VII Congreso de la Sociedad Cubana de Bioingeniería Habana 2007
APLICACIÓN DE LA VOLTAMETRÍA EN EL ANÁLISIS DEL CRECIMIENTO MICROBIOLÓGICO H. Cobas, S. Pavoni, A. Zayas, F. Rodríguez, E. Álvarez, R. Contreras Centro de Investigaciones en Microelectrónica, Antigua Carretera de Vento, km 8 ½, Boyeros. hcobas@electrica.cujae.edu.cu
RESUMEN En este trabajo se presenta el seguimiento del ciclo de vida de la bacteria Escherichia coli mediante la utilización de la técnica de voltametría de barrido lineal empleando microceldas planas de platino y microvolúmenes de muestras. La instrumentación electroquímica utilizada se compone de una computadora como instrumento virtual sobre la que corre un programa diseñado en LabVIEW, una tarjeta de adquisición de datos (NI-6014) y un potenciostato. Como referencia se emplea el sistema DIRAMIC. Se obtienen las curvas de crecimiento a partir de determinar el valor del pico de corriente (Ip) para cada voltamograma, el ancho del mismo (W) y la turbidez de la muestra leída con el DIRAMIC. En las curvas de Ip y W se diferencian claramente la fase de latencia del resto de las fases del ciclo de vida. Se filtran los datos de las tres curvas y se comparan los de Ip y W con los de turbidez. De la comparación de Ip y turbidez se obtuvo un coeficiente de correlación del 83,2 % cuando se analizaron las cuatro zonas que componen el ciclo de vida y 92,7 % al excluir la última zona. Para el caso de la comparación de W y turbidez la correlación fue del 83,6 % al analizar todas las zonas y 91,08 % al excluir la cuarta. Se aprecia una correspondencia general entre la evolución de los voltamogramas y las fases de crecimiento microbiológico, lo que evidencia la potencialidad del empleo de esta técnica en el estudio de las mismas.
Palabras clave: crecimiento microbiológico, Escherichia coli, voltametría de barrido lineal, microelectrodos.
1. INTRODUCCIÓN Como voltametría se denomina a un conjunto de técnicas de análisis electroquímico que permiten la detección de especies electroactivas contenidas en un electrolito. Estas técnicas consisten en aplicar una tensión controlada entre los electrodos de una celda electrolítica y medir la corriente que se genera en la misma como consecuencia de reacciones de oxidación-reducción que
ocurren en los electrodos. Entre ellas se encuentran la voltametría cíclica, donde la forma de onda es triangular y la voltametría de barrido lineal, donde la tensión se varía linealmente en el tiempo. Como resultado, se obtienen curvas de corriente-tensión, conocidas como voltamogramas. Desde el punto de vista analítico, estas técnicas de medición han resultado de interés para el desarrollo de muchos sensores electroquímicos. El análisis microbiológico es importante para el diagnóstico de enfermedades, el control de la calidad del agua y de los alimentos, etc. El empleo de la voltametría cíclica para el estudio de muestras microbiológicas se reporta desde la década de 1980 cuando Matsunaga [1, 2] y sus colaboradores desarrollaron una celda de medición de 25 ml de volumen, constituida por un electrodo de grafito y una membrana para filtrar y atrapar microorganismos. La celda se conectaba a un sistema de tres electrodos (alambre de platino como auxiliar y electrodo saturado de calomel como referencia) y para medir se insertaba en una cubeta con el cultivo bacteriano. Al aplicar voltametría cíclica de 0 a 1 V con diversas especies bacterianas, se manifestaron picos de oxidación en 0,7 V con respecto al electrodo saturado de calomel. Resultados similares se observaron por Subrahmanyam [3] con muestras de hongo Aspergillus terreus. En ese caso se empleó un electrodo de trabajo de oro de 0,2 cm2 inmerso en 100 ml de medio de cultivo, igualmente conectado en un sistema de tres electrodos con electrodo saturado de calomel como referencia. Recientemente se reportó la aplicación de la voltametría de barrido lineal de 0 a 1 V con microceldas conformadas por dos microelectrodos planos de platino y gotas 10 µl de volumen de cultivos de Escherichia coli [4, 5, 6]. Independientemente de la velocidad de barrido, se obtuvieron voltamogramas sin pico de corriente para las muestras que se encontraban en fase de latencia y voltamogramas con pico de corriente cuando la muestra se encontraba en fase de crecimiento exponencial. De esta forma podía determinarse la duración de la fase de latencia y relacionarlas con la concentración inicial de las células bacterianas en el cultivo. Sin embargo, la investigación se limitó a las dos primeras fases del crecimiento del microorganismo. El objetivo de este
VII Congreso de la Sociedad Cubana de Bioingeniería Habana 2007 trabajo es extender el análisis voltamétrico al resto de las fases de crecimiento de la Escherichia coli para discutir las potencialidades de las voltametrías de barrido lineal en el estudio de las fases de crecimiento microbiológico, con el empleo de microceldas planas de platino y microvolúmenes de muestras. 2. METODOLOGÍA Crecimiento microbiológico El crecimiento microbiológico está dado por el incremento en el número de células en una población de microorganismos [7]. Una curva típica de crecimiento en un medio de cultivo se presenta en la Fig. 1. En ella pueden identificarse cuatro fases principales. Inicialmente se transita por una etapa de latencia en la que los microorganismos se adaptan al nuevo ambiente y no hay crecimiento celular aparente. A continuación ocurre la fase de crecimiento exponencial, donde la masa bacteriana crece hasta que se agotan los nutrientes y se acumulan sustancias tóxicas que inhiben el crecimiento. Luego se alcanza la fase estacionaria que se caracteriza por un cese del crecimiento poblacional debido a la compensación de la formación y muerte de células. Finalmente se llega a la fase de muerte.
