Presencia de micotoxinas en maiz y tortilla by Nixta_2013

10/14/2013

EFECTO de la NIXTAMALIZACIÓN sobre las MICOTOXINAS del MAÍZ y las TORTILLAS Magda Carvajal, P. Castillo, GM. Moctezuma, J. Espinosa, ME. Gonsebatt, W. Reyes

Proporciones de cáncer atribuidas a diferentes causas en USA (Doll & Peto, 1981)

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ESTRUCTURA DE LA CONFERENCIA Efecto de nixtamalización sobre las micotoxinas. O

1. AFLATOXINAS

O O

2. FUMONISINAS

CH3

CH3 R2 CH3 R3

R4 OH R5

3. ZEARALENONA 4. DESOXINIVALENOL (DON) 5. 15-ACETIL-DON

Micotoxinas son metabolitos secundarios (compuestos orgánicos sintetizados por el hongo sin papel directo en su crecimiento o reproducción) tóxicos, en alimentos y dañinos a la salud. Los principales hongos son: Aspergillus spp. (Aflatoxinas, OTA). Penicillium spp. Fusarium spp. Tricotecenos (DON, 15-A-DON, DAS, T2), Fumonisinas y Zearalenona. (CAST, 2003; JECFA, 2001).

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LAS YESCAS, TAMAULIPAS

1991-1994 60,000 ton

Limpio

Contaminado

40% 60%

95% MAÍZ BLANCO

MAÍZ AMARILLO

LA COMISIÓN INTERSECRETARIAL (CONASUPO, SSA Y SARH) DETERMINÓ, EL 6 DE AGOSTO DE 1991, QUE EL 95% DEL MAÍZ BLANCO Y EL 60% DEL AMARILLO ESTABAN CONTAMINADOS CON AFLATOXINAS.

CARACTERÍSTICAS DE LAS AFLATOXINAS 1.

SER FLUORESCENTES

INVISIBLES, INODORAS, INSÍPIDAS.

SER RESISTENTES A: a. CALOR DE 260 A 320°C. b. COCIMIENTO, ULTRAPASTEURIZACIÓN, TRATAMIENTO CON CAL, FERMENTACIÓN.

ACTUAR EN TRAZAS

INSOLUBLES EN AGUA, SOLUBLES EN SOLVENTES ORGÁNICOS.

MUTÁGENAS Y CANCERÍGENAS.

FORMAN ADUCTOS (Biomarcadores)

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CIRROSIS CAUSADA POR AFLATOXINAS EN GANADO MEXICANO

Vientre hinchado de una vaca que ingirió 1 mg/kg de AFB1 una sola vez, y desarrolló daño hepático (cirrosis).

Líquido ascítico, síntomas de cirrosis

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Defunciones

Descripción

Orden

Total 1

Diabetes mellitus

Enfermedades isquémicas del corazón

71,072

Enfermedad cerebrovascular

31,235

Cirrosis y enfermedades crónicas del hígado

28,392

Agresiones (homicidios)

6, 7 y 8

80,788

27,213

Enfermedad pulmonar obstructiva crónica Enfermedades hipertensivas, Accidentes de transporte

22,595; 18,942 y 17,225

Infecciones respiratorias agudas bajas

16,401

Afecciones originadas en periodo perinatal

14,825

Nefritis y nefrosis

13,858

Desnutrición calórico proteica

7,952

Tumor maligno de tráquea, bronquios y pulmón

6,748

Lesiones autoinfligidas (suicidios)

5,732

Tumor maligno de la próstata

5,666

Tumor maligno del estómago

5,557

Tumor maligno del hígado

5,451

Tumor maligno de la mama

5,258

VIH/SIDA

5,043

Tumor maligno del cuello del útero

3,927

Las demás

2011

590,693

184,886

AFLATOXINAS 1. Analizar Aflatoxinas de las tortillas. 2. Determinar la actividad química (fluorescencia) y biológica (mutagenicidad) de la AFB1 en un modelo de la digestión humana. 3. Determinar si las tortillas contaminadas con AFB1 son un riesgo para la salud.

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4 muestreos: secas y lluvias de 2006 y 2007

Metodología

96 puntos de muestreo

48h / 70C

800 KG

1/5 tortillas con AF 67/394 muestras analizadas (17%) con al menos una AF.

