G, Cozzi A, Levi S, Hayflick S, Tiranti V. Pantothenate kinase-associated neurodegeneration: altered mitochondria membrane potential and defective respiration in Pank2 knockout mouse model. Hum Mol Genet. 2012 Dec 15;21(24):5294-305.

menta con l’invecchiamento. Questo è accompagnato da un aumento di ferro rilevato da MRI, dall’accumulo di aggregati di ferro rilevabili con colorazione di Perl e da segni di danno ossidativo. È interessante notare che il numero di aggregati di ferro diminuiva dopo 3 settimane di trattamento con il chelante orale deferiprone.

I topi sono stati poi incrociati per 7 generazioni con C57/BL6J. L’accumulo della ferritina transgene era molto più basso in questo ceppo che in FVB, e alcuni topi LN2 mostravano segni di danno ossidativo nel cervello. Analisi di microscopia elettronica ha rivelato depositi di ferro associati a pigmento granulare nelle zone di cervelletto e striato di un topo C57-LN2. Queste ultrastrutture intracellulari, mai osservate nei nuclei, avevano una densità di un ordine di grandezza superiore ai controlli. Neuroni ippocampali post-natali, ottenuti da topi C57-LN2 hanno mostrato una più alta percentuale di mortalità in risposta al sovraccarico cronico di ferro e /o a somministrazione acuta di H2O2, rispetto alle cellule di controllo. Studi comportamentali sono stati avviati. I topi C57-LN2 di 2 mesi di età avevano un difetto nella coordinazione motoria.

Inoltre, abbiamo analizzato il comportamento di topi LN2 di 2 anni (nel ceppo FVB) trattati con erbicidi (Paraquat e Maneb) che causano stress ossidativo e neurodegenerazione. Nessun deficit motorio importante è emerso, ma i topi LN2 mostravano una paradossale attivazione comportamentale. Abbiamo preparato vettori per generare nuovi topi Tg che esprimono umana L ferritina (FTLwt) e un altro mutante patogeno (LN4). Le sequenze sono state ottimizzate per l’espressione in topo, quindi sono state clonate in un plasmide sotto il controllo del promotore PGK, ed i costrutti verificati mediante sequenziamento. Esperimenti di trasfezione transiente mostrano che l’espressione delle ferritine umane in cellule murine è considerevolmente limitata rispetto alle cellule umane.

In un altro approccio, eteropolimeri patogeni ricombinanti mutanti sono stati analizzati mediante voltammetria ciclica. Questo nuovo approccio ha mostrato che l’energia di rilascio di ferro dal mutante inizia molto prima di quella dal WT, e che il mutante produce più specie ROS in soluzione fisiologica del wt. In conclusione, i topi transgenici ricapitolano alcuni dei segni patologici di neuroferritinopatia umana, e sono utili per testare nuove strategie farmacologiche per ridurre ferritina/accumulo di ferro nel cervello.

ABSTRACT N. 144 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile

180.000 Durata (anni): 2

Anno d’inizio: 2010

PINK1, UNA PROTEINA MUTATA NELLA MALATTIA DI PARKINSON A TRASMISSIONE AUTOSOMICA RECESSIVA, INTERAGISCE CON LA PROTEINA PROAUTOFAGICA BECLIN1 E CON IL SUO PARTNER ANTIAPOPTOTICO BCL-XL: CARATTERIZZAZIONE DEL RUOLO NEUROPROTETTIVO DI QUESTE INTERAZIONI ATTRAVERSO LA REGOLAZIONE DI MULTIPLE VIE CELLULARI

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche AROSIO PAOLO

Telethon grant N.

GGP10099

Totale €

585.800

Num Centri: 5

GGP10140

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 143 Responsabile

VALENTE ENZA MARIA

Telethon grant N.

Durata (anni): 3

Arena Giuseppe (1,2), Gelmetti Vania (1), Torosantucci Liliana (1), Vignone Domenico (1), Cilia Emanuele (1), De Rosa Priscilla (1,2), Lamorte Giuseppe (1), Jonas Elizabeth (3), Valente Enza Maria (1,4)

Anno d’inizio: 2010

MODELLI ANIMALI DI NEUROFERRITINOPATIE PER LO STUDIO DEL RUOLO DEL FERRO NELLA NEURODEGENERAZIONE

(1) CSS-Mendel Institute, IRCCS Casa Sollievo della Sofferenza, viale Regina Margherita 261, 00198 Rome, Italy, Tel +39..416 0537, Fax +39.06.4416 0548, E-mail: e.valente@css-mendel.it (2) Dept. of Experimental Medicine, Sapienza University, Rome, Italy (3) Dept. of Internal Medicine, Yale University, New Haven (CT), USA (4) Dept. of Medicine and Surgery, University of Salerno, Salerno, Italy

Cremona Ottavio (2), Giorgio Marco (3), Grohovaz Fabio (2), Levi Sonia (2), Arosio Paolo (1) (1) Dipartimento Medicina Molecolare e Traslazionale, Università di Brescia, Viale Europa 11, 25129 Brescia, Italy, Tel. 0303717303, Fax 0303717305, Email: arosio@med.unibs.it (2) Università Vita-Salute- San Raffaele Scientific Institute, Via Olgettina 58, 201232 Milano (3) Dipartimento di Oncologia Sperimentale, Istituto Europeo di Oncologia, Milano

Mutazioni in PINK1 rappresentano una causa frequente di malattia di Parkinson (MP) autosomica recessiva. PINK1 codifica per una chinasi implicata nell’omeostasi mitocondriale e nella prevenzione dello stress ossidativo e dell’apoptosi. Insieme a Parkin, PINK1 regola la dinamica e il traffico mitocondriale, nonché la degradazione mitofagica dei mitocondri danneggiati. Inoltre PINK1 può attivare l’autofagia interagendo con la proteina pro-autofagica Beclin-1.

Per esplorare ulteriormente questo pathway, ci siamo focalizzati sui membri del complesso di Beclin-1, dimostrando che PINK1 interagisce fortemente con Bcl-xL, una delle principali proteine della famiglia di Bcl-2, nota anche per inibire l’autofagia attraverso il legame con Beclin-1. L’interazione PINK1-Bcl-xL aumenta in cellule trattate con il disaccoppiante mitocondriale CCCP, che induce accumulo di PINK1 sulla membrana esterna dei mitocondri depolarizzati. In linea con questo, abbiamo osservato mediante microscopia confocale

Le neuroferritinopatie sono malattie genetiche rare con una trasmissione autosomica dominante causata da mutazioni nel C-terminale della ferritina L (FTL). Appartengono al gruppo di patologie Neurodegenerazione con Accumulo Cerebrale di Ferro (NBIA). Abbiamo studiato l’invecchiamento di modelli animali che esprimono il mutante patogeno umano FTL498InsTC (LN2) sotto il promotore PGK. Topi Tg nel background FVB mostrano un forte accumulo di LN2 in tutti i tessuti analizzati, in particolare nel cervello, che au-

95

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

che, dopo CCCP, Bcl-xL colocalizza con PINK1 wt ma non con un mutante privo della sequenza target mitocondriale, suggerendo che il legame PINK1-Bcl-xL avviene per lo più sulla superficie mitocondriale. L’interazione tra PINK1 e Bcl-xL non interferisce con il legame Bcl-xL-Beclin-1, e Bcl-xL non risulta necessaria per reclutare Parkin e attivare la mitofagia. Questi dati indicano che il significato dell’interazione PINK1-Bcl-xL è indipendente dal ruolo dell’asse PINK1-Parkin che regola la mitofagia.

PINK1 è in grado di fosforilare direttamente la serina 62 (S62) di Bcl-xL sia in vitro che in vivo. I livelli di fosfo-Bcl-xL aumentano proporzionalmente con l’aumento dei livelli o dei tempi di esposizione a CCCP, suggerendo una diretta correlazione con la depolarizzazione mitocondriale. In questo setting, la down-regolazione di PINK1 o la over-espressione di un mutante difettivo del dominio chinasico riduce marcatamente i livelli di fosfo-Bcl-xL. Fosforilando Bcl-xL S62, PINK1 protegge significativamente dall’apoptosi indotta da CCCP, come rivelato dalla riduzione dei livelli di PARP clivata e dell’apoptosi misurata mediante FACS. E’ interessante notare che la S62 è adiacente ad un aspartato (D61) che viene clivato in seguito a stimoli apoptotici, generando un frammento Cterminale pro-apoptotico (deltaN-Bcl-xL). Abbiamo dimostrato che tale clivaggio è indotto anche dalla depolarizzazione mitocondriale e che deltaN-Bcl-xL aumenta in assenza di PINK1, mentre è ridotto in presenza del costrutto fosfo-mimetico Bcl-xL S62E. Questi dati suggeriscono che la fosfo-S62 potrebbe proteggere dall’apoptosi ostacolando la produzione di deltaN-Bcl-xL, attraverso un ingombro sterico o elettrostatico del sito di clivaggio.

Il presente studio fornisce un legame funzionale tra PINK1, Bcl-xL e l’apoptosi, suggerendo un nuovo meccanismo attraverso cui PINK1 regola la sopravvivenza cellulare, potenzialmente rilevante per la patogenesi della MP, così come per altre malattie incluso il cancro.

la maggior parte delle persone.

In questo progetto analizziamo i processi molecolari perturbati nelle cellule del sangue di pazienti affetti dalla forme monogenetiche LRRK2 e Parkin della malattia di Parkinson per la definizione della malattia.

Analizzando campioni di sangue da pazienti affetti dalla forma genetica LRRK2 con la mutazione G2019S e pazienti con la mutazione nel gene Parkin mediante analisi high-throughput di trascrittomica si sono identificati geni la cui espressione viene alterata nel fPD. Si analizzano tali risultati alla luce delle informazioni di trascrittomica di pazienti soggetti a sPD. Il nostro scopo finale è l’identificazione di nuovi spunti riguardo alla relazione fra le diverse forme di fPD e delle loro similarità e differenze con l’sPD. Questo potrebbe rivelarsi di notevole importanza per la diagnosi in pazienti presintomatici e per il monitoraggio degli effetti di nuovi trattamenti terapeutici.

ABSTRACT N. 146 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile

GGP10224 319.500

Num Centri: 3

Durata (anni): 3

Durata (anni): 2

Anno d’inizio: 2011

Goldwurm Stefano (1), Landers John (2), Duga Stefano (3) (1) Parkinson Institute, Istituti Clinici di Perfezionamento, via Bignami 1, 20126 Milano, Tel. 02.57993319, Fax 02.57993468, E-mail: stefano.goldwurm@gmail.com (2) University of Massachusetts Medical School, Worcester, Massachusetts, USA (3) Department of Medical Biotechnology and Translational Medicine, University of Milan

GUSTINCICH STEFANO

Totale €

94.500

IDENTIFICAZIONE DI GENI RECESSIVI CHE PROVOCANO LA MALATTIA DI PARKINSON TRAMITE SEQUENZA COMPLETA DELL’ESOMA

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Telethon grant N.

GGP11164

Totale € Num Centri: 3

ABSTRACT N. 145 Responsabile

GOLDWURM STEFANO

Telethon grant N.

La malattia di Parkinson (MdP) è una malattia neurodegenerativa progressiva molto frequente caratterizzata dalla degenerazione dei neuroni dopaminergici del sistema nervoso centrale. La perdita di cellule dopaminergiche si associa al tipico tremore a riposo del malato; altri sintomi sono rallentamento motorio, rigidità muscolare, instabilità posturale, turbe vegetative e spesso sintomi ansioso-depressivi. La MdP è una malattia complessa causata in genere dall’interazione di numerosi fattori genetici e ambientali per la maggior parte ancora ignoti. In alcune rare forme genetiche, la malattia è causata da un singolo gene e viene trasmessa all’interno della famiglia. Non tutti i geni responsabili di queste forme familiari sono stati identificati. In questo progetto ci proponiamo di identificare nuovi geni che provocano la MdP con un meccanismo autosomico recessivo. La nostra ricerca si basa su una nuova tecnologia in grado di sequenziare completamente l’esoma, cioè quella parte del genoma che codifica per proteine. L’esoma verrà sequenziato in soggetti con una probabile forma genetica autosomica recessiva di MdP. Verranno, infatti, analizzati pazienti con MdP da 7 famiglie dove 2 o più fratelli e sorelle sono affetti e i genitori sono consanguinei. La presenza di una forte familiarità (fratelli e sorelle affetti) e la consanguineità dei genitori aumenta la probabilità di essere in presenza di una forma recessiva.

Durante il primo anno del progetto sono stati sequenziati gli esomi di 10 individui. Attualmente stiamo valutando la presenza, in una popolazione di controlli sani italiani, delle varianti genetiche identificate in omozigosi nei pazienti sequenziati e che sono relativamente rare nei database disponibili (<5%).

Le varianti che risulteranno rare o assenti nella popolazione di controllo (composta da 900 individui) verranno poi ricercate in un gruppo numeroso di pazienti con MdP, sporadici e familiari, per confermare il coinvolgimento del gene nella patogenesi della malattia.

L’identificazione di geni responsabili della MdP nelle rare forme genetiche è molto utile per capire meglio i meccanismi molecolari che portano alla malattia, consentendo di identificare nuovi bersagli terapeutici sfruttabili anche a vantaggio dei pazienti affetti dalle più comuni forme sporadiche.

Anno d’inizio: 2010

DEFINIZIONE DELLA MALATTIA DI PARKINSON TRAMITE PROFILO DI ESPRESSIONE GENICA DA SANGUE PERIFERICO DI PAZIENTI AFFETTI DALLA FORME MONOGENETICHE LRRK2 E PARKINA Calligaris Raffaella (1), Vlachouli Christina (1), Finaurini Sara (1), Vatta Paolo (1), Banica Mihaela (2), Tesolin Lucia (2), Cucca Alberto (2), Cattaruzza Tatiana (2), Antonutti Lucia (2), Goldwurm Stefano (3), Pizzolato Gilberto (2), Gustincich Stefano (1) (1) Area of Neurobiology, International School for Advanced Studies (SISSA), via Bonomea 265, Trieste, Italy, Tel.+39.040.3787705, Fax +39.040.3787702, E-mail: gustinci@sissa.it (2) Department of Clinical, Technological and Traslational Sciences, University of Trieste, Italy (3) Parkinson Institute, Istituti Clinici di Perfezionamento, Milan, Italy

La malattia di Parkinson (PD) è una lenta ma progressiva malattia degenerativa del sistema nervoso centrale. Si manifesta principalmente con quattro sintomi caratteristici quali il tremore, la rigidità, la bradicinesia e l’instabilità posturale. L’insorgenza dei sintomi motori è conseguenza della perdita di dopamina striatale dovuta alla selettiva degenerazione di neuroni dopaminergici della Substantia Nigra (SN) pars compacta. Sebbene questi sintomi possano essere alleviati dall’utilizzo di farmaci dopaminergici, non esiste attualmente un trattamento farmacologico che possa rallentare o bloccare il processo neurodegenerativo. L’esordio dei sintomi motori è correlabile ad una riduzione della dopamina (DA) del 80% e ad una perdita dei neuroni dopaminergici della SN del 60%, indicando che la malattia di PD è caratterizzata da una lunga fase presintomatica. Molti studi recenti descrivono il PD non solo come una malattia del sistema dopaminergico striatale ma anche del sistema centrale e periferico. Analisi di trascrittomica nel sangue di pazienti affetti da malattie neurodegenerative si sono rilevati un ottimo sistema sia per analizzare i processi neurodegenerativi in atto sia per identificare biomarkers come nuovi strumenti diagnostici.

Sebbene l’eziologia della malattia di Parkinson non sia ancora del tutto chiara, studi su geni mutati nel PD genetico e familiare (fPD), come LRRK2 e Parkin, hanno contributo in maniera importante alle nostre conoscenze attuali. È ancora da chiarire se diverse forme di casi genetici presentino meccanismi comuni di neurodegenerazione e quale sia la loro relazione con il PD sporadico (sPD) che colpisce

ABSTRACT N. 147 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile

GGP10109

Totale €

187.500

Num Centri: 1

96

CHIEREGATTI EVELINA

Telethon grant N.

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2010

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

MECCANISMI PATOGENETICI DEL MORBO DI PARKINSON FAMILIARE: ALFA-SINUCLEINA E LA SUA FORMA MUTATA A30P AGISCONO SULLA STRUTTURA DEI MICROFILAMENTI E DEI FILAMENTI INTERMEDI. VIE DI SEGNALAZIONE ED EFFETTI SULLE DINAMICHE CITOSCHELETRICHE

versità degli Studi di Genova (4) Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale, Sezione di Farmacologia, Università degli Studi di Ferrara

Mutazioni nel gene che codifica la proteina Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) sono la causa più comune di malattia di Parkinson (MP) ereditaria, tuttavia i meccanismi molecolari responsabili della patologia sono ad oggi sconosciuti. LRRK2 è una proteina multifunzione di grandi dimensioni con domini chinasico e GTPasico e motivi di interazione proteina-proteina. Nonostante il ruolo fisiologico di LRRK2 non sia chiaro, abbiamo recentemente riportato che LRRK2 è in grado di modulare il rilascio di neurotrasmettitore orchestrando il traffico di vescicole sinaptiche mediante l’interazione con diversi componenti dell’apparato molecolare di secrezione. È stato osservato che la disfunzione sinaptica contribuisce all’insorgenza e alla progressione della MP. Abbiamo dimostrato in precedenza che la mutazione patologica più comune G2019S causa un aumento dell’attività chinasica di LRRK2 e che questa attività è responsabile della neuro-tossicità associata alle proteine LRRK2 mutate. Da queste osservazioni, la nostra ipotesi è che LRRK2 mutata aumenti la fosforilazione di proteine pre-sinaptiche chiave, causando un danno alla funzione sinaptica e, in ultima analisi, neurodegenerazione. In questo lavoro riportiamo le nostre recenti osservazioni in merito. Innanzi tutto, abbiamo osservato che il recettore dell’Epidermal Growth Factor (EGFR) attiva LRRK2, aumentandone l’autofosforilazione, la rilocalizzazione in membrana e la stabilizzazione. Attivazione di EGFR è stata precedentemente collegata alla modulazione della funzionalità sinaptica. A questo proposito abbiamo visto che LRRK2 interagisce efficientemente con vescicole sinaptiche (VS) isolate e filamenti di actina (che forniscono i ‘binari’ per il movimento delle VS) ed è anche in grado di interagire e fosforilare efficientemente proteine chiave del ciclo delle VS, come NSF e synapsin I. Inoltre, PAK6, una protein chinasi associata ai filamenti di actina, agisce a monte di LRRK2 inducendone la de-fosforilazione e rilocalizzandola. Infine, il silenziamento genico di LRRK2 in neuroni corticali aumenta significativamente le correnti post-sinaptiche evocate e la mobilità delle VS, mentre sinaptosomi striatali di topi knock-out per LRRK2 stimolati con K+ mostrano un aumentato rilascio di [3-H]-dopamina rispetto ai controlli. Complessivamente, i nostri dati biochimici e di elettrofisiologia indicano che LRRK2 è attivata dalle cascate del segnale mediate da EGFR e controlla il traffico vescicolare mediante interazione/fosforilazione di proteine pre-sinaptiche chiave. L’attività chinasica di LRRK2 o i suoi attivatori a monte rappresentano pertanto dei bersagli terapeutici promettenti nella cura della MP.

Emanuele Marco, Tilve Sharada, Difato Francesco, Ronzitti Giuseppe, Chieregatti Evelina Dept. of Neuroscience and Brain Technologies, Istituto Italiano di Tecnologia, Via Morego 30, 16163 Genova, Tel. 010.71781740, Fax 010.71781230, E-mail: evelina.chieregatti@iit.it

Il morbo di Parkinson (PD) è una malattia degenerativa progressiva che può essere definita in termini biochimici come una deficienza dello stato dopaminergico dovuta a degenerazione dei neuroni dopaminergici, ma le cause della morte neuronale sono ancora poco conosciute. La strategia terapeutica è quella di risanare la deficienza di dopamina nel cervello con mezzi farmacologici o con impianti di neuroni dopaminergici. Recentemente sono state individuate mutazioni nel gene di alfa-sinucleina (Syn) o duplicazioni e triplicazioni del gene, in diverse famiglie con PD a precoce manifestazione. Inoltre Syn è presente ad alti livelli nelle inclusioni intracellulari caratteristiche dei neuroni di pazienti con PD. Syn è localizzata nelle terminazioni presinaptiche dei neuroni, in una posizione chiave per regolare la secrezione di neurotrasmettitori. Dati recenti inoltre indicano che Syn è presente nel fluido cerebrospinale e che trapianti di tessuto sano in pazienti con PD, spesso presentano accumuli di Syn e vanno incontro a degenerazione, suggerendo che Syn extracellulare, rilasciata dai neuroni, potrebbe essere responsabile del processo neurodegenerativo.

Lo scopo del nostro lavoro è capire l’effetto di Syn sulla funzionalità del citoscheletro nella terminazione presinaptica, dove esercita un ruolo chiave nella regolazione dell’attività neuronale e nel processo di rigenerazione neuronale. Abbiamo dimostrato l’interazione di Syn con l’actina ed un effetto sulla sua dinamica di polimerizzazione che è profondamente alterato in presenza della forma mutata di Syn. In neuroni in coltura infettati con Syn e actina fluorescenti stiamo studiando la localizzazione subcellulare e la regolazione dinamica dell’interazione tra Syn e actina, e abbiamo dimostrato che l’associazione tra le due proteine aumenta dopo stimolo depolarizzante del neurone, suggerendo un meccanismo di regolazione del rilascio di neurotrasmettitori.

I processi cellulari coinvolti nello sviluppo neuronale nelle aree del cervello nelle quali è presente neurogenesi adulta, come la polarizzazione, l’allungamento dei neuriti e la corretta migrazione dei nuovi neuroni, sono regolati dalle dinamiche citoscheletriche, come anche la rigenerazione degli assoni dopo lesione. In modelli animali di PD, la neurogenesi adulta è carente e la scarsa abilità dei neuroni a rigenerare aggrava la patologia. Noi abbiamo messo a punto un sistema di microdissezione dell’assone di neuroni in coltura per poter investigare l’effetto di Syn sui tempi e sulla capacità di rigenerazione dei processi neuritici. Seguendo la dinamica dell’actina durante la rigenerazione dell’assone dopo lesione abbiamo visto che Syn, sia introdotta nel neurone che aggiunta nell’ambiente extracellulare come proteina purificata, diminuisce la capacità di guarigione dell’assone. La comprensione dei meccanismi d’azione di Syn sulla funzionalità e sullo sviluppo dei neuroni sarà importante per identificare nuovi target terapeutici.

ABSTRACT N. 149 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile

GGP12237 350.000

Num Centri: 4

Durata (anni): 3

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2008

Ciccone Roberto (1), Fichera Marco (2,3), Elisabetta Trabetti (4), Prandini Paola (4), Della Mina Erika (1), Bayindir Baran (1), Bulgheroni Sara (5), Franco Anna (6), Bonaglia Maria Clara (7), Di Benedetto Daniela (2), Musumeci Sabastiano Antonino (2), Giusto Stefania (2), Zusi Chiara (4), Malerba Giovanni (4), Xumerle Luciano (4), Politi Pierluigi (8), Brighenti Maurizio (6), Riva Daria (5), Orsetta Zuffardi (1)

GREGGIO ELISA

Totale €

384.800

ARRAY-CGH AD ALTA RISOLUZIONE AD ANALISI D’ESPRESSIONE GENICA NELLO STUDIO DEI DISORDINI DELLO SPETTRO AUTISTICO

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Telethon grant N.

GGP08226

Totale € Num Centri: 3

ABSTRACT N. 148 Responsabile

CICCONE ROBERTO

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2012

(1) Dipartimento di Medicina Molecolare, Università di Pavia, Via Forlanini 14, 27100 Pavia Tel. 0382 987726 Fax. 0382 525030 email roberto.ciccone@unipv.it (2) IRCCS Associazione Oasi M.SS Troina, Italy (3) Genetica Medica, Università di Catania, Catania, Italy (4) Dept. Life and Reproduction Sciences, Section of Biology and Genetics, University of Verona, Verona, Italy (5) UO Neurologia dello Sviluppo, IRCCS Istituto C. Besta, Milano, Italy (6) Centro Diagnosi, Cura e Ricerca per l’Autismo, Verona, Italy (7) Istituto Scientifico E. Medea, Bosisio Parini, Italy (8) Dipartimento di Sanità Pubblica, Neuroscienze, Medicina Sperimentale e Forense, Università di Pavia, Pavia, Italy

FUNZIONE E DISFUNZIONE A LIVELLO PRESINAPTICO DI LRRK2, UNA PROTEINA CHINASI ASSOCIATA ALLA MALATTIA DI PARKINSON Civiero Laura (1), Belluzzi Elisa (1), Cirnaru Maria Daniela (2), Russo Isabella (1), Marte Antonella (3), Pischedda Francesca (2), Longo Francesco (4), Bubacco Luigi (1), Morari Michele (4), Onofri Franco (3), Piccoli Giovanni (2), Greggio Elisa (1) (1) Dipartimento di Biologia, Università degli Studi di Padova, Via Ugo Bassi 58B, 35121, Padova, Tel. +39.049.8276244, Fax +39.049.8276300; E-mail: elisa.greggio@unipd.it (2) Istituto di Neuroscienze, IN-CNR, Milano (3) Dipartimento di Medicina Sperimentale, Sezione di Fisiologia Umana, Uni-

L’autismo è caratterizzato dalla compromissione dell’interazione sociale e della comunicazione verbale e non verbale, e da comportamenti ripetitivi e stereotipati. L’autismo è considerato una delle malattie ereditarie complesse più diffuse. Varie evidenze suggeriscono

97

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

che questa malattia ha forti basi genetiche ma pochissimi geni causativi sono stati identificati. L’obiettivo del nostro progetto è quello di utilizzare la tecnica array-CGH ad alta risoluzione per identificare alterazioni genomiche in pazienti affetti da autismo e per definire il loro ruolo patologico. Inoltre, l’analisi di espressione genica su linee linfoblastoidi di questi individui viene effettuata per capire il ruolo patologico di CNVs identificate mediante array-CGH. Abbiamo esaminato 273 pazienti autistici tramite array-CGH (180K Agilent). ad alta risoluzione identificando 163 CNVs non polimorfiche in 118 pazienti. La dimensione di queste alterazioni genomiche variavano da 11 kilobasi a 4,9 megabasi; 88 CNVs erano delezioni e 75 erano duplicazioni. Molte di queste varianti sono state testate nei genitori e nei fratelli dei soggetti affetti. Ogni CNV è stata studiata confrontandola con quelle riportate nel database delle CNVs associate ad autismo e con i dati riportati in letteratura, permettendoci di distinguere tra CNVs già identificate in pazienti autistici e CNVs non lo erano.

31 CNV (18 delezioni e 13 duplicazioni) contenevano geni precedentemente riportati come associati ad autismo. Di queste , 9 erano CNVs de novo, 11 non sono state studiate nei genitori, 11 sono state ereditate da un genitore apparentemente sano. Tra i geni già noti essere associati ad autismo, abbiamo identificato alterazioni genomiche a carico di GRPR, CNTNAP2, NRXN1, SYNGAP1, AUTS2, DOCK8, DISC1, SOX11, CNTN4, ASMT, DOCK4 e NRXN3. Abbiamo inoltre identificato alcune CNVs non polimorfiche che abbiamo considerato potenzialmente causative di autismo in quanto alcuni dei geni in esse contenute hanno una funzione o espressione tali per cui sono da considerarsi buoni candidati nell’eziologia dell’autismo I campioni di sangue di soggetti autistici e le loro famiglie sono stati raccolti da quattro centri diversi centri. Dopo l’analisi array-CGH, su 27 individui portatori di sbilanciamenti genomici potenzialmente causativi della patologia, è stata eseguita un’analisi di espressione genica tramite Next Generation Sequencing dell’mRNA totale (RNASeq), al fine di meglio definire il ruolo patologico delle CNVs identificate. Tutti gli esperimenti di espressione genica sono stati effettuati usando mRNA da linee linfoblastoidi (LCL). Per valutare quali tra i geni disregolati fossero associati alla CNVs, abbiamo studiato la varianza dell’espressione in ciascun individuo selezionato identificando geni con alterazioni significative nell’espressione. Per esplorare l’impatto funzionale di CNV in nell’autismo a livello genomico, la nostra analisi si è basata sulla sovrapposizione dei dati di arrayCGH e di quelli di espressione. Abbiamo dimostrato che due geni (KIAA0430 e PKD1P6) clusterizzavano all’interno di una CNV sul cromosoma 16 potenzialmente causativa di autismo.

za degli eventi mini GABA-A e non AMPA-mediati. Cambiamenti di frequenza sono associati ad una accellerazione delle cinetiche di inattivazione. Pertanto si può ipotizzare che un alterazione dell’equilibrio eccitazione/inibizione, importante per la stabilizzazione dei circuiti neuronali, sia responsabile dei deficit comportamentali osservati nei pazienti ASD. Esperimenti preliminari eseguiti su neuroni corticali “regularspiking” di animali giovani hanno eveidenziato una riduzione di ampiezza delle correnti sinaptiche inibitorie nei topi NL3R451C KI rispetto ai controlli. Nessuna alterazione dell’equilibrio eccitazione/inibizione è stata osservata nelle cellule principali in seguito a stimolazione di fibre talamiche che fanno sinapsi sia sulle cellule principali che sugli interneuroni positivi alla parvalbumina. Questi dati suggeriscono che il ruolo della NL3 sul controllo delle proprietà sinaptiche cambia in funzione della regione o del circuito investigato.

La NL3 è localizzata a livello delle sinapsi eccitatorie ed inibitorie dove interagisce con le molecule scaffold postsinaptiche attraverso alcune sequenze consenso altamente conservate. Al fine di comprendere le proprietà funzionali di tali sequenze abbiamo generato dei mutanti deleti della NL3 e abbiamo testato la loro capacità di interagire con PSD95 e con la gefirina utilizzando esperimenti di pulldown. Dati preliminari evidenziano che la NL3 priva del dominio di legame al PDZ mantiene una interazione, seppur ridotta, con PSD95 suggerendo l’esistenza di un altro dominio della NL3 coinvolto nel reclutamento di questa molecola scaffold.

Infine, l’interazione funzionale del recettore GABAA con la gefirina alle sinapsi GABAergiche NLR R451C KI, èstata studiata in esperimenti atti ad analizzare la traiettoria di singoli recettori GABAA sulla superficie dei neuroni. Questi esperimenti hanno dimostrato che, rispetto ai controlli, i recettori GABAA sono più mobili, suggerendo un ruolo fondamentale della NL3 nella stabilizazzione dei recettori GABA-A alle sinapsi.

ABSTRACT N. 151 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile

Responsabile

CHERUBINI ENRICO

Telethon grant N.

GGP11043

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2011

Ambrosini Elena (2), Pessia Mauro (3), Apicella Fabio (1), Baldini Sara (1), Brignone Maria Stefania (2), Conti Valerio (4), D’Adamo Maria Cristina (3), Guerrini Renzo (4,1), Lanciotti Angela (2), Marchese Maria (1), Moro Francesca (1), Santorelli Filippo Maria (1), Tancredi Raffaella (1), Valvo Giulia (1), Sicca Federico (1)

385.600 Durata (anni): 3

384.300

RUOLO DEI CANALI RETTIFICATORI DI INGRESSO DEL K+ ASTROCITARI NELLA PATOGENESI DEI DISTURBI DELLO SPETTRO AUTISTICO CON SUSCETTIBILITÀ ALLE CRISI EPILETTICHE (FENOTIPO AUTISMO-EPILESSIA)

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche

Totale €

GGP11188

Totale € Num Centri: 3

ABSTRACT N. 150

Num Centri: 2

SICCA FEDERICO

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2011

MECCANISMI ALLA BASE DI UNA ALTERATA TRASMISSIONE GABAERGICA NELL’IPPOCAMPO DI TOPI TRANSGENICI PORTATORI DELLA MUTAZIONE UMANA R451C NEL GENE CODIFICANTE LA NLG3: UN MODELLO ANIMALE DI AUTISMO

(1) Epilepsy, Neurophysiology and Neurogenetics Clinical and Research Unit, IRCCS Stella Maris Foundation, Viale dei giacinti 2, 56128 Calambrone (Pisa), Italy Tel. +39.050886234, Fax +39.050886247, E-mail: fsicca@inpe.unipi.it (2) Section of inflammatory and demyelinating diseases of the central nervous system, Department of Cell Biology and Neurosciences, Istituto Superiore di Sanità, Roma (3) Department of Internal Medicine, Section of Human Physiology, University of Perugia, Perugia (4) Pediatric Neurology Unit, University Hospital A. Meyer, Florence

Barberis Andrea (2), Cellot Giada (1), Cherubini Enrico (1), Petrini Enrica (2), Pizzarelli Rocco (1), Ruggeri Federica (1), Stancheva Stefka (2), Zacchi Paola (1) (1) Neurosciece Dept., International School for Advanced Studies (SISSA), Via Bonomea 265, 34136 Trieste, Italy, Tel. 040.3787704, Fax 040.3787702, Email: cher@sissa.it (2) Department of Neuroscience and Brain Technologies, The Italian Institute of Technology, Genova, Italy

Background: La frequente comorbidità tra disturbi dello spettro autistico (ASD) ed epilessia (Fenotipo Autismo-Epilessia o AEP) suggerisce l’esistenza di meccanismi patogenetici in comune, potenzialmente legati a disfunzione dei canali gliali rettificatori di ingresso del potassio (Kir). Questi, regolando il buffering astrocitario del K+, sono essenziali per il funzionamento neuronale e sinaptico. Abbiamo recentemente individuato mutazioni gain-of-function di KCNJ10 (Kir4.1) in bambini con AEP, suggerendo che un difetto di buffering del K+ possa contribuire a determinare sia le crisi che i sintomi fondamentali dell’autismo.

Obiettivi: Allo scopo di valutare se e come difetti dei canali Kir contribuiscano a determinare l’AEP, intendiamo screenare 150 pazienti per varianti geniche in KCNJ10 (Kir4.1), KCNJ16 (Kir5.1) e KCNJ2 (Kir2.1), e caratterizzarli clinicamente per una precisa correlazione genotipo-fenotipo. Gli effetti funzionali delle mutazioni sull’attività del canale, sul trafficking intracellulare, e sulla funzione astrocitaria saranno valutati in vitro, e in vivo su un modello di topo knock-in.

Metodi: Il campione viene caratterizzato clinicamente (crisi, EEG, comportamento, sviluppo cognitivo, dati antropometrici), e geneti-

Le neurolighine sono molecole di adesione postsinaptiche che interagiscono con le neurexine presinaptiche assicurando il cross-talk tra specializzazioni post e presinaptiche. Una mutazione puntiforme nel dominio extracellulare della NL3, R451C, è stata riscontrata in alcune famiglie con figli affetti da autismo. Sebbene rare, queste mutazioni evidenziano un ruolo chiave della sinapsi nell’Autismo.

Abbiamo utilizzato un modello di topi transgenici portatori della mutazione R451C umana per determinare se, nel corso dello sviluppo, la funzione GABAergica fosse compromessa. Registrazioni elettrofisiologiche effettuate da cellule piramidali CA3 su fettine di ippocampo hanno evidenziato un aumento di frequenza dei “Giant Depolarizing Potentials”, nei topi NL3R451C KI rispetto ai controlli. Questo effetto è probabilmente dovuto ad un incremento del drive GABAergico alle cellule principali come dimostrato dall’aumentata frequen-

98

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

camente (sequenziamento diretto secondo Sanger, di KCNJ10, KCNJ16 e KCNJ2). Gli effetti funzionali delle mutazioni sono investigati utilizzando ovociti di Xenopus laevis, colture primarie di astrociti di ratto e topo, linee cellulari di astrocitoma/glioma umani e modelli computazionali in silico. E’ in costruzione un modello murino knock-in di KCNJ10 (R18Q) che sarà utilizzato per studiare in vivo e in vitro i meccanismi di malattia e per studi farmacologici.

Risultati: Abbiamo finora analizzato 128 bambini e identificato 4 varianti missenso di KCNJ10 (R18Q, V84M, R348H, R271C), in un totale di 14 individui, e la variante K346T di KCNJ2 in due fratelli. Abbiamo anche osservato che gli spasmi infantili con buona prognosi sono il tipo di crisi prevalente nei pazienti mutati. Lo studio funzionale della mutazione K346T ha evidenziato che i canali Kir2.1 mutanti mostrano una maggiore ampiezza della corrente quando espressi in ovociti di Xenopus laevis, senza differenze nella conduttanza di singolo canale rispetto al wild-type (WT). In cellule di astrocitoma umano la mutazione aumenta l’espressione e la stabilizzazione del canale sulla membrana plasmatica. Come osservato per le mutazioni di Kir4.1, anche la variante K346T di Kir2.1 sembra produrre un effetto gain-of-function.

Conclusioni: I dati preliminari rinforzano il ruolo dei difetti astrocitari nella patogenesi dell’AEP. Determinare la frequenza dei difetti dei canali Kir nell’AEP, e le loro conseguenze molecolari, fornirà nuove conoscenze sulla fisiopatologia degli ASD e delle crisi, e sui meccanismi con cui gli astrociti regolano la funzione neuronale e sinaptica. Ciò potrebbe migliorare la diagnosi e favorire lo sviluppo di strategie terapeutiche più razionali.

strazione, alla nascita, di una singola somministrazione di OXT (Schaller F et al, Hum Mol Genet 2010).

Piano sperimentale: per identificare gli effetti causati dal deficit di OXT a livello neuronale, stiamo sviluppando colture ippocampali derivate da animali Oxtr KO and Magel2 KO ed abbiamo iniziato a caratterizzare i processi modulati dall’ OXT durante la sinaptogenesi ed il differenziamento neuronale. Inoltre, siccome abbiamo precedentemente dimostrato che i neuroni derivati da animali Oxtr KO presentano una alterazione dell’ equilibrio Eccitazione/Inibizione (Sala et al., Biol Psy, 2011), stiamo studiando come l’ OXT regoli recettori, canali ionici e trasportatori coinvolti nella regolazione dell’ equilibrio GABA/Glutamato. Infine, per sviluppare nuovi agenti farmacologici, stiamo caratterizzando le proprietà farmacologiche di due nuove classi di composti: “ligandi funzional-seletive”, (Urban et al., J Pharmacol Exp Ther, 2007) e “ligandi bivalenti” (Messer, Curr Pharm Des, 2004) che speriamo possano rappresentare composti con nuove e particolari attività neurobiologiche e terapeutiche.

ABSTRACT N. 153 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile

429.000 Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2012

CARATTERIZZAZIONE DELLE ALTERAZIONI NEURONALI INDOTTE DALLE MUTAZIONI DI SHANK3 E SVILUPPO DI APPROCCI TERAPEUTICI FARMACOLOGICI E GENETICI UTILIZZANDO MODELLI ANIMALI E CELLULE IPS DEI PAZIENTI

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche CHINI BICE

Telethon grant N.

GGP12207

Totale €

136.300

Num Centri: 1

GGP11095

Totale € Num Centri: 4

ABSTRACT N. 152 Responsabile

SALA CARLO

Telethon grant N.

Durata (anni): 2

Sala Carlo (1), Verpelli Chiara (1), Vicidomini Cinzia (1), Currelli Sebastiano (2), Broccoli Vania (3), Giustetto Maurizio (4), Dityatev Alexander (2)

Anno d’inizio: 2012

(1) CNR Istituto di Neuroscienze, Via Vanvitelli 32, 20129 Milano, Tel.0250317096, Fax 027490574, email c.sala@in.cnr.it (2) Dipartimento di Neuroscienze Fondazione Istituto Italiano di Tecnologia, Genova (3) Division of Neuroscience, Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, Milano (4) Dipartimento di Anatomia, Farmacologia e Medicina Legale, Università di Torino e Istituto Nazionale di Neuroscienze, Torino

ANALOGHI DELL’OSSITOCINA NELLA SINDROME DI PRADERWILLI: NUOVI STRUMENTI PER LO STUDIO ED IL TRATTAMENTO DEI DISTURBI COMPORTAMENTALI DI TIPO AUTISTICO Busnelli Marta (1,2), Leonzino Marianna (1,2), Ceresini Ilaria (1), Chini Bice (1) (1) CNR Institute of Neuroscience, Via Vanvitelli 32, Milan, Italy, +39.02 5031695, +39.027490574, E-mail: b.chini@in.cnr.it (2) Dept. Pharmacology, University of Milan, Milan, Italy

La sindrome da delezione 22q13 è una malattia genetica priva di cure che causa una forma severa di ritardo menatale e autismo. La sindrome è caratterizzata da ipotonia neonatale, ritardo globale dello sviluppo, assenza o ritardo di linguaggio e lievi segni dismorfici.

Il fatto che ad un numero crescente di pazienti venga diagnosticata questa sindrome fa ritenere che essa possa essere una causa frequente di ritardo mentale e autismo. Tuttavia questa malattia genetica rimane sotto-diagnosticata, a causa sia della difficoltà di rilevare la microdelezione della porzione terminale del cromosoma 22 con una analisi cromosomica di routine sia di riconoscere le sue caratteristiche cliniche. I segni neurologici maggiori della sindrome da delezione 22q13 sono con molta probabilità causati dalla mancanza di una delle due copie del gene SHANK3/PROSAP2, che codifica per una proteina strutturale del sistema nervoso coinvolta nella formazione delle spine dendritiche. Mutazioni di SHANK3 sono state identificate anche in pazienti con differenti forme di ritardo mentale e autismo. Con questo progetto ci proponiamo di caratterizzare in dettaglio il ruolo di SHANK3 nel corretto funzionamento delle sinapsi del cervello.

Abbiamo utilizzato una serie di tecnologie complementari tra le quali anche modelli animali. Per meglio caratterizzare la patologia nell’uomo abbiamo usato anche cellule pluripotenti ottenute direttamente dai pazienti affetti dalla sindrome che verranno differenziate in neuroni e che ci consentiranno di identificare le alterazioni neuronali che causano la patologia. Infine utlizzeremo tutti questi modelli sperimentali per sviluppare terapie farmacologiche e genetiche che possano migliorare le alterazioni neuronali e cliniche dei pazienti.

Stato dell’ arte e razionale: la sindrome di Prader-Willi syndrome (PWS) è una malattia genetica rara che colpisce 1: 25,000 nati vivi. I neonati e bambini PWS presentano gravi problemi alimentari associati a uno spettro complesso e variabile di disturbi neuroendocrini e comportamentali che perdurano in età adulta. Ad oggi, non è disponibile nessun trattamento farmacologico specifico e l’impiego di antidepressivi, neurolettici e regolatori dell’ appetito si è dimostrato di limitata efficacia nel trattamento dei disturbi comportamentali dei soggetti PWS. L’ossitocina (OXT), un neuropeptide prodotto dall’ ipotalamo, è stata recentemente dimostrata giocare un ruolo chiave nella patogenesi del PWS: gli individui PWS presentano infatti una riduzione del numero di neuroni ossitocinergici nell’ ipotalamo, a cui corrisponde una riduzione dei livelli di neuropeptide circolante. L’ OXT, per il suo coinvolgimento sia nella regolazione dell’ assunzione di cibo che delle relazioni sociali, rappresenta quindi un nuovo potenziale ausilio terapeutico in questa malattia. Studi clinici pilota hanno dimostrato un effetto positivo dell’ OXT nei disturbi della sfera sociale in soggetti autistici, nella schizofrenia e nei disturbi d’ansia; in uno studio clinico molto ristretto ma di grande interesse, l’ OXT si è inoltre rivelata in grado di migliorare le interazioni sociali di soggetti PWS (Tauber et al Orphanet J Rare Dis 2011). Tuttavia, i trattamenti farmacologici con OXT sono al momento limitati dal fatto che il peptide naturale possiede una scarsa selettività recettoriale e breve emivita. E’ quindi necessario sviluppare nuovi analoghi farmacologici, più selettivi e potenti, che consentano da un lato di studiare e identificare gli effetti neurobiologici del peptide, e, dall’ altro, di agire su sintomi specifici di pazienti PWS. Scopo: Il nostro progetto ha come scopo lo sviluppo di nuovi agenti farmacologici in grado di trattare sintomi o gruppi di sintomi nei soggetti affetti da PWS. Questi farmaci verranno caratterizzati per i loro effetti sul differenziamento neuronale, sulla sinaptogenesi e sulla plasticità sinaptica utilizzando colture neuronali ottenute da due modelli anmali: topi KO per il recettore dell’ OXT e topi KO per il gene Magel2; questi ultimi presentano un fenotipo parziale di PWS che può essere completamente normalizzato dalla sommini-

ABSTRACT N. 154 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile

GGP07264

Totale €

279.000

Num Centri: 2

99

CATANIA MARIA VINCENZA

Telethon grant N.

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2007

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

COINVOLGIMENTO DEI RECETTORI METABOTROPICI DEL GLUTAMMATO DEL GRUPPO I NELLA FISIOPATOLOGIA DELLA SINDROME DEL CROMOSOMA X FRAGILE

(1) Istituto di Genetica Medica, Università Cattolica del Sacro Cuore, Largo Francesco Vito 1, 00168 Roma, Italia, Tel. 06.3054449; Fax 06.30157223; Email: gneri@rm.unicatt.it (2) Dipartimento di Biologia Sperimentale e Scienze Biochimiche, Facoltà di Medicina e Chirurgia, Università di Roma Tor Vergata, Roma, Italia

Bonaccorso Carmela Maria (1,2), D’Antoni Simona (1), Spatuzza Michela (1), Molinaro Gemma (3), Aloisi Elisabetta (1,4,5), Musumeci Sebastiano (2), Battaglia Giuseppe (3), Nicoletti Ferdinando (3,6), Davidovic Laetitia (7), Bardoni Barbara (7), Catania Maria Vincenza (1,2)

La sindrome del cromosoma X Fragile (FXS) rappresenta la forma più frequente di ritardo mentale ereditario ed è dovuta a mutazioni che inattivano FMR1, un gene localizzato sul cromosoma X che contiene una sequenza ripetuta CGG nel promotore. L’espansione di questa sequenza oltre le 200 triplette CGG (full mutation) induce modificazioni epigenetiche che a loro volta determinano l’inattivazione trascrizionale del gene FMR1 e l’assenza della corrispondente proteina FMRP. Il gruppo del Coordinatore ha già dimostrato che FMR1 può essere riattivato trattando cellule di pazienti FXS con l’agente demetilante 5-azadesossicitidina. Avevamo proposto di: 1) screenare decine di composti potenzialmente riattivanti, in collaborazione col Broad Institute (Harvard e MIT) e la ditta Neuropharm (UK); 2) caratterizzare le modificazioni epigenetiche critiche per la regolazione trascrizionale del gene in pazienti FXS ed in rari maschi non affetti ma portatori di una “full mutation” non metilata (UFM); 3) analizzare lo status di cellule iPS (Pluripotenti indotte) derivate da fibroblasti di controli normali, pazienti FXS e portatori di UFM. I risultati finora ottenuti possono essere riassunti come segue: 1) 20 composti con attività potenzialmente riattivante forniti dal Dr. Steve Haggarty del Broad Institute (Harvard & MIT) sono stati testati, ma nessuno aveva un’attività riattivante degna di nota. Abbiamo quindi approfondito gli iniziali trattamenti con 5.azadC, seguendo gli effetti del trattamento fino a 4 settimane dopo la sospensione. Abbiamo scoperto che l’effetto aumenta fino a circa una settimana dalla fine del trattamento e consente di raggiungere livelli di trascritto simili a quelli di un controllo normale. 2) abbiamo esteso l’analisi delle modificazioni epigenetiche del locus FMR1 in soggetti normali, pazienti FXS e portatori di UFM, studiando la metilazione del DNA nella regione 1000 bp a monte del promotore e approfondendo il ruolo di CTCF nella regolazione della trascrizione di FMR1 e del suo antisenso asFMR1. 3) La collaborazione col Dr. Guoping Fan dell’Università di California a Los Angeles (UCLA) non è potuta proseguire e la Dr.ssa Pirozzi si è trasferita a Leuven, dove il Partner ha un altro laboratorio, e sta cercando di ottenere lì le cellule iPS. Il gruppo del Partner si interessa da anni ai meccanismi cellulari e molecolari che sottendono le anomalie delle spine dendritiche dei pazienti FXS, avvalendosi di un modello murino (Fmr1 KO) della sindrome. Il Partner 1 ha studiato l’interazione di FMRP con i microRNA (miRNA) e, impiegando un approccio basato sulla tecnologia microarray in collaborazione col Dr. Victor Ambros (Umass, USA), ha osservato che l’assenza di FMRP causa l’alterazione dei livelli di alcuni miRNA sinaptici. Il passaggio successivo è consistito nell’identificazione di alcuni mRNA messaggeri che interagiscono con i miRNA differenzialmente espressi, per caratterizzarne il potenziale effetto sulla morfologia delle spine dendritiche.

(1) ISN-CNR, Catania, Italy; - ISN-CNR, via Gaifami 18 95126 Catania, Italy Tel.+39/095-7338134 E-mail: m.catania@isn.cnr.it (2) IRCCS Oasi Maria SS, Troina (EN), Italy (3) Dept. of Neurosci., Neuromed, Pozzilli (IS), Italy (4) PhD program in Neuropharmacology, University of Catania, Catania, Italy (5) Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), U862, Neurocentre Magendie, Univ. Bordeaux II, Bordeaux Cedex, France (6) Dept. of Pharmacol., “La Sapienza”, Rome, Italy (7) CNRS UMR 6097, Univ. de Nice Sophia-Antipolis, Nice, France

La sindrome del cromosoma X fragile (FXS) è la forma più comune di disabilità intellettiva ereditaria. E ‘causata dall’assenza di FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein), una proteina coinvolta nella traduzione e nel trasporto degli mRNA ad essa legati. FMRP si trova nei complessi ribonucleoproteici e interagisce direttamente con diverse proteine, tra cui altre proteine leganti RNA, quali i suoi paraloghi FXR1P e FXR2P. Il significato funzionale di questa interazione è attualmente sconosciuto.

Numerosi studi avvalorano un ruolo centrale dei recettori mGlu del gruppo I, mGlu5 in particolare, nella fisiopatologia della FXS: 1) l’attivazione dei recettori mGlu1/5 stimola la traduzione di mRNA a livello delle sinapsi, 2) alcune forme di plasticità sinaptica dipendenti dalla sintesi proteica e indotte dall’ attivazione dei recettori mGlu del I gruppo sono incrementate in topi Fmr1 Knock Out (KO); 3) un ridotto numero di recettori mGlu5 interagiscono con le proteine costitutive Homer in topi Fmr1 KO, 4) antagonisti di mGlu5 attenuano il fenotipo patologico in modelli animali di FXS. Il blocco dei recettori mGlu è considerata una possibile strategia terapeutica nella FXS, ma i meccanismi alla base delle alterate risposte mediate dall’attivazione dei recettori mGlu5 nella FXS non sono chiari.

Noi abbiamo studiato nei topi normali e Fmr1 KO: 1) la distribuzione regionale, l’espressione di superficie, la localizzazione in dendriti/assoni dei recettori mGlu5, nonchè la loro internalizzazione dopo esposizione ad agonisti; 2) l’idrolisi dei polifosfoinositidi (PPI) attivata dalla stimolazione dei recettori mGlu1/5; 3) il rilascio del glutammato in vivo; 4) il profilo di espressione proteica in sinaptosomi di corteccia; 5) la modulazione dell’interazione tra FMRP, FXR1P e FXR2P da parte dei recettori mGlu del gruppo I. Abbiamo osservato che: a) in topi Fmr1 KO i recettori mGlu5 sono più espressi nei sinaptosomi ippocampali negli animali giovani, ma non negli adulti; b) in neuroni Fmr1 KO i recettori mGlu5 sono più espressi sulla superficie cellulare e non internalizzano. Essi sono presenti negli assoni nei neuroni KO, ma non nei WT; c) l’idrolisi del PPI mediata dai recettori mGlu5 è maggiore nei topi Fmr1 KO rispetto ai WT, nei giovani, ma è invariata nell’adulto, d) il rilascio di glutammato indotto da depolarizzazione è ridotto in topi Fmr1 KO; e) esistono differenze nel profilo di espressione di proteine sinaptiche tra WT e KO, ma solo in topi giovani e non in topi adulti f) l’attivazione del recettore mGlu5 riduce l’interazione tra FMRP/FXR2P nei WT e FXR1P/FXR2P nei KO. In conclusione, i nostri studi suggeriscono un’alterata regolazione dei recettori mGlu5 nel FXS con effetti evidenti durante lo sviluppo e suggeriscono un potenziale coinvolgimento del compartimento pre-sinaptico nel fenotipo FXS; inoltre, essi hanno rivelato una nuova funzione dei recettori mGlu5, quali modulatori della interazione tra FMRP ed i suoi paraloghi FXR1P e FXR2P.

ABSTRACT N. 156 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile

GGP10150 253.500

Num Centri: 2

Durata (anni): 2

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2011

Allegra Manuela (1,2), Spalletti Cristina (1,3), Redolfi Nelly (4), Murru Luca (5), Lodovichi Claudia (4,6), Passafaro Maria (5,7), Caleo Matteo (1) (1) CNR Neuroscience Institute Via G. Moruzzi 1, 56124 Pisa, Italy, Tel. +39.050.3153195, Fax +39.050.3153220 E-mail: caleo@in.cnr.it (2) Scuola Normale Superiore, Pisa (3) Scuola Superiore S. Anna, Pisa (4) Venetian Institute of Molecular Medicine (VIMM), Padua (5) CNR Neuroscience Institute, Milan (6) CNR Neuroscience Institute, Padua (7) Dulbecco Telethon Institute (DTI), Milan

NERI GIOVANNI

Totale €

348.600

SVILUPPO E FUNZIONE DEI CIRCUITI NEURONALI IN UN MODELLO DI RITARDO MENTALE ASSOCIATO AL CROMOSOMA X

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Telethon grant N.

GGP11116

Totale € Num Centri: 3

ABSTRACT N. 155 Responsabile

CALEO MATTEO

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2011

MECCANISMI DI RIATTIVAZIONE DEL GENE FMR1 ED ANALISI DELLA PATOGENESI MOLECOLARE DELLA SINDROME X FRAGILE: VERSO UNA TERAPIA FARMACOLOGICA

La disabilità intellettiva (ID) è una complessa patologia del sistema nervoso centrale la cui ezio-patogenesi rimane largamente oscura.

Il contributo genetico all’eziologia della ID è noto e tra le condizioni genetiche, la più frequente è la forma di ID associata a mutazioni di geni localizzati sul cromosoma X. Oligophrenin-1 (OPHN1) è un ge-

Neri Giovanni (1), Bagni Claudia (2), Tabolacci Elisabetta (1), Zalfa Francesca (2), Chiurazzi Pietro (1)

100

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

ne situato sul cromosoma X associato a ID. Il coinvolgimento di OPHN1 nella ID è stato stabilito attraverso la identificazione di mutazioni in OPHN-1 in pazienti con ID. OPHN1 è espressa in aree cerebrali caratterizzate da alta plasticità sinaptica, quali l’ippocampo e il bulbo olfattivo. È stato ipotizzato che mutazioni a carico di OPHN1 siano responsabili di alterazioni morfologiche e anomalie nella formazione di contatti sinaptici tra i neuroni. Connessioni neuronali anomale sono responsabili di alterazioni del funzionamento dei rispettivi circuiti neuronali. Si ritiene che da questo alterato funzionamento dipendano i deficit cognitivi riscontrati nella ID. La specificità delle connessioni neuronali è infatti essenziale per un normale funzionamento del sistema nervoso centrale. Capire i meccanismi di base che portano ad alterazioni nella morfologia, e nella formazione e funzione dei circuiti neuronali a seguito di alterazioni in OPHN1 è essenziale per poter progettare un possibile approccio terapeutico per la disabilità intellettiva.

Nel presente progetto ci proponiamo di capire i meccanismi di base che sottendono l’eziopatogenesi della ID associata a mutazioni di OPHN1, analizzando le potenziali alterazioni morfologiche e funzionali dei circuiti neuronali in un modello murino di ID associato alla perdita di funzione di OPHN1. Il bulbo olfattivo e l’ippocampo sono strutture ideali per questi studi, in quanto contengono neuroni che si rigenerano continuamente, e che vanno incontro a tutta una serie di processi di maturazione anatomica e funzionale prima di inserirsi nel circuito preesistente. Stiamo quindi valutando la neurogenesi e la maturazione dei neuroni neogenerati in topi di fenotipo selvatico e topi mutanti per OPHN1. Stiamo inoltre esaminando i circuiti inibitori nei topi mutanti, in quanto tutta una serie di dati in letteratura supportano un ruolo chiave delle alterazioni del sistema GABAergico nella eziopatogenesi della ID e dell’autismo. In particolare, dati preliminari ottenuti su neuroni ippocampali indicano una significativa diminuzione dell’ampiezza delle correnti postsinaptiche inibitorie in neuroni che mancano di OPHN1. E’ interessante notare come la frequenza delle correnti inibitorie non sia alterata nei neuroni privati di OPHN1. Questi dati suggeriscono un ruolo di OPHN1 nel regolare la trasmissione sinapsi inibitoria nell’ippocampo. Studi neuroanatomici in corso sono mirati a corroborare questi dati elettrofisiologici, e puntano a valutare la densità e la tipologia dell’innervazione GABAergica nell’ippocampo e nel bulbo olfattivo di topi mutanti per OPHN1.

di ippocampo e corteccia. la riduzione del numero di interneuroni migrantie la loro morfologia alterata indicano un ruolo di Rac1 e Rac3 nella rgolazione della motilità di queste cellule, interferendo con la loro localizzazione finale. Questi difetti potrebbero contribuire al fenotipo epilettico dei topi dKO. I topi con la rimozione condizionale di Rac1 nei neuroni mostrano una perdita di interneuroni positivi per PV minore, e diventano epilettici da adulti. (c) L’analisi elettrofisiologica dei circuiti ippocampali in sezioni di cervello mostra la maggiore sensibilità dei cervelli dKO all’induzione di crisi epilettiche a basse dosi di 4-aminopiridina rispetto ai controlli. Mentre le proprietà passive e attive dei neuroni piramidali (incluse capacità della membrana, potenziale di riposo, ampiezza e durata degli spike) sono normali, queste cellule mostrano la riduzione delle correnti inibitorie spontanee. Obiettivo 2 - Confronto tra topi Rac1N e Rac3KO. L’analisi comportamentale ha mostrato nei topi Rac1N difetti comparabili ma più pronunciati di quelli osservati nei Rac3-KO (Corbetta et al, 2008). Stiamo cercando differenze in altri aspetti della memoria, paura, o ansia. Obiettivo 3 – Interazioni funzionali tra le Rac e i complessi GIT durante lo sviluppo neuronale. Con la spettroscopia di massa abbiamo identificato un pattern composito di complessi GIT/PIX/PAK nel cervello, che include diverse isoforme per le proteine betaPIX, alfaPIX, e PAK3, dove le ultime due sono alterate nel Ritardo Mentale. La biochimica non rivela differenze nella composizione di questi complessi tra cervelli WT e mutati. In parallelo abbiamo dimostrato la forte riduzione di ramificazioni dendritiche in culture ippocampali in seguito a silenziamento di aPIX o di GIT2, che suggerisce che i complessi aPIX/GIT2 sono importanti per la maturazione dendritica, un pre-requisito per il normale sviluppo delle spine dendritiche.