minutos se sacó un frasco de la incubadora, se midió la turbidez de la muestra y con una micropioeta se tomaron 10 µl de la misma para realizar la evaluación electroquímica. Instrumentación electroquímica Los experimentos electroquímicos se realizaron según el esquema de medición presentado en la Fig. 2. Se basa en la instrumentación virtual e incluye una computadora personal, LabView como lenguaje de programación, una tarjeta de adquisición de datos National Instruments NIDAQ 6014 de 16 bits con un módulo de expansión CB68LP y un potenciostato. El sistema está diseñado para medir corriente con resolución menor de 10 nA y generar una tensión de entre ±10 V con resolución menor de 5 mV.
Fig. 2. Esquema del sistema de medición.
Fig.1. Curva típica microorganismos.
de
crecimiento
de
una
población
de
Preparación de las muestras microbiológicas En el trabajo experimental se utilizaron colonias de la cepa estándar de laboratorio Escherichia coli ATCC 25922 y el medio de cultivo líquido DIRAMIC Kit Diagnóstico (DKD) [8]. Como sistema de medición de referencia para la determinación de la concentración celular se utilizó el equipo para el Diagnóstico Rápido Microbiológico DIRAMIC [9]. Este instrumento permite detectar los cambios de turbidez debido al crecimiento microbiano en muestras contenidas en un frasco de vidrio de 4,5 ml e indica los valores de turbidez en la escala estándar de McFarland (1 McFarland ≈ 3x108 cél/ml). Se prepararon 40 muestras en frascos de vidrio de 4,5 ml, cada una con concentración inicial del orden de 1x106 cél/ml de E. coli en el medio de cultivo. Para favorecer el crecimiento, las muestras se pusieron a incubar a 37ºC con excepción de la que se midió en “tiempo de incubación igual cero”. Durante un período de crecimiento de 11 horas, aproximadamente cada 15
La interfaz gráfica del instrumento virtual consta de un panel de configuración donde el operador pueda configurar los parámetros de cada experimento (técnica electroquímica, características de la señal para excitar a la celda electroquímica, dirección de almacenamiento de los datos en el disco duro, protocolo del experimento, etc.). Presenta también un panel de medición donde se representan gráficamente en tiempo real las señales generadas y los resultados de las mediciones. La adquisición de señales se efectúa a través la tarjeta de adquisición de datos NI 6014 - National Instrument [6]. Se emplean entradas y salidas analógicas de este dispositivo para interactuar con un potenciostato, circuito electrónico mediante el cual se le aplica la polarización a la celda electroquímica y se sensa la corriente circulante por la misma. El elemento sensor del sistema de medición lo constituye una microcelda electroquímica fabricada en tecnología de películas delgadas. La microcelda está constituida de dos electrodos de platino en configuración disco-anillo [4, 5]. El denominado electrodo de trabajo tiene la forma de un disco de 1 mm de diámetro y el anillo de aproximadamente 2 mm2 de área se utilizó como pseudorreferencia [4, 5]. La muestra que se va a analizar constituye el electrolito de la celda y se deposita en forma
de gota sobre los electrodos con el empleo de una micropipeta. Los análisis se efectuaron mediante la técnica de voltametría de barrido lineal de 0 a 1 V a 20 mV/s.
[McFarland]
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III
3.0 I
IV
II
(a)
0.0
Para cada muestra medida se obtuvo la característica corriente-diferencia de potencial aplicado. Como se esperaba según los reportes anteriores [4-6], en los experimentos se observaron dos tipos de comportamientos bien diferenciados (Fig. 3): voltamogramas sin pico de corriente (A) y voltamogramas con pico (B). En la misma figura se indican los parámetros corriente pico (Ip) y ancho del voltamograma (W) que se utilizarán en el análisis de los resultados.
A B Ip/2
I [μA]
1.5
W
1.0
Ip/2
0.5
0.0 0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
ΔV [V]
Fig. 3. Clasificación de los voltamogramas obtenidos: Voltamograma sin pico. B) Voltamograma con pico de corriente.