400

No. de muestras

molienda

300 200 100 0

396

M. AF

Porcentaje

0 10203040506070

AFLATOXINAS EN TORTILLAS DE LA CIUDAD DE MÉXICO

1 M. AFB1

65.7

M. AFB2

35.8

M. AFG1

14.9

M. AFG2

16.4

Φ AF (µg kg-1): AFB1 (12.1) AFB2 (2.7) AFG1 (64.1) AFG2 (3.7) y AFt (20.3) AFB1 es la más teratógena y cancerígena y fue la más frecuente en tortillas. 13.4% tuvieron más AF de lo permitido (12 g kg-1) en la legislación de Mexico.

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Procesamiento al maíz naturalmente contaminado con AFB1 MAÍZ 2000 g

100 g antes de nixtamalizar

Masa: moler y separar 100 g

3 repeticiones

Moler grano

nixtamalizar 1900 g muestra de agua

100 mL antes de nixtamalizar

de 25 g c/u

Agua de cocción (nejayote)

100 mL después de nixtamalizar y reposar

separar 100 g de masa testigo

3 repeticiones de 25g c/u

concentrar a 100 mL y

Análisis de HPLC y prueba de Ames

Moler y amasar con MeOH

Análisis de HPLC prueba de Ames

Hacer tortillas

Extracto de AFB1 de una tortilla (pH 11.6) (A= 12.8 ng AFB1 y 43 colonias revertantes) y 10 tortillas (B= 128 ng AFB1 y 49 colonias revertantes) digerida con jugo pancreático a pH 7.5 con maíz naturalmente contaminado con AFB1, sin efecto mutágeno.

Burgos-Hernández y otros (2001 a,b) reportaron que muchos compuestos fitoquímicos de vegetales y frutas pueden bloquear el proceso cancerígeno y mutagénico. En el maíz, puede ser el ácido linoleico que bloquea la mutagenicidad de las AF, actúa como antioxidante y protegería a la población expuesta de cantidades elevadas de AF en la dieta.

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MODELO DE DIGESTIÓN DE LAS TORTILLAS MAÍZ +/- AF

1. NIXTAMALIZACIÓN 2. MASA 3. TORTILLAS

CON ENZIMAS DIGESTIVAS

CONTROL SALIVA

pH 12

7.0

J.GÁST. J. PANCR.

1.2

SALIVA +JG+JP

7.5

5-6

HPLC DE AFLATOXINAS

PRUEBA DE AMES

ESTUDIOS DE MUTACIÓN POR AFLATOXINAS EN PRUEBA DE AMES AFB1 (Mutágena)

Cofactor NADP Concentrado microsomal S9

Salmonella typhimurium TA-98 con Plásmido + factor R MUTANTE

- HISTIDINA OPERÓN de la HISTIDINA

+ HISTIDINA NORMAL

COLONIAS REVERTANTES MUTADAS

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Cantidad mínima de AFB1 que causa una mutación en la prueba de Ames con Salmonella typhimurium TA-98 (100 uL). Caja

µL de S9 inducido por Aroclor

Control PBS µL

AFB1 (ng)

1 2 3 4

500 -

500 500

5 6 7 8 9 10

500 500 500 500 500 500

Prueba de Ames N° de colonias mutadas Repeticiones Controles 2 1 3 26 26 27 26 26 22 20 14 16 50 13 25 17 Tratamientos 0.39 27 21 20 0.78 19 16 25 1.6 40 32 35 3.8 40 30 30 6.25 29 40 35 10.0* 68 69 67

11 12 13

500 500 500

12.5 25 50

82 202 337

87 160 370

87 153 285

Promedio de colonias mutadas

26 23 17 18 23 20 37 33 35 68 ** 85 172 331

CONCLUSIONES DE NIXTAMALIZACIÓN SOBRE AF 1. La nixtamalización sólo elimina parcialmente a las AF del maíz. 2. El pH determina las actividades química y mutágena de la AFB1 y se activa en un pH neutro ( 5 a 7.5). 3. La nixtamalización del maíz provoca pérdida de la AFB1, no por efecto de la cal (pH 12.0), sino por la eliminación del agua de nejayote que elimina pericarpios, pero las AF quedan aún en el interior del grano. 4. Las AF de las tortillas siguen siendo activas biológica y químicamente, en pH neutros de 5 a 7.5, aunque con el pH básico de la nixtamalización y el pH muy ácido del jugo gástrico, se disfrazan los efectos mutágeno y la fluorescencia química.

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5. La saliva (pH 7.0), jugo pancreático (pH 7.5) y mezcla de saliva + jugos gástrico y pancreático (pH 5.0), incrementaron el efecto mutágeno de la AFB1. 6. El límite mínimo para que la AFB1 produzca una mutación fue de 10 ng. 7. Es importante seleccionar el maíz menos contaminado por AFB1 para el consumo humano, pues después de la nixtamalización y al someterla a la digestión, sus niveles químicos y biológicos se recuperan tanto en la boca (por la acción de la saliva), como en el duodeno (por la pancreatina) pudiendo ocasionar daños en la salud.