ABSTRACT N. 158 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile

GGP12126 284.800

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2011

Ricciardi Sara (1), Ungaro Federica (1), Hambrock Melanie (2), Rademacher Nils (2), Sessa Alessandro (1), Kalscheuer Vera M. (2), Broccoli Vania (1)

DE CURTIS IVAN

Totale €

349.700

BASI MOLECOLARI E MODELLI CELLULARI DELLE MALATTIE NEUROLOGICHE INFANTILI CAUSATE DA MUTAZIONI DEL GENE CDKL5

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Telethon grant N.

GGP11110

Totale € Num Centri: 2

ABSTRACT N. 157 Responsabile

BROCCOLI VANIA

Telethon grant N.

(1) Istituto Scientifico San Raffaele, Via Olgettina 58, 20132 Milan. Tel. 02.26434616. E-mail: broccoli.vania@hsr.it (2) Max Planck Institute for Molecular Genetics, Department of Human Molecular Genetics, Berlin, Germany

Anno d’inizio: 2012

RUOLO DELLE GTPasi DELLA FAMIGLIA RHO DURANTE LO SVILUPPO NEURONALE

La sindrome di Rett è un patologia dello sviluppo neurologico e rappresenta una delle cause più comuni di ritardo mentale nelle bambine. Per molto tempo MECP2 è stato considerato l’unico gene responsabile della malattia. Tuttavia, recenti ricerche hanno identificato mutazioni nel gene CDKL5 come responsabili di una particolare forma di Rett associata a forti crisi epilettiche. Questa variante di Rett si caratterizza dall’assenza di un periodo di normale sviluppo perinatale dovuto all’insorgenza di gravi forme di epilessia subito dopo la nascita. Oltre all’epilessia le pazienti presentano molti dei tratti clinici tipici della sindrome di Rett, come la perdita della parola, lo sviluppo di stereotipie e microcefalia. Questa particolare forma di Rett è quasi esclusivamente dovuta a mutazioni del gene CDKL5. Questo gene codifica per una proteina chinasi capace di attività fosforilasica poco caratterizzata fino ad oggi. Recentemente, il nostro lavoro ha dimostrato come CDKL5 sia localizzata nei neuroni del cervello durante la loro maturazione ed attività e localizza principalmente nelle sinapsi. Infatti, CDKL5 è necessario per la corretta formazione e mantenimento delle sinapsi eccitatorie. Neuroni privi di CDKL5 sviluppano spine dendritiche immature e morfologicamente alterate. Nello spazio sinaptico CDKL5 interagisce con la proteina NGL-1 fosforilandone il residuo aminoacidico Ser-631. Questo evento rafforza l’interazione di NGL-1 con la proteina PSD95 stabilizzando la struttura sinaptica. Questi risultati svelano i meccanismi molecolari che sono regolati da CDKL5 per uno sviluppo corretto sinaptico. Il ruolo di CDKL5 in sinapsi è mantenuto anche in neuroni umani. Infatti, neuroni glutamatergici derivati da cellule iPS riprogrammate di pazienti mostrano un numero sostanzialmente ridotto di contatti sinaptici maturi.

Vaghi Valentina (1), Pennucci Roberta (1), Talpo Francesca (2), Corbetta Sara (1), Totaro Antonio (1), Montinaro Valentina (1), Barone Cinzia (1), Croci Laura (3), Spaiardi Paolo (2), D’Adamo Patrizia (4), Bachi Angela (3), Consalez G. Giacomo (3), Biella Gerardo (2), de Curtis Ivan (1) (1) Università Vita-Salute San Raffaele e Istituto Scientifico San Raffaele, via Olgettina 58, 20132 Milano, Tel. 02.26434828; Fax 02.26434844; decurtis.ivan@hsr.it (2) Dipartimento di Scienze Fisiologiche e Farmacologiche, Università di Pavia (3) Istituto Scientifico San Raffaele, Milano (4) Dulbecco Telethon Institute presso Istituto Scientifico San Raffaele, Milano

Gli scopi del nostro progetto riguardano la caratterizzazione dei fenotipi indotti dalla rimozione genica delle GTPasi neuronali Rac1 e Rac3 in topi knockout (KO), e l’analisi della funzione di complessi effettori di Rac coinvolti nel Ritardo Mentale durante lo sviluppo neuronale. Durante il primo anno, il progetto si è sviluppato come segue: Obiettivo 1 – Analisi dei Meccanismi che causano evidenti Difetti nel Cervello dei doppi KO (dKO). (a) Né la proliferazione dei precursori, né la morte o difetti di migrazione cellulare spiegano la forte perdita di “mossy cells” (MCs) nell’ilo dei topi dKO. (b) Dall’analisi dell’espressione delle Rac in situ e della sinapsinaI-Cre, abbiamo identificato gli interneuroni GABAergici come possibili target del dKO. Infatti, abbiamo trovato un forte difetto di interneuroni GABAergici positivi per Lhx6 in corteccia ed ippocampo dei topi dKO, dovuto soprattutto alla perdita degli interneuroni positivi per la parvalbumina (PV). La rimozione delle Rac influenza anche la maturazione degli interneuroni che raggiungono la destinazione finale, causando la riduzione delle sinapsi inibitorie nelle cellule piramidali

101

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

ABSTRACT N. 159

APPROCCI FARMACOLOGICI PER IL RIPRISTINO DEI LIVELLI DI BDNF IN MODELLI CELLULARI ED ANIMALI DELLA SINDROME DI RETT

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche CIANI ELISABETTA

Responsabile Telethon grant N.

GGP11147

Totale €

458.700

Num Centri: 4

Durata (anni): 3

Bittolo Tamara, Baj Gabriele, Vaghi Valentina, Tongiorgi Enrico Brain Centre for Neuroscience, Dipartimento di Scienze della Vita, Università di Trieste, Via Giorgieri, 5 - edif.Q, 34127 Trieste, Tel. 040.5588724, E-mail: tongi@units.it

Anno d’inizio: 2011

CDKL5, UN NUOVO GENE ALLA BASE DI UNA VARIANTE DELLA SINDROME DI RETT, GIOCA UN RUOLO CHIAVE NELLA REGOLAZIONE DELLA PROLIFERAZIONE, MORTE E DIFFERENZIAMENTO DEI PRECURSORI NEURONALI

La sindrome di Rett (RTT) è la principale causa di ritardo mentale nelle bambine. La RTT è causata da mutazioni in un gene situato sul cromosoma X, denominato MECP2, che in condizioni normali regola l’espressione di numerosi geni. Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF) risulta espresso a livelli ridotti rispetto al nomale in modelli animali della RTT. Due recenti studi hanno dimostrato che in modelli animali di RTT, è possibile invertire il decorso della malattia mediante espressione di alti livelli di BDNF. Mediante PCR quantitativa, abbiamo determinato l’espressione residuale dei trascritti del BDNF in cervelli umani di soggetti normali e affetti da RTT nelle cortecce somatosensoriali e motorie e abbiamo trovato livelli diversi di trascritti a seconda della mutazione del gene MeCP2. Inoltre, abbiamo determinato i livelli dei trascritti del BDNF nella corteccia e nell’ippocampo di topi normali e in topi transgenici con delezione del gene MeCP2 (Bird) a differenti stadi post-natali. Dato che la terapia genica presenta notevoli difficoltà pratiche abbiamo ritenuto opportuno intraprendere un progetto che individui un approccio farmacologico verso la cura della RTT. Abbiamo quindi condotto un’analisi farmacologica sistematica mediante un saggio in vitro basato su luciferasi per determinare quali composti possono essere usati per stimolare la sintesi BDNF. La combinazione di serotonina e norepinefrina è risultata essere la più efficace nello stimolare la sintesi del BDNF. Abbiamo quindi testato in topi con delezione del MeCP2, l’effetto di desipramina e mirtazapina, due antidepressivi che inducono un aumento combinato di serotonina e norepinefrina. Abbiamo rilevato che in sole due settimane di trattamento, lo spessore della corteccia sensoriale, che nei topi MeCP2-ko è ridotta del 20% rispetto ai topi normali, può essere parzialmente recuperato con dedipramina e che con mirtazapina si ottenevano risultati ancora più significativi. Sono possibili future applicazioni cliniche in quanto si tratta di farmaci già approvati per l’uso nell’uomo.

Trazzi Stefania (1), Fuchs Claudia (1), Emanuele Valli (2), Amendola Elena (3), Giustetto Maurizio (4), Pizzorusso Tommaso (5), Calzà Laura (6), Bartesaghi Renata (1), Gross Cornelius (3), Perini Giovanni (2), Ciani Elisabetta (1) (1) Dipartimento di Scienze Biomediche e Neuromotorie, Università di Bologna, Tel. 051.2091726, Fax 051.2091737, E-mail: elisabetta.ciani@unibo.it (2) Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie, Università di Bologna (3) European Molecular Biology Laboratory, EMBL, Monterotondo (Roma) (4) Dipartimento di Anatomia, Farmacologia e Medicina Legale, Università di Torino (5) Istituto di Neuroscienze del CNR, Pisa (6) Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie, Università di Bologna

La Sindrome di Rett (RTT) è una grave patologia neurologica progressiva caratterizzata da un precoce arresto dello sviluppo neurologico e da declino cognitivo. Recentemente, sono state identificate mutazioni nel gene CDKL5, situato sul cromosoma X, in pazienti con RTT caratterizzata da crisi epilettiche ad esordio precoce. Nonostante il chiaro coinvolgimento di mutazioni di CDKL5 in questa variante della RTT, restano ancora da chiarire le funzioni che tale proteina svolge durante lo sviluppo cerebrale ed i meccanismi molecolari che ne regolano l’espressione. In questo studio abbiamo utilizzato approcci in vivo ed in vitro, per ottenere nuove evidenze riguardo al ruolo di CDKL5 nei processi alla base dello sviluppo cerebrale.

Tramite l’utilizzo di linee cellulari di neuroblastoma come modello neuronale, abbiamo scoperto che l’inibizione dell’espressione di CDKL5 causa un incremento della proliferazione cellulare ed una riduzione del differenziamento. Viceversa, un incremento dell’espressione di CDKL5 causa un arresto del ciclo cellulare e promuove il differenziamento. Questi dati indicano che CDKL5 ha un’azione antiproliferativo e pro-differenziativo in cellule neuronali. E’ interessante osservare che MYCN, un fattore di trascrizione che promuove la proliferazione cellulare durante lo sviluppo cerebrale, inibisce l’espressione di CDKL5. Abbiamo scoperto che MYCN direttamente reprime il promotore di CDKL5, suggerendo l’esistenza di un asse funzionale tra MYCN e CDKL5. L’inibizione esercitata da MYCN sul promotore di CDKL5 è stata confermata nei granuli cerebellari, indicando un’inibizione MYCN-dipendente di CDKL5 in tipi diversi di precursori neuronali. Per ottenere un modello sperimentale che mimi la patologia umana abbiamo creato un topo knockout (KO) costitutivo per Cdkl5 mediante delezione dell’esone 4 del gene Cdkl5. Analisi di Western blot degli estratti cerebrali e di immunofluorescenza su sezioni cerebrali confermano l’assenza di espressione della proteina Cdkl5 nei topi maschi emizigoti e nelle femmine omozigoti, e livelli di espressione intermedi nelle femmine eterozigoti. I topi KO per Cdkl5 sono vitali e possono quindi essere utilizzati per studiare gli effetti delle mutazioni di CDKL5 in vivo. A conferma del ruolo antiproliferativo di CDKL5 osservato in vitro, abbiamo osservato che i topi KO hanno un tasso di proliferazione dei precursori neuronali più elevato rispetto ai wild type, sia nel giro dentato dell’ippocampo che nella zona subventricolare. Tali aree cerebrali sono anche caratterizzate da un incremento di apoptosi che causa una riduzione del numero finale di neuroni malgrado l’incremento di proliferazione.

Nel complesso i nostri risultati evidenziano un ruolo critico di CDKL5 nel controllo di proliferazione, apoptosi e differenziamento dei neuroni e pongono le basi per una migliore comprensione dei sintomi neurologici osservati durante le prime fasi della maturazione cerebrale nei pazienti con mutazioni del gene CDKL5.

ABSTRACT N. 161 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile

GGP08258 99.700

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2009

Meloni Ilaria (1), Broccoli Vania (2), Livide Gabriella (1), Ricciardi Sara (2), Mari Francesca (1), Ariani Francesca (1), Renieri Alessandra (1) (1) Medical Genetics, Department of Biotechnology, University of Siena, Phone +39.0577.233303, Fax +39.0577.233325, E-mail: renieri@unisi.it (2) San Raffaele Scientific Institute, Dibit, Milano, Italy

La sindrome Rett classica (RTT) è dovuta a mutazioni nel regolatore trascrizionale MECP2. Mutazioni in FOXG1 causano la variante congenita. FOXG1 codifica per un repressore trascrizionale che ha un ruolo essenziale nello sviluppo del telencefalo. In particolare Foxg1 è implicato nella regolazione dell’arealizzazione corticale e della proliferazione delle cellule progenitrici. La sua espressione persiste nel cervello adulto suggerendo un ruolo anche nei neuroni postmitotici. I fenotipi simili risultanti da mutazioni nei due geni suggeriscono che MeCP2 e FoxG1 potrebbero interagire, o quanto meno partecipare a vie di segnalazione comuni. Per verificare questa ipotesi abbiamo effettuato esperimenti di co-immunoprecipitazione su HEK293T e neuroni primari ma non abbiamo evidenziato una interazione diretta. E’ comunque possibile che le due proteine partecipino a vie di segnalazione comuni senza interagire direttamente. Poiché sono coinvolti entrambi nel controllo trascrizionale, tali vie di segnalazione potrebbero riguardare la regolazione dell’espressione di geni specifici. Nonostante gli intensi forzi di ricerca, solo pochissimi geni bersaglio di FoxG1 sono stati identificati. Per identificare tali geni e verificare se esistano geni comuni al network di MeCP2, abbiamo confrontato i profili di espressione genica nel cervello di topi

TONGIORGI ENRICO

Totale €

293.100

SINDROME DI RETT CONGENITA: MODELLI CELLULARI E MURINI PER LO STUDIO DEL RUOLO DI FOXG1 NELLA NEUROGENESI

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Telethon grant N.

GGP09117

Totale € Num Centri: 2

ABSTRACT N. 160 Responsabile

RENIERI ALESSANDRA

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2008

102

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

eterozigoti Foxg1+/- e di controlli al giorno postnatale 30. L’analisi ha identificato 55 geni con espressione alterata: 28 sovra-espressi e 27 sotto-espressi. Un set di 15 geni sono stati scelti per la successiva validazione, sulla base della loro funzione.

Il silenziamento di MECP2 in neuroni di topo in coltura ha permesso di identificare specifici fenotipi, consistenti con le osservazioni su tessuto cerebrale autoptico. Per verificare se l’assenza di Foxg1 causasse cambiamenti simili e definire la sua funzione a livello cellulare abbiamo manipolato i livelli di Foxg1 in neuroni in coltura. La sua sotto-espressione tramite shRNA causa un aumento della ramificazione dendritica e la comparsa di spine sottili e immature; la densità delle spine risulta aumentata. L’aumento dei livelli di Foxg1 causa una riduzione della ramificazione dendritica; non si osservano effetti sulle spine, a parte una riduzione della loro lunghezza.

Nel 2007 è stato dimostrato che è possibile riprogrammare fibroblasti umani in iPS (cellule staminali pluripotenti indotte) e differenziare poi queste cellule in neuroni. Questa tecnologia offre l’opportunità unica di ricapitolare in vitro la formazione di un tessuto in condizioni sia normali che patologiche. Per questo motivo all’inizio del progetto abbiamo deciso di ottenere iPS da fibroblasti di pazienti con mutazioni in FOXG1 e differenziarle in neuroni. Dopo diversi tentativi abbiamo finalmente riprogrammato i fibroblasti di una paziente con una mutazione troncante in FoxG1 (p.S323fsX325). La caratterizzazione dei cloni è stata completata e stiamo procedendo con il differenziamento neuronale

della sottopopolazione CR+ è alterata in questi mutanti. È interessante notare che in topi eterozigoti femmine MeCP2 +/-, un modello che mima molti aspetti di sintomi RTT, erano ricapitolate la maggior parte delle alterazioni presenti nei topi dei topi privi di MeCP2.

Le spine dendritiche sono anch’esse alterate nei mutanti MeCP2.

Per monitorare la dinamica delle spine dendritiche in mutanti MeCP2 abbiamo usato la microscopia in vivo a due fotoni nei topi MeCP2y/-::GFP. Abbiamo trovato che la mutazione risulta in una compromessa produzione e plasticità dei filopodi che suggerisce che i processi coinvolti nella regolazione delle protrusioni filopodiali sono alla base dei difetti delle spine dendritiche presenti nei mutanti MeCP2.

Per valutare le alterazioni cerebrali nei pazienti con sindrome di Rett, abbiamo analizzato 13 pazienti con mutazione MeCP2 (fascia d’età anni 2-21). Tutti i pazienti sono stati sottoposti a controlli clinici regolari e periodici follow-up con EEG e una valutazione speciale per le funzioni respiratorie. La somministrazione di TMS a singolo impulso ha mostrato un ridotto tempo di conduzione motorio. La risonanza magnetica, funzionale e anatomica (voxel-based morphometry, VBM; Etichettatura Spin arteriosa, ASL; Diffusion Tensor Imaging, DTI), è stata eseguita in 10 pazienti del nostro campione e l’analisi dei dati e la comparazione con controlli adeguati è ancora in corso.

ABSTRACT N. 163

ABSTRACT N. 162

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile

PIZZORUSSO TOMMASO

Telethon grant N.

GGP09196

Totale €

482.200

Num Centri: 4

Durata (anni): 3

GGP10032

Totale €

398.600

Num Centri: 2 Anno d’inizio: 2009

LANDSBERGER NICOLETTA

Telethon grant N.

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2010

RUOLO DELLA FOSFORILAZIONE DI MECP2 E DELLE CHINASI IMPLICATE NELLA SINDROME DI RETT E NELL’ENCEFALOPATIA EPILETTICA INFANTILE PRECOCE-2

RETT E VALIDAZIONE DI TERAPIE IN MODELLI PRECLINICI: UNO STUDIO GENOMICO, MORFOFUNZIONALE E COMPORTAMENTALE NEI MODELLI ANIMALI E NEL PAZIENTE

Bergo Anna (1), Strollo Marta (1), Kisltrup-Nielsen Charlotte (1), Soddu Silvia (2), Landsberger Nicoletta (1)

Pizzorusso Tommaso (1), Battini Roberta (4), Biagi Laura (4), Calcagno Eleonora (2), Casarano Manuela (4), Cea Valentina (3), Cioni Giovanni (4), Giustetto Maurizio (2), Guzzetta Andrea (4), Landi Silvia (5), Lonetti Giuseppina (1), Morello Noemi (2), Pini Giorgio (6), Putignano Elena (1), Ratto Gian Michele (5), Sala Carlo (3), Tosetti Michela (4)

(1) Department of Theoretical and Applied Science, Lab. of the Genetic and Epigenetic Control of Gene Expression, University of Insubria, Busto Arsizio, Varese, Italy, Tel. 02.26436278, Fax 02.26434844, E-mail: landsberger.nicoletta@hsr.it (2) Dipartimento di Oncologia Sperimentale, Istituto Tumore Regina Elena, Roma

Istituto di Neuroscienze del CNR, via Moruzzi 1, 56124, Pisa, Tel.+39.050.3153167, Fax +39.050.3153220, E-mail: pizzorusso@in.cnr.it (2) Dept. of Neuroscience and Natl. Inst. of Neuroscience, Univ. of Torino (3) Istituto di Neuroscienze del CNR, Milano (4) Division of Child Neurology and Psychiatry, University of Pisa, Stella Maris Scientific Institute, Calmbrone, Pisa (5) National Enterprise for Nanoscience and Nanotechnology, Istituto Nanoscienze, Consiglio Nazionale delle Ricerche, Pisa (6) Tuscany Rett Center, Versilia Hospital, 55043 Lido di Camaiore, Lucca

Dal 1999, anno della scoperta di MECP2 come gene malattia della Sindrome di Rett, molti sono stati gli studi volti a comprendere la patogenesi del disordine. In genere MeCP2 è stata considerata un DNA methyl-binding protein, ubiquitariamente espressa e capace di reprimere la trascrizione grazie al compattamento della cromatina.

Recenti studi hanno però proposto come MeCP2 possa anche funzionare da attivatore trascrizionale. MeCP2, appare oggi come una proteina multifunzionale i cui diversi ruoli potrebbero essere regolati da una fosforilazione differenziale. In accordo con ciò, anche se il controllo della trascrizione viene ancora considerato la funzione principale, altri sono i ruoli proposti per la proteina. La dimostrazione della sua interazione con la proteina YB1 ha infatti portato ad ipotizzare un suo coinvolgimento nello splicing alternativo, mentre il nostro gruppo ha contribuito a proporre che alla RTT potrebbe anche contribuire una ridotta sintesi proteica nelle cellule del cervello.

Con questa comunicazione proponiamo una nuova funzione di MeCP2. Dimostriamo, infatti, che la methyl-binding protein è un costituente del centrosoma. Infatti, per immunofluorescenza è possibile localizzare la proteina, e in particolare una sua specifica fosfoisoforma, sul centrosoma. Questa localizzazione appare chiaramente anche in neuroni primari ippocampali e corticali, così come in esperimenti di frazionamento proteico. La validità dei risultati è confermata mediante l’uso di neuroni o cellule derivate da topi knock-out o interferiti per Mecp2. Fenotipicamente, le cellule difettive per Mecp2 sono caratterizzate da un importante deficit nella capacità di nucleare i microtubuli e gli aster citoplasmatici, da un’alterata proliferazione e un variato numero di centrosomi. Inoltre abbiamo iniziato a valutare l’espressione e lo stato di attivazione di molte chinasi coinvolte nella funzione del centrosoma (come Aurora e PLK1); è interessante osservare come i nostri primi risultati evidenzino chiari fenotipi molecolari.

Anche se per ora la letteratura riporta dati contradditori, il centrosoma appare in generale non solo come il punto di aggancio dei microtubuli ma anche come il principale sito di nucleazione dei microtubuli ed è coinvolto nella polarizzazione, maturazione e migrazione neuronale. Non c’è quindi da stupirsi se molti componenti perma-

La sindrome di Rett (RS) è un disordine progressivo dello sviluppo privo di trattamento efficace che si manifesta nelle bambine durante il primo sviluppo postnatale. La grande maggioranza delle pazienti RS porta mutazioni del gene MeCP2.

Abbiamo studiato il ruolo di MeCP2 nello sviluppo neuronale in vivo ed in vitro. Neuroni corticali sono stati infettati con lentivirus che esprimono shRNA per MeCP2 (shMeCP2) o shCTRL (controllo) a DIV3-4 e analizzati a DIV7 e DIV14. Abbiamo studiato lo sviluppo assonale e dendritico con anticorpi contro Tau e MAP2. Abbiamo quindi trovato che il silenziamento di MeCP2, come precedentemente dimostrato, riduce lo sviluppo neuronale sia dei dendriti che degli assoni così come il numero di spine dendritiche. I neuroni sono stati quindi utilizzati per l’analisi proteomica utilizzando la metodologia SILAC per lo studio della espressione proteica differenziale. Stiamo precedendo all’analisi delle proteine marcate tramite spettrometria di massa.

Abbiamo poi studiato gli effetti della mutazione di MeCP2 sullo sviluppo e sulla maturazione dei circuiti eccitatori ed inibitori in vivo.

Si è osservato che l’eliminazione Mecp2 può indurre alterazioni significative nella densità e distribuzione di alcuni, ma non tutti, i sottotipi di interneuroni GABAergici nella corteccia cerebrale. Mentre la nascita e la migrazione dei neuroni positivi per la somatostatina (SST+) sembra normale, la densità laminare sia degli interneuroni positivi per la parvalbumina (PV+) che per la calretinina (CR+) è aumentata in maniera anormale in una prima fase dello sviluppo post-natale in cui i topi mutanti per MeCP2 sono ancora asintomatici. Inoltre, sia l’organizzazione che la differenziazione morfologica

103

PROGETTI DI RICERCA TElEThOn

nenti o transienti del centrosoma siano stati associati a malattie neuropsichiatriche. Con questa comunicazione proponiamo, quindi, che la nuova funzione centrosomica di MeCP2 potrebbe essere rilevante per la maturazione e il differenziamento neuronale e, quindi, debba essere considerata nella patogenesi della sindrome di Rett e nelle malattie connesse a MECP2. In accordo con ciò abbiamo recentemente sviluppato una linea murina difettiva nello specifico sito di fosforilazione di MeCP2 associato con il centrosoma e i primi risultati indicano la presenza di un fenotipo simile alla Rett.

IL COMPLESSO R-RAS/RIN2/RAB5 CONTROLLA L’ADESIONE DELLE CELLULE ENDOTELIALI E LA MORFOGENESI VASCOLARE ATTRAVERSO L’ENDOCITOSI DELLE INTEGRINE ATTIVE E LA TRASDUZIONE DEL SEGNALE RAC-DIPENDENTE Sandri Chiara (1,2), Caccavari Francesca (1,2), Valdembri Donatella (1,2), Camillo Chiara (1,2), Veltel Stefan (3), Santambrogio Martina (1,2), lanzetti letizia (2,4), Bussolino Federico (2,5,6), Ivaska Johanna (3), Serini Guido (1,2,6) (1) laboratory of Cell Adhesion Dynamics, Institute for Cancer Research and Treatment (IRCC), Strada Provinciale 142 Km 3.95, 10060 Candiolo (TO), Italy, Tel. +39.011.9933508, Fax +39.011.9933524, E-mail: guido.serini@ircc.it (2) Department of Oncological Sciences, University of Torino School of Medicine, 10060 Candiolo, Italy (3) University of Turku Centre for Biotechnology and VTT Medical Biotechnology, 02044 Turku, Finland (4) laboratory of Membrane Trafficking, Institute for Cancer Research and Treatment (IRCC), Candiolo, Italy (5) laboratory of Vascular Oncology, Institute for Cancer Research and Treatment (IRCC), Candiolo, Italy (6) Center for Complex Systems in Molecular Biology and Medicine - SysBioM, University of Torino, c/o Department of Animal and human Biology (DBAU), Torino, Italy

ABSTRACT N. 164 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie neurologiche Responsabile

MELDOLESI JACOPO

Telethon grant N.

GGP09066

Totale €

442.300

Num Centri: 2

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2009

ESPRESSIONE ED EFFETTI DI L1CAM E DELLE SUE MUTAZIONI MISSENSE IN CELLULE PC12 E NEURONI Tagliavacca l., Mikulak J., Colombo F., Racchetti G., Meldolesi J., Valente P., Medrihan l., Bosco F., Baldelli P.

Durante l’angiogenesi embrionale, le semaforine secrete di classe 3 (SEMA3) [1] regolano la navigazione dei vasi sanguigni per mezzo delle neuropiline [2] e delle plexine, che rispettivamente fungono da subunità leganti e trasduttrici dei complessi recettoriali. le plexine agiscono inibendo la piccola GTPasi R-Ras [3], che è prevalentemente espressa nelle cellule vascolari [4] di cui promuove l’adesione alla matrice extracellulare (ECM) attraverso un meccanismo ignoto [5]. Abbiamo scoperto come nelle cellule endoteliali la proteina RIn2 interagisca con R-Ras e ne medi l’attività pro-adesiva e pro-angiogenica [6,7]. Sia R-Ras-GTP che RIn2 si localizzano infatti nei siti nascenti di adesione all’ECM che si formano in associazione con i lamellipodi, dove R-Ras-GTP lega RIn2 e ne converte la funzione da fattore di scambio dei nucleotidi guaninici (GEF) di Rab5 a proteina adattatrice, che dapprima interagisce ad elevata affinità con Rab5-GTP, favorendo così la selettiva endocitosi delle integrine ß1 attive legate all’ECM, e successivamente causa la traslocazione di R-Ras-GTP sugli endosomi precoci. In questo compartimento vescicolare, il modulo segnalatorio R-Ras/RIn2/Rab5 attiva l’adesione cellulare in modo Rac1-dipendente attraverso TIAM1, una Rac GEF che si localizza sugli endosomi precoci ed è stimolata dall’interazione sia con le proteine Ras che con il lipide vescicolare fofatidilinositolo 3 monofosfato. In conclusione, la capacità di R-Ras-GTP di convertire la proteina RIn2 da GEF di Rab5 ad adattatore permette la stimolazione dell’endocitosi delle integrine ß1 attive legate all’ECM [8] ed il conseguente veicolamento di R-Ras GTP verso gli endosomi precoci, dove questa piccola GTPasi stimola a sua volta, attraverso TIAM1, l’attivazione di una via pro-adesiva di trasduzione del segnale che dipendente da Rac1.

REFEREnzE 1. Serini G et al. (2003) Class 3 semaphorins control vascular morphogenesis by inhibiting integrin function. nature 424: 391-397.

2. Valdembri D et al. (2009) neuropilin-1/GIPC1 Signaling Regulates a5ß1 Integrin Traffic and Function in Endothelial Cells. PloS Biology 7: e1000025. doi:1000010.1001371/journal.pbio.1000025.

3. Serini G, Bussolino F (2004) Common cues in vascular and axon guidance. Physiology (Bethesda) 19: 348-354.

4. Komatsu M, Ruoslahti E (2005) R-Ras is a global regulator of vascular regeneration that suppresses intimal hyperplasia and tumor angiogenesis. nat Med 11: 1346-1350.

5. hall A, lalli G (2010) Rho and Ras GTPases in axon growth, guidance, and branching. Cold Spring harb Perspect Biol 2: a001818.

6. Sandri C, Caccavari F, Valdembri D, Camillo C, Veltel S, et al.

(2012) The R-Ras/RIn2/Rab5 complex controls endothelial cell adhesion and morphogenesis via active integrin endocytosis and Rac signaling. Cell Res 22: 1479-1501.

7. Fernandez-Borja M (2012) A tale of three GTPases and a RIn in endothelial cell adhesion. Cell Res. 22:1426–1428.

8. Valdembri D, Serini G (2012) Regulation of adhesion site dynamics by integrin traffic. Current Opionion in Cell Biology 24:582-591.

Istituto Scientifico San Raffaele, Via Olgettina 58, 20132 Milan

Il progetto si concentra sull’espressione di un gene, quello della proteina di adesione l1CAM, le cui mutazioni missense inducono la sindrome l1 o CRASh, una malattia genetica molto variabile in termini di gravità e di sintomatologia. Questa variabilità è tale che per molti anni la malattia fu interpretata come composta da sindromi diverse, raggruppate insieme solo quando la patogenesi fu chiarita. l’espressione di l1CAM è governata da un fattore repressivo della trascrizione, REST/nRSF, fondamentale per il differenziamento dei neuroni e delle cellule neurali, che funziona anche nei neuroni maturi. Al contrario delle cellule non-neurali, quelle neurali esprimono bassissimi livelli di l1CAM, livelli che aumentano in seguito a stimolazione o lesione e possono indurre diminuzioni dei bersagli inclusa l1CAM. Il nostro lavoro si è sviluppato in due direzioni.

Primo, abbiamo studiato REST e l1CAM nelle cellule neurali PC12 e abbiamo trovato che il fattore governa non solo il livello ma anche lo splicing di l1CAM attraverso il suo bersaglio nova2 (Mikulak et al., JnC 120: 699-709, 2012). Questo risultato è importante perchè le forme spliced ad alto REST sono molto meno efficaci di quelle full length presenti nelle cellule a basso REST. Successivamente abbiamo studiato 4 mutanti missense del domain di superficie di l1CAM, trovando che ciascuno di essi modifica diversamente la funzione della proteina. Inoltre abbiamo scoperto una nuova funzione di l1CAM, mantenuta da 2, ma non dagli altri 2 mutanti: una modulazione robusta e dose-dipendente del recettore TrkA dell’nGF. Questo risultato, potenzialmente rilevante per alcune lesioni cerebrali di malati di CRASh, può contribuire alla eterogeneità dei quadri funzionali indotti dai vari mutanti (Tagliavacca et al., JnC 2012 Sep 13. doi: 10.1111/jnc.12015).

In parallelo, abbiamo usato colture primarie ippocampali ottenute da topi KO per l1CAM come modello della patologia. Registrazioni su matrici di microlettrodi hanno evidenziato una riduzione dell’attività elettrica spontanea nei circuiti ippocampali KO. Registrazioni di patch-clamp hanno mostrato che i neuroni KO per l1CAM sono caratterizzati da potenziale di riposo più negativo, resistenza di ingresso e reobase più alte, minor potenziale di soglia ed ampiezza del potenziale d’azione. In accordo con questi effetti, abbiamo osservato una riduzione dell’espressione dei canali del na+ voltaggiodipendenti (nav) e della densità di corrente na+. Inoltre la microscopia confocale ha messo in luce un’alterata localizzazione dei nav sul cono d’insorgenza ed una ridotta crescita assonale in cellule KO per l1CAM. Quest’azione di l1CAM suggerisce un nuovo ruolo del fattore d’adesione nella maturazione funzionale dell’eccitabilità di membrana dei neuroni ippocampali in via di sviluppo.

ABSTRACT N. 165 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie neurologiche Responsabile

SERINI GUIDO

Telethon grant N.

GGP09175

Totale €

295.800

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

ABSTRACT N. 166 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie neurologiche Responsabile

Anno d’inizio: 2009

GGP12095

Totale €

270.000

Num Centri: 1

104

DI CUNTO FERDINANDO

Telethon grant N.

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2012

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

IDENTIFICAZIONE DI TARGET TERAPEUTICI NELLA MICROCEFALIA PRIMARIA ATTRAVERSO L’ANALISI DELLA VIA CITK/ASPM

lari in cellule di lievito e in cellule umane. Utilizzando il modello lievito è stato trovato che l’integrità del genoma è messa in pericolo dall’incorporazione di rNMPs nel DNA. Questa incorporazione errata è di solito prevenuta dalla selettività delle DNA polimerasi. Nonostante ciò, si è trovato che la DNA polimerasi epsilon incorpora rNMPs con alta frequenza. Abbiamo scoperto che sia la RNasiH1 che la RNasiH2 rimuovono rNMPs dal DNA, e l’incapacità di fare ciò causa stress replicativo al successivo round di replicazione. Abbiamo ottenuto evidenze sperimentali che la capacità di sopravvivere a stress replicativo di cellule mutate nelle RNasiH dipende da due pathways riparativi, noti come PRR (Post-Replication Repair). Cellule mutate nelle RNasiH hanno un PRR costitutivamente attivo, evidenziabile dall’ubiquitinazione del PCNA, un noto marcatore di tale processo (Lazzaro et al., 2012, Mol. Cell, 45, 99-110).

Abbiamo scoperto che la contemporanea espressione dei geni codificanti le 3 subunità della RNasiH2 umana complementa in vivo la funzione dei corrispondenti geni di lievito, aprendo la possibilità di utilizzare tale sistema modello per capire come specifiche mutazioni nei pazienti AGS possano causare la malattia alterando una funzione della RNasiH2. Stiamo trasferendo in cellule umane le conoscenze acquisite nel sistema modello di lievito per verificare se i meccanismi coinvolti sono conservati nel corso dell’evoluzione. A tal fine, abbiamo costruito delle linee cellulari umane in cui l’espressione dei geni codificanti per la RNasiH1 e/o la RNasiH2 è stabilmente silenziata mediante tecniche di shRNA. In tali cellule abbiamo misurato la ipersensibilità ad agenti che inducono stress replicativo e possibili difetti nella progressione del ciclo cellulare e nella proliferazione.

Abbiamo anche misurato i livelli di ubiquitinazione del PCNA, dato che anche in cellule umane tale modificazione è usata come readout dell’attivazione del PRR. Nel loro insieme, i risultati ottenuti evidenziano nuove funzioni della RNasiH2 e del PRR nel risolvere i problemi connessi con l’incorporazione di rNMPs nel DNA.

Bianchi Federico (1), Gai Marta (1), Chang Yoon Jeung (2), El Assawy Nadia (3), Di Cunto Ferdinando (1) (1) University of Torino, Molecular Biotechnology Centre, Via Nizza 52, 10126, Torino, Italy, Tel. +39.011.6706409, Fax +39.011.6706432, E-mail: ferdinando.dicunto@unito.it (2) Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, MPI-CBG, Dresden, Germany (3) University of Torino, Department of Neurology and Neurorehabilitation, IRCCS, Istituto Auxologico Italiano, Piancavallo (VB)

Le microcefalie di origine genetica sono patologie caratterizzate da una forte riduzione del volume dell’encefalo, spesso associate con sintomi estremamente invalidanti come ritardo mentale, paralisi, atassia ed epilessia. Nella grande maggioranza dei casi queste sindromi sono il risultato di una perdita di precursori neuronali e/o di neuroni durante l’embriogenesi. Pertanto, lo sviluppo di terapie efficaci rappresenta una delle frontiere più ardue della medicina, soprattutto perché qualsiasi intervento deve essere attuato durante la gravidanza. La conoscenza dei meccanismi cellulari e molecolari che portano alla microcefalia è essenziale per lo sviluppo di nuove terapie. Nell’ultima decade, i geni responsabili di molte di queste sindromi sono stati identificati, determinando un progresso molto significativo nella diagnostica. Tuttavia, i meccanismi con cui questi geni agiscono nello sviluppo cerebrale sono ancora oscuri. Nel nostro laboratorio abbiamo generato topi mutanti che sviluppano una forma molto severa di microcefalia per una mutazione nel gene CITK. In questo progetto proponiamo di continuare i nostri studi su questo modello, per differenti motivazioni, supportate dai dati preliminari mostrati in questo poster. Innanzitutto, è molto probabile che la proteina CIT-K cooperi con altre proteine critiche per le microcefalie, come ASPM. In secondo luogo, i topi che mancano di CIT-K sono un modello generale di microcefalia molto interessante, perchè mostrano sia un’aumentata morte sia, probabilmente, una ridotta generazione dei precursori neuronali durante l’embriogenesi.

Infine abbiamo scoperto che le anomalie cellulari che caratterizzano questi topi possono essere ridotte in modo significativo modulando proteine la cui funzione può essere modificata da composti farmacologici già disponibili. Riteniamo che il programma proposto possa estendere significativamente la comprensione delle microcefalie e la possibilità di combatterle.

ABSTRACT N. 168 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile

GGP11003 295.300

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2013

Ruggiero Carmen (1), Grossi Mauro (1), Fragassi Giorgia (1), Capone Vanessa (1), Pozzoli Manuela (2,3), Bertani Ilaria (2,3), Restelli Elena (2,3), Zanardi Alan (2,3), Chiesa Roberto (2,3), Sallese Michele (1)

PLEVANI PAOLO

Totale €

357.700

RUOLO DELLO STRESS CELLULARE, PROTEOSTASI E OMEOSTASI DEL CALCIO NELLA DEGENERAZIONE DELLE CELLULE DEL PURKINJE NELLA SINDROME DI MARINESCO-SJOGREN

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Telethon grant N.

GGP12220

Totale € Num Centri: 2

ABSTRACT N. 167 Responsabile

SALLESE MICHELE

Telethon grant N.

(1) Unit of Genomic Approaches to Membrane Traffic, Department of Cellular and Translational Pharmacology. Consorzio Mario Negri Sud, Via nazionale 8/a, Santa Maria Imbaro (Chieti), Tel. 0872.570421, Fax 0872.570412, E-mail: sallese@negrisud.it (2) Dulbecco Telethon Institute, Milano (3) Laboratory of Prion Neurobiology, Department of Neuroscience, Mario Negri Institute for Pharmacological Research, Milano

Anno d’inizio: 2011

IL RUOLO DELL’RNasiH2 NELLA PATOGENESI DELLA SINDROME DI AICARDI-GOUTIÈRES Pizzi Sara (1), Lazzaro Federico (1), Novarina Daniele (1), Delmastro Daria (1), Tamolli Giada (1), Sertic Sarah (1), Granata Magda (1), Panigada Davide (1), Burgers Peter (2), Kunkel Thomas (3), Muzi-Falconi Marco (1), Plevani Paolo (1)

La sindrome di Marinesco-Sjogren (MSS) è una rara malattia genetica neuromuscolare, autosomica-recessiva che si manifesta nei primi anni di vita. Le manifestazioni cliniche principali sono: difficoltà nel coordinare i movimenti e nel linguaggio, debolezza muscolare che impedisce di sostenersi e camminare in modo autonomo e frequente cataratta congenita bilaterale. La malattia, generalmente, progredisce per un certo numero di anni, fino a stabilizzarsi e consentire ai pazienti una durata di vita pressoché normale. Ad oggi non vi sono terapie specifiche, ma si praticano trattamenti riabilitativi. Recentemente è stato identificato un gene responsabile chiamato SIL1 che risulta mutato nella maggior parte degli individui affetti da MSS. La mutazione di SIL1 causa la morte di importanti neuroni del cervelletto, evento responsabile dei sintomi principali della malattia. I meccanismi alla base della morte neuronale però non sono noti, e questo impedisce lo sviluppo di un trattamento efficace.

La nostra idea è di generare modelli cellulari della MSS per cercare eventuali alterazioni funzionali potenzialmente coinvolte nella morte neuronale.

Al momento abbiamo modificato geneticamente due linee cellulari riproducendo con successo alcune delle caratteristiche molecolari della malattia. Inoltre abbiamo scoperto che le cellule da noi modificate evidenziano un danno dell’apparato secretorio. Questo problema potenzialmente potrebbe causare la morte dei neuroni nel cervelletto.

I risultati ottenuti in questi modelli saranno validati in tessuti di topi

(1) Dipartimento di Bioscienze, Università degli Studi di Milano, Via Celoria 26, 20133 Milano, Italy (2) Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO U.S.A. (3) Laboratory of Structural Biology and Molecular Genetics, NIEHS, Research Triangle Park, NC, U.S.A.

La sindrome di Aicardi-Goutières (AGS) presenta sintomi clinici che mimano un’infezione virale congenita, con cui è spesso confusa.

Mutazioni in 6 geni (AGS1-6) sono state trovate in pazienti AGS. Circa il 65 % dei pazienti portano mutazioni nei geni AGS2, AGS3, AGS4 che codificano le 3 subunità dell’RNasiH2. Le RNasiH tagliano e degradano la porzione RNA in molecule ibride RNA:DNA. Gli eucarioti contengono due tipi di RNasiH, RNasiH1 e RNasiH2, che hanno specificità di substrato parzialmente sovrapposte. La RNasiH2 è l’unica ad incidere un singolo ribonucleotide (rNMP) all’interno di un filamento di DNA ed è un complesso di 3 subunità la cui funzione nella replicazione e trascrizione è per lo più ancora da chiarire. Per comprendere i meccanismi che collegano mutazioni nei geni RNasiH2 con la sindrome di AGS utlizziamo approcci genetici e moleco-

105

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

portatori della mutazione SIL1, che presentano sintomi sovrapponibili a quelli della malattia umana, e che potranno essere usati per vagliare potenziali trattamenti farmacologici.

Questo studio ci aiuterà a capire come la mutazione del gene SIL1 causa la MSS, e a sviluppare una strategia terapeutica.

zione genica determina il fenotipo della DS non sono stati chiariti e non ci sono terapie per migliorare la disabilità mentale.

Una riduzione generalizzata della neurogenesi ed un’anomala maturazione dendritica sono i fattori principali responsabili dell’ipotrofia cerebrale e, quindi, del ritardo mentale nella DS. Secondo dati recenti il gene trisomico APP (proteina precursore dell’amiloide), un gene importante per la generazione e il differenziamento dei neuroni, appare un candidato chiave alla base di entrambe queste anomalie. Tale ipotesi deriva da dati preliminari in vitro i quali mostrano che le alterazioni della proliferazione e dello sviluppo dendritico di precursori neuronali trisomici sono dovuti ad un aumento dei livelli di AICD, un prodotto di clivaggio di APP da parte della gamma-secretasi. Poichè livelli elevati di AICD nella DS appaiono inevitabili a causa della triplicazione di APP, la prevenzione della formazione di AICD, tramite inibizione della gamma-secretasi. potrebbe rappresentare un approccio terapeutico razionale.

Lo scopo generale del nostro progetto è di stabilire se sia possibile curare i difetti dello sviluppo cerebrale nella DS usando un inibitore selettivo della gamma-secretasi che agisce su APP, al fine di ridurre la formazione di AICD e ripristinare, quindi, la neurogenesi e la maturazione dendritica. Useremo il topo Ts65Dn poichè tale modello ricapitola numerose anomalie del cervello DS. Se, come ci attendiamo, tale approccio terapeutico ripristinerà le alterazioni cerebrali dovute alla trisomia, i risultati potrebbero aprire la strada a trials clinici mirati a curare la disabilità mentale in bambini con DS.

ABSTRACT N. 169 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile

BANKS LAWRENCE

Telethon grant N.

GGP10006

Totale €

194.700

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2010

LA PROTEINA UBE3a LIGASI DELL’UBIQUITINA ASSOCIATA ALLA SINDROME DI ANGELMAN CONTROLLA LE FUNZIONI DEL PROTEOSOMA Tomaic Vjekoslav, Massimi Paola, Banks Lawrence ICGEB, Padriciano 99, Trieste, Italy. Tel +39.040.3757328; E-mail: banks@icgeb.org

La Sindrome di Angelman è una malattia caratterizzata da disordine neurologico che ha come conseguenza seri difetti nello sviluppo.

Nella maggior parte dei casi lo scatenarsi della Sindrome è associato alla perdita o alla mutazione della copia materna del gene che codifica per la UBE3a. Questa proteina è una ligasi dell’ubiquitina, la cui funzione primaria si crede sia la regolazione del livello di espressione delle proteine. Questo avviene attraverso la sua capacità di coniugare l’ubiquitina alle proteine substrato, le quali vengono quindi degradate dal proteosoma S26. Studi precedenti hanno sottolineato che la perdita dell’attività enzimatica ha come fenotipo finale la mancanza del gene “in toto”, suggerendo che l’attività enzimatica sia l’aspetto incisivo della proteina durante lo sviluppo. D’altro canto , molto poco si sa riguardo le proteine target di UBE3a, la cui mancata regolazione potrebbe quindi causare lo sviluppo della Sindrome. Per rispondere a tale quesito abbiamo condotto una serie di analisi proteomiche con lo scopo di identificare partners critici della UBE3a. In primo luogo abbiamo dimostrato che la UBE3a è in grado di interagire con diverse subunità del proteosoma, ed inoltre che la mutazione del dominio catalitico della UBE3a associata alla Sindrome di Angelman può avere un decisivo effetto inibitorio sul funzionamento normale del proteosoma. Questo evidenzia che in certi casi, mutazioni all’interno della UBE3a possono avere effetti che si associano con quelli conseguenti alla semplice perdita del gene, implicando una potenziale funzione dominante negativa.

Analisi successive hanno identificato anche una diversa serie di proteine cellulari coinvolte nella regolazione di molteplici pathways cellulari, come il trasporto vescicolare e il pathway di Hippo. Studi correnti sono rivolti a confermare quali di queste proteine sono direttamente degradate o modificate dall’UBE3a e contribuiranno a provvedere nuovi targets per terapie in grado di rettificare gli effetti dovuti alla perdita della ligasi.

ABSTRACT N. 171 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile

BARTESAGHI RENATA GGP12149

Totale € Num Centri: 3

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2012

Fiore Michele, Gradogna Antonella, Jeworutzki Elena, De Stefano Silvia, Zanardi Ilaria, Zifarelli Giovanni, Pusch Michael Istituto di Biofisica, CNR, Via De Marini 6, 16149 Genova, Tel. 010.6475561, Fax 010.6475500, E-mail: pusch@ge.ibf.cnr.it

Le proteine CLC sono proteine di membrana trasportatori di ioni Cl. Mutazioni all’interno di quattro dei nove geni CLC ed in tre piccole subunità associate, causano varie malattie genetiche umane.

Mutazioni all’interno di CLC-5 provocano la malattia di Dent, caratterizzata dalla proteinuria a basso peso molecolare, e calcoli renali.

Noi intendiamo studiare il meccanismo di trasporto accoppiato sfruttando le proprietà di trasporto di mutanti difettosi (es. E268A) che mostrano proprietà di attività parziale. Inoltre, vogliamo studiare il meccanismo di rettificazione del CLC-5, una proprietà poco compresa di questo trasportatore endosomiale. Qui, noi siamo aiutati da risultati preliminari di una mutazione puntiforme che mostra correnti di trasporto anche a voltaggi negativi. In particolare, noi intendiamo realizzare la tecnica cut-open voltage-clamp su oociti per migliorare la risoluzione temporale delle registrazioni.

Mutazioni all’interno di CLC-Kb e nella sua subunità beta barttina causa la sindrome di Bartter, una nefropatia da eliminazione di sali associata a sordità nel caso in cui sono presenti mutazioni all’interno della barttina. I canali CLC-K sono modulati dalla concentrazione esterna di Ca e protoni. In questo progetto noi intendiamo caratterizzare ulteriormente la struttura e la funzione di nuovi siti di legame identificati recentemente da noi. Noi studieremo anche un’ulteriore regolazione dei canali CLC-K a pH alcalino scoperta tramite esperimenti preliminari.

Recentemente, abbiamo identificato GlialCAM come un partner di legame del CLC-2 nelle cellule gliali. Mutazioni all’interno del GlialCAM provocano leucoencefalopatia megalocefalica con cisti subcorticali (MLC), una rara leucodistrofia caratterizzata da macrocefalia. L’interazione del GlialCAM con CLC-2 induce il raggruppamento (“clusterizzazione”) di CLC-2 al livello delle giunzioni cellulari ed aumenta la funzione del canale CLC-2. Noi intendiamo studiare i meccanismi biofisici e cellulari degli effetti funzionali di GlialCAM su CLC-2.

Lo scopo del progetto è la comprensione biofisica dei meccanismi che sono alla base di varie malattie genetiche che coinvolgono i canali trasportatori CLC. Tale conoscenza sarà di aiuto nello sviluppo di trattamenti che sono diretti verso l’aumento della funzione di queste proteine di membrana, o farmacologicamente o geneticamente.

296.400 Durata (anni): 3

226.700

MECCANISMI MOLECOLARI RIGUARDANTI IL TRASPORTO, LA REGOLAZIONE DA PARTE DI PICCOLI LIGANDI E L’INTERAZIONE CON ALTRE SUBUNITÀ DELLE PROTEINE CLC COINVOLTE IN MALATTIE GENETICHE UMANE

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Telethon grant N.

GGP12008

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 170 Responsabile

PUSCH MICHAEL

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2012

TERAPIA PREVENTIVA DEL RITARDO MENTALE NELLA SINDROME DI DOWN CON UN NUOVO INIBITORE DELLA GAMMA-SECRETASI: MECCANISMI APP-DIPENDENTI NELLO SVILUPPO DEL SISTEMA NERVOSO Calzà Laura (2), Magistretti Jacopo (3), Bartesaghi Renata (1) (1) Dipartimento di Scienze Biomediche e Neuromotorie, University of Bologna, Piazza di Porta San Donato 2, 40126 Bologna, Italy, Tel +39.051.2091727, Fax +39.051.2091737, E-mail: renata.bartesaghi@unibo.it (2) Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie, University of Bologna, Italy (3) Dipartimento Di Biologia e Biotecnologie, University of Pavia, Italy

La sindrome di Down (DS) è una patologia genetica causata dalla triplicazione del cromosoma umano 21. Gli individui con DS possono presentare vari problemi medici, ma la disabilità mentale è la caratteristica invariabile, e più invalidante, di questa patologia. Nonostante i numerosi sforzi, i meccanismi tramite i quali la triplica-

106

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

ABSTRACT N. 172

Favaro Rebecca (1), Mercurio Sara (1), Ferri Anna (1), Bertolini Jessica (1), Badiola Sanga Alexandra (1), Mariani Jessica (1), Beccari Leonardo (2), Zhang Yubo (3), Bovolenta Paola (2), Robson Paul (4), Wei Chia-lin (3), Nicolis Silvia (1)

Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile

RAGNINI-WILSON ANTONELLA

Telethon grant N.

GGP08143

Totale €

222.400

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

(1) Dipartimento di Biotecnologie e Bioscienze, Università di Milano-Bicocca, piazza della Scienza 2, 20126 Milano, Italy, Tel. +39.02.64483339; Fax +39.02.64483314; E-mail: silvia.nicolis@unimib.it (2) Centro de Biología Molecular Severo Ochoa. CSIC-UAM. Universidad Autónoma de Madrid, Madrid, Spain (3) DOE Joint Genome Institute, Walnut Creek, CA, USA (4) Genome Institute of Singapore, Singapore

Anno d’inizio: 2008

MALATTIE CORRELATE A DIFETTI NELLA FUNZIONE DELLE MIOSINE DI CLASSE V: BASI MOLECOLARI DEL MECCANISMO DI RICONOSCIMENTO DEL CARGO

Il nostro progetto mira a identificare e caratterizzare funzionalmente i bersagli molecolari del fattore trascrizionale Sox2, quali mediatori della sua funzione nella malattia genetica del cervello. Mediante ablazione condizionale di Sox2 in topo investigheremo i geni regolati da Sox2, definiremo i bersagli diretti di Sox2, i meccanismi molecolari della loro regolazione, e la loro rilevanza funzionale per il fenotipo patologico.

Mutazioni eterozigoti di Sox2 nell’uomo causano una sindrome che comprende uno spettro di difetti del sistema nervoso centrale. Abbiamo riprodotto aspetti essenziali di questa patologia con modelli genetici di deficienza di Sox2. Abbiamo mostrato che la deficienza di un bersaglio di Sox2, la citochina Shh, è critica per la patologia cerebrale (ippocampale) di questi topi (presente nei pazienti), in quanto è parzialmente recuperata tramite un farmaco che mima Shh (Favaro R et al., Nat. Neurosci. 2009). Più recentemente, abbiamo trovato che l’ablazione precoce di Sox2 causa importante perdita di tessuto nel telencefalo ventrale (striato; neuroni GABAergici), anch’essa dipendente da Shh; ciò riproduce aspetti dell’oloprosencefalia, malattia che può essere causata da mutazione di SHH. Mediante approccio di gene-candidato, abbiamo identificato Nkx2.1, un noto regolatore dello sviluppo del telencefalo ventrale, quale nuovo bersaglio di Sox2. Abbiamo anche identificato anomalie di corteccia e ippocampo, che stiamo caratterizzando.

Stiamo investigando i bersagli di Sox2 anche con approcci genomici.

Mediante RNAseq, abbiamo identificato molti geni regolati da Sox2, espressi differenzialmente in cellule staminali neurali (NSC) Sox2-delete e normali. Molti dei loro promotori sono legati da Sox2. Tuttavia, regioni regolative importanti sono spesso localizzate a grande distanza dai geni regolati. Stiamo investigando le interazioni a lunga distanza nella cromatina di NSC normali e Sox2-delete mediante ChIA-PET (Handoko L et al., Nat. Genet. 2011). L’ablazione di Sox2 determina profondi cambiamenti nelle interazioni a lunga distanza determinate da RNApolII, con perdita di molte interazioni, e generazione di nuove.

Molte interazioni coinvolgono geni differenzialmente espressi tramite RNAseq, e molti di questi geni sono importanti nei processi di sviluppo cerebrale compromessi nei nostri mutanti. Stiamo cercando di identificare le interazioni a lunga distanza che coinvolgono il legame diretto di Sox2 (tramite ChIPseq), e investigheremo il loro significato funzionale mediante transfezione e transgenesi.

La recente annotazione funzionale del genoma umano (nature.com/ encode) ha rivelato che un’ampia proporzione degli SNPs associati a malattia genetica mappano in regioni di DNA con prevista funzione regolativa (Maurano M et al, Science 2012). Identificare i bersagli di Sox2 getterà luce sui meccanismi della malattia causata da Sox2, e potrebbe indicare il coinvolgimento di Sox2 in malattie precedentemente non relate a Sox2.

Frascella Annalisa (2,1), Mosca Maria Giovanna (1), Bau Cutrona Meritxell (1,2), Di Giandomenico Daniele (1), Bartocci Daniela (2,1), Porcu Giampiero (1), Ragnini-Wilson Antonella (1,2) (1) Department of Cellular and Translational Pharmacology, Consorzio Mario Negri Sud Via Nazionale S.M. Imbaro (Ch), Italy, Tel. 087.2570317/412, Email: ragnini@negrisud.it (2) Department of Biology, University of Rome Tor Vergata, Rome, Italy

La motilità degli organelli e vescicole intracellulari mediata dalla miosina MyoVa è richiesta per la pigmentazione della pelle e dei capelli, per la risposta immunologica, mielinazione e trasmissione sinaptica.

Mutazioni nel C-terminale della MyoVa codificata dal cervello umano influenzano la stabilità della proteina e sono associate alla Sindrome di Griscelli di tipo 1 (GS1). Le manifestazioni patologiche della GS1 includono ipomelanosi accompagnate da severe disfunzioni neurologiche. L’ipopigmentazione è dovuta al difetto nel trasporto dei melanosomi nei dendriti dei melanociti causata dalla mancanza del complesso Rab27/MyoVa. Le cause molecolari che conducono ai difetti neurologici non sono note. Nelle spine dendritiche dei neuroni dell’ ippocampo, MyoVa e MyoVb, interagendo con Rab11 riciclano endosomi a cui sono associati i ricettori AMPA a seguito dello stimolo LTP. Questo processo è necessario per la plasticità sinaptica, memoria e apprendimento. Recentemente, in modelli animali per la GS1, è stato dimostrato che mutazioni che causano perdita di funzione di MyoVa causano difetto di trasporto del ER nei dendriti delle cellule di Purkinje [1]. Malgrado si ritenga che MyoVb sia il principale motore per i ricettori AMPAr nei dendriti, mutazioni in MyoVb causano la malattia recessiva autosomica MVID che non causa difetti neurologici.

Per comprendere le basi dei difetti neurologici in GS1 è necessario comprendere quali e quanti siano i cargo specificamente trasportati dalle MyoV espresse nei neuroni. Abbiamo precedentemente dimostrato che in lievito l’ortologo di Rab11, Ypt32, interagisce con il Cterminale della MyoV di lievito Myo2 nella regione VBR [2]. Questa regione è altamente conservata tra le MyoV di lievito e umane.