III
II
IV
I
(b)
0.8 II
0.4
III
IV
I
(c)
0.0 0
2
4
6
8
10
12
Tiempo de incubación [h]
Fig. 4. Crecimiento de Escherichia coli durante 11 horas de incubación. (a) Turbidez de cada muestra antes de la medición voltamétrica. (b) Intensidad de la corriente pico en voltamogramas realizados a 20 mV/s con cada muestra. (c) Ancho del voltamograma determinado según la Fig. 3. En cada curva la línea continua gris corresponde a un filtrado de las fluctuaciones mediante transformada rápida de Fourier.
2.5
2.0
1.5 0.0
W [V]
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
I p [μA]
3.0
A)
En la Fig. 4 se presentan con respecto al tiempo de incubación, los valores de turbidez medidos con el sistema DIRAMIC, así como los parámetros Ip y W extraídos de cada voltamograma. En cada curva se han indicado cuatro zonas (I, II, III y IV) para analizar cómo se detectaron las etapas de crecimiento del microorganismo con cada sistema de medición. De un total de 40 mediciones se obtuvieron siete voltamogramas sin pico de corriente con cada una de las muestras medidas en las primeras dos horas (zona I en la Fig. 4). A partir de la octava muestra, incubada durante 122 minutos y con turbidez de 1,03 McFarland, se manifestó el pico de corriente en todos los voltamogramas realizados. Este resultado confirma los reportes anteriores [4, 5] en cuanto a la clara diferenciación de las fases de latencia y la de crecimiento exponencial. En las tres primeras muestras correspondientes a la fase de crecimiento exponencial (zona II de la Fig. 4b), la intensidad de corriente pico aumentó con el incremento del tiempo de incubación. Para tiempos de incubación mayores de tres horas, la dispersión en los valores de intensidad de corriente de los picos fue grande (valor
medio de 1,55 µA con desviación estándar de 0,53 µA en la zona III)y en comparación con la curva de crecimiento descrita por los valores de turbidez (Fig. 4a), la separación entre las fases de crecimiento exponencial y estacionaria quedó menos definida. En la parte identificada como IV en la Fig. 4a, aumentó la dispersión en los valores de turbidez. Este fenómeno pudiera estar relacionado con el comienzo de la fase de muerte en algunas de las muestras. En esta misma zona, aunque se mantuvo la dispersión de los valores de intensidad de corriente de los picos, el valor medio disminuyó a 1,09 µA con una desviación estándar de 0,51 µA. Los datos representados en las curvas de la figura 4 se filtraron mediante la transformada rápida de Fourier. Con las curvas filtradas, se obtuvo entre la turbidez y la corriente pico una correlación de 83,2% al considerar todas las zonas y de 92,7% al excluir la zona IV. Como se observa en la Fig. 4c, el ancho de los voltamogramas (W) se modificó con el avance del tiempo de incubación. Se puede ver como a partir de la zona II aumenta el ancho del voltamograma. Se alcanza en la zona III un valor medio de 0,61 V con una desviación estándar de 0,48 V. En la zona IV el valor medio disminuyó a 0,485 V con una desviación estándar de 0,046 V. El incremento del ancho de los voltamogramas se manifestó en mayor medida en el final de las zonas II y principio de la III. Este comportamiento probablemente estuvo ocasionado por el aumento de la variedad de especies electroactivas que podían oxidarse, lo que daba lugar a un solapamiento de picos individuales que se manifiesta como un pico más ancho. En este caso, la correlación con la turbidez fue de 83,6% para todo el intervalo y de 91,08% al excluir la zona IV. Los resultados anteriores muestran una correspondencia general entre la evolución de los
VII Congreso de la Sociedad Cubana de Bioingeniería Habana 2007 voltamogramas microbiológico.
y
las
fases
de
crecimiento
[6] [7]
4. CONCLUSIONES Se efectuó el seguimiento del ciclo de vida de la bacteria Escherichia coli durante un período de 11 horas. Se tomaron un total de 40 muestras espaciadas cada 15 minutos que fueron analizadas electroquímicamente utilizando la técnica de voltametría de barrido lineal. Se diferenciaron claramente la fase de latencia, donde los voltamogramas no manifestaron picos, del resto de las fases de crecimiento de la bacteria, donde si mostraron picos. Los datos de las curvas de turbidez, corriente pico y ancho del voltamograma, una vez filtrados, arrojaron una correlación de 83,2 % cuando se analizaron las cuatro zonas y 92,7 % al excluir la última para el caso de las curvas (a) y (b) de la Fig. 4; para el caso de las curvas (a) y (b) de la misma figura se obtuvo una correlación de 83,6 % al analizar todas las zonas y 91,08 % al excluir la cuarta. Con los resultados obtenidos se ha puesto en evidencia la potencialidad de la técnica de voltametría de barrido lineal en el estudio de las fases de crecimiento microbiológico dada la correspondencia general entre la evolución de los voltamogramas y las fases de crecimiento microbiológico.
AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen al Instituto para la Química y Biosensores (ICB) de Münster, Alemania por la fabricación del dispositivo sensor.
REFERENCIAS [1] [2]
[3]
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