ADUCTOS DE AF EN CÁNCER CERVICAL 1. DETERMINAR LA PRESENCIA DE ADUCTOS DE AFB1-DNA EN CÁNCER CERVICOUTERINO. 2. SABER SI HAY SINERGISMO ENTRE VPH Y LOS ADUCTOS DE AFB1-ADN.

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SÍNTESIS DEL ADUCTO DE AFB1-N7-GUANINA EN LAB AFB1-Gua reportado b) por Essigmann 7-Gua AFB1-N -ADN AFB 1

0.4

Área cromatográfica

Aducto deAFB AFB11-Gua -N7-Gua sintetizado Aducto sintetizado

Área 2.7 TR 22.4

0.3 0.2 0.1

10 20 30 Tiempo retención(minutos) (minutos) Tiempo de retención

min. nm

b) Aducto AFB1-Gua reportado TR 22 min, con % area 0.7

a) TR 22.4 min y % area 2.7 = 2.1 µg mL-1 del aducto AFB1-Gua.

HPLC DEL ADUCTO DE AFB1- GUANINA DE IMIDAZOL EN ANILLO ABIERTO (IRO)

100

60 40

20 0

A) SINTETIZADO POR ACTIVACIÓN PERÁCIDA DE LA AFB1

30 5

B) ADUCTO HIDROLIZADO DEL TUMOR DE COLON HUMANO

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Aductos AFB1-FAPY pg / mg DNA

1025 pg AFB1-FAPY mg-1 ADN 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0

2.6 pg AFB1FAPY mg-1 ADN

Muestras control

Muestras con cáncer

Promedio de muestras control y con cáncer estadísticamente significativas con prueba t p = 0.00006

aductos AFB1-FAPY (pg) / mg ADN

Concentraciones promedio (pg del aducto AFB1-FAPY/ mg ADN) en muestras con cáncer positivas para VPH.

De las 40 muestras con CC el 65% con aductos AFB1-FAPY, 40 % con VPH 16 y 25 % con VPH 18.

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0

1416.4 pg AFB1-FAPY

633 pg AFB1-FAPY

HPV16

HPV18

Tipos de VPH

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CONCLUSIONES DE ADUCTOS DE AF EN CA CERVICAL 1. LAS AF PREDISPONEN AL CÁNCER CERVICOUTERINO HUMANO. 2. EN MÉXICO EL 65% Y EN UK EL 60% DE LOS CASOS DE CÁNCER CERVICOUTERINO TUVIERON ADUCTOS AFB1-FAPY. 3. CADA CANCERÍGENO SOLO (VPH Y ADUCTOS DE AFB1-FAPY) PUEDEN CAUSAR EL CC Y PUEDEN TAMBIÉN RELACIONARSE SINERGÉTICAMENTE. 4. LOS ADUCTOS AFB1-FAPY INCREMENTAN 6.1 VECES LA FRECUENCIA DE CÁNCER CERVICOUTERINO Y SE RELACIONAN MÁS AL VPH 16 QUE AL VPH 18.

HAY QUE VER SEMEJANZAS ….. O O CH3

ACETATO DE FORBOL –12MIRISTATO-13

13 O

PROMOTOR DE TUMORES

O H

CH 2

O NH

AMINOPENTOL-NMIRISTOL

2 1

METABOLITO DEL AMINOPENTOL-1 H

3 O

CH3 O

O H

CH3

O H

DIAMOND (1984); SHIER (1992)

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No hay relación entre daño visual en la mazorca, unidades formadoras de colonia por gramo (UFCg-1) y niveles de fumonisinas en maíz cosechado en Huejotitán y Ameca, Jalisco, México (Reyes, 2001). Daño visual

HUEJOTITÁN UFC g-1

FUM

AMECA SD

UFC g-1

FUM mg kg-1

mg kg-1 < 2% A (n)

22,422 (9)

10.21

1.18

1,969 a(18)

6.27

4.68

2-10% B (n)

42,157 (7)

10.55

2.83

1,885 a (8)

8.3

654

10-25% C (n)

418,333 (3)

9.33

0.478

25-50% D(n)

8000 (1)

11.00

24,344 b (4)

9.05

4.8

Niveles de Fumonisina mayores en masa disminuyen en tortilla en Guadalajara (g/g) (Reyes, 2001) Niveles