Usando mutagenesi sito diretta applicata al dominio globulare (GTD) di MyoVa, cellule di lievito e di neuroblastoma umano SH-SY5Y differenziate con acido retinoico (RA), abbiamo dimostrato che Rab11 lega MyoVa nel VBR. Inoltre usando microscopia confocale e epifluorescente automatizzata ad alto contenuto abbiamo dimostrato che la sovraespressione di MyoVa GTD wt o mutato nei siti di interazione con Rab11, o il silenziamento di MyoVa causano difetti di traffico del recettore AMPA GluR1 ai neuriti di cellule SH-SY5Y differenziate con RA. Infine abbiamo stabilito i protocolli adeguati per la trasfezione e differenziamento con RA tali da poter usare SH-SY5Y per screening farmacologici e/o siRNA. L’obiettivo finale è di usare questo modello cellulare neuronale umano per identificare farmaci o molecole capaci di sostituire la funzione di MyoVa tramite tecniche di screening basate sull’analisi del traffico di GluR1 dal soma ai neuriti di cellule SHSY5Y differenziate con RA, con procedure di analisi di immagine simili a quelle da noi precedentemente pubblicate [3].

REFERENZE (1) Hammer and Sellers 2012 Nature Mol.Cell Biol.13:1326 (2) Casavola et al., 2008 Mol. Microbiol. 67:1051-66 (3) Sacco et al., 2012 Mol Syst Biol. doi:10.1038/msb.2012.36.

ABSTRACT N. 174 Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2010

NICOLIS SILVIA KIRSTEN

Telethon grant N.

GGP12152

Totale €

210.000

Num Centri: 1

338.800

CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE E CELLULARE DI UBIAD1, UN NUOVO PRODOTTO GENICO COINVOLTO NELLA DISTROFIA DEL CRISTALLINO DI SCHNYDER

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

GGP10195

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 173

SANTORO MASSIMO

Telethon grant N.

Durata (anni): 3

Vera Mugoni (1), Ruben Postel (2), Valeria Catanzaro (1), Elisa De Luca (1), Emilia Turco (1), Giuseppe Digiglio (1), Lorenzo Silengo (1), Micheal Murphy (3), Claudio Medana (4), Didier Stainier (5), Jeroen Bakkers (2), Massimo Santoro (1)

Anno d’inizio: 2012

IDENTIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE FUNZIONALE DEI BERSAGLI MOLECOLARI DEL FATTORE TRASCRIZIONALE SOX2 NELLA MALATTIA GENETICA DEL CERVELLO: UN APPROCCIO MEDIANTE ABLAZIONE CONDIZIONALE DI SOX2 NEL TOPO

(1) Molecular Biotechnology Center, Università degli Studi di Torino, Via Nizza 52, 10126 Torino, Tel. 011.6706499/432 (2) Hubrecht Institute, University Medical Center and Interuniversity Cardiology Institute for the Netherlands, Utrecht, The Netherlands (3) Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit, Hills Road, Cambridge

107

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

Fz4-FEVR e ATP7B-H1069Q, quindi favorendo il raggiungimento del corretto folding. Questi risultati potrebbero aprire la strada a possibili stategie terapeutiche e contribuire anche ad una maggiore comprensione della funzione di CRYAB, del trasporto di proteine lungo la via secretoria e della malattia di Wilson.

CB2 0XY, UK (4) Department of Chemistry, University of Torino, Torino, Italy (5) Department of Developmental Genetics, Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany

La Distrofia del Cristallino di Schnyder (Schnyder crystalline corneal dystrophy; SCCD) è una malattia genetica rara che porta progressivamente alla cecità. I pazienti affetti dalla SCCD mostrano un progressivo accumulo di molecole lipidiche come il colesterolo e i fosfolipidi nella cornea. La SCCD è stata associata a mutazioni dominanti nel gene umano UBIAD1, tuttavia i meccanismi molecolari della malattia sono ancora sconosciuti. Attraverso analisi biochimiche del flusso del 13C abbiamo dimostrato che UBIAD1 è una nuova prenyltransferasi, non mitocondriale, che catalizza la biosintesi della molecola antiossidante CoenzymaQ10 (CoQ10). Esperimenti di frazionamento cellulare hanno chiarito che Ubiad1 svolge la sua attività enzimatica nel compartimento delle membrane del Golgi. La mancanza di Ubiad1, riducendo il Golgi-CoQ10, causa danno ossidativo nei tessuti cardiovascolari sia in un modello di zebrafish sia in cellule endoteliali primarie umane. La mancanza di Ubiad1 e del GolgiCoQ10 danneggia l’attività eNOS. Come conseguenza eNOS probabilmente diventa “uncouple” generando radicali superossido. Nel complesso i nostri dati svelano un intrigante ruolo genetico e metabolico di UBIAD1 nello stato cellulare redox durante la patogenesi della SCCD. In fatti le varianti di UBIAD1 legate alla SCCD modulano i livelli di CoQ10 e presumibilmente influenzano lo stato redox nella cornea dei pazienti affetti da SCCD. Il mantenimento di livelli fisiologici di CoQ10 e NO possono essere tenuti in considerazione per un ruolo di Ubiad1 nella SCCD. Questi risultati possono essere impiegati per la diagnosi della SCCD e lo sviluppo di strategie terapeutiche

ABSTRACT N. 176 Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

GGP09029 151.300

Num Centri: 1

Durata (anni): 2

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2011

Testa Francesco (1), Rossi Settimio (1), Maguire Albert (2,3,4), Della Corte Michele (1), Di Iorio Valentina (1), Banfi Sandro (5,6), Surace Enrico Maria (5), Bennett Jean (2,3), Auricchio Alberto (5,7), Simonelli Francesca (1,5) (1) Dipartimento di Oftalmologia, Seconda Università degli Studi di Napoli, Via S. Pansini 5, 80131, Napoli, Italy, Tel. +39.081.5666761, Fax +39.081.7704501; E-mail: francesca.simonelli@unina2.it (2) Scheie Eye Institute, F.M. Kirby Center for Molecular Ophthalmology, University of Pennsylvania School of Medicine, Philadelphia, Pennsylvania, USA (3) Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children’s Hospital of Philadelphia, Philadelphia, Pennsylvania, USA (4) University of Pennsylvania School of Medicine, Philadelphia, Pennsylvania, USA (5) Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM), Naples, Italy (6) Medical Genetics, Department of General Pathology, Seconda Università degli Studi di Napoli, Naples, Italy (7) Medical Genetics, Department of Pediatrics, University of Naples “Federico II”, Naples, Italy

BONATTI STEFANO

Totale €

221.800

STUDIO DI SICUREZZA ED EFFICACIA IN SOGGETTI CON AMAUROSI CONGENITA DI LEBER (ACL) TRAMITE VETTORE ADENO-ASSOCIATO PER TRASFERIRE IL GENE RPE65 UMANO NELL’EPITELIO PIGMENTATO DELLA RETINA (EPR): TRATTAMENTO E FOLLOW-UP DI 3 PAZIENTI ITALIANI

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Telethon grant N.

GGP10199

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 175 Responsabile

SIMONELLI FRANCESCA

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2009

ALFA-B-CRYSTALLINO RECUPERA L’ESPRESSIONE IN MEMBRANA PLASMATICA DI RECETTORI MUTANTI FZ4 E ATP7B RITENUTI NEL RETICOLO ENDOPLASMICO

La dimostrazione di sicurezza e stabilità nel ripristino della funzione visiva dopo una singola iniezione di adenovirus-associato ricombinante veicolante la copia corretta del gene RPE65 (AAV2hRPE65v2) ha indotto a verificare la possibilità di ottenere un ulteriore beneficio attraverso una seconda somministrazione del vettore AAV nell’occhio controlaterale, non trattato, dei pazienti. La risommistrazione del vettore al secondo occhio è stata effettuata in tre adulti con LCA dovuta a mutazione del gene RPE65, in un periodo compreso tra 1.7 e 3.3 anni dopo aver ricevuto la prima iniziale iniezione sottoretinica di AAV2-hRPE65v2. I risultati ottenuti nei primi 6 mesi di follow-up, includenti la valutazione della risposta immunitaria, dei test della funzionalità visiva e della corteccia occipitale attraverso risonanza magnetica funzionale, hanno dimostrato che la risomministrazione è sicura ed efficace anche dopo una precedente esposizione al AAV2-hRPE65v2.

D’Agostino Massimo (1), Lemma Valentina (1), Caporaso Gabriella (1), Cannata Serio Magda (1), Chesi Giancarlo (2), Polishchuk Roman (2), Bonatti Stefano (1) (1) Dipartimento di Biochimica e Biotecnologie Mediche, via S. Pansini 5, 80131 Napoli, +39.081.7463200, E-mail: bonatti@unina.it (2) Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM), Napoli

Alfa-B-Crystallino (CRYAB) appartiene alla famiglia delle “small heat shock proteins” ed è caratterizzata da un dominio N-terminale importante per la formazione di oligomeri, cruciali per la sua funzione di chaperone svolta dai domini alfa-cristallino e C-terminale (Horwitz J., Exp.Eye Res. 76:145-153, 2003). Sebbene altamente espressa nell’occhio, dove interagisce con l’alfa-A-Crystallino per garantire la trasparenza della lente, CRYAB è stata trovata fortemente espressa anche nel cervello, cuore, muscolo scheletrico e rene, dove la sua attività di chaperone è stata dimostrata per molte proteine citosoliche (Arrigo A.P. et Al, FEBS Lett. 581:3665-3674, 2007). Inoltre CRYAB è un interattore citosolico nel rene della cadherin-16 (CDH16), proteina di superficie a singolo tratto transmembrana (Thedieck C. et al., J. Mol. Biol., 145-153, 2008). Tramite un’analisi di proteomica abbiamo identificato CRYAB come partner del recettore di superficie Frizzled4 (Fz4) e di un suo mutante, ritenuto nel reticolo endoplasmatico (ER), associato ad una forma dominante della vitreoretinopatia essudativa familiare (adFEVR, Fz4-FEVR). La sovraespressione di CRYAB, ma non del suo mutante R120G difettivo per l’attività di chaperone, ripristinava la corretta localizzazione di Fz4-FEVR sulla superficie cellulare e revertiva il suo effetto dominante negativo sulla controparte wild-type (Kaykas A et al., Nat. Cell Biol., 6:52-58, 2006). Inoltre, abbiamo trovato che l’overespressione di CRYAB ripristinava la localizzazione golgiana del mutante ATP7B-H1069Q (associato alla Wilson Disease), che era similmente ritenuto nell’ER. Molta attenzione è stata dedicata agli chaperone di proteine transmembrana presenti nel lume dell’ER, ma relativamente poco si conosce sul folding delle porzioni citosoliche di queste complesse proteine. In base alla proprietà di risolvere gli aggregati di Desmina, la nostra ipotesi è che CRYAB potrebbe inibire la formazione di grossi complessi oligomerici di

ABSTRACT N. 177 Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

CARELLI VALERIO

Telethon grant N.

GGP11182

Totale €

289.000

Num Centri: 4

Durata (anni): 2

Anno d’inizio: 2011

IDENTIFICAZIONE DEI GENI MODIFICATORI NUCLEARI NELLA NEUROPATIA OTTICA EREDITARIA DI LEBER E LORO VALIDAZIONE IN LINEE CELLULARI E ORGANISMI MODELLO Carelli Valerio (1), Cantatore Palmiro (2), D’Adamo Pio (3), Daga Andrea (4) (1) Dipartimento di Scienze Biomediche e NeuroMotorie, Università di Bologna, IRCCS Istituto delle Scienze Neurologiche, Via Altura 3, 40139 Bologna, Italy, Tel. +39.051.4966747, Fax +39.051.4966098, E-mail: valerio.carelli@unibo.it (2) Dipartimento di Bioscienze, Biotecnologie e Scienze Farmacologiche, Università di Bari (3) Servizio di Genetica Medica, IRCCS Burlo-Garofolo, Università di Trieste (4) IRCCS “E.Medea”, Conegliano Veneto (TV)

La Neuropatia ottica ereditaria di Leber (LHON) è una malattia che

108

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

induce cecità prevalentemente nei giovani maschi, ora riconosciuta come la più frequente malattia mitocondriale. La LHON è associata a mutazioni puntiformi del mtDNA nei geni che codificano per le subunità del complesso I (CI). Rimangono difficilmente interpretabili la prevalenza maschile, la tessuto-specificità e la penetranza incompleta. Abbiamo intrapreso un “tour de force” multi-livello per identificare i geni modificatori della LHON integrando approcci tradizionali, come l’analisi di linkage, con approcci di ultima generazione, come l’analisi di sequenza MitoExome, la genotipizzazione di SNPs e studi di espressione con Microarray. Questo sforzo è integrato da una strategia innovativa per generare mutanti del mtDNA nel CI in Drosophila per fornire un modello di difetto del CI, mtDNA-dipendente.

Riportiamo schematicamente i risultati del primo anno: 1. Linkage e studi di genotipizzazione in un’ampia famiglia LHON. L’analisi di linkage non ha evidenziato load-scores significativi assumendo un tratto monogenico. La successiva analisi genome-wide ha generato un elenco di SNPs da cui abbiamo selezionato i 50 più significativi. Questi dati indicano che la penetranza nella LHON è modulata da polimorfismi in geni diversi, piuttosto che da una singola mutazione. L’uso di co-variate (età, sesso, fumo e numero di copie dell’mtDNA in linfociti) ha generato un secondo pool di geni.

2. MitoExome in 27 fratelli discordanti da 11 famiglie LHON. Abbiamo studiato fratelli maschi discordanti (13 affetti vs 14 portatori sani), in cui è stato sequenziato l’esoma di 1605 proteine mitocondriali e lo stesso mtDNA. Nessuna associazione è emersa da questa analisi, ma considerando solo la singola ampia famiglia sono emersi 7 SNPs (2 protettivi e 5 di rischio). Includendo nell’analisi l’esposizione a fumo e alcool, sono state identificate 3 ulteriori varianti.

3. Studi di espressione con Microarry su biopsie muscolari di fratelli maschi discordanti.

Abbiamo usato 3 coppie di fratelli maschi discordanti del gruppo precedente, per i quali disponevamo di biopsia muscolare per eseguire una analisi di espressione con Microarray. 4 geni di interesse sono stati ottenuti da questa analisi.

4. Generazione di mutazioni in CI nell’mtDNA di Drosophila.

Abbiamo adottato una strategia pubblicata per selezionare mutazioni nel mtDNA di Drosophila a carico del CI. Sono state ottenute 4 mutazioni indipendenti nella subunità ND5. Attualmente queste mutazioni vengono studiate per la loro rilevanza patogenetica, anche se al momento nessuna di queste altera la respirazione mitocondriale. Ulteriori studi sono in corso per svelare il loro potenziale patologico.

In conclusione, l’approccio multi-livello di questo progetto ha generato un certo numero di geni candidati con un possibile ruolo modificatore nella LHON. La validazione delle varianti selezionate in ampie coorti di individui LHON è attualmente in corso.

me carattere recessivo legato al sesso, che si manifesta con grave difetto della vista e con anomalie dei melanosomi nei melanociti cutanei e nell’epitelio pigmentato della retina. Il prodotto del gene responsabile dell’albinismo oculare, chiamato OA1, è un recettore associato a proteine G, localizzato sulla membrana degli organelli intracellulari (melanosomi e lisosomi) e necessario per la biogenesi e il trasporto dei melanosomi. Nel 2008, Lopez et al. (1) hanno proposto che la L-DOPA sia il ligando di OA1 e, fra gli altri dati, hanno riportato che in assenza di tirosina - un amino acido strutturalmente correlato alla L-DOPA - l’OA1 esogeno espesso in cellule COS da un vettore plasmidico aumentava significativamente. Secondo gli autori questo era dovuto al fatto che nel normale mezzo di coltura, che contiene tirosina, OA1 legava questo amino acido come uno pseudo-ligando, e veniva così costitutivamente internalizzato e degradato; al contrario, in assenza di tirosina il recettore recuperava la sua espressione (1). Per stabilire il ruolo della tirosina nella funzione di OA1, abbiamo eseguito una serie di controlli e abbiamo trovato che questo effetto non è specifico né per OA1 né per la tirosina, ma si osserva anche con altre proteine e altri amino acidi. Infatti, in assenza di amino acidi essenziali, le cellule scatenano una risposta epigenetica, che porta alla riattivazione di transgeni e virus integrati nel genoma e silenziati (2). Questo processo è in parte mediato dall’inibizione dell’istone deacetilasi HDAC4 e funziona anche con l’HIV-1, l’agente eziologico dell’AIDS, in uno stato di latenza. Infatti, la deprivazione di amino acidi o l’inibizione di HDAC4 promuovono la riattivazione di HIV-1 in cellule linfocitiche ACH-2 esprimenti HDAC4 (2). Perciò, una scoperta casuale ci ha permesso di passare dall’albinismo oculare ai meccanismi di sorveglianza epigenetica utilizzati dalle cellule per difendere il loro genoma dall’invasione di retrovirus o di altri parassiti genetici. Oltre ad avere importanza biologica, i nostri risultati suggeriscono che l’utilizzo di HDAC4 come selettivo bersaglio farmacologico potrebbe rappresentare una nuova strategia per modulare l’espessione sia dei vettori virali utilizzati a scopo terapeutico, sia dell’HIV-1 integrato nei “reservoir” di latenza, evitando un’eccessiva citotossicità.

1. Lopez VM, Decatur CL, Stamer WD, Lynch RM, McKay BS (2008) L-DOPA is an endogenous ligand for OA1. PLoS Biol 6:e236.

2. Palmisano I, Della Chiara G, D’Ambrosio RL, Huichalaf C, Brambilla P, Corbetta S, Riba M, Piccirillo R, Valente S, Casari G, Mai A, Boneschi FM, Gabellini D, Poli G, Schiaffino MV. (2012) Amino acid starvation induces reactivation of silenced transgenes and latent HIV-1 provirus via down-regulation of histone deacetylase 4 (HDAC4). Proc Natl Acad Sci U S A, 109:E2284-93.

ABSTRACT N. 179 Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

ABSTRACT N. 178 Responsabile

296.200 Durata (anni): 2

Anno d’inizio:

SCHIAFFINO MARIA VITTORIA

Telethon grant N.

GGP08156

Totale €

384.500

Num Centri: 1

GGP12033

Totale € Num Centri: 3

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche

LANZANI GUGLIELMO

Telethon grant N.

Durata (anni): 3

SVILUPPO DI INTERFACCE BIO-ORGANICHE FOTOVOLTAICHE E LORO APPLICAZIONE COME PROTESI RETINICHE PER LA CURA DELLA RETINITE PIGMENTOSA

Anno d’inizio: 2008

Ghezzi Diego (2), Antognazza Maria Rosa (1), Maccarone Rita (3), Lanzarini Erica (1), Martino Nicola (1), Mete Maurizio (4), Pertile Grazia (4), Bisti Silvia (3), Benfenati Fabio (2), Lanzani Guglielmo (1)

ALLA RICERCA DELLE BASI MOLECOLARI DELL’ALBINISMO OCULARE DI TIPO 1: UN’ECCEZIONALE OPPORTUNITÀ PER FAR LUCE SULLA TRASDUZIONE DEL SEGNALE NEL SISTEMA DELLE ENDOMEMBRANE

(1) Department of Physics and Center for Nano Science and Technology, Politecnico di Milano, Piazza Leonardo da Vinci 32, 20133, Milano, Tel. 02.23999877; Fax. 02.23996126; E-mail: guglielmo.lanzani@iit.it (2) Department of Neuroscience and Brain Technologies, Istituto Italiano di Tecnologia, Genova, Italy (3) Dipartimento di Tecnologie Biomediche, Università dell’Aquila, L’Aquila, Italy (4) UO Oculistica, Ospedale S. Cuore Don Calabria, Negrar (Verona), Italy

Palmisano Ilaria (1), Della Chiara Giulia (2), D’Ambrosio Rosa Lucia (1), Huichalaf Claudia (3), Brambilla Paola (4), Corbetta Silvia (2), Riba Michela (1), Piccirillo Rosanna (5), Valente Sergio (6), Casari Giorgio (1,7), Mai Antonello (6), Martinelli Boneschi Filippo (4), Gabellini Davide (3), Poli Guido (2,7), Schiaffino Maria Vittoria (1)

Il progetto è finalizzato alla creazione di un’interfaccia fotovoltaica biocompatibile, basata su semiconduttori organici, volta a risolvere la cecità in pazienti affetti da Retinite pigmentosa (RP) o da altre patologie caratterizzate dalla degenerazione dei fotorecettori. Grazie ad un team multidisciplinare composto da fisici, neuroscienziati e oculisti, ci proponiamo il raggiungimento dei seguenti obiettivi: a. Ottimizzare l’efficienza e la biocompatibilità dell’interfaccia fotovoltaica bio-organica, mediante caratterizzazione in-vitro su colture primarie di neuroni ippocampali. b. Studiare l’interfaccia ex vivo su espianti di retina prelevati da animali normali e da modelli sperimentali di degenerazione fotorecettoriale. c. Studiare l’interfaccia in vivo, mediante impianti sottoretinici in modelli animali di degenerazione fotorecettoriale.

(1) Center for Translational Genomics and Bioinformatics, San Raffaele Scientific Institute, Via Olgettina 58, 20132 Milan, Italy, Tel. +39-02-2643.4729; Fax +39-02-2643.6352; E-mail: schiaffino.mariavittoria@hsr.it (2) Division of Immunology, Transplantation and Infectious Diseases, San Raffaele Scientific Institute, Milan (3) Dulbecco Telethon Institute and Division of Regenerative Medicine, San Raffaele Scientific Institute, Milan (4) Division of Neuroscience, San Raffaele Scientific Institute, Milan (5) Department of Cell Biology, Harvard Medical School, Boston, MA, USA (6) Dipartimento di Chimica e Tecnologie del Farmaco, Sapienza Università di Roma, Roma (7) Vita-Salute San Raffaele University, School of Medicine, Milan

L’albinismo oculare di tipo 1 è una malattia genetica trasmessa co-

109

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

I materiali organici rappresentano dei materiali attivi ideali per la realizzazione di sensori artificiali da accoppiare in modo diretto al tessuto nervoso, come dimostra l’interfaccia bio-organica che abbiamo recentemente sviluppato (Ghezzi et al. Nature Comm., 2011). Si è dimostrato che colture primarie di neuroni ippocampali possono essere efficacemente stimolate sotto l’effetto della luce visibile, opportunamente mediata da un polimero semiconduttore. I materiali adottati sono intrinsecamente sensibili alla luce visibile, sono porosi, supportando quindi efficacemente la crescita di network cellulari in-vitro, possono essere depositati su substrati flessibili, presentano buone caratteristiche di biocompatibilità, e sono in grado di generare corrente elettrica in condizioni fotovoltaiche, in assenza di elettrodi metallici e con minima dissipazione termica, non richiedendo quindi dispositivi esterni per l’alimentazione e/o la trasduzione dell’informazione luminosa. Quest’ultima caratteristica, peculiare della tecnologia organica, è resa possibile dalla creazione di un intenso campo elettrico fortemente localizzato alla superficie del polimero a contatto con l’ambiente extracellulare, responsabile dell’attivazione, otticamente mediata, della rete neuronale. La validità dell’approccio proposto è stata di recente confermata da esperimenti preliminari, su espianti di retina preventivamente sottoposte a danno fototossico. Il progetto proposto mira a sviluppare l’approccio intrapreso, ponendosi come obiettivo la realizzazione di un dispositivo organico in grado di stimolare i neuroni retinici in-vivo in condizioni di normale luminosità diurna.

elettroretinogramma focale (fERG). Lo studio ha finora arruolato 38 pazienti, è in corso e si prevede che terminerà nel Maggio 2013.

Preliminarmente è stata valutata la affidabilità e riproducibilità del fERG nei pazienti inclusi nello studio. I risultati indicano che nella maggioranza dei pazienti le risposte fERG, pur essendo più variabili che nei soggetti normali, sono significativamente separabili dal rumore elettrico di fondo e sufficientemente affidabili in ripetuti tests (variabilità media 0.5 dB, SD 1.7 dB). ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01278277 REFERENZE B.Falsini, M. Piccardi, D. Marangoni, A. Minnella, M. Bertelli, S. Bisti, A. Fadda A SubmicroVolt Focal ERG Technique for Evaluating Macular Function in Stargardt/FF Dystrophy: Clinical Assessment of Test Reliability. ARVO abstract 2012; Invest Ophthalmol Vis Sci 2012;53: E-Abstract 6434. (supported by Telethon Grant GGP10149 to BF)

ABSTRACT N. 180

GENETICA DELLA PERDITA UDITIVA

ABSTRACT N. 181 Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

Responsabile

257.000 Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2009

Girotto Giorgia, Vuckovic Dragana, Paolo Gasparini

FALSINI BENEDETTO

Telethon grant N.

GGP10149

Totale €

141.400

Num Centri: 1

GGP09037

Totale € Num Centri: 1

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche

GASPARINI PAOLO

Telethon grant N.

Durata (anni): 2

Genetica Medica, IRCCS-Burlo Garofolo, Università di Trieste, Via dell’Istria 65, Trieste, Italy, Tel. +39.045.3785355, E-mail: geneticamedica@burlo.trieste.it Anno d’inizio: 2011

Il progetto si focalizza principalmente sullo studio dei geni implicati nella funzione uditiva, sull’analisi genetica delle sordità monogeniche e sull’identificazione delle cause genetiche della presbiacusia, per migliorare le strategie di diagnosi e la terapia dei pazienti e dei loro familiari. Per raggiungere questi obiettivi, abbiamo pianificato una strategia che combina attività di ricerca di base ed applicata ovvero: a) identificazione di nuovi geni mediante sequenziamento ad alto processamento di coorti e mediante approccio genome wide e di linkage in famiglie e popolazioni isolate b) ottenimento di dati molecolari epidemiologici, di nuovi algoritmi e linee guida diagnostiche c) validazione di un metodo non invasivo per l’analisi di portatori di mutazioni a carico del gene GJB2.

Durante i 3 anni del progetto, sono state sviluppate le seguenti attività: a) 3 GWAS su tratti uditivi quantitativi ottenuti mediante metanalisi di dati provenienti da 17 popolazioni isolate provenienti dall’Europa e dal Centro Asia per un numero totale di 3800 individui. Molti loci significativi (p<10-8) sono stati identificati. I dati sono stati inoltre utilizzati per costruire varie pathways “in silico” . b) 2 GWAS su tratti uditivi qualitativi con particolare riferimento alla presbiacusia. Alcuni geni/loci significativi (p<10-8) sono stati identificati includendo geni correlati allo sviluppo e alla funzione uditiva ma anche geni la cui funzione è ancora sconosciuta. Una replica di questi risultati è stata prodotta utilizzando una casistica proveniente da diversi paesi Europei c) analisi immunoistochimica in modelli animali relativa ad una serie di geni identificati con le analisi descritte ai punti a e b. Alcuni geni hanno mostrato una espressione cellula specifica all’interno della coclea mentre altri presentano un espressione che interesse più aree cocleari d) sequenziamento dell’esoma di 8 pazienti provenienti da due diverse popolazioni isolate. L’analisi è stata eseguita per permettere di identificare i geni causativi e i dati filtrati sono in corso di validazione e) sequenziamento dell’esoma di 6 famiglie Italiane (sordità dominante) e 5 Qatarine (sordità recessiva). Nelle famiglie italiane sono stati identificati 5 nuovi geni/loci, mentre in quelle qatarine 4 con la scoperta di un nuovo gene coinvolto nelle perdite uditive. In particulare una mutazione causativa (c.7873 t>g che comporta un p.*2625Gluext*11) è stata trovata nel gene BDP1. Questa mutazione distrugge il codone di terminazione e comporta un allungamento della proteina di 11 aa. Studi di immunoistochimica hanno dimostrato che BDP1 è effettivamente espresso nella coclea di topo. f) validazione di un metodo rapido e non invasivo di screening per i portatori di mutazioni sul gene GJB2 che ha confermato l’affidabilità del protocollo diagnostico.

UNA NUOVA STRATEGIA TERAPEUTICA MIRATA AL DANNO OSSIDATIVO DEI FOTORECETTORI NELLE EREDO-DEGENERAZIONI RETINICHE INDOTTE DA MUTAZIONI DEL GENE ABCR. STUDIO CLINICO E SPERIMENTALE Falsini Benedetto (1), Piccardi Marco (1), Maccarone Rita (2), Bisti Silvia (2) (1) Istituto di Oftalmologia, Università Cattolica del S. Cuore, Roma, Largo F. Vito 1, 00168 Roma, Tel 0630154929 (2) DISCAB (Dipartimento di Scienze Cliniche Applicate e Biotecnologiche), Università dell’Aquila, L’Aquila

L’area di interesse nella quale questo progetto è sviluppato è quello delle degenerazioni retiniche dovute a mutazioni del gene ABCR, responsabili della distrofia maculare giovanile di Stargardt (STD/FF).

La STD/FF è una delle maggiori cause di ipovisione grave in età giovanile, e consiste in una disfunzione e perdita dei fotorecettori coni e bastoncelli, in consguenza di un danno fotoossidativo. Una terapia mirata a contrastare questo meccanismo di danno fotossidativo potrebbe mitigare gli effetti della malattia o quantomeno arrestarne l’evoluzione. In questo progetto si propone di investigare una nuova terapia basata sulla somministrazione di un derivato de crocus sativus (Zafferano) che si è dimostrato particolarmente efficace nella protezione del danno fotossidativo nel modello animale. In aggiunta, dati preliminari nella degenerazione maculare legata all’età, altra patologia legata al danno fotossidativo, mostrano un’efficacia del composto nel migliorare significativamente la funzionalità retinica, in assenza di effetti collaterali. Il progetto si sivluppa in due laboratori, uno, quello dell’Università Cattolica, in cui verranno esaminati e trattati i pazienti, ed un altro, quello dell’Università dell’Aquila, in cui verranno testati e trattati topi transgenici con knock-out genetico del gene ABCR. Modello sperimentale Topi transgenici con il knock-out del gene ABCA4 vengono stabiliti in colonia e valutati nel tempo per studiare le caratteristiche della loro degenerazione retinica e l’effetto del trattamento orale con zafferano. Gli animali vengono valutati sia istologicamente che funzionalmente (elettroretinografia). I risultati finora ottenuti hanno evidenziato un processo di neuroinfiammazione retinica associata ad alterazioni elettrofunzionali. La neuroinfiammazione viene modulata nella sua entità dal trattamento con lo zafferano.

Trial clinico E’ in corso un trial clinico randomizzato, con placebo in doppio cieco e con disegno cross-over nel quale viene valutato l’effetto della supplementazione di zafferano nei pazienti Stargardt con mutazione ABCA4. La principale variabile di risultato è rappresentata dalla risposta obiettiva della regione maculare a stimoli luminosi mediante

110

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

ABSTRACT N. 182

APPROCCI “OMICI” PER L’IDENTIFICAZIONE DI NUOVI GENI RESPONSABILI DI SORDITÀ NON SINDROMICA NEUROSENSORIALE EREDITARIA

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

MAMMANO FABIO

Telethon grant N.

GGP09137

Totale €

331.500

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Soldà Giulia (1), Robusto Michela (1), Asselta Rosanna (1), Ghilardi Anna (2), Castorina Pierangela (3), Benzoni Elena (3), Primignani Paola (4), Ambrosetti Umberto (3), Del Giacco Luca (2), Duga Stefano (1)

Anno d’inizio: 2009

(1) Dipartimento di Biotecnologie Mediche e Medicina Traslazionale (BIOMETRA), Via Viotti 3/5, 20133, Milano, Italy, Tel. 02.50315823, Fax 02.50315864, E-mail: stefano.duga@unimi.it (2) Dipartimento di Bioscienze, Università degli Studi di Milano, Milano, Italy (3) Laboratorio di Genetica Medica e UO Audiologia, Fondazione IRCCS, Ospedale Maggiore Policlinico, Mangiagalli e Regina Elena, Milano, Italy (4) S.O. Genetica Medica, Ospedale Niguarda Cà Granda, Milano, Italy

EFFICIENTE INSERIMENTO GENICO NELL’ORECCHIO INTERNO ATTRAVERSO CANALOSTOMIA Crispino Giulia (1,2), Galindo Ramirez Fabian (2), Di Pasquale Giovanni (3), Jay Chiorini (3), Mammano Fabio (1,2,4) (1) Fondazione per la Ricerca Biomedica Avanzata, Istituto Veneto di Medicina Molecolare, Via Orus, 2, 35129 Padova, Italy, Tel. 049.7923231, E-mail: fabio.mammano@unipd.it (2) Dipartimento di Fisica “G. Galilei, Università” di Padova, Padova, Italy (3) Molecular Physiology and Therapeutics Branch, National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA (4) Istituto CNR di Neuroscienze, Padova, Italy

Obiettivi del progetto Questo progetto è volto all’identificazione di nuovi determinanti genetici della sordità non sindromica neurosensoriale ereditaria (NSHL) attraverso un duplice approccio: a) investigando il ruolo patogenetico di mutazioni nel gene MIR96, e b) ricercando nuovi geni/mutazioni mediante sequenziamento dell’esoma (WES) in famiglie affette e successiva caratterizzazione funzionale in zebrafish.

Risultati ottenuti a) Il microRNA miR-96 svolge un ruolo essenziale nell’orecchio interno dei vertebrati e mutazioni puntiformi nella sua “seed region” causano NSHL autosomica dominante (AD-NSHL). Nel nostro laboratorio è stata identificata una nuova mutazione, miR-96(+57T>C), in una famiglia italiana affetta da AD-NSHL. La mutazione sostituisce un residuo altamente conservato ed è predetta ridurre la stabilità della struttura secondaria del pre-miRNA. Studi in sistemi cellulari hanno dimostrato che i livelli di entrambi i miRNA maturi (miR96-5p e miR-96-3p) sono significativamente ridotti in presenza della mutazione, mentre i livelli del precursore rimangono inalterati.

Inoltre, la normale espressione di entrambi i miRNA può essere ripristinata con una mutazione compensatoria che ricostituisca la struttura secondaria del precursore. Infine, anche se la sequenza del miR-96-5p maturo non è modificata, la mutazione +57T>C è in grado di alterare in modo significativo la regolazione dei trascritti bersaglio del miRNA. Complessivamente, questi dati forniscono ulteriori evidenze sul coinvolgimento del miR-96 nella sordità e dimostrano che anche difetti quantitativi di questo miRNA possono contribuire all’insorgenza di NSHL. b) Quattro famiglie italiane (NSHL1-4) affette da NSHL a trasmissione recessiva sono state sottoposte a WES. Per 3 famiglie (NSHL1-3) non è stata identificata alcuna mutazione in geni noti.

Attualmente, sono in fase di validazione alcune varianti candidate in geni non precedentemente associati alla sordità. In parallelo, l’unità Zebrafish sta mettendo a punto i protocolli di silenziamento/overespressione, che saranno essenziali per la validazione funzionale dei nuovi geni identificati, analizzando un gene già associato a NSHL, SMPX. Nella famiglia NSHL4 il sequenziamento ha portato alla identificazione di una nuova mutazione missenso nel gene PRPS1 (locus DFNX1), che codifica per l’enzima fosforibosilpirofosfato sintetasi I (PRS-I). Il successivo screening di PRPS1 in 13 ulteriori famiglie con NSHL X-linked ha consentito l’identificazione di una seconda mutazione missenso non precedentemente nota. Entrambi le sostituzioni aminoacidiche sono predette destabilizzare la struttura dell’enzima e determinano una riduzione > 60% dell’attività di PRS-I negli eritrociti dei pazienti.

In conclusione, i nostri dati evidenziano la ricorrenza di mutazioni in PRPS1 tra i pazienti italiani affetti da NSHL, suggerendo che questo gene rappresenti un locus da includere negli screening genetici di famiglie con NSHL X-linked.

I nostri recenti studi hanno mostrato che l’inserimento genico in vitro effettuato attraverso un virus adeno associato bovino ricombinante (BAAV) può ripristinare l’espressione proteica e l’accoppiamento delle giunzioni comunicanti in colture organotipiche di coclea provenienti da modelli murini di sordità associata a connessine (Ortolano et al., PNAS, 2008; Crispino et al., PlosOne, 2011).

Per verificare l’efficacia del BAAV anche in vivo, abbiamo esplorato differenti approcci per la somministrazione delle particelle virali. La canalostomia nel canale semicircolare è un metodo attraente per la relativa semplicità dell’approccio chirurgico (Kawamoto, K., et al., Mol Ther., 2001) e anche perchè deriva dalla labirintectomia, utilizzata per il trattamento delle vertigini nell’uomo.

Utilizzando coloranti di assorbanza e marcatori fluorescenti, abbiamo confermato che la canalostomia minimizza i danni alle strutture esistenti, e assicura una distribuzione dell’agente iniettato in tutta la coclea.

Abbiamo quindi utilizzato questa tecnica per inserire nell’orecchio interno di topi Cx26loxP/loxP di 4 e 30 giorni dei vettori di BAAV contenenti una cassetta di espressione per Cre-IRESGFP (BAAVCre–IRESGFP). L’espressione della Cre ricombinasi in vivo ha catalizzato la ricombinazione del gene floxato per la Cx26, provocando una riduzione di circa il 50% dei livelli di mRNA della Cx26. Tre settimane dopo l’iniezione, le soglie uditive, ottenute attraverso la registrazione delle risposte del tronco encefalico (ABRs), erano significativamente aumentate nei topi Cx26loxP/loxP che avevano ricevuto BAAVCre–IRESGFP ma erano rimaste normali nei fratelli iniettati solo con il veicolo cosi come in topi di ceppo selvaggio iniettati con BAAVCre-IRESGFP. Successivamente, abbiamo provato a ripristinare la funzione uditiva nei topi sordi deleti della Cx30 (Cx30 KO). Studi precedenti avevano dimostrato che la sovraespressione della Cx26 atttaverso l’inserimento di un BAC ripristinava completamente l’udito nei topi Cx30 KO (Ahmad S. et al., PNAS, 2007). Nel nostro studio, abbiamo inserito attraverso canalostomia un BAAVCx26CFP BAAV nei topi sordi Cx30 KO di 4 giorni. Tre settimane dopo l’operazione, abbiamo registrato l’ABR e abbiamo osservato soglie uditive invariate. Per capire questo risultato, abbiamo analizzato i livelli di mRNA di Cx26CFP a differenti giorni dopo l’iniezione. Abbiamo osservato un livello massimo di espressione di Cx26CFP due giorni dopo l’operazione, che diminuiva giorno dopo giorno, scomparendo quasi completamente 30 giorni dopo l’operazione.

Tutti insieme, i nostri risultati dimostrano chiaramente che 1) il BAAV in vivo trasduce l’orecchio interno del topo in modo efficiente ma con effetto transiente e 2) l’espressione delle connessine è necessaria per la funzione uditiva in ogni stadio di sviluppo.

I nostri futuri sforzi saranno indirizzati alla costruzione di un vettore BAAV che permetta una espressione stabile delle connessine ricombinanti nell’orecchio interno, permettendo di conseguenza un recupero dell’udito.

ABSTRACT N. 184 Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

310.100

GGP11177

Totale €

345.000 Durata (anni): 3

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2009

REGOLAZIONE GATA1-MEDIATA DELL’ESPRESSIONE GENICA DI SEC23B: IMPLICAZIONI PER LA DIAGNOSI DI ANEMIA CONGENITA DISERITROPOIETICA II

DUGA STEFANO

Telethon grant N. Num Centri: 3

GGP09044

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 183

IOLASCON ACHILLE

Telethon grant N.

Russo Roberta (1,2), Andolfo Immacolata (2), Gambale Antonella (2), Esposito Maria Rosaria (2), Langella Concetta (1,2), Asci Roberta (2), Iolascon Achille (1,2)

Anno d’inizio: 2011

111

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

canze. Dato che anche livelli ridotti di fattore FVII/FIX (>3%) possono ripristinare l’emostasi, queste patologie rappresentano modelli ideali per valutare approcci terapeutici innovativi.

RIPRISTINO DEI LIVELLI DI FVII/FIX MEDIANTE U1snRNA MODIFICATE IN MODELLI CELLULARI L’espressione di minigeni specifici per F7/F9 ha portato a definire il meccanismo causativo di 25 mutazioni differenti nel sito donatore di splicing (5’ss), caratterizzato da “exon skipping” e/o attivazione di siti criptici.

Abbiamo dimostrato come la componente chiave dello spliceosoma U1snRNA, modificata per legarsi mediante complementarietà al 5’ss mutato, sia capace di correggere efficacemente numerose mutazioni nel 5’ss. Inoltre, queste U1snRNA sono risultate capaci di correggere alcune mutazioni nel sito accettore di splicing (3’ss). Mediante costrutti di cDNA competenti per lo splicing, si è dimostrato come la correzione dello splicing produca livelli significativi di FVII/FIX secreto e con attività coagulante (da non rilevabile a >10% per il FVII, fino 100% per il FIX).

Per aumentare la specificità di sequenza bersaglio, abbiamo disegnato U1snRNA complementari a sequenze introniche non conservate a valle del 5’ss (U1snRNA Esone Specifiche, EXSpeU1), e dimostrato un gradiente di efficacia che decresce all’aumentare della distanza. La ExSpeU1 migliore (ExSpeU1-FIX+9) ha ripristinato la secrezione e la funzione (~90%) del FIX in presenza di diverse mutazioni sia al 5’ss che al 3’ss.

RIPRISTINO DEI LIVELLI DI FVII IN MODELLI ANIMALI In modelli cellulari, l’U1snRNA+5a (U1+5a) ripristina parzialmente (~10%) l’espressione del FVII umano (hFVII) compromessa dalla mutazione c.840+5G>A nel 5’ss dell’IVS7. Nei topi, abbiamo studiato il ripristino mediato da U1+5a, sia transiente (attraverso vettori non virali) che prolungato (vettori virali adenoassociati [AAV]), mediante co-espressione del minigene del FVII mutato (FVII+5A) e di U1+5a. In entrambi i sistemi sperimentali, trascritti normali di FVII erano apprezzabili negli epatociti. La co-espressione transiente della U1+5a ha prodotto la comparsa di hFVII negli epatociti e livelli di proteina circolante fino a 367ng/ml (~17% of wt-hFVII). L’espressione prolungata di hFVII circolante, e dose-dipendente (da non rilevabile a 30ng/ml), è stata dimostrata con vettori virali.

CONCLUSIONI Per la prima volta si è i) dimostrata la correzione di varie mutazioni di splicing mediante un’unica ExSpeU1, e i livelli di FVII/FIX raggiunti, se ottenuti nei pazienti, risulterebbero terapeutici e ii) fornita la “proof-of-principle- in vivo del potenziale terapeutico della correzione mediata da U1snRNA per mutazioni di splicing, una causa frequente di patologie genetiche umane.

(1) CEINGE, Biotecnologie Avanzate, Via Gaetano Salvatore 486, 80145 Napoli, Tel. +39.081.3737898, Fax +39.081.3737804, E-mail: achille.iolascon@unina.it (2) Dipartimento di Biochimica e Biotecnologie Mediche, Università degli Studi di Napoli “Federico II”, Napoli

Il gene SEC23B codifica per un componente del complesso di rivestimento vescicolare (COP)II, coinvolto nel traffico anterogrado reticolo endoplasmatico-Golgi. Mutazioni in questo gene causano l’Anemia Diseritropoietica Congenita II (CDAII), una malattia autosomica recessiva caratterizzata da eritropoiesi inefficace. Circa 60 differenti mutazioni causative sono state descritte (Iolascon, 2011; Russo, 2011; Punzo, 2011; Liu, 2012). La maggior parte dei pazienti presenta due mutazioni, concordemente al modello di ereditarietà recessiva. Tuttavia, nella nostra coorte, circa il 10% dei pazienti ha una sola mutazione in eterozigosi. Abbiamo, quindi, ipotizzato la presenza di una seconda mutazione nel gene GATA1, supponendo possa essere coinvolto nella regolazione dell’espressione di SEC23B. Il fattore trascrizionale GATA1 è un regolatore della trombo/eritropoiesi. Infatti, mutazioni in questo gene sono state già associate ad una variante di CDA, l’anemia diseritropoietica legata all’X con trombocitopenia (XDAT).

Scopi del nostro lavoro: (i) screening mutazionale del gene GATA1 in pazienti CDAII SEC23B-negativi o incompleti; (ii) caratterizzazione della regione promotrice di SEC23B e (iii) studio della regolazione GATA1-mediata dell’espressione di SEC23B. Lo screening mutazionale di GATA1 è stato eseguito come precedentemente descritto (Russo, 2010). Abbiamo identificato un paziente XDAT, con mutazione emizigote Gly208Arg. Due pazienti CDAII, SEC23B-incompleti, hanno mostrato la stessa variante polimorfica (rs113966884 G/A) nella regione 5’ a monte del gene GATA1. Abbiamo dimostrato che entrambe le variazioni determinano una ridotta espressione di GATA1, correlata ad una diminuzione di SEC23B, implicando una connessione funzionale tra i due geni.

L’analisi del promotore di un gene è un passo essenziale per identificare i network di regolazione genica. Per caratterizzare la regione promotrice di SEC23B, abbiamo realizzato 10 mutanti per delezione della regione di 3500 bp a monte del gene. Mediante saggio di luciferasi dei mutanti abbiamo identificato la regione minima promotrice del gene. Le analisi in silico di tale regione hanno predetto la presenza di putativi siti di legame dei principali fattori di trascrizione (TFBS) coinvolti nel differenziamento eritroide, GATA1 e KLF1: infatti, mutazioni in entrambe le proteine causano particolari tipi di CDA. La regolazione GATA1-mediata dell’espressione di SEC23B è stata confermata mediante co-trasfezione dei costrutti pCDNA3.1GATA1/G208R e pGL3-HuSEC23B/3.44 in cellule HEK-293. Il legame effettivo di GATA1 al promotore di SEC23B è stato dimostrato mediante saggio di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) in un modello cellulare eritroide.

L’identificazione di TFBS nel promotore di SEC23B potrebbe consentire la diagnosi conclusiva di pazienti CDAII con particolari fenotipi clinici o con pattern incompleto di mutazioni nel gene. Tale studio, inoltre, apre la strada a nuove conoscenze sui meccanismi molecolari di regolazione dell’espressione di SEC23B.

ABSTRACT N. 186 Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

GGP09280

Totale €

125.400

Num Centri: 1

ABSTRACT N. 185 PINOTTI MIRKO

Telethon grant N.

GGP09183

Totale €

345.300

Num Centri: 2

Durata (anni): 3

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2009

POTENZIALI EFFETTI TERAPEUTICI DELLE CELLULE UMANE ENDOTELIALI DEI SINUSOIDI EPATICI, DEL MIDOLLO OSSEO E DEL SANGUE DA CORDONE NELL’EMOFILIA A

TProgetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

FOLLENZI ANTONIA

Telethon grant N.

Merlin Simone (1), Zanolini Diego (1), Ranaldo Gabriella (1), Cannizzo Stefania (1), Feola Maria (1), Valente Guido (2), Prat Maria (1), Follenzi Antonia (1)

Anno d’inizio: 2009

NUOVE STRATEGIE TERAPEUTICHE PER DIFETTI EREDITARI DELLA COAGULAZIONE CAUSATI DA MUTAZIONI DI SPLICING

(1) Università del Piemonte Orientale, Dipartimento di Scienze della Salute, via Solaroli 17, 28100, Novara, Tel. 0321.660674, E-mail: antonia.follenzi@med.unipmn.it (2) Università del Piemonte Orientale, Dipartimento di Medicina Traslazionale, Novara

Balestra Dario (1), Fernandez Eugenio (2), Dal Mas Andrea (2), Cavallari Nicola (1), Barbon Elena (1), Bussani Erica (2), Ferraresi Paolo (1), Canella Alessandro (1), Branchini Alessio (1), Campioni Matteo (1), Baroni Marcello (1), Mattioli Chiara (2), Pagani Franco (2), Pinotti Mirko (1)

L’identificazione di cellule capaci di sintetizzare e rilasciare il FVIII è fondamentale per lo sviluppo di nuove terapie per la cura dell’emofilia A. Per la maggior parte, sono le cellule endoteliali, in particolare le cellule endoteliali dei sinusoidi epatici (LSEC), ad esprimere FVIII. Tuttavia, nostri studi recenti di trapianto di midollo osseo nei topi emofilici hanno suggerito che altri tipi cellulari potrebbero sintetizzare e rilasciare FVIII, e infine correggere il fenotipo emorragico in topi affetti da emofilia A (Follenzi et al., 2012). Pertanto, per verificare la capacità delle cellule circolanti del sangue di esprimere FVIII, abbiamo analizzato diversi tipi cellulari ematopoietici umani e murini. In un primo tempo, abbiamo generato un anticorpo policlonale contro il FVIII umano ricombinante. In un secondo tempo abbiamo verificato che il FVIII fosse presente in cellule ematopoietiche umane appena isolate da sangue periferico o midollo osseo, co-

(1) Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare, Università di Ferrara, Via Fossato di Mortara 74, 44121 Ferrara, Tel. 0532.424424, Fax 0532.424484, Email: pnm@unife.it (2) Human Molecular Genetics, International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology, Padriciano, Trieste

Lo splicing aberrante del pre-RNA indotto da mutazioni è causa frequente (>20%) di deficienze gravi di fattore VII (FVII) e IX (FIX, emofilia B) della coagulazione. Esse possono causare gravi emorragie, talora fatali, ed il loro trattamento è associato a gravi compli-

112

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

sì come in cellule provenienti da sangue cordonale. Tali tipi cellulari includono cellule della linea mieloide, quali monociti, macrofagi, cellule dentritiche e megacariociti. L’identità di questi tipi cellulari è stata verificata in immunofluorescenza tramite co-marcatura tra il FVIII e marker specifici, CD14 per monociti/macrofagi, CD11c per cellule dendritiche e vWF o CD61 per i megacariociti differenziati da midollo osseo. Inoltre, l’espressione del FVIII in queste cellule è stata verificata a livello di mRNA e di proteina. In terzo luogo, abbiamo confermato l’espressione di FVIII nelle cellule del fegato umano normale, del midollo osseo, milza, polmoni e reni. Infine, sono stati eseguiti trapianti in topi affetti da emofilia A o con KC di topi C57Bl/6 o con monociti isolati da sangue cordonale umano tramite selezione immunomagnetica con CD11b. L’analisi dei tessuti in immunofluorescenza ha mostrato che le cellule trapiantate hanno attecchito nel fegato e sopravvissute per almeno una settimana. Il saggio del “taglio della coda” in topi affetti da emofilia A ha mostrato la correzione del fenotipo emorragico in 9 topi su 14 (64%) dopo trapianto di KC, in 9 topi su 11 (82%) dopo trapianto con cellule derivanti da sangue cordonale umano e confermato con i saggi aPTT e COATEST la presenza di attività del FVIII nel plasma dei topi emofilici. Recentemente, abbiamo isolato epatociti, LSEC e KC da biopsie di fegato umano e confermato l’espressione del FVIII in questi tipi cellulari e iniziato colture LSEC per verificarne la potenziale capacità proliferativa in vitro al fine di trapiantarle in topi gamma-null emofilici, generati in laboratorio, per valutare infine il potenziale terapeutico.

Conclusioni: Oltre alle cellule endoteliali del fegato, il FVII è espresso nelle cellule circolanti del sangue, inclusi monociti, macrofagi e megacariociti. Questi approfondimenti nelle origini cellulari del FVIII offrono nuovi meccanismi per comprendere le alterazioni nella sintesi di FVIII e il rilascio per sviluppare nuove terapie per l’emofilia.

cative in condizioni di sovraccarico acuto di eme, che nel topo wildtype causa un forte aumento dell’espressione di FLVCR1a nel fegato. Al contrario il sovraccarico cronico di eme è associato ad una diminuzione dell’espressione di FLVCR1a nel fegato che suggerisce che l’esporto di eme dall’epatocita mediato da FLVCR1a debba essere bloccato quando i livelli plasmatici di eme sono costantemente alti. Stiamo attualmente conducendo altri esperimenti per meglio indagare questi aspetti.

Con questo progetto ci aspettiamo di trovare una terapia che promuova efficacemente la detossificazione dell’eme in eccesso in modo da prevenire e/o limitare il danno endoteliale che contribuisce in modo significativo alla patologia. Questo potrebbe portare a migliorare le terapie attuali basate sull’utilizzo di chelanti del ferro e generici farmaci anti-ossidanti.

Vinchi et al, Circulation, under revision

ABSTRACT N. 188 Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

132.000 Durata (anni): 2

Anno d’inizio: 2010

PRODUZIONE DI EMOGLOBINA IN CELLULE ERITROIDI DA PAZIENTI CON BETA TALASSEMIA ALTERANDO PROCESSI BIOMOLECOLARI IN GRADO DI REGOLARE L’ESPRESSIONE DEI GENI PER LE GLOBINE Bianchi Nicoletta (1,2), Borgatti Monica (1,2), Zuccato Cristina (1,2), Finotti Alessia (1,2), Breveglieri Giulia (1,2), Salvatori Francesca (1,2), Breda Laura (3), Gardenghi Sara (3), Brognara Eleonora (1,2), Lampronti Ilaria (1,2), Fabbri Enrica (1,2), Fibach Eitan (4), Rivella Stefano (3), Gambari Roberto (1,2)

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche TOLOSANO EMANUELA

Telethon grant N.

GGP12082

Totale €

180.800

Num Centri: 1

GGP10214

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 187 Responsabile

GAMBARI ROBERTO

Telethon grant N.

Durata (anni): 2

(1) Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare, Via Fossato di Mortara 74, Ferrara, Italy, Tel. 0532.974443, Fax 0532.974500; E-mail: gam@unife.it (2) Dipartimento di Scienze della Vita e Biotecnologie, Ferrara, Italy (3) Weill Cornell Medical College, Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology, New York, USA (4) Hadassah Hospital, Jerusalem, Israel

Anno d’inizio: 2012

STRATEGIE TERAPEUTICHE VOLTE AD ALLEVIARE IL DANNO OSSIDATIVO INDOTTO DALL’EME NELL’ANEMIA FALCIFORME

Obiettivi. L’obiettivo 1 è stato il reclutamento e la caratterizzazione genetica di pazienti affetti da beta-talassemia. L’obiettivo 2 è costituito dall’analisi dei meccanismi molecolari alla base dell’attività degli induttori di emoglobina fetale (HbF) e il loro impiego in combinazione con la terapia genica utilizzando vettori lentivirali. L’obiettivo 3 è stato lo studio dell’espressione genica in soggetti HPFH (hereditary persistence of fetal hemoglobin) e in pazienti affetti da beta-talassemia con alti livelli di HbF. L’obiettivo 4 è stato l’analisi del network dei microRNA in cellule isolate da pazienti HPFH e in progenitori eritroidi trattati con induttori di HbF. L’obiettivo 5 è stato l’applicazione di un approccio read-through per la produzione di emoglobina adulta (HbA) in modelli cellulari per la talassemia beta°39.

Risultati. I. Abbiamo partecipato allo sviluppo di un vettore terapeutico (Ank-T9W) per la terapia della beta-talassemia e confermato che un trattamento combinato di ErPCs da omozigoti beta°39 e IVS-110 con l’induttore di HbF mitramicina (MTH) e vettori lentivirali porta all’induzione di HbF/HbA riducendo l’eccesso di alfa-globina, suggerendo una combinazione di terapia genica e induzione di HbF (strategia GT/HbF) per il trattamento della beta-talassemia. II. Abbiamo proseguito nello studio dell’espressione di microRNA 210 nell’induzione di HbF in cellule eritroidi trattate con MTH. Abbiamo confermato in raptor mRNA un bersaglio del microRNA 210. L’induzione di HbF mediata da MTH è associata con l’inibizione dell’espressione genica di raptor e del pathway mTOR-C1. III. Abbiamo sviluppato nuovi cloni cellulari K562 contenenti sequenze BCL11A per studiare l’attivazione di HbF attraverso inibizione di repressori della trascrizione dei geni per la globina gamma. Abbiamo studiato BCL11A durante l’induzione di HbF in precursori eritroidi (ErPC) da pazienti con beta-talassemia trattati con MTH e scoperto che l’aumento della gamma-globina e la produzione di HbF sono eventi preceduti da una diminuzione dei livelli di BCL11A in ErPC da pazienti con beta-talassemia trattati con MTH. Questi risultati suggeriscono che i livelli di BCL-11A sono associati con espressione dei geni per la gamma-globina; pertanto, l’interferenza con BCL-11A fornisce un nuovo approccio per indurre l’espressione dei geni per la gammaglobina. IV. Abbiamo confermato correzione read-through in ErPCs da pazienti omozigoti beta°39, nonostante il basso livello di mRNA beta°39 dovuto a NMD. Abbiamo sviluppato cloni di cellule K562 con UPF-1 silenziato. V. Abbiamo sviluppato un nuovo protocollo

Vinchi Francesca, Ingoglia Giada, Petrillo Sara, Chiabrando Deborah, Fiorito Veronica, Mercurio Sonia, Tolosano Emanuela Molecular Biotechnology Center, Via Nizza 52 10126 Torino, Tel. 011.6706423, Fax 011.6706432,; E-mail: emanuela.tolosano@unito.it

L’anemia falciforme è caratterizata da un’elevata emolisi intravascolare. Il rilascio di eme promuove la generazione di radicali liberi che causano danno endoteliale e tissutale. Nei pazienti la deplezione plasmatica di aptoglobina ed emopexina, le principali proteine coinvolte rispettivamente nella rimozione dell’eccesso di emoglobina ed eme e l’aumentata espressione tissutale dell’enzima Heme Ossigenasi-1 (HO-), deputato a degradare l’eme in eccesso, indicano che i sistemi fisiologici di detossificazione dall’eme sono esausti. Nel nostro laboratorio abbiamo recentemente dimostrato che una terapia basata sulla somministrazione di emopexina è efficace nel prevenire il danno endoteliale e l’infiammazione in un modello murino di anemia falciforme. La protezione è ottenuta attraverso un aumento del catabolismo dell’eme a livello epatico ed un aumento della sua escrezione nella bile.

Questo progetto ha lo scopo di verificare se la promozione dell’escrezione biliare di eme possa rappresentare una nuova strategia terapeutica per prevenire il danno endoteliale e tissutale nell’anemia falciforme. Ci concentreremo sull’analisi del ruolo dell’esportatore di eme FLVCR1a (Feline Leukemia Virus subgroup C Receptor1a) e utilizzeremo modelli murini già presenti nel nostro laboratorio, topi knock-out condizionali che non esprimono FLVCR1a negli epatociti (FLVCR1afl/fl-;alb-cre) e topi con l’anemia falciforme.

Gli obiettivi specifici di questo progetto sono: 1) studiare la localizzazione sub-cellulare di FLVCR1a negli epatociti; 2) valutare il ruolo di FLVCR1a nell’emolisi acuta e cronica; 3) ottenere modelli cellulari e animali con aumentata espressione di FLVCR1a; 4) valutare l’effetto di una terapia combinata che associ all’effetto di emopexina l’effetto di un’aumentata espressione di FLVCR1a.

Risultati: l’analisi dei topi FLVCR1afl/fl-;alb-cre in condizioni basali ha dimostrato che FLVCR1a ha un ruolo cruciale nel prevenire l’eccesso di eme e lo stress ossidativo nel fegato. Le differenze tra topi FLVCR1afl/fl-;alb-cre e topi wild-type diventano ancora più signifi-

113

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

ABSTRACT N. 190

che non necessita di PCR per la diagnosi molecolare di beta-talassemia basata su SPR-Imaging, sonde PNA e nanoparticelle. VI. Abbiamo ulteriormente caratterizzato linee di topi transgenici portatori dei geni umani beta°39, IVS-I-6 e IVS-I-110.

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

ABSTRACT N. 189

BALDUINI CARLO LUIGI

Telethon grant N.

GGP10089

Totale €

373.000

Num Centri: 4

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2011

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

GRESELE PAOLO

Telethon grant N.

GGP10155

Totale € Num Centri: 1

UN NUOVO GENE RESPONSABILE DI PIASTRINOPENIA EREDITARIA: STUDI CLINICI, PATOGENETICI E FARMACOLOGICI

124.300 Durata (anni): 2

Perrotta Silverio (2), Seri Marco (3), Savoia Anna (4), Balduini Carlo (1)

Anno d’inizio: 2010

L’ATTIVAZIONE COSTITUTIVA DEL RECETTORE ALFAIIB-BETA3 CAUSATA DA UNA MUTAZIONE DELL’INTEGRINA BETA3 PORTA A DIFETTI DELLA FUNZIONALITÀ PIASTRINICA E DELLA TROMBOPOIESI

(1) Medicina Interna III, Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo-Università degli Studi di Pavia, Piazzale Golgi, 27100 Pavia, Tel. 0382.502183, Fax 0382.526223, E-mail: c.balduini@smatteo.pv.it (2) Dipartimento di Padiatria, Seconda Università di Napoli, Napoli (3) U.O. Genetica Medica, Dipartimento di Scienze Mediche e Chirurgiche, Università degli Studi di Bologna, Policlinico S. Orsola-Malpighi, Bologna (4) Dipartimento di Scienze mediche, chirurgiche e della salute, Università di Trieste, IRCCS Burlo Garofolo, Trieste

Bury Loredana (1), Cecchetti Luca (1), Giannini Silvia (1), Corazzi Teresa (1), Appolloni Viviana (1), Guglielmini Giuseppe (1), Falcinelli Emanuela (1), Mezzasoma Anna Maria (1), Savoia Anna (2), Malara Alessandro (3), Balduini Alessandra (3), Italiano Joseph E (4), Gresele Paolo (1)

OBIETTIVI GENERALI DELLO STUDIO Identificare l’eziopatogenesi della Trombocitopenia 2 (THC2, OMOM 188000), descriverne gli aspetti clinici ed identificare molecole per il suo trattamento.

OBIETTIVI SPECIFICI 1) Eziopatogenesi: caratterizzazione delle alterazioni cellulari e molecolari.

2) Clinica: caratterizzazione clinico-laboratoristica dei soggetti affetti.

3) Terapia: identificazione di farmaci in grado di migliorare la piastrinopenia.

RISULTATI OTTENUTI SINO AD ORA ALTERAZIONI MOLECOLARI. Lo studio di 35 soggetti di 9 famiglie con THC2 ha permesso di identificare 6 differenti mutazioni in una sequenza altamente conservata di 19 bp situata nella regione nontradotta (UTR) in 5’ di ANKRD26, un gene la cui funzione non è nota. Queste varianti, che nelle famiglie affette segregavano con la piastrinopenia, non erano presenti in 500 controlli e non sono riportate nel database “1000 genomes”. Studi in vitro (luciferase reporter assay) hanno suggerito l’ipotesi che le mutazioni identificate aumentino l’espressione di ANKRD26 (1).

ASPETTI CLINICI. Delle 210 famiglie con piastrinopenia ereditaria presenti nel nostro database, 21 sono risultate affette da mutazioni in 5’UTR di ANKRD26. THC2 è quindi una delle forme meno rare di piastrinopenia ereditaria. La piastrinopenia e la diatesi emorragica erano in genere modeste. Non era di solito presente macrocitosi piastrinica e ciò distingue questa forma dalla maggior parte delle altre. L’aggregazione piastrinica in vitro è risultata normale. L’esame del midollo osseo ed i livelli di trombopoietina serica hanno suggerito che la piastrinopenia derivi da dismegacariopoiesi. Alcuni pazienti presentavano valori inaspettatamente elevati di emoglobina e leucociti. Un riscontro importante è sata l’alta incidenza di leucemia acuta (2).

ALTERAZIONI CELLULARI. La microscopia elettronica ha mostrato che la maggior parte delle piastrine e dei megacariociti THC2 contiene grandi quantitatà di “Particulate Cytoplasmic Structures” (PaCSs), una nuova componente cellulare composta da proteasoma e proteine poliubiquitinate che è stata recentemente identificata in numerosi tumori solidi, nella mucosa gastrica infettata da H. Pylori e nelle lesioni preneoplastiche correlate, oltre che nella Sindrome di Schwachman-Diamond, una malattia genetica a rischio di trasformazione leucemica (3).

CONCLUSIONI PRELIMINARI Le mutazioni in 5’ UTR di ANKRD26 identificate nella THC2 interferiscono con la megacariopoiesi ed inducono formazione di PaCSs, piastrinopenia e predisposizione alla leucemia acuta. Dal momento che la presenza di PaCSs è tipica di diverse condizioni neoplastiche e pre-neoplastiche, lo studio delle conseguenze funzionali delle mutazioni di questo gene può aiutare a comprendere meglio non solo i meccanismi della produzione piastrinica ma anche quelli dell’oncogenesi.

REFERENZE 1- Pippucci et al. Am J Hum Genet 2011;88:115-20.

3- Necchi V et al. Thromb Haemost, in press 2- Noris P et al. Blood 2011;117:6673-80.

(1) Dipartimento di Medicina Interna, Sezione di Medicina Interna e Cardiovascolare, Università di Perugia, Via Enrico dal Pozzo, 06126 Perugia, Italia, Tel. 075.5783989, E-mail: grespa@unipg.it (2) Laboratory of Genetics, IRCCS Burlo Garofolo, Trieste, Italy (3) Biotechnology Laboratories, Department of Biochemistry, University of Pavia, Italy (4) Dep. Of Medicine, Hematology Division, BWH Hospital, Boston MA, USA

Mutazioni a livello del recettore alphaIIb-beta3 sono causa della Trombastenia di Glanzmann (GT), una malattia emorragica autosomica recessiva caratterizzata da sanguinamento, aggregazione piastrinica assente, ma conta e dimensione piastriniche normali. Recentemente abbiamo descritto un caso di macrotrombocitopenia ereditaria autosomica dominante associata a disfunzione piastrinica e diatesi emorragica mucocutanea causata da una mutazione in eterozigosi (2134 +1 G> C) del gene ITGB3, codificante per la subunità beta3 del recettore alfhaIIb-beta3 (Gresele P et al Haematologica 2009): una forma variante di GT. Studi condotti esprimendo la suddetta mutazione in cellule CHO hanno dimostrato che la proteina mutata esercita un effetto dominante negativo e induce l’attivazione costitutiva del recettore alfaIIbbeta3. Esperimenti di citofluorimetria e Western blotting hanno dimostrato come la co-espressione della subunità beta3 mutata e di quella normale diminuisca il numero di recettori alfaIIb-beta3 espressi sulla superficie. Inoltre, cellule CHO esprimenti la proteina mutata legano il fibrinogeno e l’anticorpo PAC-1 senza bisogno di stimolazione e aggregano spontaneamente in presenza di fibrinogeno. Esperimenti di Western blotting hanno dimostrato una fosforilazione costitutiva della coda citoplasmatica dell’integrina beta3 e della Focal adhesion kinase, uno spreading su fibrinogeno precoce e una retrazione del coagulo incompleta: tutti indizi di un difetto nell’outside-in signalling mediato dal recettore alfaIIb-beta3.

Anche le piastrine dei pazienti mostrano un’attivazione costitutiva dell’outside-in signalling che porta ad un’aumentata polimerizzazione dell’actina in piastrine non stimolate e a spreading spontaneo su fattore di Von Willebrand.

Per individuare le cause della macrotrombocitopenia abbiamo effettuato studi di megacariocitopoiesi e formazione di proplatelets isolando le cellule staminali emopoietiche da sangue periferico del nostro paziente e coltivandole fino al loro differenziamento in megacariociti. Inoltre abbiamo espresso il recettore alfaIIb-beta3 mutante in megacariociti murini derivati da fegati fetali. In questi sono stati analizzati lo spreading e la formazione di proplatelets su diverse proteine della matrice extracellulare. La maturazione dei megacariociti si è rivelata normale ma la formazione di proplatelets gravemente compromessa e risultante in un diminuito numero di piastrine di aumentate dimensioni. Lo spreading su fibrinogeno è anomalo, con il 50% dei megacariociti che mostrano una distribuzione disordinata dell’actina e punti di adesione focale più evidenti rispetto alle fibre di actina. Il recettore alfaIIb-beta3 è ridotto ma costitutivamente attivo anche nei megacariociti, come mostrato dalla fosforilazione costitutiva della Focal adhesion kinase. La maturazione delle piastrine dai loro intermedi preplatelets è compromessa e genera piastrine di dimensioni eterogenee.

I nostri dati dimostrano che l’outside-in signalling trasdotto da un recettore alfaIIb-beta3 costitutivamente attivato è causa sia della macrotrombocitopenia che del difetto della funzione piastrinica nei nostri pazienti GT-varianti.

114

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

ABSTRACT N. 191

Modena, Via del Pozzo 71, 41100 Modena, Tel. 059.4222714; E-mail: antonello.pietrangelo@unimore.it

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

LA VOLPE ADRIANA

Telethon grant N.

GGP11076

Totale € Num Centri: 3

Premesse e razionale. L’emocromatosi ereditaria (EE) è una malattia del metabolismo caratterizzata da un progressivo accumulo di ferro negli organi vitali che porta a danno e gravi patologie quali cirrosi epatica, diabete, malattie cardiache, impotenza e infertilità, e artrite (Pietrangelo, N Engl J Med 350: 2383-2397, 2004). L’attuale terapia è basata sul salasso che però presenta alcune limitazioni e controindicazioni. E’ quindi auspicabile lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per rimuovere o prevenire l’accumulo di ferro come approccio sostitutivo o aggiuntivo alla salassoterapia. Obiettivi. Sviluppare nuove terapie per l’EE basate sulla stimolazione e normalizzazione della produzione epatica di epcidina, l’ormone difettivo nell’EE. Scopi specifici dei primi due hanno sono stati: 1) definire i meccanismi molecolari che sottendono alla regolazione dell’epcidina da parte delle proteine morfogenetiche dell’osso (BMP); b) studiare biologia e ruolo delle diverse BMP nell’EE. Risultati e Discussione Per stabilire se il ferro sierico o quello epatico (o entrambi) regolano l’espressione della BMP6, la BMP centrale nel controllo dell’epcidina, abbiamo somministrato a topi una dieta ricca in ferro per 1-5 giorni così da ottenere animali con diversi livelli di saturazione della transferrina (TS) di ferro epatico (LIC). Abbiamo dimostrato che sia la TS che il LIC influenzano indipendentemente l’espressione di epcidina. Però, mentre la TS attiva la via del segnale Smad1/5/8 e non induce l’espressione di BMP6, il LIC correla in modo indipendente con l’attivazione di Smad1/5/8 e l’espressione di BMP6. Per studiare la biologia e il ruolo delle BMP, in particolare della BMP6, nell’EE, abbiamo preliminarmente utilizzato epatociti primari di topi esposti a dosi fisiologiche di diverse BMPs. Abbiamo scoperto che tutte le BMP anche a basse dosi stimolano l’epcidina e attivano la via SMAD in epatociti di controllo, ma, in epatociti di topi knock-out per HFE, la sola BMP6 non è in grado di stimolare l’epcidina, suggerendo uno specifico ruolo di HFE nella via del segnale di BMP6. In seguito, per verificare se la BMP6 è indotta anche nel fegato umano dal ferro e se anche nell’EE umana la via del segnale BMP è compromessa, abbiamo analizzato biopsie epatiche di pazienti con EE o emocromatosi non ereditaria. Abbiamo scoperto che anche nel fegato umano, e nell’EE, la BMP6 risponde ai livelli di ferro. Ciononostante, la correlazione tra i livelli di ferro ed attivazione della via BMP/SMAD è persa nell’EE in confronto alle forme non-ereditarie. I risultati di questi studi dimostrano che nell’EE l’evento patogenetico centrale è l’alterazione della via del segnale BMP/SMAD e che verosimilmente la BMP6 è al centro di questo malfunzionamento. Nel corso del terzo anno del progetto, useremo BMP o analoghi per stimolare la via BMP/SMAD e ritardare o prevenire l’accumulo di ferro nell’emocromatosi murina.

457.800 Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2012

NUOVI BERSAGLI FARMACOLOGICI NELL’ANEMIA DI FANCONI Adamo Adele (1), Germoglio Marcello (1), Valenti Anna (2), Vettone Antonella (2), Perugino Giuseppe (2), Ciaramella Maria (2), Bottega Roberta (3), Comar Manola (3), De Rocco Daniela (3), Savoia Anna (3), La Volpe Adriana (1) (1) CNR Institute of Genetics and Biophysics “A. Buzzati-Traverso”, Via Pietro Castellino, 80131 Naples, Italy, Tel. 081.6132366, Fax 081.6132706, E-mail: adriana.lavolpe@igb.cnr.it (2) CNR Institute of Protein Biochemistry, Naples, Italy (3) IRCCS Burlo Garofolo, University of Trieste, Trieste, Italy

L’ Anemia di Fanconi (FA) è una malattia genetica recessiva causata da almeno 15 differenti geni coinvolti nei sitemi di riparazione del DNA. FA è caratterizzata da progressiva anemia aplastica, multipli difetti di sviluppo congeniti e un alto rischio di tumori ematologici e solidi. La via metabolica FA si interconnette con il controllo del ciclo cellulare e l’apoptosi. I geni dell’FA sono conservati evolutivamente e ciò permette studi meccanicistici in sitemi modello come il nematode C. elegans. Abbiamo dimostrato che l’inattivazione della Giunzione Non Omologa del DNA (NHEJ) sopprime l’instabilità genomica dovuta a mutazioni nel gene FANCD2 in C. elegans (fcd-2) e in cellule umane (Adamo et al., 2010).

La proteina FAND2, insieme a FANCI, è in posizione critica nel “pathway” FA: l’attivazione della riparazione del danno si attiva con il caricamento del complesso ubiquitinato FANCD2/I sulla cromatina a livello del danno, l’esatta funzione di queste proteine nella riparazione non è nota.

I modelli 3D delle proteine FANCD2 e FANCI in C. elegans da noi ottenuti usando la struttura 3D di topo mostrano una evidente conservazione. Per identificare le attività biochimiche ed eventuali partner proteici del complesso FANCD2/I lo abbiamo clonato, lo stiamo purificando in ospiti eterologhi e stiamo facendo un’analisi mutazionale.

La risposta al checkpoint del danno è attivamente silenziata nelle prime fasi dello sviluppo di C. elegans. La prima cellula embrionale si divide nelle cellule P1 ed AB. La divisione successive è asincrona.

Dati preliminari dimostrano che il tempo di divisione di P1 è ritardata dopo trattamento con cisplatino nel mutante fcd-2, ma non in altri mutanti della riparazione. Questo ritardo è soppresso dall’ eliminazione della ligasi- 4 suggerendo che la NHEJ è inappropriatamente attivata negli embrioni del mutante fcd-2 ed è causa del ritardo di divisione e dei difetti di sviluppo. Questo spiega anche la presenza di difetti congeniti in pazienti FA. Stiamo analizzando un nuovo mutante che sopprime i fenotipi di fcd-2 in C. elegans.

Il polyomavirus SV40, un virus a DNA che si è diffuso nella popolazione umana attraverso vaccini anti-polio contaminati, trasforma ad alta efficienza i fibroblasti FA suggerendo una iper-suscettibilità al virus dei pazienti. Abbiamo identificato il T-Ag di SV40 nel 25% dei pazienti FA. I pazienti positivi per SV40 sono soprattutto maschi, italiani e nati prima del 1990. A causa dei difetti di riparazione del DNA in FA, è probabile che il virus persista più a lungo in tali individui. Ulteriori studi in una popolazione di pazienti più ampia ci servirà a capire le possibili implicazioni nella progressione della malattia.

ABSTRACT N. 193 Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

GGP10233 306.300

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2012

Camaschella Clara (1), Nai Antonella (2), Pagani Alessia (2), Rausa Marco (2), Silvestri Laura (2) Università Vita-Salute San Raffaele and San Raffaele Scientific Institute, Via Olgettina, 60 20132 Milano, Italy, Tel. +39.0.26437782, Fax +39.02.26432640, E-mail: camaschella.clara@hsr.it

Tutti i tipi di emocromatosi sono caratterizzati da una produzione insufficiente dell’ormone regolatore del ferro, hepcidin. Le forme giovanili sono causate da mutazioni nei geni che codificano per hepcidin e per il corecettore delle BMP, hemojuvelin. La causa della insufficiente produzione di hepcidin nelle forme di emocromatosi causate da mutazioni di HFE e TfR2 rimane invece ancora inspiegata così come non è ancora stato chiarito il meccanismo che porta alla riduzione di hepcidin nella espansione eritropoietica. Lo studio dell’IRIDA, anemia recessiva ferro-carente con alti livelli di hepcidin, e del suo modello animale KO per il gene Tmprss6, ci ha permesso di proporre che la malattia sia dovuta ad in attivazione di TfR2 o Hfe mimi una condizione di aumentata richiesta eritropoietica, dovuta ad una aumentata attività della serin-proteasi TMPRSS6. Lo scopo del progetto è quello di dimostrare che TfR2 antagonizza quest’effetto sia in vitro che in modelli animali. Allo scopo di definire la posizione relativa di TfR2 e Tmprss6 stiamo incrociando per collaborazione topi in cui i geni codificanti le due proteine sono stati inattiva-

PIETRANGELO ANTONELLO

Totale €

349.800

EMOCROMATOSI: DAI GENI ALLA CLINICA E RITORNO

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Telethon grant N.

GGP12025

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 192 Responsabile

CAMASCHELLA CLARA

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2010

NUOVE STRATEGIE PER CURARE L’EMOCROMATOSI EREDITARIA ATTRAVERSO LA STIMOLAZIONE DELLA PRODUZIONE EPATICA DI EPCIDINA, L’ORMONE DEL FERRO Vecchi Chiara, Sabelli Manuela, Montosi Giuliana, Garuti Cinzia, Corradini Elena, Pietrangelo Antonello Centro di Ricerca Epatologica Avanzata “Mario Coppo” (CREA), Dipartimento Scienze Mediche e Chirurgiche, Azienda Ospedaliero-Universitaria Policlinico di

115

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

ti. I risultati preliminari indicano che i doppi knock out migliorano il fenotipo dell’emocromatosi Tfr2 e modificano la risposta eritropoietica. Allo scopo di studiare il ruolo di TfR2 nella funzione eritroide stiamo inattivando in collaborazione tale gene selettivamente nel midollo osseo murino per valutare la funzione di un potenziale modulatore eritroide, rappresentato dalla forma solubile di TfR2. Per indagare la funzione di HFE, a monte rispetto a TMPRSS6, valuteremo la capacità di HFE di controllare dal punto di vista trascrizionale o funzionale transferrina e TMPRSS6. In studi preliminari stiamo testano l’effetto di inibitori potenziali di TMPRSS6 in vitro ed il meccanismo di cleavage del substrato hemojuvelin da parte di TMPRSS6 attraverso la mutagenesi di potenziali siti di taglio in hemojuvelin.

Questo progetto nasce dai risultati del precedente progetto Telethon GGP08089 in cui abbiamo dimostrato che la perdita di Tmprss6 aumenta hepcidin in condizioni di espansione eritropoietica nel topo, ha lo scopo di identificare il pathway funzionale che porta ad inibizione di hepcidin da parte del ”regolatore eritroide” e la sua relazione con le emocromatosi dovute a mutazioni di TfR2 e HFE. Gli studi preclinici volti a ridurre l’attività di Tmprss6 hanno potenziale applicabilità non solo nel tratamento dell’ emocromatosi ma anche per tutte quelle condizioni caratterizzate da un’attività inappropriata del regolatore eritroide, come le beta talassemie.

e 374 non sono riportate come dbSNP. Abbiamo testato 17 geni con varianti comuni nei 2 pz., verificando che tutte le 34 varianti fossero state ereditate da un genitore. Attualmente si stanno verificando 2 ipotesi: i) ereditarietà recessiva di una variante omozigote per geni diversi nei 2 pz, ii) presenza di mutazioni severe coinvolgenti la stessa pathway verificando il grado di severità delle oltre 360 mutazioni e il loro posizionamento in diverse pathway cellulari.

ABSTRACT N. 195 Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

190.000 Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2011

IL SISTEMA RECETTORE P2X7/ADENOSINA: UN NUOVO BERSAGLIO PER LA TERAPIA DELLE MALATTIE AUTOINFIAMMATORIE Sarti Alba Chiara, Falzoni Simonetta, Donvito Giovanna, Di Virgilio Francesco Department of Morphology, Surgery and Experimental Medicine, University of Ferrara, via Borsari 46, 44121, Ferrara, Tel. 0532.455353, Fax .55351, E-mail: fdv@unife.it

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche GATTORNO MARCO

Telethon grant N.

GGP09127

Totale €

302.600

Num Centri: 4

GGP11014

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 194 Responsabile

DI VIRGILIO FRANCESCO

Telethon grant N.

Durata (anni): 2

Le malattie autoinfiammatorie sono un gruppo di patologie caratterizzate da febbre ricorrente con manifestazioni infiammatorie localizzate alla pelle, alla pleura, al peritoneo, alle articolazioni ed anche agli occhi, al fegato, alla milza ed al sistema nervoso. Tipicamente si manifestano in assenza di auto-anticorpi o linfociti T autoreattivi.

Alcune di queste malattie seguono un pattern di ereditarietà mendeliana, altre hanno una genetica molto più complessa, indicativa della partecipazione di più loci. Alcune di queste patologie sono denominate “inflammasomopatie” intrinseche perché dovute a mutazioni della proteina NLRP3, il principale componente di uno dei sottotipi di inflammasoma più comuni. A volte, l’ interessamento del fegato e dei reni può essere così grave da portare a morte. Il fattore patogenetico più rilevante in questemalattie è l’ eccessiva secrezione di mediatori dell’ infiammazione denominati citochine, soprattutto interleuchina-1beta (IL-1beta). In generale, con l’ eccezione della febbre mediterranea famigliare (FMF), che è relativamente comune nelle popolazioni medio-orientali e nell’ Italia meridionale, queste malattie sono rare. Le malattie auto infiammatorie sono oggetto di crescente interesse da parte dei medici e dei ricercatori biomedici perché non sono al momento disponibili terapie efficacii.

La nostra Unità di Ricerca ha recentemente identificato uno dei più potenti recettori (denominato P2X7) responsabile della maturazione e della secrezione di IL-1beta, ed ha chiarito il meccanismo intracellulare attraverso cui questo recettore attiva il rilascio di questa citochina. Inoltre, abbiamo scoperto che nel corso dell’ infiammazione l’ ATP, un importante mediatore energetico intracellulare, viene secreto nel sangue e nei liqudi biologici. L’ ATP nell’ ambiente extracellulare agisce come un potente mediatore pro-infiammatorio, ma anche come un precursore per la produzione di un potente agente anti-infiammatorio denominato adenosina. Ci sono osservazioni che indicano che la difettosa degradazione dell’ ATP in adenosina può impedire l’ attivazione di un importantissimo sistema anti-infiammatorio fisiologico, così causando episodi infiammatori incontrollati.

L’ incapacità di produrre sufficienti quantità di adenosina potrebbe essere alla base degli episodi incontrollati di infiammazione tipici delle malattie autoinfiamatorie. Nel corso di questo Progetto ci proponiamo di 1) identificare i fattori che regolano l’ omeostasi dell’ ATP extracellulare in vari modelli animali di infiammazione; 2) analizzare l’ omeostasi dell’ ATP extracellulare e la sua conversione in adenosina da parte di cellule immunitarie isolate da pazienti affetti da malattie auto infiammatorie; 3) sperimentare nuovi farmaci antiinfiammatori attivi sul recettore P2X7.

Anno d’inizio: 2009

EFFETTO DELLE MUTAZIONI DEL GENE CIAS-1 SUI MECCANISMI PATOGENETICI DELLE SINDROMI PERIODICHE AUTOINFIAMMATORIE DA DIFETTO DI CRIOPIRINA (CAPS). RICERCA DI NUOVI GENI E DI NUOVI APPROCCI TERAPEUTICI Gattorno Marco, Ceccherini Isabella, Giannoni Paolo, Rubartelli Anna (1) UO Pediatria 2, Istituto G. Gaslini, Largo G. Gaslini 5, 16147, Genova Tel. 010-5636793, E-mail: marcogattorno@ospedale-gaslini.ge.it (2) Laboratorio di Genetica Molecolare, Istituto G Gaslini (3) Centro di Biotecnologie Avanzate, Genova (4) Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro, Genova

1. Abbiamo già dimostrato che uno stato di redox distress accompagna l’espressione di proteine mutate dell’inflammasoma. Per verificare l’influenza dello stress ossidativo sulla secrezione di IL-1ß nei pz CAPS, abbiamo studiato lo stato redox a riposo dei monociti di pazienti CAPS, la risposta redox all’LPS, e il rapporto tra redox signaling e processing e secrezione di IL-1ß. Come controlli, abbiamo utilizzato pz con artrite giovanile idiopatica (JIA) non monogenica.

La secrezione di IL-1ß indotta da LPS è fortemente anticipata (con plateau a 3-6 h dello stimolo) nei pz con mutazioni in CIAS1 rispetto ai controlli sani e ai pazienti affetti da JIA. La rapida secrezione di IL-1ß correla con condizioni di redox alterato a riposo e con una risposta redox aberrante alla stimolazione con LPS. Il “redox distress” induce varie risposte allo stress nei monociti CAPS stimolati con LPS, compresa l’inibizione della sintesi proteica, con conseguente deficit nella produzione di citochine a valle di IL-1, come IL-6 e IL-1receptor antagonist (IL-1Ra). La scarsa produzione di tali citochine accoppiata all’aumentata e accelerata secrezione di IL-1ß spiega la severità delle manifestazioni cliniche e il maggior coinvolgimento dell’immunità innata nei CAPS. 2. Generazione di topo CIAS1-knock-in condizionale (in collaborazione con la facility Telethon) con la mutazione murina N475K (corrispondente alla mutazione umana N477K). Dopo la conferma della trasmissione germ-line della mutazione, il topo chimera CAPS è stato fornito dalla facility Telethon. E’ stato selezionato il topo chimera con il più alto contenuto di cellule mutate e incrociato con un topo wild type (C57BL/6) per generare eterozigoti N475K. L’analisi della trasmissione della linea germinale è stata effettuata con PCR. I topi eterozigoti sono stati incrociati per creare topi knock-in omozigoti.

Al momento stiamo incrociando questi topi mutati con topi esprimenti Cre ricombinasi in varie linee, sotto il controllo di differenti promotori. L’analisi del fenotipo è in corso.

3. Abbiamo effettuato la ricerca di geni candidati (NLRP12, CASP1, IL1RN, and IRAK1BP1) in 7 pz CAPS-like. In un pz con CAPS è stata identificata una mutazione del gene NLRP12. Non sono state trovate mutazioni in altri geni. In 2 pz è stato pertanto avviato un approccio exome sequencing presso i lab. Genomnia, previa esclusione di mosaicismo somatico. Nei 2 pz sono stati identificate rispettivamente 14742 e 13428 sostituzioni aminoacidiche. Di queste 386

ABSTRACT N. 196 T Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

FLEISCHHAUER KATHARINA

Telethon grant N.

GGP08201

Totale €

291.700

Num Centri: 3

Durata (anni): 2

Anno d’inizio: 2008

STRATEGIE INNOVATIVE PER LA CURA DELLE MALATTIE GENETICHE MEDIANTE IL TRAPIANTO DI MIDOLLO OSSEO

116

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

Andreani Marco (2), Carcassi Carlo (3), Fleischhauer Katharina (1)

maci efficaci sono ora disponibili. Nonostante ciò la patogenesi del HAE è solo parzialmente definita e i meccanismi che scatenano gli attacchi ancora quasi completamente sconosciuti. In questo contesto abbiamo deciso di seguire sia un approccio focalizzato sul gene specifico del C1-INH sia un approccio di tipo high-throughput.

I bassi livelli di C1-INH plasmatico fanno ipotizzare un effetto dominante-negativo dell’allele mutato su quello selvatico. Tuttavia, il dosaggio dei due alleli in pazienti affetti da HAE con differenti mutazioni ci ha permesso di escludere tale fenomeno. Abbiamo inoltre identificato un putativo elemento di stabilità del trascritto, che stiamo indagando attraverso studi in linee cellulari selezionate.

Il fine dell’analisi di microarray è stato quello di identificare i geni coinvolti negli attacchi di angioedema, che potrebbero potenzialmente ridurre la soglia per lo scatenarsi dell’attacco.

Sono stati raccolti campioni di sangue da 8 pazienti affetti da HAE in fase di attacco e in fase di remissione, e da 8 donatori sani. L’RNA estratto è stato ibridato con bead-chip Illumina. L’analisi genomica ha evidenziato che diversi geni sono modulati e possono avere un ruolo durante l’attacco. Tra i geni 10 geni significativamente upregolati in fase di attacco abbiamo validato in RT-PCR e ELISA i geni coinvolti nella regolazione del tono vascolare.

La Gene Set Enrichment Analysis ha inoltre evidenziato diversi processi che sono differentemente regolati quando si paragona la fase di attacco sia con quella di remissione nei pazienti HAE sia con i soggetti sani, tra cui processi “in risposta a stimoli esterni” e quelli “di adesione cellulare”.

In conclusione, gli esperimenti di microarray hanno messo il luce diversi geni e processi coinvolti nel HAE: tale risultato aiuterà a far luce sui meccanismi scatenanti gli episodi di angioedema e a promuovere l’identificazione di nuovi potenziali bersagli terapeutici.

(1) Istituto Scientifico San Raffaele, via Olgettina 58, 20132 Milano, Tel. 02.2643.4341/6198, E-mail: fleischhauer.katharina@hsr.it (2) Istituto Mediterraneo di Ematologia (IME), Roma (3) Istituto Policlinico Universitario “Mario Aresu”, Cagliari

Significato: Il trapianto di midollo osseo (TMO) da donatore sano, familiare oppure non-consanguineo, rappresenta l’unica cura definitiva per numerose malattie genetiche associate ad un alto rischio di mortalità. Il successo di questa cura è tuttavia limitato dall’insorgenza di una risposta immune alle cellule trapiantate, controllata da un ampio numero di geni che presentano delle sequenze variabili da un individuo all’altro, i cosiddetti geni polimorfici. In questo progetto, tre centri di eccellenza italiani rispettivamente di Milano, Roma e Cagliari, hanno intrapreso uno sforzo collaborativo per caratterizzare un panello di geni polimorfici legati alla risposta immune al TMO in pazienti affetti da beta-talassemia, una malattia genetica dei globuli rossi frequente nei paesi Mediterranei, e per studiare il ruolo di determinati cellule del sistema immunitario nella risposta al TMO. Risultati: Abbiamo dimostrato un’associazione significativa di eventi clinici avversi dopo TMO da donatore familiare o non-consanguineo, con tre sistemi di geni polimorfici diversi, rispettivamente della famiglia HLA-G, KIR e CTLA-4. Inoltre, mediante gli studi funzionali, abbiamo osservato per la prima volta un gerarchia nella risposta immune contro diversi bersagli, nonché una correlazione della tolleranza immunologica con definiti tipi cellulari. Questi risultati hanno delle implicazioni importanti per la selezione del donatore di TMO, nuovi protocolli clinici di immuno-soppressione post-trapianto nonché di terapia cellulare. Essi sono stati oggetto di 12 pubblicazioni scientifiche nelle riviste più rinomate del settore, a livello internazionale.

Prospettive: I risultati ottenuti in questo progetto hanno delle implicazioni importanti per la predizione del rischio immunologico non solo nel contesto del TMO ma anche in quello della terapia genica, trasferibile anche ad altre importanti aree sanitarie quali i trapianti d’organo, le malattie autoimmuni e il cancro.

ABSTRACT N. 198 Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

ABSTRACT N. 197

BALDARI COSIMA

Telethon grant N.

GGP11021

Totale €

264.000

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2011

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

CICARDI MARCO

Telethon grant N.

GGP08223

Totale € Num Centri: 3

IL SISTEMA DI TRASPORTO INTRAFLAGELLARE NEI LINFOCITI T: DISSEZIONE FUNZIONALE NEL TRASPORTO DEL RECETTORE DELL’ANTIGENE E VALUTAZIONE QUALE BERSAGLIO DELLA MALATTIA NELL’IMMUNODEFICIENZA COMUNE VARIABILE

411.500 Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2008

REGOLAZIONE DEI GENI COINVOLTI NELLA PATOGENESI DELL’ANGIOEDEMA EREDITARIO DA CARENZA DI C1 INIBITORE

Finetti Francesca (1), Patrussi Laura (1), Masi Giulia (1), Lucherini Orso Maria (1), Onnis Anna (1), Pazour Gregory J (2), Baldari Cosima T (1)

Caccia Sonia (2), Castellano Giuseppe (3), Zanichelli Andrea (1), Divella Chiara (3), Sallustio Fabio (7), Loreto Gesualdo (3), Bonanni Erika (1), Suffritti Chiara (1), Russo Rosaria (4), Bossi Fleur (5), Berardelli Romina (2,6), Fra Anna Maria (6), Rimoldi Valeria (2), Asselta Rosanna (2), Duga Stefano (2), Cicardi Marco (1)

(1) Dipartimento di Scienze della Vita, Università degli Studi di Siena, Via Aldo Moro 2, 53100 Siena, Tel 0577.234400; Fax 0577.234476; E-mail: baldari@unisi.it (2) Program in Molecular Medicine, University of Massachussetts Medical School, Worcester, MA 01605, USA

(1) Dip. di Scienze Cliniche “Luigi Sacco”, Università degli Studi di Milano, Ospedale Luigi Sacco, Via G.B. Grassi 74, 20157, Milano, Tel. +39.02.50319829, Fax +39.02.50319828, E-mail: Marco.Cicardi@unimi.it (2) Dip. di Biotecnologie Mediche e Medicina Traslazionale, Università degli Studi di Milano, Milano (3) Dip. di Emergenza e Trapianto di Organi, Università degli Studi di Bari, Bari (4) Dip. di Fisiopatologia Medico-Chirurgica e dei Trapianti, Università degli Studi di Milano, Milano (5) Dip. di Scienze della Vita, Università di Trieste, Trieste (6) Dip. di Medicina Molecolare e Traslazionale, Università degli Studi di Brescia, Brescia (7) Consorzio C. A. R. S. O., Valenzano, Bari

L’immunodeficienza comune variabile (CVID) rappresenta circa il 50% delle immunodeficienze ereditarie. L’eziologia genetica è stata stabilita solo per il 15-20% dei casi, con l’identificazione di mutazioni in tre geni codificanti regolatori diretti (TACI, BAFF-R, CD19) o indiretti (ICOS) della maturazione delle cellule B. L’identificazione dell’attivazione linfocitaria quale bersaglio centrale della malattia ha aperto la strada alla ricerca del difetto genetico nell’ampia casistica di CVID ad eziologia sconosciuta. Difetti di segnalazione del recettore dell’antigene delle cellule T (TCR) riscontrati in pazienti CVID hanno evidenziato il macchinario di segnalazione del TCR e la sua organizzazione alla sinapsi immunologica (IS) tra cellula T e APC come candidati interessanti per la ricerca del difetto genetico nei casi di CVID ad eziologia sconosciuta.

Abbiamo recentemente dimostrato che il sistema di trasporto intraflagellare (IFT), che era stato studiato solo in relazione al suo ruolo nella ciliogenesi, agisce come promotore dell’assemblaggio della IS in linfociti T regolando il riciclo polarizzato del TCR e gli eventi di traffico di membrana necessari per l’attivazione linfocitaria. In questo studio abbiamo analizzato l’interazione tra IFT20 e le proteine Rab che regolano il riciclo recettoriale. Abbiamo dimostrato che IFT20 colocalizza e cofraziona con Rab5, che è associata con gli endosomi precoci, così come con Rab4 e Rab11, che regolano, rispettivamente, la via di riciclo veloce e lenta. La riduzione dell’espressione di IFT20 è associata alla mancata polarizzazione di Rab4 e Rab11 alla IS, indicando che IFT20 è coinvolta in entrambe le vie di riciclo recettoriale. In accordo con questi risultati l’analisi dell’effetto del knockdown di IFT20 sul TCR, nonché sul recettore di transferri-

L’angioedema ereditario (HAE) è una malattia Mendeliana rara (prevalenza 1:50.000) causa di edemi ricorrenti localizzati alla cute, alla mucosa del tratto gastrointestinale e alla laringe, con notevole impatto negativo sulla qualità della vita dei pazienti e che, nei casi più gravi, possono causare morte per asfissia. Il mediatore degli attacchi di angioedema è la bradichinina, rilasciata quando fattori scatenanti, quali stress fisici e psicologici, attivano il sistema di contatto.

Alla base della malattia vi è la carenza di C1-inibitore (C1-INH), dovuta a mutazioni in uno dei due alleli che codificano per questa proteina. I livelli funzionali di C1-INH nel plasma dei pazienti con HAE sono sempre inferiori alla metà del valore normale, ovvero al livello di espressione che dovrebbe essere garantito dall’allele non mutato, prevenendo in teoria lo svilupparsi degli attacchi di angioedema.

Sono stati fatti progressi nel trattamento degli attacchi e diversi far-

117

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

na (TfR) ed il recettore chemochinico CXCR4, tutti recettori soggetti a riciclo, mostrano che IFT20 è necessaria per il riciclo polarizzato alla IS sia del TCR che del TfR, ma non del CXCR4, indicando che IFT20 è implicata nel sorting di questi recettori durante il loro traffico intracellulare attraverso il compartimento di riciclo. Inoltre, abbiamo dimostrato che tutti i componenti del sistema IFT sono espressi in cellule T, e che altri due polipeptidi IFT, IFT54 e IFT57, intervengono come elementi fondamentali nella via di riciclo regolata da IFT20 in queste cellule.

Complessivamente, i risultati forniscono nuove conoscenze sui meccanismi che controllano il riciclo polarizzato del TCR alla IS e chiariscono l’interazione tra il sistema IFT ed il macchinario esocitico nell’assemblaggio della IS. I risultati, che forniscono nuovi candidati per la classificazione genetica della CVID ad eziologia sconosciuta, saranno trasferiti al contesto patologico dei difetti di attivazione delle cellule T in questi pazienti.

SAP REGOLA LA DIACILGLICEROLO CHINASI ALFA: IMPLICAZIONI PER LA RISPOSTA IMMUNITARIA IN PAZIENTI CON MALATTIA LINFOPROLIFERATIVA LEGATA AL CROMOSOMA X (XLP) E POSSIBILI APPROCCI FARMACOLOGICI PER LA TERAPIA DELL’XLP Baldanzi Gianluca (1), Ruffo Elisa (1), Pighini Andrea (1), Patrussi Laura (2), Baldari Tatiana (2), Nichols Kim (3), Snow Andrew (4), Graziani Andrea (1) Dept. of Translational Medicine, University of Piemonte Orientale, Via Solaroli 17, 28100, Novara, Tel. 0321-660619, E-mail: graziani@med.unipmn.it (2) Dept. of Evolutionary Biology, University of Siena, Italy (3) Division of Oncology, Children’s Hospital of Philadelphia, Philadelphia, PA, USA (4) Dept of Pharmacology, Uniformed Services University of the Health Sciences, Bethesda, MD, USA

ABSTRACT N. 199

La sindrome linfoproliferativa legata al cromosoma X (XLP) è una rara immunodeficienza congenita, causata dalla perdita di espressione di SLAM-associated protein (SAP), una proteina adattatrice SH2, essenziale per il segnale mediato da SLAM e contribuisce alla segnalazione indotta dal TCR/CD28 ed all’attivazione delle cellule T. L’assenza di SAP porta ad un estremo, solitamente fatale incremento del numero di linfociti in seguito all’infezione con EBV. Recenti evidenze hanno mostrato che la mancanza di SAP causa una resistenza all’apoptosi mediata dal TCR restimulation-induced cell death (RICD), un processo che normalmente limita l’espansione delle cellule T durante una risposta immunitaria. Tuttavia i meccanismi mediante i quali SAP trasduce TCR restimulation cell death non sono noti.

Abbiamo recentemente mostrato che in seguito alla stimolazione del TCR, SAP media la regolazione negativa dell’attività enzimatica della diacilglicerolo chinasi alfa (DGK-alfa) (Baldanzi et al. J. Immunol. 2011). DGK-alfa è un enzima che fosforila il diacilglicerolo in acido fosfatidico, agisce come regolatore negativo della segnalazione del TCR ed induce anergia delle cellule T. In seguito alla co-stimolazione del TCR con CD28 o SLAM, DGK-alfa, ma non DGK-zeta, fuoriesce dal nucleo e subisce una rapida regolazione negativa della sua attività enzimatica dipendente da SAP. Inoltre, la sovra-espressione di SAP è sufficiente ad inibire DGK-alfa, mentre i mutanti di SAP non sono in grado di legare i residui fosfotirosinici ed i domini SH3 sono inefficienti. In cellule Jurkat prive di SAP l’inibizione di DGKa parzialmente recupera il segnale difettivo TCR/CD28, inclusa l’attivazione di Ras e ERK1/2, il reclutamento in membrana di PKCteta, l’induzione dell’attività trascrizionale di NF-AT e la produzione di IL-2.

Infine, abbiamo studiato se RICD possa essere indotta attraverso una regolazione negativa di DGK-alfa in maniera SAP dipendente.

Sorprendentemente sia il silenziamento di DGK-alfa che la sua l’inibizione farmacologica efficientemente ripristina RICD in cellule Jurkat prive di SAP, così come nelle cellule T sia di pazienti XLP che di topi SAP KO. I nostri dati indicano che l’inibizione mediata da SAP di DGK-alfa sostiene il segnale del diacilglicerolo, rafforzando in tal modo l’attivazione delle cellule T e RICD. Tali dati, inoltre, suggeriscono che l’inibizione di DGK-alfa possa essere una nuova strategia farmacologica nel trattamento di XLP.

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

FERRARI SIMONA

Telethon grant N.

GGP12052

Totale €

50.000

Num Centri: 1

Durata (anni): 1

Anno d’inizio: 2011

IDENTIFICAZIONE DEL GENE RESPONSABILE DI UNA FORMA AUTOSOMICA DOMINANTE DI IMMUNODEFICIENZA COMUNE VARIABILE (CVID) Di Pierro Valentina (1), Lyons Paul (2,3), Zuntini Roberta (1), Schaffer Alejandro (4), Quinti Isabella (5), Grimbacher Bodo (6), Smith Ken (2), Ferrari Simona (1) (1) Laboratory of Medical Genetics, S.Orsola-Malpighi-University Hospital, via Massarenti 9, 40138, Bologna, Italy, Tel. +39.051.2082410, Fax +39.051.2082416, E-mail: simo.ferrari@unibo.it (2) Cambridge Insitute of Medical Research, University of Cambridge, UK (3) Wellcome Trust Sanger Institute, Hinxton, UK (4) National Center for Biotechnology Information, NIH, Bethesda, USA (5) Dept of Immunology, University “La Sapienza”, Roma, Italy (6) Centre of Chronic Immunodeficiency, University Medical Centre Freiburg, Germany

L’immunodeficienza comune variabile (CVID) è la più frequente immunodeficienza anticorpale sintomatica dell’adulto. Questa definizione comprende un gruppo eterogeneo di patologie caratterizzate da ridotti livelli sierici di immunoglobuline, scarsa risposta ai vaccini e aumentata suscettibilità alle infezioni.

La maggioranza dei pazienti CVID sono sporadici e soltanto 20% dei casi sono famigliari. Sono state riportate mutazioni nei geni codificanti per ICOS, BAFF-R, CD19, CD20, CD81 e CD21 nelle forme autosomiche recessive e mutazioni nel gene che codifica per TACI in circa 15% dei pazienti CVID con ereditarietà autosomica sia dominante che recessiva.

Oggetto di questo studio è un’ampia famiglia in cui CVID è trasmessa con ereditarietà autosomica dominante. La diagnosi di CVID è stata posta in accordo con i criteri diagnostici dell’ESID/PAGID, basati su: riduzione dei livelli di IgG e IgA al di sotto di 2 SD rispetto ai livelli medi per l’età; età di esordio > 2 anni; scarsa risposta alle vaccinazioni; esclusione di altre cause di ipogammaglobulinemia.

Il DNA di nove individui affetti e otto non affetti è disponibile per questo studio.

Allo scopo di identificare la mutazione responsabile di CVID in questa famiglia, è stata eseguita l’analisi del linkage sull’intero genoma. Il locus CVID è stato mappato sul braccio lungo del cromosoma 3 nella regione q27.2-q29. Questa regione di 9.2 Mb è compresa fra il marcatore D3S3570 e D3S1265; il massimo LOD score di 3.90 a ?=0.00 si trova in corrispondenza del marcatore D3S2747.

In collaborazione con il Wellcome Trust Sanger Institute, abbiamo sequenziato l’esoma di quattro individui affetti, allo scopo di identificare la varianti rare comuni all’interno della regione di linkage e stiamo analizzando i risultati ottenuti dal sequenziamento.

ABSTRACT N. 201 Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

GGP10034 193.600

Num Centri: 1

Durata (anni): 2

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2011

Kallikourdis Marinos (1,3), Trovato Anna Elisa (1), Anselmi Fabio (1), Sarukhan Adelaida (1), Tassone Laura (2), Badolato Raffaele (2), Viola Antonella (1,3) (1) Laboratorio Immunità Adattativa, Fondazione Humanitas per la Ricerca, Via Manzoni 56, Rozzano (MI), Italy, Tel. 02.82245118. Fax 02.82245101, E-mail: antonella.viola@humanitasresearch.it (2) Clinica Pediatrica, University of Brescia, c/o Spedali Civili, Brescia, Italy (3) Dipartimento BioMeTra, Università degli Studi di Milano

GRAZIANI ANDREA

Totale €

284.800

LA PATOGENESI DELLA SINDROME WHIM: ANALISI DELLE FUNZIONI DEL CXCR4 NELLA ATTIVAZIONE E NEL TRAFFICO DEI LINFOCITI

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Telethon grant N.

GGP10170

Totale € Num Centri: 2

ABSTRACT N. 200 Responsabile

VIOLA ANTONELLA

Telethon grant N.

La sindrome WHIM (verruche, ipogammaglobulinemia, infezioni e Myelokathexis), è una malattia umana rara caratterizzata da neu-

Anno d’inizio: 2010

118

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

tropenia, myelokathexis, ritardato switch della classe anticorpale, ipogammaglobulinemia, ricorrenti infezioni, compromissione della funzione delle cellule B di memoria e dalla presenza di verruche indotte dal papillomavirus umano (HPV). La sindrome WHIM è causata da una mutazione dominante del recettore chemochinico CXCR4 che porta al troncamento del C-terminale della proteina. E’ stato dimostrato che questa mutazione altera il traffico intracellulare del recettore nei neutrofili, portando ad una maggiore responsività alle chemochine e alla ritenzione dei neutrofili nel midollo osseo, spiegando così la myelokathexis e neutropenia. Eppure molti difetti nell’immunità adattativa dei pazienti WHIM rimangono ancora in gran parte inspiegati. Abbiamo ipotizzato che le mutazioni associate alla WHIM sul recettore CXCR4 possano influenzare la formazione di sinapsi immunologiche tra le cellule T e le cellule presentanti l’antigene (APC). Noi mostriamo che la mutazione del CXCR4 associato alla sindrome WHIM danneggia la stabilità dei coniugati tra cellula TAPC nei pazienti WHIM, in presenza di un ligando chemochinico esterno competitivo. Questo è dovuto ad un’alterazione del reclutamento del recettore alla sinapsi T-APC. Inoltre, utilizzando un topo retrogenico che sviluppa cellule T WHIM-mutate, mostriamo, in microscopia a 2 fotoni su fettine di linfonodo ex vivo, che il CXCR4 WHIM-mutato inibisce la formazione di interazioni di lunga durata tra le cellule T-APC, altera l’attivazione delle cellule T in vivo e i suoi effetti a valle. Questi risultati dimostrano che i recettori delle chemochine possono influenzare la stabilità della sinapsi immunologica e ci permettono di proporre un meccanismo che spiega direttamente i sintomi correlati alla risposta adattativa nella sindrome WHIM.

di actina in cellule ematopoietiche. I pazienti soffrono di infezioni ricorrenti e svillupano malattie autoimmuni. I nostri studi hanno recentemente rilevato che una produzione eccessiva di interferone di tipo primo da parte di cellule dendritiche plasmacitoidi (pDCs) contribuisce allo sviluppo della malattia. I pazienti dimostrano alterazioni nel numero di pDCs e una elevata espressione di geni dell’interferone di tipo primo e di geni inducibili da interferone. Lo studio del meccanismo alla base di questa alterazione ha permesso di evidenziare un ruolo di WASp nella regolazione negativa della risposta agli agonisti del recettore TLR9 in pDCs. Questo studio rivela dunque una nuova componente nella patogenesi di questa malattia e permette di sviluppare prospettive terapeutiche.

ABSTRACT N. 203 Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

GGP10231 121.000

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2010

Bortolussi Giulia (1), Bockor Luka (1), Zentilin Lorena (1), Mancarella Antonio (1), Bellarosa Cristina (2), Giacca Mauro (1), Tiribelli Claudio (2), Muro Andrés F. (1) (1) International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology (ICGEB), Padriciano, 99, 34149, Trieste, Italy, Tel. 040.3757369, Fax 040.226555, Email: muro@icgeb.org (2) Fondazione Italiana Fegato, Centro Studi Fegato, Trieste, Italy

BENVENUTI FEDERICA

Totale €

435.900

TERAPIA GENICA FEGATO-SPECIFICA PERMANENTE IN UN MODELLO MURINO DELLA SINDROME DI CRIGLER-NAJJAR

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Telethon grant N.

GGP10051

Totale € Num Centri: 5

ABSTRACT N. 202 Responsabile

MURO ANDRES FERNANDO

Telethon grant N.

La sindrome di Crigler-Najjar (CNSI) è una malattia genetica rara causata dall’inattività dell’enzima uridina diglucuronil-transferasi (Ugt1a1) che coniuga la bilirubina nel fegato. I bambini affetti da CNSI hanno livelli di bilirubina molto alti e sono a rischio di sviluppare danno neurologico a meno che non vengano trattati con fototerapia sin dalla nascita. Tuttavia la fototerapia perde la sua efficacia durante l’adolescenza e l’unica cura definitiva è il trapianto di fegato.

Al fine di trovare terapie alternative che possano curare in modo permanente il difetto genetico abbiamo generato un modello murino che riproduce tutte le maggiori caratteristiche della malattia quali: l’iperbilirubinemia neonatale, l’estesa morte delle cellule neuronali, i danni motori ed infine la morte. In precedenza abbiamo mostrato che il trasferimento genico di CMV-hUgt1a1 nel periodo neonatale è capace di curare tutti i topi mutanti. Tuttavia l’espressione del gene era localizzata nel muscolo scheletrico ma non nel fegato.

Nel presente studio, per ottenere un’espressione fegato-specifica della hUGT1a1 abbiamo usato vettori AAV sierotipo 8 contenenti il promotore del gene dell’Alfa1 antitripsina (AAT) insieme all’enhancer del gene dell’ApoE. Tutti i topi mutanti, trattati con una singola iniezione del virus a 4 giorni di vita, sono diventati adulti senza mostrare danni neurologici, con livelli di bilirubina più bassi del 7080% rispetto ai controlli non trattati, a 1 e 2 mesi dopo l’iniezione.

A 17 mesi dall’iniezione i topi trattati mostravano livelli di bilirubina il 50% più bassi dei controlli non trattati e comunque molto lontani dal rischio di sviluppare danno neurologico.

La comparazione tra la terapia genica fegato-specifica dell’AAV8ATT-hUGT1a1 con quella dell’AAV9-CMV-hUGT1a1 che si esprime nel muscolo scheletrico mostra livelli simili di bilirubina plasmatica, nonostante il fegato esprima 60 volte meno hUGT1a1 (mRNA) rispetto al muscolo scheletrico, e solo l’1% di proteina hUGT1a1 nel fegato, rispetto ai controlli wt. Apparentemente questa percentuale è sufficiente per mantenere bassi i livelli di bilirubina plasmatica per tutta la vita. Ipotizziamo che questa notevole differenza nell’efficienza di hUGT1a1 sia legata alla espressione, nel fegato ma non nel muscolo, del trasportatore Mrp2 che espelle la bilirubina coniugata fuori dagli epatociti.

In conclusione, abbiamo dimostrato che il trasferimento genico di un vettore virale fegato specifico che esprime l’hUGT1a1 è capace di revertire il fenotipo letale dei topi mutanti ed allungare la loro sopravvivenza fino ai 2 anni di vita. Inoltre, abbiamo mostrato che l’1% dell’espressione di hUGT1a1 è sufficiente a ridurre i livelli di bilirubina molto al di sotto del rischio di sviluppare danno neurologico. I nostri dati confermano che il fegato è l’organo più appropriato per applicare una terapia genica permanente per la CNSI, scartando la possibilità di trattare organi extra-epatici come il muscolo scheletrico.

Anno d’inizio: 2010

UNA CONNESSIONE TRA L’ALTERATA RISPOSTA AI RECETTORI DI TIPO TOLL NELLE CELLULE DENDRITICHE E LE MALATTIE AUTOIMMUNI NEI PAZIENTI AFFETTI DALLA SINDOMRE DI WISKOTT-ALDRICH Prete Francesca (1), Catucci Marco (2), Labrada Mayrel (3), Gobessi Stefania (4), Castiello Maria Carmina (5), Bonomi Elisa (6), Aiuti Alessandro (7), Vermi William (6,8), Cancrini Caterina (9), Metin Ayse (10), Hambleton Sophie (11), Bredius Robbert (12), Notarangelo Luigi-Daniele (13), Van der Burg Myriam (14), Kalinke Ulrich (15), Villa Anna (2,16), Benvenuti Federica (1) (1) Federica Benvenuti. Cellular Immunology, ICGEB, Area di Ricerca, Padriciano 99, Trieste,Italy, Tel. 040.3757389, Fax 040.226555 (2) San Raffaele Scientific Institute, Telethon Institute for Gene Therapy, Milan, Italy (3) Immunobiology Division, Center of Molecular Immunology, Havana, Cuba (4) International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology (ICGEB) Molecular Hematology Group, Campus “A. Buzzati-Traverso,” Rome, Italy (5) Vita-Salute San Raffaele University, Milan, 20132, Italy (6) Department of Pathology, University of Brescia/Spedali Civilli di Brescia, Brescia, Italy (7) Department of Public Health and Cell Biology, Tor Vergata University, Rome, Italy (8) Department of Pathology and Immunology, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri 63110, USA (9) Department of Pediatrics, Children’s Hospital Bambino Gesù and Tor Vergata University, Rome, Italy (10) Pediatric Immunology and Allergy Department, Ankara Children’s Diseases. Hematology Oncology Training Hospital Pediatric Hematology, Bone Marrow, Transplantation Unit, Ankara Children’s Hematology Oncology Training Hospital, Ankara, Turkey (11) Institute of Cellular Medicine, Newcastle University, NE2 4HH, UK (12) Department of Hematology and Immunology of Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands (13) Division of Immunology, Children’s Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA, USA (14) Department of Immunology, Erasmus MC, University Medical Center Rotterdam, 3015 GE Rotterdam, The Netherland (15) Institute for Experimental Infection Research, TWINCORE, Hanover, Germany (16) Milan Unit, Istituto di Ricerca Genetica e Biomedica, Consiglio Nazionale delle Ricerche, Milan, Italy

La sindrome di Wiskott-Aldrich è una grave immunodeficienza causata da mutazioni in una proteina (WASp), che regola il citosheletro

119

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

ABSTRACT N. 204

Hospital, Via Olgettina 60, 20132, Milan, Tel. +39.320.7981514, Fax 39.02.26434328, E-mail: maiuri.luigi@hsr.it (2) Pediatrics, Yale University School of Medicine, New Haven, USA (3) Cellular and Molecular Physiology, Yale University School of Medicine, New Haven, USA (4) Experimental Pharmacology, University Federico II, Naples, Italy (5) INSERM U848 - Institut Gustave Roussy, Villejuif, France (6) Pediatrics, University Federico II, Naples, Italy

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

GALIETTA LUIS

Telethon grant N.

GGP10026

Totale €

391.000

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2010

Nei polmoni dei pazienti con Fibrosi Cistica (FC), il difettivo funzionamento della proteina CFTR è associato ad un alterato controllo della risposta infiammatoria e un eccessivo stress ossidativo. Queste condizioni favoriscono l’infiammazione cronica, la suscettibilità ad infezioni batteriche croniche, e al danno del tessuto polmonare.

L’eme-ossigenasi 1 (HO-1)/ monossido di carbonio (CO) è una pathway cellulare indotta da stress che gioca un ruolo principale nella modulazione della risposta redox della cellula e nell’attivazione di risposte citoprotettive cellulari. L’obiettivo principale del progetto è di studiare il ruolo di questa pathway in FC. In macrofagi la pathway dell’HO-1/CO funziona da regolatore negativo del Toll like receptor 4 (TLR4) signaling (Wang et al 2009). I nostri dati dimostrano che in macrofagi FC trattati con LPS isolato da Pseudomonas aeruginosa (PA), l’HO-1 ha una distribuzione intracellulare difettiva, con una ridotta localizzazione a livello della superficie cellulare. L’over-espressione di HO-1 in macrofagi FC con manipolazioni genetiche o farmacologiche, ristabilisce la sua localizzazione a livello della superficie cellulare, riducendo l’eccessiva produzione di citochine pro-infiammatorie in risposta a LPS. La compartmentalization dell’ HO-1 sulla superficie cellulare è stata associata all’espressione della proteina caveolina-1 (Cav-1) (Wang et al 2009). Stiamo quindi valutando se la mancata localizzazione dell’HO-1 a livello della membrana plasmatica dei macrofagi FC è dovuta all’espressione difettiva della proteina Cav-1. Studieremo inoltre se HO-1 nei macrofagi gioca anche un ruolo nell’induzione di autofagia (Waltz, et al., 2011) e se la sua modulazione in macrofagi FC può migliorare la capacità battericida di queste cellule che è noto essere difettiva (Abdulrahman et al., 2011).

Anche le cellule bronchiali umane FC (CFBE41o-) stimolate con LPS o PA hanno una difettiva induzione della pathway HO-1/CO in paragone a cellule bronchiali umane non-FC (16HBE14o-); l’overespressione dell’HO-1 in CFBE41o- attraverso manipolazioni genetiche diminuisce lo stress ossidativo, ristabilisce una controllata risposta infiammatoria. Stiamo ora valutando il ruolo di HO-1 nella induzione di autofagia in cellule epiteliali bronchiali FC. Infine, i nostri dati preliminari dimostrano che l’induzione della pathway HO-1/CO in topi FC trattati con LPS riduce i segni d’iperinfiammazione che caratterizzano questo modello animale di malattia. Saranno condotti esperimenti per valutare l’efficacia di farmaci noti modulatori dell’HO-1, nel controllare la risposta infiammatoria e lo stress ossidativo in modelli FC in vitro e in vivo.