Producto Masa

Promedio SD

2.013 0.999

Tortilla 1.277 0.979

Mínimo

0.5

0.1

Máximo

3.8

3.3

Sector Hidalgo

Sector Juárez

Sector Reforma

Masa

Tortilla

Masa Tortilla

1.506

0.883

1.24

1.0

1.77

0.460

0.418

0.375

0.459

0.924

0.73

0.16

0.7

0.5

2.43

1.5

2.0

1.8

0.7 3.4

1.396 0.788 0.56 3.1

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Producto

AFB1(µg kg-1) FB1 (µg kg-1) HFB1(µg kg-1)

Maíz Nixtamal Agua de nejayote Masa Tortilla

12.8 18.7 11.0

7300 1500 -

100 1500 -

0.0 5.3

2900 1400

500 900

Efecto de la nixtamalización de la tortilla sobre la Zearalenona (ppm) natural y añadida. Muestra

Maíz control

Tortilla

Maíz control

Fracción de agua

trans-Zea (Zea ± SD)

cis-Zea

trans-Zea

cis-Zea

transZea

0.22 ± 0.08 (6.6 ± 2.4)

± 0.08 0.96 ± 0.44 0.19±0.1 0.02 (0.3 ± 0.14) (28.4 ± 0.2)

Zea 0.75 ± 0.15 añadida: (22.5 ± 2.5) 1 ppm 5 ppm

3.62 ± 0.75 (108.6± 22.5)

Maíz FS 362

0.23 ± 0.08 (6.9 ± 2.4)

Maíz FS 808

0.23 ± 0.65 (126.9± 19.5)

1.74 ± 0.47 (51.9± 14)

% de reducción cis-Zea de trans-Zea en tortilla 0

0.3± 0.13 0.03 ± 0.0 (0.42± 0.3)

70.7 73.8 0

100

59.1

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Arriba. Cromatograma de iones totales de los derivados de la Zearalenona – cis-trimetilsilil (Zea-TMS) TR 12.73 min, y trans- Zea-TMS, TR 13.93 min. Al Centro: Espectro de masas del derivado de la cis-Zea-TMS de tortilla naturalmente contaminada con Zea. Abajo: Espectro de masas de estándar de cis- Zea-TMS añadido a la matriz.

CONCLUSIÓN DE ZEARALENONA LA NIXTAMALIZACIÓN ELIMINA LA MAYORÍA DE LA ZEARALENONA (59 A 100 %) EN LAS TORTILLAS Y EN CANTIDADES MÁS ALTAS DE ZEA TRANFORMA EL ISÓMERO TRANS EN ZEA- CIS Abbas, H.K., Mirocha, C.J., Rosiles, R. and Carvajal, M. 1988. Decomposition of zearalenone and deoxynivalenol in the process of making tortillas from corn. Cereal Chemistry, 65 (1): 15-19.

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Vómitos

Úlceras de estómago de cerdos

Gibberella Gibberella en maízen = F.maíz graminearum

DON ó VOMITOXINA Límites de tolerancia en alimentos (FDA): humanos (1 ppm), aves y rumiantes (10 ppm), vacas lecheras (2 ppm), perros y gatos (5 ppm).

Vómito

Inmunosupresión

Anorexia

Reducción de Desoxinivalenol (DON) y 15-acetil A- DON por la nixtamalización de tortillas de maíz naturalmente contaminado y fortificado con DON y 15-A DON. Niveles de micotoxinas (mg kg-1) Maíz Maíz DON 15-A DON 3.28 ± 3.64 1.49 ± 1.07 FS 362 (98.4 ±109.2) (44.7 ± 32.1) Indiana 12.26 ± 3.01 9.83 ± 1.62 FS 808 Indiana (367.8 ± 90.3) (294.9 ± 48.6) 8.25 ± 3.78 10 ppm ND (247.5 ± 113.4) DON 5 ppm DON 4.46 ± 2.75 ND (133.8 ± 82.5) 0.85 ± 0.66 1 ppm DON ND (25.5 ±19.8) Maíz control -

Tortilla DON 15-A DON 0.63 ± 1.03 0 (18.2 ± 29.7) 3.45 ± 1.10 0 (102.8 ± 32.8) 2.24 ± 1.22 ND (65.6 ± 35.7) 1.27 ± 2.01 ND (37.6 ± 59.5) 0.15 ± 0.05 ND (4.5 ±1.5) -

% de reducción DON 15-A DON 81.7% 100 72.1%

100

73.5%

71.9%

82.4%