La comprensione del ruolo dell’HO-1 nella modulazione dei difetti cellulari associati alla difettiva funzione di CFTR potrebbe condurre all’identificazione di nuovi targets molecolari per potenziali interventi terapeutici atti a migliorare la patologia polmonare FC.

IDENTIFICAZIONE DI NUOVE STRATEGIE PER LA CORREZIONE DEL DIFETTO DI BASE NELLA FIBROSI CISTICA Pedemonte Nicoletta, Caci Emanuela, Sondo Elvira, Ferrera Loretta, Tomati Valeria, Scudieri Paolo, Zegarra-Moran Olga, Ravazzolo Roberto, Galietta Luis J.V. Lab. di Genetica Molecolare, Ist. G. Gaslini, 16147 Genova, Tel. 010.5636801, Fax 010.3779797, E-mail: galietta@unige.it

La fibrosi cistica (FC) è causata da un ridotto trasporto di anioni nelle cellule epiteliali di vari organi. Nei polmoni, il difetto di base causa infezioni batteriche croniche e ostruzione delle vie aeree da parte di secrezioni mucose molto dense. Lo scopo generale del nostro progetto è di sviluppare nuove strategie farmacologiche per correggere il difetto di base nella FC. Per questo scopo, stiamo considerando due diversi bersagli molecolari: CFTR, la proteina direttamente colpita dalle mutazioni nei pazienti FC, e i canali del cloruro attivati da calcio (CaCC), che rappresentano un bersaglio terapeutico alternativo per aggirare il difetto di base. Il nostro progetto si propone in particolare di: 1) identificare nuove proteine-bersaglio e di sviluppare farmaci utili per la correzione funzionale di F508del, la mutazione più frequente nei pazienti FC; 2) di studiare la proteina TMEM16A quale componente principale dei canali CaCC. La mutazione F508del provoca un difetto di maturazione della proteina CFTR. Infatti, la proteina CFTR mutata è riconosciuta dai sistemi cellulari di controllo e indirizzata precocemente verso la degradazione. Per correggere il difetto di maturazione, abbiamo effettuato lo screening su scala genomica di una collezione di molecole di RNA silenzianti (siRNA) utilizzando un saggio funzionale. In questo modo abbiamo identificato alcune proteine il cui spegnimento determina un recupero parziale del mutante F508del-CFTR. In parallelo, abbiamo identificato nuove molecole di sintesi, appartenenti alla famiglia degli aminoariltiazoli, che hanno azione correttiva duplice sulla maturazione e sull’attività intrinseca della proteina CFTR mutata.

Abbiamo anche studiato la proteina TMEM16A in quanto componente principale dei canali CaCC epiteliali. I nostri risultati più recenti hanno dimostrato che l’espressione della proteina TMEM16A è associata con la metaplasia delle cellule mucipare, uno stato di ipersecrezione di muco tipico della FC, dell’asma e di altre patologie croniche dell’apparato respiratorio. In particolare, la proteina TMEM16A è fortemente espressa nelle cellule caliciformi a differenza di CFTR che è invece espressa nelle cellule ciliate. Questi risultati suggeriscono che TMEM16A sia particolarmente richiesta per la secrezione e fluidificazione del muco. È ora importante capire il significato dell’espressione separata di CFTR e TMEM16A in tipi cellulari diversi per valutare l’utilità di TMEM16A quale bersaglio terapeutico nella FC. Pubblicazioni con il contributo Telethon: 1) Pedemonte et al. (2010) Am J Physiol 298: C866-C874 2) Pedemonte et al. (2011) J Biol Chem 286:15215-15226 3) Budriesi et al. (2011) J Med Chem 54: 3885-3394 4) Ferrera et al. (2011) Biochim Biophys Acta 1808: 2214-2223 5) Sondo et al. (2011) Am J Physiol 301: C872-C885 6) Scudieri et al. (2012) J Physiol (in press)

ABSTRACT N. 206 T Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

152.200 Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2013

IL DIFETTO DI FUNZIONE DEL CFTR ALTERA LE RISPOSTE DI IMMUNITÀ INNATA MEDIATE DA RECETTORI TOLL-LIKE: IMPLICAZIONI PATOGENETICHE E TERAPEUTICHE PER LA MALATTIA EPATICA ASSOCIATA A FIBROSI CISTICA

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche MAIURI LUIGI

Telethon grant N.

GGP12128

Totale €

293.700

Num Centri: 3

GGP12133

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 205 Responsabile

STRAZZABOSCO MARIO

Telethon grant N.

Durata (anni): 2

Fiorotto Romina (2), Scirpo Roberto (1), Morell Carola Maria (1), Strazzabosco Mario (1) Anno d’inizio: 2012

(1) Department of Surgery and Interdisciplinary Medicine; University of MilanoBicocca, Via Cadore 48, 20900 Monza, Italy, Tel. 02.64488052, Fax 02.64488260, E-mail: mario.strazzabosco@unimib.it (2) Department of Internal Medicine; Yale University; New Haven (USA)

L’EME-OSSIGENASI 1 (HO-1) COME MODULATORE DELLA PATOLOGIA POLMONARE ASSOCIATA ALLA FIBROSI CISTICA

Ragioni dello studio: La Fibrosi Cistica (FC) è una grave e comune malattia genetica, causata da mutazioni del CFTR, una proteina che regola la secrezione di fluidi in molti organi. Alcuni pazienti con FC presentano complicanze epatiche che possono comprometterne la sopravvivenza e la qualità di vita. Purtroppo una cura per le complicanze epatiche non è ancora disponibile. Nel fegato il CFTR è

Villella Valeria (1), Ferrari Eleonora (1), Esposito Speranza (1), Kyritsi Konstantina (1,2), Monzani Romina (1), Egan Marie (2,3), Maiuri Maria Chiara (4,5), Kroemer Guido (5), Raia Valeria (6), Bruscia Emanuela (1,2), Maiuri Luigi (1) (1) European Institute for Research in Cystic Fibrosis (IERFC) by San Raffaele

120

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

espresso dalle cellule dell’epitelio biliare, specializzate nella produzione della bile. Il difetto di CFTR compromette la capacità delle cellule biliari di produrre bile in quantità e qualità adeguata causando una colestasi che può evolvere in una severa disfunzione dell’organo. Tuttavia, utilizzando dei modelli sperimentali con CFTR difettivo esposti a endotossine batteriche abbiamo visto che la colestasi non è l’evento primario che determina il danno biliare ma è un’alterata risposta alle endotossine che provoca la malattia epatica. Ipotesi e obiettivi: Abbiamo quindi ipotizzato che la mancanza di CFTR abbia un profondo impatto sui meccanismi di difesa che, in condizioni normali, proteggono il sistema biliare dalle infezioni (immunità innata).

In questo progetto vogliamo studiare il ruolo di CFTR nella regolazione dell’immunità innata delle cellule epiteliali e basandoci sulle nostre osservazioni testare nuove strategie terapeutiche. Metodi: Utilizzeremo cellule biliari di topo normali e con CFTR mutato per determinare in vitro come CFTR regola i TLR, recettori Toll-like che riconoscono molecole associate a patogeni. Successivamente, studieremo in vivo in modelli murini, l’effetto terapeutico mediato dalla perturbazione di meccanismi coinvolti nell’attivazione di questi recettori. Risultati attesi: Ci aspettiamo di trovare che il CFTR è necessario per un corretto funzionamento dell’immunità innata epiteliale e che in corso di FC la complicanza epatica è il risultato di una risposta infiammatoria esagerata delle cellule biliari con CFTR difettivo. Possibili ricadute per ricerca e clinica: I nostri studi cambieranno l’attuale comprensione della patogenesi della colangiopatia in FC e proporranno nuove strategie terapeutiche con un significativo impatto sulla gestione dei pazienti con malattia epatica in FC.

duare i neonati CF è 70 ng/ml, corrispondente al 99° centile della distribuzione dell’IRT nella popolazione di riferimento, cioè la soglia che nella popolazione di riferimento assicura la specificità del 99% e l’1% di esiti falsi positivi.

Risultati attesi. La definizione di una strategia razionale per scegliere una soglia ottimale può risparmiare ai genitori preoccupazioni, ansie e disagi dovuti a un esito falso positivo, contribuendo a ridurre i costi per i Servizio Sanitario Nazionale, in termini di test non eseguiti sull’IRT, sul DNA e sul sudore. Le nuove soglie potrebbero essere dapprima adottate in Lombardia e poi, se appropriate in altre Regioni Italiane.

ABSTRACT N. 208 Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

206.800 Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2010

STUDI STRUTTURA-FUNZIONE SULLA 24-DEIDROCOLESTEROLO RIDUTTASI, L’ENZIMA DIFETTOSO NELLA DESMOSTEROLOSI, UNA GRAVE MALATTIA EREDITARIA A CARICO DEL METABOLISMO DEGLI STEROLI Zucchini Daniela (1), Zito Arianna (2), Cuevas Polo Nerea (3), Galbiati M. Rita (2), Caruso Donatella (2), Maggi Roberto (2), Tedeschi Gabriella (3), Vanoni Maria Antonietta (1)

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche

(1) Dipartimento di Bioscienze, Università degli Studi di Milano, Via Celoria 26, 20133 Milano Italia, Tel. +39.02.50314901; Fax +39.02.50314895; E-mail: maria.vanoni@unimi.it (2) Dipartimento di Scienze Farmacologiche e Biomolecolari, Università degli Studi di Milano, Milano (3) Dipartimento di Scienze Veterinarie e Sanità Pubblica, Università degli Studi di Milano, Milano

MILANI SILVANO

Telethon grant N.

GGP12258

Totale €

66.000

Num Centri: 1

GGP10090

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 207 Responsabile

VANONI MARIA ANTONIETTA

Telethon grant N.

Durata (anni): 2

Anno d’inizio: 2012

MIGLIORARE L’ACCURATEZZA DIAGNOSTICA DI UN PROTOCOLLO DI SCREENING NEONATALE PER LA FIBROSI CISTICA: SCELTA DELLE SOGLIE OTTIMALI PER I LIVELLI EMATICI DELLA TRIPSINA IMMUNOREATTIVA (IRT)

La desmosterolosi è una grave, ma rara, malattia ereditaria che causa imponenti difetti nello sviluppo dell’organismo riconducibili a mutazioni del gene codificante l’enzima 24-deidrocolesterolo riduttasi (DHCR24). L’attività enzimatica è stata rilevata in tessuti di mammifero più di 20 anni orsono, ma l’enzima non è stato ancora isolato e caratterizzato per comprenderne le reali proprietà e correlarne il ruolo nella biosintesi del colesterolo, la funzione antiapoptotica e di protezione da stress ossidativo, di recente scoperta, e i gravi difetti nello sviluppo osservati. Pertanto, questo progetto mira a produrre e isolare la DHCR24 per dimostrane le proprietà biochimiche in vitro e a studiarne il ruolo in linee cellulari di origine neuronale.

Analisi delle sequenze predette dalle sequenze dei DNA codificanti (cDNA) la DHCR24 e di localizzazione subcellulare, anche da noi condotti, indicano che la DHCR24 sia una flavoproteina costituita da una regione N-terminale (ca. 50 residui) di ancoraggio alla membrana del reticolo endoplasmico e da un dominio catalitico solubile.

Pertanto, abbiamo ingegnerizzato il cDNA della DHCR24 umana per iperprodurre in E. coli e S. cerevisiae forme solubili e cataliticamente attive della proteina. In seguito alle numerose prove condotte, abbiamo ottenuto forme solubili della proteina mancante della regione di ancoraggio alla membrana che sono però prive del cofattore flavinico, oltre che aggregate, indicando un non corretto ripiegamento. Esse sono purificabili all’omogeneità in presenza di denaturanti o detergenti aprendo cosi’ la strada a esperimenti di rinaturazione e di produzione di nuovi anticorpi antiDHCR24. I numerosi anticorpi disponibili commercialmente danno, infatti, risultati erratici quando utilizzati per la localizzazione della DHCR24 endogena in tessuti e linee cellulari dove riconoscono molte specie proteiche che esperimenti di proteomica hanno dimostrato non corrispondere a forme di DHCR24.

Per chiarire il ruolo della DHCR24 in cellula, il DNA codificante la proteina è stato reingegnerizzato per esprimere forme intere e mancanti della regione di ancoraggio alla membrana in modo transiente e, ora, stabile (per una maggiore riproducibilità delle condizioni) come proteina di fusione con GFP (specie usata sin qui per lo studio in cellula della DHCR24) o un peptide FLAG in linee cellulari Gn11 che esprimono bassi livelli di DHCR24 endogena. Il peptide FLAG, di piccole dimensioni, ha una minore probabilità di indurre artefatti influenzando le proprietà della DHCR24 rispetto alla GFP. Abbiamo, dunque, messo a punto i metodi che permettono di correlare livelli e localizzazione della DHCR24 espressa, proliferazione e differenziamento della cellula (con metodi citochimici e biochimici), livelli di precursori e derivati del colesterolo, tra cui specie a funzione regolatoria (mediante gas cromatografia e spettrometria di massa) e risposta allo stress ossidativo.

Milani Silvano (1), Bossi Anna (1), Corbetta Carlo (2) (1) Department of Clinical Sciences and Community Health, Unit of Medical Statistics and Biometry, University of Milan, via Venezian 1, 20133 Milano, Italy, Tel. 02.503.20854, Fax 02.503.20866, E-mail: silvano.milani@unimi.it (2) Laboratorio di Riferimento Regionale per lo Screening Neonatale, Ospedale dei Bambini “Vittore Buzzi”, AO Istituti Clinici di Perfezionamento, Milan, Italy

Scenario. La Fibrosi Cistica (CF) è una malattia ereditaria autosomica recessiva che causa infezioni polmonari croniche, anomalie gastrointestinali e nutrizionali, perdita di sali e, nei maschi, assenza congenita bilaterale dei vasi deferenti. Si è visto che la diagnosi e il trattamento precoci migliorano la qualità della vita dei pazienti e la prognosi della malattia. In tale contesto, lo screening neonatale riveste un ruolo cruciale, purché la sua accuratezza diagnostica sia molto elevata. Infatti, esiti falsi negativi implicano ritardi nella diagnosi e nella terapia, mentre esiti falsi positivi inducono ingiustificata ansietà nelle famiglie di bambini sani. In Lombardia, attualmente, il rapporto tra falsi e veri esiti positivi è 60:1.

Scopi. Il progetto di ricerca mira a valutare le prestazioni di possibili strategie per lo screening neonatale per la Fibrosi Cistica, in termini di sensibilità, specificità e rapporto costo-efficacia.

Progetto e metodi. Tra i fattori da considerare per migliorare l’accuratezza diagnostica dello screening per la CF, la ricerca si concentrerà sui metodi utili a scegliere i valori soglia ottimali di concentrazione ematica di tripsina immunoreattiva (IRT), misurata su campioni di sangue essiccato. I valori di sensibilità e specificità in funzione dei valori soglia saranno ricavati dai dati forniti dal “Laboratorio di Riferimento Regionale per lo Screening Neonatale dell’A.O. Istituti Clinici di Perfezionamento (ICP)” di Milano, che esegue lo screening di tutti i nati in Lombardia (~100mila/anno). Si progetterà e attiverà una struttura di database per archiviare i dati di tutti i neonati sottoposti a screening (~30 voci per neonato) tra il 2004 e il 2012 (~220 pazienti CF attesi per 850 mila nati). La lista dei pazienti CF positivi allo screening sarà sottoposta a controllo crociato con la lista di tutti i pazienti CF, così da stimare il numero di esiti falsi negativi. La durata mediana dello studio (~4.5 anni) è abbastanza lunga per individuare quasi tutti i bambini CF sfuggiti allo screening. La distribuzione dei valori di IRT derivati dallo screening sarà usata per valutare l’effetto delle variazioni della soglia su sensibilità e specificità. Attualmente la soglia di IRT in uso per indivi-

121

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

ABSTRACT N. 209

Anelli Tiziana (1,2), Cortini Margherita (1,2), Fagioli Claudio (2), Mossuto Maria Francesca (1,2), Sannino Sara (2), van Anken Eelco (1,2), Fra Anna (3), Lougaris Vassilis (4), Plebani Alessandro (4), Sitia Roberto (1,2)

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

VOLTATTORNI CARLA

Telethon grant N.

GGP10092

Totale €

213.200

Num Centri: 2

Durata (anni): 3

(1) University Vita Salute San Raffaele Scientific Institute, Via Olgettina 58, 20132 Milan, Italy, Tel. 02.26434722, Fax 02.26434723, E-mail: sitia.roberto@hsr.it (2) Division of Genetics and Cell Biology, San Raffaele Scientific Institute, Milan (3) Department of General Pathology and Immunology, Brescia University (4) Department of Pediatrics, Brescia University

Anno d’inizio: 2010

SVILUPPO DI NUOVE STRATEGIE PER IL TRATTAMENTO DELL’IPEROSSALURIA PRIMARIA DI TIPO I

Il termine proteostasi è usato a indicare l’equilibrio tra sintesi, folding, trasporto e degradazione delle proteine, essenziale per sopravvivenza e benessere cellulare. Non sorprendentemente, difetti proteostatici sono alla base di molte malattie genetiche. Nella via secretoria prossimale, le proteine difettose sono trattenute e poi degradate per limitarne gli effetti potenzialmente tossici per la cellula, come aggregazione o induzione di ER stress cronico.

ERp44 è uno chaperone multifunzionale coinvolto nel controllo qualità della secrezione (glicoproteine oligomeriche), omeostasi redox (regola Ero1) e signalling mediato da calcio (inibisce IP3R1). Una coda C terminale collega i domini a e b’ e regola il legame dei substrati. Abbiamo dimostrato che il pH regola i movimenti della coda in vivo e in vitro. A pH 6.5 (come nel cis-Golgi) ERp44 espone simultaneamente sito attivo e motivo RDEL. In questo modo, KDELR può legare i complessi tra ERp44 e substrati, e ricondurli nell’ER nel cui pH neutro favorisce i complessi ternari si dissociano. Abbiamo identificato 3 residui all’interfaccia tra dominio a e coda e 2 istidine alla giunzione tra dominio b’ e coda C come elementi fondamentali a conferire pH dipendenza (Vavassori et al., sottomesso). Dati ottenuti in collaborazione con A. Luini e coll. (TIGEM), suggeriscono che ERp44 attiva la cascata kinasica dipendente da KDELR, regolando il trasporto ER-Golgi. Per quanto concerne il signaling mediato da Ca2+ abbiamo dimostrato ERp44 si accumula nei siti di contatto tra ER e mitocondri inibendo IP3R1 (Anelli et al., 2012, ARS). Per meglio definirne interattoma e trasporto abbiamo inserito in ERp44 un Halo-tag. Tale dominio lega covalentemente ligandi fluorescenti o insolubili, e permette saggi di “pulse-chase in vivo” e co-immunoprecipitazione. Per quanto riguarda la generazione di topi KO inducibili, abbiamo validato un clone ES, e stiamo testandone la capacità di trasmissione.

La mancanza selettiva di IgM (SIgMD) è una immunodeficienza ad eziologia sconosciuta, caratterizzata da bassi livelli di IgM sieriche, e normali IgA e IgG. Essendo le IgM substrati di ERp44, una miglior conoscenza dell’interattoma di ERp44 potrebbe essere importante per decifrare la patogenesi della SIgMD. Alla Clinica Pediatrica dell’Università di Brescia stiamo seguendo 7 pazienti (2 senza IgM e 5 con bassi livelli). I pazienti presentano infezioni respiratorie ricorrenti non severe, tranne uno che ha sofferto una grave infezione pneumococcica nel 1° anno di vita. I livelli di IgG, IgA, linfociti B IgM+, formula leucocitaria e risposta alle immunizzazioni sono nella norma. Non abbiamo rilevato mutazioni nelle regioni codificanti dei geni Ig-mu o J. Abbiamo immortalizzato con EBV cellule B di tali pazienti: esse mostrato normali livelli di secrezione di IgM. Stiamo inducendo differenziamento in vitro di cellule B di pazienti per verificare integrità ed efficienza dei meccanismi di assemblaggio e trasporto di IgM.

Cellini Barbara (1), Montioli Riccardo (1), Oppici Elisa (1), Roncador Alessandro (1), Bianconi Silvia (1), Amoroso Antonio (5), De Marchi Mario (2), Mandrile Giorgia (2), Peruzzi Licia (4), Marangella Martino (3), Voltattorni Carla (1) (1) Department of Life Sciences and Reproduction, Section of Biological Chemistry, University of Verona, Strada le Grazie 8, 37134 Verona, Tel 045.8027175, E-mail: carla.borrivoltattorni@univr.it (2) Department of Clinical and Biological Sciences, University of Torino (3) Nephrology Unit, Ospedale Mauriziano, Torino (4) Pediatric Nephrology Unit, Children Hospital OIRM Sant’Anna, Torino (5) Department of Genetics, Biology and Biochemistry,University of Torino

L’iperossaluria primaria di tipo 1 (PH1) è una malattia rara a trasmissione autosomica recessiva causata da mutazioni puntiformi del gene AGXT che codifica per l’alanina:gliossilato aminotransferasi (AGT). L’AGT è un enzima epatico perossisomale dipendente dal piridossal 5’-fosfato responsabile della detossificazione del gliossilato.

Il deficit di AGT causa l’accumulo del gliossilato con il conseguente deposito di cristalli di ossalato di calcio dapprima nei reni e nelle vie urinarie, e poi in tutto l’organismo [1].

Di seguito sono riportati i progressi della ricerca relativi agli obiettivi proposti nel progetto Telethon: 1) studio della correlazione tra genotipo, fenotipo enzimatico e fenotipo clinico di pazienti affetti da PH1, 2) pianificazione di una “enzyme enhancement therapy”, 3) sviluppo di una “enzyme administration therapy”.

Nel secondo anno di studi sono stati ottenuti i seguenti risultati: 1) Mediante studi biochimici (cinetici, spettroscopici, strutturali) e/o studi di biologia cellulare è stato caratterizzato il difetto molecolare dei mutanti W108R, S158L, G161S, G161C, D183N, S187, S218L, P319L e G350D. Sulla base dei risultati ottenuti sono stati proposti alcuni potenziali agenti farmacologici in grado di contrastare l’effetto delle mutazioni [2]. E’ stato inoltre studiato l’impatto sull’AGT delle mutazioni G47R e S81L, sia da sole che in combinazione con la mutazione G170R. I dati ottenuti sono stati interpretati sulla base dei dati clinici di pazienti omozigoti o eterozigoti composti che presentano le mutazioni esaminate. E’ stata inoltre eseguita una revisione dei dati clinici dell’intero gruppo di pazienti aggiornato a Settembre 2012.

2) E’ stato analizzato l’effetto di un noto inibitore competitivo dell’AGT, l’acido amminoossiacetico (AOA), sull’espressione di mutanti patogenici caratterizzati da difetti di “folding” (G41R and G41V) in un sistema cellulare modello di PH1. I dati hanno mostrato che il trattamento con l’AOA aumenta l’attività specifica delle varianti in modo dose-dipendente, suggerendo pertanto che l’AOA agisca da “chaperone” farmacologico. Questi risultati costituiscono un promettente passo avanti nell’identificazione di molecole in grado di agire da “enzyme enhancement therapeutics” nel trattamento della PH1.

3) E’ stata clonata e purificata la proteina di fusione Tat-AGT, costituita dall’AGT in fusione con un “cell penetrating peptide” (peptide TAT). La Tat-AGT è cataliticamente attiva, è in grado di penetrare all’interno di cellule di mammifero e di detossificare il gliossilato perossisomale [3]. Questi dati, assieme a risultati preliminari ottenuti da studi di coniugazione dell’AGT con nanoparticelle polimeriche, costituiscono il punto di partenza per lo sviluppo di una “enzyme administration therapy” per la PH1.

REFERENzE: 1. P. Chocat, et al, Nephrol Dial Transplant. 2012 2. E.Oppici, et al, Mol. Gen. and Metab. 2012 3. A. Roncador, et al, Int. J. Pept. Res. Ther. 2012

ABSTRACT N. 211 Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

GGP11077 343.200

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Durata (anni): 2

Anno d’inizio: 2012

Procino Giuseppe (1), Milano Serena (1), Carmosino Monica (1), Nicoletti Maria Celeste (1), Wess Jürgen (2), Svelto Maria (1) (1) Dipartimento di Bioscienze, Biotecnologie e Scienze Farmacologiche, Università degli Studi di Bari, Via Orabona 4, 70126, Bari, Tel. 080.5443328, Fax 080.5443388, E-mail: maria.svelto@uniba.it (2) National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Disease, NIH, Bethesda, MD, USA

SITIA ROBERTO

Totale €

114.400

STATINE COME POTENZIALI STRUMENTI TERAPEUTICI PER IL TRATTAMENTO DEL DIABETE INSIPIDO NEFROGENICO

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Telethon grant N.

GGP12040

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 210 Responsabile

SVELTO MARIA

Telethon grant N.

Il diabete insipido nefrogenico X-linked (X-NDI) è una patologia rara caratterizzata dalla resistenza del rene all’azione dell’ormone antidiuretico vasopressina (AVP) e si manifesta con severa poliuria e grave rischio di disidratazione. E’ causato da mutazioni inattivanti nel gene per il recettore dell’AVP di tipo II (V2R), che impediscono il

Anno d’inizio: 2011

PATOGENESI DELLE MALATTIE DA ALTERATO TRASPORTO E ACCUMULO PROTEICO NELLA VIA SECRETORIA

122

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

normale traffico del canale per l’acqua AQP2 verso la membrana plasmatica luminale delle cellule di dotto collettore renale. Di conseguenza, la capacità renale di concentrare le urine si riduce fortemente. Inoltre, poiché l’AVP regola anche i livelli di trascrizione dell’AQP2, i pazienti NDI hanno bassi livelli di questa proteina. Ciò rappresenta una delle maggiori limitazioni verso la messa a punto di una terapia mirata ad aggirare il blocco del segnale dell’AVP. Infatti, anche se fosse espressa sulla membrana plasmatica, la quota residua di AQP2 di un paziente NDI potrebbe non essere sufficiente a garantire un adeguato riassorbimento idrico nel rene. Questa considerazione ci ha spinti a esplorare vie di segnalazione alternative che fossero in grado di ripristinare livelli fisiologici di AQP2 nel rene.

Uno dei candidati più promettenti è il recettore della secretina (SCTR) che, come il V2R, incrementa i livelli intracellulari di cAMP in seguito ad interazione con il suo ligando, la secretina (SCT) un ormone digestivo prodotto dall’intestino.

Nel presente lavoro mostriamo che il SCTR è funzionalmente espresso sulla membrana basolaterale delle cellule principali di dotto collettore renale.

Per esplorare i potenziali effetti benefici della SCT sul fenotipo NDI, topi X-NDI, il modello animale della malattia, sono stati infusi sottocute con SCT (2.5 mmol/Kg/die, mediante mini pompe osmotiche) per 14 giorni. I parametri urinari non erano migliorati dalla SCT. E’ stato però interessante vedere che la SCT incrementava significativamente i livelli di AQP2 nel rene, anche se la proteina era accumulata nel citoplasma delle cellule renali e non sulla membrana plasmatica.

Il nostro gruppo ha in precedenza dimostrato che la fluvastatina (FLU) determina un incremento della quantità di AQP2 espressa sulla membrana plasmatica delle cellule renali, indipendentemente dall’AVP. I topi già infusi con SCT erano quindi iniettati con FLU( 50mg/Kg) e la diuresi monitorata per le 6 ore successive all’iniezione. In maniera molto interessante la diuresi si riduceva fino al 90% nei topi trattati con SCT e FLU. L’analisi mediante immunofluorescenza confermava che la SCT incrementa la disponibilità di AQP2 nel rene e la FLU ne faceva aumentare l’espressione di membrana.

Nel loro insieme queste evidenze suggeriscono fortemente che l’associazione di SCT e FLU potrebbe rappresentare un nuovo ed efficace trattamento terapeutico per l’X-NDI.

sidua. L’identificazione di un profilo metaimmunologico nel monitoraggio precoce del diabete di tipo 1 potrebbe aiutare il management e la terapia dei soggetti con diabete giovanile, con probabile impatto sulla prognosi a lungo termine.

ABSTRACT N. 213 Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

GJT08004 100.000

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2009

Novelli Michela (1), Beffy Pascale (2), Menegazzi Marta (3), Porozov Svetlana (1), Martino Luisa (1), Masini Matilde (1), De Tata Vincenzo (1), Migliorini Paola (4), Marchetti Piero (4), Masiello Pellegrino (1) (1) Dipartimento di Ricerca Traslazionale e delle Nuove Tecnologie in Medicina e Chirurgia, Università di Pisa, Via Roma 55 , 56126 Pisa, Tel. +39.050.2218571, Fax +39.050.2218557, E-mail: pellegrino.masiello@med.unipi.it (2) Istituto di Fisiologia Clinica, CNR, Pisa (3) Dip. di Scienze della Vita e della Riproduzione, Università di Verona (4) Dip. di Medicina Clinica e Sperimentale, Università di Pisa

Obiettivo generale: Sviluppare un nuovo approccio terapeutico per la protezione delle cellule beta pancreatiche nel diabete di tipo 1, basato su composti vegetali non peptidici. Premessa/scopi: Abbiamo in precedenza dimostrato che l’estratto di Hypericum perforatum (St. John’s wort, SJW) e il suo componente iperforina (HPF) sono potenti inibitori dell’attivazione di STAT-1 e NF-kB indotta da citochine e prevengono la morte beta-cellulare nella linea INS-1E, nonché nelle isole isolate di ratto e umane. Dato che la via di STAT1 è coinvolta nella differenziazione Th1 delle cellule T, questi composti potrebbero anche esercitare effetti immunomodulatori. Gli scopi di questo studio sono: A) chiarire i meccanismi dell’azione regolatrice di SJW e HPF sulla trasduzione del segnale delle citochine nelle cellule INS-1E; B) valutare la loro capacità di contrastare gli effetti delle citochine sull’espressione di geni bersaglio di STAT-1 e NF-kB coinvolti nella risposta infiammatoria e nell’apoptosi; C) esplorare il profilo microarray dei microRNA in cellule beta esposte a citochine e/o composti vegetali; D) verificare il ruolo immuno-regolatore di SJW e HPF in cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC). Metodi: In cellule INS-1E, esposte a citochine con o senza estratto di SJW (1-2 microg/ml) o HPF (1-2 microM), è stato valutato mediante western blotting lo stato di fosforilazione di vari componenti delle vie di STAT-1, NF-kB e MAPK. L’RNA estratto con il mirVana miRNA kit è stato usato per l’analisi RT-qPCR dell’espressione genica (large RNA) e del profilo miRNA. Risultati: Scopo A. La fosforilazione di STAT-1 in tirosina e serina, indotta da citochine, è significativamente ridotta da SJW e HPF in modo dose-dipendente.

Questi composti prevengono l’attivazione di NF-kB bloccando la fosforilazione della subunità p65 e della chinasi regolatrice della subunità inibitoria IkB e modulano altresì la via MAPK mediante inibizione dose-dipendente delle fosforilazioni di ERK1/2, p38 MAPK e JNK. Scopo B. SJW e HPF aboliscono l’espressione indotta da citochine di geni pro-infiammatori quali iNOS, CXCL9, CXCL10, ICAM-1, COX2 e sono capaci di correggere in parte lo squilibrio tra fattori anti- e pro-apoptotici, soprattutto prevenendo l’aumento di proteine pro-apoptotiche (DP5, PUMA, BAK). Obiettivo C. Alcune variazioni nell’espressione di miRNA indotte dall’esposizione a citochine vengono corrette dalle sostanze vegetali (in particolare da SJW), anche se la funzione di tali miRNA nelle cellule beta non è nota. Scopo D. Nelle PBMC stimolate, l’espressione di T-bet e CXCR3-A, markers del differenziamento Th1, è inibita da SJW e HPF dopo 4 ore di incubazione, mentre quella di GATA-3 e CXCR3-B, markers di polarizzazione Th2, è aumentata o invariata. Conclusioni: L’estratto di SJW e l’HPF si confermano promettenti strumenti farmacologici per la prevenzione della perdita di cellule beta indotta da citochine ed esercitano effetti immunomodulatori in vitro.

MATARESE GIUSEPPE

Totale €

50.000

EFFETTI PROTETTIVI DI COMPOSTI FITOCHIMICI NEI CONFRONTI DEI DANNI INDOTTI DA CITOCHINE NELLE CELLULE BETA PANCREATICHE ED ESPLORAZIONE DEI MECCANISMI COINVOLTI

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Telethon grant N.

GJT08016

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 212 Responsabile

MASIELLO PELLEGRINO

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2009

LEPTINA, STATO METABOLICO E CELLULE T REGOLATORIE NATURALI: BASI CELLULARI E MOLECOLARI PER UN UN INTERVENTO IMMUNOTERAPEUTICO INNOVATIVO NEL DIABETE DI TIPO 1 Matarese Giuseppe, De Rosa Veronica, Procaccini Claudio, Galgani Mario Istituto di Endocrinologia e Oncologia Sperimentale (IEOS) del CNR, Via Pansini 5 80131 Napoli, Tel 081.7464580, E-mail: giuseppe.matarese@cnr.it

Il Diabete di tipo 1 è caratterizzato dalla distruzione immuno mediata delle cellule beta pancreatiche in soggetti geneticamente predisposti. Gli induttori della rottura della tolleranza così come i meccanismi responsabili della progressiva perdita della funzione beta cellulare non sono compresi fino in fondo. L’aumento vertiginoso di obesità e dismetabolismo in paesi avanzati e ricchi sono stati presi in considerazione anche per l’aumento di frequenza del diabete di tipo 1. La comprensione del legame tra metabolismo, immunità e tolleranza immunitaria potrebbero portare alla scoperta di nuovi markers di malattia capaci di monitorizzarne l’andamento. In questo contesto abbiamo studiato una serie di marcatori immunologici con grande impatto sul metabolismo in soggetti normali, in soggetti ad alto rischio di diabete 1 ed in diabetici a diagnosi a 12 e 24 mesi dalla diagnosi. Un modello di matrici di correlazioni multiple è stato sviluppato su grafici a due dimensioni. Marcatori di funzione beta cellulare fino a due anni dopo la diagnosi sono stati evidenziati utilizzando il modello della regressione logistica multivariata. Abbiamo evidenziato che il profilo metaimmunologico cambiava nel tempo particolarmente in oggetti con malattia più grave. Il modello di regressione logistica multivariata ha identificato peso, BMI, età e peptide c, il numero di cellule CD3CD16CD56 e la percentuale di cellule dendritiche tipo 1 CD1c+CD19-CD14-CD303- come markers precoci di malattia predittivi della gravità e della funzione beta cellulare re-

123

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

ABSTRACT N. 214

UTILIZZO DI TIMP3 PER BLOCCARE LE COMPLICANZE METABOLICHE E VASCOLARI DELL’OBESITÀ

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

FALCONE MARIKA MARIA CATERINA

Telethon grant N.

GJT08017

Totale € Num Centri: 1

Federici Massimo, Casagrande Viviana, Cavalera Michele, Mavilio Maria, Stohr Robert, Menghini Rossella

124.300 Durata (anni): 3

Dipartimento di Medicina dei Sistemi, Università degli Studi di Roma Tor Vergata, Via Montpellier 1, 00133 Roma. Italia

Anno d’inizio: 2009

TIMP3 è ridotto nel muscolo e nelle placche carotidee di pazienti con Diabete di Tipo 2 ma non è chiaro se TIMP3 alteri il metabolismo di glucosio e lipidi. In questo studio analizziamo topi ApoE-/(EKO) e ApoE-/-Timp3-/- (ET3KO) monitorandone la sopravvivenza; effettuando analisi metaboliche con sistemi LC-MS e colorazioni convenzionali di lipidi, metaboliti e placche aterosclerotiche; analizzando valori fisiologici con gabbie calorimetriche. Gli animali ET3KO, comparati con gli EKO, mostrano un aumentato tasso di mortalità durante un follow-up di 12 mesi (N=18 per gruppo; p<0.001); l’aorta e l’arco aortico dei topi ET3KO risultano maggiormente reattive alle colorazioni con Sudan-IV e Oil-Red (40% di incremento, p<0.01). Inoltre, i topi ET3KO, rispetto ai topi EKO, presentano livelli più elevati di colesterolo totale, colesterolo HDL e trigliceridi (p<0.05 per tutti i parametri); negli animali ET3KO si riscontra anche una frequenza cardiaca più bassa (p<0.01), pressione sistolica e diastolica più alta (p=0.06; p<0.05), aumentato consumo di O2 e produzione di CO2 con un più basso quoziente respiratorio (p<0.0001 per tutti i parametri). Questi dati suggeriscono un differente utilizzo dei substrati metabolici; nello specifico abbiamo trovato aumentati i livelli di C14:OH, C16:OH e C18:OH (p<0.01), di arginina (p<0.05) e istidina (p<0.01) nel sangue dei topi ET3KO. Non state riscontrate differenze nel consumo di cibo e acqua. Analisi Western Blot rivelano una ridotta fosforilazione di Thr172-AMPK (p<0.05) e un’aumentata fosforilazione in Ser473-AKT(p<0.05) nel muscolo scheletrico dei topi ET3KO rispetto agli EKO, suggerendo che l’ossidazione lipidica può essere disfunzionale negli animali ET3KO. La perdita di Timp3 accelera l’aterosclerosi e causa un aumento nel numero delle placche aterosclerotiche, incrementa il tasso di mortalità oltre a produrre difetti nel metabolismo intermedio.

Quest’ultimo risulta nell’accumulo di acidi grassi idrossilati a lunga catena in circolo che può complicare la composizione della placca aterosclerotica o perturbare il metabolismo cardiaco.

VALUTAZIONE DEL POTENZIALE TERAPEUTICO DELLE CELLULE REGOLATORIE NKT NEL DIABETE AUTOIMMUNE DI TIPO 1 Di Pietro Caterina (1), Nichols Kim (2), Caielli Simone (1), Falcone Marika (1) (1) Experimental Diabetes Unit, San Raffaele Scientific Institute, L30 LottoQ, Via Olgettina 60, 20132, Milan, Italy, Tel. 02.2643.2317/2914, E-mail: falcone.marika@hsr.it (2) Pediatric Oncology, Children s Hospital of Philadelphia, Philadelphia, USA

Introduzione: i linfociti NKT invarianti sono una sottopopolazione di cellule dell’immunità innata con una doppia funzione in grado di espletare sia un ruolo pro-infiammatorio che regolatorio, quest’ultimo è fondamentale per mantenere la tolleranza immunologica verso il self e prevenire le malattie autoimmuni come il diabete di tipo 1 (DT1). Entrambe le funzioni dei linfociti NKT sono mediate dal contatto diretto tra il linfocita NKT e cellule dendritiche di tipo mieloide (MCD). Il nostro gruppo di ricerca ha dimostrato che la suscettibilità genetica al diabete autoimmune nel modello pre-clinico (topo NOD) è legata ad un difetto genetico del gene Slamf1 che porta ad un’alterazione dei livelli di espressione della molecola costimolatoria SLAM sulle MCD e ad un difetto del differenziamento periferico di linfociti NKT2 regolatori.

Obiettivo del lavoro: il nostro scopo è ora quello di ripristinare i meccanismi che conducono al differenziamento periferico di linfociti NKT2 regolatori nei topi diabetici NOD e di verificare se lo stesso difetto genetico di espressione di molecole SLAM è presente anche su MDC di pazienti affetti da DT1. Obiettivo a lungo termine sarà quello di disegnare nuovi approcci terapeutici per il ripristino della funzione NKT regolatoria e la prevenzione del DT1.

1. Ripristino del differenziamento di linfociti NKT regolatori mediante induzione di normali livelli di espressione della molecola SLAM su MDC di topi NOD. A questo scopo abbiamo clonato il gene SLAM non difettoso (da topi C57BL/6) all’interno del vettore retrovirale MIGR1 contenente IRES (internal ribosome entry site) associato a GFP. La trasduzione di MDC di NOD con questo vettore virale ha portato a livelli di espressione di SLAM paragonabili a quelli del topo di controllo non-autoimmune. Nonostante ciò i nostri esperimenti preliminari in vitro hanno mostrato che le MDC trasdotte non sono ancora in grado di indurre differenziamento di linfociti NKT2 regolatori. In questo momento stiamo valutando se tale incapacità sia dovuta al fatto che comunque anche i linfociti NKT devono avere normali livelli di espressione di SLAM perché si verifichi l’interazione omotipica SLAM-SLAM o al fatto che le condizioni colturali portano ad un differenziamento prevalente di linfociti effettori (NKT1/NKT17).

2. Valutazione della capacità di linfociti NKT2 regolatori e di MDC con normali livelli di espressione di SLAM di prevenire e/o curare il diabete autoimmune in modelli pre-clinici. Stiamo attualmente effettuando esperimenti in vivo mediante iniezione di cellule ematopoietiche trasdotte con il vettore SLAM-MIGR1 in topi NOD irradiati (chimere) per verificare se normali livelli di espressione di molecole co-stimolatorie SLAM su MDC e linfociti NKT siano in grado di indurre linfociti NKT con proprietà immuno-regolatorie e soprattutto di prevenire il diabete autoimmune nel topo NOD. 3. Analisi dei livelli di espressione di molecole SLAM su MDC di pazienti affetti da DT1 e controlli. Qui il nostro obiettivo è quello di verificare se un difetto di espressione di molecole SLAM e di differenziazione di linfociti NKT2 regolatori sia presente anche in individui affetti da DT1. Ad oggi abbiamo analizzato un gruppo limitato di pazienti diabetici e controlli (n=6) ed i nostri risultati preliminari dimostrato che effettivamente vi è una riduzione di espressione di SLAM su MDC di pazienti affetti da DT1. A questo punto dobbiamo allargare il numero di pazienti e controlli studiati (n=20) al fine di verificare se i nostri risultati abbiano una significatività statistica.

ABSTRACT N. 216 Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

GGP08065 263.000

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2009

Oriente Francesco, Cabaro Serena, Griffo Elisabetta, Auriemma Fabiana, Beguinot Francesco Dipartimento di Biologia e Patologia Cellulare e Molecolare, Università di Napoli, Via S. Pansini 5, 80131, Napoli, Tel. 081.7463248, Fax 081.7463235, Email: beguino@unina.it

Prep1 è un fattore di trascrizione ad omeodominio della famiglia TALE, che include anche Pbx e Meis e gioca un ruolo importante nell’ ematopoiesi, organogenesi e nello sviluppo. Prep e Meis contengono Pbx-Interacting Motifs omologhi (HR1 e HR2) e formano complessi trascrizionalmente attivi con Pbx. I complessi Meis/Prep-Pbx legati al DNA, a propria volta, legano e modificano l’ attività di altri fattori di trascrizione Hox e non-Hox. Topi ipomorfi per Prep1 hanno un fenotipo complesso. Un aspetto importante è l’ aumento della sensibilità all’ insulina del tessuto muscolare, accompagnata dalla protezione dal diabete indotto da streptozotocina. Sia in vivo che in vitro, il ridotto livello di Prep1 è accompagnato da una riduzione di p160, l’ assenza della quale up-regola l’ espressione di GLUT4 mediata da PGC1a e stimola il trasporto del glucosio nella cellula muscolare.

Studi più recenti hanno mostrato un aumentato accumulo di glicogeno ed una ridotta gluconeogenesi nel fegato di topi Prep1i/+ indipendente da p160/ PGC1a, ma accompagnato da aumento nella fosforilazione del recettore insulinico e di IRS1/2. Questi topi presentano anche ridotti livelli di triglicertidi epatici. In questo lavoro, abbiamo indagato la funzione di Prep1 nella lipogenesi epatica.

Abbiamo osservato che i trigliceridi sierici e l’ espressione epatica dell’ enzima lipogenetico FAS sono significativamente ridotti nei topi Prep1i/+. Nel feagato di questi animali, la fosforilazione di PKCzeta, LKB1, AMPK e ACC, che controllano l’ espressione di FAS e la produzione dei trigliceridi era, invece, aumentata. I livelli della lipido

FEDERICI MASSIMO

Totale €

245.400

LA FUNZIONE DEL GENE PREP1 NEL DIABETE TIPO 2

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Telethon grant N.

GGP09012

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 215 Responsabile

BEGUINOT FRANCESCO

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2008

124

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

fosfatasi SHIP2, un inibitore del signalling di PI3K/PKCzeta, erano ridotti del 40% nel fegato dei topi ipomorfi. Coerentemente, cellule epatiche HEPG2 sovraesprimenti PREP1 presentavano livelli aumentati di trigliceridi e di FAS mentre la fosforilazione di PKCzeta, LKB1, AMPK e ACC era fortemente ridotta, un effetto dovuto all’ up-regulation di SHIP2 mediata dal complesso Prep1/Pbx1. Per verificare le conseguenze della lipogenesi mediata da Prep1, abbiamo indotto steatosi epatica alimentando topi Prep1i/+ ed animali di controllo con diete a ridotto contenuto di metionina e colina (MCD). Nei topi Prep1i/+. le diete MCD causavano un minore incremento del contenuto di trigliceridi rispetto ai topi di controllo. Anche i marcatori istologici di steatosi, infiammazione e la necrosi epatocitaria risultavano meno evidenti, indicando che il silenziamento di Prep1 mitiga l’ effetto della dieta steatogenica.

Questi dati suggeriscono che il silenziamento di Prep1 riduce la lipotossicità aumentando il signalling di PKCzeta/AMPK e mitiga la steatosi. I dati provvedono un razionale per indagare Prep1 come un nuovo bersaglio terapeutico per prevenire la progressione della steatosi in steatoepatite non alcolica.

dischi intercalari di pazienti con mutazione vi era una diminuzione del segnale immunoreattivo per PG che era ridotto non solo nelle regioni del ventricolo destro con patologia, ma anche nel ventricolo sinistro e nel setto privi alterazioni. Tale riduzione sembra essere specifica per l’ARVC se paragonata a campioni di pazienti con scompenso legato ad altre patologie. Sono necessari ulteriori studi per verificare sensibilità e specificità del test, ma le osservazioni suggeriscono un suo possibile ruolo diagnostico.

ABSTRACT N. 218 Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

GGP09293 246.900

Num Centri: 3

Durata (anni): 2

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2010

Pieroni Maurizio (1), Antonio Oliva (2), Gemma Pelargonio (3), Camporeale Antonia (3), Partemi Sara (2), Notarstefano Pasquale (1), Pagans Sara (4), Pascali Vincenzo (2), Bolognese Leonardo (1), Brugada Ramon (4)

BAUCE BARBARA

Totale €

336.000

IDENTIFICAZIONE DEI PREDITTORI GENETICI, ELETTROANATOMICI E STRUTTURALI DI ARITMIE VENTRICOLARI MALIGNE IN PAZIENTI CON SINDROME DI BRUGADA

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Telethon grant N.

GGP10186

Totale € Num Centri: 2

ABSTRACT N. 217 Responsabile

PIERONI MAURIZIO

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2009

(1) Cardiovascular Department ASL8 Arezzo San Donato Hospital Via Pietro Nenni, 20 52100 Arezzo, Italy (2) Institute of Forensic Medicine, Catholic University Rome, Italy (3) Cardiovascular Department, Catholic University Rome, Italy (4) Cardiovascular Genetic Department, Girona, Spain

NUOVI GENI E ASPETTI CLINICO-PATOLOGICI IN FAMIGLIE AFFETTE DA CARDIOMIOPATIA ARITMOGENA DEL VENTRICOLO DESTRO

Premessa: Nella prima parte clinica del nostro Progetto, abbiamo valutato la presenza di anomalie elettroanatomiche al mappaggio 3D e l’eventuale substrato istopatologico di queste anomalie. Abbiamo pertanto sottoposto pazienti con diagnosi di sindrome di Brugada (BrS) a mappaggio elettroanatomico (EAM) ed a biopsia endomiocardica EAM-guidata del ventricolo destro.

Metodi In questa prima parte del progetto abbiamo arruolato 13 pazienti consecutivi (11M, 49±8 aa) con diagnosi di BrS secondo gli attuali criteri diagnostici. In particolare tutti i pazienti presentavano un ECG tipo 1 a riposo (n=9) o dopo stimolazione con flecainide (n=4).

Tutti i pazienti sono stati sottoposti a mappaggio CARTO 3D e a biopsia EAM-guidata. Nei pazienti con normale mappa EAM, le biopsie sono state eseguite sia dall’apice che dal tratto di efflusso (RVOT) del ventricolo destro.

Risultati La presentazione clinica era stata una tachicardia ventricolare sostenuta polimorfa in 7 pazienti, una sincope in 3; 3 pazienti erano asintomatici. Undici pazienti (84%) presentavano una mappa EAM anormale: in 8 casi l’area con potenziali anomali coinvolgeva il RVOT, in 4 casi con coinvolgimento della parete libera ed in 2 casi del segmento postero-laterale ed inferiore. Nei restanti 3 pazienti erano presenti isolate aree di basso voltaggio nella parete libera (2 casi) o del segmento postero-laterale.

Tra i pazienti con mappa EAM anormale, l’esame istologico ha evidenziato un substrato patologico in 9 casi (81%). In particolare è stata evidenziata una sostituzione fibroadiposa in 2 pazienti con area di basso voltaggio nel RVOT, miocardite in 5 casi con mappa EAM alterata nella parete libera (in 3 casi con coinvolgimento del RVOT) e alterazioni di tipo cardiomiopatico aspecifico in 2 pazienti con coinvolgimento del RVOT settale e del segmento postero-basale. In 4 casi la biopsia ha mostrato assenza di alterazioni istologiche: 2 pazienti con mappa EAM anomala a livello del RVOT ed in 2 casi con normale mappa EAM. Non è stata osservata nessuna correlazione tra la presentazione clinica ed il quadro ECG, con l’aspetto della mappa EAM né con il quadro istologico. Lo studio elettrofisiologico ha indotto una fibrillazione ventricolare in 2 pazienti, uno dei quali con coinvolgimento del RVOT. Conclusioni Nei pazienti con BrS arruolati abbiamo riscontrato una elevata prevalenza di anomalie al mappaggio EAM, con un coinvolgimento prevalente del RVOT. Le anomalie della mappa EAM rappresentavano l’espressione di una alterazione istologica nell’81% dei casi, rinforzando quindi l’ipotesi che la BrS non può essere considerata una sindrome puramente elettrica.

L’identificazione delle aree con alterato potenziale e del corrispondente substrato istologico può influenzare si la prognosi che il trattamento, compresa una potenziale strategia ablativa.

Basso Cristina (2), Rampazzo Alessandra (3), Rigato Ilaria (1), Perazzolo Marra Martina (1), Carturan Elisa (2), Pilichou Kalliopi (2), Smaniotto Jessica (3), Rizzo Stefania (2), De Bortoli Marzia (3), Calore Martina (3), Thiene Gaetano (2), Bauce Barbara (1) Clinica Cardiologica, Dipartimento di Scienze Cardiologiche, Toraciche e Vascolari, Università di Padova, Via Giustiniani 2, 35100 Padova, Tel. 049.8218642, Fax 049.0211802, E-mail: barbara.bauce@unipd.it (2) Patologia Cardiovascolare, Dipartimento di Scienze Cardiologiche, Toraciche e Vascolari, Università di Padova, Padova (3) Dipartimento di Biologia, Università di Padova, Padova

Background. La cardiomiopatia aritmogena del ventricolo destro (ARVC) è una patologia cardiaca caratterizzata da instabilità elettrica che può portare a morte improvvisa. Dato che la maggior parte dei geni-malattia codifica per proteine desmosomiali, l’ARVC può essere considerata una patologia del desmosoma.

Risultati. Screening clinico-genetico in probandi con ARVC e nei loro familiari. Un totale di 110 casi indice e di 219 familiari sono stati sottoposti a ricerca di mutazioni dei geni Plakofillina-2 (PKP2), Desmoplakina (DSP), Desmogleina-2 (DSG2) e 137 sono risultati portatori di mutazione. La penetranza era minore nel gruppo di soggetti con mutazione singola rispetto ai portatori di mutazione multipla.

Infine, l’analisi di una popolazione pediatrica con mutazioni desmosomiali ha mostrato come i segni clinici di malattia compaiano nell’adolescenza e prima giovinezza e come la risonanza magnetica con mezzo di contrasto fornisca importanti elementi diagnostici.

Identificazione di nuovi geni malattia. Abbiamo ipotizzato che l’alfa T-cateninina, che codifica per CTNNA3, potesse presentare mutazioni in pazienti con ARVC. L’alfa T-catenina lega le plakofilline e questo legame contribuisce alla formazione dell’area composita, che rafforza l’adesione cellula-cellula nei cardiomiociti. Abbiamo sottoposto a screening per mutazioni del gene CTNNA3 76 pazienti con ARVC negativi per mutazioni dei geni desmosomiali legati a tale patologia. Le mutazioni c.281T>A (p.V94D) e c.2293_2295delTTG (p.del765L) sono state identificate in due probandi. Saggi del doppio ibrido e studi di transfezione cellulare hanno mostrato una ridotta interazione tra la proteina che porta la mutazione p.V94D e la beta-catenina, mentre la proteina mutata p.del765L mostra una dimerizzazione molto più spiccata e forma aggregati nelle cellule HEK293T. Tali risultati indicano una relazione causale tra mutazioni CTNNA3 e l’ARVC e suggeriscono che la patogenesi dell’ARVC coinvolga componenti dell’area composita.

Alterazioni ultrastrutturali ed istochimiche delle giunzioni intercellulari nel tessuto miocardico. Per meglio comprendere la patogenesi dell’ARVC abbiamo utilizzato l’immunoistochimica e studiato la distribuzione delle proteine giunzionali nei dischi intercalari. Abbiamo valutato se le proteine desmosomiali mutate fossero espresse nei dischi intercalari e se la mutazione di una proteina portasse a delle alterazioni nella distribuzione delle altre proteine. Si è visto che nei

125

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

ABSTRACT N. 219

associata con aritmie gravi, molto simili a quelle osservate nei pazienti, e causate da Triggered Activity (TA) a livello cellulare. In collaborazione con il dott. Auricchio (TIGEM) abbiamo prodotto un vettore AAV9 portatore di CASQ2 WT ed abbiamo infettato i topi KO. Dopo 35 settimane abbiamo dimostrato una inibizione totale delle aritmie ed una normalizzazione delle anomalie ultrastrutturali (Denegri M et al Circ Res 2012).

Su queste basi abbiamo studiato l’efficacia della infezione con AAV9-CASQ2 nel topo CASQ2-R33Q/R33Q (da noi sviluppato in precedenza), portatore di una mutazione trovata in una famiglia CPVT. La caratterizzazione della dinamica del Ca2+ ha evidenziato che i miociti R33Q/R33Q sviluppano rilasci di Ca2+ spontanei con conseguente insorgenza di post-potenziali precoci (EAD) e tardivi (DAD).

A livello subcellulare abbiamo evidenziato alterazioni dell’architettura delle CRU (calcium release unit) ed una frammentazione delle onde di Ca2+. Questi risultati configurano un nuovo meccanismo aritmogeno nella CPVT (Liu N et al. submitted). Abbiamo poi verificato l’efficacia clinica della nostra strategia di gene targeting. I topi CASQ2-R33Q/R33Q sono stati studiati a 26 e 52 settimane dopo l’infezione. L’incidenza di tachicardia ventricolare è scesa dal 87% (n = 8) nei controlli al 17% (n = 12) nei topi infettati (p<0.005).

Come atteso i DAD e TA sono stati quasi aboliti (26 settimane: i papà: 0%, TA 0%, n = 18; 52 settimane: DAD: 8%, TA: 8%, n = 12). Infine, western blot e saggi di immunofluorescenza hanno dimostrato la ri-espressione e la corretta localizzazione di CASQ2.

CONCLUSIONI. I risultati ottenuti fino ad ora dimostrano che la riespressione AAV9-mediata di CASQ2 è una strategia efficace e duratura per ripristinare le anomalie funzionali indotte da mutazioni CASQ2 anche quando, come nel caso della R33Q, il mutante endogeno è ancora presente. Poiché i vettori AAV sono già stati utilizzati in clinica, i nostri dati possono preludere ad una sperimentazione clinica della terapia genica nei pazienti con CPVT.

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

TARONE GUIDO

Telethon grant N.

GGP12047

Totale €

182.600

Num Centri: 1

Durata (anni): 2

Anno d’inizio: 2012

MELUSINA COME AGENTE DI TERAPIA GENICA: UN NUOVO APPROCCIO PER CONTRASTARE LE CARDIOMIOPATIE Tarone Guido, Brancaccio Mara, Vitale Nicoletta, Rubinetto Cristina, Cimino James Università di Torino, Dipartimento di Biotecnologie Molecolari e Scienze per la Salute, Via Nizza 52, 10126 Torino, Tel. 011.6706433, Fax 011.6706432, Email: guido.tarone@unito.it

Le cardiomiopatie sono malattie mortali causate in gran parte da mutazioni genetiche ereditarie che compromettono la funzione cardiaca. Poiché queste patologie sono generate da diversi possibili mutazioni che interessano geni differenti, la terapia genica convenzionale mirata a correggere ciascuna specifica mutazione non è sempre possibile. Un approccio di terapia genica mutazione-indipendente potrebbe essere molto vantaggioso e, in linea di principio, applicabile a cardiomiopatie generate da diversi mutazioni anche non ancora identificate. Con questo progetto valuteremo l’efficacia di un approccio di terapia genica basata sulla sovraespressione di melusina una proteina muscolo-specifica con attività di chaperon.

Le proteine chaperon riconoscono un ampio spettro di proteine danneggiate da condizioni di stress o da mutazioni genetiche permettendo loro di mantenere il corretto funzionamento. Abbiamo precedentemente dimostrato che melusina è selettivamente espressa nei muscoli e nel cuore ed è richiesta per la risposta cardiaca a stimoli di stress come il sovraccarico pressorio. Inoltre, la sovraespressione di melusina contrasta efficacemente l’insufficienza cardiaca indotta da stenosi aortica ed infarto del miocardio. Questo progetto si propone di utilizzare melusina come approccio di terapia genica mutazione-indipendente per contrastare lo stress cellulare indotto da mutazioni genetiche in modelli murini di cardiomiopatia familiare.

ABSTRACT N. 221 Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2011

PRIORI SILVIA GIULIANA

Telethon grant N.

GGP11141

Totale €

465.600

Num Centri: 3

215.600

NUOVO METODO PER LO STUDIO DELLE ARITMIE CATECOLAMINERGICHE FAMILIARI BASATO SULL’USO DI PROTEINE FOTOATTIVATE

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

GGP11224

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 220

MONGILLO MARCO

Telethon grant N.

Durata (anni): 3

Da Broi Francesca, Plazzo Anna Pia, Zaglia Tania, Mongillo Marco Venetian Institute of Molecular Medicine, Via Orus, 2, 35129 Padova, Tel. 049.7923229 and Dept of Biomedical Sciences, University of Padova, Padova, Italy

Anno d’inizio: 2011

MUTAZIONI DEL GENE CASQ2 (CALSEQUESTRINA) ED ARITMIE CARDIACHE: APPROCCIO SPERIMENTALE ALLA PATOGENESI E TERAPIA

Il cuore è densamente innervato dai neuroni del sistema nervoso simpatico (SN) che regolano la funzionalità cardiaca durante l’esercizio fisico o lo stress attivando i recettori beta adrenergici (betaARs). L’aumento dell’attività simpatica può portare allo sviluppo di aritmie in CPVT, sviluppando DADs dipendenti da un sovraccarico di Ca2+ dovuto alla stimolazione da norepinefrina (NE). La DAD può costituire un focus aritmogenico che si scatena inizialmente in un gruppo limitato di cellule. Infatti attività simpatica non bilanciata in regioni diverse del cuore è associata ad aritmie (Arora, Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2003) e alterazioni nella ricaptazione presinaptica di NE portano ad aumenti nella [NE] nel miocardio (Esler, Hypertension 1988). Questi dati supportano un modello nel quale il controllo autonomico della contrattilità avviene attraverso l’interazione diretta tra i neuroni e i cardiomiociti (CM) bersaglio.

Lo scopo di questo progetto è capire se l’interazione tra SN e CM è specifica e ha un ruolo nelle vie di segnalazione intercellulare. Questo permetterà di capire come uno squilibrio dell’attività simpatica possa influire sulla fisiologia dei CM e portare ad aritmie.

Come modello in vitro, abbiamo sviluppato co-colture tra CM e SN del ganglio cervicale superiore, isolati da ratti neonati. In seguito a trattamento con NGF, i SN sviluppano degli assoni e stabiliscono un contatto diretto con i CM; nel sito di contatto si formano terminali sinaptici contenenti NE, con accumulo dei beta1-ARs sulla membrana del CM. Abbiamo monitorato le vie di segnalazione dei beta-ARs misurando le variazioni di [cAMP] e dell’attività di PKA, utilizzando i sensori EPAC1-camps e AKAR3. La stimolazione dei SN è stata ottenuta con KCl, bradichinina o controllando il potenziale di membrana neuronale tramite patch clamp.

L’attivazione di uno specifico SN porta ad aumento di cAMP nei CM bersaglio, ma non in cellule senza contatto.

Per stimare la [NE] che agisce sui beta-AR presenti sulla membrana

Denegri Marco (1), Lodola Francesco (1), Boncompagni Simona (2), Liu Nian (3), Valle Giorgia (4), Volpe Pompeo (4), Protasi Feliciano (2), Napolitano Carlo (1,3), Priori Silvia G (1,3,5) (1) Molecular cardiology, IRCCS Fondazione Salvatore Maugeri, Via Maugeri 10, 27100, Pavia, Italy, Tel. 0382.592049, Fax 0382.592059, E-mail: silvia.priori@fsm.it (2) CeSI, Center for Research on Ageing & DNA, Department of Neuroscience and Imaging, G. d’Annunzio University, Chieti, Italy (3) Cardiovascular Genetic Program, The Leon H. Charney Division of Cardiology, New York University School of Medicine, New York, USA (4) Department of Biomedical Sciences, University of Padova, Padova, Italy (5) Department of Molecular Medicine, University of Pavia, Pavia, Italy

La Tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica (CPVT) è una malattia ereditaria che causa aritmie ventricolari e sincopi in situazioni di stress acuto. La mortalità è di circa il 30% entro la quarta decade di vita. Nel corso di precedenti progetti Telethon abbiamo contribuito a definirne le basi genetiche, l’epidemiologia e la fisiopatologia della CPVT. Il progetto GGP11141 è finalizzato allo sviluppo di strategie di terapia genica, con un’attenzione specifica alla variante autosomica recessiva (secondaria a mutazioni del gene calsequestrina, CASQ2).

In primo luogo abbiamo caratterizzato il nostro modello knock out (KO) di CASQ2 dimostrando una riduzione >90% dei monomeri di calsequestrina, mentre esperimenti di microscopia elettronica hanno dimostrato un allargamento del lume reticolo sarcoplamaitico da 26±0.3nm a 37±1,2nm, p <0.001). La diminuzione di CASQ2 era

126

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

del CM nel sito di contatto, abbiamo paragonato le ampiezze del segnale di FRET ottenuto attivando il neurone con quello ottenuto con diverse [NE]. Con gli stessi esperimenti in presenza di diverse quantità del beta bloccante propranololo abbiamo stimato la [NE] presente nello spazio intermembrana nell’ordine di 100 nM. Ciò permetterà di calcolare la frazione di beta-AR attivati dalla NE rilasciata dal SN. In conclusione, abbiamo dimostrato l’esistenza di un contatto sinaptico tra i SN e i CM che rappresenta uno spazio isolato in cui è presente un’alta concentrazione di agonista che permette l’attivazione di una frazione di beta-AR sulla membrana dei CM in seguito a stimolazione neuronale. Questa stretta interazione può permettere il controllo rapido e spazialmente definito delle vie di segnalazione intracellulare dei CM. Questo suggerisce che il controllo da parte dei SN di un ristretto gruppo di cellule possa generare foci di aritmie in condizioni patologiche.

60% il livello di espressione dell’allele mutato, producendo solo un minimo effetto sull’allele wild type (WT).

Il potenziale terapeutico di questo siRNA sarà ora saggiato in vivo, nel modello murino Delta KPQ. La disponibilità del modello dei topi SCN5A-DeltaKPQ rappresenta un prezioso strumento traslazionale, che noi abbiamo sfruttato per caratterizzare il fenotipo cardiaco, nel tentativo di identificare i predittori di rischio.

La frequenza cardiaca (HR), la temperatura del corpo e i segnali di attività locomotoria sono stati registrati da un sistema telemetrico per 3 giorni consecutivi, in 6 topi WT e 6 topi transgenici LQT. Gli animali, tenuti in una camera a temperatura controllata a 20-24 ° C, con alternanza costante luce/buio di 12 ore, sono stati analizzati in media ogni 5 min per le intere 24 ore. Sono stati individuati due periodi di 12 ore, LUCE (quiescenza/ciclo di sonno tranquillo) e SCURO (attività /ciclo di veglia). Nel gruppo LQT l’HR era inferiore durante il periodo di LUCE piuttosto che durante la NOTTE (497 ± 70 vs 535 ± 51 bpm, p <0,05). Il gruppo WT si è comportato allo stesso modo (545 ± 23 vs 571 ± 40 bpm, p <0,05). La variabilità dell’HR è stata maggiore nel gruppo LQT rispetto al WT, sia durante il BUIO (5453 ± 781 vs 4185 ± 1427 bpm, p <0,05) che durante la LUCE (5266 ± 388 vs 4189 ± 966 bpm, p <0,05).

I topi LQT e WT hanno mostrato un andamento circadiano di HR conservato. Tuttavia, le variazioni insolitamente grandi di HR osservate nei topi LQT suggeriscono un’anomala regolazione cardiaca.

ABSTRACT N. 222 Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

CROTTI LIA

Telethon grant N.

GGP09247

Totale €

383.700

Num Centri: 4

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2009

ABSTRACT N. 223

DAL TOPO ALL’UOMO: VERSO L’IDENTIFICAZIONE DI UNA TERAPIA GENICA PER LA VARIANTE LQT3 DI SINDROME DEL QT LUNGO

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

Crotti Lia (1,2), Zentilin Lorena (3), Macedo Antero (3), Giacca Mauro (3), Schwartz Peter (1,2), Insolia Roberto (2), Girardengo Giulia (2), Besana Alessandra (5), Calvillo Laura (5), Montano Nicola (6), Wu Maddalena (4), Bari Vlasta (4), Porta Alberto (4)

SANTUCCI ANNALISA

Telethon grant N.

GGP10058

Totale €

233.200

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2010

ALLESTIMENTO DI MODELLI SPERIMENTALI DI ALCAPTONURIA E VALUTAZIONE PRECLINICA DI AGENTI TERAPEUTICI PER IL TRATTAMENTO DELL’ARTROPATIA OCRONOTICA

Dipartimento di Cardiologia, IRCCS Fondazione Policlinico San Matteo, Piazzale Golgi 19, 27100, Pavia, Tel. 0382.501323, Fax 0382.501322, E-mail: l.crotti@smatteo.pv.it (2) Sezione di Cardiologia, Dipartimento di Medicina Molecolare, Università di Pavia, Pavia (3) International Center for Genetic Engineering and Biotechnolgy (ICGEB), Padriciano, Trieste (4) Dipartimento di Tecnologie per la Salute, Istituto Ortopedico Galeazzi, Università degli Studi di Milano, Milano (5) Laboratorio di Genetica Cardiovascolare, IRCCS Istituto Auxologico Italiano, Milano (6) Dipartimento di Scienze Cliniche, Medicina Interna II, Ospedale L. Sacco, Università di Milano, Milano

(1) Dipartimento di Biotecnologie, Chimica e Farmacia, Università degli Studi di Siena, via Fiorentina 1, 53100, Siena, Tel. 0577.234958, Fax 0577.234903, Email: annalisa.santucci@unisi.it (2) Dipartimento di Scienze della vita, Università degli Studi di Siena, Siena

Lo scopo specifico del progetto è lo sviluppo di una strategia terapeutica per la LQT3 basata sul silenziamento selettivo e permanente dell’allele SCN5A mediante espressione in vivo, mediate da vettori AAV, di siRNA in grado di riconoscere la sequenza mutata.

La strategia sperimentale sfrutta la presenza della delezione caratteristica di 9-bp nell’allele mutato (Delta KPQ). Su questa base, abbiamo inizialmente individuato 5 diverse sequenze bersaglio, che riconoscono 19 o 29 nucleotidi della sequenza genomica a cavallo del sito di delezione. Oigonucleotidi corrispondenti sono stati clonati in un backbone di un vettore AAV sotto il controllo trascrizionale del promotore di PolIII U6. Questo vettore esprime, in aggiunta, la proteina fluorescente ZsGreen che permette di monitorare facilmente l’efficienza di trasduzione.

Da questi costrutti, nell’AVU Facility dell’ICGEB, sono stati generati vettori virali AAV6 ad alto titolo e saggiati in vitro in colture di cardiomiociti neonatali ottenuti da topi Delta KPQ eterozigoti. L’analisi quantitativa in real-time PCR allele-specifica, ha evidenziato l’effetto dello short RNA 5, in grado di mediare il silenziamento degli alleli SCN5A, con un effetto maggiore, anche se non assoluto verso l’allele mutato.

In parallelo, l’analisi elettrofisiologica ha mostrato la riproducibile normalizzazione delle anomalie dei flussi di corrente caratterizzanti la LQT3.

Ala luce di questi risultati, un AAV9-sh5 è stato iniettato in topi neonatali. L’analisi molecolare quantitativa eseguita dopo un mese, ha confermato il silenziamento in vivo del messaggero dell’allele mutante a livelli vicini al 50% rispetto ai topi non trattati o iniettati con un vettore AAV di controllo, ed in assenza di effetti tossici evidenti. Topi trattati sperimentalmente nella stessa maniera saranno ora analizzati in telemetria e valutati per l’insorgenza di aritmie dopo trattamento con carbacolo.

Nella ricerca di un siRNA con un’azione più selettiva nei confronti dell’allele Delta KPQ, abbiamo testato in vitro 10 nuove sequenze bersaglio. Uno di questi siRNA, si4734, è stato capace di ridurre del

Introduzione L’alcaptonuria (AKU) è una patologia ultra-rara causata da una carente attività dell’enzima omogentisato-1,2-diossigenasi che si traduce in un accumulo di acido omogentisico (HGA) e nella conseguente produzione di pigmenti ocronotici melanino-simili la cui composizione è tuttora sconosciuta. Ad oggi, non è disponibile alcun trattamento farmacologico specifico per AKU. Materiali e Metodi Abbiamo voluto verificare se l’AKU implicasse un’amiloidosi secondaria, e per questo abbiamo investigato, mediante colorazione con Congo Red, Tioflavina T ed analisi al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) la presenza di amiloide in campioni prelevati da pazienti alcaptonurici (cartilagine, sinovia, grasso peri-ombelicale, ghiandola salivare) ed in condrociti e cartilagine umana trattati con HGA. La presenza di proteina siero amiloide A (SAA) e P (SAP) è stata analizzata mediante immunofluorescenza, ed i relativi livelli nel plasma dei pazienti quantificati mediante saggio ELISA. Inoltre, mediante elettroforesi bidimensionale, abbiamo analizzato i livelli di specifiche proteine coinvolte in processi amiloidogenici in condrociti umani prelevati da pazienti alcaptonurici.

Risultati e prospettive future I tessuti osteoarticolari AKU di 7/7 pazienti hanno mostrato la presenza di SAA-amiloide, rivelando altresì la co-localizzazione dell’amiloide con il pigmento ocronotico. La presenza di SAA e SAP nei depositi è indice di un’amiloidosi secondaria. Livelli elevati di SAA e SAP sono stati rinvenuti nel plasma dei pazienti AKU. L’amiloidosi sistemica è stata inoltre dimostrata mediante colorazione con Congo Red del grasso addominale e della ghiandola salivare dei pazienti. Dopo il morbo di Parkinson, AKU è quindi la seconda patologia umana nella quale l’amiloide è associato ad una forma di melanina.

Abbiamo inoltre dimostrato nelle cellule AKU l’espressione aberrante di proteine coinvolte in processi amiloidogenici. Nel loro complesso, i risultati delle nostre ricerche sull’AKU come amiloidosi secondaria di tipo II (AA) aprono nuove ed interessanti prospettive per

Millucci Lia (1), Spreafico Adriano (1), Tinti Laura (1), Braconi Daniela (1), Ghezzi Lorenzo (1), Paccagnini Eugenio (2), Bernardini Giulia (1), Amato Loredana (1), Laschi Marcella (1), Lupetti Pietro (2), Orlandini Maurizio (1), Santucci Annalisa (1)

127

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

un eventuale trattamento farmacologico della malattia, dal momento che il trattamento con metotrexato si è dimostrato efficace nel ridurre in modo significativo in vitro gli aggregati A-amiloidi (Millucci L, et al. Alkaptonuria is a novel human secondary amyloidogenic disease. Biochim Biophys Acta 2012;1822(11):1682-91. doi: 10.1016/j.bbadis.2012.07.011).

EFFETTI DI LOSARTAN VS NEBIVOLOLO VS L’ASSOCIAZIONE DI ENTRAMBI SULLA PROGRESSIONE DELLA DILATAZIONE DELLA RADICE AORTICA NELLA SINDROME DI MARFAN CON MUTAZIONE DEL GENE FBN1: REPORT SUL TRIAL CLINICO IN ATTO Serio Alessandra (1), Grasso Maurizia (1), Favalli Valentina (1), Disabella Eliana (1), Giorgianni Carmela (1), Regazzi Mario (2), Broglia Monica (2), Klersy Catherine (3), Dore Roberto (4), Arbustini Eloisa (1)

ABSTRACT N. 224 Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

BALDINI ANTONIO

Telethon grant N.

GGP11029 326.700

Totale € Num Centri: 1

(1) Centro Malattie Genentiche Cardiovascolari, Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, Pavia (2) Unità di Farmacologia e Farmacocinetica, Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, Pavia (3) Direzione Scientifica, Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, Pavia (4) Dipartimento di Radiologia, Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, Pavia

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2011

VARIABILITÀ FENOTIPICA E APLOINSUFFICIENZA GENICA Introduzione. La sindrome di Marfan (MFS) è una malattia genetica rara causata da mutazioni del gene Fibrillina 1 (3:10.000 individui). L’aneurisma della radice aortica (>80% dei casi) può complicarsi con la dissezione per diametri aortici superiori a 5 cm. Il Fattore di Crescita Trasformante beta 1 (TGFbeta1) ha un ruolo chiave nel danno della parete aortica. In studi animali il blocco del TGFbeta previene il danno strutturale e la dilatazione aortica: pertanto i sartani (ARB), che inibiscono tale molecola, sono indicati nella terapia della MFS [1,2]. In passato sono stati usati i beta bloccanti (BB), ma esiste discordanza sulla loro efficacia nel prevenire la dissezione aortica.

Metodi. Il trial clinico è uno studio di fase III; l’arruolamento prevedeva 291 (231 per potenza statistica del 90% e 30 per tenere conto di drop out del 20%) pazienti affetti da MFS con dimostrata mutazione su FBN1 e dilatazione aortica. I pazienti sono stati randomizzati in terapia con Losartan, Nebivololo o entrambi. Obiettivo primario è la valutazione comparativa dell’efficacia dei farmaci sulla progressione della radice aortica. Gli obiettivi secondari comprendono la farmacocinetica dei farmaci, il dosaggio comparativo dei livelli di TGFbeta totale ed attivato, l’analisi quantitativa dell’espressione del gene mutato, le basi farmacogenetiche della risposta alla terapia. È inoltre valutata la qualità di vita (QoL) nei tre gruppi. L’analisi statistica prevede un’ analisi ad interim al mese 24 e analisi conclusive al mese 48. Il Comitato Etico locale ha approvato lo studio. Esso è registrato in ClinicalTrials.gov (OMS: num. NCT00683124) ed è riconosciuto dalla Agenzia Italiana del Farmaco (num. EudraCT 2008-001462-81).

Risultati. La dimensione del campione (al netto del drop out n = 262) è stato raggiunto nel mese di settembre 2012. L’arruolamento è stato formalmente chiuso e comunicato al comitato etico locale nel 10 settembre 2012. Il calo osservato è stato significativamente inferiore a quanto calcolato (8% vs 20%) a causa della alta aderenza e la partecipazione al progetto dei pazienti e delle famiglie. Più del 50% dei pazienti ha completato il follow-up a 24 mesi.

Conclusioni. Il follow-up è in corso come previsto. Ad oggi, nessuno dei pazienti si è aggravato o ha sviluppato dissezione aortica acuta.

Entrambi i farmaci sono ben tollerati senza evidenza di effetti collaterali importanti. Il follow-up deve essere concluso prima di conoscere i risultati nei tre bracci dello studio.

REFERENZE (1) Shin GT, Am J Kidney Dis 2000 (2) Fukuda N, Am J Hypertens 2000 (2) Roman MJ, Am J Cardiol 1989

Caprio Cinzia (1), Fulcoli Filomena Gabriella (1), Franzese Monica (2), Angelini Claudia (2), Baldini Antonio (1) (1) Istituto di Genetica e Biofisica “Adriano Buzzati-Traverso”, CNR, Via Pietro Castellino, 111-80131 Napoli, Italy (2) Istituto per le Applicazioni del Calcolo, “M. Picone” , CNR, Via Pietro Castellino, Napoli, Italy

L’aploinsufficienza di TBX1 conduce ad un alterato sviluppo dell’apparato faringeo e ad un’alterata embriogenesi nel topo e la mutazione del gene nell’uomo è responsabile della Sindrome Di George, una sindrome da anomalie congenite multiple che include anche un importante fenotipo nell’adulto. Il gene codifica per un fattore di trascrizione della famiglia T-box. Lo scopo del progetto è quello di investigare meccanismi che conducono all’aploinsufficienza del gene Tbx1 e ridurre il suo impatto fenotipico in vivo usando farmaci. Nell’ambito di questo progetto sono già state associate alcune funzioni molecolari di Tbx1 all’interazione con il complesso di rimodellamento della cromatina Swi-Snf-like e con metiltransferasi istoniche. Più recentemente, abbiamo effettuato saggi di ChIP-seq per mappare i siti di legame di Tbx1 alla cromatina e correlarli con le caratteristiche funzionali dei geni.

I risultati indicano che i siti di legame di Tbx1 sono principalmente localizzati in regioni distali dal TSS (64,2%), e che questi sono ampiamente correlati con l’arricchimento di H3K4me1 (77,4%). Usando saggi quantitativi, abbiamo anche trovato che l’arricchimento di Tbx1 correla positivamente con H3K4me1 in loci specifici. Abbiamo quindi ipotizzato che un ridotto dosaggio di Tbx1 potrebbe implicare un insufficiente arricchimento di H3K4me1 in regioni critiche e una conseguente alterazione nell’espressione di geni target e che il trattamento con un inibitore delle demetilasi potrebbe compensare il ridotto dosaggio di Tbx1 migliorandone il fenotipo. Abbiamo quindi trattato animali mutanti con l’epi-drug tranilcipromina (TCP), un farmaco approvato per essere utilizzato sull’uomo, che è un potente inibitore della demetilazione mediata da Lsd1. Il tipico fenotipo in embrioni aploinsufficienti per Tbx1 è caratterizzato da ipo/aplasia della quarta arteria faringea a E10.5. I risultati di questo esperimento dimostrano che l’iniezione della TCP porta ad un significativo (pv=0.01) sebbene parziale recupero di questo difetto in embrioni mutanti. In parallelo, abbiamo sperimentato un’altra strategia per recuperare il fenotipo, basato su nostri precedenti risultati secondo i quali la perdita di Tbx1 porta ad una ridotta proliferazione cellulare favorendo il differenziamento cellulare in diversi tessuti. Abbiamo testato se un ridotto dosaggio di p53 (sia geneticamente, usando mutanti per p53, che farmacologicamente, usando la Pifitrina) potesse modificare il fenotipo mutante di Tbx1 in vivo, usando lo stesso saggio biologico in vivo. I risultati hanno mostrato un completo recupero del fenotipo aploinsufficiente in embrioni a E10.5 usando la soppressione genetica, ed un recupero minore, ma comunque significativo usando il farmaco (4,6*10-5). Complessivamente, i nostri risultati indicano che l’aploinsufficienza di Tbx1, quindi il fenotipo morfogenetico può essere almeno parzialmente corretto o prevenuto usando farmaci. Una conoscenza dettagliata dei meccanismi di azione di Tbx1 fornirà ulteriori criteri nella scelta di potenziali farmaci.

ABSTRACT N. 226 Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

ARBUSTINI ELOISA GGP08238

Totale € Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2008

Moschetta Antonio (1), Modica Salvatore (1), Petruzzelli Michele (1,2), Bellafante Elena (1), Murzilli Stefania (1), Salvatore Lorena (1), Celli Nicola (3), Di Tullio Giuseppe (1), Palasciano Giuseppe (2) (1) Laboratory of Lipid Metabolism and Cancer, Department of Translational Pharmacology, Consorzio Mario Negri Sud, Santa Maria Imbaro (CH), Tel. 0872.570344; Fax 0872.570299; E-mail: moschetta@negrisud.it (2) Clinica Medica “A. Murri,” Department of Internal and Public Medicine, University of Bari, Bari, Italy

194.700 Durata (anni): 3

205.700

ATTIVAZIONE INTESTINALE DEL RECETTORE NUCLEARE PER GLI ACIDI BILIARI FXR NEL TRATTAMENTO DELLA COLESTASI INTRAEPATICA PROGRESSIVA FAMILIARE

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Telethon grant N.

GGP08259

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 225 Responsabile

MOSCHETTA ANTONIO

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2008

128

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

con l’aumento di cellule CD45+ve nello spazio portale (r=0.97, p<0.01). L’espressione genica di TGFß1 mostra un aumento età-dipendente che parallela la ß6. L’analisi FACS mostra che il 50-75% delle cellule CD45+ve sono macrofagi (CD45/CD11b/F4/80+ve).

Colangiociti Pkhd1-KO polarizzati secernono dal versante basolaterale livelli aumentati di KC e IP-10 (p<0.05). Entrambe le citochine stimolano la migrazione dei macrofagi (p<0.05). L’espressione basale di ß6mRNA nei colangiociti Pkhd1-KO (0.015±0.002 2dCt) è potentemente stimolata dalle citochine di derivazione macrofagica, TGFß1 (0.017±0.002 2dCt, p<0.05) e TNFa (0.018±0.003 2dCt, p <0,05). L’inibizione del TGFßRII abroga l’effetto del TGFß1 (0.014±0,003 2dCt, p<0.05) ma non quello di TNFa (0.017±0.001 2dCt, p=ns) sul ß6mRNA. L’espressione di Coll1mRNA nei colangiociti Pkhd1-KO (0.0009±0.0003 2dCt) aumenta significativamente dopo stimolazione con TGFß1 (0.002±0.0005 2dCt, p<0.05).

CONCLUSIONI - I colangiociti Pkhd1-KO secernono chemochine (KC, IP-10) dal versante basolaterale in grado di reclutare macrofagi nello spazio portale. A loro volta i macrofagi rilasciano citochine (TGFß1, TNFa) in grado di aumentare l’espressione di avß6 integrina nei colangiociti Pkhd1-KO. L’avß6 integrina attiva la forma latente del TGFß1 stimolando ulteriormente le proprietà fibrogeniche dei colangiociti.

(3) Environmental Sciences Center, Consorzio Mario Negri Sud, Santa Maria Imbaro (CH), Italy

La Colestasi Intraepatica Progressiva Familiare (in inglese Progressive Familial Intrahepatic Cholestasis, PFIC) è una grave malattia del fegato, a carattere ereditario, caratterizzata da progressiva compromissione della funzione epatica ed esito precoce in cirrosi, durante l’infanzia o l’adolescenza. Sono state individuate le modificazioni genetiche responsabili delle tre forme di PFIC e riguardanti geni coinvolti nella corretta formazione della bile. In particolare, la PFIC tipo 2 e tipo 3 sono dovute a mutazioni dei trasportatori nella bile degli acidi biliari (ATP Binding Cassette (ABC)-B11) e dei fosfolipidi (ABC-B4), rispettivamente. Al momento attuale, la terapia medica è inefficace e l’unica possibilità terapeutica consiste nel trapianto di fegato. Concrete speranze ha suscitato la recente scoperta del ruolo cardine svolto dal recettore nucleare degli acidi biliari Farnesoid X Receptor (FXR) nell’omeostasi epatobiliare. I Recettori Nucleari sono il sostegno molecolare dello stato di salute dei lipidi: si legano direttamente al DNA e determinano l’attivazione o lo spegnimento di più geni contemporaneamente, garantendo risposte coordinate e funzionalmente efficaci. FXR, in particolare, orchestra la formazione e secrezione della bile, ed il suo fisiologico ricircolo tra fegato ed intestino. La fisiologia biliare, infatti, risiede nell’attività sincronizzata di fegato ed intestino, e dalla sua modulazione da parte degli ormoni e della dieta. A livello epatico, FXR inibisce la sintesi ed aumenta la secrezione biliare dei sali biliari. Abbiamo dimostrato che l’attivazione intestinale di FXR è in grado di inibire la sintesi epatica di sali biliari. Inoltre, abbiamo dimostrato come la riattivazione intestinale di FXR nei modelli genetici di colestasi protegge dal danno epatico riducendo la quantità di sali biliari tossici circolanti attraverso la secrezione del nuovo ormone intestinale FGF15.

ABSTRACT N. 228 Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

FABRIS LUCA

Telethon grant N.

GGP09189

Totale € Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2011

Mele Caterina (1), Iatropoulos Paraskevas (1), Maranta Ramona (1), Gamba Sara (1), Curreri Manuela (1), Daina Erica (1), Noris Marina (1), Remuzzi Giuseppe (1,2), Bresin Elena (1)

218.200 Durata (anni): 3

271.500

BASI GENETICHE DELLA SINDROME NEFROSICA STEROIDORESISTENTE E IMPLICAZIONI PER LA TERAPIA

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

GGP11201

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 227

BRESIN ELENA

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2009

(1) Centro di Ricerche Cliniche per le Malattie Rare “Aldo e Cele Daccò”, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri, Via G.B. Camozzi 3, 24020 Ranica (Bg), Italia, Tel. +39.035.4535327, Fax +39.035.4535373, E-mail: raredis@marionegri.it (2) Dipartimento di Nefrologia e Dialisi, Azienda Ospedaliera Ospedali Riuniti di Bergamo, Bergamo

TRANSIZIONE EPITELIO-MESENCHIMALE E MECCANISMI DI CROSS TALK NELLO SVILUPPO DELLA FIBROSI EPATICA NEI DIFETTI CONGENITI DI FIBROCISTINA (FIBROSI EPATICA CONGENITA) Fabris Luca (1), Locatelli Luigi (2), Cadamuro Massimiliano (1), Spirli Carlo (3), Schuppan Detlef (4), Strazzabosco Mario (2)

Introduzione. La sindrome nefrosica è una condizione caratterizzata da aumentata permeabilità della barriera glomerulare con conseguenti proteinuria, ipoalbuminemia e edemi. I quadri istologici più osservati sono la Nefropatia a Lesioni Minime (NLM) e la Glomerulosclerosi Focale e Segmentale (GSFS). I glucocorticoidi rappresentano la terapia d’elezione; nonostante l’impiego di dosaggi adeguati, il trattamento non è peraltro in grado di indurre remissione nel 10% dei pazienti con NLM e nel 60-80% di quelli con GSFS. Si parla in questi casi di Sindrome Nefrosica Steroido Resistente (SNSR). I pazienti affetti da SNSR sono a rischio di gravi infezioni, episodi tromboembolici, dislipidemia e il 40% di essi va incontro ad insufficienza renale terminale entro 10 anni dall’esordio. Studi genetici hanno dimostrato che la SNSR può essere causata da mutazioni in geni che codificano per proteine importanti nella funzione del podocita (NPHS1, NPHS2, PLCE1, MYO1E, PTPRO, LAMB2, CD2AP, INF2, ACTN4, TRPC6, WT1 e ARHGAP24). Le mutazioni sono state trovate in circa il 60% dei pazienti con esordio in età infantile e in circa il 20% di quelli con esordio in età adolescenziale o adulta.

Presso il Centro di Ricerche Cliniche per le Malattie Rare è stato istituito un Registro Internazionale per la SNSR con lo scopo di identificarne le basi genetiche e studiare le correlazioni genotipo-fenotipo per migliorare le possibilità di consulenza e terapia.

Metodi. Dopo aver ottenuto il consenso informato, i dati clinici e biochimici dei pazienti e dei loro familiari sani sono stati inseriti in un Case report Form e valutati da un gruppo multidisciplinare di esperti in malattie rare. Lo screening genetico è stato eseguito mediante sequenziamento del DNA estratto da un campione di sangue.

Risultati. I dati clinici e i campioni biologici di 165 pazienti (101 casi sporadici e 64 casi familiari appartenenti a 29 famiglie) sono stati raccolti con il coinvolgimento di 15 Unità di Nefrologia italiane e 4 internazionali. 37 pazienti su 165 presentano manifestazioni extrarenali. In 7 pazienti, inizialmente riconosciuti affetti da SNSR sporadica, è stata formulata una diagnosi sindromica dopo rivalutazione dei dati clinici (4 pazienti con sindrome di Alport, 2 con sindrome di Denysh-Drash e 1 con sindrome rene-coloboma).

Ad oggi, una alterazione genetica è stata identificata nel 17% dei pazienti. I geni coinvolti sono INF2 (9 su 144 pazienti analizzati),

(1) Dipartimento di Scienze Chirurgiche, Oncologiche e Gastroenterologiche (DiSCOG), Università di Padova, via Giustiniani, 2, 35128 Padova, Tel. +39.328.3337780, E-mail: luca.fabris@unipd.it (2) Dipartimento di Chirurgia e Medicina Interdisciplinare, Università di MilanoBicocca, Milano (3) Department of Medicine and Liver Center, Yale University, New Haven, CT, USA (4) Division of Gastroenterology Hepatology, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, Boston, MA, USA

INTRODUZIONE e SCOPO - La fibrosi epatica congenita (CHF) è causata da mutazioni del gene PKHD1 che codifica per la fibrocistina, una proteina espressa su ciglia e centromeri dei colangiociti. La CHF è caratterizzata da un aberrante sviluppo dell’epitelio biliare accompagnato da progressiva fibrosi con ipertensione portale. I meccanismi responsabili della fibrosi portale nella CHF non sono noti. L’avß6 integrina media l’attivazione locale del TGFß1 ed è espressa dai colangiociti reattivi durante la colestasi. Per comprendere i meccanismi della fibrosi nella CHF abbiamo studiato l’espressione dell’avß6 integrina e la sua regolazione nei topi Pkhd1-KO. METODI - Nei topi Pkhd1-KO abbiamo studiato, a diverse età (1-12 mesi): a) fibrosi (Sirius Red) e ipertensione portale (peso milza/peso corporeo), b) espressione della ß6 (RT-PCR, IHC), c) espressione di a-SMA e TGFß1 (RT-PCR), d) infiltrato infiammatorio portale (IHC e FACS su fegato intero), f) secrezione di chemochine nelle colture di colangiociti primari polarizzati (Luminex assay), g) effetti delle citochine su proliferazione (MTS assay) e migrazione (camera di Boyden) dei macrofagi, h) effetti di TGFß1 e TNFa in presenza/assenza dell’inibitore del recettore di tipo II del TGFß (TGFßRII) sull’espressione della ß6, i) effetti del TGFß1 sull’espressione del collagene di tipo I (Coll1) da parte dei colangiociti (RT-PCR).

RISULTATI - I topi Pkhd1-KO mostrano un progressivo aumento dell’espressione di ß6 integrina nell’epitelio biliare con l’età. L’espressione di ß6 correla sia con la fibrosi portale (r=0.94, p<0.02) che

129

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

ABSTRACT N. 230

WT1 (7/91), MYO1E (4/82), PLCE1 (4/53), NPHS2 (1/105), CD2AP (1/50) e PAX2 (2/2). In questi casi è stata fornita una consulenza genetica.

Il Registro aderisce a PodoNet, un consorzio di ricerca europeo per lo studio delle malattie podocitarie, inizialmente supportato nell’ambito del bando E-Rare, che ha censito 1469 pazienti provenienti da 34 paesi.

Conclusioni. Il Registro della SNSR ha permesso di caratterizzare meglio un numero rilevante di pazienti e di identificare una coorte idonea per condurre studi epidemiologici, genetici e clinici.

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

NORIS MARINA GGP09075

Totale €

263.500

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

208.300 Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2007

ANALISI ULTRASTRUTTURALE AD ALTA RISOLUZIONE DEI COMPLESSI PROTEICI RESPONSABILI DEL TRASPORTO INTRAFLAGELLARE (IFT): SISTEMA MOLECOLARE ESSENZIALE PER LA FORMAZIONE DELLE CIGLIA E ALLA BASE DELLA MALATTIA DEL RENE POLICISTICO (PKD, POLYCYSTIC KIDNEY DISEASE)

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Telethon grant N.

GGP07269

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 229 Responsabile

LUPETTI PIETRO

Telethon grant N.

Vannuccini Elisa (1), Cantele Francesca (2), Gentile Mariangela (1), Dini Daniele (1), Lanzavecchia Salvatore (2), Paccagnini Eugenio (1), Lupetti Pietro (1)

Anno d’inizio: 2009

(1) Dip. Scienze della Vita, Università degli Studi di Siena, Via Aldo Moro 2, 53100 Siena, Tel. 0577.234402, Fax 0577.234476, E-mail: pietro.lupetti@unisi.it (2) Dip. di Chimica Strutturale, Università di Milano, Milano

ANOMALIE DEL COMPLEMENTO NELLA GLOMERULONEFRITE MEMBRANOPROLIFERATIVA PRIMARIA Noris Marina (1), Bresin Elena (1), Piras Rossella (1), Sorosina Annalisa (1), Valoti Elisabetta (1), Alberti Marta (1), Bettoni Serena (1), Zito Anna (1), Daina Erica (1), Gamba Sara (1), Donadelli Roberta (1), Gabutti Luca (2), Remuzzi Giuseppe (1,3)

La malattia policistica renale (PKD) è una delle più diffuse patologie ereditarie. Numerose varianti della PKD sono dovute a difetti nel ciglio primario che si trova su ciascuna cellula dei tubuli renali. La PKD è causata da difetti in un sistema conosciuto come Trasporto IntraFlagellare (IFT), un movimento bidirezionale ATP dipendente di treni di particelle polipeptidiche localizzato tra la membrana flagellare e i doppietti microtubulari periferici. I treni IFT sono necessari per l’assemblaggio ed il mantenimento, così come per la funzione sensoria, di tutte le ciglia primarie (non motili) e delle ciglia motili.

Analisi biochimiche e molecolari sulle particelle IFT hanno fornito una notevole quantità di informazioni mentre non molto si sapeva riguardo l’ultrastruttura dei complessi IFT, fino a quando abbiamo pubblicato nel 2009 la prima analisi ultrastrutturale 3D ad alta risoluzione, utilizzando analisi di tomografia elettronica di sezioni flagellari provenienti da cellule di Chlamydomonas sottoposte a flat embedding. Analizzando attentamente flagelli da cellule vegetative, abbiamo identificato due tipologie di treni che differiscono per lunghezza e ultrastruttura: treni lunghi più sottili e treni corti più compatti, ciascuno con una caratteristica periodicità interna. Al fine di capire se le differenze strutturali tra le due tipologie di treni IFT possano essere correlate a differenti funzioni, abbiamo quantificato il numero di treni lunghi e corti in flagelli in rigenerazione del ceppo wt 137c e in flagelli in riassorbimento del ceppo temperatura sensibile pf1fla10-1 che, quando incubato a 32°C manca di una subunità del motore molecolare responsabile del IFT retrogrado. Le prime evidenze rivelano che i treni lunghi potrebbero avere un ruolo predominante nel trasporto anterogrado mentre la quantità di treni corti per flagello sembra non essere correlata nè alla rigenerazione flagellare nè al riassorbimento. Ulteriori analisi sono necessarie per capire questo sistema, che si sta rivelando molto più complesso di quanto predetto sulla base dei dati molecolari e biochimici, nonché come dimostrato da recenti studi. Nuovi dati provengono dalla ricostruzione tridimensionale di complessi corti, ottenuti tramite una nuova strategia di allineamento sviluppata ad hoc in collaborazione con il gruppo di ricerca del professor Salvatore Lanzavecchia, Università di Milano. Questi treni presentano due link al subtubulo B del doppietto microtubulare. I suddetti link sono connessi a un dominio basale elettrondenso dal quale si estendono alcune densità fino a connettersi alla membrana flagellare. Un altro aspetto che stiamo affrontando è l’analisi ultrastrutturale di particelle IFT isolate. Siamo riusciti a sviluppare un nuovo protocollo di estrazione che ci ha permesso di ottenere stringhe native di treni IFT isolati. La marcatura mediante immunogold di questo materiale ha dimostrato per la prima volta che entrambi i subcomplessi A e B sono presenti nei treni IFT. Oltre a queste evidenze, il nostro nuovo protocollo di isolamento ci fornirà materiale appropriato per ulteriori analisi strutturali delle connessioni dei complessi A e B all’interno dei treni dall’utilizzo di procedure di imaging ad alta risoluzione. Abbiamo inoltre appena intrapreso la analisi strutturale dei cambiamenti conformazionali di treni IFT lunghi e corti che avvengono al tip flagellare e alla zona di transizione, il punto selettivo che controlla il traffico di componenti flagellari tra il citoplasma e il comparto flagellare.

(1) Mario Negri Institute for Pharmacological Research, Clinical Research Center for Rare Diseases Aldo e Cele Daccò, via Camozzi 3, 24020 Ranica (BG), Italy, Tel. 035.4535362, Fax +39.035.4535377, E-mail: marina.noris@marionegri.it (2) Department of Internal Medicine and Division of Nephrology, Ospedale la Carità, Locarno, Switzerland (3) Department of Nephrology and Dialysis, Azienda Ospedaliera Ospedali Riuniti di Bergamo, Bergamo, Italy

La Glomerulonefrite Membranoproliferativa (GNMP) primaria è una malattia renale rara che si manifesta nel 4-7% dei casi di sindrome nefrosica, colpisce soprattutto bambini e spesso progredisce in insufficienza renale terminale. GNMP è caratterizzata da ipocomplementemia e istologicamente da espansione mesangiale diffusa dovuta a proliferazione capillare, aumento della matrice mesangiale ed ispessimento capillare. Sono stati descritti diversi tipi di GNMP in base a studi di immunofluorescenza, caratteristiche ultrastrutturali e profilo del complemento: GNMP tipo I (la forma più comune), tipo II, tipo III e glomerulonefrite a depositi di C3 (C3GN).

Nel 2006 è stato istituito presso il Centro di Ricerche Cliniche per le Malattie Rare un Registro italiano di Glomerulonefrite Membranoproliferativa primaria con i seguenti obiettivi: raccogliere i dati clinici dei pazienti, studiare le anomalie genetiche/biochimiche e fornire il miglior approccio terapeutico.

Più di 130 casi di GNMP (età 1-80 anni), provenienti da 20 Unità di Nefrologia, sono stati inclusi nel Registro: 34 pazienti con GNMP I, 28 con GNMP II, 4 con GNMP III, 18 con C3GN, 35 con un quadro di GNMP non definito e 13 con GNMP sovrapposta a microangiopatia trombotica.

In molti pazienti sono stati osservati livelli persistentemente bassi di C3 e nel 40% è risultata positiva l’attività del fattore nefritico C3NeF. Nel 10.6% dei pazienti sono state identificate mutazioni in geni predisponenti la Sindrome Emolitico Uremica atipica, codificanti per: Fattore H (CFH, 5.3%), Fattore I (CFI, 3.1%), Proteina Cofattore di Membrana (MCP, 1.3%), componente C3 del complemento (C3, 1.5%). Gli attuali studi sono focalizzati sulle conseguenze funzionali delle anomalie genetiche e sull’identificazione di nuove mutazioni/varianti geniche che potrebbero predisporre alla GNMP, considerando che in molti pazienti la causa della malattia è ancora sconosciuta. Data l’evidenza che GNMP è una malattia dovuta a iperattivazione del complemento, i geni candidati sono quelli codificanti per proteine del sistema del complemento.

Infine, il dosaggio del complesso terminale del complemento (sC5b9, vn 127-303 ng/ml) è risultato molto elevato nel 25% dei pazienti valutati (livelli >1000 ng/ml) e moderatamente elevato (livelli da 500 a 999 ng/ml) nel 13% dei pazienti. Questo marcatore di attivazione del complemento potrà essere usato per identificare i pazienti che potrebbero beneficiare del trattamento con Eculizumab, un anticorpo monoclonale che lega il C5 e inibisce la formazione del complesso litico terminale. A questo proposito, tra i pazienti con GNMP recentemente trattati con Eculizumab è stata osservata una buona risposta alla terapia solo in quei pazienti (due del nostro Registro) che prima del trattamento mostravano alti livelli di sC5b-9. Questi dati suggeriscono che l’Eculizumab potrebbe essere una terapia efficace in particolare nei pazienti con dimostrata iperattivazione della via terminale del complemento.

130

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

ABSTRACT N. 231

L’insufficienza ovarica precoce, o POF, è una patologia eterogenea con una rilevante componente genetica. Il progetto si propone da una parte di identificare nuovi geni responsabili del fenotipo POF e dall’altra di studiare la funzione di due geni, DIAPH2 e BMP15, e dell’allele premutato del gene FMR1, già associati a POF. Il coordinatore e il partner 2 si sono occupati di analisi di associazione su tutto il genoma (GWAS). La coorte Val Borbera e quella caso-controllo di pazienti POF e EM di origine italiana (NIDO) sono entrate fare parte di un consorzio internazionale (ReproGen Consortium) che si propone di studiare la genetica dell’età riproduttiva della donna. GWAs per l’età di menopausa, EM e POF sono stati completati e sono stati identificati 17 nuovi loci. Complessivamnete i nuovi loci aumentano il rischio di POF e EM più del maggiore fattore di rischio ambientale conosciuto, il fumo. Il coordinatore ha continuato lo studio funzionale del gene DIAPH2 in cellule di granulosa umane (hGC) e in ovaio di topo, dimostrando un ruolo rilevante di DIAPH2 nell’organizzazione del citoscheletro di hGC. Il partner 1 ha condotto un’analisi filogenetica sulla sequenza proteica di BMP15 in diverse specie. Da questa analisi sono emerse varianti del gene BMP15 sottoposte a pressione selettiva positiva nella specie umana ed è stato dimostrato che alcune che sono capaci di causare un significativo aumento del signalling BMP15-dipendente.

I dati permettono di ipotizzare che mutazioni che causano un’aumentata sintesi proteica o un aumento della stimolazione BMP15dipendente possano determinare l’insorgenza di POF, andando a influire sul delicato equilibrio dei fattori intra-follicolari e l’asse ipotalamo-ipofisi-ovaio nelle diverse fasi della follicolo genesi.

Ulteriori geni candidati per l’insorgenza della POF con un possibile ruolo nella funzionalità ovarica sono stati identificati dallo studio del trascrittoma indotto dallo stimolo di BMP15 in colture primarie di cellule della granulosa (GCs). BMP15 risulta inibire l’espressione di geni importanti a livello ovarico sia precocemente (FST) che più tardivamente (TGFB3R, STAR, LHCGR, SMAD3, ADAMTS1, FST) oltre a geni importanti nella regolazione dei processi proliferativi e antiapoptotici (BCOR, BCL6). La validazione di questi geni mediante PCR quantitativa permetterà di indagare i pathway fondamentali del signalling di BMP15 durante la follicologensi e, in futuro, lo screening mutazionale di questi geni in casistiche POF potrebbere fornire nuovi elementi per la comprensio Il partner 4 ha utilizzato un modello in vitro di cellule della granulosa ovarica che esprimono 70 ripetizioni CGG, dimostrando che numerose proteine, tra cui alcuni membri della famiglia delle ribonucleoproteine associate all’RNA eterogeneo nucleare (hnRNP M, hnRNP F, hnRNP H, hnRNP G) le RNA binding proteins Sam68 e SFPQ e due proteine appartenenti alla famiglia delle small heats shock (Hsp27 e CRYAB), sono in grado di interagire direttamente con ripetizioni riboCGG nel range della premutazione. In particolare è stato evidenziato un significativo aumento della proteina CRYAB nella frazione proteica insolubile che potrebbe riflettere una rilocalizzazione della proteina stessa a livello nucleare come risposta precoce allo stress cellulare indotto dalla espressione della ripetizione espansa. Inoltre, la vitalità delle cellule premutate della granulosa è significativamente ridotta suggerendo un ruolo tossico l’mRNA premutato di per sé stesso nelle ovaie.

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

GHIGGERI GIAN MARCO

Telethon grant N.

GGP08050

Totale €

355.700

Num Centri: 2

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2008

DETERMINANTI GENETICHE DELL’IPODISPLASIA RENALE NON SINDROMICA E FENOTIPI ASSOCIATI Sanna-Cherchi Simone (3), Bodria Monica (1), Scolari Francesco (4), Caridi Gianluca (1), Carrea Alba (1), Allegri Landino (2), Gharavi Ali G. (3), Ghiggeri Gian Marco (1) (1) UOC.di Nefrologia, Dialisi e Trapianto, Laboratorio di Fisiopatologia dell’Uremia, Istituto Giannina Gaslini, Largo G. Gaslini, 5 16148 Genova, Italy, Tel. +39.010.380742, Fax +39.010.395214, E-mail: GMarcoGhiggeri@ospedalegaslini.ge.it (2) Dipartimento di Medicina Clinica, Nefrologia e Scienze della Vita, Università di Parma, Parma, Italy (3) Division of Nephrology, Columbia University College of Physicians and Surgeons, New York, NY USA (4) Divisione di Nefrologia e Dialisi, Ospedale di Montichiari (BS), Università di Brescia, Italy

La diagnosi prenatale di malformazioni urogenitali rappresenta il 20% dei difetti diagnosticati alla nascita. Sono in essa incluse tutte le anomalie congenite del rene e delle vie urinarie (CAKUT) riscontrabili nel 40-50% di pazienti pediatrici e nel 7% degli adulti con insufficienza renale terminale, dialisi e trapianto. La scarsa conoscenza delle cause genetiche del CAKUT ne rende difficile una precoce identificazione e ne inficia potenziali attività terapeutiche atte a rallentarne l’evoluzione verso l’uremia.

In questo progetto sono stati utilizzate nuove tecnologie per l’identificazione di varianti rare che potessero caratterizzare una larga casistica di pazienti con ipodisplasia renale, una grave malformazione congenita appartenente al CAKUT. Sono stati utilizzati gli array ad alta densità (SNP array) per identificare varianti cromosomiche strutturali (delezioni, duplicazioni) mentre tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (Next-Gen Sequencing) sono state utilizzate per l’identificazione di varianti puntiformi nelle forme familiari di malattia.

Sono state identificati 72 distinte varianti o nuovi disordini genomici nel 16.6% dei pazienti sporadici (10.5% conosciuti e 6.1% rari o nuovi ) e una parte di questi erano associati a malattie neuropsichiatriche (DiGeorge/velocardiofacial syndrome, delezione 1q21, 2q37 e duplicazione del 17p11.2).

Tramite sequenziamento di nuova generazione su forme di CAKUT familiare abbiamo identificato mutazioni nel gene VUR1, un nuovo mediatore del segnale del fattore di crescita FGF, in circa il 3% dei pazienti affetti da malformazioni del tratto urinario.

Complessivamente, questi nuovi approcci genomici ci hanno permesso di identificare mutazioni patogeniche ed eseguire la diagnosi molecolare in un gran numero di pazienti, con implicazioni sulla consulenza genetica e personalizzazione del trattamento.

ABSTRACT N. 233 Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche

ABSTRACT N. 232

Responsabile

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

TONIOLO DANIELA

Telethon grant N.

GGP09126

Totale €

574.700

Num Centri: 4

Durata (anni): 3

ROSSI ANTONIO

Telethon grant N.

GGP11079

Totale €

174.200

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2011

CARATTERIZZAZIONE FUNZIONALE DEL RUOLO DELLA NUCLEOTIDASI 1 ATTIVATA DAL CALCIO (CANT1) NELLO SCHELETRO: UNO STUDIO IN VIVO CON UN MODELLO ANIMALE DI DISPLASIA DI DESBUQUOIS

Anno d’inizio: 2009

DELUCIDARE LE BASI GENETICHE DELLA MENOPAUSA PRECOCE E ALCUNI DEI MECCANISMI MOLECOLARI DELLA PATOLOGIA

Monti Luca (1), De Leonardis Fabio (1), Forlino Antonella (1), Tenni Ruggero (1), Huber Celine (2), Nizon Mathilde (2), Cormier-Daire Valerie (2), Rossi Antonio (1)

Toniolo Daniela (1,4), Persani Luca (2), Marozzi Anna (3), Rossetti Raffaella (2), Caslini Cecilia (3), Bione Silvia (4), Corre Tanguy (1), Sala Cinzia (1), Barbieri Caterina (1)

(1) Università di Pavia, Dipartimento di Medicina Molecolare, sez Biochimica, via Taramelli 3/B, 27100 Pavia, Tel.+39.0382.987229; Fax +39.0382.423108; E-mail: antrossi@unipv.it (2) University Paris Descartes, Dept. Genetics and INSERM U781, Hôpital Necker Enfants Malades, Paris, France

(1) San Raffaele Scientific Institute, Milano - VIA Olgettina 58, 20132 Milano.

Tel. +390226434764, Fax+390226434767,daniela.toniolo@hsr.it (2) Division of Endocrine and Metabolic Diseases & Lab. of Endocrine and Metabolic Research, Ospedale San Luca, IRCCS Istituto Auxologico Italiano, Milano (3) Dipartimento di Biologia e Genetica per le Scienze Mediche, Università di Milano (4) Institute of Molecular Genetics, CNR, Pavia

La displasia di Desbuquois (DD) è una grave condrodisplasia a trasmissione autosomica recessiva caratterizzata da ritardata crescita pre- e post-natale, dislocazione delle articolazioni e scoliosi. Due forme di DD sono state descritte in base alla presenza (tipo 1) o

131

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

assenza (tipo 2) di caratteristiche deformità delle mani. Nei pazienti con DD tipo I sono state identificate mutazioni nel gene della Nucleotidasi 1 Attivata dal Calcio (CANT1) (Huber C et al (2009) Am J Med Genet, 85, 706-710 e Nizon M et al (2012) Hum Mut, 33, 1261-66). CANT1 codifica per una nucleotidasi che idrolizza preferenzialmente UDP; due forme diverse dell’enzima sono state caratterizzate, ma la loro funzione deve essere ancora compresa: 1) una forma associata alle membrane del reticolo endoplasmatico e del Golgi. La localizzazione subcellulare ed il substrato preferenziale (UDP) suggeriscono che CANT1 sia coinvolta nella glicosilazione delle proteine e nel controllo di qualità; 2) una forma secreta e solubile che potrebbe essere coinvolta nella trasduzione del segnale mediata dai recettori pirimidinergici che appartengono alla proteine G. La DD ha caratteristiche fenotipiche comuni ad altre condrodisplasie caratterizzate da difetti nel metabolismo dei proteoglicani della cartilagine, le principali glicoproteine della cartilagine. Per valutare se il difetto in CANT1 interferisse con la disponibilità di UDP-zuccheri necessari alla sintesi dei proteoglicani, abbiamo marcato con [35S]solfato e [3H]glucosamina colture di fibroblasti provenienti da due pazienti affetti da DD, omozigoti rispettivamente per la mutazione p.R300H e p.P245RfsX3 e quattro controlli. Nelle cellule dei pazienti la sintesi dei glicosaminoglicani (GAGs) era quasi normale in condizioni basali, ma era significativamente ridotta quando le cellule erano incubate con beta-D-xiloside un composto che aumenta la sintesi delle catene di condroitin e dermatan solfato. La sintesi di acido ialuronico, che avviene sulla membrana plasmatica, un compartimento diverso da quello dei proteoglicani, era normale suggerendo quindi che la funzione di CANT1 è localizzata nel reticolo endoplasmatico e nel Golgi e che questo enzima è coinvolto nel metabolismo dei proteoglicani (Nizon M et al (2012) Hum Mut, 33, 1261-66). Per definire la funzione fisiologica di CANT1 ed il suo ruolo nella patogenesi della DD stiamo generando un modello murino knock-in di CANT1 che riproduce una mutazione già rilevata nella condizione di omozigosi in diversi pazienti affetti da DD tipo I. Tutti gli studi verranno condotti sul modello animale che intendiamo generare in quanto non sarebbero possibili per ragioni etiche sui pazienti e consentiranno una migliore comprensione della funzione di CANT1 e delle basi molecolari delle forme ereditarie di osteocondrodisplasie al fine di sviluppare nuove valide terapie.

coronaropatia rispetto ai familiari non affetti o ad un gruppo di 150 pazienti con PDB della stessa area geografica. I campioni di DNA di 6 membri affetti e 2 non affetti di questa famiglia sono stati analizzati tramite NimbleGen SeqCap EZ Exome™ capture kits (Roche) ed i frammenti risultanti sono stati sequenziati su una Illumina GAIIx (Illumina, San Diego, CA) con reads di 90 bp. Più di 50,000,000 reads con una copertura media di 50X sono state ottenute per ogni membro ed allineate alla sequenza di riferimento del genoma umano (GRCh37/hg19) con MAQ7 ed il software NextGENe v2.00 (SoftGenetics, State College, PA). Questo approccio ha consentito una copertura di più dell’88% delle regioni “target” con 10 o più reads.

Abbiamo poi combinato i dati di tutti gli individui per ottenere le varianti condivise. In tutto, 57 varianti codificanti non-sinonime erano condivise tra i campioni dei membri affetti e non erano presenti nei non affetti. Solo 32 (66%) di queste varianti sono state confermate tramite sequenziamento diretto, ma 24 di queste erano presenti nel database “1000 Genome”. Tra le 8 nuove varianti solo 3 presentavano segregazione completa con la malattia nella nostra famiglia.

Da notare che queste 3 varianti sono localizzate sul cromosoma 1, a livello di una regione associata alla malattia in una nostra precedente analisi di linkage.

Obiettivo 2: abbiamo analizzato più di 800 casi di PDB per la mutazione del gene SQSTM1 ed altre varianti polimorfiche di geni potenzialmente associati al PDB o alla risposta al trattamento con bisfosfonati, al fine di condurre un’analisi sia retrospettiva che prospettica. Le analisi di associazione saranno effettuate nel corso del secondo anno, alla fine del periodo di follow-up.

ABSTRACT N. 235 Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

221.000 Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2012

DIFETTI ENZIMATICI NELLA CONDRODISPLASIA PUNTATA RIZOMELICA: BIOCHIMICA E POSSIBILITÀ TERAPEUTICHE Mattevi Andrea, Nenci Simone, Piano Valentina Dipartimento di Biologia e Biotecnologie “L. Spallanzani”, Università degli Studi di Pavia, via Ferrata 9, 27100 Pavia, Tel. 0382.985534, Fax 0382.528496, Email: andrea.mattevi@unipv.it

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche GENNARI LUIGI

Telethon grant N.

GGP11119

Totale €

125.200

Num Centri: 2

GGP12007

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 234 Responsabile

MATTEVI ANDREA

Telethon grant N.

Durata (anni): 2

L’importanza dei perossisomi per il normale sviluppo e crescita dei mammiferi è evidenziata dall’esistenza di un gruppo eterogeneo di malattie genetiche, i disordini perossisomiali.

Tra i disordini perossisomiali dovuti alla disfunzione di un singolo enzima, la Condrodisplasia Puntata Rizomelica colpisce circa 1 individuo su 100000, causando malformazioni scheletriche, ritardo mentale e morte infantile.

La RCDP presenta difetti nella sintesi di una particolare classe di fosfolipidi, caratterizzati da un legame etere (invece che estere) che connette la catena alchilica al carbonio in posizione 1 del glicerolo.

La maggior parte dei fosfolipidi eteri è costituita dai plasmalogeni.

Nella RCDP, l’insufficienza dei plasmalogeni può essere causata dalla disfunzione di due enzimi perossisomiali, che catalizzano il passaggio fondamentale nella biosintesi dei fosfolipidi eteri: la diidrossiacetone fosfato acil-transferasi (DHAPAT) e l’alchil-diidrossiacetone fosfato sintasi (ADPS). Il primo enzima catalizza l’acilazione del DHAP, che in seguito viene utilizzato dall’ADPS per sostituire la catena acilica con un acido grasso, generando il precursore di tutti i fosfolipidi eteri, l’alchil-DHAP (1).

L’obbiettivo del nostro lavoro è la comprensione degli aspetti biochimici e strutturali della flavoproteina perossisomiale ADPS, per esplorare la relazione genotipo/fenotipo delle mutazioni associate alla RCDP e mettere le basi per nuovi futuri approcci terapeutici.

A questo proposito, la proteina ricombinante ADPS di C. porcellus (95% di identità con la proteina umana) è stata espressa e purificata per eseguire prove di cristallizzazione, che hanno portato alla risoluzione della struttura cristallina dell’enzima.

In seguito abbiamo riprodotto e studiato cinque mutanti patologici, che incidono sul legame con il cofattore e/o con il substrato. Il punto chiave di questi esperimenti è che tutte le mutazioni inattivano completamente l’enzima, supportando l’idea che le mutazioni che causano la RCDP compromettono la biosintesi de novo dei fosfolipidi eteri.

L’analisi biochimica e strutturale ci ha permesso di ipotizzare un meccanismo di reazione inusuale per le flavoproteine, che è stato estensivamente studiato attraverso esperimenti di spettrofotometria e spettroscopia di massa e che risulta convergere nella formazione

Anno d’inizio: 2011

GENETICA E FARMACOGENETICA DELLA MALATTIA OSSEA DI PAGET Gianfrancesco Fernando (2), Formicola Daniela (2), Esposito Teresa (2), Rendina Domenico (3), Merlotti Daniela (1), Magliocca Sara (2), Muscariello Riccardo (3), Strazzullo Pasquale (3), Nuti Ranuccio (1), Gennari Luigi (1) (1) Department of Internal Medicine, Endocrine-Metabolic Sciences and Biochemistry, University of Siena, Policlinico Santa Maria alle Scotte, Viale Bracci, 53100 Siena, Tel. 0577.585364, Fax 0577.233446, E-mail: gennari@unisi.it (2) Institute of Genetics and Biophysics “Adriano Buzzati-Traverso”, CNR, Naples, Italy

La malattia ossea di Paget (PDB) è una patologia cronica invalidante con una forte componente genetica. Nonostante l’identificazione di mutazioni del gene SQSTM1 in più del 40% dei casi familiari, la patogenesi del PDB rimane in parte sconosciuta così come gli effetti delle mutazioni SQSTM1 sul fenotipo e sulla risposta al trattamento.

Gli obiettivi principali del nostro progetto sono i seguenti: 1) identificare un nuovo gene responsabile del PDB e del tumore gigantocellulare attraverso tecniche di next-generation sequencing in un ampio pedigree; 2) condurre uno studio di farmacogenetica sugli effetti delle mutazioni di SQSTM1 e di altre varianti genetiche associate, sulla risposta al trattamento con bisfosfonati.

Obiettivo 1: Abbiamo ulteriormente caratterizzato il fenotipo clinico del pedigree. Tutti i 14 membri affetti avevano un PDB poliostotico, ma i 4 soggetti che hanno sviluppato un tumore gigantocellulare presentavano una maggiore severità di malattia con una ridotta risposta alla terapia con bisfosfonati ed una maggiore prevalenza di dolore osseo, deformità e fratture. Oltre ad una aumentata incidenza delle tipiche complicanze pagetiche, i membri affetti di questa famiglia presentavano anche una prevalenza 5 volte maggiore di

132

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

di un addotto covalente con il substrato, per permettere lo scambio acile/alchile (2).

Recentemente, abbiamo esteso il nostro interesse verso l’enzima DHAPAT, che si ipotizza interagire e formare un complesso eterotrimerico con l’enzima ADPS in vivo. Per questa ragione, la caratterizzazione di DHAPAT e la riproduzione in vitro del complesso proteico potrebbero essere determinanti per comprendere meglio gli aspetti biochimici e strutturali dell’interazione che sta alla base del passaggio fondamentale nel processo di sintesi dei fosfolipidi eteri.

1. Ronald JA, Wanders RJ, Waterham HR. Biochemistry of mammalian peroxisomes revisited. Annu Rev Biochem. 2006;75:295-332 2. Nenci S, Piano V, Rosati S, Aliverti A, Pandini V, Fraaije MW, Heck AJR, Edmondson DE, Mattevi A. The precursor of ether phospholipids is synthesised by a flavoenzyme through covalent catalysis.

PNAS (in press). 2012

prodotti in osteoprogenitori umani mediante trasduzione stabile con GsaR201C. La DF è una disfunzione del controllo adrenergico del lineage stromale/osteogenico come sistema. Tutti i meccanismi da noi indentificati sono “druggable”.

ABSTRACT N. 237 Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

GGP09227 262.500

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Durata (anni): 2

Anno d’inizio: 2012

Lo Iacono Nadia (1,2), Marrella Veronica (1,2), Ficara Francesca (1,2), Poliani Pietro L (3), Traggiai Elisabetta (4), Kostenuik Paul (5), Blair Harry (6), Villa Anna (1,2), Sobacchi Cristina (1,2)

BIANCO PAOLO

Totale €

123.000

SOMMINISTRAZIONE DI RANKL E TRAPIANTO DI CELLULE MESENCHIMALI STAMINALI COME APPROCCI TERAPEUTICI PER L’OSTEOPETROSI RANKL-DIPENDENTE

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Telethon grant N.

GGP12178

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 236 Responsabile

SOBACCHI CRISTINA

Telethon grant N.

(1) CNR-IRGB, Milan Unit, via Manzoni 113, 20089 Rozzano, Milan, Italy, Tel. +39.02.82245164, Fax +39.02.82245191, E-mail: cristina.sobacchi@humanitasresearch.it (2) Humanitas Clinical and Research Center, Rozzano, Milan, Italy (3) University of Brescia, Brescia, Italy (4) Istituto G. Gaslini IRCCS, Genoa, Italy (5) Metabolic Disorders Research Unit, Amgen Inc, Thousand Oaks, USA (6) University of Pittsburgh, Pittsburgh, USA

Anno d’inizio: 2009

DISPLASIA FIBROSA POLIOSTOTICA - MODELLI DI MALATTIA E MODELLI DI TERAPIA Riminucci Mara (1), Saggio Isabella (2), Remoli Cristina (1), Cersosimo Stefania (1), Sacchetti Benedetto (1), Spica Emanuela (1), Astrologo Letizia (1), Gehron Robey Pamela (3), Davis Graham (4), Holmbeck Kenn (3), Boyde Alan (4), Piersanti Stefania (2), Comite Paola (1), Michienzi Stefano (1), Bianco Paolo (1)

L’Osteopetrosi Autosomica Recessiva (ARO) è una malattia genetica rara dell’osso che si presenta nei primi anni di vita con estrema sclerosi dello scheletro, difetti ematologici e neurologici. L’ARO è spesso letale a causa di anemia e infezioni secondarie, e il trapianto di cellule staminali ematopoietiche (HSCT) rimane l’unica terapia.

Finora, l’ARO RANKL-dipendente è l’unica forma in cui il difetto non è intrinseco alla linea ematopoietica e non può quindi essere corretto dal trapianto. Per individuare una terapia efficace per questo sottogruppo di pazienti, abbiamo testato gli effetti della somministrazione sottocutanea di 1 mg/kg di RANKL a topi Rankl-/- dall’età neonatale ogni 48 ore.

Dopo 1 mese, il fenotipo osseo dei topi Rankl-/- trattati è stato corretto e difetti secondari legati alla malattia, come l’ematopoiesi extramidollare, sono stati notevolmente migliorati, con un significativo aumento della cellularità del midollo osseo e un miglioramento importante della struttura della milza e delle varie popolazioni cellulari. Questo regime di trattamento sembra essere ben tollerato, senza evidenti effetti avversi durante il mese di terapia.

D’altra parte, la somministrazione di 1 mg/kg di RANKL a topi Rankl-/- per 3 mesi causa eccessiva stimolazione del riassorbimento osseo, marcata riduzione del contenuto minerale, allargamento di aggregati linfoidi, formazione di essudati polmonari con riduzione della funzione polmonare e morte di tutti i topi trattati.

Nel complesso, abbiamo dimostrato che il trattamento a breve termine con RANKL corregge il difetto osseo in topi Rankl-/- senza effetti collaterali importanti; i problemi di sicurezza sollevati dal trattamento eccessivo nei topi ha evidenziato l’importanza di un attento monitoraggio nei pazienti con questa terapia.

Nonostante i risultati incoraggianti, a causa del numero limitato di individui che trarrebbero beneficio da questa terapia, dei costi e delle regole complesse che regolano la somministrazione di farmaci non approvati, non siamo riusciti ad ottenere RANKL GMP per la terapia nell’uomo. Quindi, in base alla nostra esperienza sulla terapia cellulare in modelli murini (Frattini et al, 2005; Panaroni et al, 2009; Tondelli et al, 2009) e ai risultati positivi già riportati sul trapianto di cellule staminali mesenchimali (MSCT) in pazienti affetti da Osteogenesi Imperfetta (Horwitz et al, 2002; Le Blanc et al, 2005), abbiamo deciso di valutare anche questo approccio in topi Rankl-/-. Se i nostri risultati preclinici saranno incoraggianti, potremo facilmente passare al livello clinico, grazie alla collaborazione con la Stem Cell Factory dell’Ospedale San Gerardo (Monza).

Ad oggi, abbiamo prodotto 2 linee di MSCs da modollo osseo di topi C57BL/6J GFP+ e C57BL/6J 6RFP+.Queste cellule saranno utilizzate per MSCT neonatale e in utero; studieremo gli effetti su ossa, organi linfoidi (timo, milza, linfonodi) e altri organi potenzialmente interessati (ad es., polmone, rene, fegato, cuore e cervello).

(1) Dipartimento di Medicina Molecolare, Università La Sapienza, Roma, Viale Regina Elena 324, 00161 Roma, Italy, Tel. + 39.06.4441049, Fax +39.06.4461972, E-mail: paolo.bianco@uniroma1.it (2) Dipartimento di Genetica e Biologia Molecolare, Università La Sapienza, Roma, Italy (3) NIDCR, NIH, Bethesda MD, USA (4) Queen Mary’s, University of London, UK

La Displasia Fibrosa (OMIM174800) è una grave malattia invalidante dello scheletro causata da mutazioni attivanti del gene Gsa. Modelli animali, a lungo mancati, sono indispensabili per comprenderne i meccanismi e per sviluppare terapie razionali. Abbiamo generato e caratterizzato estensivamente multiple linee transgeniche di topi in cui il gene malattia, GsaR201C, è espresso costitutivamente, o selettivamente in specifici tipi cellulari dell’ambiente osseo. Abbiamo cosi’ ottenuto un quadro della biologia della malattia interamente nuovo, dettagliato ed esteso, insieme a cruciali indicazioni terapeutiche. Primo, nel topo, l’espressione costitutiva di GsaR201C è compatibile con la trasmissione per linea germinale; dà luogo a una replica esatta della patologia ossea umana, ma ereditaria e independente da mosaicismo; non compromette lo sviluppo, la scheletogenesi e l’osteogenesi prenatale. Secondo, l’espressione della mutaziona targeted a osteoblasti non produce una replica della DF, bensi’ un fenotipo marcato di alta massa ossea, mediato dalla downregolazione di SOST, e fenocopia di disordini umani da mutazioni inattivanti di SOST (Van Buchem, Scelrosteosi). Tutti i caratteri patologici definenti la DF (osteolisi, fratture, osteomalacia, fibrosi) riflettono invece l’effetto della mutazione in compartimenti del lineage stromale/osteogenico diversi dall’osteoblasto maturo. Terzo, gli adipociti del midollo sono i colpevoli insospettati della deposizione di osso abnorme nella DF. Nel grasso (midollo, WAT, BAT) GsaR201C upregola UCP-1 e lipolisi termogenica, mimando l’effetto della stimolazione b-adrenergica nel grasso “beigè. Nell’osso, ne deriva la conversione di adipociti midollari (lineage stromale/osteogenico) in osteoblasti displastici. L’espressione ectopica dell’inibitore della mineralizzazione, MGP, hallmark di tali osteoblasti displastici, causa osteomalacia e fratture nella DF. MGP non è espressa in osteoblasti con espressione targeted di GsaR201C, ovvero derivati da progenitori normali; osteoblasti MGP+ possono originare solo da precursori mutati. Quarto, l’espressione della mutazione in osteoprogenitori perivascolari esprimenti ADRB2, ma non in osteoblasti esprimenti PTH1R, causa overespressione di RANKL in osteoprogenitori, ma non in osteoblasti maturi; osteoprogenitori mutati guidano osteoclastogenesi inappropriata, che causa osteolisi e fratture nell’osso DF. In osteoprogenitori WT, l’effetto è mimato dalla stimolazione del recettore ADRB2, ma non del recettore PTH1R. Quinto, la DF evolve attraverso fasi distinte dominate da meccanismi distinti, con distinte finestre di intervento terapeutico. Sesto, i meccanismi chiave identificati nel topo sono operanti nella DF umana, e ri-

133

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

ABSTRACT N. 238

L’espansione di triplette di DNA codificanti glutamina (Q) o alanina (A) è causa di gravi patologie come la corea di Huntington e la displasia cleidocranica. Tratti di poli-glutamina (polyQ) e -alanina (polyA) sono fisiologicamente presenti in molte proteine, talvolta in associazione, ma il loro allungamento nelle malattie da espansione causa aggregazione e disfunzione proteica, portando a danno o morte cellulare. I meccanismi strutturali e molecolari attraverso i quali tratti espansi di polyQ e polyA causano questi fenomeni sono compresi solo in parte.

Abbiamo recentemente osservato che i tratti di polyQ partecipano alla formazione di strutture supersecondarie alfa-elicali coiled-coil (CC) con un ruolo critico nell’innescare l’aggregazione e la tossicità di proteine con tratti di polyQ espansi. Il fatto che i tratti di polyA e polyQ coesistano spesso, anche in proteine associate a patologie da espansione, ci ha suggerito l’ipotesi che anche i tratti di polyA possano formare strutture CC importanti sia per la funzione delle proteine, sia per la loro aggregazione e disfunzione associate ad espansione.

Per provare questa ipotesi, abbiamo dapprima effettuato screening bioinformatici di proteomi umani e non umani per determinare l’occorrenza e la co-occorrenza di tratti polyA e polyQ, e la loro associazione con domini CC, osservando nei proteomi studiati una significativa associazione fra tratti polyA e polyQ, ed una significativa sovrapposizione dei tratti di polyA con domini CC. Per verificare sperimentalmente la propensità di tratti polyA a formare CC abbiamo sintetizzato peptidi con tratti di polyA di lunghezza fisiologica o patologica. Esperimenti di dicroismo circolare hanno mostrato come i tratti di polyA formino CC, e che tratti di lunghezza maggiore conferiscono ai CC aumentata stabilità. Esperimenti di cross-linking hanno mostrato come CC con polyA espansi formino polimeri che potrebbero innescare aggregazione in vivo.

Abbiamo quindi studiato in vivo il ruolo dei CC di polyA nella aggregazione, funzione e disfunzione delle proteine usando mutagenesi guidata dalla struttura nella proteina RUNX2 - un fattore trascrizionale con CC sia di polyQ che di polyA che causa la displasia cleidocranica in presenza di espansione del tratto di polyA. Abbiamo generato mutanti con incrementata o ridotta stabilità del CC di RUNX2 wild type (wt) o con tratto di polyA espanso. L’overespressione di questi mutanti in linee cellulari ha mostrato come la stabilità del CC di polyA, insieme a quella del CC di polyQ, abbia un ruolo critico nella regolazione della funzione di RUNX2 wt e nella aggregazione e disfunzione di RUNX2 con espansione.

Queste osservazioni indicano come strutture CC formate da tratti di polyA abbiano un ruolo fondamentale nella aggregazione, funzione e disfunzione delle proteine contenenti polyA, e supportano un modello CC unitario per le dinamiche strutturali delle proteine associate a malattie genetiche con espansione di tratti polyQ e polyA.

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

TETI ANNA MARIA

Telethon grant N.

GGP09018

Totale €

200.100

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2009

NUOVI APPROCCI TERAPEUTICI PER L’OSTEOPETROSI Cappariello Alfredo (2), Del Fattore Andrea (1,2), Rucci Nadia (1), Teti Anna Maria (1) (1) Dipartimento di Scienze Cliniche Applicate e Biotecnologie, Via Vetoio Coppito 2, 67100 L’Aquila, Tel. 0862.433513; Fax 0862.433523, E-mail: teti@univaq.it (2) Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Roma

Lo scopo di questo progetto è di sperimentare nuove terapie per due forme di osteopetrosi, rara malattia genetica che altera il riassorbimento osseo osteoclastico, causando addensamento e fragilità delle ossa e gravi deficit ematologici e neurologici. La prima forma, autosomica recessiva, è caratterizzata da assenza di osteoclasti ed è causata da mutazioni del gene TNFSF11, codificante la citochina osteoclastogenica RANKL. Abbiamo preparato camere di diffusione, che isolano le cellule ma consentono il flusso di molecole, ed in esse abbiamo inserito supporti 3D di idrossiapatite sulla cui superficie abbiamo adsorbito il dominio catalitico dell’enzima MMP-14 per consentire il rilascio della sequenza attiva del RANKL di membrana. Cellule esprimeni RANKL, ossia osteoblasti primari o cellule MC3T3 transfettate con RANKL, coltivate sul supporto 3D inserito nelle camere di diffusione, hanno rilasciato quantità misurabili di RANKL solubile. Abbiamo quindi impiantato le camere di diffusione nell’addome di topi RANKL knock-out (KO) di 21 giorni di età, i quali sono stati sacrificati dopo 30 giorni dall’impianto. Sezioni istologiche di tibie di topi di controllo erano del tutto negative alla colorazione istochimica per il marcatore degli osteoclasti TRAcP, a conferma della totale assenza della linea osteoclastica. Le tibie prelevate da topi impiantati mostravano invece cellule TRAcP-positive sia sulla superficie dell’osso che nel midollo osseo, condizione questa compatibile con l’induzione dell’osteoclastogenesi. Stiamo ora ottimizzando le procedure di impianto per ottenere un miglioramento fenotipico dei topi RANKL KO. La seconda forma di osteopetrosi, autosomica dominante, è causata da mutazioni in eterozigosi del gene CLC7, codificante le subunità omodimeriche dell’antiporto Cl-/H+ di tipo 7, indispensabile per il riassorbimento osseo. In cellule transfettate con CLC7 mutato abbiamo silenziato l’mRNA mutato trattando con siRNA altamente specifici, i quali sono invece risultati inefficaci nei confronti dell’mRNA normale sia in vitro che in xenotrapianti. Abbiamo quindi somministrato siRNA contro l’allele normale a topi WT ed abbiamo ottenuto una riduzione dose- e tempo-dipendente del trascritto CLC7 nella tibia ed in altri organi. Abbiamo anche trattato topi WT con siRNA diretti contro mRNA mutati, i quali si sono dimostrati del tutto inefficaci sul trascritto normale, a conferma della loro elevata specifità. Per analizzare in vivo i siRNA contro l’allele mutato, abbiamo generato un topo clc7-p.G213R knock-in (KI) recante l’omologo della più frequente mutazione umana (p.G215R). Analogamente ai pazienti, i topi clc7p.G213R KI mostrano un fenotipo osteopetrotico grave in omozigosi e più lieve in eterozigosi. Abbiamo selezionato in vitro siRNA contro la mutazione p.G213R i quali saranno ora somministrati ai topi clc7p.G213R KI eterozigotici per verificare la loro efficacia, specificità e capacità di migliorare il fenotipo osteopetrotico.

ABSTRACT N. 240 Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

GGP11223 147.300

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2009

Alessandro Terrinoni (1), Valeria Serra (1), Ernesto Bruno (1), Andreas Strasser (2,3), Elizabeth Valente (2), Hans van Bokhoven (4), Xin Lu (5), Richard A. Knight (6), Gerry Melino (1,6) (1) Biochemistry Laboratory IDI-IRCCS, c/o Department of Experimental Medicine and Surgery, University of Rome “Tor Vergata”, via Montpellier 1, 00133 Rome, Italy, Tel. +39.06.72596976, Fax +39.06.72596977; E-mail: melino@uniroma2.it (2) The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Parkville, Victoria, Australia (3) Department of Medical Biology, Melbourne University, Parkville, Victoria, Australia (4) Department of Human Genetics, Nijmegen Centre for Molecular Life Sciences, Radboud University Nijmegen Medical Centre, Nijmegen, The Netherlands (5) Nuffield Department of Clinical Medicine, Ludwig Institute for Cancer Research, University of Oxford, Oxford, UK (6) Medical Research Council, Toxicology Unit, Hodgkin Building, Leicester University, Leicester, UK

FIUMARA FERDINANDO

Totale €

223.000

SORDITÀ NEUROSENSORIALE IN PAZIENTI AFFETTI DA SINDROME EEC: RUOLO DI P63 NEI MECCANISMI DI APOPTOSI/DIFFERENZIAMENTO DEL NEUROEPITELIO COCLEARE

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Telethon grant N.

GGP09133

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 239 Responsabile

MELINO GENNARO

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2011

STRUTTURE COILED-COIL DI POLIALANINA REGOLANO AGGREGAZIONE, FUNZIONE E DISFUNZIONE DI PROTEINE ASSOCIATE A MALATTIE GENETICHE Pelassa Ilaria (1), Corà Davide (2), Fiumara Ferdinando (1) (1) Department of Neuroscience, Università degli Studi di Torino, Corso Raffaello 30, 10125 Torino, Tel. 011.6708486, E-mail: ferdinando.fiumara@unito.it (2) Center for Molecular Systems Biology, Università degli Studi di Torino, Torino

Le displasie ectodermiche (ED), sono malattie autosomico-dominanti caratterizzate da anomalie cranio-facciali, degli arti e di alcune ghiandole. Mutazioni eterozigoti del gene p63 sono state riscon-

134

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

trate nei pazienti affetti da sindromi definibili come EEC-simili, ma precedentemente conosciute con nomi diversi (EEC, AEC, ADULT, RHD), infatti è stato dimostrato che le differenze riscontrabili sono dovute a mutazioni in specifici domini di p63. Inoltre recentemente, è stato dimostrato che alcuni di questi pazienti soffrono di sordità neurosensoriale, o conduttiva di diverso grado. Al momento non sono presenti cure per i pazienti affetti da queste malattie. p63 è un membro della famiglia genica di p53, codifica sei diverse proteine.

Le isoforme trascrizionalmente attive (TA) possono attivare molti dei geni bersaglio di p53, inducendo apoptosi e arresto della proliferazione cellulare. Al contrario le isoforme mancanti dell’estremità amino-terminale (DeltaN), sono molto importanti nelllo sviluppo dell’epidermide e nel mantenimento del potenziale proliferativo dei cheratinociti. p63 è espresso nello strato basale dell’epidermide e nella cresta ectodermica apicale, un epitelio essenziale per la morfogenesi dell’arto. Il fenotipo dei topi che presentano una delezione del gene p63, hanno dimostrato che esso è un importante regolatore trascrizionale dell’embriogenesi. Per capire il ruolo di p63 nella fisiopatogenesi della sordità in questi pazienti, abbiamo utilizzato modelli di topi in cui il gene è stato ablato (p63 -/-).

Gli studi trascrizionali in vitro e quelli sugli animali, hanno dimostrato che l’isoforma TAp63 è in grado di regolare diversi geni coinvolti nello sviluppo del neuroepitelio cocleare. In particolare abbiamo identificato il gene Hes-5, appartenente al pathway di Notch, come principale target di p63. nel topo p63-/-, l’assenza di induzione di Hes5 determina un incremento del numero delle cellule ciliate cocleari, e quindi una modificazione della funzionalità dell’organo del Corti. I nostri studi hanno poi dimostrato che il difetto dello sviluppo del neuroepitelio cocleare è dovuto ad un eccessivo differenziamento di cellule di supporto in cellule ciliate, e non ad un difetto di apoptosi di queste ultime. I nostri dati quindi dimostrano che TAp63 è fondamentale per lo sviluppo dell’organo del Corti. La scoperta che la sordità neurosensoriale riscontrata nei pazienti con EEC sindrome è associata alla funzione di p63 determina che questo gene deve essere annoverato tra quelli responsabili di sordità a base genetica.

desmoplachina. In linea con la ridotta funzione desmosomiale, i cheratinociti mutanti AEC hanno una ridotta capacità di resistere alle sollecitazioni meccaniche, difetto che è stato alleviato con la somministrazione di inibitori del recettore del fattore di crescita dell’epidermide (EGFR) noto per stabilizzare i desmosomi. La ridotta resistenza meccanica derivante dalle mutazioni nel gene p63 può quindi essere alleviata farmacologicamente aumentando l’adesione desmosomiale con possibili implicazioni terapeutiche.

Il nostro studio rivela che p63 è un regolatore fondamentale di geni che promuovono la crescita cellulare e la staminalità, e i contatti cellulari, e che queste funzioni sono compromesse nella sindrome di AEC.

ABSTRACT N. 242 Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

GGP12239 259.700

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2011

Merlo Giorgio R. (1), Guerrini Luisa (2), Antonio Costanzo (3) (1) Dept. of Molecular Biotechnology and Health Sciences, University of Torino, Via Nizza 52, 10126 Torino, Tel. +39.011.6706449, Fax. +39.011.6706432, E-mail: gmerlo@dti.telethon.it (2) Dept. of Biosciences, University of Milano, Italy (3) Dept. of Dermatology, University of Rome “Tor Vergata”, Rome, Italy

Questo progetto definisce le regolazioni molecolari a monte e a valle di p63, molecola chiave per lo sviluppo ectodermico, mutata nella malattia congenita Ectodermal Dysplasia-Ectrodactyly-Cleft Palate (EEC). Stiamo studiando la funzione di specifici bersagli di p63 tessuto-specifici di (Dlx5, Irf6, Pin1, Ikka) mediante genetica funzionale. Le nuove conoscenze sulle vie regolative legate a p63 saranno usate per a) identificare dei bersagli farmacologici per la correzione precoce dei difetti degli arti/palato/pelle, b) per intraprendere un approccio di gene delivery, ponendo quindi le basi per la correzione delle dismorfologie che caratterizzano la EEC e relativi disordini.

A monte di p63. La stabilità di p63 è controllata da diversi meccanismi post-trascrizionali e post-traslazionali, tra cui microRNAs, sumoilazione, fosforilazione, ubiquitinazione e, identificato recentemente, la peptidyl-prolyl isomerizazione. L’isomerasi Pin1 induce degradazione di p63, in vitro ed in vivo, e Pin1 risulta sotto il controllo di Dlx5/Dlx6, geni che causano ectrodattilìa nel topo e nell’uomo. La stabilità di p63 è anche controllata da Irf6, il quale è a sua volta target di p63, costituendo un loop regolativo essenziale per la morfogenesi della pelle e la differenziazione cheratinocitaria.

A valle di p63. Abbiamo identificato Irf6, Ikka, e Dlx5/Dlx6, ed ulteriormente identificato Wnt5a a valle di Dlx5/Dlx6. Stiamo caratterizzando funzionalmente questi geni e verificando la loro capacità di correggere i difetti di arti e palato, in vivo. Stiamo usando i modelli di topo di EEC (p63R279H), di SHFM (Dlx5;Dlx6) e di Van-der-Woude (Irf6R84C), e generando linee di topi transgenici ri-esprimenti i target regolati negativamente. Da incrocio di queste linee murine, otterremo informazioni sulla potenziale rilevanza terapeutica dei pathways identificati.

Essendo localizzato sulla superficie dell’embrione, l’ectoderma è facilmente accessibile a vettori di trasduzione virali e non-virale, a bio-molecole diffusibili o molecole di sintesi. Siamo in grado di realizzare colture in vitro di arti e di palato embrionali, normali e mutanti, da usare per testare strategie terapeutiche usando i targets di p63 e le molecole segnale FGF/BMP come paradigma per intervenire sui tessuti malati. Per testare l’approccio gene-delivery, culture di arti e palato saranno trasdotte con Pin1 e Ikka (arti) e Irf6 (palato e pelle) attraverso vettori lentivirali. In un secondo paradigma, verranno testate le molecole diffusibili FGFs e TGFb/BMPs, trovate a valle di Irf6/Ikka, applicandole alle culture di tessuti embrionali e fornendo quindi una dimostrazione-di-principio per affrontare uno screening di composti per un intervento biochimico.

Complessivamente, combinando le conoscenze attuali e neogenerate, speriamo di fornire evidenze sperimentali per il ripristino delle funzioni dei target di p63 tessuto-specifici e dimostrare la fattibilità di un recuperare del normale sviluppo.

MISSERO CATERINA

Totale €

489.800

TRASFERIRE LE CONOSCENZE SUL RUOLO DEL GENE MALATTIA P63 DURANTE LO SVILUPPO EMBRIONALE ALLA POSSIBILITÀ DI RIPRISTINARE LO SVILUPPO NORMALE IN MODELLI DI COLTURE DI TESSUTO E IN VIVO

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Telethon grant N.

GGP11097

Totale € Num Centri: 3

ABSTRACT N. 241 Responsabile

MERLO GIORGIO ROBERTO

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2012

STUDIO DEI MECCANISMI COINVOLTI NEI DIFETTI CUTANEI CARATTERIZZANTI LA SINDROME DI HAY-WELLS Missero Caterina (1), Ferone Giustina (1), Mollo Maria Rosaria (1), Thomason Helen (2), Dixon Jill (2), Zhou Huiqing (3), van Bokhoven Hans (3), Antonini Dario (1) (1) CEINGE Biotecnologie Avanzate, via G. Salvatore 486, 80145 Napoli, Italy, Tel. +39.081.3737853, Fax +39.081.3737808, E-mail: missero@ceinge.unina.it (2) Faculty of Medical and Human Sciences, Manchester Academic Health Sciences Centre, University of Manchester, Manchester, UK (3) Department of Human Genetics, Nijmegen Centre for Molecular Life Sciences, Radboud University Nijmegen Medical Centre, Nijmegen, NL

La sindrome di Hay-Wells (AEC syndrome) è una malattia autosomica dominante caratterizzata da palatoschisi, displasia ectodermica, e gravi erosioni cutanee alla nascita. La sindrome è causata da mutazioni nel gene p63, che codifica per un fattore di trascrizione essenziale per lo sviluppo cutaneo. Nel nostro laboratorio è stato recentemente generato un modello murino knock-in (p63+/L514F) portatore di una mutazione puntiforme clinicamente rilevante in p63, che ricapitola fedelmente i sintomi della malattia nell’uomo.

Utilizzando questo modello murino abbiamo riscontrato che la mutazione AEC funge da dominante negativo sulla proteina di p63 “sana” riducendo l’espansione delle cellule staminali della cute. Questi difetti dipendono dalla riduzione di due recettori di fattori di crescita FGFR2 e FGFR3, geni regolati direttamente da p63. I dati ottenuti sono stati confermati anche nei pazienti affetti dalla sindrome di AEC e in modelli murini deleti per FGFR2 in cui sono stati riscontrati difetti nelle cellule staminali. Il ripristino dell’espressione del recettore FGFR2 nelle cellule epiteliali portatrici della mutazione di p63 L514F riattiva la crecita cellulare.

Inoltre abbiamo dimostrato che la fragilità cutanea riscontrata nella sindrome di AEC e nel modello murino della sindrome è associata a ridotti contatti tra le cellule (desmosomi), a causa della ridotta espressione di geni coinvolti in questi contatti, quali le caderine e la

135

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

ABSTRACT N. 243

care nuovi meccanismi molecolari attraverso i quali l’iperattivazione della via di RAS influenza lo sviluppo e la crescita post-natale, e di generare strumenti da utilizzare per una corretta diagnosi e gestione del paziente, e modelli cellulari per l’identificazione di nuovi target terapeutici e lo sviluppo di farmaci.

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

TARTAGLIA MARCO

Telethon grant N.

GGP10020

Totale €

231.700

Num Centri: 1

Durata (anni): 2

Anno d’inizio: 2010

ABSTRACT N. 244 Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche

BASI MOLECOLARI DELLA SINDROME DI NOONAN E DI MALATTIE GENETICHE CORRELATE

Responsabile

Martinelli Simone (1), Flex Elisabetta (1), Fodale Valentina (1), Pantaleoni Francesca (1), Stellacci Emilia (1), Carta Claudio (1), Motta M. Letizia (1), Cianetti Luciano (1), Cordeddu Viviana (1), Caputo Viviana (1), Ciolfi Andrea (1), Niceta Marcello (1), Zampino Giuseppe (2), Digilio Maria C (3), Selicorni Angelo (4), Mazzanti Laura (5), Rossi Cesare (6), Lepri Francesca (3), De Luca Alessandro (7), Ferrero Giovanni B (8), Nardozza Aurelio P (9), Castagnoli Luisa (9), Stella Lorenzo (9), Kutsche Kerstin (10), Lemischka Ihor (11), Cavé Helene (12), Ahmadian M Reza (13), Zenker Martin (14), Dallapiccola Bruno (3), Gelb Bruce D (11), Tartaglia Marco (1)

CESARENI GIANNI

Telethon grant N.

GGP09243

Totale €

254.600

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2009

DIMERIZZAZIONE DI SHP-2: UN MECCANISMO REGOLATIVO ADDIZIONALE PER LA MODULAZIONE DELL’ATTIVITÀ DI SHP2 Nardozza Aurelio Pio (1), D’Orazio Melania (1), Santonico Elena (1), Trapannone Riccardo (1), Corallino Salvatore (1), Filomeni Giuseppe (1,2), Tartaglia Marco (2), Battistoni Andrea (1), Castagnoli Luisa (1), Cesareni Gianni (1,3)

(1) Dipartimento di Ematologia, Oncologia e Medicina Molecolare, Istituto Superiore di Sanità, Viale Regina Elena 299, 00161 Roma, Italy Tel. 06.49902569, Fax 06.49902850, E-mail: mtartaglia@iss.it (2) Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma, Italy (3) Ospedale Bambino Gesù, Roma, Italy (4) Università di Milano Bicocca, Monza, Italy (5) Policlinico S. Orsola-Malpighi, Bologna, Italy (6) Università di Bologna, Bologna, Italy (7) Istituto Mendel-IRCCS ‘‘Casa Sollievo della Sofferenzà’, Roma, Italy (8) Università di Torino, Torino, Italy (9) Università “Tor Vergata”, Roma, Italy (10) University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germany (11) Mount Sinai School of Medicine, New York, NY, USA(12) Hopital Robert Debrè, Paris, France (13) Heinrich-Heine University Medical Center, Düsseldorf, Germany (14) Institute of Human Genetics, University Hospital, Magdeburg, Germany

(1) University of Rome Tor Vergata, Via della ricerca scientifica, 00133 Rome, Italy, Tel. +39.06.72594315, Fax. +39.06.72594599, E-mail. Cesareni@uniroma2.it (2) Department of Hematology, Oncology and Molecular Medicine, Istituto Superiore di Sanità, Rome, Italy (3) IRCCS Fondazione Santa Lucia, Rome, Italy

La tirosin fosfatasi SHP-2 gioca un ruolo regolativo chiave nella modulazione della risposta cellulare ai fattori di crescita e alle citochine. Nell’ultimo decennio, l’integrazione di informazioni genetiche, biochimiche e strutturali ha aiutato nell’interpretazione delle conseguenze patologiche derivanti da alterazioni nella funzione di SHP-2.

Utilizzando approcci complementari, forniamo evidenze che SHP-2 endogena può dimerizzare attraverso al formazione di legami disulfide che potrebbero anche coinvolgere la cisteina catalitica. Mostriamo che la frazione di SHP-2 dimerica è modulata dalla stimolazione con fattori di crescita e dallo stato redox della cellula. La misurazione dell’attività fosfatasica delle forme monomerica e dimerica indica che quest’ultima è tre volte meno attiva, indicando quindi nel processo di dimerizzazione un meccanismo addizionale possibile per controllare l’attività di SHP-2. Sorprendentemente, dimeri formati da due mutanti di SHP-2, SHP-2E76K e SHP-2T468M, che sono alla base di distinte patologie umane e mostrano proprietà biochimiche diverse, hanno mostrato di rispondere differentemente alla stimolazione con EGF. Mentre il mutante SHP-2E76K iperattivo associato a leucemia reagisce all’EGF modulando il suo rapporto dimero/monomero con una cinetica confrontabile alla proteina wild type, è stato osservato che la formazione del dimero aumenta nel caso del mutante SHP-2T468M, noto per causare la sindrome di LEOPARD. Sebbene il meccanismo alla base di questa differenza nella risposta non possa essere ancora razionalizzato, questi risultati suggeriscono un possibile ruolo regolativo della dimerizzazione nella funzione di SHP-2.

La sindrome di Noonan (SN) rappresenta una delle più comuni malattie genetiche associate a difetti dello sviluppo e della crescita.

Questa condizione è causata dalla disregolazione del flusso del segnale intracellulare lungo la via RAS-MAPK, ed è geneticamente eterogenea. Nel corso dell’ultima decade, abbiamo dimostrato che mutazioni germinali di PTPN11, SOS1, KRAS, NRAS, BRAF, RAF1 e SHOC2 rappresentano la causa molecolare della SN nel 75% dei casi.

Nel progetto recentemente concluso ci siamo proposti i seguenti obiettivi: identificare nuovi geni-malattia, caratterizzare i meccanismi molecolari alla base della funzione aberrante delle proteine coinvolte, definire accuratamente l’impatto clinico delle mutazioni e identificare le relazioni genotipo-fenotipo.

Di seguito, presentiamo i risultati più rilevanti ottenuti nell’ambito del progetto.

Tramite un approccio basato sull’analisi di un pannello di geni candidati, abbiamo identificato mutazioni inattivanti nel gene onco-soppressore CBL, codificante una proteina adattatrice con attività E3 ubiquitin-ligasica, in una nuova condizione sindromica con spettro fenotipo riconducibile a quello caratteristico delle RASopatie (Martinelli et al. 2010, Am J Hum Genet, 87:250-7). L’uso della stessa strategia ha consentito più recentemente di scoprire un nuovo gene implicato nelle RASopatie che conferisce predisposizione allo sviluppo di disordini mieloproliferativi e leucemie (manoscritto in preparazione).

Gli studi condotti hanno consentito di fornire un quadro più accurato dello spettro mutazionale di SOS1, RAF1 e SHOC2, e del fenotipo associato (Lepri et al. 2011, Hum Mutat 32:760-72; due manoscritti in preparazione).

L’attività di ricerca è stata diretta alla caratterizzazione funzionale di un pannello di mutazioni di PTPN11 associate a SN (Martinelli et al.

2012, J Biol Chem 287:27066-77). Il lavoro sperimentale ha portato all’identificazione di nuovi meccanismi molecolari implicati nella disregolazione funzionale di HRAS nella sindrome di Costello e nella SN, e ha consentito di identificare i domini che controllano la localizzazione di SHOC2 nella cellula e quelli implicati nella localizzazione costitutiva della proteina mutata in membrana (Gremer et al.

2010, Hum Mol Genet 19:790-802 e due manoscritti in preparazione).

Infine, abbiamo contribuito a generare cellule iPS da pazienti con sindrome LEOPARD (Carvajal-Vergara et al. 2010, Nature 465:80812), SN (Mulero-Navarro et al. 2012, Nature, sotto revisione) e altre RASopatie (manoscritto in preparazione).

Complessivamente, le ricerche condotte hanno permesso di identifi-

ABSTRACT N. 245 Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

TALORA CLAUDIO

Telethon grant N.

GGP12264

Totale €

252.600

Num Centri: 3

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2012

DEREGOLAZIONE DEL CALCIO E STRESS-OSSIDATIVO: DAI MECCANISMI MOLECOLARI ALLE IMPLICAZIONI TERAPEUTICHE NELLA PATOLOGIA DI HAILEY-HAILEY Biolcati Gianfranco (1), Aurizi Aurizi (1), Barbieri Barbieri (1), Palleschi Claudio (2), Zanni Elena (2), Uccelletti Daniela (2), Cialfi Samantha (3), Manca Sonia (3), Screpanti Isabella (3), Talora Claudio (3) Porphyria Center San Gallicano Institute IRCCS, Rome, Italy Dept. Biology and Biotechnology “C. Darwin”; Sapienza University of Rome (3) Dept. of Molecular Medicine, Sapienza University of Rome, Viale Regina Elena 291, 00161, Rome, Italy, Tel. +39.06.49255674, Fax +39.06.4464129, Email: claudio.talora@uniroma1.it

136

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

La malattia di Hailey-Hailey è una rara patologia dermatologica caratterizzata dalla formazione continua di vescicole, che rapidamente evolvono in erosioni soprattutto a livello delle pieghe del corpo.

Istologicamente la patologia è caratterizzata da discheratosi acantolitica. Alcune nostre osservazioni indicano che la manifestazione della malattia è caratterizzata da un aumento dello stress-ossidativo che influenza l’espressione di fattori, in particolare Notch1 e p63, che svolgono un importante ruolo nel controllo della proliferazione e del differenziamento dei cheratinociti. L’ alpha-Melanocyte-Stimulating hormone (a-MSH) è un ormone che oltre a regolare la pigmentazione svolge un ruolo antiossidante indipendentemente dalla sintesi di melanina. Considerando il ruolo importante dello stress-ossidativo nella manifestazione della patologia di Hailey-Hailey abbiamo analizzato il potenziale effetto antiossidante di un analogo dell’ aMSH (Nle4-D-Phe7-a-MSH) in pazienti affetti da HHD. Abbiamo inizialmente valutato l’effetto di questo analogo dell’alpha-MSH in colture primarie di cheratinociti derivati da lesioni di pazienti affetti da HHD. Abbiamo trovato che il trattamento con Nle4-D-Phe7-a-MSH contribuisce ad un aumento dell’espressione di Nrf2, un fattore trascrizionale importante nel controllo dei livelli di stress-ossidativo nella cellula. Inoltre, il trattamento con Nle4-D-Phe7-a-MSH, di cherationociti-HHD abolisce i difetti proliferativi di queste cellule. Nel loro insieme i nostri risultati indicano che Nrf2 è un importante bersaglio dell’ Nle4-D-Phe7-a-MSH. In considerazione delle proprietà antiossidanti dell’ Nle4-D-Phe7-a-MSH abbiamo testato il potenziale uso clinico di questo analogo dell’ a-MSH. In particolare l’Nle4-DPhe7-a-MSH (16 mg) è stato somministrato in uno studio pilota di fase II, in pazienti che presentavano lesioni croniche e recalcitranti.

Nei pazienti trattati abbiamo riscontrato il 100% della clearance delle lesioni dopo 60 giorni dalla prima somministrazione. La qualità della vita, testate attraverso il Dermatology Life Quality Index , era significativamente migliorata a 30 giorni dopo la prima somministrazione di Nle4-D-Phe7-a-MSH. In conclusione, Nle4-D-Phe7-aMSH è efficace per il trattamento delle lesioni HHD.

La cascata di eventi innescata dalle citochine infiammatorie (TNFalfa, IL1, etc) che convergono sull’attivazione di IKK, funzionano attraverso cambiamenti conformazionali che sembra derivino dall’ubiquitinazione di NEMO o dalla sua capacità di legare catene di poliubiquitina. TRAF6, la E3 ligasi responsabile della poliubuquitinazione non-degradativa di NEMO, partecipa al controllo dell’immunità, dell’osteoclastogenesi, dello sviluppo della pelle, e delle funzioni cerebrali.

Abbiamo caratterizzato la mutazione E57K, isolata in una paziente con una forma lieve di IP, in cui abbiamo osservato un ridotta risposta al IL-1, e abbiamo stabilito che una regione della proteina compresa tra aa57a e aa69 di NEMO è responsabile del legame a TRAF6, richiesto per l’attivazione di NF-kB. Questa regione in concerto con dominio NUB di NEMO, che lega le catene di poliubiquitina legate a TRAF6 (precedentemente da noi identificato), garantisce una specificità di riconoscimento tra NEMO e TRAF6.

Dopo stimolazione con TNF, il complesso IKK è reclutato al suo recettore e attiva NF-kappaB, che a sua volta induce la trascrizione di geni anti-apoptotici.

In assenza di NEMO, le cellule sono sensibili alla morte indotta dal TNF, processo alla base dell’infiammazione osservata nel IP. Grazie all’analisi di mutazioni associate all’IP, in cui si osservava un difetto nell’attivazione di NF-kappaB che non conduceva a morte cellulare, abbiamo potuto stabilire un ruolo di NEMO nel prevenire la morte cellulare che non dipende da NF-kappaB.

ABSTRACT N. 246

IDENTIFICAZIONE DEI MECCANISMI MOLECOLARI ALLA BASE DEI DIFETTI DI SEGREGAZIONE DEI CROMOSOMI SESSUALI NEI MAMMIFERI: IL RUOLO DEL GENE SPO11

ABSTRACT N. 247 Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche GGP12189

Totale €

324.200 Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2012

URSINI MATILDE VALERIA

Telethon grant N.

GGP08125

Totale €

351.800

Num Centri: 3

Telethon grant N. Num Centri: 2

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

BARCHI MARCO

Responsabile

Durata (anni): 3

Sette Claudio, Barchi Marco University of Rome “Tor Vergata”, Department of Biomedicine and Prevention, section of Anatomy, Via Montpellier n.1, 00133, Roma, Italy, Tel.06.72596266, Fax 06.72596268, E-mail: marco.barchi@uniroma2.it

Anno d’inizio: 2008

ANALISI DEI MECCANISMI MOLECOLARI CHE COMPROMETTONO LA FUNZIONALITÀ DI NEMO NELLA PATOGENESI IP

Nella meiosi, la ricombinazione tra cromosomi omologhi è essenziale per garantire la loro corretta segregazione nella formazione gameti. Un componente chiave di questo meccanismo è la proteina SPO11, l’endonucleasi che introducendo doppi tagli nel DNA inizia la ricombinazione meiotica. Infatti, se il gene Spo11 viene eliminato, sia nel maschio che nelle femmina di topo, la segregazione cromosomica non avviene correttamente, con conseguente sterilità (Baudat F. et al., Mol Cell (6) 5, 2000). Nei mammiferi il gene Spo11 codifica per almeno due forme di splicing: Spo11-beta e Spo11-alfa (Keeney S. et al., Genomics (61) 2, 1999). Recentemente abbiamo generato un animale transgenico che esprime il cDNA di SPO11-beta sotto il promotore meiotico-specifico Xmr [XmrTg(Spo11-beta)], ed abbiamo dimostrato che tale proteina recupera il fenotipo sterile di topi Spo11-/- nelle femmine. Tuttavia nel maschio, l’espressione del transgene XmrTg(Spo11-beta) in assenza di Spo11 endogeno (animale “Spo11-beta only”) non supporta la corretta segregazione dei cromosomi XY. Come consequenza, la maggior parte degli spermatociti sono eliminati a metafase-I, e gli animali sono sterili (Kauppi L. et al., Sience (331) 6019, 2011). Questi risultati suggeriscono che SPO11-alpha ha un ruolo non ridondante, ed è necessaria per la corretta ricombinazione e segregazione dei cromosomi XY. Poichè la assenza di segregazione tra i cromosomi XY è meccanicisticamente simile a quello che avviene nei pazienti affetti dalla syndrome di Klinefelter (cariotipo XXY), i nostri risultati suggeriscono che alterazioni nella espressione delle isoforme di SPO11, potrebbero essere implicate nella patogenesi della malattia di Klinefelter, ed in quelle sindromi di origine paterna, caratterizzate dal difetto di segregazione dei cromosomi sessuali (ad esempio individui XYY o XO).

In questo studio ci proponiamo quindi di capire il potenziale ruolo di SPO11 nella patogenesi delle sindromi caratterizzate dalla non-disgiunzione dei cromosomi sessuali nel maschio. A tale fine genereremo topi geneticamente modificati per studiare la funzione delle isoforme di splicing di SPO11 nel corso della meiosi. Inoltre cercheremo gli interattori molecolari della proteina SPO11, noti nel lievito, ma largamente sconosciuti nei mammiferi. Nello specifico il progetto si pone i seguenti obbiettivi: Obbiettivo 1 (coordinatore): generazione di topi che esprimono la

Pescatore Alessandra (1), Fusco Francesca (1), Leonardi Antonio (2), Vito Pasquale (3,4), Ursini Matilde Valeria (1) (1) Human Molecular Genetics Laboratory, Institute of Genetics and Biophysics “A. Buzzati-Traverso” CNR, Via P. Castellino 111, 80125 Naples, Italy Tel.+39.081.6132262, Email: ursini@igb.cnr.it (2) Dipartimento di Biologia e Patologia Cellulare e Molecolare, “Federico II,” University of Naples, Naples, Italy (3) Dipartimento di Scienze Biologiche ed Ambientali, Università degli Studi del Sannio, Benevento, Italy (4) Biogem Consortium, Ariano Irpino, Italy

L’Incontinentia pigmenti (IP, OMIM#308300) è un disordine Xlinked, letale nei maschi, che colpisce tessuti di origine neuroectodermica. E’ causata da mutazioni del gene NEMO localizzato sul cromosoma X. L’architettura del locus presenta una elevata frequenza di micro/macro-omologie, di ripetizioni in tandem, e di ripetute che possono favorire anomali meccanismi di ricombinazione e/o di replicazione del DNA producendo alleli patologici.

Sono qui presentati gli ultimi risultati del nostro progetto Telethon, che hanno migliorato la diagnosi molecolare di IP, un pre-requisito indispensabile per prevenzione e applicazione di specifiche terapie.

Abbiamo dimostrato che estese delezioni genomiche possono derivare da meccanismi di NAHR, NHEJ, FoSTeS, MMBIR e conversione genica. Questi eventi si verificano durante la meiosi e/o la mitosi e possono coinvolgere oltre NEMO anche altri geni contigui, come G6PD. In questi casi le pazienti IP non mostrano segni clinici derivati da deficit di G6PD. NEMO é la subunità regolatrice del complesso IKK, essenziale per l’attivazione di NF-kappaB, fattore di trascrizione che controlla l’immunità, regola la sopravvivenza, il differenziamento e la proliferazione cellulare.

Oltre alle delezioni che causano una totale perdita di funzione di NEMO, abbiamo identificato mutazioni missenso. L’analisi molecolare di queste mutazioni ci ha permesso di comprendere meccanismi di regolazione del complesso IKK, dipendenti da NEMO.

137

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

ABSTRACT N. 249

proteina Spo11-alfa nel background genetico Spo11-/-. Il fenotipo di questi animali sarà analizzato in dettaglio, studiando i difetti della segregazione degli autosomi e dei cromosomi sessuali.

Obbiettivo 2 (coordinatore): analisi della segregazione dei cromosomi XY negli spermatozoi di topi che esprimono la isoforma di splicing di Spo11-beta o di Spo11-alfa nel background genetico Spo11/-.

Obbiettivo 3 (coordinatore/partner 1): identificazione dei partner funzionali di Spo11-beta e Spo11-alfa. La loro identificazione potrebbe mettere in luce nuovi meccanismi alla base dei difetti di segregazione dei cromosomi sessuali.

Obbiettivo 4 (partner 1): identificazione dei fattori che modulano lo splicing di Spo11 nel testicolo di topo. Tramite l’utilizzo del minigene di Spo11, identificheremo i fattori di splicing (espressi nel testicolo) in grado di regolare lo splicing di Spo11. Inoltre, usando modelli animali che sono difettivi nella segregazione dei cromosomi XY, o che sono difettivi nella espressione dei fattori di splicing identificati, analizzeremo in vivo, la correlazione tra difetti di segregazione dei cromosomi XY ed espressione di specifici fattori di splicing.

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

GGP11122 231.000

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2012

Abe Takuya, Branzei Dana Fondazione IFOM, Istituto FIRC di Oncologia Molecolare, Via Adamello 16, 2139, Milano, Italy, Tel. 02.574303259, Fax 02.574303231, E-mail: dana.branzei@ifom.eu

Le coesine sono proteine altamente conservate che appartengono alla famiglia SMC (structural maintenance of chromosomes) e che legano i cromatidi fratelli dalla replicazione fino all’anafase. Il complesso delle coesine comprende quattro proteine di base: Smc1, Smc3, Scc3 e Scc1 (conosciuta anche come Mdc1 o Rad21), che svolgono un ruolo di tipo strutturale. Il complesso viene legato alla cromatina nelle fasi G1 e S tramite l’azione combinata di altre due proteine, Scc2 e Scc4.

Il termine “coesinopatie” si riferisce in generale all’effetto che hanno sulla salute dei pazienti le mutazioni nelle proteine che svolgono un ruolo nella coesione tra cromatidi fratelli. Tre patologie sono state sin’ora caratterizzate: la sindrome di Cornelia de Lange (CdLS), la sindrome di Robert/SC focomelica (RBS) e la sindrome di rottura di Varsavia (WABS). Le coesinopatie manifestano un vasto spettro di fenotipi che includono ritardo mentale, ritardo nella crescita e altri numerosi difetti di sviluppo. I meccanismi molecolari in grado di giustifare gli effetti dimostrati dai pazienti sono ancora però sconosciuti.

Le cellule derivate da pazienti affetti da coesinopatie oltre a difetti nella coesione tra cromatidi fratelli mostrano un’evidente sensibilita ai danni al DNA. Mimando nelle cellule di DT40 le mutazioni trovate nei pazienti miriamo a creare un modello cellulare per lo studio di queste patologie. Grazie alle possibilità che queste cellule ci rendono disponibili stiamo testando l’ipotesi di un legame tra i difetti nella riparazione del DNA e le anomalie cromosomiche riscontrate, correlazione che potrebbe spiegare la variabilità fenotipica di queste patologie.

RICCIO ANDREA

Totale €

223.500

CORRELAZIONE TRA DIFETTI NELLA RIPARAZIONE DEL DNA E ANOMALIE STRUTTURALI DEI CROMOSOMI NELLE CELLULE DI PAZIENTI AFFETTI DA COESINOPATIE

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Telethon grant N.

GGP12160

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 248 Responsabile

BRANZEI DANA

Telethon grant N.

Anno d’inizio: 2011

IMPRINTING GENOMICO E DISORDINI DELLA CRESCITA: DIFETTI GENETICI E MECCANISMI MOLECOLARI Sparago Angela (1), Cerrato Flavia (2), De Crescenzo Agostina (2), Citro Valentina (1), Anvar Zahra (1,2), Riso Vincenzo (1,2), Freschi Andrea (2), Kukreja Harpreet (1), Grimaldi Giovanna (1), Riccio Andrea (1,2) (1) Istituto di Genetica e Biofisica A.Buzzati-Traverso, CNR, via P. Castellino 111, Napoli, Italy, Tel. 081.6132444, Fax 081.6132706, E-mail: andrea.riccio@unina2.it (2) Dipartimento di Scienze Ambientali, Seconda Università di Napoli

L’obiettivo di questo progetto è di definire la genetica molecolare e la patogenesi dei disordini della crescita congeniti che sono associati a difetti dell’imprinting genomico, come la Sindrome di BeckwithWiedemann (BWS) e la Sindrome di Silver-Russell (SRS). Un’alta percentuale di individui affetti da BWS o SRS hanno difetti di imprinting nel cluster dei geni imprinted della regione cromosomica 11p15.5. Tali difetti possono derivare o da mutazioni delle Regioni di Controllo dell’Imprinting (ICR) ed in questo caso mostrare un elevato rischio di ricorrenza oppure insorgere in maniera indipendente dalla sequenza presente in cis e generalmente non essere trasmessi alla progenie. E’ stato dimostrato che delezioni di 1.8-2.2 kb presenti all’interno della ICR telomerica (IC1) della regione 11p15.5 sono associate all’ipermetilazione delle sequenza residua della ICR e alla BWS con diversa penetranza ed espressività. Noi abbiamo studiato la relazione tra tali microdelezioni ed il fenotipo clinico attraverso l’analisi in vivo ed in vitro di una serie di alleli mutanti. Abbiamo dimostrato che le microdelezioni alterano la funzione di IC1 modificando la spaziatura dei siti di legame (CTS) della proteina CTCF. La gravità dell’inattivazione ed il fenotipo clinico sono influenzati dalla spaziatura dei CTS residui dell’allele mutante. Quindi, per predire correttamente rischio di ricorrenza e importanza del fenotipo clinico, è necessaria un’attenta caratterizzazione delle microdelezioni. Più recentemente, abbiamo identificato un caso in cui una delezione di 60 kb della regione 11p15.5 ereditata per via paterna era associata a limitazione della crescita intra-uterina (IUGR) severa ricorrente. Abbiamo dimostrato che la delezione include la ICR centromerica (IC2) della regione 11p15.5 e determina un’alterazione dell’imprinting con silenziamento di KCNQ1OT1 ed attivazione di CDKN1C e PHLDA2. Questo caso rappresenta la prima dimostrazione che difetti di imprinting del dominio centromerico della regione 11p15.5 sono associati a IUGR. Riguardo i casi con difetti di imprinting ma nessuna alterazione di sequenza in cis, la nostra attenzione è focalizzata sull’identificazione dei fattori proteici necessari per il mantenimento della metilazione del DNA nelle ICR durante lo sviluppo embrionale precoce. E’ stato dimostrato che ZFP57 è neccessario per il mantenimento dell’imprinting di diversi loci nel topo. Tuttavia, nei pazienti BWS e SRS non sono state finora identificate mutazioni in tale gene. Stiamo esplorando la possibilità del coinvolgimento di altri loci attraverso il sequenziamento degli esomi nel DNA dei pazienti.

ABSTRACT N. 250 Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

BIFFO STEFANO

Telethon grant N.

GGP10012

Totale €

263.400

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2011

MODULAZIONE DELLA ATTIVITÀ DEL FATTORE DI INIZIO 6 (EIF6) E SUO UTILIZZO TERAPEUTICO NELLE MALATTIE A CAUSA RIBOSOMALE Biffo Stefano (1,2), Pesce Elisa (1), Calamita Piera (1), Johanna Rommens (3), Giovanna D’amico (4) (1) San Raffaele Scientific Institute, Via Olgettina 58 20132 Milano, Italy Email: biffo.stefano@hsr.it (2) Disit, Alessandria, Italy (3) Centro Matilde Tettamanti, Monza, Italy (4) Hospital For Sick Children, Toronto, Canada

eIF6 lega la subunità ribosomale 60S impedendone il legame improprio con la 40S. Mutazioni puntiformi di eIF6 migliorano il fenotipo della perdita di SBDS, il gene mutato nella sindrome di Swachman Diamond. Inoltre, sia la sovraespressione di eIF6 che la mancanza di SBDS causano una maggiore incidenza tumorale. La nostra ipotesi è che la modulazione di eIF6 possa rappresentare una strategia terapeutica nella cura della sindrome di Swachman Diamond.

Abbiamo sviluppato un sistema su larga scala per evidenziare modulatori del legame di eIF6. In questo sistema abbiamo testato la efficienza di legame dei mutanti di eIF6 e della simultanea somministrazone di SBDS. I dati mostrano che il sistema sviluppato è altamente riproducibile con un fattore Z di 0.90. La efficienza di legame del mutante di eIF6 è comparabile a quella di eIF6 normale.

Abbiamo anche iniziato a produrre cellule tumorali con SBDS muta-

138

PROGETTI DI RICERCA TELETHON

ABSTRACT N. 252

to e i controlli rilevanti per definire la loro resistenza ai chemioterapici. Abbiamo prima tentato in collaborazione con G. D’Amico (Laboratorio di Immunologia e Terapia Cellulare, Fondazione Tettamanti, Monza, Italy) di trasformare cellule umane mutate. Non siamo stati in grado di ottenere cellule tumorali. Allo stato attuale stiamo valutando la possibiità di trasformare fibroblasti di topo embrionali provenienti da un ceppo murino con SBDS mutato (in collaborazione con Johanna Rommens, The Hospital for Sick children, Toronto, Canada).

In futuro contiamo di analizzare gli effetti di SBDS sul rilascio di eIF6 e caratterizzare le proprietà molecolari delle cellule tumorali con SBDS mutato.

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

181.500 Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2009

IL LIEVITO SACCHAROMYCES CEREVISIAE COME AMBIENTE CELLULARE PER STUDIARE LA REPLICAZIONE, L’INTEGRAZIONE E L’INCAPSIDAZIONE DEL VIRUS ADENO-ASSOCIATO Cervelli Tiziana, Backovic Ana, Della Latta Veronica, Bologna Caterina, Cipriani Filippo, Galli Alvaro

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche

Istituto di Fisiologia Clinica, CNR via Moruzzi 1, Pisa, Tel. 050.3153094, Fax 050.3153327, E-mail: alvaro.galli@ifc.cnr.it

PICHIERRI PIETRO

Telethon grant N.

GGP12144

Totale €

225.500

Num Centri: 1

GGP09166

Totale € Num Centri: 1

ABSTRACT N. 251 Responsabile

GALLI ALVARO

Telethon grant N.

Durata (anni): 3

Il metodo ideale per la terapia genica è sostituire il gene mutato con una copia funzionale. I vettori virali più promettenti per la terapia genica sono quelli basati sul virus adeno-associato (AAV), un virus non patogeno a DNA a singolo filamento (ssDNA). A tutt’oggi, l’applicazione più importante di vettori AAV in trial clinici di terapia genica riguarda la fibrosi cistica. Crediamo che una conoscenza più profonda della biologia di AAV possa dare un grande contributo per l’applicazione terapeutica dei vettori AAV. I due motivi principali che limitano l’uso di vettori AAV per studi di terapia genica sono: l’eccessiva variabilità dell’ efficienza di trasduzione che può dipendere dal tipo delle cellule e la mancanza di metodi sicuri ed efficienti di purificazione e di produzione di vettori AAV. I metodi più usati per produrre i vettori di AAV sono molto complicati e molto costosi. Di conseguenza, trovare un sistema eucariotico più semplice in cui AAV si replica e si incapsida, offre non solo un’occasione eccellente per approfondire la biologia di AAV ma può anche essere molto importante per mettere a punto metodi alternativi per la produzione di vettori AAV (rAAV). Recentemente, è stato dimostrato che il lievito Saccharomyces cerevisiae può essere uno strumento genetico molto utile per la ricerca virologica. Il nostro scopo finale è quello di utilizzare il lievito Saccharomyces cerevisiae come recipiente cellulare per la produzione di rAAV. Nel corso degli ultimi due anni abbiamo dimostrato che rAAV si replica in lievito in presenza di Rep68 e che le proteine capsidiche VP1, VP2 e VP3 si esprimono e si assemblano in lievito. Inoltre, per aumentare la quantità di ssDNA abbiamo utilizzato due ceppi di lievito con mutazioni nei geni rad52 e rad50 coinvolti nel processamento del ssDNA durante la riparazione del DNA. Non è stato dimostrato nessun effetto sul ssDNA di AAV in questi ceppi. Per assemblare rAAV in cellule umane, è necessario esprimere sia le proteine Rep e Cap di AAV, che le proteine del virus helper quali ad esempio E4orf6 e E1b55k di adenovirus. L’espressione in lievito di queste proteine adenovirali induce un significativo aumento del livello di ssDNA di AAV. Inoltre abbiamo anche dimostrato che, sempre in lievito, il complesso E4orf6-E1b55k, come già dimostrato in cellule umane, altera l’espressione della proteina MRE11 che è coinvolta nella riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA. Ciò conferma che il lievito è un buon modello per studiare la replicazione di AAV. Un’altra strategia per aumentare la produzione di ssDNA è stata quella di costruire un rAAV contenente un’origine di replicazione di lievito, per poter mantenere all’interno della cellula un livello costante di plasmide da cui si produce ssDNA. Abbiamo dimostrato che si possono ottenere alti livelli di ssDNA senza Rep68. Per migliorare la produzione di proteine capsidiche abbiamo costruito dei nuovi vettori plasmidici. Inoltre, abbiamo ottenuto il rapporto ottimale di Vp1:VP3, esprimendo VP3 dal promotore naturale p40 e VP1 dal promotore Gal1 di lievito. Combinando tutti questi vettori ed ottimizzando i tempi di induzione e crescita del lievito, abbiamo finalmente ottenuto un alto livello di proteine capsidiche nella giusta proporzione. Inoltre abbiamo anche dimostrato che il lievito produce anche la proteina regolatrice AAP necessaria per l’incapsidazione del DNA. Infine, abbiamo dimostrato che il lievito sotto certe condizioni è capace di formare capsidi di AAV. Al momento, stiamo effettuando esprimenti per determinare se il ssDNA entra nel capside di AAV e per ottimizzare il metodo di purificazione di rAAV da colture di lievito. Nel loro insieme, i nostri risultati indicano fortemente che il lievito ha la potenzialità di essere usato per produrre rAAV per la terapia genica.

Anno d’inizio: 2012

VERSO LA COMPRENSIONE DELLA PATOGENESI DELLA SINDROME DI WERNER: STUDIO DELLA CORRELAZIONE FUNZIONALE TRA LA PROTEINA ATR E LA PROTEINA WRN NELL’INSORGENZA DELLA SENESCENZA CELLULARE PREMATUTA DELLA SINDROME Iannascoli Chiara (1,3), Palermo Valentina (1,3), Zolla Valerio (1,3), Basile Giorgia (2,3), Franchitto Annapaola (2,3), Pichierri Pietro (1,3) (1) Istituto Superiore di Sanità, Sezione di Cancerogenesi Sperimentale e Computazionale, Viale Regina Elena 229, 00161 Roma, Tel. 06.49902994/2954, Fax 06.60513138, E-mail: pietro.pichierri@iss.it (2) Istituto Superiore di Sanità, Sezione di Epidemiologia Molecolare, Roma (3) Istituto Superiore di Sanità, Gruppo di Studio sulla Stabilità del Genoma, Roma

La sindrome di Werner è una malattia genetica rara caratterizzata clinicamente da sintomi di invecchiamento precoce come aterosclerosi, ingrigimento dei capelli e cataratta e da predisposizione a sviluppare cancro. Le cellule provenienti da individui affetti da questa sindrome hanno una ridotta capacità di proliferare in coltura, sono molto sensibili a certi tipi di danni al DNA che determinano l’arresto del processo di duplicazione del genoma, accumulano aberrazioni e mutazioni nel loro DNA e vanno incontro a morte cellulare più delle cellule di un individuo normale. Il gene che è mutato nella sindrome di Werner produce una proteina chiamata Werner (WRN) che è una elicasi. Il meccanismo tramite il quale la proteina WRN evita che le cellule entrino prematuramente in senescenza è ancora sconosciuto.

Nelle cellule normali, la senescenza è associata a danno ai telomeri.

Tuttavia, le cellule WS entrano in senescenza, normalmente, con telomeri lunghi ed invece mostrano spesso segni di senescenza indotta da stress cellulare, rari in cellule normali. Nelle cellule, una delle fonti di stress è correlata con accumulo di danni durante la replicazione del DNA. Risultati provenienti dal nostro gruppo, ottenuti anche grazie al precedente supporto di Telethon, hanno evidenziato che cellule provenienti da pazienti WS accumulano rotture al DNA durante la replicazione. Inoltre, studi del nostro e di altri gruppi di ricerca indicano che WRN partecipa al pathway molecolare che presiede all’integrità del DNA in replicazione e che è regolato dalla chinasi ATR, mutata nella sindrome di Seckel. In questo progetto, avvieremo un’analisi meccanicistica della funzione di WRN durante la replicazione e delle sue connessioni con il pathway di ATR per stabilire se la senescenza prematura di WS derivi dalla perdita di funzioni regolate da ATR. Nostri risultati preliminari evidenziano che la funzione di WRN regolata da ATR possa essere necessaria ad una corretta attivazione del checkpoint durante la replicazione ed alla stabilizzazione di alcuni siti naturali di arresto della replicazione (siti fragili comuni). Per testare la nostra ipotesi, oltre l’uso di modelli cellulari di WS validati, ci si avvarrà di un nuovo modello cellulare ottenuto tramite silenziamento genico (RNAi) regolato di WRN in fibroblasti umani primari normali, combinato con l’espressione di alleli RNAi-resistenti di WRN, mutati per siti regolatori specifici attivi durante la replicazione. Questo modello di “allele-switch”, è in grado di riassumere alcuni fenotipi cellulari chiave della WS e ci permetterà di indagare gli eventi cellulari e molecolari che portano alla senescenza prematura nella sindrome, confrontandoli con quelli osservati nelle cellule normali. Svelare i meccanismi alla base dell’invecchiamento precoce nei pazienti è un pre-requisito alla possibile identificazione di nuovi target terapeutici utili per migliorare l’approccio clinico di questa malattia.

139

SERVIZI TELETHON ALLA RICERCA

ABSTRACT N. 253

SERVIZI TELETHON ALLA RICERCA

Progetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile

GIACCA MAURO

Telethon grant N.

GGP11068

Totale €

204.600

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

ABSTRACT N. 254 Servizi Telethon alla Ricerca Responsabile

Anno d’inizio: 2011

VERSO UNA PIÙ EFFICACE TERAPIA GENICA CON VETTORI AAV. SCREENING AD ALTA PROCESSIVITÀ PER L’IDENTIFICAZIONE DEI DETERMINANTI MOLECOLARI CHE REGOLANO LA TRASDUZIONE DA AAV, LA PRODUZIONE DEI VETTORI E LA CORREZIONE GENICA

FILOCAMO MIRELLA

Telethon grant N.

GTB07001

Totale €

2.062.768

Num Centri: 10

Durata (anni): 5

Anno d’inizio: 2007

RETE DELLE BIOBANCHE GENETICHE TELETHON (TNGB) WWW.BIOBANKNETWORK.ORG Filocamo Mirella (1), Baldo Chiara (2), Goldwurm Stefano (3), Renieri Alessandra (4), Angelini Corrado (5), Moggio Maurizio (6), Mora Marina (7), Merla Giuseppe (8), Politano Luisa (9), Garavaglia Barbara (10)

Giacca Mauro, Lorena Zentilin, Mano Miguel, Zacchigna Serena, Lovric Jasmina, Ippodrino Rudy, Backovic Ana International Center for Genetic Engineering and Biotechnology (ICGEB), Padriciano 99, 34149 Trieste, Italia, Tel. +39.040.3757324, Fax +39.040.226555, E-mail: giacca@icgeb.org

(1) UOSD Centro di Diagnostica Genetica e Biochimica delle Malattie Metaboliche, Istituto G. Gaslini, Largo G. Gaslini 5, 16147 Genova, Tel. 010.5636792/609, Fax 010.383983, E-mail: info@biobanknetwork.org (2) SC Laboratorio di Genetica Umana, E.O. Ospedali Galliera, Genova (3) Centro Parkinson, Istituti Clinici di Perfezionamento, Milano (4) UOC Genetica Medica, Dip. di Biotecnologie, Università di Siena (5) Dip. di Neuroscienze, Università di Padova, IRCCS San Camillo, Venezia (6) UOD Diagnostica Malattie Neuromuscolari, Fond. IRCCS Cà Granda Osp. Maggiore Policlinico, Milano (7) Laboratorio di Biologia Cellulare, UO Malattie Neuromuscolari e Neuroimmunologia, Fond. IRCCS Istituto Neurologico C. Besta, Milano (8) Unità di Genetica Medica, IRCCS Casa Sollievo della Sofferenza, S. Giovanni Rotondo (FG) (9) Cardiomiologia e Genetica Medica, Dip. di Medicina Sperimentale, Seconda Università di Napoli (10) UO Neurogenetica Molecolare, Fond. IRCCS Istituto Neurologico C. Besta, Milano

I vettori virali basati sul virus Adeno-associato (AAVs) rappresentano in questo momento un potente strumento per la terapia genica umana, per applicazioni cliniche nel trattamento di malattie ereditarie, degenerative o acquisite, e allo stesso tempo un prezioso strumento di ricerca di base per il trasferimento genico in modelli animali. Tuttavia, nonostante la manifesta efficacia dei vettori AAV, specificamente per la trasduzione di cellule post-mitotiche muscolari e neuronali, esistono delle limitazioni alla trasduzione virale in certi tipi di cellule e tessuti, limitazioni che ostacolano lo sviluppo di più ampie applicazioni terapeutiche. Le informazioni disponibili sui determinanti molecolari che regolano la permissività agli AAV sono ancora modeste.

Negli ultimi anni abbiamo dimostrato che le proteine cellulari coinvolte nella riparazione del danno al DNA, in particolare nella riparazione delle rotture al doppio filamento (DSB) (complesso Mre11Rad50-Nbs1 (MRN)) legano fisicamente il genoma del virus all’interno della cellula ospite e ne influenzano negativamente il successivo processamento. Di recente, abbiamo evidenziato come la permissività di AAV sia strettamente correlata con la differenziazione cellulare, processo che coincide con la riduzione dell’espressione delle proteine del complesso MRN. Infatti, la diminuzione dei livelli delle proteine MRN, mediata da trattamento con siRNA specifici o con miR-24, che regola negativamente i livelli NBS1, inducono aumento di permissività agli AAV sia in cellule in coltura che nel fegato in vivo, in modelli murini (Lovric et al., 2012). Questi risultati pongono l’accento su come diversi aspetti dell’interazione di AAV con la cellula ospite non siano stati ancora completamente delucidati.

Al fine di identificare in modo sistematico i fattori cellulari, sia negativi sia positivi, implicati nei processi di internalizzazione, trafficking intracellulare, processamento del genoma di AAV ed infine espressione del transgene abbiamo eseguito uno screening ad alta densità (HTS) in cellule HeLa trasdotte con un vettore AAV2-Luciferasi, utilizzando una library di siRNA diretti contro tutti i geni espressi umani, (18175 geni bersaglio umani). I risultati ottenuti in un primo screening hanno permesso di identificare 1528 geni che incidono sull’efficienza della trasduzione di AAV per più di 4 volte (184 geni per più di 8 volte). Di questi geni, 993 svolgono un’azione inibitoria, mentre 535 sono richiesti per un’efficiente trasduzione da parte dei vettori AAV. Gli effetti di questi geni è stata confermata in un successivo screening. L’analisi ontologica dei geni con azione inibitoria ha rivelato un arricchimento per fattori correlati con la ricombinazione e la riparazione del danno al DNA, inclusi i membri del complesso MRN, e il controllo del ciclo cellulare, mentre nel sotto gruppo dei geni richiesti per l’infezione sono particolarmente rappresentati quelli implicati nell’endocitosi, trafficking intracellulare, trascrizione e geni codificanti per componenti del sistema ubiquitina-proteasoma. Degno di nota è il fatto che da questo studio sono emersi, in numero significativo, geni non precedentemente associati con la trasduzione di AAV. Una migliore comprensione del meccanismo d’azione dei geni identificati aprirà nuove prospettive per lo sviluppo di vettori AAV più efficienti o di strategie che sfruttino la somministrazione di siRNA per migliorare la trasduzione in vivo.

Lovric, J., Mano, M., Zentilin, L., Eulalio, A., Zacchigna, S., and Giacca, M. (2012). Terminal Differentiation of Cardiac and Skeletal Myocytes Induces Permissivity to AAV Transduction by Relieving Inhibition Imposed by DNA Damage Response Proteins. Mol Ther: 20, 2087–2097.

Il TNGB è stato fondato nel 2008 con l’obiettivo di coordinare Biobanche Genetiche (BG) già finanziate come singole unità da Telethon. La Rete, formata da 10 biobanche, conserva attualmente circa 80.000 campioni e il suo catalogo elenca oltre 750 malattie genetiche.

Le attività e la regolamentazione del TNGB sono definiti nella Carta Costituente che include linee guida riguardanti gli aspetti organizzativi ed etici e definisce i benefici e i doveri di ciascuna BG. Il TNGB, governato dal Network Board (Coordinatore e Direttori delle Biobanche), si avvale di un Coordinatore Emerito e di un Advisory Board, composto da esperti in ambito etico e legale e da un rappresentante di UNIAMO, Federazione Italiana di Associazioni di Familiari e Pazienti con malattie rare.

Scopo principale del TNGB è quello di armonizzare e standardizzare tutte le attività delle biobanche (raccolta, processazione, conservazione, distribuzione dei campioni a scopo di diagnosi e/o ricerca, registrazione dei dati correlati) per garantire la qualità dei campioni e, allo stesso tempo, attuare le normative sulla sicurezza e sulla tutela dei dati personali e dei diritti dei donatori.

Altro importante obiettivo del TNGB è stato quello di migliorare la visibilità e di diffondere informazioni relative ai servizi offerti dalla BG all’interno della comunità scientifica e delle associazioni di famiglie/pazienti.

Per raggiungere al meglio gli obiettivi preposti, il TNGB ha adottato e condivide un sistema informatico (IT) che gestisce tutte le attività delle BG e aggrega i dati per il sito web, dove è disponibile online il catalogo delle malattie. La piattaforma IT consente anche la gestione coordinata e la condivisione di regole di accesso ai campioni basata su un unico “Pannello di Controllo delle Richieste” che garantisce trasparenza e ottimizzazione del flusso dei campioni.

Durante gli ultimi 5 anni, la comunità scientifica ha ampiamente utilizzato i servizi del TNGB per diagnosi e ricerca, i cui risultati hanno dato luogo a 249 pubblicazioni scientifiche su riviste internazionali.

Il TNGB è inoltre di supporto a famiglie che hanno necessità di campioni di loro familiari (casi indice), conservati nelle Biobanche, per ottenere consulenze genetiche e/o diagnosi prenatali.

Il TNGB collabora strettamente con le Associazioni di Pazienti con malattie rare con l’obiettivo sia di preservare i loro preziosi campioni sia di centralizzarne la raccolta per condurre e ottenere risultati affidabili nel campo delle malattie genetiche. Le collaborazioni tra le Biobanche della rete e le Associazioni sono formalizzate con accordi firmati dalle parti e dal Coordinatore, per conto di Telethon.

Tutte le informazioni, i documenti e i contatti relativi al TNGB sono disponibili sul sito web dedicato http://www.biobanknetwork.org/.

140

SERVIZI TELETHON ALLA RICERCA

ABSTRACT N. 255

cing (WES)” è una applicazione fondamentale dell’NGS che permette di analizzare selettivamente le regioni esoniche dei genomi eucariotici che sono le più rilevanti per studio delle variazioni alleliche ad alta penetranza e le loro relazioni con il fenotipo. Un’analisi completa WES coinvolge un gran numero di passi che hanno la necessità di essere organizzati in un workflow efficiente. La gestione di un workflow di analisi NGS e l’enorme quantità di dati prodotti richiede capacità computazionali avanzate.

Risultati La nostra risorsa web chiamata WEP (Whole-Exome sequencing Pipeline web tool) esegue una pipeline WES completa e ne fornisce un facile accesso attraverso l’interfaccia per i risultati intermedi e finali. La pipeline WES è composta da diversi passi: 1) verifica dei controlli di qualità e di integrità dei dati di input, trimming delle sequenze e filtraggio di quelle che non superano determinate soglie di qualità; 2) allineamento con gap; 3) conversione dei file in format BAM, ordinamento ed indicizzazione; 4) rimozione dei duplicati; 5) ottimizzazione dell’allineamento intorno alle posizione delle inserzioni/delezioni; 6) ricalibrazione dei punteggi di qualità; 7) identificazione di varianti polimorfiche “single nucleotide” and “deletion/insertion” (SNP and DIP)”; 8) annotazione delle varianti; 9) immagazzinamento dei risultati in database costruiti ad hoc per permettere le intersezioni tra i risultati ottenuti nei vari esperimenti, valutazioni statistiche e molto ancora.

Per superare la sfida posta dalla gestione di grandi moli di dati e massimizzare le informazioni biologiche estratte, la risorsa WEP riduce il numero di risultati finali filtrando i dati con specifiche soglie selezionabili. Ciò facilita l’identificazione di varianti funzionalmente significative.

Conclusioni WEP consente ad un utente di effettuare l’intera analisi senza conoscere l’architettura hardware e software, utilizzando sia dati “single end” che “paired end”. L’interfaccia fornisce un accesso facile ed intuitivo per la sottomissione dei dati e un’interfaccia web per la visualizzazione delle varianti annotate. Gli utenti senza background IT avanzato possono accedere, attraverso l’interfaccia, agli algoritmi più aggiornati e testati, configurati ad hoc per massimizzare la qualità delle varianti selezionate e minimizzare gli artefatti ed i falsi positivi.

Il web tool è disponibile al sito: http://www.caspur.it/wep.

Servizi Telethon alla Ricerca Responsabile

POLISHCHUK ROMAN

Telethon grant N.

GTF08001

Totale €

183.000

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2009

SERVIZIO TELETHON DI MICROSCOPIA ELETTRONICA TEEMCOF Polishchuk Elena (1,2), Iacobacci Simona (1), Turacchio Gabriele (2), Polishchuk Roman (1) (1) Telethon Institute of Genetics and Medicine, Via Pietro Castellino, 111, 80131, Naples, Italy, Tel. +39.081.6132336, Fax +39.081.5609877, E-mail: polish@tigem.it (2) Institute of Protein Biochemistry, CNR, Naples, Italy

Lo studio delle malattie genetiche è composto da molti passaggi, dall’identificazione del gene responsabile dello sviluppo della malattia, alla messa a punto di approcci terapeutici per il trattamento della malattia Un passaggio chiave, il chiarimento dei meccanismi della patogenesi, richiede una precisa caratterizzazione dei meccanismi molecolari coinvolti nella fisiologia di tali prodotti genici aberranti (sintesi, turnover, interazioni con componenti delle macchine molecolari e precisa localizzazione cellulare).

In questo passaggio, la microscopia elettronica (ME) gioca un ruolo fondamentale nella comprensione dello sviluppo della malattia, fornendo un rilevamento ad alta risoluzione di prodotti genici anomali e analisi di cambi ultrastrutturali indotti dalla loro espressione. Comunque, diversamente dagli approcci genetici e molecolari, gli studi di ME sono rimasti un’utopia per molti laboratori a causa degli alti costi e della mancanza della strumentazione ed esperienza necessari.

Lo scopo è quindi di fornire aiuto ai progetti Telethon che richiedono approcci di ME per l’analisi delle malattie genetiche. Lunga esperienza, conoscenze tecniche, strumentazione e personale qualificato sono disponibili per tale aiuto al Telethon Electron Microscopy Core Facility (TeEMCoF).

Il TeEMCoF ha fornito assistenza tecnica ed esperienza, assieme a valutazioni qualitative e quantitative per ME, per numerosi studi supportati dai fondi Telethon. Per questo è servito un intenso lavoro di esperti scienziati, tecnici ed un utilizzo di equipaggiamento necessario, per eseguire efficacemente gli studi di ME richiesti dagli scienziati Telethon.

In sostanza, con l’aiuto di Telethon ed in collaborazione con i ricercatori supportati da Telethon, abbiamo migliorato la nostra conoscenza della genomica funzionale a partire dal livello cellulare fino all’intero organismo e abbiamo aiutato a creare nuovi strumenti per la scoperta e la cura delle malattie genetiche.

ABSTRACT N. 256 Servizi Telethon alla Ricerca Responsabile

PESOLE GRAZIANO

Telethon grant N.

GTF09024

Totale €

105.000

Num Centri: 1

Durata (anni): 3

Anno d’inizio: 2010

WEP: UN WORKFLOW DI ANALISI AD ELEVATE PRESTAZIONI PER L’ANALISI DI DATI DI SEQUENZE DI “WHOLE-EXOME” Mattia D’Antonio (1), De Meo D’Onorio Paolo (2), Paoletti Daniele (2), Elmi Berardino (1), Pallocca Matteo (2), Sanna Nico (2), Picardi Ernesto (1), Pesole Graziano (1,3,4), Castrignanò Tiziana (2) (1) Dipartimento di Bioscienze, Biotecnologie e Scienze Farmacologiche, Università degli Studi di Bari, via Orabona, 4, Bari, Italy, Tel. +39.080.5443588, E-mail: graziano.pesole@uniba.it (2) CASPUR, Consorzio interuniversitario per le Applicazioni di Supercalcolo per Università e Ricerca, Rome, Italy (3) Istituto di Biomembrane e Bioenergetica, Consiglio Nazionale delle Ricerche, Bari, Italy (4) Center of Excellence in Genomics (CEGBA), Bari, Italy

Stato dell’arte L’avvento di tecnologie di sequenziamento massivo parallelo (Next Generation Sequencing, NGS) ha profondamente modificato il panorama della ricerca genetica. In particolare il “Whole Exome Sequen-

141

INDICI

143

Indice per Autore NOME

ABSTRACT

NOME

A AIUTI ALESSANDRO ANDRIA GENEROSO

15, 16, 24, 34 84

ABSTRACT

CATANIA MARIA VINCENZA

154

CATTANEO ANTONINO

106

CATTANEO ELENA

140

ARBUSTINI ELOISA

225

CECCONI FRANCESCO

AROSIO PAOLO

143

CESARENI GIANNI

244

CHERUBINI ENRICO

150

CHIEREGATTI EVELINA

147

AURICCHIO ALBERTO

7, 10

36

B

CHIESA ROBERTO

BACCHETTA ROSA

19

CHINI BICE

152

BALDARI COSIMA

198

CIANI ELISABETTA

159

224

CICARDI MARCO

197

190

CICCONE ROBERTO

149

BALDINI ANTONIO BALDUINI CARLO LUIGI BALLABIO ANDREA BANFI SANDRO BANG MARIE-LOUISE

2

CLEMENTI EMILIO

9

COMI GIACOMO PIETRO CONTE CAMERINO DIANA

74

BANKS LAWRENCE

169

CORONA DAVIDE

BARCHI MARCO

247

CORTI STEFANIA

BARTESAGHI RENATA

170

COSSU GIULIO

BAUCE BARBARA

217

CROTTI LIA

BECCHETTI ANDREA

130

CUBELLIS MARIA VITTORIA

BEGUINOT FRANCESCO

216

BENFENATI FABIO

127

d

BENVENUTI FEDERICA

202

D'ADAMO PATRIZIA

BERNARDI PAOLO BIANCHI MARIA LUISA

115 55 95 60, 61 222 83

46

D'ADDA DI FAGAGNA FABRIZIO

125

69

DAGA ANDREA

118

113

DE CURTIS IVAN

BIANCO PAOLO

236

DE MATTEIS MARIA ANTONIETTA

BIFFO STEFANO

59 78, 94

89

BIANCHI VERA BIFFI ALESSANDRA

44

20, 21, 33, 35 250

157 12, 14

DELIA DOMENICO

124

DENTI MICHELA ALESSANDRA

139

54

DI BERNARDO DIEGO

BOLINO ALESSANDRA

43

DI BLASI CLAUDIA

BOLOGNESI MARTINO

134

DI CUNTO FERDINANDO

166

175

DI FEDE GIUSEPPE

137

DI VIRGILIO FRANCESCO

195

DUGA STEFANO

183

BOLETTA ALESSANDRA

BONATTI STEFANO BONETTO VALENTINA BORTOLOZZI MARIO BOZZONI IRENE

41 105 65

5 86

f

BRANZEI DANA

249

BRESIN ELENA

228

FABRIS LUCA

227

BROCCOLI VANIA

158

FALCONE MARIKA MARIA CATERINA

214

4

FALSINI BENEDETTO

180

72, 88

FANELLI FRANCESCA

BRUNETTI PIERRI NICOLA BRUNO CLAUDIO BRUSCO ALFREDO

FEDERICI MASSIMO

122

48 215

BRUZZONE SANTINA

101

FELLIN TOMMASO

131

BUCCI CECILIA

102

FELTRI MARIA LAURA

103

FERLINI ALESSANDRA

C

FERRARI GIULIANA

CALEO MATTEO

156

FERRARI SIMONA

CAMASCHELLA CLARA

193

FERRARIN MAURIZIO

CANCEDDA LAURA

128

FILOCAMO MIRELLA

62 25, 26 199 99 254

CARELLI VALERIO

177

FIMIA GIAN MARIA

75

CARMIGNOTO GIORGIO

132

FIORILLO CHIARA

71

CARRA SERENA CARUSO MAURIZIA CASARI GIORGIO

FIUMARA FERDINANDO

85 57 123

143

82, 239

FLEISCHHAUER KATHARINA

196

FOIANI MARCO

126

NOME

ABSTRACT

NOME

ABSTRACT

FOLLENZI ANTONIA

186

MOSCHETTA ANTONIO

226

FORLONI GIANLUIGI

136

MURO ANDRES FERNANDO

203

FRALDI ALESSANDRO FRANCO BRUNELLA

MUSCO GIOVANNA

3

N

g GABELLINI DAVIDE GALIETTA LUIS

49

13 NALDINI LUIGI 39 204

28, 29, 30

NERI GIOVANNI

155

NICOLIS SILVIA KIRSTEN

173

GALLI ALVARO

252

NIGRO VINCENZO

GAMBARI ROBERTO

188

NISTRI ANDREA

77 133

GASPARINI LAURA

116

NOBILE CARLO

129

GASPARINI PAOLO

181

NORIS MARINA

229

GATTORNO MARCO

194

GAZZERRO ELISABETTA

O

80

GENNARI LUIGI

234

ORLACCHIO ANTONIO

GHIGGERI GIAN MARCO

231

ORLANDO VALERIO

GIACCA MAURO

253

GOLDWURM STEFANO

146

p

GRAZIANI ANDREA

200

PALMIERI FERDINANDO

GREGGIO ELISA

148

PANE MARIKA

GREGORI SILVIA

32

GRESELE PAOLO

189

GRITTI ANGELA GUSTINCICH STEFANO

PARENTI GIANCARLO PASSAFARO MARIA PIA

23

PENNUTO MARIA

145

PESOLE GRAZIANO PETRUZZELLA VITTORIA

I IOLASCON ACHILLE

PICHIERRI PIETRO 184

l LA VOLPE ADRIANA

191

117 38

109 67 1 45 42, 93 256 76 251

PIERONI MAURIZIO

218

PIETRANGELO ANTONELLO

192

PINOTTI MIRKO

185

PINTON PAOLO

107

LANDSBERGER NICOLETTA

163

PIZZORUSSO TOMMASO

162

LANZANI GUGLIELMO

179

PLEVANI PAOLO

167

LEVI SONIA

142

POLISHCHUK ROMAN

LIBERI GIORDANO

119

PREVITALI STEFANO CARLO

LUINI ALBERTO LUPETTI PIETRO

11 230

MAFFEI MARGHERITA MAGLIANO LORENZA

81

PRIORI SILVIA GIULIANA

220

PROIETTI DE SANTIS LUCA

138

PROTASI FELICIANO

M

6, 255

PUSCH MICHAEL

92 171

52

R

68

MAIURI LUIGI

205

RAGNINI-WILSON ANTONELLA

MAMMANO FABIO

182

RAMPOLDI LUCA

MASIELLO PELLEGRINO

213

RENIERI ALESSANDRA

161

MATARESE GIUSEPPE

212

RICCIO ANDREA

248

MATTEI ELISABETTA

64

MATTEOLI MICHELA

135

RONCAROLO MARIA GRAZIA ROSSI ANTONIO

MATTEVI ANDREA

235

MELDOLESI JACOPO

164

S

MELINO GENNARO

240

172 53

31 233

SALA CARLO

153

MERCURI EUGENIO

79

SALLESE MICHELE

168

MERLINI LUCIANO

90

SALVATORE DOMENICO

MERLO GIORGIO ROBERTO

242

MESSINA SONIA

66

MILANI SILVANO

207

MINCHIOTTI GABRIELLA MISSERO CATERINA

SALVIATI LEONARDO

56 241

MONGILLO MARCO

221

MONTINI EUGENIO

22, 27

144

58 114

SANDONA' DORIANNA

73

SANDRI MARCO

37

SANTORO MASSIMO

174

SANTUCCI ANNALISA

223

SCHENONE ANGELO

100

SCHIAFFINO MARIA VITTORIA

178

NOME

ABSTRACT

NOME

SCORRANO LUCA

47

TIZIANO FRANCESCO DANILO

SERAFINI MARTA

51

TOLOSANO EMANUELA

SERINI GUIDO SETTE CLAUDIO SETTEMBRE CARMINE SICCA FEDERICO

165 96 50 151

SICILIANO GABRIELE

112

SIMONELLI FRANCESCA

176

SITIA ROBERTO

210

SOBACCHI CRISTINA

237

SQUITIERI FERDINANDO

141

STRAZZABOSCO MARIO

206

SURACE ENRICO SVELTO MARIA SZABADKAI GYORGY

TARONE GUIDO

TONGIORGI ENRICO

160

TONIOLO DANIELA

232

TORRENTE YVAN

63

TUPLER ROSSELLA GINEVRA

70

URSINI MATILDE VALERIA

211

VALENTE ENZA MARIA

144

VANONI MARIA ANTONIETTA

208

VAZZA GIOVANNI

91

VERGANI LODOVICA VILLA ANNA

245

VIOLA ANTONELLA

219

VITA GIUSEPPE VOLTATTORNI CARLA

TARONI FRANCO

121 243

TAVEGGIA CARLA

104

246

v

8

TARTAGLIA MARCO

97 187

u

T TALORA CLAUDIO

ABSTRACT

87 108 17, 18 201 98 209

z

TESTI ROBERTO

120

ZEVIANI MASSIMO

TETI ANNA MARIA

238

ZITO ESTER

145

110, 111 40

Indice per Patologia ACCUMULO LISOSOMIALE, MALATTIE DA

ATROFIA MUSCOLARE SPINALE E BULBARE

BALLABIO ANDREA, Abstract n.2

PENNUTO MARIA, Abstract n.93

FRALDI ALESSANDRO, Abstract n.3

ATROFIA OTTICA

GRITTI ANGELA, Abstract n.23

SCORRANO LUCA, Abstract n.47

PARENTI GIANCARLO, Abstract n.1

ATROFIA OTTICA DI LEBER

AICARDI-GOUTIERES, SINDROME DI

CARELLI VALERIO, Abstract n.177

PLEVANI PAOLO, Abstract n.167

AUTISMO

ALBINISMO OCULARE

CHERUBINI ENRICO, Abstract n.150

SCHIAFFINO MARIA VITTORIA, Abstract n.178

CICCONE ROBERTO, Abstract n.149

ALCAPTONURIA

SICCA FEDERICO, Abstract n.151

SANTUCCI ANNALISA, Abstract n.223

AUTOIMMUNE POLIENDOCRINA, SINDROME, TIPO 1

ALZHEIMER, MALATTIA DI

MUSCO GIOVANNA, Abstract n.49

DI FEDE GIUSEPPE, Abstract n.137

BARTTER, SINDROME DI

AMAUROSI CONGENITA DI LEBER, TIPO 2

CONTE CAMERINO DIANA, Abstract n.115

SIMONELLI FRANCESCA, Abstract n.176

PUSCH MICHAEL, Abstract n.171

AMAUROSI CONGENITA DI LEBER, TIPO 4

BECKWITH-WIEDEMANN, SINDROME DI

AURICCHIO ALBERTO, Abstract n.7

RICCIO ANDREA, Abstract n.248

ANCHILOBLEFARON-ANOMALIE ECTODERMICHE-SCHISI

BRUGADA, SINDROME DI

LABIO-PALATINA

PIERONI MAURIZIO, Abstract n.218

MELINO GENNARO, Abstract n.240

CAPS - SINDROMI PERIODICHE ASSOCIATE ALLA

MISSERO CATERINA, Abstract n.241

CRIOPIRINA

ANEMIA A CELLULE FALCIFORMI

DI VIRGILIO FRANCESCO, Abstract n.195

TOLOSANO EMANUELA, Abstract n.187

GATTORNO MARCO, Abstract n.194

ANEMIA DI FANCONI

CARDIOFACIOCUTANEA, SINDROME

LA VOLPE ADRIANA, Abstract n.191

TARTAGLIA MARCO, Abstract n.243

ANEMIA DISERITROPOIETICA CONGENITA

CARDIOMIOPATIA DILATATIVA, TIPO 1A

IOLASCON ACHILLE, Abstract n.184

BANG MARIE-LOUISE, Abstract n.74

ANGELMAN, SINDROME DI

CARDIOMIOPATIA VENTRICOLARE DESTRA ARITMOGENA

BANKS LAWRENCE, Abstract n.169

BAUCE BARBARA, Abstract n.217

ANGIOEDEMA EREDITARIO

CARDIOMIOPATIE

CICARDI MARCO, Abstract n.197

TARONE GUIDO, Abstract n.219

ATASSIA A INSORGENZA PRECOCE CON APRASSIA

CHARCOT-MARIE-TOOTH, MALATTIA DI

OCULOMOTORIA E IPOALBUMINEMIA

BOLINO ALESSANDRA, Abstract n.43

LIBERI GIORDANO, Abstract n.119

FERRARIN MAURIZIO, Abstract n.99 VITA GIUSEPPE, Abstract n.98

ATASSIA DI FRIEDREICH TESTI ROBERTO, Abstract n.120

CHARCOT-MARIE-TOOTH, MALATTIA DI, TIPO 1, LEGATA ALL’X BORTOLOZZI MARIO, Abstract n.105

ATASSIA SPINOCEREBELLARE, TIPO 28 BRUSCO ALFREDO, Abstract n.122

CHARCOT-MARIE-TOOTH, MALATTIA DI, TIPO 1A

CASARI GIORGIO, Abstract n.123

BRUZZONE SANTINA, Abstract n.101

TARONI FRANCO, Abstract n.121

SCHENONE ANGELO, Abstract n.100

ATASSIA TELEANGIECTASIA

CHARCOT-MARIE-TOOTH, MALATTIA DI, TIPO 2B

D’ADDA DI FAGAGNA FABRIZIO, Abstract n.125

BUCCI CECILIA, Abstract n.102

DELIA DOMENICO, Abstract n.124

CHARCOT MARIE TOOTH, MALATTIA DI, TIPO 4F

FOIANI MARCO, Abstract n.126

FELTRI MARIA LAURA, Abstract n.103

ATROFIA MUSCOLARE SPINALE

CISTICA DELLA MIDOLLARE RENALE, MALATTIA, TIPO 2

CORTI STEFANIA, Abstract n.95

RAMPOLDI LUCA, Abstract n.53

SETTE CLAUDIO, Abstract n.96

COCKAYNE, SINDROME DI

TIZIANO FRANCESCO DANILO, Abstract n.97

PROIETTI DE SANTIS LUCA, Abstract n.138

ATROFIA MUSCOLARE SPINALE CON DISTRESS RESPIRATORIO, TIPO 1

COENZIMA Q10, DEFICIT DI

COMI GIACOMO PIETRO, Abstract n.94

SALVIATI LEONARDO, Abstract n.114

147

COLESTASI PROGRESSIVA FAMILIARE INTRAEPATICA

DISTROFIA MUSCOLARE DEI CINGOLI

MOSCHETTA ANTONIO, Abstract n.226

BANG MARIE-LOUISE, Abstract n.74 BRUNO CLAUDIO, Abstract n.72

CONDRODISPLASIE

COMI GIACOMO PIETRO, Abstract n.78

MATTEVI ANDREA, Abstract n.235

FIORILLO CHIARA, Abstract n.71

CORNELIA DE LANGE, SINDROME DI

MAGLIANO LORENZA, Abstract n.68

BRANZEI DANA, Abstract n.249

NIGRO VINCENZO, Abstract n.77 PETRUZZELLA VITTORIA, Abstract n.76

CRIGLER-NAJJAR, SINDROME DI

SANDONA’ DORIANNA, Abstract n.73

MURO ANDRES FERNANDO, Abstract n.203

DISTROFIA MUSCOLARE DEI CINGOLI, AUTOSOMICA

DEFICIENZA DELL’ISOFORMA 1 DEL CARRIER MITOCONDRIALE DI ASPARTATO/GLUTAMMATO

RECESSIVA, TIPO 2H

PALMIERI FERDINANDO, Abstract n.109

FIMIA GIAN MARIA, Abstract n.75

DEMENZA FRONTOTEMPORALE

DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE

DENTI MICHELA ALESSANDRA, Abstract n.139

BIANCHI MARIA LUISA, Abstract n.69 BOZZONI IRENE, Abstract n.65

DENT, MALATTIA DI, TIPO 1

CLEMENTI EMILIO, Abstract n.59

DE MATTEIS MARIA ANTONIETTA, Abstract n.12

COSSU GIULIO, Abstract n.60, 61

PUSCH MICHAEL, Abstract n.171

FERLINI ALESSANDRA, Abstract n.62 MAGLIANO LORENZA, Abstract n.68

DEPLEZIONE DEL DNA MITOCONDRIALE, SINDROME DA, FORMA MIOPATICA

MATTEI ELISABETTA, Abstract n.64

BIANCHI VERA, Abstract n.113

MESSINA SONIA, Abstract n.66 ORLANDO VALERIO, Abstract n.38

DESBUQUOIS, SINDROME DI

PANE MARIKA, Abstract n.67

ROSSI ANTONIO, Abstract n.233

SALVATORE DOMENICO, Abstract n.58

DESMOSTEROLOSI

SANDRI MARCO, Abstract n.37

VANONI MARIA ANTONIETTA, Abstract n.208

TORRENTE YVAN, Abstract n.63

DIABETE INSIPIDO NEFROGENO LEGATO ALL’X

DISTROFIA MUSCOLARE FACIO-SCAPOLO-OMERALE

SVELTO MARIA, Abstract n.211

GABELLINI DAVIDE, Abstract n.39 TUPLER ROSSELLA GINEVRA, Abstract n.70

DIABETE, TIPO 1 FALCONE MARIKA MARIA CATERINA, Abstract n.214

DISTROFIA MUSCOLARE OCULO-FARINGEA

MASIELLO PELLEGRINO, Abstract n.213

FIUMARA FERDINANDO, Abstract n.82

MATARESE GIUSEPPE, Abstract n.212

DISTROGLICANOPATIE

DIABETE, TIPO 2

CUBELLIS MARIA VITTORIA, Abstract n.83

BEGUINOT FRANCESCO, Abstract n.216

GAZZERRO ELISABETTA, Abstract n.80

FEDERICI MASSIMO, Abstract n.215

DOWN, SINDROME DI

DIGEORGE, SINDROME DI

BARTESAGHI RENATA, Abstract n.170

BALDINI ANTONIO, Abstract n.224

ECTRODATTILIA - DISPLASIA ECTODERMICA - LABIO

SERINI GUIDO, Abstract n.165

PALATOSCHISI

DISABILITÀ INTELLETIVA LEGATA ALL’X

MELINO GENNARO, Abstract n.240

CALEO MATTEO, Abstract n.156

MERLO GIORGIO ROBERTO, Abstract n.242

D’ADAMO PATRIZIA, Abstract n.46 DE CURTIS IVAN, Abstract n.157

EMICRANIA EMIPLEGICA FAMILARE

PASSAFARO MARIA PIA, Abstract n.45

CARMIGNOTO GIORGIO, Abstract n.132 NISTRI ANDREA, Abstract n.133

DISPLASIA SPONDILO-EPIMETAFISARIA TARDIVA DE MATTEIS MARIA ANTONIETTA, ABSTRACT N.14 DISTROFIA

EMOCROMATOSI FAMILIARE

DEL CRISTALLINO DI SCHNYDER

CAMASCHELLA CLARA, Abstract n.193

SANTORO MASSIMO, Abstract n.174

PIETRANGELO ANTONELLO, Abstract n.192

DISTROFIE MUSCOLARI CONGENITE

EMOFILIA

GAZZERRO ELISABETTA, Abstract n.80

FOLLENZI ANTONIA, Abstract n.186

MERCURI EUGENIO, Abstract n.79

NALDINI LUIGI, Abstract n.30 PINOTTI MIRKO, Abstract n.185

DISTROFIA MUSCOLARE CONGENITA CON DEFICIT DI MEROSINA

ENCEFALOPATIA EPILETTICA INFANTILE, 2

PREVITALI STEFANO CARLO, Abstract n.81

LANDSBERGER NICOLETTA, Abstract n.163

DISTROFIA MUSCOLARE CONGENITA DI ULLRICH

ENCEFALOPATIA FAMILIARE CON CORPI INCLUSI DI

BERNARDI PAOLO, Abstract n.89

NEUROSERPINA

MERLINI LUCIANO, Abstract n.90

BOLOGNESI MARTINO, Abstract n.134

148

ENCEFALOPATIE DA PRIONI

INSENSIBILITÀ AL DOLORE CON ANIDROSI

CHIESA ROBERTO, Abstract n.44

CATTANEO ANTONINO, Abstract n.106

MATTEOLI MICHELA, Abstract n.135

INSONNIA FATALE FAMILIARE

EPILESSIA

FORLONI GIANLUIGI, Abstract n.136

BENFENATI FABIO, Abstract n.127

INSUFFICIENZA OVARICA PRECOCE

CANCEDDA LAURA, Abstract n.128

TONIOLO DANIELA, Abstract n.232

EPILESSIA DEL LOBO LATERO-TEMPORALE

IPEROSSALURIA PRIMARIA

NOBILE CARLO, Abstract n.129

AURICCHIO ALBERTO, Abstract n.7

EPILESSIA IDIOPATICA GENERALIZZATA

BRUNETTI PIERRI NICOLA, Abstract n.4

CANCEDDA LAURA, Abstract n.128

DI BERNARDO DIEGO, Abstract n.5

EPILESSIA LEGATA ALL’X, CON DISTURBI VARIABILI E DEL

VOLTATTORNI CARLA, Abstract n.209

COMPORTAMENTO

IPERTERMIA MALIGNA

BENFENATI FABIO, Abstract n.127

DI BLASI CLAUDIA, Abstract n.86

EPILESSIA MIOCLONICA DELL’INFANZIA

PROTASI FELICIANO, Abstract n.92

CARMIGNOTO GIORGIO, Abstract n.132

IPEX

FELLIN TOMMASO, Abstract n.131

BACCHETTA ROSA, Abstract n.19

EPILESSIA NOTTURNA DEL LOBO FRONTALE

IPODISPLASIA RENALE NON SINDROMICA, TIPO 1

BECCHETTI ANDREA, Abstract n.130

GHIGGERI GIAN MARCO, Abstract n.231

FABRY, MALATTIA DI

IRIDA, SINDROME

CUBELLIS MARIA VITTORIA, Abstract n.83

CAMASCHELLA CLARA, Abstract n.193

PARENTI GIANCARLO, Abstract n.1

KLINEFELTER, SINDROME DI

FATTORE VII, DEFICIT DI

BARCHI MARCO, Abstract n.247

PINOTTI MIRKO, Abstract n.185

KRABBE, MALATTIA DI

FEBBRE PERIODICA FAMILIARE

BIFFI ALESSANDRA, Abstract n.35

DI VIRGILIO FRANCESCO, Abstract n.195

LEOPARD, SINDROME DI

FIBROSI CISTICA

CESARENI GIANNI, Abstract n.244

GALIETTA LUIS, Abstract n.204

TARTAGLIA MARCO, Abstract n.243

LUINI ALBERTO, Abstract n.11 MAIURI LUIGI, Abstract n.205

LEUCODISTROFIA AUTOSOMICA DOMINANTE

MILANI SILVANO, Abstract n.207

GASPARINI LAURA, Abstract n.116

STRAZZABOSCO MARIO, Abstract n.206

LEUCODISTROFIA METACROMATICA

FIBROSI EPATICA CONGENITA

BIFFI ALESSANDRA, Abstract n.20, 21

FABRIS LUCA, Abstract n.227

GRITTI ANGELA, Abstract n.23

GLICOGENOSI, TIPO 2

LEUCOENCEFALOPATIA MEGAENCEFALICA CON CISTI

ANDRIA GENEROSO, Abstract n.84

SUBCORTICALI

PARENTI GIANCARLO, Abstract n.1

PUSCH MICHAEL, Abstract n.171

GLOMERULONEFRITE MEMBRANOPROLIFERATIVA, LEGATA

LINFOPROLIFERATIVA LEGATA ALL’X, SINDROME

ALLA X

GRAZIANI ANDREA, Abstract n.200

NORIS MARINA, Abstract n.229

LOWE, SINDROME OCULO-CEREBRO-RENALE DI

GRANULOMATOSA CRONICA, MALATTIA

DE MATTEIS MARIA ANTONIETTA, Abstract n.12

AIUTI ALESSANDRO, Abstract n.34

MALATTIE GENETICHE IN GENERALE

GRISCELLI, SINDROME DI

FILOCAMO MIRELLA, Abstract n.254

RAGNINI-WILSON ANTONELLA, Abstract n.172

PESOLE GRAZIANO, Abstract n.256

HAILEY–HAILEY, MALATTIA DI

POLISHCHUK ROMAN, Abstract n.255

TALORA CLAUDIO, Abstract n.245

MALATTIE MITOCONDRIALI

HUNTINGTON, MALATTIA DI

PINTON PAOLO, Abstract n.107

CATTANEO ELENA, Abstract n.140

SICILIANO GABRIELE, Abstract n.112

SQUITIERI FERDINANDO, Abstract n.141

VERGANI LODOVICA, Abstract n.108 ZEVIANI MASSIMO, Abstract n.110, 111

IMMUNODEFICIENZA COMBINATA GRAVE AIUTI ALESSANDRO, Abstract n.15

MALFORMAZIONE CAVERNOSA CEREBRALE

IMMUNODEFICIENZA COMUNE VARIABILE

SERINI GUIDO, Abstract n.165

BALDARI COSIMA, Abstract n.198

MARFAN, SINDROME DI

FERRARI SIMONA, Abstract n.199

ARBUSTINI ELOISA, Abstract n.225

INCONTINENTIA PIGMENTI

MARINESCO–SJÖGREN, SINDROME DI

URSINI MATILDE VALERIA, Abstract n.246

SALLESE MICHELE, Abstract n.168

149

MASA, SINDROME

NOONAN, SINDROME DI

MELDOLESI JACOPO, Abstract n.164

CESARENI GIANNI, Abstract n.244 TARTAGLIA MARCO, Abstract n.243

McCUNE-ALBRIGHT, SINDROME DI

OBESITÀ

BIANCO PAOLO, Abstract n.236

FEDERICI MASSIMO, Abstract n.215

MICROCEFALIA

MAFFEI MARGHERITA, Abstract n.52

DI CUNTO FERDINANDO, Abstract n.166

OMENN, SINDROME DI

MIOPATIA CONGENITA ‘CENTRAL CORE’

VILLA ANNA, Abstract n.18

PROTASI FELICIANO, Abstract n.92

ORO-FACIO-DIGITALE, SINDROME

SZABADKAI GYORGY, Abstract n.91

FRANCO BRUNELLA, Abstract n.13

MIOPATIA DI BETHLEM BERNARDI PAOLO, Abstract n.89

OSTEOPETROSI, AUTOSOMICA RECESSIVA, TIPO 1

CECCONI FRANCESCO, Abstract n.36

TETI ANNA MARIA, Abstract n.238

MERLINI LUCIANO, Abstract n.90

OSTEOPETROSI, AUTOSOMICA RECESSIVA TIPO 2 SOBACCHI CRISTINA, Abstract n.237

MIOPATIA DI BRODY SANDONA’ DORIANNA, Abstract n.73

PARAPLEGIA SPASTICA EREDITARIA, AUTOSOMICA

MIOPATIE CONGENITE

DOMINANTE, TIPO 12

BRUNO CLAUDIO, Abstract n.88

ORLACCHIO ANTONIO, Abstract n.117

CARRA SERENA, Abstract n.85

PARAPLEGIA SPASTICA EREDITARIA, AUTOSOMICA

DI BLASI CLAUDIA, Abstract n.86

DOMINANTE, TIPO 29

VAZZA GIOVANNI, Abstract n.87

ORLACCHIO ANTONIO, Abstract n.117

ZITO ESTER, Abstract n.40 PARAPLEGIA SPASTICA EREDITARIA, AUTOSOMICA MIOTONIA CONGENITA AUTOSOMICA DOMINANTE

DOMINANTE, TIPO 38

CONTE CAMERINO DIANA, Abstract n.115

ORLACCHIO ANTONIO, Abstract n.117

MIOTONIA CONGENITA AUTOSOMICA RECESSIVA

PARAPLEGIA SPASTICA FAMILIARE

CONTE CAMERINO DIANA, Abstract n.115

DAGA ANDREA, Abstract n.118

MUCOPOLISACCARIDOSI TIPO 1

PARKINSON, MALATTIA DI

BIFFI ALESSANDRA, Abstract n.33

CHIEREGATTI EVELINA, Abstract n.147

FRALDI ALESSANDRO, Abstract n.3

GOLDWURM STEFANO, Abstract n.146

SERAFINI MARTA, Abstract n.51

GREGGIO ELISA, Abstract n.148 GUSTINCICH STEFANO, Abstract n.145

MUCOPOLISACCARIDOSI TIPO 3

VALENTE ENZA MARIA, Abstract n.144

FRALDI ALESSANDRO, Abstract n.3 PARENTI GIANCARLO, Abstract n.1

PEMFIGO CRONICO FAMILIARE TALORA CLAUDIO, Abstract n.245

MUCOPOLISACCARIDOSI TIPO 6 AURICCHIO ALBERTO, Abstract n.7

PHELAN-Mc-DERMID, SINDROME (SINDROME DA DELEZIONE

FRALDI ALESSANDRO, Abstract n.3

22Q13) SALA CARLO, Abstract n.153

NEFROPATIA IPERURICEMICA GIOVANILE FAMILIARE RAMPOLDI LUCA, Abstract n.53

POLIALANINE, MALATTIE DELLE FIUMARA FERDINANDO, Abstract n.239

NEFROSICA STEROIDO-RESISTENTE (SNSR), SINDROME BRESIN ELENA, Abstract n.228

PRADER-WILLI, SINDROME DI CHINI BICE, Abstract n.152

NEURODEGENERAZIONE ASSOCIATA A DIFETTI DELLA PANTOTENATO KINASI (PKAN)

QT LUNGO, SINDROME DA

LEVI SONIA, Abstract n.142

CROTTI LIA, Abstract n.222

NEURODEGENERAZIONE CON ACCUMULO CEREBRALE DI

RENE POLICISTICO, MALATTIA DEL

FERRO, TIPO 3

BOLETTA ALESSANDRA, Abstract n.54

AROSIO PAOLO, Abstract n.143

LUPETTI PIETRO, Abstract n.230

NEUROPATIA DEMIELINIZZANTE CONGENITA

RETINITE PIGMENTOSA

TAVEGGIA CARLA, Abstract n.104

FANELLI FRANCESCA, Abstract n.48 LANZANI GUGLIELMO, Abstract n.179

NEUROPATIA EREDITARIA SENSORIA E AUTONOMA, FORMA V

SURACE ENRICO, Abstract n.8

CATTANEO ANTONINO, Abstract n.106

RETT, SINDROME DI

NEUROPATIA IPERTROFICA DI DEJERINE-SOTTAS

LANDSBERGER NICOLETTA, Abstract n.163

FELTRI MARIA LAURA, Abstract n.103

PIZZORUSSO TOMMASO, Abstract n.162

NIJMEGEN, SINDROME DA ROTTURE DI

RENIERI ALESSANDRA, Abstract n.161

DELIA DOMENICO, Abstract n.124

TONGIORGI ENRICO, Abstract n.160

150

RETT, SINDROME DI, ASSOCIATA A FORME EPILETTICHE

NALDINI LUIGI, Abstract n.29

(CDKL5)

RONCAROLO MARIA GRAZIA, Abstract n.31

BROCCOLI VANIA, Abstract n.158

SULFATASI, DEFICIT MULTIPLO DI

CIANI ELISABETTA, Abstract n.159

SITIA ROBERTO, Abstract n.210

ROBERTS, SINDROME DI

TACHICARDIA VENTRICOLARE POLIMORFA

BRANZEI DANA, Abstract n.249

CATECOLAMINERGICA MONGILLO MARCO, Abstract n.221

ROTTURA DI VARSAVIA, SINDROME DI

PRIORI SILVIA GIULIANA, Abstract n.220

BRANZEI DANA, Abstract n.249

SANDONA’ DORIANNA, Abstract n.73

SCHISI DELLE MANI E DEI PIEDI

TALASSEMIA BETA

MELINO GENNARO, Abstract n.240

FERRARI GIULIANA, Abstract n.25, 26

SCLEROSI LATERALE AMIOTROFICA

FLEISCHHAUER KATHARINA, Abstract n.196

BONETTO VALENTINA, Abstract n.41

GAMBARI ROBERTO, Abstract n.188

SCLEROSI LATERALE AMIOTROFICA, GIOVANILE, TIPO 4

TROMBOASTENIA DI GLANZMANN E NAEGELI

LIBERI GIORDANO, Abstract n.119

GRESELE PAOLO, Abstract n.189

SHWACHMAN-DIAMOND, SINDROME

TROMBOCITOPENIA 2

BIFFO STEFANO, Abstract n.250

BALDUINI CARLO LUIGI, Abstract n.190

SILVER-RUSSEL, SINDROME DI

TURNER, SINDROME DI

RICCIO ANDREA, Abstract n.248

BARCHI MARCO, Abstract n.247

SORDITÀ EREDITARIA

ULLRICH, DISTROFIA MUSCOLARE CONGENITA DI

DUGA STEFANO, Abstract n.183

BERNARDI PAOLO, Abstract n.89

GASPARINI PAOLO, Abstract n.181

MERLINI LUCIANO, Abstract n.90

MAMMANO FABIO, Abstract n.182

VELO-CARDIO-FACCIALE, SINDROME SERINI GUIDO, Abstract n.165

STARGARDT, MALATTIA DI, TIPO 1 FALSINI BENEDETTO, Abstract n.180

VITREORETINOPATIA ESSUDATIVA, TIPO 1

STUDI DI BASE NEUROMUSCOLARI

BONATTI STEFANO, Abstract n.175

CARUSO MAURIZIA, Abstract n.57

WERNER, SINDROME DI

CECCONI FRANCESCO, Abstract n.36

PICHIERRI PIETRO, Abstract n.251

MINCHIOTTI GABRIELLA, Abstract n.56

WHIM, SINDROME

SALVATORE DOMENICO, Abstract n.58

VIOLA ANTONELLA, Abstract n.201

STUDI DI BASE, IMMUNOLOGIA

WILLIAMS, SINDROME DI

FLEISCHHAUER KATHARINA, Abstract n.196

CORONA DAVIDE, Abstract n.55

STUDI DI BASE, OCCHIO

WILSON, MALATTIA DI

BANFI SANDRO, Abstract n.9

POLISHCHUK ROMAN, Abstract n.6

NICOLIS SILVIA KIRSTEN, Abstract n.173

WISKOTT-ALDRICH, SINDROME DI

STUDI DI BASE, TERAPIA GENICA

AIUTI ALESSANDRO, Abstract n.16

AIUTI ALESSANDRO, Abstract n.24

BENVENUTI FEDERICA, Abstract n.202

AURICCHIO ALBERTO, Abstract n.10

VILLA ANNA, Abstract n.17

GALLI ALVARO, Abstract n.252 GIACCA MAURO, Abstract n.253

X FRAGILE, SINDROME DA

GREGORI SILVIA, Abstract n.32

CATANIA MARIA VINCENZA, Abstract n.154

MONTINI EUGENIO, Abstract n.27

NERI GIOVANNI, Abstract n.155

151

FONDAZIONE TELETHON Sede di Roma Via Carlo Spinola, 16 00154 Roma, Italia Tel. +39 06 440151 Fax +39 06 44202032

Sede di Milano Piazza Cavour, 1 20121 Milano, Italia Tel. +39 02 2022171 Fax +39 06 44015600

www.telethon.it e-mail: telethon@telethon.it